ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ДОСТАВКА БИОМОЛЕКУЛ ДЛЯ ИНДУКЦИИ ТОЛЕРАНТНОСТИ Российский патент 2021 года по МПК C12N5/78 A61K35/15 A61K35/17 A61P37/02 

ПЕРЕКРЕТСНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Эта заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США с № 62/331384, поданной 3 мая 2016 года, которая включена таким образом посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ.

Настоящее изобретение в целом относится к способам подавления иммунного ответа или индукции толерантности путем доставки соединения в клетку путем пропускания клеточной суспензии через деформирующее клетки сужение.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Нежелательные иммунные ответы способствуют аутоиммунитету, отторжению трансплантата, аллергии и ответам против лекарственных средств. Аутоиммунитет развивается, когда в организме возрастает аутоиммунная реакция, как правило, в результате дисрегулированного иммунного ответа против аутоантигенов. Аутоиммунные заболевания включают, например, диабет типа I, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, аутоиммунную гемолитическую анемию и рассеянный склероз. Патогенные иммунные реакции после трансплантации органа от донора в принимающем организме могут привести к отторжению трансплантата и снижению выживаемости пациентов. Кроме того, нежелательные иммунные ответы против пищевых антигенов и антигенов окружающей среды приводят к аллергическим заболеваниям, таким как астма, пищевая аллергия и атопический дерматит. Поэтому подходы к установлению иммунологической толерантности к антигену являются объектом интенсивной терапевтической разработки.

Существующие внутриклеточные способы доставки являются неэффективными при модуляции фенотипа или функции клеток, чтобы индуцировать антигенспецифическую толерантность. Таким образом, существует неудовлетворенная потребность в методах внутриклеточной доставки, которые могут загружать антиген и толерогенные факторы (индуцирующие иммунологическую толерантность факторы; толерогены) в цитоплазму клеток и стимулировать мощный ответ в виде иммуносупрессии для лечения патогенных иммунных реакций, лежащих в основе аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантата. Ссылки, которые описывают способы использования микрофлюидных сужений для доставки соединений в клетки, включают WO2013059343, WO2015023982, WO2016070136, WO2016077761 и PCT/US2016/13113.

Все приведенные здесь ссылки, включая заявки на патенты и их публикации, включены посредством ссылки во всей своей полноте.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящим изобретением обеспечивается способ индукции толерантности к антигену у индивидуума, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и/или толерогенный фактор проникают в иммунную клетку, причем образуется толерогенная (вызывающая иммунологическую толерантность) иммунная клетка, и введение индивидууму иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления толерогенная иммунная клетка способна индуцировать толерантность к антигену, например, в результате представления указанного антигена указанной толерогенной иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует активность и/или экспрессию костимулирующей молекулы, модулирует активность и/или экспрессию иммуносупрессорной (вызывающей иммуносупрессию) молекулы, модулирует активность и/или экспрессию молекулы воспаления и/или модулирует активность другой иммунной клетки.

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ подавления иммунного ответа у индивидуума, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и/или толерогенный фактор проникают в иммунную клетку, причем образуется иммуносупрессорная иммунная клетка, и введение индивидууму иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления представление указанного антигена указанной иммуносупрессорной иммунной клеткой подавляет иммунный ответ на антиген.

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ индукции толерантности к антигену у индивидуума, включающий введение индивидууму иммунной клетки, причем иммунная клетка содержит антиген и/или толерогенный фактор, причем антиген и толерогенный фактор были введены в иммунную клетку путем пропускания иммунной клетки через сужение, причем указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызвав нарушение в клетке, так что антиген и толероген проникли в иммунную клетку.

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ подавления иммунного ответа у индивидуума, включающий введение индивидууму иммунной клетки, причем иммунная клетка содержит антиген и/или толерогенный фактор, причем антиген и толерогенный фактор были введены в иммунную клетку путем пропускания иммунной клетки через сужение, причем указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызвав нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор проникли в иммунную клетку.

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ образования толерогенной иммунной клетки, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в иммунную клетку, тем самым образуя толерогенную иммунную клетку.

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ образования иммуносупрессорной иммунной клетки, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в иммунную клетку, тем самым образуя иммуносупрессорную иммунную клетку.

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ образования толерогенной антигенпредставляющей (антигенпрезентирующей) иммунной клетки, в котором толерогенную иммунную клетку дополнительно пропускают через второе сужение, причем указанное второе сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется толерогенной иммунной клеткой.

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ образования иммуносупрессорной антигенпредставляющей иммунной клетки, в котором иммуносупрессорную иммунную клетку дополнительно пропускают через второе сужение, причем указанное второе сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется иммуносупрессорной иммунной клеткой.

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ образования толерогенной антигенпредставляющей клетки, в котором антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в антигенпредставляющую клетку. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула). В некоторых вариантах осуществления антигенпредставляющая клетка образуется in vitro или in vivo до введения иммуносупрессорной молекулы.

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ образования иммуносупрессорной антигенпредставляющей клетки, в котором антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в антигенпредставляющую клетку. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула). В некоторых вариантах осуществления антигенпредставляющая клетка образуется in vitro или in vivo до введения толерогенного фактора.

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ доставки толерогенного фактора, который создает толерогенный фенотип в иммунной клетке, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в клетку, причем указанная клеточная суспензия соприкасается с толерогенным фактором. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула).

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ доставки толерогенного фактора, который создает иммуносупрессорный фенотип в иммунной клетке, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор, который создает иммуносупрессорный фенотип, проникает в клетку, причем указанная клеточная суспензия соприкасается с толерогенным фактором. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула).

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ подавления иммунного ответа у индивидуума, включающий пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в иммунную клетку, пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в иммунную клетку, причем образуется иммуносупрессорная иммунная клетка, и введение индивидууму первой иммунной клетки и второй иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления представление указанного антигена указанной первой или второй иммунной клеткой подавляет иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся индивидууму одновременно. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся индивидууму последовательно. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула).

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ индукции толерантности к антигену у индивидуума, включающий пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в иммунную клетку, пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в иммунную клетку, причем образуется толерогенная иммунная клетка, и введение индивидууму первой иммунной клетки и второй иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления представление указанного антигена указанной первой или второй иммунной клеткой индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся индивидууму одновременно. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся индивидууму последовательно. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула).

Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают способ подавления иммунного ответа у индивидуума, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что соединение, кодирующее нефункциональный цитокин-связывающий белок, проникает в иммунную клетку, и введение индивидууму иммунной клетки, причем указанный нефункциональный цитокин-связывающий белок экспрессируется, причем указанный нефункциональный цитокин-связывающий белок связывается со свободными цитокинами воспаления, тем самым подавляя иммунный ответ, например, путем ингибирования иммунной клетки зоны воспаления. В некоторых вариантах осуществления нефункциональный цитокин-связывающий белок включает нефункциональный рецептор для цитокина. В некоторых вариантах осуществления в нефункциональном рецепторе для цитокина отсутствуют цитоплазматические сигнальные домены. В некоторых вариантах осуществления нефункциональный цитокин-связывающий белок содержит протеолитический центр, который расщепляет цитокин-мишень. В некоторых вариантах осуществления нефункциональный цитокин-связывающий белок включает антитело против цитокина. В некоторых вариантах осуществления нефункциональный цитокин-связывающий белок включает рецептор содержащих антитело против цитокина В-клеток.

В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с предыдущими вариантами осуществления, иммунная клетка относится к индивидууму. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка относится к другому индивидууму. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка является клеткой из пула клеток от множества индивидуумов.

В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с предыдущими вариантами осуществления, сужение содержится внутри микрофлюидного канала. В некоторых вариантах осуществления сужение представляет собой пору или содержится внутри поры. В некоторых вариантах осуществления пора содержится внутри поверхности. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой фильтр. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой мембрану. В некоторых вариантах осуществления размер сужения зависит от диаметра иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления размер сужения составляет приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от диаметра клетки. В некоторых вариантах осуществления канал содержит сужения длиной, составляющей приблизительно 10 мкм, и шириной, составляющей приблизительно 4 мкм. В некоторых случаях размер поры составляет приблизительно 0,4 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 4 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 8 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 12 мкм или приблизительно 14 мкм. В некоторых вариантах осуществления способ осуществляют при температуре от приблизительно -5^οС до приблизительно 45^οС.

Ссылка на диаметр безъядерной клетки означает диаметр клетки в жидкости до прохождения через сужение, например, когда клетка приближается к сужению, если не указано иное.

В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с предыдущими вариантами осуществления, клеточная суспензия включает смешанную популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия представляет собой цельную кровь. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия включает мононуклеарные клетки периферической крови. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия включает очищенную популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия включает клетки млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия включает клетки обезьян, мышей, собак, кошек, лошадей, крыс, овец, коз, свиней или кроликов. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия включает клетки человека. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия включает клетки, не являющиеся клетками млекопитающих. В некоторых вариантах клеточная суспензия содержит бактериальные, дрожжевые клетки, клетки кур, лягушек, насекомых, рыб или нематод. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой клетку обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой Т-клетку, В-клетку, дендритную клетку, моноцит, макрофаг, NK-клетку, врожденную лимфоидную клетку, нейтрофил, базофил, эозинофил, клетку-супрессор миелоидного происхождения или тучную клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенпредставляющая клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления антигенпредставляющая клетка представляет собой клетку обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика. В некоторых вариантах осуществления антигенпредставляющая клетка представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах осуществления антигенпредставляющая клетка представляет собой Т-клетку, В-клетку, дендритную клетку, моноцит, макрофаг, NK-клетку, врожденную лимфоидную клетку, нейтрофил, базофил, эозинофил, клетку-супрессор миелоидного происхождения или тучную клетку.

В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с предыдущими вариантами осуществления, антиген является чужеродным антигеном. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой аутоантиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой трансплантационный антиген аллотрансплантата. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой модифицированный антиген. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген включает антиген, слитый с терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген включает антиген, слитый с нацеливающим пептидом. В некоторых вариантах осуществления указанная клеточная суспензия соприкасается с антигеном до, одновременно или после прохождения через сужение.

В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с предыдущими вариантами осуществления, толерогенный фактор ингибирует активность костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор уменьшает экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор удаляет нуклеиновую кислоту, которая модулирует экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует костимулирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула представляет собой CD80 или CD86.

В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с предыдущими вариантами осуществления, толерогенный фактор усиливает активность иммуносупрессорного фактора. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорным фактором является коингибирующая молекула, регулятор транскрипции или иммуносупрессорная молекула. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает активность коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует коингибирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который усиливает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность полипептида, который увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления коингибирующая молекула представляет собой PD-L1, PD-L2 или CTLA-4.

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает активность иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает экспрессию иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует иммуносупрессорную молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность полипептида, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорная молекула представляет собой аргиназу-1 (ARG1), оксид азота (NO), синтазу 2 оксида азота (NOS2), индоламин-2,3-диоксигеназу (IDO), IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα или TGFβ.

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует активность молекулы воспаления. В некоторых вариантах осуществления молекулой воспаления является фактор транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует фактор транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор уменьшает экспрессию фактора транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор удаляет нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию фактора транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию фактора транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор фактора транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления фактором транскрипции при воспалении является NF-κB, регуляторный фактор интерферона или молекула, связанная с путем передачи сигналов JAK-STAT. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует модифицированный TCR, содержащий цитоплазматический сигнальный домен, который запускает продукцию иммуносупрессорных цитокинов при связывании с антигеном. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует химерный рецептор антигена, содержащий цитоплазматические сигнальные домены, которые запускают продукцию иммуносупрессорных цитокинов при связывании с антигеном.

В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с предыдущими вариантами осуществления, толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую короткую интерферирующую РНК (siRNA), мРНК, микроРНК (miRNA), длинную некодирующую РНК (lncRNA), тРНК или короткую шпилечную РНК (shRNA). В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой плазмиду. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает комплекс белок-нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает полипептид Cas и направляющую РНК или донорную ДНК. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид Cas, и направляющую РНК или донорную ДНК. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает полипептид Cas9 и направляющую РНК или донорную ДНК. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид Cas9, и направляющую РНК или донорную ДНК. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает полипептид. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой нуклеазу, белок TALEN, нуклеазу c цинковыми пальцами, мегануклеазу или рекомбиназу CRE. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой фермент транспозазу или интегразу. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления полипептидом является фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой небольшую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой наночастицу. В некоторых вариантах осуществления указанная клеточная суспензия соприкасается с толерогенным фактором до, одновременно или после прохождения через сужение.

В тех вариантах осуществления, в которых подавляется иммунный ответ, иммунный ответ подавляется на по крайней мере приблизительно 25%, приблизительно 50%, приблизительно 75%, приблизительно 100%, приблизительно 150%, приблизительно 200% или более чем на приблизительно 200%. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенный Т-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение активации Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение выживаемости Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение пролиферации Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение функциональности Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает изменение фенотипа Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает некостимулированную активацию Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает усиленный Treg ответ. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенный В-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный В-клеточный ответ включает снижение продукции антител. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает снижение продукции цитокинов. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенную аутоиммунную реакцию. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенную аллергическую реакцию. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген, связанный с трансплантированной тканью. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против трансплантированной ткани. В некоторых вариантах осуществления антиген связан с вирусом. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенный патогенный иммунный ответ против вируса. В некоторых вариантах осуществления антиген связан с бактерией. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенный патогенный иммунный ответ против бактерии. В некоторых вариантах осуществления антиген связан с грибком. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенный патогенный иммунный ответ против грибка. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического носителя.

В тех вариантах осуществления, в которых индуцируется толерантность, толерантность может включать уменьшенный Т-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение активации Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение выживаемости Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение пролиферации Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение функциональности Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает изменение фенотипа Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает некостимулированную активацию Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает усиленный Treg ответ. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает уменьшенный В-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный В-клеточный ответ включает снижение продукции антител. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает снижение продукции цитокинов. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает уменьшенную аутоиммунную реакцию. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает уменьшенную аллергическую реакцию. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает уменьшенный иммунный ответ против трансплантированной ткани. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает уменьшенный патогенный иммунный ответ против вируса. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического носителя.

В некоторых вариантах осуществления, в которых модифицированную иммунную клетку вводят индивидууму, способ, кроме того, включает по крайней мере одно (например, по крайней мере 2, 3, 4, 5, 6 или более) дополнительное введение модифицированной иммунной клетки, описанной выше. В некоторых вариантах осуществления продолжительность времени между любыми двумя введениями составляет по крайней мере 1 день, 1 неделю, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев или 1 год.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к системе, содержащей сужение, иммунную клетку, антиген и/или толерогенный фактор, для применения в любом из вышеупомянутых способов. Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к системе, содержащей сужение, иммунную клетку и соединение, кодирующее нефункциональный цитокин-связывающий белок, для применения в любом из вышеупомянутых способов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕТЕЖЕЙ

На фиг. 1 продемонстрировано описание схемы воздействия.

На фиг. 2 показано количество OT-I- и OT-II-специфических Т-клеток в день 12 у мышей из четырех групп воздействия.

На фиг. 3 показаны процент селезеночных Т-клеток, которые экспрессировали IFN-γ на высоком уровне, (слева) и уровень продукции IFN-γ (справа).

На фиг. 4 показано количество OT-I-специфических Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, как определено с помощью ELISpot.

На фиг. 5 показаны репрезентативные проточные цитограммы для TCRVα2+ селезеночных OT-I-специфических и происходящих из лимфоузлов OT-II-специфических T-клеток для каждой группы воздействия.

На фиг. 6 показаны репрезентативные проточные цитограммы для OT-I-специфических клеток с высоким уровнем IFN-γ и маркером антигенной активации CD44.

На фиг. 7 продемонстрировано описание схемы воздействия.

На фиг. 8 показано количество OT-I- и OT-II-специфических Т-клеток в день 12ь у мышей из четырех групп воздействия.

На фиг. 9 показан процент селезеночных Т-клеток, которые экспрессировали IFN-γ на высоком уровне.

На фиг. 10 показаны репрезентативные проточные цитограммы для количества OT-I-специфических T-клеток в сравнение с CD8+ Т-клетками (верхние панели) и для клеток с высоким уровнем IFN-γ в сравнение с маркером антигенной активации CD44 (нижние панели).

На фиг. 11А и 11В продемонстрированы описания репрезентативных схем воздействия.

На фиг. 12А и 12В продемонстрированы описания репрезентативных схем воздействия.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящим изобретением обеспечиваются способы индукции толерантности и/или подавления иммунного ответа у индивидуума путем пропускания клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужения, что обеспечивает доставку антигена и/или толерогенного фактора в иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления сужение содержится внутри микрофлюидном канале. В некоторых вариантах осуществления сужение представляет собой пору или содержится внутри поры.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способам индукции толерантности и/или подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в иммунную клетку, и введение индивидууму иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления представление антигена в толерогенной клетке индуцирует толерантность и/или подавляет иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется в толерогенной среде. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется в толерогенной среде. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или иммунносупрессия являются антигенспецифическими. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или иммунносупрессия, включая толерантность и/или подавление иммунного ответа против множества антигенов, являются неспецифическими.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способам индукции толерантности и/или подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор проникают в иммунную клетку, и введение индивидууму иммунной клетки, тем самым индуцируя толерантность и/или подавляя иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления указанный антиген представляется в толерогенной среде. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенную среду, причем представление антигена в указанной толерогенной среде индуцирует толерантность и/или подавляет иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления указанный антиген процессируется в толерогенной среде. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или иммунносупрессия являются антигенспецифическими. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или иммунносупрессия, включая толерантность и/или подавление иммунного ответа против множества антигенов, являются неспецифическими.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способам индукции толерантности и/или подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в иммунную клетку, и введение индивидууму иммунной клетки, тем самым индуцируя толерантность и/или подавляя иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенную среду, причем представление антигена в указанной толерогенной среде индуцирует толерантность и/или подавляет иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или иммунносупрессия являются антигенспецифическими. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или иммунносупрессия, включая толерантность и/или подавление иммунного ответа против множества антигенов, являются неспецифическими.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способам образования толерогенных и/или иммуносупрессорных антигенпредставляющих клеток, в которых антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, причем сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в антигенпредставляющую клетку. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула).

I. ОБЩИЕ МЕТОДЫ

Методы и процедуры, описанные или упомянутые здесь, как правило, хорошо разработаны и обычно применяются специалистами в данной области техники с использованием общепринятой методологии, такой как, например, широко применяемые методологии, описанные в Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); выпусках Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6^th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); и Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).

II. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

С целью интерпретации этой спецификации будут применяться следующие определения, и в соответствующих случаях термины, используемые в единственном числе, также будут включать множественное число и наоборот. В случае, если любое определение, представленное ниже, противоречит любому документу, включенному сюда посредством ссылки, следует руководствоваться представленным определением.

Как используется здесь, форма единственного числа «a», «an» и «the» включает множественные ссылки, если не указано иное.

Понятно, что аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения, описанные здесь, включают «содержащие (включающие)», «состоящие» и «по существу состоящие из» аспектов и вариантов осуществления.

Используемый здесь термин «приблизительно» относится к обычному диапазону ошибок для соответствующего значения, абсолютно известного специалисту в данной области техники. Ссылка на «приблизительно» значение или параметр здесь включает (и описывает) варианты осуществления, которые направлены на это значение или параметр как таковой.

Используемый здесь термин «пора» относится к отверстию, включая, без ограничения, отверстие, разрыв, полость, отверстие, разрыв, зазор или перфорацию внутри материала. В некоторых примерах (где указано) термин относится к поре внутри поверхности настоящего изобретения. В других примерах (где указано) пора может относиться к поре в клеточной мембране.

Используемый здесь термин «мембрана» относится к селективному барьеру или листу, содержащему поры. Термин включает гибкую листовую структуру, которая действует как граница или прокладка. В некоторых примерах термин относится к поверхности или фильтру, содержащей(ему) поры. Этот термин отличается от термина «клеточная мембрана».

Используемый здесь термин «фильтр» относится к пористому изделию, которое обеспечивает избирательный проход через поры. В некоторых примерах термин относится к поверхности или мембране, содержащей поры.

Используемый здесь термин «гетерогенный» относится к тому, что является смешанным или не является однородным по структуре или составу. В некоторых примерах термин относится к порам, имеющим разные размеры, формы или распределения внутри конкретной поверхности.

Используемый здесь термин «гомогенный» относится к тому, что является единообразным или однородным по всей структуре или составу. В некоторых примерах термин относится к порам, имеющим постоянные размеры, формы или распределение внутри конкретной поверхности.

Используемый здесь термин «гетерологичная» относится к молекуле, которая происходит от другого организма. В некоторых примерах термин относится к нуклеиновой кислоте или белку, который обычно не обнаруживается или не экспрессируется в данном организме.

Используемый здесь термин «ингибировать (супрессировать)» может относиться к акту блокирования, уменьшения, элиминации или иного противодействия присутствию или активности конкретной мишени. Ингибирование (супрессия) может относиться к частичному ингибированию или полному ингибированию. Например, ингибирование иммунного ответа может относиться к любому акту, ведущему к блокаде, уменьшению, элиминации или любому другому противодействию иммунному ответу. В других примерах ингибирование экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, но без ограничения этим, уменьшение транскрипции нуклеиновой кислоты, уменьшение избыточного количества мРНК (например, подавление транскрипции мРНК), деградацию мРНК, ингибирование трансляции мРНК и т.д. В других примерах ингибирование экспрессии белка может включать, но без ограничения этим, уменьшение транскрипции нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, снижение стабильности мРНК, кодирующей белок, ингибирование трансляции белка, снижение стабильности белка и т.д.

Используемый здесь термин «подавлять» может относиться к акту уменьшения, снижения, препятствования, ограничения, понижения или иного уменьшения присутствия или активности конкретной мишени. Подавление может относиться к частичному подавлению или полному подавлению. Например, подавление иммунного ответа может относиться к любому акту, ведущему к уменьшению, снижению, препятствованию, ограничению, понижению или иному уменьшению иммунного ответа. В других примерах подавление экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, но без ограничения этим, уменьшение транскрипции нуклеиновой кислоты, уменьшение избыточного количества мРНК (например, подавление транскрипции мРНК), деградацию мРНК, ингибирование трансляции мРНК и т.д. В других примерах подавление экспрессии белка может включать, но без ограничения этим, уменьшение транскрипции нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, снижение стабильности мРНК, кодирующей белок, ингибирование трансляции белка, снижение стабильности белка и т.д.

