СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ТАКСАНОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 

Область техники

Предлагаемое техническое решение относится к персонализированной молекулярной и постгеномной медицине, а именно к способам оценки эффективности терапии таксанами пациентов с онкологическими заболеваниями, в частности, раком молочной железы.

Уровень техники

Из уровня техники известно ограниченное число платформ, использующих отдельные виды широкомасштабного генетического профилирования для консультирования докторов и пациентов. Примером является система Caris Molecular Intelligence (Russell et al. 2014; Green et al. 2014; Popovtzer et al. 2015; Vigneswaran et al. 2016). Использование данной системы основано на анализе ограниченного спектра мутаций с ранее показанной клинической значимостью, а также на профилировании биообразцов пациентов на иммуногистохимической панели определения белковых онкомаркеров. Однако указанная система не использует результатов исследования широкомасштабных данных по генной экспрессии и не адаптирована для предсказания клинического ответа применения таксанов.

Способы прогнозирования активности препаратов из группы таксанов известны из следующих публикаций.

1) Заявка WO2006061216 A2 от 14 декабря 2006 г. "Генетические изменения, полезные для прогнозирования ответа злокачественной неоплазии на лечение на основе таксанов". Для прогнозирования ответа злокачественной неоплазии на лечение таксанами используются маркеры, представляющие собой генетические изменения, такие как единичные нуклеотидные полиморфизмы и вариации копийности, при этом не учитывается экспрессия генов.

2) Патент US 9671405 B2 от 19 сентября 2012 г. "Выявление чувствительности к таксанам у больных раком предстательной железы". Данное изобретение основано на использовании статуса сплайсинга андрогенового рецептора для определения чувствительности к таксанам, при этом применяется только для пациентов с раком предстательной железы.

3) Заявка JP 2005524388 A от 26 декабря 2002 г. "Однонуклеотидные полиморфизмы предсказания чувствительности к паклитакселу и их комбинация". В данном изобретении предлагается предсказывать ответ на только один препарат из семейства таксанов - паклитаксел, и только по одиночным нуклеотидным полиморфизмам.

4) Патент JP 6190434 B2 от 16 октября 2016 г. "Маркеры экспрессии генов для прогнозирования ответа на химиотерапевтические агенты" (прототип). В изобретении предлагается оценивать вероятность ответа на терапию таксанами пациентов с раком молочной железы с помощью анализа экспрессии одного гена - GBP1.

Вышеупомянутые изобретения основаны либо на генотипических данных опухолей, либо на анализе экспрессий крайне ограниченного набора генов. В отличие от известных решений предлагаемый способ, основанный на анализе экспрессионной подписи, состоящей из 15 генов человека, позволяет эффективно разделять пациентов, которые ответят на терапию таксанами, и пациентов, которые не ответят на терапию. Способ разработан в результате исследования экспрессионного профиля большого количества пациентов с раком молочной железы и показал высокие значения площади под кривой ошибок для наборов данных, на которых проводилось тестирование.

В настоящее время ожидаемый клинический результат для пациентов с онкологическими заболеваниями основан на субъективных определениях клинических и патологических особенностей опухоли. Например, врачи принимают решения о соответствующих хирургических процедурах и адъювантной терапии на основании стадии, класса и степени патологического поражения органа, затронутого опухолью. Стандартные клинические критерии сами по себе имеют ограниченную способность точно оценивать прогноз пациента. На сегодняшний день в клинической практике не существует эффективных способов прогнозирования эффективности действия существующих противоопухолевых препаратов для конкретного пациента, которые бы учитывали особенности молекулярного дисбаланса, образующегося при развитии конкретной опухоли. Как следствие, большинство пациентов получают стандартные препараты, выбор которых основан на клинических или морфологических параметрах, таких как стадия заболевания, размер опухоли, агрессивность развития заболевания и др., что зачастую приводит к тому, что пациенты не отвечают на терапию, и рост опухоли продолжается. Развитие персонализированного подхода к лечению раковых заболеваний исходя из молекулярных изменений в организме пациента является актуальной задачей, и данное изобретение призвано расширить круг подходов, применяющихся для ее решения.

Технической проблемой, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка новых подходов к лечению рака молочной железы, в частности, при помощи классификатора, предсказывающего индивидуальный положительный или отрицательный клинический ответ на лечение таксанами при раке молочной железы на основании профилирования экспрессии генов в ткани биоптата опухоли.

Раскрытие изобретения

Технический результат заключается в создании способа прогнозирования клинического ответа на лечение таксанами индивидуальных пациентов с раком молочной железы, основанного на анализе уровней экспрессии 15 генов (экспрессионной подписи).

Предлагаемый способ позволяет предсказывать эффективность ответа на препараты из семейства таксанов, например, паклитаксел или доцетаксел, для больных раком молочной железы по данным, полученным на разных платформах анализа генной экспрессии.

Технический результат достигается за счет создания способа определения клинической эффективности применения по меньшей мере одного таксансодержащего препарата при терапии рака молочной железы у пациента, согласно которому:

(а) измеряют в образце опухолевой ткани пациента уровни экспрессии двух групп генов: CASP8AP2, KIFC1, МСМ5, NUP153, PRKD3, STMN1, SYNCRIP (группа I), и CCND1, EIF4B, HMGCL, MAST4, MRPS30, NFATC4, OCEL1, SYBU (группа II), при этом измерение уровней экспрессии производят при помощи одного из следующих приборов: прибор для секвенирования тотальной РНК, микрочип или прибор для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции;

(б) рассчитывают значение суммы логарифмов абсолютных уровней экспрессии генов, измеренных на этапе (а) (рассчитывают значение генной суммы), при этом уровни экспрессии генов группы I берут с положительным знаком при логарифме абсолютного уровня экспрессии, уровни экспрессии генов группы II берут с отрицательным знаком при логарифме абсолютного уровня экспрессии;

(в) сравнивают полученное значение с пороговым, определенным с использованием указанного прибора для группы пациентов с известным статусом ответа на терапию, и при превышении полученного значения пороговой величины, определяют таксансодержащий препарат как клинически эффективное средство для лечения рака молочной железы у пациента.

Пороговое значение, определяемое в способе по настоящему изобретению, используя группу пациентов с известным статусом ответа на терапию таксанами, зависит от экспериментальной платформы и определенной схемы терапии, включающей в себя таксаны.