Используемый здесь термин «усиливать» может относиться к акту улучшения, повышения, повышения или иного увеличения присутствия или активности конкретной мишени. Например, усиление иммунного ответа может относиться к любому акту, ведущему к улучшению, усилению, усилению или иному увеличению иммунного ответа. В других примерах усиление экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, но без ограничения этим, увеличение транскрипции нуклеиновой кислоты, увеличение избыточного количества мРНК (например, увеличение транскрипции мРНК), снижение деградации мРНК, увеличение трансляции мРНК и т.д. В других примерах усиление экспрессии белка может включать, но без ограничения этим, увеличение транскрипции нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, повышение стабильности мРНК, кодирующей белок, увеличение трансляции белка, увеличение стабильности белка и т.д.

Используемый здесь термин «индуцировать» может относиться к акту инициирования, побуждения, стимулирования, установления или иного получения результата. Например, индукция иммунного ответа может относиться к любому акту, ведущему к инициированию, побуждению, стимуляции, установлению или иному получению желаемого иммунного ответа. В других примерах индукция экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, но без ограничения этим, инициирование транскрипции нуклеиновой кислоты, инициирование трансляции мРНК и т.д. В других примерах индукция экспрессии белка может включать, но без ограничения этим, увеличение транскрипции нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, повышение стабильности мРНК, кодирующей белок, увеличение трансляции белка, увеличение стабильность белка и т.д.

Используемый здесь термин «гомологичная» относится к молекуле, которая происходит из того же организма. В некоторых примерах термин относится к нуклеиновой кислоте или белку, который обычно обнаруживается или экспрессируется в данном организме.

Используемый здесь термин «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, включая рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды. Таким образом, этот термин включает, но без ограничения ими, одно-, двух- или многоцепочечную ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. Скелет полинуклеотида может включать сахара и фосфатные группы (как правило, можно найти в РНК или ДНК) или модифицированные или замещенные сахара или фосфатные группы. Скелет полинуклеотида может включать повторяющиеся звенья, такие как N- (2-аминоэтил)-глицин, связанные пептидными связями (т.е. пептид-нуклеиновую кислоту). Альтернативно, скелет полинуклеотида может включать полимер из синтетических субъединиц, таких как фосфорамидаты, и, таким образом, он может быть олигодезоксинуклеозидфосфорамидатом (P-NH2) или смешанным фосфорамидат-фосфодиэфирным олигомером. Кроме того, двухцепочечный полинуклеотид может быть получен из одноцепочечного полинуклеотида в качестве продукта химического синтеза либо путем синтеза комплементарной цепи и отжига цепей в соответствующих условиях, либо путем синтеза комплементарной цепи de novo с использованием ДНК-полимеразы с использованием подходящего праймера.

Термины «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо для ссылки на полимер из аминокислотных остатков и не ограничиваются минимальной длиной. Такие полимеры из аминокислотных остатков могут содержать природные или неприродные аминокислотные остатки и включают, но без ограничения ими, пептиды, олигопептиды, димеры, тримеры и мультимеры из аминокислотных остатков. По определению включены как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Термины также включают модификации после экспрессии полипептида, например гликозилирование, сиалилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Кроме того, для целей настоящего изобретения «полипептид» относится к белку, который включает модификации, такие как делеции, добавления и замены (как правило, консервативные по своей природе), по отношению к нативной последовательности, если белок сохраняет желаемую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, путем сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, например, посредством мутаций хозяев, которые продуцируют белки, или ошибок из-за ПЦР-амплификации.

Для любых структурных и функциональных характеристик, описанных здесь, способы определения этих характеристик известны в данной области техники.

III. ИММУНОСУПРЕССИЯ И ТОЛЕРАНТНОСТЬ

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления иммунного ответа и/или индукции толерантности у индивидуума, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и/или толерогенный фактор проникают в иммунную клетку, причем образуется толерогенная или иммуносупрессорная иммунная клетка, и введение иммунной клетки индивидууму, причем представление указанного антигена индуцирует толерантность и/или подавляет иммунный ответ на антиген.

Толерогенная иммунная клетка описывается как иммунная клетка, способная представлять или представляющая антиген индуцирующим толерантность образом (например, представление антигена толерогенной иммунной клеткой индуцирует толерантность к антигену) или способная придавать толерогенный фенотип другой клетке, такой как другая антигенпредставляющая клетка, тем самым образуя толерогенную антигенпредставляющую клетку. Иммуносупрессорная иммунная клетка определяется как иммунная клетка, способная представлять антиген вызывающим иммуносупрессию образом (например, представление антигена иммуносупрессорной иммунной клеткой подавляет иммунный ответ на антиген) или способная придавать иммуносупрессорный фенотип другой клетке, такой как другая антигенпредставляющая клетка, тем самым образуя иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку.

В некоторых вариантах осуществления описанная здесь толерогенная и/или иммуносупрессорная иммунная клетка, или ее предшественник, не приводились в соприкосновение с адъювантом. В некоторых вариантах осуществления адъювант включает лиганды для паттерн-распознающих рецепторов (PRR) (например, toll-подобных рецепторов (TLR), NOD-подобных рецепторов (NLR), RIG-I-подобных рецепторов (RLR) и рецепторов лектинов C-типа (CLR)) и связанных с патогенами молекулярных структур (PAMP). В некоторых вариантах осуществления адъювант выбирают из группы, состоящей из лигандов для TLR3 и RLR (например, синтетических аналогов дцРНК (dsRNA), таких как поли(I:C)), лигандов для TLR4 (например, липополисахаридов (LPS), монофосфориллипида A (MPLA)), лигандов TLR5 (например, бактериального флагеллина (самого по себе или слитого с антигеном)), лигандов для TLR7/8 (например, имидазохинолинов, таких как имиквимод, гардиквимод и R848), лигандов для TLR9 (например, олигодезоксинуклеотидов, содержащие специфические мотивы CpG, включая CpG ODN, такие как ODN 1826 и ODN 2006), лигандов для NOD2 (например, фрагментов клеточной стенки бактерий, таких как мурамилдипептид (MDP)), квасцов, эмульсий типа «вода-в-масле» (неполного адъюванта Фрейнда, MF59), rhIL-2, анти-CD40 или CD40L, IL-12 и циклических динуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления описанная здесь толерогенная и/или иммуносупрессорная иммунная клетка заключает в себе уменьшенную способность обеспечивать один или более костимулирующих сигналов по сравнению с нетолерогенным и/или неиммуносупрессорным предшественником. В некоторых вариантах осуществления костимулирующие сигналы включают передачу сигналов через CD40, CD80, CD86, CD54, CD83, CD79 или лиганд для ICOS.

В некоторых вариантах осуществления описанная здесь толерогенная и/или иммуносупрессорная иммунная клетка заключает в себе уменьшенную способность обеспечить один или более сигналов воспаления по сравнению с нетолерогенным и/или неиммуносупрессорным предшественником. В некоторых вариантах осуществления сигналы воспаления включают передачу сигналов через интерлейкин-1 (IL-1), IL-12, IL-18, фактор некроза опухоли (TNF), интерферон-гамма (IFN-гамма), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), NF-κB, регуляторный фактор интерферона (IRF) или JAK-STAT.

Иммунологическая толерантность представляет собой иммунологическую неотвечаемость на стимуляцию антигеном, к которому индуцируется толерантность. Толерантность проявляется, когда субъект не отвечает на последующую стимуляцию индуцирующим толерантность антигеном. Толерантность может быть опосредована несколькими различными механизмами, которые включают апоптоз аутореактивных клеток, индукцию анергии или отклонение от фенотипа лимфоцитов. В некоторых вариантах осуществления толерантность может включать Т-клеточную неотвечаемость, что приводит к дезактивации иммунного ответа против конкретного антигена. Толерантность также может быть опосредована регуляторными Т-клетками (Tregs) путем секреции иммуносупрессорных цитокинов и через контактные взаимодействия с молекулами клеточной поверхности или цитотоксическими факторами. Дефекты в толерогенных механизмах могут способствовать аутоиммунным заболеваниям, отторжению трансплантатов, ответам против лекарственных средств и патогенным ответам против вирусной инфекции. Иммуносупрессия представляет собой снижение активности иммунного ответа. Например, иммуносупрессия может включать, без ограничения, уменьшенную отвечаемость на атигенную стимуляцию, уменьшенную активацию и пролиферацию иммунных клеток, модулированную продукцию и/или секрецию цитокинов, снижение выживаемости иммунных клеток или снижение эффекторных функций иммунных клеток.

В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы доставки в иммунную клетку, причем клеткой является клетка млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления клеткой является первичная клетка или клетка клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления клеткой является клетка крови. В некоторых вариантах осуществления клеткой крови является иммунная клетка. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой лимфоцит. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой Т-клетку, В-клетку, клетку природный киллер (NK), дендритную клетку (DC), NKT-клетку, тучную клетку, моноцит, макрофаг, базофил, эозинофил или нейтрофил. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой адаптивную иммунную клетку, такую как Т-клетка или В-клетка. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой образованную ex vivo клетку (например, ex vivo образованную дендритную клетку). Приводимые в качестве примера ex vivo образованные клетки включают иммунные клетки, полученные из стволовых клеток или клеток-предшественников (например, аутологичных стволовых клеток или клеток-предшественников). В некоторых вариантах осуществления иммунной клеткой является врожденная иммунная клетка. Приводимые в качестве примера врожденные иммунные клетки включают врожденные лимфоидные клетки (ILC1, ILC2, ILC3), базофилы, эозинофилы, тучные клетки, NK-клетки, нейтрофилы и моноциты. В некоторых вариантах осуществления иммунной клеткой является клетка памяти. В некоторых вариантах осуществления иммунной клеткой является первичная Т-клетка человека. В некоторых вариантах осуществления клеткой является клетка мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, козы, обезьяны или кролика. В некоторых вариантах осуществления клеткой является клетка человека. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия включает клетку, не являющуюся клеткой млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления клеткой является клетка курицы, лягушки, насекомых, рыб или нематод.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы индукции толерантности к антигену у индивидуума, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, и введение индивидууму иммунной клетки, причем иммунная клетка является толерогенной иммунной клеткой, и причем представление указанного антигена индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется толерогенной иммунной клеткой с индукцией толерантности к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерогенная иммунная клетка придает толерогенный фенотип другой антигенпредставляющей клетке, тем самым образуя толерогенную антигенпредставляющую клетку, и антиген представляется толерогенной антигенпредставляющей клеткой с индукцией толерантности к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерантность является антигенспецифической.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы индукции толерантности к антигену у индивидуума, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор, соприкасающиеся с клеткой, проникают в иммунную клетку, тем самым образуя толерогенную иммунную клетку, содержащую антиген, и введение индивидууму толерогенной иммунной клетки, причем представление указанного антигена индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется толерогенной иммунной клеткой с индукцией толерантности к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерогенная иммунная клетка придает толерогенный фенотип другой антигенпредставляющей клетке, тем самым образуя толерогенную антигенпредставляющую клетку, и антиген представляется толерогенной антигенпредставляющей клеткой с индукцией толерантности к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерантность является антигенспецифической.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, и введение индивидууму иммуносупрессорной иммунной клетки, причем иммунной клеткой является иммуносупрессорная иммунная клетка, и причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется иммуносупрессорной иммунной клеткой для подавления иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорная иммунная клетка придает иммуносупрессорный фенотип другой антигенпредставляющей клетке, тем самым образуя иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку, и антиген представляется иммуносупрессорной антигенпредставляющей клеткой с подавлением иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессия является антигенспецифической.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор, соприкасающиеся с клеткой, проникают в иммунную клетку, тем самым образуя иммуносупрессорную иммунную клетку, содержащую антиген, и введение индивидууму иммуносупрессорной иммунной клетки, причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется иммуносупрессорной иммунной клеткой с подавлением иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорная иммунная клетка придает иммуносупрессорный фенотип другой антигенпредставляющей клетке, тем самым образуя иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку, и антиген представляется иммуносупрессорной антигенпредставляющей клеткой с подавлением иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессия является антигенспецифической.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы индукции толерантности к антигену у индивидуума, при этом способ включает введение индивидууму толерогенной иммунной клетки, причем толерогенная иммунная клетка содержит антиген, причем представление указанного антигена индуцирует толерантность к антигену, и причем антиген был введен в толерогенную иммунную клетку путем пропускания толерогенной иммунной клетки или ее предшественника через сужение, причем указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызвав нарушение в клетке, так что антиген проник в толерогенную иммунную клетку или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется толерогенной иммунной клеткой с индукцией толерантности к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерогенная иммунная клетка придает толерогенный фенотип другой антигенпредставляющей клетке, тем самым образуя толерогенную антигенпредставляющую клетку, и антиген представляется толерогенной антигенпредставляющей клеткой с индукцией толерантности к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерантность является антигенспецифической.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы индукции толерантности к антигену у индивидуума, при этом способ включает введение индивидууму толерогенной иммунной клетки, причем толерогенная иммунная клетка содержит антиген и толерогенный фактор, причем представление указанного антигена индуцирует толерантность к антигену, и причем антиген и толерогенный фактор были введены в толерогенную иммунную клетку путем пропускания толерогенной иммунной клетки или ее предшественника через сужение, причем указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызвав нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор проникли в толерогенную иммунную клетку или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется толерогенной иммунной клеткой с индукцией толерантности к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерогенная иммунная клетка придает толерогенный фенотип другой антигенпредставляющей клетке, тем самым образуя толерогенную антигенпредставляющую клетку, и антиген представляется толерогенной антигенпредставляющей клеткой с индукцией толерантности к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерантность является антигенспецифической.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, при этом способ включает введение индивидууму иммуносупрессорной иммунной клетки, причем иммуносупрессорная иммунная клетка содержит антиген, причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген, и причем антиген был введен в иммуносупрессорную иммунную клетку путем пропускания иммуносупрессорной иммунной клетки или ее предшественника через сужение, причем указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызвав нарушение в клетке, так что антиген проник в иммуносупрессорную иммунную клетку или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется иммуносупрессорной иммунной клеткой с подавлением иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорная иммунная клетка придает иммуносупрессорный фенотип другой антигенпредставляющей клетке, тем самым образуя иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку, и антиген представляется иммуносупрессорной антигенпредставляющей клеткой с подавлением иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессия является антигенспецифической.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, при этом способ включает введение индивидууму иммуносупрессорной иммунной клетки, причем иммуносупрессорная иммунная клетка содержит антиген и толерогенный фактор, причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген, и причем антиген и толерогенный фактор были введены в иммуносупрессорную иммунную клетку путем пропускания иммуносупрессорной иммунной клетки или ее предшественника через сужение, причем указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызвав нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор проникли в иммуносупрессорную иммунную клетку или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется иммуносупрессорной иммунной клеткой с подавлением иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорная иммунная клетка придает иммуносупрессорный фенотип другой антигенпредставляющей клетке, тем самым образуя иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку, и антиген представляется иммуносупрессорной антигенпредставляющей клеткой с подавлением иммунного ответа на антиген. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессия является антигенспецифической.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования толерогенной иммунной клетки, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, тем самым образуя толерогенную иммунную клетку. В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования толерогенной антигенпредставляющей иммунной клетки, в которых толерогенную иммунную клетку дополнительно пропускают через второе сужение, причем указанное второе сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, причем антиген представляется толерогенной иммунной клеткой.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования иммуносупрессорной иммунной клетки, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, тем самым образуя иммуносупрессорную иммунную клетку. В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования иммуносупрессорной антигенпредставляющей иммунной клетки, в которых иммуносупрессорная иммунная клетка дополнительно пропускается через второе сужение, причем указанное второе сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, причем антиген представляется иммуносупрессорной иммунной клеткой.

В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает модуляцию экспрессии и/или активности иммуномодулирующего агента (например, костимулирующей молекулы, иммунодепрессанта или воспалительной или противовоспалительной молекулы). В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает ингибирование экспрессии и/или активности иммуностимулирующего агента (например, костимулирующей молекулы), усиление экспрессии и/или активности иммунодепрессанта, ингибирование экспрессии и/или активности молекулы воспаления и/или усиление экспрессии и/или активности противовоспалительной молекулы.

В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает ингибирование экспрессии и/или активности иммуностимулирующего агента (например, костимулирующей молекулы). В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент представляет собой костимулирующую молекулу. Взаимодействие между костимулирующими молекулами и их лигандами важно для поддержания и интеграции передачи сигналов от TCR для стимуляции оптимальной пролиферации и дифференцировки Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает уменьшение экспрессии костимулирующей молекулы. Приводимые в качестве примера костимулирующие молекулы, представленные на антигенпредставляющих клетках, включают, без ограничения, CD40, CD80, CD86, CD54, CD83, CD79 или лиганд для ICOS. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула представляет собой CD80 или CD86. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает ингибирование экспрессии нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует или модулирует экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, которая экспрессирует или модулирует экспрессию костимулирующей молекулы, удаляется. В некоторых вариантах осуществления удаление нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует или модулирует экспрессию костимулирующей молекулы, достигается посредством редактирования гена. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает ингибирование костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает ингибирование экспрессии или функции костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает повышенную активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает повышенную активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает деградацию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает маркирование костимулирующей молекулы для разрушения. Например, иммунносупрессия и/или толерантность могут включать убиквитинирование костимулирующей молекулы, тем самым нацеливая ее на разрушение.

В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает усиление экспрессии и/или активности иммунодепрессанта. В некоторых вариантах осуществления иммунодепрессант представляет собой коингибирующую молекулу, регулятор транскрипции или иммуносупрессорную молекулу. Коингибирующие молекулы негативно регулируют активацию лимфоцитов. Приводимые в качестве примера коингибирующие молекулы включают, без ограничения, PD-L1, PD-L2, HVEM, B7-H3, TRAIL, рецепторы для иммуноглобулиноподобных транскриптов (ILT) (ILT2, ILT3, ILT4), FasL, CTLA4, CD39, CD73, и B7-H4. В некоторых вариантах осуществления коингибирующая молекула представляет собой PD-L1 или PD-L2. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает повышенную активность коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает увеличенную экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает повышенную активность регулятора транскрипции, который усиливает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает повышенную активность полипептида, который увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включают ингибирование ингибитора коингибирующей молекулы.

В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает увеличенную экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы. Приводимые в качестве примера иммуносупрессорные молекулы включают, без ограничения, аргиназу-1 (ARG1), индоламин-2,3-диоксигеназу (IDO), простагландин E2 (PGE2), индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS), оксид азота (NO), синтазу 2 оксида азота (NOS2), TSLP, вазоактивный интестинальный пептид (VIP), фактор роста гепатоцитов (HGF), TGFβ, IFNα, IL-4, IL-10, IL-13 и IL-35. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорной молекулой является NO или IDO. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает повышенную активность иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает повышенную активность регулятора транскрипции, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает повышенную активность полипептида, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает ингибирование негативного регулятора иммуносупрессорной молекулы.

В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает ингибирование экспрессии и/или активности молекулы воспаления. В некоторых вариантах осуществления молекула воспаления представляет собой цитокин воспаления. В некоторых вариантах цитокин воспаления выбирают из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона гамма (IFN-гамма) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). В некоторых вариантах осуществления молекулой воспаления является фактор транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает ингибирование фактора транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает уменьшение экспрессии фактора транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления фактором транскрипции при воспалении является NF-κB, регуляторный фактор интерферона (IRF) или молекула, связанная с путем передачи сигналов JAK-STAT. Путь с участием NF-κB представляет собой прототипный провоспалительный путь передачи сигналов, который опосредует экспрессию провоспалительных генов, включая цитокины, хемокины и молекулы адгезии. Регуляторные факторы интерферона (IRF) составляют семейство факторов транскрипции, которые могут регулировать экспрессию провоспалительных генов. Путь передачи сигналов JAK-STAT передает информацию от экстраклеточных цитокиновых сигналов в ядро, что приводит к транскрипции ДНК и экспрессии генов, участвующих в пролиферации и дифференциации иммунных клеток. Система JAK-STAT состоит из рецептора клеточной поверхности, Янус-киназ (JAK) и преобразователя сигналов и активатора транскрипции (STAT) в виде белков. Приводимые в качестве примера молекулы JAK-STAT включают, без ограничения, JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 (STAT5A и STAT5B) и STAT6. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает усиленную экспрессию супрессора белка передачи цитокиновых сигналов (SOCS). Белки SOCS могут ингибировать передачу сигналов через путь JAK-STAT. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает ингибирование экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая фактор транскрипции при воспалении, удаляется. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает повышенную активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию фактора транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает повышенную активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию фактора транскрипции при воспалении.

В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает усиление экспрессии и/или активности противовоспалительной молекулы. В некоторых вариантах осуществления противовоспалительной молекулой является противовоспалительный цитокин. В некоторых вариантах осуществления противовоспалительный цитокин выбирают из IL-4, IL-10, IL-13, IFN-альфа и трансформирующего фактора роста бета (TGFβ). В некоторых вариантах осуществления противовоспалительной молекулой является противовоспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает усиление противовоспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает увеличенную экспрессию противовоспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает усиление экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей противовоспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая противовоспалительный фактор транскрипции, удаляется. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает снижение активности регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию противовоспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления иммунносупрессия и/или толерантность включает снижение активности ингибитора белка, который подавляет экспрессию противовоспалительного фактора транскрипции.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования толерогенной антигенпредставляющей клетки, содержащей антиген, в которых толерогенную антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в толерогенную антигенпредставляющую клетку, тем самым образуя толерогенную антигенпредставляющую клетку, содержащую антиген.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования толерогенной антигенпредставляющей клетки, в которых антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в антигенпредставляющую клетку, тем самым образуя толерогенную антигенпредставляющую клетку. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула).

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования толерогенной антигенпредставляющей клетки, содержащей антиген, в которых антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор проникают в антигенпредставляющую клетку, тем самым образуя толерогенную антигенпредставляющую клетку, содержащую антиген. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула).

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования иммуносупрессорной антигенпредставляющей клетки, содержащей антиген, в которых иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку, тем самым образуя иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку, содержащую антиген.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования иммуносупрессорной антигенпредставляющей клетки, в которых антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в антигенпредставляющую клетку, тем самым образуя иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула).

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования иммуносупрессорной антигенпредставляющей клетки, содержащей антиген, в которых антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор проникают в антигенпредставляющую клетку, тем самым образуя иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку, содержащую антиген. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула).

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы доставки антигена в первую иммунную клетку (например, толерогенную иммунную клетку), при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, вызывая тем самым нарушение в клетке, так что антиген проникает в клетку, причем указанная клеточная суспензия соприкасается с антигеном. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор доставляется в первую иммунную клетку способами, описанными здесь, тем самым придавая толерогенный фенотип первой иммунной клетке. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется индуцирующим толерантность образом, например, первой иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется индуцирующим толерантность образом другой иммунной клеткой, например, второй иммунной клеткой, такой как иммунная клетка, имеющая толерогенный фенотип, присущий свойству первой иммунной клетки, или иммунная клетка, имеющая толерогенный фенотип, независимый от первой иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса I толерогенной иммунной клеткой (например, первой или второй иммунной клеткой). В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса II толерогенной иммунной клеткой (например, первой или второй иммунной клеткой).

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы доставки толерогенного фактора, который создает толерогенный фенотип, в первую иммунную клетку, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, вызывая тем самым нарушение в клетке, так толерогенный фактор проникает в клетку, причем указанная клеточная суспензия соприкасается с толерогенным фактором, тем самым создавая толерогенную иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула). В некоторых вариантах осуществления антиген эндоцитируется первой иммунной клеткой или толерогенной иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антиген доставляется в первую иммунную клетку или в толерогенную иммунную клетку любым из способов, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется индуцирующим толерантность образом, например, толерогенной иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется индуцирующим толерантность образом другой иммунной клеткой, например, второй иммунной клеткой, например иммунной клеткой, имеющей толерогенный фенотип, присущий свойству толерогенной иммунной клетки, или иммунной клеткой, имеющей толерогенный фенотип, независимый от толерогенной иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса I толерогенной иммунной клеткой (например, толерогенной иммунной клеткой или второй иммунной клеткой). В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса II толерогенной иммунной клеткой (например, толерогенной иммунной клеткой или второй иммунной клеткой).

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы доставки антигена и толерогенного фактора, который создает толерогенный фенотип, в первую иммунную клетку, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор проникают в клетку, причем указанная клеточная суспензия соприкасается с антигеном и толерогенным фактором, тем самым образуя толерогенную иммунную клетку, содержащую антиген. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула). В некоторых вариантах осуществления антиген представляется индуцирующим толерантность образом, например, толерогенной иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется индуцирующим толерантность образом другой иммунной клеткой, например, второй иммунной клеткой, например иммунной клеткой, имеющей толерогенный фенотип, присущий свойству толерогенной иммунной клетки, или иммунной клеткой, имеющей толерогенный фенотип, независимый от толерогенной иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса I толерогенной иммунной клеткой (например, толерогенной иммунной клеткой или второй иммунной клеткой). В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса II толерогенной иммунной клеткой (например, толерогенной иммунной клеткой или второй иммунной клеткой).

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы доставки антигена в первую иммунную клетку (например, иммуносупрессорную иммунную клетку), при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует первую иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в клетку, причем указанная клеточная суспензия соприкасается с антигеном. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор доставляется в первую иммунную клетку способами, описанными здесь, тем самым придавая иммуносупрессорный фенотип первой иммунной клетке. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется вызывающим иммуносупрессию образом, например, первой иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется вызывающим иммуносупрессию образом другой иммунной клеткой, например, второй иммунной клеткой, такой как иммунная клетка, имеющая иммуносупрессорный фенотип, присущий свойству первой иммунной клетки, или иммунная клетка, имеющая иммуносупрессорный фенотип, независимый от первой иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса I иммуносупрессорной иммунной клеткой (например, первой или второй иммунной клеткой). В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса II иммуносупрессорной иммунной клеткой (например, первой или второй иммунной клеткой).

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы доставки толерогенного фактора, который создает иммуносупрессорный фенотип, в иммунную клетку, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор, который создает иммуносупрессорный фенотип, проникает в клетку, причем указанная клеточная суспензия соприкасается с толерогенным фактором, тем самым образуя иммуносупрессорную иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула). В некоторых вариантах осуществления антиген эндоцитируется первой иммунной клеткой или иммуносупрессорной иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антиген доставляется в первую иммунную клетку или иммуносупрессорную иммунную клетку любым из способов, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется вызывающим иммуносупрессию образом, например, иммуносупрессорной иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется вызывающим иммуносупрессию образом другой иммунной клеткой, например, второй иммунной клеткой, например, иммунной клеткой, имеющей иммуносупрессорный фенотип, присущий свойству иммуносупрессорной иммунной клетки, или иммунной клеткой, имеющей толерогенный фенотип, независимый от иммуносупрессорной иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса I иммуносупрессорной иммунной клеткой (например, иммуносупрессорной иммунной клеткой или второй иммунной клеткой). В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью MHC класса II иммуносупрессорной иммунной клеткой (например, иммуносупрессорной иммунной клеткой или второй иммунной клеткой).

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы доставки антигена и толерогенного фактора, который создает иммуносупрессорный фенотип, в первую иммунную клетку, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор проникают в клетку, причем указанная клеточная суспензия соприкасается с антигеном и толерогенным фактором, тем самым образуя иммуносупрессорную иммунную клетку, содержащую антиген. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула). В некоторых вариантах осуществления антиген представляется вызывающим иммуносупрессию образом, например, иммуносупрессорной иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется вызывающим иммуносупрессию образом другой иммунной клеткой, например, второй иммунной клеткой, например иммунной клеткой, имеющей иммуносупрессорной фенотип, присущий свойству иммуносупрессорной иммунной клетки, или иммунной клеткой, имеющей иммуносупрессорный фенотип, независимый от иммуносупрессорной иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса I иммуносупрессорной иммунной клеткой (например, иммуносупрессорной иммунной клеткой или второй иммунной клеткой). В некоторых вариантах осуществления антиген процессируется и представляется с помощью МНС класса II иммуносупрессорной иммунной клеткой (например, иммуносупрессорной иммунной клеткой или второй иммунной клеткой).

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления иммунного ответа у индивидуума, включающие пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в иммунную клетку, пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в иммунную клетку, причем образуется иммуносупрессорная иммунная клетка, и введение индивидууму первой иммунной клетки и второй иммунной клетки, причем указанный антиген представляется вызывающим иммуносупрессию образом и подавляет иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется первой иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка имеет толерогенный фенотип, присущий свойству второй иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген представлен второй иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется третьей иммунной клеткой, например, иммунной клеткой, имеющей толерогенный фенотип, присущий свойству второй иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления третья иммунная клетка имеет толерогенный фенотип, независимый от свойства второй иммунной клетки (например, третья иммунная клетка имела толерогенный фенотип до введения индивидууму второй иммунной клетки). В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула). В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся одновременно. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка объединяются в клеточной суспензии до введения индивидууму. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся последовательно. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка вводится индивидууму до введения второй иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка вводится индивидууму более чем за приблизительно 1 минуту, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 12 часов или 24 часа до введения второй иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления вторая иммунная клетка вводится индивидууму до введения первой иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления вторая иммунная клетка вводится индивидууму более чем за приблизительно 1 минуту, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 12 часов или 24 часа до введения первой иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления доставка толерогенного фактора во вторую клетку придает второй клетке секреторную функцию. Например, вторая клетка может секретировать IL-4, IL-10, IL-13, IFNα и/или TGFβ, тем самым усиливая иммуносупрессорное микроокружение. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорное микроокружение допускает толерогенное представление антигена первой клеткой.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы индукции антигенспецифической толерантности у индивидуума, включающие пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в иммунную клетку, пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в иммунную клетку, и введение индивидууму первой иммунной клетки и второй иммунной клетки, причем указанный антиген представляется индуцирующим толерантность образом и подавляет иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется первой иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка имеет толерогенный фенотип, присущий свойству второй иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется второй иммунной клеткой. В некоторых вариантах осуществления антиген представляется третьей иммунной клеткой, например, иммунной клеткой, имеющей толерогенный фенотип, присущий свойству второй иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления третья иммунная клетка имеет толерогенный фенотип, независимым от свойства второй иммунной клетки (например, третья иммунная клетка имела толерогенный фенотип до введения второй иммунной клетки индивидууму). В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула). В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся одновременно. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся последовательно. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка объединяются в клеточной суспензии до введения индивидууму. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка вводится индивидууму до введения второй иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления первая иммунная клетка вводится индивидууму более чем за приблизительно 1 минуту, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 12 часов или 24 часа до введения второй иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления вторая иммунная клетка вводится индивидууму до введения первой иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления вторая иммунная клетка вводится индивидууму более чем за приблизительно 1 минуту, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 12 часов или 24 часа до введения первой иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления доставка толерогенного фактора во вторую клетку придает второй клетке секреторную функцию. Например, вторая клетка может секретировать IL-4, IL-10, IL-13, IFNα и/или TGFβ, тем самым усиливая иммуносупрессорное микроокружение. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорное микроокружение допускает толерогенное представление антигена первой клеткой.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления иммунного ответа у индивидуума, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что соединение, кодирующее нефункциональный цитокин-связывающий белок, проникает в иммунную клетку, и введение индивидууму иммунной клетки, причем указанный нефункциональный цитокин-связывающий белок экспрессируется, причем указанный нефункциональный цитокин-связывающий белок связывается со свободными цитокинами воспаления, тем самым подавляя иммунный ответ. Например, нефункциональный цитокин-связывающий белок может связывать и/или секвестрировать свободные цитокины воспаления, тем самым предотвращая их связывание с функциональными рецепторами цитокинов и инициирование последующей передачи сигналов. В некоторых вариантах осуществления цитокины разрушаются при интернализации и внутриклеточном процессировании нефункциональных цитокин-связывающих белков. В некоторых вариантах осуществления нефункциональный цитокин-связывающий белок включает нефункциональный рецептор цитокина. В некоторых вариантах осуществления в нефункциональном рецепторе цитокина отсутствуют цитоплазматические сигнальные домены. В некоторых вариантах осуществления нефункциональный цитокин-связывающий белок содержит протеолитический центр, который расщепляет цитокин-мишень. Например, нефункциональный цитокин-связывающий белок может включать фермент, который расщепляет или деградирует цитокин при связывании. В некоторых вариантах осуществления нефункциональный цитокин-связывающий белок включает антитело против цитокина. В некоторых вариантах осуществления нефункциональный цитокин-связывающий белок включает В-клеточный рецептор. Приводимые в качестве примера цитокины, которые могут быть связаны нефункциональным рецептором цитокина, включают, без ограничения, IL-2, IL-6, TNF2, IL-1 и IFNκγ.

В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ подавляется на по крайней мере приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 100%. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включают уменьшенный Т-клеточный ответ. Например, уменьшенный Т-клеточный ответ может включать, без ограничения, снижение активации или пролиферации Т-клеток, снижение выживаемости Т-клеток или снижение функциональности клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение активации Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение выживаемости Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение пролиферации Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение функциональности Т-клеток. Например, снижение функциональности Т-клеток может включать, без ограничения, модулирование секреции цитокинов, снижение миграции Т-клеток в места воспаления и снижение цитотоксической активности Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включают снижение продукции и/или секреции цитокинов воспаления и/или увеличение продукции и/или секреции противовоспалительных цитокинов. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включают снижение продукции и/или секреции одного или более цитокинов воспаления, выбираемых из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухолей (TNF), интерферона гамма (IFN-гамма) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включают снижение продукции и/или секреции одного или более противовоспалительных цитокинов, выбираемых из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-альфа и трансформирующего фактора роста бета (TGFβ). В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает изменение фенотипа Т-клеток. Например, статус Т-клеток может меняться с провоспалительного фенотипа на нормальный или противовоспалительный фенотип. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает некостимулированную активацию Т-клетки, которая впоследствии может привести к гибели клеток. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает усиленный ответ регуляторных Т-клеток (Treg). В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает усиленный ответ регуляторных B-клеток (Breg), толерогенных моноцитов, клеток-супрессоров миелоидного происхождения или толерогенных макрофагов. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает уменьшенный В-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления уменьшенный В-клеточный ответ включает снижение продукции антител.

В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает уменьшенную аутоиммунную реакцию. Например, уменьшенная аутоиммунная реакция может включать, без ограничения, уменьшенный иммунный ответ или индуцированную толерантность к антигену, связанному с диабетом I типа, ревматоидным артритом, псориазом, рассеянным склерозом, болезнью Крона или язвенным колитом. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает уменьшенную аллергическую реакцию. Например, уменьшенная аллергическая реакция может включать уменьшенный иммунный ответ или индуцированную толерантность к антигенам, связанным с аллергической астмой, атопическим дерматитом, аллергическим ринитом (сенной лихорадкой) или пищевой аллергией. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген, связанный с трансплантированной тканью. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает уменьшенный иммунный ответ или индуцированную толерантность к трансплантированной ткани. В некоторых вариантах осуществления антиген связан с вирусом. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает уменьшенный патогенный иммунный ответ или индуцированную толерантность к вирусу. Например, патогенный иммунный ответ может включать цитокиновую бурю, вызываемую некоторыми вирусными инфекциями. Цитокиновая буря является потенциально фатальной иммунной реакцией, состоящей из цикла положительной обратной связи между цитокинами и лейкоцитами.

В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является фактор свертывания крови. Приводимые в качестве примера факторы свертывания включают, без ограничения, фактор VIII и фактор IX. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является антитело. Приводимые в качестве примера терапевтические антитела включают, без ограничения, антитела против TNFα, VEGF, CD3, CD20, IL-2R, Her2, RSVF, CEA, IL-1β, CD15, миозина, PSMA, гликопротеина с М.м. 40 кДа, CD33, CD52, IgE, CD11a, EGFR, C5, интегрина альфа-4, IL-12/IL-23, IL-6R и RANKL. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является фактор роста. Приводимые в качестве примера терапевтические факторы роста включают, без ограничения, эритропоэтин (EPO) и фактор дифференциации и роста мегакариоцитов (MDGF). В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является гормон. Приводимые в качестве примера терапевтические гормоны включают, без ограничения, инсулин, гормон роста человека и фолликулостимулирующий гормон. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является рекомбинантный цитокин. Приводимые в качестве примера терапевтические рекомбинантные цитокины включают, без ограничения, IFNβ, IFNα и GM-CSF. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического носителя. В некоторых вариантах осуществления терапевтический носитель представляет собой вирус, такой как аденовирус, аденоассоциированный вирус, бакуловирус, вирус герпеса или ретровирус, используемый для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления терапевтический носитель представляет собой носитель на основе липидов, например липосому. В некоторых вариантах осуществления терапевтический носитель представляет собой наночастицу.

IV. МИКРОФЛУИДНЫЕ КАНАЛЫ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДЕФОРМИРУЮЩИХ КЛЕТКИ СУЖЕНИЙ

В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления иммунного ответа или индукции толерантности путем пропускания клеточной суспензии через сужение, причем сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген или толерогенный фактор проникает в клетку, причем сужение содержится внутри микрофлюидного канала. В некоторых вариантах осуществления множество сужений может быть размещено параллельно и/или последовательно внутри микрофлюидного канала. Приводимые в качестве примера микрофлюидные каналы, содержащие деформирующие клетки сужения, для применения в описанных здесь способах описаны в WO 02013059343. Приводимые в качестве примера поверхности с порами для применения в описанных здесь способах описаны в предварительной заявке на патент США с № 62/214820, поданной 09/04/2015.

В некоторых вариантах осуществления микрофлюидный канал включает просвет и сконфигурирован таким образом, что через него может проходить клетка, суспендированная в буфере, причем микрофлюидный канал включает сужение. Микрофлюидный канал может быть изготовлен из любого из ряда материалов, в том числе кремния, металла (например, нержавеющей стали), пластика (например, полистирола), керамики, стекла, кристаллических веществ, аморфных веществ или полимеров (например, полиметилметакрилата (PMMA), PDMS, циклоолефинового сополимера (COC) и т. д.). Изготовление микрофлюидного канала может быть выполнено любым способом, известным в данной области техники, включая сухое травление, мокрое травление, фотолитографию, литьевое формование, лазерную абляцию или маски SU-8.

В некоторых вариантах осуществления сужение внутри микрофлюидного канала включает входную часть, центральную точку и выходную часть. В некоторых вариантах осуществления длина, глубина и ширина сужения внутри микрофлюидного канала могут меняться. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения внутри микрофлюидного канала зависит от диаметра клетки или кластера клеток. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения внутри микрофлюидного канала составляет от приблизительно 20% до приблизительно 99% от диаметра клетки. В некоторых вариантах осуществления размер сужения составляет приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от диаметра клетки. В некоторых вариантах осуществления размер сужения составляет приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от минимального поперечного сечения клетки. В некоторых вариантах осуществления канал содержит сужение шириной между приблизительно 2 мкм и приблизительно 10 мкм или любой шириной или в любом диапазоне ширины между ними. Например, ширина сужения может быть любой из приблизительно 2 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 4 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 6 мкм или приблизительно 7 мкм. В некоторых вариантах осуществления канал содержит сужение длиной, составляющей приблизительно 10 мкм, и шириной, составляющей приблизительно 4 мкм. Поперечное сечение канала, входной части, центральной точки и выходной части также могут меняться. Например, поперечные сечения могут быть круглыми, эллиптическими, удлиненными щелями, квадратными, шестиугольными или треугольными по форме. Входная часть определяет угол сужения, при этом угол сужения оптимизирован для уменьшения закупорки канала и оптимизирован для увеличения доставки соединения в клетку. Угол выходной части также может меняться. Например, угол выходной части сконфигурирован так, чтобы уменьшить вероятность турбулентности, которая может привести к неламинарному потоку. В некоторых вариантах осуществления стенки входной части и/или выходной части являются линейными. В других вариантах осуществления стенки входной части и/или выходной части являются изогнутыми.

V. ПОВЕРХНОСТЬ С ПОРАМИ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДЕФОРМИРУЮЩИХ КЛЕТКИ СУЖЕНИЙ

В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления иммунного ответа или индукции толерантности путем пропускания клеточной суспензии через сужение, причем сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и/или толерогенный фактор проникает в клетку, причем сужение представляет собой пору или содержится внутри поры. В некоторых вариантах осуществления поры содержатся внутри поверхности. Приводимые в качестве примера поверхности с порами для применения в описанных здесь способах описаны в предварительной заявке на патент США с № 62/214820, поданной 09/04/2015.

Описываемые здесь поверхности могут быть изготовлены из любого из ряда материалов и принимать любую из ряда форм. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой фильтр. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой мембрану. В некоторых вариантах осуществления фильтром является фильтр для тангенциальной поточной фильтрации. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой губчатую или губкообразную матрицу. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой матрицу.

В некоторых вариантах осуществления поверхностью является поверхность в виде извилистого пути. В некоторых вариантах осуществления поверхность в виде извилистого пути содержит ацетат целлюлозы. В некоторых вариантах осуществления поверхность включает материал, выбираемый, без ограничения, из синтетических или природных полимеров, поликарбоната, кремния, стекла, металла, сплава, нитрата целлюлозы, серебра, ацетата целлюлозы, найлона, сложного полиэфира, полиэфирсульфона, полиакрилонитрила (PAN), полипропилена, PVDF, политетрафторэтилена, смеси сложных эфиров целлюлозы, фарфора и керамики.

Описываемая здесь поверхность может иметь любую форму, известную в данной области техники; например трехмерную форму. Двумерная форма поверхности может быть, без ограничения, круглой, эллиптической, круглой, квадратной, звездообразной, треугольной, многоугольной, пятиугольной, шестиугольной, семиугольной или восьмиугольной. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет круглую форму. В некоторых вариантах осуществления трехмерная форма поверхности является цилиндрической, конической или кубической.

Поверхность может иметь различную ширину и толщину поперечного сечения. В некоторых вариантах осуществления ширина поперечного сечения поверхности составляет от приблизительно 1 мм до приблизительно 1 м или любую ширину поперечного сечения или любой диапазон поперечных сечений между ними. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет определенную толщину. В некоторых вариантах толщина поверхности является постоянной. В некоторых вариантах толщина поверхности является переменной. Например, в некоторых вариантах осуществления одни участки поверхности являются более толстыми или тонкими, чем другие участки поверхности. В некоторых вариантах толщина поверхности меняется на приблизительно 1% - приблизительно 90% или любой процент или любой диапазон процентов между ними. В некоторых вариантах осуществления толщина поверхности составляет от приблизительно 0,01 мкм до приблизительно 5 мм или любое значение или любой диапазон значений между ними.

В некоторых вариантах осуществления сужение представляет собой пору или содержится внутри поры. Ширина поперечного сечения пор связана с типом подвергаемой воздействию клетки. В некоторых вариантах осуществления размер пор зависит от диаметра клетки или кластера клеток, подвергаемых воздействию. В некоторых вариантах осуществления размер пор таков, что в клетке происходит нарушение при прохождении через пору. В некоторых вариантах осуществления размер пор меньше, чем диаметр клетки. В некоторых вариантах осуществления размер пор составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% от диаметра клетки. В некоторых вариантах осуществления размер пор составляет приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от диаметра клетки. Оптимальный размер пор или ширина поперечного сечения пор может меняться в зависимости от типа приложения и/или клетки. В некоторых вариантах осуществления размер пор составляет от приблизительно 2 мкм до приблизительно 14 мкм. В некоторых вариантах осуществления размер пор составляет приблизительно 2 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 4 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 8 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 12 мкм или приблизительно 14 мкм. В некоторых вариантах осуществления ширина поперечного сечения составляет от приблизительно 2 мкм до приблизительно 14 мкм. В некоторых вариантах осуществления поперечное сечение пор составляет приблизительно 2 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 4 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 8 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 12 мкм или приблизительно 14 мкм.