В частных вариантах реализации изобретения пороговое значение определяют, рассчитывая долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности применения таксансодержащего препарата у пациентов с известным статусом ответа на данный препарат и минимизируя значение следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов + доля ложноотрицательных результатов.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи платформы микрочипирования Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array, используемым видом терапии является химиотерапия на основе антрациклинов и таксанов, при этом пороговое значение равно -12.5.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи платформы микрочипирования Affymetrix Human Genome U133A Array, используемым видом терапии является паклитаксел и 5-фторурацил доксорубицин и циклофосфамид, при этом пороговое значение равно -4.85.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи платформы микрочипирования Affymetrix Human Genome U133A Array, терапией является 5-фторурацил/эпирубицин/циклофосфамид с доцетакселом/капецитабином (ТХ), при этом пороговое значение равно -4.00.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи платформы секвенирования Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K, терапией является терапия эпирубицином и циклофосфамидом, затем доцетакселом, при этом пороговое значение равно 3.85.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи платформы секвенирования Illumina HiSeq 2500, используемым видом терапии является комбинированная терапия таксанами, при этом пороговое значение равно -4.55.

Исследованиями, предоставляющими исходные данные для данного способа, могут быть мультиомиксное генетическое профилирование: высокопроизводительное профилирование экспрессии генов на уровне мРНК с использованием гибридизации на микрочипах, высокопроизводительное секвенирование нового поколения (использование известных специалистам способов секвенирования полного транскриптома или полногеномного секвенирование тотальной РНК или отдельно выделенной фракции мРНК), ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) в реальном времени. Настоящее изобретение позволяет повысить степень надежности определения клинической эффективности применения таксанов для лечения солидных опухолей у пациентов.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется иллюстрациями, представленными на Фиг. 1-10, которые служат только для цели иллюстрации вариантов осуществления и не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение.

Фиг. 1 - Величины генной суммы, химиотерапия на основе антрациклинов и таксанов, платформа Asymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array.

Фиг. 2 - Кривая рабочей характеристики приемника для величин генной суммы, химиотерапия на основе антрациклинов и таксанов, платформа Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Величина AUC классификатора составляет 0,71. Величина р для t-теста Стьюдента составляет 0,87.

Фиг. 3 - Величины генной суммы, терапия 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом, платформа Affymetrix Human Genome U133A Array.

Фиг. 4 - Кривая рабочей характеристики приемника для величин генной суммы, терапия 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом, платформа Affymetrix Human Genome U133A Array. Величина AUC классификатора составляет 0.78. Величина р для t-теста Стьюдента составляет 4.17*10^-5. 0.78.

Фиг. 5 - Величины генной суммы, 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом, платформа Affymetrix Human Genome U133A Array.

Фиг. 6 - Кривая рабочей характеристики приемника для величин генной суммы, терапия 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом, платформа Affymetrix Human Genome U133A Array. Величина AUC классификатора составляет 0.75. Величина р для t-теста Стьюдента составляет 3.31 * 10^-5.

Фиг. 7 - Величины генной суммы, терапия эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом, платформа Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K.

Фиг. 8 - Кривая рабочей характеристики приемника для величин генной суммы, терапия эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом, платформа Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K. Величина AUC классификатора составляет 0,82. Величина p для т-теста Стьюдента составляет 0,004.

Фиг.9 - Величины генной суммы, комбинированная терапия таксанами, платформа Illumina HiSeq 2500.

Фиг. 10 - Кривая рабочей характеристики приемника для величин генной суммы, терапия таксанами, платформа Illumina HiSeq 2500. Величина AUC классификатора составляет 0,7. Величина р для т-теста Стьюдента составляет 0,46.

Осуществление изобретения

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Под таксанами или препаратами семейства таксанов стоит понимать препараты из следующего списка: паклитаксел, доцетаксел, наб-паклитаксел, кабазитаксел. Под применением или введением таксанов в составе определенного вида терапии в данном изобретении подразумевается применение или введение лекарственного препарата, содержащего таксаны в качестве активного ингредиента, а также дополнительно содержащего эксипиенты (неактивные вещества), например, соли, стабилизаторы, регуляторы кислотности и др. Примерами таких лекарственных препаратов являются, например, разрешенные на территории РФ препараты Taxol, Taxotere или Таксакад. Используемая для реализации предлагаемого способа тест-система представляет собой набор генов, которые в совокупности предсказывают эффективность ответа онкобольного, страдающего раком молочной железы, на препараты из семейства таксанов (например, Taxotere), в том числе и в комбинации с другими видами лечения. Для применения тест-системы необходим набор данных по экспрессии генов, полученный для образца раковой опухоли на экспериментальной платформе микрочипирования или секвенирования нового поколения. Для каждого гена необходим нормализованный уровень экспрессии (сигнал) за вычетом фона в случае микрочипирования и нормализованное количество картированных на данный ген прочтений для секвенирования нового поколения.

В частности, но не ограничиваясь приведенными примерами, настоящее изобретение позволяет предсказывать результативность терапии таксанами по данным генной экспрессии, получаемым на следующих экспериментальных платформах для следующих видов терапии:

1) Химиотерапия на основе антрациклинов и таксанов, платформа микрочипирования Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array.

2) Терапия паклитакселом и 5-фторурацилом доксорубицином и циклофосфамидом, платформа микрочипирования Affymetrix Human Genome U133A Array.

3) Терапия 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом, платформа микрочипирования Affymetrix Human Genome U133A Array.

4) Терапия эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом, платформа микрочипирования Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K.

5) Терапия, включающая таксаны, платформа секвенирования нового поколения Illumina.

При реализации предлагаемого способа используются данные, полученные на вышеуказанных и иных платформах следующим образом:

1) Образец опухолевой ткани пациента, для которого требуется предсказать эффективность терапии таксанами, обрабатывается в соответствии с инструкциями производителя используемой экспериментальной платформы определения генной экспрессии. В частности, обработка может включать в себя следующие шаги: а) фиксация образца замораживанием или с помощью формалина с дальнейшей фиксацией образца путем заливки в парафиновый блок, б) выделение тотальной РНК или фракции мРНК доступным набором реактивов, в) конструирование библиотеки ДНК для анализа генной экспрессии на выбранной экспериментальной платформе путем конверсии РНК в комплементарную ДНК с последующей ПЦР-амплификацией.