Входы и выходы из канала поры могут иметь различные углы. Угол поры можно выбрать для минимизации закупоривания поры при прохождении клеток. В некоторых вариантах осуществления скорость потока через поверхность составляет от приблизительно 0,001 мл/см²/сек до приблизительно 100 л/см²/сек или любую скорость или любой диапазон скоростей между ними. Например, угол входной или выходной части может составлять от приблизительно 0 до приблизительно 90 градусов. В некоторых вариантах осуществления входная или выходная часть может быть больше 90 градусов. В некоторых вариантах осуществления поры имеют одинаковые углы входа и выхода. В некоторых вариантах осуществления поры имеют разные углы входа и выхода. В некоторых вариантах осуществления край поры является гладким, например закругленным или изогнутым. Гладкий край поры имеет сплошную, плоскую и ровную поверхность без выступов, гребней или неровных частей. В некоторых вариантах осуществления край поры является острым. Острый край поры имеет тонкий край, который заострен или находится под острым углом. В некоторых вариантах осуществления канал поры является прямым. Прямой канал поры не содержит кривых, изгибов, углов или других неровностей. В некоторых вариантах осуществления канал поры является изогнутым. Изогнутый канал пор изогнут или отклоняется от прямой линии. В некоторых вариантах осуществления канал поры содержит множество кривых, например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более кривых.

Поры могут иметь любую форму, известную в данной области техники, включая двумерную или трехмерную форму. Форма пора (например, форма поперечного сечения) может быть, без ограничения, круглой, эллиптической, круглой, квадратной, звездообразной, треугольной, многоугольной, пятиугольной, шестиугольной, семиугольной и восьмиугольной. В некоторых вариантах осуществления поперечное сечение поры имеет округлую форму. В некоторых вариантах осуществления трехмерная форма поры является цилиндрической или конической. В некоторых вариантах осуществления пора имеет рифленую форму входа и выхода. В некоторых вариантах осуществления форма пор является гомогенной (т.е. единообразной или регулярной) между порами внутри конкретной поверхности. В некоторых вариантах осуществления форма пор является гетерогенной (т.е. смешанной или разнообразной) между порами внутри конкретной поверхности.

Описанные здесь поверхности могут содержать диапазон общего количества пор. В некоторых вариантах осуществления поры охватывают от приблизительно 10% до приблизительно 80% от общей площади поверхности. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит от приблизительно 1,0×10⁵ до приблизительно 1,0×10³⁰ всех пор или любое число или любой диапазон чисел между ними. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит от приблизительно 10 до приблизительно 1,0×10¹⁵ пор на мм² площади поверхности.

Поры могут быть распределены различными способами внутри конкретной поверхности. В некоторых вариантах осуществления поры распределены параллельно внутри конкретной поверхности. В одном из таких примеров поры распределены бок о бок в одном и том же направлении и находятся на одном и том же расстоянии друг от друга внутри конкретной поверхности. В некоторых вариантах распределение пор упорядочено или гомогенно. В одном из таких примеров поры распределены регулярным, систематическим образом или находятся на одном и том же расстоянии друг от друга внутри конкретной поверхности. В некоторых вариантах осуществления распределение поры является случайным или гетерогенным. В одном из таких примеров поры распределены нерегулярным, неупорядоченным образом или находятся на разных расстояниях друг от друга на конкретной поверхности. В некоторых вариантах осуществления множество поверхностей распределены последовательно. Множество поверхностей может быть гомогенным или гетерогенными по размеру поверхности, ее форме и/или шероховатости. Множество поверхностей может дополнительно содержать поры с гомогенным или гетерогенным размером пор, их формой и/или числом, тем самым обеспечивая одновременную доставку ряда соединений в различные типы клеток.

В некоторых вариантах осуществления отдельная пора имеет постоянный размер ширины (т.е. постоянную ширину вдоль длины канала поры). В некоторых вариантах осуществления отдельная пора имеет переменную ширину (т.е. увеличивающуюся или уменьшающуюся ширину вдоль длины канала поры). В некоторых вариантах осуществления поры внутри конкретной поверхности имеют одинаковую глубину отдельной поры. В некоторых вариантах осуществления поры внутри конкретной поверхности имеют разные глубины отдельных пор. В некоторых вариантах осуществления поры непосредственно примыкают друг к другу. В некоторых вариантах осуществления поры разделены друг от друга расстоянием. В некоторых вариантах осуществления поры разделены друг от друга расстоянием от приблизительно 0,001 мкм до приблизительно 30 мм или любым расстоянием или любым диапазоном расстояний между ними.

В некоторых вариантах осуществления поверхность покрыта материалом. Материал может быть выбран из любого материала, известного в данной области техники, включая, без ограничения, тефлон, клейкое покрытие, поверхностно-активные вещества, белки, молекулы адгезии, антитела, антикоагулянты, факторы, которые модулируют клеточную функцию, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы или трансмембранные белки. В некоторых вариантах осуществления поверхность покрыта поливинилпирролидоном. В некоторых вариантах осуществления материал ковалентно прикреплен к поверхности. В некоторых вариантах осуществления материал нековалентно прикреплен к поверхности. В некоторых вариантах осуществления поверхностные молекулы высвобождаются в клетки, проходящие через поры.

В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет модифицированные химические свойства. В некоторых вариантах осуществления поверхность является полярной. В некоторых вариантах осуществления поверхность является гидрофильной. В некоторых вариантах осуществления поверхность является неполярной. В некоторых вариантах осуществления поверхность является гидрофобной. В некоторых вариантах осуществления поверхность является заряженной. В некоторых вариантах осуществления поверхность является положительно и/или отрицательно заряженной. В некоторых вариантах осуществления поверхность может быть положительно заряжена в некоторых участках и отрицательно заряжена в других участках. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет общий положительный или общий отрицательный заряд. В некоторых вариантах осуществления поверхность может быть любой из гладкой, электрополированной, грубой или подвергнутой плазменной обработке. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит цвиттерион или диполярное соединение. В некоторых вариантах осуществления поверхность подвергнута плазменной обработке.

В некоторых вариантах осуществления поверхность содержится внутри более крупного модуля. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержится внутри шприца, такого как пластиковый или стеклянный шприц. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержится внутри пластикового держателя фильтра. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержится внутри наконечника пипетки.

VI. НАРУШЕНИЯ В КЛЕТКАХ

В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления иммунного ответа или индукции толерантности путем пропускания клеточной суспензии через сужение, причем сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген или толерогенный фактор проникает в клетку, причем нарушением в клетке является нарушение в клетке, которое позволяет материалу изнутри клетки перемещаться в клетку (например, дыра, разрыв, полость, отверстие, пора, разрыв, зазор, перфорация). Деформация может быть вызвана, например, давлением, вызванным механическим воздействием и/или поперечными силами. В некоторых вариантах осуществления нарушением является нарушение внутри клеточной мембраны. В некоторых вариантах осуществления нарушение является временным. В некоторых вариантах осуществления нарушение в клетке длится от приблизительно 1,0×10^-9 секунд до приблизительно 2 часов или любое время или промежуток времени между ними. В некоторых вариантах осуществления нарушение в клетке длится от приблизительно 1,0×10^-9 секунд до приблизительно 1 секунды, от приблизительно 1 секунды до приблизительно 1 минуты или от приблизительно 1 минуты до приблизительно 1 часа. В некоторых вариантах осуществления нарушение в клетке длится от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-2, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-3, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-4, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-5, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-6, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-7 или от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-8 секунд. В некотором варианте осуществления нарушение в клетке длится в течение любого из следующих промежутков времени: от приблизительно 1,0×10^-8 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-7 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-6 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-5 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-4 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-3 до приблизительно 1,0×10^-1 или от приблизительно 1,0×10^-2 до приблизительно 1,0×10^-1 секунд. Нарушения (например, поры или дыры) в клетках, созданные описанными здесь способами, не образуются в результате сборки белковых субъединиц с образованием мультимерной структуры пор, такой как структура, созданная комплементарными или бактериальными гемолизинами.

Когда клетка проходит через сужение, сужение временно порождает повреждение в клеточной мембране, которое является причиной пассивной диффузии материала через нарушение. В некоторых вариантах осуществления клетка деформируется только в течение короткого периода времени, порядка 100 мкс, чтобы минимизировать вероятность активации путей апоптоза через механизмы передачи сигналов в клетке, хотя возможны и другие продолжительности (например, от наносекунд до часов). В некоторых вариантах осуществления клетка деформируется в течение от приблизительно 1,0×10^-9 секунд до приблизительно 2 часов или в течение любого времени или промежутка времени между ними. В некоторых вариантах осуществления клетка деформируется в течение приблизительно 1,0×10^-9 секунд - приблизительно 1 секунды, приблизительно 1 секунды - приблизительно 1 минуты или приблизительно 1 минуты - приблизительно 1 часа. В некоторых вариантах осуществления клетка деформируется в течение любого из следующих промежутков времени: от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-2, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-3, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-4, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-5, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-6, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-7 или от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-8 секунд. В некотором варианте осуществления клетка деформируется в течение любого из следующих промежутков времени: от приблизительно 1,0×10^-8 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-7 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-6 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-5 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-4 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-3 до приблизительно 1,0×10^-1 или от приблизительно 1,0×10^-2 до приблизительно 1,0×10^-1 секунд. В некоторых вариантах осуществления деформирование клетки включает деформирование клетки в течение времени в диапазоне, без ограничения, от приблизительно 1 мкс до по крайней мере приблизительно 750 мкс, например, по крайней мере приблизительно 1 мкс, 10 мкс, 50 мкс, 100 мкс, 500 мкс или 750 мкс.

В некоторых вариантах осуществления прохождение соединения в клетку происходит одновременно с прохождением клетки через сужение и/или нарушением в клетке. В некоторых вариантах осуществления прохождение соединения в клетку происходит после прохождения клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления прохождение соединения в клетку происходит через несколько минут после прохождения клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления прохождение соединения в клетку происходит через приблизительно 1,0×10^-2 секунд - по крайней мере приблизительно 30 минут после прохождения клетки через сужение. Например, прохождение соединения в клетку происходит через приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 1 секунду, приблизительно 1 секунду - приблизительно 1 минуту или приблизительно 1 минуту - приблизительно 30 минут после прохождения клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления прохождение соединения в клетку происходит через приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 10 минут, приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 5 минут, приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 1 минуту, приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 50 секунд, приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 10 секунд, приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 1 секунду или приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 0,1 секунды после прохождения клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления прохождение соединения в клетку происходит через приблизительно 1,0×10^-1 секунд - приблизительно 10 минут, приблизительно 1 секунду - приблизительно 10 минут, приблизительно 10 секунд - приблизительно 10 минут, приблизительно 50 секунд - приблизительно 10 минут, приблизительно 1 минуту - приблизительно 10 минут или приблизительно 5 минут - приблизительно 10 минут после прохождения клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления нарушение в клетке после ее прохождения через сужение устраняется в пределах порядка приблизительно пяти минут после прохождения клетки через сужение.

В некоторых вариантах жизнеспособность клеток после прохождения через сужение составляет от приблизительно 5% до приблизительно 100%. В некоторых вариантах жизнеспособность клеток после прохождения через сужение составляет по крайней мере приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток определяется через приблизительно 1,0×10^-2 секунд - по крайней мере приблизительно 10 дней после прохождения клетки через сужение. Например, жизнеспособность клеток определяется через приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 1 секунды, приблизительно 1 секунды - приблизительно 1 минуты, приблизительно 1 минуты -приблизительно 30 минут или приблизительно 30 минут - приблизительно 2 часа после прохождения клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток определяется через приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 2 часа, приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 1 час, приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 30 минут, приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 1 минуту, приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 30 секунд, приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 1 секунду или приблизительно 1,0×10^-2 секунд - приблизительно 0,1 секунды после прохождения клетки через сужение. В некоторых вариантах жизнеспособность клеток определяется через приблизительно 1,5 часа - приблизительно 2 часа, приблизительно 1 час - приблизительно 2 часа, приблизительно 30 минут - приблизительно 2 часа, приблизительно 15 минут - приблизительно 2 часа, приблизительно 1 минуту - приблизительно 2 часа, приблизительно 30 секунд - приблизительно 2 часа или приблизительно 1 секунду -приблизительно 2 часа после прохождения клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток определяется через приблизительно 2 часа - приблизительно 5 часов, приблизительно 5 часов - приблизительно 12 часов, приблизительно 12 часов - приблизительно 24 часа или приблизительно 24 часа - приблизительно 10 дней после прохождения клетки через сужение.

VII. ПАРАМЕТРЫ ДОСТАВКИ

Ряд параметров может влиять на доставку соединения в клетку для подавления иммунного ответа или индукции толерантности описанными здесь способами. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия соприкасается с соединением до, одновременно или после прохождения через сужение. Через сужение может проходить клетка, суспендированная в растворе, который включает соединение для доставки, хотя соединение может быть добавлено к клеточной суспензии после пропускания клеток через сужения. В некоторых вариантах осуществления сужение покрыто соединением для доставки.

Примеры параметров, которые могут влиять на доставку соединения в клетку, включают, но без ограничения ими, размеры сужения, угол на входе в сужение, поверхностные свойства сужений (например, шероховатость, химическая модификация, гидрофильность, гидрофобность и т.д.), скорости рабочего потока (например, время прохождения клетки через сужение), концентрацию клеток, концентрация соединения в клеточной суспензии, и время, в течение которого клетка восстанавливается или инкубируется после прохождения через сужения, может повлиять на прохождение доставляемого соединения в клетку. Дополнительные параметры, влияющие на доставку соединения в клетку, могут включать скорость клетки в сужении, скорость сдвига в сужении, вязкость клеточной суспензии, составляющую скорости, перпендикулярную скорости потока, и время в сужение. Такие параметры могут быть разработаны для контроля доставки соединения. В некоторых вариантах осуществления концентрация клеток находится в диапазоне от приблизительно 10 до по крайней мере приблизительно 10¹² клеток/мл или быть любой концентрацией или диапазоном концентраций между ними. В некоторых вариантах осуществления концентрации соединений для доставки могут находиться в диапазоне от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 1 г/мл или быть любой концентрацией или диапазоном концентраций между ними. В некоторых вариантах осуществления концентрации соединений для доставки могут находиться в диапазоне от приблизительно 1 мкМ до по крайней мере приблизительно 2 М или быть любой концентрации или диапазоном концентраций между ними.

Температуру, используемую в способах настоящего изобретения, можно регулировать, чтобы влиять на доставку соединений и жизнеспособность клеток. В некоторых вариантах осуществления способ выполняют при температуре между приблизительно -5^οС и приблизительно 45^οС. Например, способы могут быть выполнены при комнатной температуре (например, приблизительно 20^οС), физиологической температуре (например, приблизительно 37^οС), выше, чем физиологическая температуре (например, выше, чем приблизительно 37^οС-45^οС или более) или пониженной температуры (например, от приблизительно -5^οС до приблизительно 4^οС) или температурах между этими примерными температурами.

Различные способы могут быть использованы для перемещения клеток через сужения. Например, давление может подаваться насосом со стороны входа (например, газовым баллоном или компрессором), вакуум может создаваться вакуумным насосом со стороны выхода, капиллярное действие может использоваться через трубку, и/или питание системы может осуществляться посредством силы тяжести. Также могут использоваться системы потока на основе подачи (например, шприцевой насос, перистальтический насос, ручной шприц или пипетка, поршни и т.д.). В некоторых вариантах осуществления клетки проходят через сужения при положительном давлении или отрицательном давлении. В некоторых вариантах осуществления клетки проходят через сужения при постоянном давлении или переменном давлении. В некоторых вариантах осуществления давление подается с помощью шприца. В некоторых вариантах осуществления давление подается с помощью насоса. В некоторых вариантах осуществления насос представляет собой перистальтический насос или мембранный насос. В некоторых вариантах осуществления давление применяется с использованием вакуума. В некоторых вариантах осуществления клетки проходят через сужения в результате гравитации. В некоторых вариантах осуществления клетки проходят через сужения под действием центробежной силы. В некоторых вариантах осуществления клетки проходят через сужения под действием капиллярных сил.

В некоторых вариантах поток жидкости направляет клетки через сужения. В некоторых вариантах осуществления поток жидкости является турбулентным потоком до прохождения клеток через сужение. Турбулентный поток представляет собой поток жидкости, в котором скорость в конкретной точке меняется неравномерно по величине и направлению. В некоторых вариантах осуществления поток жидкости через сужение является ламинарным потоком. Ламинарный поток включает непрерывный поток в жидкости вблизи твердой границы, где направление потока в каждой точке остается постоянным. В некоторых вариантах осуществления поток жидкости является турбулентным потоком после прохождения клеток через сужение. Скорость, с которой клетки проходят через сужения, может меняться. В некоторых вариантах осуществления клетки проходят через сужения при одинаковой скорости клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки проходят через сужения при флуктуирующей скорости клеток.

В других вариантах осуществления используется для подавления иммунного ответа или индукции толерантности путем пропускания клеточной суспензии через сужение, причем сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген или толерогенный фактор проникает в клетку, используется комбинированное воздействие, например, описанные здесь способы с последующим подверганием воздействию электрического поля на выходе из сужения. В некоторых вариантах осуществления клетка пропускается через электрическое поле, создаваемое по крайней мере одним электродом, после прохождения через сужение. В некоторых вариантах осуществления электрическое поле помогает в доставке соединений во второе местоположение внутри клетки, такое как ядро клетки. Например, комбинация из деформирующего клетки сужения и электрического поля позволяет доставлять плазмиду, кодирующую антитело, в клетку (например, клеточное ядро), что приводит к de novo продукции антитела. В некоторых вариантах осуществления один или более электродов находятся вблизи деформирующего клетки сужения для создания электрического поля. В некоторых вариантах осуществления напряженность электрического поля составляет от приблизительно 0,1 кВ/м до приблизительно 100 МВ/м или любое число или диапазоном чисел между ними. В некоторых вариантах осуществления интегральная схема используется для обеспечения электрического сигнала для управления электродами. В некоторых вариантах осуществления клетки подвергаются воздействию электрического поля с длительностью импульса от приблизительно 1 нсек до приблизительно 1 сек и в течение периода времени от приблизительно 100 нсек до приблизительно 10 сек или любого времени или интервалом между ними.

VIII. КЛЕТОЧНЫЕ СУСПЕНЗИИ ДЛЯ ДОСТАВКИ В ИММУННЫЕ КЛЕТКИ

Клеточная суспензия может представлять собой смешанную или очищенную популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия представляет собой смешанную популяцию клеток, такую как цельная кровь. В некоторых вариантах клеточная суспензия представляет собой очищенную популяцию клеток, такую как очищенная популяция иммунных клеток.

Композиция клеточной суспензии (например, осмолярность, концентрация соли, содержание сыворотки, концентрация клеток, рН и т.д.) может влиять на доставку соединения для подавления иммунного ответа или индукции толерантности. В некоторых вариантах осуществления суспензия включает цельную кровь. Альтернативно, клеточная суспензия представляет собой смесь клеток в физиологическом солевом растворе или физиологической среде, отличной от крови. В некоторых вариантах клеточная суспензия включает водный раствор. В некоторых вариантах осуществления водный раствор включает среду для культивирования клеток, PBS, соли, сахара, факторы роста, продукты животного происхождения, наполнители, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества, витамины, аминокислоты, белки, ингибиторы клеточного цикла и/или агент, который оказывает влияние на полимеризацию актина. В некоторых вариантах осуществления средой для культивирования клеток является DMEM, Opti-MEM®, IMDM или RPMI. Кроме того, буферный раствор может включать одно или более смазочных материалов (плюроников или других поверхностно-активных веществ), которые могут быть предназначены, например, для уменьшения или устранения засорения поверхности и повышения жизнеспособности клеток. Приводимые в качестве примера поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, полоксамер, полисорбаты, сахара или сахарные спирты, такие как маннит, сорбит, сыворотка животного происхождения и белок альбумин.

В некоторых компоновках с определенными типами клеток клетки можно инкубировать в одном или более растворах, которые помогают доставлять соединение во внутреннюю часть клетки. В некоторых вариантах осуществления водный раствор содержит агент, который оказывает влияние на полимеризацию актина. В некоторых вариантах осуществления агентом, который оказывает влияние на полимеризацию актина, является Латрункулин A, Цитохаоазин и/или Колхицин. Например, клетки могут инкубироваться в растворе для деполимеризации, таком как Латрункулин A (0,1 мкг/мл), в течение 1 часа до доставки для деполимеризации актинового цитоскелета. В качестве дополнительного примера клетки могут инкубироваться в 10 мкМ Колхицине (Sigma) в течение 2 часов до доставки для деполимеризации сети микротрубочек.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток обогащается перед применением в описанных способах. Например, клетки получают из жидкости организма, например, периферической крови и необязательно обогащают или очищают для концентрации В-клеток. Клетки могут быть обогащены любыми способами, известными в данной области техники, включая, без ограничения, разделение клеток в магнитном поле, клеточную сортировку с возбуждение флуоресценции (FACS) или центрифугирование в градиенте плотности.

Вязкость клеточной суспензии также может влиять на способы, описанные здесь. В некоторых вариантах осуществления вязкость клеточной суспензии находится в пределах от приблизительно 8,9×10^-4 Па^.сек до приблизительно 4,0×10^-3 Па^.сек или является любым значением или диапазоном значений между ними. В некоторых вариантах осуществления вязкость находится в пределах от приблизительно 8,9×10^-4 Па^.сек до приблизительно 4,0×10^-3 Па^.сек, от приблизительно 8,9×10^-4 Па^.сек до приблизительно 3,0×10^-3 Па^.сек, от приблизительно 8,9×10^-4 Па^.сек до приблизительно 2,0×10^-3 Па^.сек или от приблизительно 8,9×10^-4 Па^.сек до приблизительно 1,0×10^-3 Па^.сек. В некоторых вариантах осуществления вязкость находится в любых их следующих пределов: от приблизительно 0,89 сП до приблизительно 4,0 сП, от приблизительно 0,89 сП до приблизительно 3,0 сП, от приблизительно 0,89 сП до приблизительно 2,0 сП или от приблизительно 0,89 сП до приблизительно 1,0 сП. В некоторых вариантах осуществления наблюдается эффект разжижения сдвига, при котором вязкость клеточной суспензии уменьшается в условиях деформации сдвига. Вязкость может быть определена любым способом, известным в данной области техники, включая, без ограничения, вискозиметры, такие как стеклянный капиллярный вискозиметр или реометры. Вискозиметр измеряет вязкость при одном состоянии потока, в то время как реометр используется для измерения вязкостей, которые изменяются в зависимости от условий потока. В некоторых вариантах осуществления вязкость измеряется для раствора, разжижающегося при сдвиге, такого как кровь. В некоторых вариантах осуществления вязкость измеряется при температуре от приблизительно -5^οС до приблизительно 45^οС. Например, вязкость измеряется при комнатной температуре (например, приблизительно 20^οС), физиологической температуре (например, приблизительно 37^οС), выше, чем физиологическая температура (например, выше, чем 37^οС-45^οС или более), пониженной температуре (например, от -5^οС до приблизительно 4^οС) или температур между этими примерными температурами.

IX. АНТИГЕНЫ И ТОЛЕРОГЕННЫЕ ФАКТОРЫ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА ИЛИ ИНДУКЦИИ ТОЛЕРАНТНОСТИ

В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечивается доставка антигенов для подавления иммунного ответа или индукции толерантности, причем антиген доставляется в клетку любым из способов, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой один антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой смесь антигенов. Антиген представляет собой вещество, которое стимулирует специфический иммунный ответ, такой как клеточный иммунный ответ и антителоопосредуемый (гуморальный) иммунный ответ. Антигены связываются с рецепторами, экспрессируемыми иммунными клетками, такими как Т-клеточные рецепторы (TCR), которые являются специфическими для конкретного антигена. Связывание антигена с рецептором впоследствии запускает внутриклеточные пути передачи сигналов, которые приводят к последующим иммунным эффекторным путям, таким как активация клеток, продукция цитокинов, миграция клеток, секреция цитотоксических факторов и продукция антител.

В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген в виде полипептида. В некоторых вариантах осуществления соединение включает ассоциированный с болезнью антиген. В некоторых вариантах осуществления антигены происходят из чужеродных источников, таких как бактерии, грибы, вирусы или аллергены. В некоторых вариантах осуществления антигены происходят из внутренних источников, таких как собственные белки (т.е. аутоантигены). В некоторых вариантах осуществления антиген присутствует в клеточном лизате. Аутоантигенами являются антигены, присутствующие на собственных клетках организма или в них. Аутоантигены обычно не стимулируют иммунный ответ, но могут это делать в случае аутоиммунных заболеваний, таких как диабет типа I или ревматоидный артрит. В некоторых вариантах осуществления антигеном является терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой терапевтический полипептид или фрагмент терапевтического полипептида. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является фактор свертывания крови. Приводимые в качестве примера факторы свертывания включают, без ограничения, фактор VIII и фактор IX. Например, антиген может представлять собой белок фактора VIII, используемый для лечения гемофилии. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является антитело. Приводимые в качестве примера терапевтические антитела включают, без ограничения, антитела против TNFα, VEGF, CD3, CD20, IL-2R, Her2, RSVF, CEA, IL-1β, CD15, миозина, PSMA, гликопротеина с М.м. 40 кДа, CD33, CD52, IgE, CD11a, EGFR, C5, интегрина альфа-4, IL-12/IL-23, IL-6R и RANKL. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является фактор роста. Приводимые в качестве примера терапевтические факторы роста включают, без ограничения, эритропоэтин (EPO) и фактор дифференциации и роста мегакариоцитов (MDGF). В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является гормон. Приводимые в качестве примера терапевтические гормоны включают, без ограничения, инсулин, гормон роста человека и фолликулостимулирующий гормон. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим средством является рекомбинантный цитокин. Приводимые в качестве примера терапевтические рекомбинантные цитокины включают, без ограничения, IFNβ, IFNα и GM-CSF.

В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой трансплантационный антиген аллотрансплантата. Трансплантация аллотрансплантата представляет собой перенос клеток, тканей или органов реципиенту от генетически неидентичного донора того же вида. В некоторых вариантах осуществления антигеном является модифицированный антиген. Например, антигены могут быть слиты с терапевтическими средствами или направляющими пептидами. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген слит с полипептидом. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген слит с липидом. В некоторых вариантах осуществления антигеном является небелковый антиген, такой как липид, гликолипид или полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой целый микроорганизм, такой как интактная бактерия.

В некоторых вариантах осуществления антиген связан с вирусом. В некоторых вариантах осуществления антигеном является вирусный антиген. Приводимые в качестве примера вирусные антигены включают антигены SARS-CoV и антигены гриппа. В некоторых вариантах осуществления соединение включает лизат клеток из ткани, инфицированной неизвестным патогеном. В некоторых вариантах осуществления антигеном является терапевтический носитель. В некоторых вариантах осуществления терапевтический носитель представляет собой вирус, такой как аденовирус, аденоассоциированный вирус, бакуловирус, вирус герпеса или ретровирус, используемый для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим носителем является липосома. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим носителем является наночастица.

В некоторых вариантах осуществления антиген связан с микроорганизмом; например, бактерией. В некоторых вариантах осуществления подавленный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает уменьшенный патогенный иммунный ответ или индуцированную толерантность к микроорганизму; например, бактерии. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм является частью микробиома индивидуума. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм может приносить пользу микробиому индивидуума.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы доставки антигена в иммунную клетку, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в клетку, причем указанная клеточная суспензия соприкасается с антигеном. В некоторых вариантах осуществления процессирование и представление антигена в толерогенной среде подавляет иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления процессирование и представление указанного антигена в толерогенной среде индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген доставляется в иммунную клетку in vitro, ex vivo или in vivo.

В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечивается доставка толерогенных факторов для подавления иммунного ответа или индукции толерантности, причем толерогенный фактор доставляется в клетку любым из описанных здесь способов. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает подавление иммунного ответа на антиген или усиливает индукцию толерантности к антигену. Например, толерогенный фактор может способствовать толерогенному представлению антигена антигепредставляющей клеткой. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор вводится одновременно с антигеном. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор и антиген вводятся последовательно.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы образования иммуносупрессорной антигенпредставляющей иммунной клетки, содержащей антиген, в которых иммуносупрессорную иммунную клетку пропускают через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген проникает в иммунную клетку, тем самым образуя иммуносупрессорную иммунную клетку, содержащую антиген.

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодулирующего агента (такого как иммуностимулирующий агент (например, костимулирующая молекула), иммунодепрессант или воспалительная или противовоспалительная молекула). В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует экспрессию и/или активность иммуностимулирующего агента (например, костимулирующей молекулы), усиливает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы, ингибирует экспрессию и/или активность молекулы воспаления и/или усиливает экспрессию и/или активность противовоспалительной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует активность костимулирующей молекулы. Взаимодействие между костимулирующими молекулами и их лигандами важно для поддержания и интеграции передачи сигналов от TCR для стимуляции оптимальной пролиферации и дифференцировки Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор уменьшает экспрессию костимулирующей молекулы. Приводимые в качестве примера костимулирующие молекулы, представленные на антигенпредставляющих клетках, включают, без ограничения, CD40, CD80, CD86, CD54, CD83, CD79 или лиганд для ICOS. В некоторых вариантах осуществления костимулирующей молекулой является CD80 или CD86. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует экспрессию нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует или модулирует экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор удаляет нуклеиновую кислоту, которая экспрессирует или модулирует экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления удаление нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует или модулирует экспрессию костимулирующей молекулы, достигается посредством редактирования гена. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует костимулирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой короткую интерферирующую РНК (siRNA), которая ингибирует костимулирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор разрушает костимулирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор маркирует костимулирующую молекулу для разрушения. Например, толерогенный фактор может усилить убиквитинирование костимулирующей молекулы, тем самым нацеливая ее на разрушение.

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорной молекулой является коингибирующая молекула, регулятор транскрипции или иммуносупрессорная молекула. Коингибирующие молекулы негативно регулируют активацию лимфоцитов. Приводимые в качестве примера коингибирующие молекулы включают, без ограничения, PD-L1, PD-L2, HVEM, B7-H3, TRAIL, рецепторы для иммуноглобулиноподобных транскриптов (ILT) (ILT2, ILT3, ILT4), FasL, CTLA4, CD39, CD73, и B7-H4. В некоторых вариантах осуществления коингибирующая молекула представляет собой PD-L1 или PD-L2. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует коингибирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который усиливает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность полипептида, который увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует ингибитор коингибирующей молекулы.

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы. Приводимые в качестве примера иммуносупрессорные молекулы включают, без ограничения, аргиназу-1 (ARG1), индоламин-2,3-диоксигеназу (IDO), простагландин E2 (PGE2), индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS), оксид азота (NO), синтазу 2 оксида азота (NOS2), тимусный стромальный лимфопоэтин (TSLP), вазоактивный интестинальный пептид (VIP), фактор роста гепатоцитов (HGF), трансформирующий фактор роста бета (TGFβ), IFNα, IL-4, IL-10, IL-13 и IL-35. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорной молекулой является NO или IDO. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует иммуносупрессорную молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность полипептида, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует негативный регулятор иммуносупрессорной молекулы.

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует экспрессию и/или активность молекулы воспаления. В некоторых вариантах осуществления молекулой воспаления является фактор транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует фактор транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор уменьшает экспрессию фактора транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления фактором транскрипции при воспалении является NF-κB, регуляторный фактор интерферона (IRF) или молекула, связанная с путем передачи сигналов JAK-STAT. Путь NF-κB представляет собой прототипный провоспалительный путь передачи сигналов, который опосредует экспрессию провоспалительных генов, включая цитокины, хемокины и молекулы адгезии. Регуляторные факторы интерферона (IRF) составляют семейство факторов транскрипции, которые могут регулировать экспрессию провоспалительных генов. Путь передачи сигналов JAK-STAT передает информацию от экстраклеточных цитокиновых сигналов в ядро, что приводит к транскрипции ДНК и экспрессии генов, участвующих в пролиферации и дифференциации иммунных клеток. Система JAK-STAT состоит из рецептора клеточной поверхности, Янус-киназ (JAK) и преобразователя сигналов и активатора транскрипции (STAT) в виде белков. Приводимые в качестве примера молекулы JAK-STAT включают, без ограничения, JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 (STAT5A и STAT5B) и STAT6. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает экспрессию супрессора белка передачи цитокиновых сигналов (SOCS). Белки SOCS могут ингибировать передачу сигналов через путь JAK-STAT. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор удаляет нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию фактора транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию фактора транскрипции при воспалении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор фактора транскрипции при воспалении.

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает экспрессию и/или активность противовоспалительной молекулы. В некоторых вариантах осуществления противовоспалительной молекулой является противовоспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает противовоспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает экспрессию противовоспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей противовоспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор уменьшает активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию противовоспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор снижает активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию противовоспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер противовоспалительного фактора транскрипции.

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой нуклеиновую кислоту. Приводимые в качестве примера нуклеиновые кислоты включают, без ограничения, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, ДНК, рекомбинантную ДНК, кДНК, геномную ДНК, РНК, короткую интерферирующую РНК (siRNA), мРНК, короткую активирующую РНК (saRNA), микроРНК (miRNA), длинную некодирующую РНК (lncRNA), тРНК, направляющую РНК или короткую шпилечную РНК (shRNA). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является гомологичной нуклеиновой кислоте в клетке. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является гетерологичной нуклеиновой кислоте в клетке. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой плазмиду. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является терапевтической нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую короткую интерферирующую РНК (siRNA), мРНК, микроРНК (miRNA), длинную некодирующую РНК (lncRNA), тРНК или короткую шпилечную РНК (shRNA). Например, толерогенный фактор может включать siRNA для нокдауна экспрессии генов воспаления. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой последовательность ДНК, которая связывает NFκB и предотвращает активацию NFκB и последующую передачу сигналов.

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает полипептид. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления белок или полипептид представляет собой терапевтический белок, антитело, слитый белок, антиген, синтетический белок, репортерный маркер или селектируемый маркер. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой редактирующий ген белок или нуклеазу, такую как нуклеаза c цинковыми пальцами(ZFN), подобная активатору транскрипции эффекторная нуклеаза (TALEN), мегануклеаза, рекомбиназа CRE, транспозаза, фермент CAS9 или фермент интеграза. В некоторых вариантах осуществления слитые белки могут включать, без ограничения, лекарственные средства в виде химерных белков, такие как конъюгаты лекарственного средства и антитела, или рекомбинантные слитые белки, такие как белки, помеченные GST или стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления соединением является фактор транскрипции. Приводимые в качестве примера факторы транскрипции включают, без ограничения, Oct5, Sox2, c-Myc, Klf-4, T-bet, GATA3, FoxP3 и RORɣt. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα или TGFβ. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой фрагмент терапевтического полипептида. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой пептид-нуклеиновую кислоту (ПНК).

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает комплекс белок-нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой комплекс белок-нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления комплексы белок-нуклеиновая кислота, такие как регулярно расположенные группами короткие палиндромные повторы (CRISPR)-Cas9, используются в приложениях для редактирования генома. Эти комплексы содержат специфические в отношении последовательности ДНК-связывающие домены в сочетании с неспецифическими ДНК-расщепляющими нуклеазами. Эти комплексы позволяют осуществлять целенаправленное редактирование генома, включая добавление, разрушение или изменение последовательности определенного гена. В некоторых вариантах осуществления деактивированный CRISPR используется для блокировки или индукции транскрипции гена-мишени. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит белок Cas9 и направляющую РНК или донорную ДНК. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas9, и направляющую РНК или донорную ДНК. В некоторых вариантах осуществления мишенью комплекса для редактирования гена является экспрессия костимулирующей молекулы (например, CD80 и/или CD86).

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает химерный рецептор антигена (CAR). В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой химерный рецептор антигена (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой слияние экстраклеточного домена распознавания (например, антигенсвязывающего домена), трансмембранного домена и одного или более внутриклеточных сигнальных доменов. При вхождении в контакт с антигеном внутриклеточная сигнальная часть CAR может инициировать вызывающий иммуносупрессию или толерантность ответ в иммунной клетке. В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой химерный Т-клеточный рецептор для антигена. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен CAR представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (scFv). В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует модифицированный TCR, содержащий цитоплазматические сигнальные домены, которые запускают продукцию иммуносупрессорных цитокинов при связывании с антигеном. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует химерный рецептор для антигена, содержащий цитоплазматические сигнальные домены, которые запускают продукцию иммуносупрессорных цитокинов при связывании с антигеном.

В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает небольшую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой небольшую молекулу. В некоторых вариантах осуществления небольшая молекула ингибирует активность костимулирующей молекулы, усиливает активность коингибирующей молекулы и/или ингибирует активность молекулы воспаления. Примеры небольших молекул включают, без ограничения, фармацевтические агенты, метаболиты и радионуклиды или содержащие радионуклиды молекулы. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический агент представляет собой терапевтический препарат и/или цитотоксический агент. В некоторых вариантах осуществления соединение включает наночастицу. Приводимые в качестве примера наночастиц включают наночастицы золота, квантовые примеси, углеродные нанотрубки, наночастицы, дендримеры и липосомы. В некоторых вариантах осуществления наночастица содержит или связана (ковалентно или нековалентно) с терапевтической молекулой. В некоторых вариантах осуществления наночастица содержит нуклеиновую кислоту, такую как мРНК или кДНК.

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы доставки толерогенного фактора в иммунную клетку, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор проникает в клетку, причем указанная клеточная суспензия соприкасается с толерогенным фактором. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор доставляется в иммунную клетку in vitro, ex vivo или in vivo.

В некоторых вариантах осуществления соединение для доставки является очищенным. В некоторых вариантах осуществления соединение составляет по крайней мере приблизительно 60 вес.% (по сухому весу) представляющего интерес соединения. В некоторых вариантах осуществления очищенное соединение составляет по крайней мере приблизительно 75%, 90% или 99% представляющего интерес соединения. В некоторых вариантах осуществления очищенное соединение составляет по крайней мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% или 100% (в весовом отношении) представляющего интерес соединения. Степень чистоты определяют любыми известными способами, включая, без ограничения, колоночную хроматографию, тонкослойную хроматографию, ВЭЖХ-анализ, ЯМР, масс-спектрометрию или электрофорез в SDS-ПААГ. Очищенная ДНК или РНК определяется как ДНК или РНК, которая не содержит экзогенных нуклеиновых кислот, углеводов и липидов.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой промежуточное соединение. Промежуточное соединение может быть соединением, которое образуется из предшествующих промежуточных соединений и затем реагирует с получением конечного продукта реакции. В некоторых вариантах осуществления промежуточное соединение представляет собой предшественник белка или пробелок, который расщепляется ферментом с получением зрелой, функциональной формы белка. В некоторых вариантах осуществления промежуточное соединение представляет собой неактивный предшественник фермента или зимоген, который требует модификации или расщепления для получения активного фермента.

X. ПРИМЕНЕНИЯ

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечиваются способы лечения пациента путем введения пациенту иммунной клетки, модифицированной пропусканием через сужение, так что соединение проникает в клетку. В некоторых вариантах осуществления лечение включает множество (например, любой число из 2, 3, 4, 5, 6 или более) стадий введения таких модифицированных иммунных клеток пациенту. В некоторых вариантах осуществления клетку выделяют из пациента, модифицируют в соответствии с описанными способами и вводят обратно пациенту. Например, популяцию иммунных клеток выделяют из пациента, пропускают через сужение для достижения доставки соединения и затем повторно вводят пациенту для усиления терапевтического иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления клетку выделяют из индивидуума, модифицируют в соответствии с описанными способами и вводят обратно индивидууму. Например, популяцию иммунных клеток выделяют из индивидуума, пропускают через сужение для достижения доставки соединения и затем повторно вводят пациенту для подавления иммунного ответа или индукции толерантности у индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы лечения индивидуума путем введения индивидууму клетки, модифицированной пропусканием через сужение, так что соединение проникает в клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка является аутологичной клеткой. Например, иммунную клетку выделяют из индивидуума (например, пациента), модифицируют в соответствии с описанными способами и вводят обратно индивидууму. В некоторых вариантах осуществления клетку выделяют из индивидуума, модифицируют в соответствии с описанными способами и вводят обратно тому же индивидууму. В некоторых вариантах осуществления клетка является аллогенной клеткой. Например, клетку выделяют из другого индивидуума, модифицируют в соответствии с описанными способами и вводят первому индивидууму (например, пациенту). В некоторых вариантах осуществления пул клеток от множества индивидуумов модифицируют в соответствии с описанными способами и вводят первому индивидууму (например, пациенту). В некоторых вариантах осуществления клетку выделяют из индивидуума, модифицируют в соответствии с описанными способами и вводят другому индивидууму. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток выделяют из индивидуума (пациента) или другого индивидуума, пропускают через сужение для достижения доставки соединения, которое индуцирует de novo продукцию антител, и затем вводят пациенту для увеличения терапевтического ответа.

В некоторых вариантах осуществления лечение включает множество (например, любое число из 2, 3, 4, 5, 6 или более) стадий введения индивидууму модифицированных иммунных клеток, как здесь описано. Например, в некоторых вариантах осуществления обеспечивается способ лечения индивидуума путем введения индивидууму клетки, модифицированной пропусканием через сужение, так что соединение проникает в клетку, 2, 3, 4, 5, 6 или более раз. В некоторых вариантах осуществления продолжительность времени между любыми двумя последовательными введениями клетки составляет по крайней мере приблизительно 1 день (например, любую из следующих продолжительностей времени: по крайней мере приблизительно 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 1 год или дольше, включая любые диапазоны между этими значениями).

Любой из описанных выше способов проводят in vitro, ex vivo или in vivo. Для применений in vivo устройство может быть имплантировано в просвет сосуда, например, встраиваемый стент в артерию или вену. В некоторых вариантах осуществления способы используются как часть прикроватной системы для ex-vivo обработки клеток пациента и немедленного обратного введения клеток пациенту. Такие способы могут быть использованы как средство подавления иммунного ответа или индукции толерантности у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способ может быть осуществлен в типичной больничной лаборатории подготовленным в минимальной степени специалистом. В некоторых вариантах осуществления может использоваться система лечения, управляемая пациентом. В некоторых вариантах осуществления способ осуществляется с использованием встроенной системы обработки крови, в которой кровь непосредственно отводится от пациента, проходит через сужение, что приводит к доставке соединения в клетки крови и непосредственно переливается обратно пациенту после обработки.

XI. СИСТЕМЫ И НАБОРЫ

В некоторых аспектах настоящим изобретением обеспечивается система, содержащая сужение, клеточную суспензию и соединение для применения в описанных здесь способах. Система может включать любой вариант осуществления, описанный для описанных выше способов, в том числе микрофлюидных каналов или поверхности с порами для обеспечения деформирующих клетки сужений, клеточных суспензий, нарушений в клетках, параметров доставки, соединений и/или применений и т.д. В некотором варианте осуществления деформирующие клетки сужения имеют размеры для доставки в иммунные клетки. В некоторых вариантах осуществления параметры доставки, такие как рабочие скорости потока, концентрация клеток и соединений, скорость клетки в сужении и композиция клеточной суспензии (например, осмолярность, концентрация соли, содержание сыворотки, концентрация клеток, рН, и т.д.) оптимизированы для максимальной реакции соединения для подавления иммунного ответа или индукции толерантности.

Также обеспечиваются наборы или изделия для применения в доставке соединения для подавления иммунного ответа или индукции толерантности. В некоторых вариантах осуществления наборы включают композиции, описанные здесь (например, микрофлюидный канал или поверхность, содержащую поры, клеточные суспензии и/или соединения) в подходящей упаковке. Подходящие упаковочные материалы известны в данной области техники и включают, например, флаконы (например, герметичные флаконы), сосуды, ампулы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или пластиковые пакеты) и т.п.. Эти изделия могут дополнительно стерилизоваться и/или запечатываться.