2) Полученная библиотека ДНК подвергается экспериментальному анализу с использованием данной платформы, в результате генерируется массив сырых данных генной экспрессии, согласно рекомендациям производителя экспериментальной платформы.

3) Сырые данные генной экспрессии фильтруются от зашумленности и сигналов низкого качества программами, предусмотренными для этого производителями соответствующей экспериментальной платформы, используемой для определения экспрессии генов. Данная стадия может объединяться со следующей в рамках некоторых программных пакетов (например, пакета программ для анализа микрочиповых данных Affy, который объединяет нормализацию и вычитание фона).

4) Очищенные данные генной экспрессии (где возможно) нормализуются с помощью программ, предусмотренных для данных той или иной платформы. Для каждого гена необходим нормализованный сигнал (число прочтений библиотеки РНК-секвенирования, картировавшихся на ген, поделенный на длину гена и на размер библиотеки, затем умноженный на 10⁹, или нормализованный сигнал за вычетом фона в случае микрочипирования). Если программный пакет, используемый для обработки данных конкретной платформы, выдает логарифмированные данные, то процесс обработки данных завершен, в противном случае данные экспрессии дополнительно логарифмируются.

5) После проведенной нормализации рассчитывается величина, предсказывающая ответ пациента на терапию (далее-генная сумма). Генная сумма рассчитывается как сумма логарифмов абсолютных уровней экспрессии по п. 4), где каждому логарифмическому члену присвоен знак, зависящий от того, повышен или понижен уровень экспрессии гена в калибровочных наборах данных для раковых тканей пациентов-ответчиков на терапию, содержащую таксаны, по сравнению с пациентами- неответчиками на терапию таксанами.

Ниже приведен набор генов, используемых для расчета генной суммы.

Здесь и далее в описании настоящего изобретения указанные названия генов означают как сам ген, известная последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI, (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) под соответствующим номером, так и к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Например, ген «VCP» или «человеческий VCP» относится к гену, кодирующему valosin containing protein, последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_007126 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM 007126).

Гены, уровень экспрессии которых повышен у ответчиков по сравнению с неответчиками, участвуют в подсчете генной суммы с положительным знаком при логарифме абсолютного уровня экспрессии, названия генов даны согласно номенклатуре HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC): CASP8AP2, KIFC1, MCM5, NUP153, PRKD3, STMN1, SYNCRIP.

Последовательности данных генов находятся в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под следующими номерами (Таблица 1).

Гены, уровень экспрессии которых снижен у ответчиков по сравнению с неответчиками, участвуют в подсчете генной суммы с отрицательным знаком при логарифме абсолютного уровня экспрессии, названия генов даны согласно номенклатуре HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC): CCND1, EIF4B, HMGCL, MAST4, MRPS30, NFATC4, OCEL1, SYBU.

Последовательности данных генов находятся в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под следующими номерами (Таблица 2).

Таким образом, расчет генной суммы согласно настоящему изобретению, проводится согласно формуле (1): ∑_genes n × log(exp),

где n=1, если уровень экспрессии гена снижен у неответчиков по сравнению с ответчиками, n=-1, если уровень экспрессии гена снижен у ответчиков по сравнению с неответчиками; ехр - абсолютное значение экспрессии гена (в случае нормализации при помощи RMA пакет программ выдает сразу логарифмированное значение абсолютной экспрессии, и дополнительно логарифмирование для суммы не производится).

6) После расчета генной суммы производится сравнение ее полученных значений с пороговой величиной, присущей специфической экспериментальной платформе и специфическому виду терапии. Если величина генной суммы пациента превышает пороговое значение, делают вывод об эффективном ответе пациента на терапию. Если величина генной суммы ниже порогового значения, делают вывод об отсутствии эффективного ответа на терапию. Ниже приведены примеры пороговых значений генной суммы для некоторых экспериментальных платформ и схем терапии, включающих лечение таксанами.

Для успешного предсказания ответа на различные варианты терапии таксанами на различных экспериментальных платформах (например, Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array, Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K и Illumina HiSeq 2500) необходимы как набор генов для расчета генной суммы, так и пороговая величина генной суммы.

Развитие методов анализа данных генной экспрессии приводит к появлению новых экспериментальных платформ. Предлагаемый способ также применим для работы с данными существующих экспериментальных платформ, не упомянутых в примерах, а также платформ, находящихся на стадии разработки, и платформ, которые будут создаваться в будущем. Для применения изобретения для любой из экспериментальных платформ определения генной экспрессии и определения характеристического порогового значения генной суммы, предусмотрена следующая последовательность действий.

А) На основании экспериментальных данных, полученных на анализируемой платформе, создается массив данных генной экспрессии, определенной для пациентов с раком молочной железы с известным статусом ответа на определенный вид терапии таксанами (одним из препаратов группы).

Б) Полученный массив данных генной экспрессии подвергается обработке в соответствии с рекомендациями производителя платформы для очистки сырых данных от шума и первичной нормализации, аналогично пунктам 3)-4) в описании выше.

В) Для каждого пациента производится нормализация уровня экспрессии каждого гена, аналогично пункту 4) в описании выше.

Г) Для каждого пациента рассчитывается величина генной суммы.

Д) Для набора величин генной суммы пациентов с известным статусом ответа рассчитывается величина AUC (для графика рабочей характеристики приемника).

Е) При получении величин AUC, превышающих значение 0.7, возможно применение предлагаемой генной подписи по пункту 5) в описании выше для данной платформы с данным видом терапии таксанами.

Ж) На основании рассчитанных генных сумм для пациентов с известным исходом терапии таксанами данного типа выбирается пороговая величина генной суммы. Выбор пороговой величины производится таким образом, чтобы частота ложно идентифицированных ответчиков (для которых данная терапия на самом деле была успешна) была в три раза меньше частоты ложно идентифицированных неответчиков (для которых при данной терапии произошла прогрессия болезни) (минимизируют значение следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов + доля ложноотрицательных результатов). Возможно также использование субоптимальной пороговой величины, не отличающейся по значению от истинного минимума более, чем на 10% от количества пациентов с известным статусом ответа (допустимое отклонение порогового значения ±10%).