Настоящим изобретением также обеспечиваются наборы, которые включают компоненты описанных здесь способов и могут дополнительно включать инструкцию(и) для выполнения указанных способов для подавления иммунного ответа или индукции толерантности. Наборы, описанные здесь, могут дополнительно включать другие материалы, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листовки-вкладыши в упаковке с инструкциями для выполнения любых способов, описанных здесь; например, инструкции в отношении подавления иммунного ответа или индукции толерантности.

XII. ПРИМЕРНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Вариант осуществления 1. Способ индукции толерантности к антигену у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, и

b. ведение индивидууму иммунной клетки, причем иммунная клетка является толерогенной иммунной клеткой, и причем представление указанного антигена индуцирует толерантность к антигену.

Вариант осуществления 2. Способ индукции толерантности к антигену у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор, соприкасающиеся с клеткой, проникают в иммунную клетку, тем самым образуя толерогенную иммунную клетку, содержащую антиген; и

b. введение индивидууму толерогенной иммунной клетки, причем представление указанного антигена индуцирует толерантность к антигену.

Вариант осуществления 3. Способ подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку; и

b. введение индивидууму иммунной клетки, причем иммунная клетка является толерогенной иммунной клеткой, и причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген.

Вариант осуществления 4. Способ подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор, соприкасающиеся с клеткой, проникают в иммунную клетку, тем самым образуя иммуносупрессорную (вызывающую иммуносупрессию) иммунную клетку, содержащую антиген; и

b. введение индивидууму иммуносупрессорной иммунной клетки, причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген.

Вариант осуществления 5. Способ индукции толерантности к антигену у индивидуума, включающий введение индивидууму толерогенной иммунной клетки, содержащей антиген, причем представление указанного антигена индуцирует толерантность к антигену, и причем антиген был введен в толерогенную иммунную клетку путем пропускания толерогенной иммунной клетки или ее предшественника через сужение, причем указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызвав нарушение в клетке, так что антиген проник в толерогенную иммунную клетку или ее предшественника.

Вариант осуществления 6. Способ индукции толерантности к антигену у индивидуума, включающий введение индивидууму толерогенной иммунной клетки, содержащей антиген и толерогенный фактор, причем представление указанного антигена индуцирует толерантность к антигену, и причем антиген и толерогенный фактор были введены в толерогенную иммунную клетку путем пропускания толерогенной иммунной клетки или ее предшественника через сужение, причем указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызвав нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор проникли в толерогенную иммунную клетку или ее предшественника.

Вариант осуществления 7. Способ подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающий введение индивидууму иммуносупрессорной иммунной клетки, содержащей антиген, причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген, и причем антиген был введен в иммуносупрессорную иммунную клетку путем пропускания иммуносупрессорной иммунной клетки или ее предшественника через сужение, причем указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызвав нарушение в клетке, так что антиген проник в иммуносупрессорную иммунную клетку или ее предшественника.

Вариант осуществления 8. Способ подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающий введение индивидууму иммуносупрессорной иммунной клетки, содержащей антиген и толерогенный фактор, причем представление антигена подавляет иммунный ответ на антиген, и причем антиген и толерогенный фактор были введены в иммуносупрессорную иммунную клетку путем пропускания иммуносупрессорной иммунной клетки или ее предшественника через сужение, причем указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызвав нарушение в клетке, так что антиген и толерогенный фактор проникли в иммуносупрессорную иммунную клетку или ее предшественника.

Вариант осуществления 9. Способ образования толерогенной иммунной клетки, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, тем самым образуя толерогенную иммунную клетку.

Вариант осуществления 10. Способ образования иммуносупрессорной иммунной клетки, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, тем самым образуя иммуносупрессорную иммунную клетку.

Вариант осуществления 11. Способ в соответствии с вариантом осуществления 9 или 10, в котором указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что в иммунную клетку проникает толерогенный фактор и антиген, соприкасающиеся с клеткой.

Вариант осуществления 12. Способ в соответствии с вариантом осуществления 9 или 10, в котором иммунную клетку дополнительно пропускают через второе сужение, и в котором указанное второе сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку.

Вариант осуществления 13. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 9-12, в котором иммунной клеткой является антигенпредставляющая клетка.

Вариант осуществления 14. Способ образования толерогенной антигенпредставляющей клетки, содержащей антиген, в котором толерогенную антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, и в котором указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в антигенпредставляющую клетку.

Вариант осуществления 15. Способ образования иммуносупрессорной антигенпредставляющей клетки, содержащей антиген, в котором иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку пропускают через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетки, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в антигенпредставляющую клетку.

Вариант осуществления 16. Способ доставки толерогенного фактора, который создает толерогенный фенотип, в иммунную клетку, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор может проникать в клетку, и приведение в соприкосновение указанной клеточной суспензии с толерогенным фактором, причем толерогенный фактор ингибирует экспрессию и/или активность иммуностимулирующего агента, усиливает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы, ингибирует экспрессию и/или активность молекулы воспаления и/или усиливает экспрессию и/или активность противовоспалительной молекулы.

Вариант осуществления 17. Способ доставки антигена в толерогенную иммунную клетку, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей толерогенную иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует толерогенную иммунную клетку, вызывая нарушение в клетке, так что антиген может проникать в клетку, и приведение в соприкосновение указанной клеточной суспензии с антигеном.

Вариант осуществления 18. Способ доставки в иммунную клетку толерогенного фактора, который создает иммуносупрессорный фенотип, при этом способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммунную клетку, вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор может проникать в клетку, и приведение в соприкосновение указанной клеточной суспензии с толерогенным фактором, причем толерогенный фактор ингибирует экспрессию и/или активность иммуностимулирующего агента, усиливает экспрессию и/или активность иммуносупрессоной молекулы, ингибирует экспрессию и/или активность молекулы воспаления и/или усиливает экспрессию и/или активность противовоспалительной молекулы.

Вариант осуществления 19. Способ доставки антигена в иммуносупрессорную иммунную клетку, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей иммуносупрессорную иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует иммуносупрессорную иммунную клетку, вызывая нарушение в клетке, так что антиген может проникать в клетку, и приведение в соприкосновение указанной клеточной суспензии с антигеном.

Вариант осуществления 20. Способ подавления иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающий:

a. пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку,

b. пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что в иммунную клетку проникает толерогенный фактор, соприкасающийся с клеткой, тем самым образуя иммуносупрессорную иммунную клетку; и

c. введение индивидууму первой иммунной клетки и второй иммунной клетки, причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген.

Вариант осуществления 21. Способ в соответствии с вариантом осуществления 20, в котором представление указанного антигена указанной первой или второй иммунной клеткой подавляет иммунный ответ на антиген.

Вариант осуществления 22. Способ в соответствии с вариантом осуществления 20, в котором вторая иммунная клетка придает иммуносупрессорный фенотип первой иммунной клетке, тем самым образуя иммуносупрессорную первую иммунную клетку, и в котором представление указанного антигена указанной иммуносупрессорной первой иммунной клеткой подавляет иммунный ответ на антиген.

Вариант осуществления 23. Способ индукции толерантности к антигену у индивидуума, включающий:

a. пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку,

b. пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, тем самым образуя толерогенную иммунную клетку; и

c. введение индивидууму первой иммунной клетки и второй иммунной клетки, причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген.

Вариант осуществления 24. Способ в соответствии с вариантом осуществления 23, в котором представление указанного антигена указанной первой или второй иммунной клеткой индуцирует толерантность к антигену.

Вариант осуществления 25. Способ в соответствии с вариантом осуществления 23, в котором вторая иммунная клетка придает толерогенный фенотип первой иммунном клетке, тем самым образуя толерогенную первую иммунную клетку, и в котором представление указанного антигена указанной толерогенной первой иммунной клеткой индуцирует толерантность к антигену.

Вариант осуществления 26. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 20-25, в котором первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся индивидууму одновременно.

Вариант осуществления 27. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 20-25, в котором первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся индивидууму последовательно.

Вариант осуществления 28. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 9, 11-14, 16, 17 и 23-27, в котором толерогенная иммунная клетка или ее предшественник не приводились в соприкосновение с адъювантом.

Вариант осуществления 29. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8, 10-13, 15, 18-22, 26 и 27, в котором иммуносупрессорная иммунная клетка или ее предшественник не приводились в соприкосновение с адъювантом.

Вариант осуществления 30. Способ в соответствии с вариантом осуществления 28 или 29, в котором адъювант выбирают из группы, состоящей из лигандов для TLR3 и RLR, лигандов для TLR4, лигандов для TLR5, лигандов для TLR7/8, лигандов для TLR9, лигандов для NOD2, квасцов, эмульсий типа «вода-в-масле», rhIL-2, анти-CD40, CD40L, IL-12 и циклических динуклеотидов.

Вариант осуществления 31. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 9, 11-14, 16, 17 и 23-28, в котором толерогенная иммунная клетка заключает в себе уменьшенную способность обеспечивать один или более костимулирующих сигналов по сравнению с нетолерогенным предшественником толерогенной иммунной клетки.

Вариант осуществления 32. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8, 10-13, 15, 18-22, 26, 27 и 29, в котором иммуносупрессорная иммунная клетка заключает в себе уменьшенную способность обеспечивать один или более костимулирующих сигналов по сравнению с неиммуносупрессорным предшественником иммуносупрессорной иммунной клетки.

Вариант осуществления 33. Способ в соответствии с вариантом осуществления 31 или 32, в котором один или более костимулирующих сигналов опосредуются молекулой, выбираемой из группы, состоящей из CD40, CD80, CD86, CD54, CD83, CD79 и лиганда для ICOS.

Вариант осуществления 34. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 9, 11-14, 16, 17, 23-28 и 31, в котором толерогенная иммунная клетка заключает в себе уменьшенную способность обеспечить один или более сигналов воспаления по сравнению с нетолерогенным предшественником толерогенной иммунной клетки.

Вариант осуществления 35. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8, 10-13, 15, 18-22, 26, 27, 29 и 32, в котором иммуносупрессорная иммунная клетка заключает в себе уменьшенную способность обеспечивать один или более сигналов воспаления по сравнению с неиммуносупрессорным предшественником иммуносупрессорной иммунной клетки.

Вариант осуществления 36. Способ в соответствии с вариантом осуществления 34 или 35, в котором один или более сигналов воспаления опосредуются молекулой, выбираемой из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12, IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона гамма (IFN-гамма), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), NF-κB, регуляторного фактора интерферона (IRF) и молекулы, связанной с путем передачи сигналов JAK-STAT.

Вариант осуществления 37. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 2, 4, 6, 8-11, 16, 18, 20 и 23, в котором толерогенный фактор ингибирует экспрессию и/или активность иммуностимулирующего агента, усиливает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы, ингибирует экспрессию и/или активность молекулы воспаления и/или усиливает экспрессию и/или активность противовоспалительной молекулы.

Вариант осуществления 38. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 11-14, 17, 23-28 и 31, в котором антиген представляется толерогенной иммунной клеткой.

Вариант осуществления 39. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8, 11-13, 15, 19-22, 26, 27, 29 и 32, в котором антиген представляется иммуносупрессорной иммунной клеткой.

Вариант осуществления 40. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 2, 6, 9, 11-13, 16, 23-28 и 31, в котором индуцируется толерантность к по крайней мере одному другому антигену.

Вариант осуществления 41. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 4, 8, 10-13, 18, 20-22, 26, 27, 29 и 32, в котором подавляется иммунный ответ против по крайней мере одного другого антигена.

Вариант осуществления 42. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-8, 11, 12, 14, 15, 17, 19 и 20-25, в котором по крайней мере один дополнительный антиген вводится в клетку.

Вариант осуществления 43. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 2, 4, 6, 8, 9-11, 16, 18, 20 и 23, в котором по крайней мере один дополнительный толерогенный фактор вводится в клетку.

Вариант осуществления 44. Способ подавления иммунного ответа у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что соединение, кодирующее нефункциональный цитокин-связывающий белок, соприкасающееся с клеткой, проникает в иммунную клетку; и

b. введение индивидууму иммунной клетки, причем указанный нефункциональный цитокин-связывающий белок экспрессируется, и причем указанный нефункциональный цитокин-связывающий белок связывается со свободными цитокинами воспаления.

Вариант осуществления 45. Способ в соответствии с вариантом осуществления 44, в котором нефункциональный цитокин-связывающий белок включает нефункциональный рецептор цитокина.

Вариант осуществления 46. Способ в соответствии с вариантом осуществления 45, в котором у нефункционального цитокин-связывающего белка отсутствуют цитоплазматические сигнальные домены.

Вариант осуществления 47. Способ в соответствии с вариантом осуществления 44, в котором нефункциональный цитокин-связывающий белок содержит протеолитический центр, который расщепляет цитокин-мишень.

Вариант осуществления 48. Способ в соответствии с вариантом осуществления 44, в котором нефункциональный цитокин-связывающий белок включает антитело против цитокина.

Вариант осуществления 49. Способ в соответствии с вариантом осуществления 44, в котором нефункциональный цитокин-связывающий белок включает рецептор содержащих антитело против цитокина В-клеток.

Вариант осуществления 50. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7 и 20-44, в котором иммунная клетка относится к индивидууму.

Вариант осуществления 51. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-7 и 20-44, в котором иммунная клетка принадлежит другому индивидууму.

Вариант осуществления 52. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-51, в котором сужение содержится внутри микрофлюидного канала.

Вариант осуществления 53. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-51, в котором сужение представляет собой пору или содержится внутри поры.

Вариант осуществления 54. Способ в соответствии с вариантом осуществления 53, в котором пора содержится внутри поверхности.

Вариант осуществления 55. Способ в соответствии с вариантом осуществления 54, в котором поверхность представляет собой фильтр.

Вариант осуществления 56. Способ в соответствии с вариантом осуществления 54, в котором поверхность представляет собой мембрану.

Вариант осуществления 57. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-56, в котором размер сужения зависит от диаметра иммунной клетки.

Вариант осуществления 58. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-57, в котором размер сужения составляет приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от диаметра клетки.

Вариант осуществления 59. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-58, в котором канал содержит сужение длиной, составляющей приблизительно 10 мкм, и шириной, составляющей приблизительно 4 мкм.

Вариант осуществления 60. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-59, в котором размер поры составляет приблизительно 0,4 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 4 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 8 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 12 мкм или приблизительно 14 мкм.

Вариант осуществления 61. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-60, который осуществляют при температуре от приблизительно -5^οС до приблизительно 45^οС.

Вариант осуществления 62. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4, 9, 10 и 16-61, в котором клеточная суспензия включает смешанную популяцию клеток.

Вариант осуществления 63. Способ в соответствии с вариантом осуществления 62, в котором клеточная суспензия представляет собой цельную кровь.

Вариант осуществления 64. Способ в соответствии с вариантом осуществления 62, в котором клеточная суспензия включает мононуклеарные клетки периферической крови.

Вариант осуществления 65. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4, 9, 10 и 16-61, в котором клеточная суспензия включает очищенную популяцию клеток.

Вариант осуществления 66. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4, 9, 10 и 16-65, в котором клеточная суспензия включает клетки млекопитающих.

Вариант осуществления 67. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4, 9, 10 и 16-66, в котором клеточная суспензия включает клетки обезьян, мышей, собак, кошек, лошадей, крыс, овец, коз, свиней или кроликов.

Вариант осуществления 68. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4, 9, 10 и 16-66, в котором клеточная суспензия включает клетки человека.

Вариант осуществления 69. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4, 9, 10 и 16-65, в котором клеточная суспензия включает клетки, не являющиеся клетками млекопитающих.

Вариант осуществления 70. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4, 9, 10, 16-65 и 69, в котором клеточная суспензия включает бактериальные, дрожжевые клетки, клетки кур, лягушек, насекомых, рыб или нематод.

Вариант осуществления 71. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-13 и 16-68, в котором иммунная клетка представляет собой клетку млекопитающего.

Вариант осуществления 72. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-13, 16-68 и 71, в котором иммунная клетка представляет собой клетку обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика.

Вариант осуществления 73. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-13, 16-68 и 71, в котором иммунная клетка представляет собой клетку человека.

Вариант осуществления 74. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-13 и 16-73, в котором иммунная клетка представляет собой Т-клетку, В-клетку, дендритную клетку, моноцит, макрофаг, NK-клетку, врожденную лимфоидную клетку, нейтрофил, базофил, эозинофил, клетку-супрессор миелоидного происхождения или тучную клетку.

Вариант осуществления 75. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 14, 15 и 50-74, в котором антигенпредставляющей клеткой является клетка млекопитающего.

Вариант осуществления 76. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 14, 15 и 50-75, в котором антигенпредставляющей клеткой является клетка обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика.

Вариант осуществления 77. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 14, 15 и 50-75, в котором антигенпредставляющей клеткой является клетка человека.

Вариант осуществления 78. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 14, 15 и 50-77, в котором антигенпредставляющей клеткой является Т-клетка, В-клетка, дендритная клетка, моноцит, макрофаг, NK-клетка, врожденная лимфоидная клетка, нейтрофил, базофил, эозинофил, клетка-супрессор миелоидного происхождения или тучная клетка.

Вариант осуществления 79. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-15, 20-43 и 50-78, в котором антиген представляет собой чужеродный антиген.

Вариант осуществления 80. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-15, 20-43 и 50-78, в котором антигеном является аутоантиген.

Вариант осуществления 81. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-15, 20-43 и 50-78, в котором антиген представляет собой трансплантационный антиген аллотрансплантата.

Вариант осуществления 82. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-15, 20-43 и 50-78, в котором антиген представляет собой белок или полипептид.

Вариант осуществления 83. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-15, 20-43 и 50-78, в котором антиген представляет собой лизат.

Вариант осуществления 84. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-15, 20-43 и 50-83, в котором антиген представляет собой модифицированный антиген.

Вариант осуществления 85. Способ в соответствии с вариантом осуществления 84, в котором модифицированный антиген включает антиген, слитый с терапевтическим средством.

Вариант осуществления 86. Способ в соответствии с вариантом осуществления 84, в котором модифицированный антиген включает антиген, слитый с нацеливающим пептидом.

Вариант осуществления 87. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4, 9, 10 и 16-86, в котором указанная клеточная суспензия соприкасается с антигеном до, одновременно или после прохождения через сужение.

Вариант осуществления 88. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-87, в котором толерогенный фактор ингибирует активность костимулирующей молекулы.

Вариант осуществления 89. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-88, в котором толерогенный фактор уменьшает экспрессию костимулирующей молекулы.

Вариант осуществления 90. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-89, в котором толерогенный фактор удаляет нуклеиновую кислоту, которая модулирует экспрессию костимулирующей молекулы.

Вариант осуществления 91. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-88, в котором толерогенный фактор ингибирует костимулирующую молекулу.

Вариант осуществления 92. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-91, в котором толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию костимулирующей молекулы.

Вариант осуществления 93. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-91, в котором толерогенный фактор увеличивает активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию костимулирующей молекулы.

Вариант осуществления 94. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-88, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор костимулирующей молекулы.

Вариант осуществления 95. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 88-94, в котором костимулирующая молекула представляет собой CD80 или CD86.

Вариант осуществления 96. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-95, в котором толерогенный фактор усиливает активность иммуносупрессорного фактора.

Вариант осуществления 97. Способ в соответствии с вариантом осуществления 96, в котором иммуносупрессорным фактором является коингибирующая молекула, регулятор транскрипции или иммуносупрессорная молекула.

Вариант осуществления 98. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 96 и 97, в котором толерогенный фактор усиливает активность коингибирующей молекулы.

Вариант осуществления 99. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 96-98, в котором толерогенный фактор увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы.

Вариант осуществления 100. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 96-99, в котором толерогенный фактор кодирует коингибирующую молекулу.

Вариант осуществления 101. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 96-100, в котором толерогенный фактор увеличивает активность коингибирующей молекулы.

Вариант осуществления 102. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 96-98, в котором толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который усиливает экспрессию коингибирующей молекулы.

Вариант осуществления 103. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 96-98 и 102, в котором толерогенный фактор увеличивает активность полипептида, который увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы.

Вариант осуществления 104. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 96-98 и 102, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер коингибирующей молекулы.

Вариант осуществления 105. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 97-104, в котором коингибирующая молекула представляет собой PD-L1, PD-L2 или CTLA-4.

Вариант осуществления 106. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 96 и 97, в котором толерогенный фактор усиливает активность иммуносупрессорной молекулы.

Вариант осуществления 107. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 96, 97 и 106, в котором толерогенный фактор увеличивает экспрессию иммуносупрессорной молекулы.

Вариант осуществления 108. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 96, 97 и 106, в котором толерогенный фактор кодирует иммуносупрессорную молекулу.

Вариант осуществления 109. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 96, 97 и 106, в котором толерогенный фактор увеличивает активность иммуносупрессорной молекулы.

Вариант осуществления 110. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 96, 97 и 106, в котором толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы.

Вариант осуществления 111. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 96, 97 и 106, в котором толерогенный фактор увеличивает активность полипептида, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы.

Вариант осуществления 112. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 96, 97 и 106, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер иммуносупрессорной молекулы.

Вариант осуществления 113. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 97 и 106, в котором иммуносупрессорная молекула представляет собой ARG1, NO, NOS2, IDO, IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα или TGFβ.

Вариант осуществления 114. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-87, в котором толерогенный фактор ингибирует активность молекулы воспаления.

Вариант осуществления 115. Способ в соответствии с вариантом осуществления 114, в котором молекулой воспаления является фактор транскрипции при воспалении.

Вариант осуществления 116. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87, 114 и 115, в котором толерогенный фактор ингибирует фактор транскрипции при воспалении.

Вариант осуществления 117. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 114-116, в котором толерогенный фактор уменьшает экспрессию фактора транскрипции при воспалении.

Вариант осуществления 118. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 114-116, в котором толерогенный фактор удаляет нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор транскрипции при воспалении.

Вариант осуществления 119. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 114-116, в котором толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию фактора транскрипции при воспалении.

Вариант осуществления 120. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 114-116, в котором толерогенный фактор увеличивает активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию фактора транскрипции при воспалении.

Вариант осуществления 121. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 114-116, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор фактора транскрипции при воспалении.

Вариант осуществления 122. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 115-121, в котором фактором транскрипции при воспалении является NF-κB, регуляторного фактора интерферона или молекула, связанная с путем передачи сигналов JAK-STAT.

Вариант осуществления 123. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 114-116, в котором толерогенный фактор снижает продукцию и/или секрецию одного или более цитокинов воспаления.

Вариант осуществления 124. Способ в соответствии с вариантом осуществления 123, в котором один или более цитокинов воспаления выбирают из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона гамма (IFN-гамма) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

Вариант осуществления 125. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-87 и 114-116, в котором толерогенный фактор увеличивает продукцию и/или секрецию одного или более противовоспалительных цитокинов.

Вариант осуществления 126. Способ в соответствии с вариантом осуществления 125, в котором один или более противовоспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α и трансформирующего фактора роста бета (TGFβ).

Вариант осуществления 127. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-87, в котором толерогенный фактор кодирует модифицированный TCR, содержащий цитоплазматический сигнальный домен, который запускает продукцию иммуносупрессорных цитокинов при связывании с антигеном.

Вариант осуществления 128. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-87, в котором толерогенный фактор кодирует химерный рецептор антигена, содержащий цитоплазматические сигнальные домены, которые запускают продукцию иммуносупрессорных цитокинов при связывании с антигеном.

Вариант осуществления 129. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-128, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту.

Вариант осуществления 130. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-129, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую короткую интерферирующую РНК (siRNA), мРНК, микроРНК (miRNA), длинную некодирующую РНК (lncRNA), тРНК или короткую шпилечную РНК (shRNA).

Вариант осуществления 131. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-130, в котором толерогенным фактором является плазмида.

Вариант осуществления 132. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-128, в котором толерогенный фактор включает комплекс белок-нуклеиновая кислота.

Вариант осуществления 133. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-128 и 132, в котором толерогенный фактор включает полипептид Cas9 и направляющую РНК или донорную ДНК.

Вариант осуществления 134. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-129, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид Cas9, и направляющую РНК или донорную ДНК.

Вариант осуществления 135. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-128, в котором толерогенный фактор включает полипептид.

Вариант осуществления 136. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-128 и 135, в котором полипептид представляет собой нуклеазу, белок TALEN, нуклеазу c цинковыми пальцами, мегануклеазу или рекомбиназу CRE.

Вариант осуществления 137. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-128 и 135, в котором полипептид представляет собой фермент транспозазу или интегразу.

Вариант осуществления 138. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-128 и 135, в котором полипептидом является антитело.

Вариант осуществления 139. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43, 50-128 и 135, в котором полипептидом является фактор транскрипции.

Вариант осуществления 140. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-128, в котором толерогенный фактор представляет собой небольшую молекулу.

Вариант осуществления 141. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-128, в котором толерогенный фактор представляет собой наночастицу.

Вариант осуществления 142. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-141, в котором указанная клеточная суспензия соприкасается с толерогенным фактором до, одновременно или после прохождения через сужение.

Вариант осуществления 143. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-142, в котором иммунный ответ подавляется на по крайней мере приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 100%.

Вариант осуществления 144. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-143, в котором подавленный иммунный ответ включает снижение продукции и/или секреции одного или более цитокинов воспаления.

Вариант осуществления 145. Способ в соответствии с вариантом осуществления 144, в котором один или более цитокинов воспаления выбирают из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона гамма (IFN-гамма) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

Вариант осуществления 146. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-143, в котором подавленный иммунный ответ включает увеличение продукции и/или секреции одного или более противовоспалительных цитокинов.

Вариант осуществления 147. Способ в соответствии с вариантом осуществления 146, в котором один или более противовоспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α и трансформирующего фактора роста бета (TGFβ).

Вариант осуществления 148. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-143, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный Т-клеточный ответ.

Вариант осуществления 149. Способ в соответствии с вариантом осуществления 148, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение активации Т-клеток.

Вариант осуществления 150. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 148-149, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение выживаемости Т-клеток.

Вариант осуществления 151. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 148-150, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение пролиферации Т-клеток.

Вариант осуществления 152. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 148-151, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение функциональности Т-клеток.

Вариант осуществления 153. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-152, в котором подавленный иммунный ответ включает усиленный Treg ответ.

Вариант осуществления 154. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-153, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный В-клеточный ответ.

Вариант осуществления 155. Способ в соответствии с вариантом осуществления 154, в котором уменьшенный В-клеточный ответ включает снижение продукции антител.

Вариант осуществления 156. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-155, в котором подавленный иммунный ответ включает снижение продукции цитокинов.

Вариант осуществления 157. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-156, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенную аутоиммунную реакцию.

Вариант осуществления 158. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-157, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенную аллергическую реакцию.

Вариант осуществления 159. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-15, 20-43 и 50-78, в котором антиген представляет собой антиген, связанный с трансплантированной тканью.

Вариант осуществления 160. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-159, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против трансплантированной ткани.

Вариант осуществления 161. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-15, 20-43 и 50-78, в котором антиген связан с вирусом.

Вариант осуществления 162. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-161, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный патогенный иммунный ответ против вируса.

Вариант осуществления 163. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-162, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического средства.

Вариант осуществления 164. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 3, 4, 7, 8 и 10-163, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического носителя.

Вариант осуществления 165. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43 и 50-142, в котором толерантность включает снижение продукции и/или секреции одного или более цитокинов воспаления.

Вариант осуществления 166. Способ в соответствии с вариантом осуществления 165, в котором один или более цитокинов воспаления выбирают из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона гамма (IFN-гамма) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

Вариант осуществления 167. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43 и 50-142, в котором толерантность включает увеличение продукции и/или секреции одного или более противовоспалительных цитокинов.

Вариант осуществления 168. Способ в соответствии с вариантом осуществления 167, в котором один или более противовоспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α и трансформирующего фактора роста бета (TGFβ).

Вариант осуществления 169. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43 и 50-142, в котором толерантность включает уменьшенный Т-клеточный ответ.

Вариант осуществления 170. Способ в соответствии с вариантом осуществления 169, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение активации Т-клеток.

Вариант осуществления 171. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 169-170, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение выживаемости Т-клеток.

Вариант осуществления 172. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 169-171, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение пролиферации Т-клеток.

Вариант осуществления 173. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 169-172, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение функциональности Т-клеток.

Вариант осуществления 174. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 169-173, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает изменение фенотипа Т-клеток.

Вариант осуществления 175. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 169-174, в котором толерантность включает некостимулированную активацию Т-клетки.

Вариант осуществления 176. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 169-175, в котором толерантность включает усиленный Treg ответ.

Вариант осуществления 177. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 169-176, в котором толерантность включает уменьшенный В-клеточный ответ.

Вариант осуществления 178. Способ в соответствии с вариантом осуществления 177, в котором уменьшенный В-клеточный ответ включает снижение продукции антител.

Вариант осуществления 179. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 169-178, в котором толерантность включает снижение продукции цитокинов.

Вариант осуществления 180. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 169-179, в котором толерантность включает уменьшенную аутоиммунную реакцию.

Вариант осуществления 181. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 169-180, в котором толерантность включает уменьшенную аллергическую реакцию.

Вариант осуществления 182. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 169-181, в котором толерантность включает уменьшенный иммунный ответ против трансплантированной ткани.

Вариант осуществления 183. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 169-182, в котором толерантность включает уменьшенный патогенный иммунный ответ против вируса.

Вариант осуществления 184. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 169-183, в котором толерантность включает уменьшенный иммунный ответа против терапевтического средства.

Вариант осуществления 185. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 169-184, в котором толерантность включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического носителя.

Вариант осуществления 186. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-185, который повторяют по крайней мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз.

Вариант осуществления 187. Способ в соответствии с вариантом осуществления 186, в котором продолжительность времени между любыми двумя повторениями способа составляет по крайней мере 1 день, 1 неделю, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев или 1 год.

Вариант осуществления 188. Система, содержащая сужение, иммунную клетку, антиген и/или толерогенный фактор, для применения в способах в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-43 и 50-187.

Вариант осуществления 189. Система, содержащая сужение, иммунную клетку и соединение, кодирующее нефункциональный цитокин-связывающий белок, для применения в способах в соответствии с любым из вариантов осуществления 44-187.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены с целью иллюстрации различных вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо образом. Специалист в данной области техники легко поймет, что раскрытие настоящего изобретения хорошо адаптировано для осуществления целей и получения упомянутых результатов и преимуществ, а также тех целей, результатов и преимуществ, которые присущи ему. Изменения в них и другие виды применений, которые вмещаются в сущность изобретения, определяемого объемом формулы изобретения, будут приходить на ум специалистам в данной области техники.

Пример 1: Доставка с использованием сужения антигена и толерогенных факторов в В-клетки для индукции толерантности

Проводится серия экспериментов для демонстрации индукции толерантности с использованием модельного антигена и трансгенных Т-клеток.

В-клетки смешивают с толерогенным фактором и антигеном OVA +/- толерогенный фактор и пропускают через сужение внутри микрофлюидного канала или через поверхность, содержащую поры (такая доставка с использованием сужением также называется SQZ). Давление, температура и состав буфера оптимизируют для обеспечения доставки. CFSE-помеченные OT-I или OT-II Т-клетки переносят мышам CD45.1 с последующей переносом нагруженных OVA и толерогенным фактором B-клеток. Позже мышей подвергают стимуляции OVA+LPS с помощью внутрикожной (i.d) инъекции. Дренирующие подколенные лимфатические узлы собирают для определения размножения OT-I или OT-II Т-клеток.

Пример 2: Доставка с использованием сужения антигена в В-клетки для индукции толерантности

В этом исследовании оценивали способность являющихся B-клетками антигенпредставляющих клеток (APC), содержащих внутриклеточный антиген, образованных путем доставки антигена с использованием сужения, к индукции антигензависимой толерантности in vivo. Мышам вводили антигенспецифические Т-клетки, у них вызывали толерантность путем инъекции В-клеточных АРС, и определяли количество антигенспецифических Т-клеток и уровни цитокина воспаления IFN-γ.

Материалы и методы

Мышам-реципиентам C57BL/6J (CD45.1+) адоптивно переносили OVA-специфические CD8⁺ OT-I клетки (1×10⁶) и CD4⁺ OT-II Т-клетки (1×10⁶) (и те, и другие CD45.2+) на мышь от самок мышей-доноров в день 0. В день 1 В-клетки от мышей C57BL/6J собирали и инкубировали с полноразмерным белком OVA без использования сужения (B-клетка-Endo) или с внутриклеточной доставкой белка OVA с использованием сужения (B-клетка-SQZ). Затем 5×10⁶ соответствующих В-клеток/мышь вводили мышам-реципиентам. Контрольные животные получали инъекцию либо PBS (контроль стимуляции), либо 10 мкг свободного OVA (контроль толерантности). Антигенная стимуляция имела место в день 8 с помощью внутрикожной инъекции 10 мкг белка OVA+50 нг LPS/мышь. Дренирующие подколенные лимфатические узлы и селезенки каждой мыши анализировали в день 12, и OT-I и OT-II Т-клеточный ответ на антигенную стимуляцию измеряли с помощью проточной цитометрии ради количества OT-I и OT-II Т-клеток, внутриклеточного окрашивания IFNγ и анализов ELISpot. Описание схемы воздействия показано на фиг. 1, а группы воздействия приведены в таблице 1.

Таблица 1

Группа День 0 День 1 День 8 Контроль стимуляции Адоптивный перенос OT-I и OT-II PBS OVA+LPS Контроль толерантности Адоптивный перенос OT-I и OT-II Белок OVA OVA+LPS B-клетка-Endo Адоптивный перенос OT-I и OT-II B-клетки, подвергнутые инкубации с OVA без использования сужения. OVA+LPS B-клетка-SQZ Адоптивный перенос OT-I и OT-II B-клетки с OVA, доставленным с помощью сужения. OVA+LPS

Результаты

Количество OT-I- и OT-II-специфичных Т-клеток измеряли в день 12-й у мышей из четырех групп воздействия. Клетки из дренирующих лимфатических узлов (с установкой дискриминационного окна CD3⁺/CD8⁺ или CD3⁺/CD4⁺) и селезенки (с установкой дискриминационного окна CD3⁺/CD8⁺) были проанализированы с помощью проточной цитометрии с окрашиванием для Т-клеточного рецептора (TCR) V альфа 2 (TCRVα2) в качестве маркера для антигенпредставляющих клеток и CD45.2 в качестве маркера для донорных Т-клеток. Активация и пролиферация OT-I Т-клеток как в дренирующих лимфатических узлах, так и в селезенке были значительно ингибированы (*P<0,05) у мышей, подвергнутых первичному воздействию В-клеток с доставкой с использованием сужения белка OVA, по сравнению с контролем стимуляции, на что указывает уменьшение процента СD8+ OT-I Т-клеток (TCRVα2+/CD45.2+) (фиг. 2, левая и средняя панели). Этот эффект зависел от внутриклеточной доставки с использованием сужения антигена, поскольку у животных, подвергнутых первичному воздействию B-клеток-SQZ, наблюдалось снижение уровней CD8+ OT-I Т-клеток по сравнению с мышами, подвергнутых первичному воздействию В-клеток, которые были проинкубированы с OVA без сужения (**P<0,01). Процент CD4+ OT-II клеток (TCRVα2+/CD45.2+) был также значительно ингибирован в лимфатических узлах у животных группы B-клетка-SQZ по сравнению с контролем стимуляции (фиг. 2, правая панель, *P<0,05). У животных группы B-клетка-SQZ также наблюдалось небольшое снижение процента OT-II после стимуляции по сравнению с группой B-клетка-Endo, имеющее тенденцию к значимости, в то время как не было значимого различия в уровнях OT-II в селезенке между группами воздействия (данные не представлены).

Для оценки функционального эффекта опосредованной B-клетками-SQZ толерантности на функцию Т-клеток, процент Т-клеток селезенки, которые экспрессировали высокие уровни (hi) IFNγ (фиг. 3, слева), и уровень продукции IFNγ на клетку (фиг.3, справа, MFI на основе TCRVα2+/CD45.2+/CD44hi клеток) OT-I Т-клеток, рестимулированных пептидом SIINFEKL (SEQ ID NO:1) (CD8+ активный OVA-эпитоп), оценивали для всех групп путем внутриклеточного окрашивания цитокинов. OT-I Т-клетки у мышей группы B-клетка-SQZ продемонстрировали снижение как процента экспрессирующих на высоком уровне IFNγ клеток, так и продукции IFNγ (***P<0,0005) по сравнению с контролем стимуляции, а также с мышами, подвергнутых воздействию B-клеток-Endo (***P<0,0005, ****P <0,0001). Интересно отметить, что мыши группы B-клетка-SQZ даже продемонстрировали значительное снижение процента клеток с высоким уровнем IFNγ (*P<0,05) по сравнению с контролем толерантности. Количество OT-I Т-клеток, продуцирующих IFNγ, было дополнительно подтверждено с помощью ELISpot (фиг.4). Находясь в соответствии с данными проточной цитометрии, животные группы B-клетка-SQZ продуцировали значительно меньшее количество IFNγ-положительных Т-клеток по сравнению с контролем стимуляции (**P<0,01) и группой B-клетка-Endo (****P<0,0001).

Репрезентативные проточные цитограммы для TCRVα2+ OT-I T-клеток селезенки и OT-II T-клеток лимфоузлов для каждой группы воздействия показывают, что мыши группы B-клетка-SQZ имеют более низкое количество OT-I и OT-II по сравнению с контролем стимуляции и группой B-клетка-Endo (фиг. 5, таблица 2). Репрезентативные проточные цитограммы ICS для OT-I клеток с высоким уровнем IFNγ и маркером антигенной активации CD44 показывают, что образцы из группы B-клетка-SQZ имели более низкое количество Т-клеток с высоким уровнем IFNγ по сравнению с контролем стимуляции и группой B-клетка-Endo (фиг. 6, таблица 3).

Таблица 2

Процент OT-I клеток от CD3+/CD8+ клеток Контроль стимуляции Контроль толерантности B-клетка-Endo B-клетка-SQZ Селезенка 1,47 0,79 1,54 0,32 Лимфатический узел 0,77 0,13 0,57 0,15

Таблица 3

Процент клеток с высоким уровнем IFN-γ и CD44 из OT-I клеток Контроль стимуляции Контроль толерантности B-клетка-Endo B-клетка-SQZ 79,6 67,8 77,6 54,8

Пример 3: Доставка с использованием сужения антигена в Т-клетки для индукции толерантности

Для определения способности являющихся Т-клетками антигенпредставляющих клеток (APC), содержащих внутриклеточный антиген, образованных путем доставки антигена с использованием сужения, к индукции антигензависимой толерантности in vivo, количество антигенспецифических Т-клеток и уровни цитокина воспаления IFN-γ измеряли с помощью проточной цитометрии.

Материалы и методы

Мышам-реципиентам C57BL/6J (CD45.1) адоптивно переносили 2,5×10⁶ OVA-специфических OT-I Т-клеток на мышь от самок мышей-доноров OT-I (CD45.2) в день 0. В тот же день мышам также вводили 5×10⁶ T клеток APC (CD90.1), либо подвергнутых инкубации в присутствии иммуногенного OVA-эпитопа (пептида SIINFEKL, SEQ ID NO: 1) без сужения, или Т-клеток с доставкой с использованием сужения полноразмерного белка OVA. Антигенная стимуляция имела место в день 8 с помощью внутрикожной инъекции 10 мкг белка OVA (антигена)+50 нг LPS (адъювант)/мышь у подвергнутых стимуляции животных по сравнению с не подвергнутыми воздействию животными (без Т-клеток APC, без антигена). OT-I Т-клеточный ответ на антигенную стимуляцию измеряли с помощью проточной цитометрии ради количества OT-I Т-клеток и внутриклеточного окрашивания IFNγ в день 12. Описание схемы лечения показано на фиг. 7, а группы лечения приведены в таблице 4.

Таблица 4

Группа День 0 День 8 Не подвергнутые воздействию Адоптивный перенос OT-I Контроль стимуляции Адоптивный перенос OT-I OVA+LPS Контроль толерантности Адоптивный перенос OT-I и T-клетки, подвергнутые инкубации с пептидом SIINFEKL без сужения. OVA+LPS T-клетка-SQZ Адоптивный перенос OT-I и T-клетки с OVA, доставленным с помощью сужения. OVA+LPS

Результаты

Количество OT-I-II-специфических Т-клеток измеряли в день 12 у мышей из четырех групп воздействия. Активация и пролиферация OT-I Т-клеток как в дренирующих лимфатических узлах, так и в селезенке были значительно ингибированы (****P<0,0001) у мышей, подвергнутых первичному воздействию Т-клеток с доставкой белка OVA с использованием сужения, по сравнению с контролем стимуляции (фиг. 8). У этих мышей наблюдались количества OT-I Т-клеток, схожие с таковыми у не подвергнутых воздействию мышей или контроля толерантности к OVA в свободном виде.

Для оценки функционального эффекта опосредованной Т-клетками-SQZ APC толерантности на функцию OT-I-специфических Т-клеток, уровень продукции IFNγ в OT-I Т-клетках, рестимулированный свободным пептидом SIINFEKL, оценивали для всех групп (фиг. 9). OT-I Т-клетки у мышей группы T-клетка-SQZ продемонстрировали значительное снижение процента экспрессирующих на высоком уровне IFNγ клеток (****P<0,0001) по сравнению с контролем стимуляции, аналогично контролю толерантности (****P<0,0001).

Репрезентативные проточные цитограммы для количеств OT-I T-клеток в сравнение с CD8+ Т-клетками (фиг. 10, верхние панели) и процент клеток с высоким уровнем IFNγ в сравнение с маркером антигенной активации CD44 (фиг. 10, нижние панели) показывают, что у животных группы T-клетка-SQZ было меньшее количество как OT-I Т-клеток, так и продукции IFNγ по сравнению с контролем стимуляции (таблица 5).

Таблица 5

Контроль стимуляции (%) Не подвергнутые воздействию (%) SQZ-OVA (%) Контроль толерантности (%) CD45.2+/CD8+ 20,8 1,49 1,52 2,55 Высокий уровень IFN-γ и CD44 87,1 1,37 15,5 26,0

Пример 4A: Профилактика в модели диабета типа I у мыши

Введение

Для определения способности антигенпредставляющих клеток (APC - например, B- и/или Т-клеток), содержащих антиген, доставленный с помощью SQZ, к индукции антигензависимой толерантности при профилактике in vivo модели диабета I типа у мыши, уровни глюкозы в крови измеряются еженедельно с течением времени после индукции толерантности.

Материалы и методы

Мышей NOD/ShiltJ подвергают воздействию APC в возрасте 10 недель. В день 0, APC из мышей NOD/ShiltJ собирают и инкубируют с пептидом 9-23 B-цепи инсулина (InsB9-23: CKKGSSHLVEALYLVCGERG, SEQ ID NO:2) без сужения, или InsB9-23 доставляют по условиям SQZ, с последующей инъекцией 5М APC/мышь мышам-реципиентам. Контрольные животные получают инъекцию PBS (контроль стимуляции). Измерения уровня глюкозы в крови проводят еженедельно, начиная с дня 7 после воздействия (в возрасте 11 недель). Мыши считаются страдающими диабетом, когда уровень глюкозы в их крови превышает 260 мг/дл, как измерено с помощью измерителя для диабета Bayer Contour/тест-полоски для глюкозы. Описание репрезентативной схемы воздействия показано на фиг. 11А, а группы воздействия приведены в таблице 6.

Таблица 6

Группа Дни 0 и 5 Контроль стимуляции PBS APC-Endo APC, подвергнутые инкубации с InsB_9-23 APC-SQZ APC, подвергнутые SQZ с InsB_9-23

Пример 4B: Терапия в модели диабета типа I у мыши

Введение

Для определения способности антигенпредставляющих клеток (APC - например, B- и/или Т-клеток), содержащих антиген, доставленный с помощью SQZ, к индукции антигензависимой толерантности при лечении in vivo модели диабета I типа у мыши, уровни глюкозы в крови измеряются еженедельно с течением времени после индукции толерантности у мышей.