З) Для пациента, которому необходимо предсказать вероятность эффективности исследуемого типа терапии, анализируются данные генной экспрессии и рассчитывается генная сумма в соответствии с пунктом 5.

И) Производится сравнение полученной для индивидуального пациента генной суммы с пороговой величиной, полученной на этапе Ж). Если величина генной суммы пациента превышает пороговое значение, изобретение предсказывает эффективный ответ пациента на терапию. Если величина генной суммы ниже порогового значения, изобретение предсказывает отсутствие эффективного ответа на терапию.

В отличие от приведенных выше аналогов, настоящее изобретение основывается на достоверных отличиях в экспрессии генов между ответчиками и неответчиками на различные виды терапии таксанами. Ответ на таксаны может проявляться в разной степени. По международному клиническому стандарту RECIST (http://chemoth.com/recist), ответ ракового больного на терапию классифицируется на четыре типа:

1) Полный ответ - все опухоли исчезли после лечения.

2) Частичный ответ - опухоль наибольшего диаметра уменьшилась более чем на 30%.

3) Стабилизация - существенных изменений количества и размера опухолей не наблюдалось.

4) Прогрессия заболевания - увеличение опухоли наибольшего диаметра более чем на 20%.

В соответствии с предлагаемым способом неответчиком считается пациент с прогрессией заболевания, тогда как все остальные типы ответа считаются успешным ответом на терапию.

Другим способом измерения ответа является патологический полный ответ (https://www.сancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/pathologic-complete-response). Ответ ракового больного классифицируется на два типа:

1) Патологический полный ответ - отсутствие опухолевых клеток в образце биопсии или образце, полученном в процессе операции по удалению опухоли.

2) Отсутствие патологического полного ответа - наличие опухолевых клеток в образце биопсии или образце, полученном в процессе операции по удалению опухоли.

В соответствии с предлагаемым способом неответчиком считается пациент с отсутствием патологического полного ответа, тогда как его наличие считается успешным ответом на терапию.

Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Примеры реализации изобретения для данных, полученных на некоторых экспериментальных платформах.

Пример 1. Оценка ответа на химиотерапию на основе антрациклинов и таксанов, полученных с использованием микрочипов Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array

1) Обработка биологического материала и загрузка на микрочип.

Образец опухоли пациента с раком молочной железы, для которого необходимо предсказать эффективность химиотерапии на основе антрациклинов и таксанов, замораживали в жидком азоте, затем гомогенизировали и использовали для выделения РНК с помощью комплекта реактивов RNAeasy Kit (Qiagen, Valencia, CA) согласно инструкциям производителя. Полученный препарат РНК конвертировали в форму кДНК, затем библиотека кДНК для гибридизации загружалась на микрочип и гибридизовалась в соответствии с инструкциями производителя, затем осуществлялось измерение сигналов генной экспрессии.

2) Обработка и нормализация сырых данных генной экспрессии.

Сырые данные, полученные после анализа пробы на микрочипе и выдаваемые программным обеспечением Affymetrix в формате CEL-файлов, очищали от шума и нормализовали с помощью пакета программ affy. Нормализация проводилась при помощи алгоритма RMA. В том случае, если одному гену соответствовало несколько олигонуклеотидных зондов на микрочипе, сигнал для данного гена рассчитывался как среднее арифметическое сигналов на каждом из зондов. После нормализации суммировали нормализованные логарифмы экспрессии - рассчитывали генную сумму, которая составила -7.4 для данного образца. Эта величина сравнивалась с пороговой величиной для предсказания ответа пациента на таксаны.

3) Сравнение со значениями пороговой величины.

Выбор пороговой величины для сравнения с генной суммой производили для конкретного типа терапии и платформы. Предлагаемая тест-система позволяет предсказывать ответ на разнообразные курсы химиотерапии, включающие в себя таксаны, в том числе на химиотерапию на основе антрациклинов и таксанов. На данной экспериментальной платформе пороговая величина генной суммы составляет -12.5 для данной терапии (при данном значении следующая сумма не отличается от минимальной больше, чем на 10%: 3 * доля ложноположительных результатов + доля ложноотрицательных результатов).

4) Предсказание статуса ответа пациента на химиотерапию на основе антрациклинов и таксанов.

После выбора пороговой величины производили сравнение полученной генной суммы для индивидуального образца (-7.4) с пороговыми величинами. Генная сумма оказалась выше пороговой величины, поэтому для данного пациента был предсказан эффективный ответ на терапию, содержащую таксаны и антрациклины. Предсказанный ответ на терапию совпал с действительным.

Пример 2. Оценка ответа на терапию таксанами для данных, полученных с использованием микрочипов Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K

1) Обработка биологического материала и загрузка на микрочип.

Образец опухоли пациента с раком молочной железы, для которого требовалось предсказать эффективность терапии эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом, фиксировали формалином и парафинизировали, затем гомогенизировали и выделяли РНК с помощью комплекта реактивов Qiagen RNeasy kit согласно инструкциям производителя. Полученный препарат РНК конвертировали в форму кДНК, затем библиотека кДНК для гибридизации загружалась на микрочип и гибридизовалась в соответствии с инструкциями производителя, затем осуществлялось измерение сигналов генной экспрессии.

2) Обработка данных и расчет генной суммы.

Величины сигналов, полученных на микрочипе, подвергали обработке ПО производителя чипа. После нормализации, производили расчет генной суммы. Данную величину (0.42) сравнивали с пороговой величиной для предсказания ответа пациента на терапию эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом для данной платформы.

3) Предсказание статуса ответа пациента на терапию, включающую в себя таксаны. После расчета генной суммы производили сравнение полученной генной суммы с

пороговой величиной, которая для данной экспериментальной системы и данного вида терапии составила 3.85 (при данном значении следующая сумма не отличается от минимальной больше, чем на 10%: 3 * доля ложноположительных результатов+доля ложноотрицательных результатов). Генная сумма оказалась ниже значения пороговой величины, поэтому для данного пациента было предсказано отсутствие ответа на терапию. Предсказанный ответ на терапию совпал с действительным.

Пример 3. Оценка ответа на таксаны для данных, полученных с использованием платформы секвенирования нового поколения Illumina HiSeq 2500.

1) Обработка биологического материала.

Образец опухоли рака молочной железы пациента, для которого необходимо было предсказать эффективность комбинированной терапией таксанами, фиксировали формалином и парафинизировали, затем гомогенизировали и выделяли РНК с помощью комплекта реактивов RNeasy FFPE Kit (Qiagen, Hilden, D) и раствора Deparaffmization Solution (Qiagen, Hilden, D) в соответствии с рекомендациями производителей. Подготовку библиотеки для секвенирования осуществляли с помощью системы Ovation Human FFPE RNA-seq Library System, производитель Nugen. Количество РНК для создания библиотеки определяли согласно с инструкциями производителя набора Ovation Human FFPE RNA-seq Library System.

2) Обработка сырых данных генной экспрессии и вычисление генной суммы.

Полученные чтения в сырых файлах fastq картировали на геном человека с помощью программы-картировщика STAR, с использованием версии генома для картирования GRCh38. В других приложениях настоящего изобретения, возможно картирование также и на другие версии сборки генома человека. При этом суммарное число уникально картированных чтений должно составить не менее 1.2 миллиона. Далее полученные данные о числе чтений, картированных на каждый ген делились на длину этого гена в парах оснований, затем на длину библиотеки и умножались на 10⁹.

3) Предсказание статуса ответа пациента на терапию таксанами.

После расчета генной суммы для образца пациента провели сравнение полученного результата с пороговой величиной, которая для данного типа заболевания, используемой терапии и экспериментальной платформы составляет 1.98 (при данном значении следующая сумма не отличается от минимальной больше, чем на 10%: 3 * доля ложноположительных результатов + доля ложноотрицательных результатов). Поскольку генная сумма для конкретного биообразца оказалась выше пороговой величины, данный пациент был предсказан как ответчик. Предсказанный ответ на терапию совпал с действительным.

Предлагаемый способ может быть также использован для оценки ответа на терапию таксанами для данных, полученных с использованием иной платформы профилирования генной экспрессии.

Развитие экспериментальных методов приводит к появлению новых платформ анализа генной экспрессии. Предлагаемая тест-система в том числе применима и для работы с данными генной экспрессии, полученными как на платформах, находящихся на стадии разработки, так и для еще не разработанных платформ. При этом к экспериментальной платформе предъявляются следующие требования для возможности применения настоящего изобретения:

1) Платформа должна предоставлять для каждого измеряемого гена сигналы экспрессии, пропорциональные концентрации мРНК данного гена или его белкового продукта в анализируемой ткани.

2) Среди генов, экспрессия которых измеряется с использованием данной платформы, должны присутствовать все гены, по которым рассчитывается генная сумма в рамках настоящего изобретения.

При этом для работы с платформой предусмотрена следующая последовательность действий:

А) На основании имеющихся экспериментальных данных, полученных на данной платформе, создается массив данных генной экспрессии пациентов с раком молочной железы с известным статусом ответа на терапию таксанами, таким образом, чтобы массив содержал не менее 20 пациентов, из которых не менее 4 ответчиков и не менее 4 неответчиков. Статус ответа определяется по клиническим стандартам RECIST или по патологическому полному ответу (предпочтительнее). Для успешной работы предлагаемого изобретения, неответчиками следует считать пациентов с прогрессией заболевания, тогда как другие типы ответа (стабилизация болезни, частичный и полный ответ) считаются успешным ответом на терапию. К ответчикам также стоит относить всех пациентов, ответ которых на терапию был отнесен к полному патологическому, а к неответчикам - всех пациентов, не достигших полного патологического ответа. Статус ответа стоит собирать только по одной из двух описанных здесь схем.

Б) Полученный массив данных генной экспрессии подвергается обработке в соответствии с рекомендациями производителя платформы (в общем случае это очистка сырых данных от шума и первичная нормализация).

В) Для каждого биообразца рассчитывается величина генной суммы.

Г) Для имеющихся данных по величинам генной суммы для пациентов с известным статусом ответа, рассчитывается величина AUC (для графика рабочей характеристики приемника).

Д) При получении величин AUC>0.7 возможно применение предлагаемой генной подписи для данной платформы с данным видом терапии таксанами для рака молочной железы.

Е) На основании рассчитанных генных сумм для пациентов с известным исходом терапии таксанами, выбирается пороговая величина генной суммы. Для данной пороговой величины все пациенты, чьи генные суммы оказываются выше этой величины, идентифицируются как ответчики, тогда как все остальные пациенты считаются неответчиками. Выбор пороговой величины производится таким образом, чтобы частота ложно идентифицированных ответчиков была в три раза меньше частоты ложно идентифицированных неответчиков (суммарное количество ошибок первого рода (ложно идентифицированный ответчик) и второго рода (ложно идентифицированный неответчик) было минимальным или не отличалась от минимального больше, чем на 10%, при условии, что ошибкам первого рода придается вес втрое превышающий вес ошибок второго рода).

Ж) Для пациента данной нозологии, которому требуется предсказать эффективность терапии таксанами, анализируются данные и рассчитывается генная сумма в соответствии спп.Б)-В)-

Пример 4. Работа изобретения с данными, полученными на пациентах с известным статусом клинического ответа на терапию таксанами.

4.1. Микрочип Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array, химиотерапия на основе антрациклинов и таксанов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1) Пациенты и терапия. Для данного примера были использованы данные пациентов с раком молочной железы, опубликованные в базе данных GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE28844). Данные взяты из набора данных с идентификационным номером GSE28844. Пациенты с раком молочной железы проходили химиотерапию на основе антрациклинов и таксанов, после чего измерялся статус ответа по стандартам Miller and Payne, который затем проецировался на патологический полный ответ (степени 4 и 5 были отнесены к патологическому полному ответу). Массив данных включает в себя 8 ответчиков и 23 неответчика.

2) Обработка биологического материала для платформы. Образцы опухоли, взятые до лечения, замораживались в жидком азоте непосредственно после взятия, затем лизировались и препараты РНК выделялись с помощью комплекта реактивов RNeasy minikit from Qiagen (Qiagen, Chatswort.CA) в соответствии с инструкциями производителя. Полученные библиотеки РНК обрабатывались в соответствии с инструкциями производителя платформы микрочипирования.

3) Обработка данных генной экспрессии и расчет генной суммы. Сырые данные, полученные после анализа пробы на микрочипе, очищались от шума и нормализовались с помощью пакета Affy (язык программироваия R, метод очистки и нормализации RMA). В том случае, когда одному гену соответствовало несколько олигонуклеотидных проб на микрочипе, сигнал для данного гена рассчитывался как среднее арифметическое сигналов на каждой из проб. В том случае, когда одна проба соответствовала нескольким генам, при расчете величины экспрессии каждого гена использовалась эта величина. В результате получались нормализованные логарифмированные значения экспрессий. После нормализации суммировались нормализованные логарифмы экспрессии (рассчитывалась генная сумма).

4) Предсказание статуса ответа пациента на химиотерапию на основе антрациклинов и таксанов. После расчета генной суммы производилось сравнение полученной генной суммы с пороговой величиной, равной -12.50. Если генная сумма оказывалась выше пороговой величины, данный пациент предсказывался как ответчик, в противном случае пациент предсказывался как неответчик.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1) Расчет генной суммы. Рассчитанные величины генной суммы для пациентов, а также известный и предсказанный статусы ответа на химиотерапию на основе антрациклинов и таксанов по данным платформы Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array, приведены в Таблице 3.

Распределение величин генной суммы для пациентов с указанием их известного статуса ответа на химиотерапию на основе антрациклинов и таксанов представлено на Фиг. 1.

2) Оценка успешности генной суммы как величины, предсказывающей ответ пациентов на химиотерапию на основе антрациклинов и таксанов. Для рассчитанных значений генной суммы и известных статусов ответа пациентов на таксаны была построена кривая рабочей характеристики приемника (Фиг. 2). Величина AUC генной суммы как классификатора известного статуса ответа составляет 0.71. Величина р для t-теста Стьюдента между выборкой ответчиков и неответчиков составляет 0,87.

3) Нахождение пороговой величины. Для нахождения пороговой величины производилась минимизация значения следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). В таблице 4 представлены значения предсказаний генной суммы для разных пороговых величин.

4) Предсказание статуса ответа. После предсказания статуса ответа пациентов была построена таблица ошибок системы (Таблица 5). В ячейках таблицы - число пациентов данной группы.

Доля ошибок составила 16%.

4.2. Микрочип Affymetrix Human Genome U133A Array, терапия паклитакселом и 5-фторурацилом доксорубицином и циклофосфамидом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1) Пациенты и терапия. Для данного примера были использованы данные пациентов с раком молочной железы, опубликованные в базе данных GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc^:=gse20271). Данные экспрессий и ответа взяты из набора данных с идентификационным номером GSE20271 (Vera-Ramirez и др.2013). Пациенты с раком молочной железы проходили терапию паклитакселом и 5-фторурацилом доксорубицином и циклофосфамидом, после чего измерялся статус патологического полного ответа. Массив данных включает в себя 22 ответчика и 94 неответчика.

2) Обработка биологического материала для платформы. Образцы опухоли, взятые до лечения, лизировались непосредственно после взятия и препараты РНК выделялись с помощью комплекта реактивов Qiagen RNeasy kit в соответствии с инструкциями производителя комплекта. Полученные библиотеки РНК обрабатывались в соответствии с инструкциями производителя микрочипа.

3) Обработка данных, получаемых с платформы, и расчет генной суммы.

Сырые данные, полученные после анализа пробы на микрочипе, очищались от шума и нормализовались с помощью пакета Affy (язык программирования R, функция для очистки и нормализации RMA). В том случае, когда одному гену соответствовало несколько олигонуклеотидных проб на микрочипе, сигнал для данного гена рассчитывался как среднее геометрическое сигналов на каждой из проб. В том случае, когда одна проба соответствовала нескольким генам, при расчете величины экспрессии каждого гена использовалась эта величина. После нормализации суммировались нормализованные логарифмы экспрессии (рассчитывалась генная сумма).

4) Предсказание статуса ответа пациента на таксаны. После расчета генной суммы производилось сравнение полученной генной суммы с пороговой величиной, равной -4.85. Если генная сумма оказывалась выше пороговой величины, данный пациент предсказывался как ответчик, в противном случае пациент предсказывался как неответчик на терапию паклитакселом и 5-фторурацилом доксорубицином и циклофосфамидом.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1) Расчет генной суммы. Рассчитанные величины генной суммы для пациентов, а также известный и предсказанный статусы ответа на комбинированную терапию, приведены в Таблице 6.

Распределение величин генной суммы для пациентов с указанием их известного статуса ответа на таксаны представлено на Фиг. 3.

2) Оценка успешности генной суммы как величины, предсказывающей ответ пациентов на таксаны. Для рассчитанных значений генной суммы и известных статусов ответа пациентов на терапию паклитакселом и 5-фторурацилом доксорубицином и циклофосфамидом была построена кривая рабочей характеристики приемника (Фиг. 4). Величина AUC генной суммы как классификатора известного статуса ответа составляет 0.78. Величина р для t-теста Стьюдента между выборкой ответчиков и неответчиков составляет 4.17* 10^-5.

3) Нахождение пороговой величины. Для нахождения пороговой величины производилась минимизация значения следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). В таблице 7 представлены значения предсказаний генной суммы для разных пороговых величин.

4) Предсказание статуса ответа. После предсказания статуса ответа пациентов была построена таблица ошибок системы (Таблица 8). В ячейках таблицы - число пациентов данной группы.

Доля ошибок составила 19%.

4.3. Микрочип Affymetrix Human Genome U133A Array, терапия 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1) Пациенты и терапия. Для данного примера были использованы данные пациентов рака молочной железы, опубликованные в базе данных GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE42822). Данные взяты из набора данных с идентификационным номером GSE42822 (Pusztai и др., 2014). Пациенты с раком молочной железы проходили терапию 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом, после чего измерялся статус патологического полного ответа. Массив данных включает в себя 37 ответчиков и 54 неответчика.

2) Обработка биологического материала для платформы. Образцы опухоли, взятые до лечения, фиксировали формалином и парафинизировали, затем гомогенизировали и выделяли РНК с помощью комплекта реактивов Qiagen RNeasy kit в соответствии с инструкциями производителя комплекта. Полученные библиотеки РНК обрабатывались в соответствии с инструкциями производителя микрочипа.

3) Обработка данных, получаемых с платформы, и расчет генной суммы. Сырые данные, полученные после анализа пробы на микрочипе, очищались от шума и нормализовались с помощью пакета Affy (язык программирования R, функция для очистки и нормализации RMA). В том случае, когда одному гену соответствовало несколько олигонуклеотидных проб на микрочипе, сигнал для данного гена рассчитывался как среднее геометрическое сигналов на каждой из проб. В том случае, когда одна проба соответствовала нескольким генам, при расчете величины экспрессии каждого гена использовалась эта величина. После нормализации суммировались нормализованные логарифмы экспрессии (рассчитывалась генная сумма).

4) Предсказание статуса ответа пациента на терапию 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом. После расчета генной суммы производилось ее сравнение с пороговой величиной, равной -4.00. Если генная сумма оказывалась выше пороговой величины, данный пациент предсказывался как ответчик, в противном случае пациент предсказывался как неответчик.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1) Расчет генной суммы. Рассчитанные величины генной суммы для пациентов, а также известный и предсказанный статусы ответа на терапию 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом, приведены в Таблице 9.

Распределение величин генной суммы для пациентов с указанием их известного статуса ответа на терапию 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом представлено на Фиг. 5.

2) Оценка успешности генной суммы как величины, предсказывающей ответ пациентов на таксаны. Для рассчитанных значений генной суммы и известных статусов ответа пациентов на терапию 5-фторурацилом/эпирубицином/циклофосфамидом с доцетакселомом/капецитабиномом была построена кривая рабочей характеристики приемника (Фиг. 6). Величина AUC генной суммы как классификатора известного статуса ответа составляет 0.75. Величина р для t-теста Стьюдента между выборкой ответчиков и неответчиков составляет 3.31 * 10^-5.

3) Нахождение пороговой величины. Для нахождения пороговой величины производилась минимизация значения следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). Значения предсказаний генной суммы для разных порогов представлены в Таблице 10.

4) Предсказание статуса ответа. После предсказания статуса ответа пациентов была построена таблица ошибок системы (Таблица 11). В ячейках таблицы - число пациентов данной группы.

Доля ошибок составила 35%.

4.4. Микрочип Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K, терапия терапию эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1) Пациенты и терапия. Для данного примера были использованы данные пациентов рака молочной железы, опубликованные в базе данных GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE21974). Данные взяты из набора данных с идентификационным номером GSE21974 (Stickeler и др., 2014). Пациенты с раком молочной железы проходили терапию эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом, после чего измерялся статус патологического полного ответа. Массив данных включает в себя 10 ответчиков и 22 неответчика.

2) Обработка биологического материала для платформы. Образцы опухоли, взятые до лечения, фиксировали формалином и парафинизировали, затем гомогенизировали и выделяли РНК с помощью комплекта реактивов Qiagen RNeasy kit (QIAGEN, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителя комплекта. Полученные библиотеки РНК обрабатывались в соответствии с инструкциями производителя микрочипа.

3) Обработка данных, получаемых с платформы, и расчет генной суммы.

Сырые данные, полученные после анализа пробы на микрочипе, очищались от шума и нормализовались с помощью пакета от производителя микрочипа. В том случае, когда одному гену соответствовало несколько олигонуклеотидных проб на микрочипе, сигнал для данного гена рассчитывался как среднее геометрическое сигналов на каждой из проб. В том случае, когда одна проба соответствовала нескольким генам, при расчете величины экспрессии каждого гена использовалась эта величина. После нормализации суммировались нормализованные логарифмы экспрессии (рассчитывалась генная сумма).

4) Предсказание статуса ответа пациента на терапию эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом. После расчета генной суммы производилось ее сравнение с пороговой величиной, равной -1.00. Если генная сумма оказывалась выше пороговой величины, данный пациент предсказывался как ответчик, в противном случае пациент предсказывался как неответчик.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1) Расчет генной суммы. Рассчитанные величины генной суммы для пациентов, а также известный и предсказанный статусы ответа на терапию эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом, приведены в Таблице 12.

Распределение величин генной суммы для пациентов с указанием их известного статуса ответа на терапию эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом представлено на Фиг. 7.

2) Оценка успешности генной суммы как величины, предсказывающей ответ пациентов на таксаны. Для рассчитанных значений генной суммы и известных статусов ответа пациентов на терапию эпирубицином, циклофосфамидом и доцетакселом была построена кривая рабочей характеристики приемника (Фиг. 8). Величина AUC генной суммы как классификатора известного статуса ответа составляет 0.82. Величина р для t-теста Стьюдента между выборкой ответчиков и неответчиков составляет 0.004.

3) Нахождение пороговой величины. Для нахождения пороговой величины производилась минимизация значения следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). Значения предсказаний генной суммы для разных порогов представлены в Таблице 13.

4) Предсказание статуса ответа. После предсказания статуса ответа пациентов была построена таблица ошибок системы (Таблица 14). В ячейках таблицы - число пациентов данной группы.

Доля ошибок составила 16%.

4.5. Платформа секвенирования нового поколения Illumina HiSeq 2500, комбинированная терапия таксанами. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1) Пациенты и терапия. Для данного примера были использованы данные пациентов глиобластомы, собранные компанией Oncobox. Пациенты проходили комбинированную терапию таксанами, после чего измерялся статус ответа по стандартам RECIST. Массив данных включает в себя 10 ответчиков и 2 неответчика.

2) Обработка биологического материала для платформ. Образцы опухоли, взятые до лечения, фиксировали формалином и парафинизировали, затем гомогенизировали их и выделяли препараты РНК с помощью комплекта реактивов RNeasy FFPE Kit (Qiagen, Hilden, D) и раствора Deparaffinization Solution (Qiagen, Hilden, D) в соответствии с инструкциями производителя. Подготовка библиотек для секвенирования осуществлялась с помощью специфичной к цепи системы Ovation Human FFPE RNA-seq Library System, производитель Nugen. Для создания библиотек использовалось по 250 нг тотальной РНК.

3) Обработка данных, получаемых с платформы. Полученные чтения в сырых файлах fastq картировались на референсный геном версии GRCh38 программой -картировщиком STAR. Далее полученные данные о количестве прочтений, картированных на каждый ген, делились на длину гена и на размер библиотеки, затем умножались на 10⁹. Затем логарифмированные нормированные значения использовались для подсчета генной суммы.

4) Предсказание статуса ответа пациента на таксаны. После расчета генной суммы проводилось ее сравнение с пороговой величиной, равной -4.55. Если генная сумма оказывалась выше пороговой величины, данный пациент предсказывался как ответчик, в противном случае пациент предсказывался как неответчик.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1) Расчет генной суммы. Рассчитанные величины генной суммы для пациентов, а также известный и предсказанный статусы ответа на комбинированную терапию таксанами, приведены в Таблице 15.

Распределение величин генной суммы для пациентов с указанием их известного статуса ответа на таксаны представлено на Фиг. 9.

2) Оценка успешности генной суммы как величины, предсказывающей ответ пациентов на таксаны. Для рассчитанных значений генной суммы и известных статусов ответа пациентов на таксаны была построена кривая рабочей характеристики приемника (Рисунок 10). Величина AUC генной суммы как классификатора известного статуса ответа составляет 0,7. Величина р для t-теста Стьюдента между выборкой ответчиков и неответчиков составляет 0,391.

3) Нахождение пороговой величины. Для нахождения пороговой величины производилась минимизация значения следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR)+доля ложноотрицательных результатов (FNR). Значения предсказаний генной суммы для разных порогов представлены в Таблице 16.

4) Предсказание статуса ответа. После предсказания статуса ответа пациентов была построена таблица ошибок системы (Таблица 17). В ячейках таблицы- число пациентов данной группы.

Доля ошибок составила 17%.

Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает новый подход к лечению онкологических заболеваний с использованием препаратов из семейства таксанов, на основании профилирования экспрессии генов в ткани биоптата опухоли. Заявляемый способ позволяет предсказывать эффективность ответа на препараты из семейства таксанов (например, паклитаксел или доцетаксел) для больных раком молочной железы по данным, полученным на разных платформах анализа генной экспрессии. В частности, могут быть использованы платформы получения экспериментальных данных генной экспрессии, например, микрочипы Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array и Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K, платформа секвенирования нового поколения Illumina HiSeq 2500, для разных видов терапии, содержащей таксаны (несколько вариантов комбинированной терапии). Возможно также применение способа для работы с новыми и экспериментальными платформами. Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к медицине. Раскрыт способ определения клинической эффективности применения по меньшей мере одного таксансодержащего препарата при терапии рака молочной железы у пациента. Раскрытый способ включает следующие этапы: (а) измеряют в образце опухолевой ткани пациента уровни экспрессии двух групп генов: CASP8AP2, KIFC1, МСМ5, NUP153, PRKD3, STMN1, SYNCRIP (группа I) и CCND1, EIF4B, HMGCL, MAST4, MRPS30, NFATC4, OCEL1, SYBU (группа II), при этом измерение уровней экспрессии производят при помощи одного из следующих приборов: прибор для секвенирования тотальной РНК, микрочип или прибор для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; (б) рассчитывают значение суммы логарифмов абсолютных уровней экспрессии генов, измеренных на этапе (а), при этом уровни экспрессии генов группы I берут с положительным знаком при логарифме абсолютного уровня экспрессии, уровни экспрессии генов группы II берут с отрицательным знаком при логарифме абсолютного уровня экспрессии; (в) сравнивают полученное значение с пороговым, определенным с использованием указанного прибора для группы пациентов с известным статусом ответа на терапию, и при превышении полученного значения пороговой величины определяют таксансодержащий препарат как клинически эффективное средство для лечения рака молочной железы у пациента. Предлагаемый способ позволяет предсказывать эффективность ответа на препараты из семейства таксанов, например паклитаксел или доцетаксел, для больных раком молочной железы по данным, полученным на разных платформах анализа генной экспрессии. 6 з.п. ф-лы, 10 ил., 17 табл., 4 пр.

1. Способ определения клинической эффективности применения по меньшей мере одного таксансодержащего препарата при терапии рака молочной железы у пациента, включающий следующие этапы:

(а) измеряют в образце опухолевой ткани пациента уровни экспрессии двух групп генов: CASP8AP2, KIFC1, МСМ5, NUP153, PRKDS, STMN1, SYNCRIP (группа I) и CCND1, EIF4B, HMGCL, MAST4, MRPS30, NFATC4, ОСЕL1, SYBU (группа II), при этом измерение уровней экспрессии производят при помощи одного из следующих приборов: прибор для секвенирования тотальной РНК, микрочип или прибор для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции;

(б) рассчитывают значение суммы логарифмов абсолютных уровней экспрессии генов, измеренных на этапе (а), при этом уровни экспрессии генов группы I берут с положительным знаком при логарифме абсолютного уровня экспрессии, уровни экспрессии генов группы II берут с отрицательным знаком при логарифме абсолютного уровня экспрессии;

(в) сравнивают полученное значение с пороговым, определенным с использованием указанного прибора для группы пациентов с известным статусом ответа на терапию, и при превышении полученного значения пороговой величины определяют таксансодержащий препарат как клинически эффективное средство для лечения рака молочной железы у пациента.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что пороговое значение определяют, рассчитывая долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности применения таксансодержащего препарата у пациентов с известным статусом ответа на данный препарат и минимизируя значение следующей суммы: 3 × доля ложноположительных результатов + доля ложноотрицательных результатов.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи платформы микрочипирования Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array, используемым видом терапии является химиотерапия на основе антрациклинов и таксанов, при этом пороговое значение равно -12.5.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи платформы микрочипирования Affymetrix Human Genome U133А Array, используемым видом терапии является паклитаксел и 5-фторурацил доксорубицин и циклофосфамид, при этом пороговое значение равно -4.85.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи платформы микрочипирования Affymetrix Human Genome U133A Array, терапией является 5-фторурацил/эпирубицин/циклофосфамид с доцетакселом/капецитабином (ТХ), при этом пороговое значение равно -4.00.

6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи платформы секвенирования Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K, терапией является терапия эпирубицином и циклофосфамидом, затем доцетакселом, при этом пороговое значение равно 3.85.

7. Способ по п. 1, в котором измерение уровней экспрессии генов производят при помощи платформы секвенирования Illumina HiSeq 2500, используемым видом терапии является комбинированная терапия таксанами, при этом пороговое значение равно -4.55.