Материалы и методы

Для быстрого вызова T1D у реципиентов, CD4 Т-клетки собирают из мышей BDC2.5 NOD, активируют ex vivo с использованием пептида мимотопа р31 (YVRPLWVRME, SEQ ID NO: 3) в течение 4 дней и адоптивно переносят (5M клеток/мышь) нормогликемическим NOD-реципиентам. Индукция толерантности начинается через 8 часов после адоптивного переноса и повторяется каждые 3 дня с использованием в общей сложности 3 доз. Реципиентов подвергают воздействию PBS (контроль стимуляции) или 5M APC, которые проинкубированы с p31 (APC-Endo), или в которые доставлен р31 с помощью SQZ (APC-SQZ). Уровень глюкозы в их крови измеряется каждый день с помощью измерителя для диабета Bayer Contour/тест-полоски для глюкозы. Мыши считаются страдающими диабетом, когда уровень глюкозы в крови превышает 260 мг/дл. Описание репрезентативной схемы воздействия показано на фиг. 11В, а группы о воздействия приведены в таблице 7.

Таблица 7

Группа Дни 0 и 5 Контроль стимуляции PBS APC-Endo APC, подвергнутые инкубации с InsB_9-23 APC-SQZ APC, подвергнутые SQZ с InsB_9-23

Пример 5А: Профилактика при аутоиммунном нарушении MS-типа у мыши

Введение

Для определения способности антигенпредставляющих клеток (APC - например, B- и/или Т-клеток), содержащих антиген, доставленный с помощью SQZ, к индукции антигензависимой толерантности в in vivo модели профилактики аутоиммунного нарушения MS-типа у мыши, клиническая оценка подвижности делается ежедневно с течением времени.

Материалы и методы

Самок мышей C57BL/6 (возрастом 10-12 недель) подвергают воздействию АРС до индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE). В дни -7, APC из мышей C57BL/6 собирают и инкубируют с пептидом 35-55 гликопротеина миелина олигодендроцитов (MOG_35-55: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKGS, SEQ ID NO:4) без сужения, или пептид MOG_35-55 или OVA_323-339 (отрицательный контроль: ISQAVHAAHAEINEAGRGS, SEQ ID NO:5) доставляется в APC по условиям SQZ, с последующим введением 5M APC/мышь мышам-реципиентам. В день 0 EAE индуцируется введением MOG_35-55 в CFA и коклюшного токсина в PBS (набор Гука). Мышей ежедневно оценивают, начиная с дня 7, с использованием клинической оценки, определяемой следующим образом: 1, «поникший» хвост; 2, частичный паралич задней ноги; 3, полный паралич задней ноги; 4, полный паралич задней ноги и частичный паралич передней ноги; и 5, умерщвление. Описание репрезентативной схемы воздействия показано на фиг. 12А, и группы воздействия приведены в таблице 8.

Таблица 8

Группа День -7 День 0 (Индукция ЕАЕ) Контроль стимуляции APC, подвергнутые SQZ с OVA_323-339 MOG_35-55+коклюшный токсин APC-Endo APC, подвергнутые инкубации с MOG_35-55 MOG_35-55+коклюшный токсин APC-SQZ APC, подвергнутые SQZ с MOG_35-55 MOG_35-55+коклюшный токсин

Пример 5В: Терапия при аутоиммунном нарушении MS-типа у мыши

Введение

Для определения способности антигенпредставляющих клеток (APC - например, B- и/или Т-клеток), содержащих антиген, доставленный с помощью SQZ, к индукции антигензависимой толерантности в in vivo модели установленного аутоиммунного нарушения MS-типа у мыши, клиническая оценка подвижности делается ежедневно с течением времени.

Материалы и методы

У самок мышей C57BL/6 (возрастом 10-12 недель) экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) индуцируется введением MOG_35-55 в CFA и коклюшного токсина в PBS (набор Гука) в день 0. Затем мышей подвергают воздействию APC в день возникновения EAE, который возникает, когда мыши оцениваются ≥1 на основании нижеизложенных критериев подвижности. В день ~11/12 В-клетки из мышей C57BL/6 собирают и инкубируют с пептидом35-55 гликопротеина миелина олигодендроцитов (MOG_35-55: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKGS, SEQ ID NO:4) без сужения, или пептид MOG_35-55 или OVA_323-339 (отрицательный контроль: ISQAVHAAHAEINEAGRGS, SEQ ID NO:5) доставляется в APC по условиям SQZ, с последующим введением 5M APC/мышь мышам-реципиентам. Мышей ежедневно оценивают, начиная с дня 19, с использованием клинической оценки, определяемой следующим образом: 1, «поникший» хвост; 2, частичный паралич задней ноги; 3, полный паралич задней ноги; 4, полный паралич задней ноги и частичный паралич передней ноги; и 5, умерщвление. Описание репрезентативной схемы воздействия показано на фиг. 12В, и группы воздействия приведены в таблице 9.

Таблица 9

Группа День -7 День 0 (Индукция ЕАЕ) Контроль стимуляции APC, подвергнутые SQZ с OVA_323-339 MOG_35-55+коклюшный токсин APC-Endo APC,, подвергнутые инкубации с MOG_35-55 MOG_35-55+коклюшный токсин APC-SQZ APC, подвергнутые SQZ с MOG_35-55 MOG_35-55+коклюшный токсин

Список последовательностей

SEQ ID NO Последовательность Описание 1 SIINFEKL CD8+ активный эпитоп OVA 2 CKKGSSHLVEALYLVCGERG пептид 9-23 В-цепи (InsB_9-23) 3 YVRPLWVRME пептид мимотопа p31 4 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKGS пептид 35-55 гликопротеина миелина олигодендроцитов (MOG_35-55) 5 ISQAVHAAHAEINEAGRGS Пептид OVA_323-339

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано для индукции толерантности или подавления иммунного ответа в отношении антигена у индивидуума. Способ индукции толерантности или подавления иммунного ответа на антиген предусматривает пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген и/или толерогенный фактор проникает в клетку, тем самым образуя толерогенную и/или иммуносупрессорную иммунную клетку. Изобретение обеспечивает эффективную доставку полезной нагрузки - антигена или толерогенного фактора в иммунные клетки, которые могут быть использованы для индукции невосприимчивости организма к указанному агенту. 5 н. и 195 з.п. ф-лы, 12 ил., 9 табл., 5 пр.

1. Способ индукции толерантности или подавления иммунного ответа в отношении антигена у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, и

b. введение индивидууму иммунной клетки, причем иммунная клетка является толерогенной иммунной клеткой или иммуносупрессорной иммунной клеткой, и причем представление указанного антигена индуцирует толерантность к антигену или подавляет иммунный ответ в отношении антигена.

2. Способ по п. 1, где указанная иммунная клетка дополнительно содержит толерогенный фактор, и указанный способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей указанную иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что указанный антиген и указанный толерогенный фактор, соприкасающиеся с клеткой, проникают в иммунную клетку.

3. Способ образования толерогенной иммунной клетки, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, тем самым образуя толерогенную иммунную клетку.

4. Способ образования иммуносупрессорной иммунной клетки, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, тем самым образуя иммуносупрессорную иммунную клетку.

5. Способ по п. 3 или 4, в котором указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что в иммунную клетку проникают толерогенный фактор и антиген, соприкасающиеся с клеткой.

6. Способ по п. 3 или 4, в котором иммунную клетку дополнительно пропускают через второе сужение, и в котором указанное второе сужение деформирует клетку, тем самым вызывая нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку.

7. Способ по любому из пп. 3-6, в котором иммунной клеткой является антигенпредставляющая клетка.

8. Способ по п. 7, в котором указанная иммунная клетка представляет собой толерогенную антигенпредставляющую клетку, содержащую антиген, где указанную толерогенную антигенпредставляющую клетку получают способом, включающим: пропускание толерогенной антигенпредставляющей клетки через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, посредством чего вызывается нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в антигенпредставляющую клетку.

9. Способ по п. 7, в котором указанная иммунная клетка представляет собой иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку, содержащую антиген, где указанную иммуносупрессорную антигенпредставляющую клетку получают способом, включающим: пропускание иммуносупрессорной антигенпредставляющей клетки через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, посредством чего вызывается нарушение в клетке, так что антиген, соприкасающийся с клеткой, проникает в антигенпредставляющую клетку.

10. Способ по п. 3, где толерогенный фактор ингибирует экспрессию и/или активность иммуностимулирующего агента, усиливает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы, ингибирует экспрессию и/или активность молекулы воспаления и/или усиливает экспрессию и/или активность противовоспалительной молекулы.

11. Способ по п. 4, где толерогенный фактор ингибирует экспрессию и/или активность иммуностимулирующего агента, усиливает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы, ингибирует экспрессию и/или активность молекулы воспаления и/или усиливает экспрессию и/или активность противовоспалительной молекулы.

12. Способ по п. 1, дополнительно включающий пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что в иммунную клетку проникает толерогенный фактор, соприкасающийся с клеткой, тем самым образуя вторую иммуносупрессорную иммунную клетку; и введение индивидууму второй иммунной клетки, причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген.

13. Способ по п. 12, в котором представление указанного антигена указанной первой или второй иммунной клеткой подавляет иммунный ответ на антиген.

14. Способ по п. 12, в котором вторая иммунная клетка придает иммуносупрессорный фенотип первой иммунной клетке, тем самым образуя иммуносупрессорную первую иммунную клетку, и в котором представление указанного антигена указанной иммуносупрессорной первой иммунной клеткой подавляет иммунный ответ на антиген.

15. Способ по п. 1, дополнительно включающий пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую иммунную клетку, через сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что толерогенный фактор, соприкасающийся с клеткой, проникает в иммунную клетку, тем самым образуя вторую толерогенную иммунную клетку; и введение индивидууму второй иммунной клетки, причем представление указанного антигена подавляет иммунный ответ на антиген.

16. Способ по п. 15, в котором представление указанного антигена указанной первой или второй иммунной клеткой индуцирует толерантность к антигену.

17. Способ по п. 15, в котором вторая иммунная клетка придает толерогенный фенотип первой иммунном клетке, тем самым образуя толерогенную первую иммунную клетку, и в котором представление указанного антигена указанной толерогенной первой иммунной клеткой индуцирует толерантность к антигену.

18. Способ по любому из пп. 12-17, в котором первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся индивидууму одновременно.

19. Способ по любому из пп. 12-17, в котором первая иммунная клетка и вторая иммунная клетка вводятся индивидууму последовательно.

20. Способ по любому из пп. 1-3, 5-8, 10 и 15-19, в котором толерогенная иммунная клетка или ее предшественник не приводились в соприкосновение с адъювантом.

21. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-7, 9, 11-14 и 18, 19, в котором иммуносупрессорная иммунная клетка или ее предшественник не приводились в соприкосновение с адъювантом.

22. Способ по п. 20 или 21, в котором адъювант выбирают из группы, состоящей из лигандов для TLR3 и RLR, лигандов для TLR4, лигандов для TLR5, лигандов для TLR7/8, лигандов для TLR9, лигандов для NOD2, квасцов, эмульсий типа «вода-в-масле», rhIL-2, анти-CD40, CD40L, IL-12 и циклических динуклеотидов.

23. Способ по любому из пп. 1-3, 5-8, 10 и 15-20, в котором толерогенная иммунная клетка заключает в себе уменьшенную способность обеспечивать один или более костимулирующих сигналов по сравнению с нетолерогенным предшественником толерогенной иммунной клетки.

24. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-7, 9, 11-14, 18, 19 и 21, в котором иммуносупрессорная иммунная клетка заключает в себе уменьшенную способность обеспечивать один или более костимулирующих сигналов по сравнению с неиммуносупрессорным предшественником иммуносупрессорной иммунной клетки.

25. Способ по п. 23 или 24, в котором один или более костимулирующих сигналов опосредуются молекулой, выбираемой из группы, состоящей из CD40, CD80, CD86, CD54, CD83, CD79 и лиганда для ICOS.

26. Способ по любому из пп. 1-3, 5-8, 10, 15-20 и 23, в котором толерогенная иммунная клетка заключает в себе уменьшенную способность обеспечить один или более сигналов воспаления по сравнению с нетолерогенным предшественником толерогенной иммунной клетки.

27. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-7, 9, 11-14, 18, 19, 21 и 24, в котором иммуносупрессорная иммунная клетка заключает в себе уменьшенную способность обеспечивать один или более сигналов воспаления по сравнению с неиммуносупрессорным предшественником иммуносупрессорной иммунной клетки.

28. Способ по п. 26 или 27, в котором один или более сигналов воспаления опосредуются молекулой, выбираемой из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12, IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона гамма (IFN-гамма), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), NF-κB, регуляторного фактора интерферона (IRF) и молекулы, связанной с путем передачи сигналов JAK-STAT.

29. Способ по любому из пп. 2-5, 10-12 и 15, в котором толерогенный фактор ингибирует экспрессию и/или активность иммуностимулирующего агента, усиливает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы, ингибирует экспрессию и/или активность молекулы воспаления и/или усиливает экспрессию и/или активность противовоспалительной молекулы.

30. Способ по любому из пп. 1-3, 5-8, 10 и 15-20 и 23, в котором антиген представляется толерогенной иммунной клеткой.

31. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-7, 9, 11-14, 18, 19, 21 и 24, в котором антиген представляется иммуносупрессорной иммунной клеткой.

32. Способ по любому из пп. 2, 3, 5-7, 10, 15-20 и 23, в котором индуцируется толерантность к по крайней мере одному другому антигену.

33. Способ по любому из пп. 2, 4-7, 11-14, 18, 19, 21 и 24, в котором подавляется иммунный ответ против по крайней мере одного другого антигена.

34. Способ по любому из пп. 1-2, 5-6, 8, 9 и 12-17, в котором по крайней мере один дополнительный антиген вводится в клетку.

35. Способ по любому из пп. 2, 3, 5, 10-11, 12 и 15, в котором по крайней мере один дополнительный толерогенный фактор вводится в клетку.

36. Способ по любому из пп. 1-35, где указанная иммунная клетка дополнительно содержит нефункциональный цитокин-связывающий белок, где указанный нефункциональный цитокин-связывающий белок вводят в указанную иммунную клетку способом, включающим: пропускание указанной клеточной суспензии, содержащей указанную иммунную клетку, через указанное сужение, причем указанное сужение деформирует клетку, вызывая нарушение в клетке, так что соединение, кодирующее нефункциональный цитокин-связывающий белок, соприкасающееся с клеткой, проникает в иммунную клетку, причем указанный нефункциональный цитокин-связывающий белок экспрессируется, и причем указанный нефункциональный цитокин-связывающий белок связывается со свободными цитокинами воспаления.

37. Способ по п. 36, в котором нефункциональный цитокин-связывающий белок включает нефункциональный рецептор цитокина.

38. Способ по п. 37, в котором у нефункционального цитокин-связывающего белка отсутствуют цитоплазматические сигнальные домены.

39. Способ по п. 36, в котором нефункциональный цитокин-связывающий белок содержит протеолитический центр, который расщепляет цитокин-мишень.

40. Способ по п. 36, в котором нефункциональный цитокин-связывающий белок включает антитело против цитокина.

41. Способ по п. 36, в котором нефункциональный цитокин-связывающий белок включает рецептор содержащих антитело против цитокина В-клеток.

42. Способ по любому из пп. 1, 2 и 12-36, в котором иммунная клетка относится к индивидууму.

43. Способ по любому из пп. 1, 2 и 12-36, в котором иммунная клетка принадлежит другому индивидууму.

44. Способ по любому из пп. 1-43, в котором сужение содержится внутри микрофлюидного канала.

45. Способ по любому из пп. 1-43, в котором сужение представляет собой пору или содержится внутри поры.

46. Способ по п. 45, в котором пора содержится внутри поверхности.

47. Способ по п. 46, в котором поверхность представляет собой фильтр.

48. Способ по п. 46, в котором поверхность представляет собой мембрану.

49. Способ по любому из пп. 1-48, в котором размер сужения зависит от диаметра иммунной клетки.

50. Способ по любому из пп. 1-49, в котором размер сужения составляет приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от диаметра клетки.

51. Способ по любому из пп. 1-50, в котором канал содержит сужение длиной, составляющей приблизительно 10 мкм, и шириной, составляющей приблизительно 4 мкм.

52. Способ по любому из пп. 1-51, в котором размер поры составляет приблизительно 0,4 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 4 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 8 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 12 мкм или приблизительно 14 мкм.

53. Способ по любому из пп. 1-52, который осуществляют при температуре от приблизительно -5^οС до приблизительно 45^οС.

54. Способ по любому из пп. 1-4 и 1-53, в котором клеточная суспензия включает смешанную популяцию клеток.

55. Способ по п. 54, в котором клеточная суспензия представляет собой цельную кровь.

56. Способ по п. 54, в котором клеточная суспензия включает мононуклеарные клетки периферической крови.

57. Способ по любому из пп. 1-4 и 10-53, в котором клеточная суспензия включает очищенную популяцию клеток.

58. Способ по любому из пп. 1-4 и 10-57, в котором клеточная суспензия включает клетки млекопитающих.

59. Способ по любому из пп. 1-4 и 10-58, в котором клеточная суспензия включает клетки обезьян, мышей, собак, кошек, лошадей, крыс, овец, коз, свиней или кроликов.

60. Способ по любому из пп. 1-4 и 10-58, в котором клеточная суспензия включает клетки человека.

61. Способ по любому из пп. 1-4 и 10-57, в котором клеточная суспензия включает клетки, не являющиеся клетками млекопитающих.

62. Способ по любому из пп. 1-4, 10-57 и 61, в котором клеточная суспензия включает бактериальные, дрожжевые клетки, клетки кур, лягушек, насекомых, рыб или нематод.

63. Способ по любому из пп. 1-7 и 10-60, в котором иммунная клетка представляет собой клетку млекопитающего.

64. Способ по любому из пп. 1-7, 10-60 и 63, в котором иммунная клетка представляет собой клетку обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика.

65. Способ по любому из пп. 1-7, 10-60 и 63, в котором иммунная клетка представляет собой клетку человека.

66. Способ по любому из пп. 1-7 и 10-65, в котором иммунная клетка представляет собой Т-клетку, В-клетку, дендритную клетку, моноцит, макрофаг, NK-клетку, врожденную лимфоидную клетку, нейтрофил, базофил, эозинофил, клетку-супрессор миелоидного происхождения или тучную клетку.

67. Способ по любому из пп. 8, 9 и 42-66, в котором антигенпредставляющей клеткой является клетка млекопитающего.

68. Способ по любому из пп. 8, 9 и 42-67, в котором антигенпредставляющей клеткой является клетка обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика.

69. Способ по любому из пп. 8, 9 и 42-67, в котором антигенпредставляющей клеткой является клетка человека.

70. Способ по любому из пп. 8, 9 и 42-69, в котором антигенпредставляющей клеткой является Т-клетка, В-клетка, дендритная клетка, моноцит, макрофаг, NK-клетка, врожденная лимфоидная клетка, нейтрофил, базофил, эозинофил, клетка-супрессор миелоидного происхождения или тучная клетка.

71. Способ по любому из пп. 1-9, 12-35 и 42-70, в котором антиген представляет собой чужеродный антиген.

72. Способ по любому из пп. 1-9, 12-35 и 42-70, в котором антигеном является аутоантиген.

73. Способ по любому из пп. 1-9, 12-35 и 42-70, в котором антиген представляет собой трансплантационный антиген аллотрансплантата.

74. Способ по любому из пп. 1-9, 12-35 и 42-70, в котором антиген представляет собой белок или полипептид.

75. Способ по любому из пп. 1-9, 12-35 и 42-70, в котором антиген представляет собой лизат.

76. Способ по любому из пп. 1-9, 12-35 и 42-75, в котором антиген представляет собой модифицированный антиген.

77. Способ по п. 76, в котором модифицированный антиген включает антиген, слитый с терапевтическим средством.

78. Способ по п. 76, в котором модифицированный антиген включает антиген, слитый с нацеливающим пептидом.

79. Способ по любому из пп. 1-4, 10-78, в котором указанная клеточная суспензия соприкасается с антигеном до, одновременно или после прохождения через сужение.

80. Способ по любому из пп. 1-35 и 42-79, в котором толерогенный фактор ингибирует активность костимулирующей молекулы.

81. Способ по любому из пп. 1-35 и 42-80, в котором толерогенный фактор уменьшает экспрессию костимулирующей молекулы.

82. Способ по любому из пп. 1-35 и 42-81 и 50-89, в котором толерогенный фактор удаляет нуклеиновую кислоту, которая модулирует экспрессию костимулирующей молекулы.

83. Способ по любому из пп. 1-35 и 42-80, в котором толерогенный фактор ингибирует костимулирующую молекулу.

84. Способ по любому из пп. 1-35 и 42-83, в котором толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию костимулирующей молекулы.

85. Способ по любому из пп. 1-35 и 42-83, в котором толерогенный фактор увеличивает активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию костимулирующей молекулы.

86. Способ по любому из пп. 1-35 и 42-80, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор костимулирующей молекулы.

87. Способ по любому из пп. 80-86, в котором костимулирующая молекула представляет собой CD80 или CD86.

88. Способ по любому из пп. 1-35 и 42-87, в котором толерогенный фактор усиливает активность иммуносупрессорного фактора.

89. Способ по п. 88, в котором иммуносупрессорным фактором является коингибирующая молекула, регулятор транскрипции или иммуносупрессорная молекула.

90. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88 и 89, в котором толерогенный фактор усиливает активность коингибирующей молекулы.

91. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88-90, в котором толерогенный фактор увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы.

92. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88-91, в котором толерогенный фактор кодирует коингибирующую молекулу.

93. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88-92, в котором толерогенный фактор увеличивает активность коингибирующей молекулы.

94. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88-90, в котором толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который усиливает экспрессию коингибирующей молекулы.

95. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88-94, в котором толерогенный фактор увеличивает активность полипептида, который увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы.

96. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88-90 и 94, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер коингибирующей молекулы.

97. Способ по любому из пп. 89-96, в котором коингибирующая молекула представляет собой PD-L1, PD-L2 или CTLA-4.

98. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88 и 89, в котором толерогенный фактор усиливает активность иммуносупрессорной молекулы.

99. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88, 89 и 98, в котором толерогенный фактор увеличивает экспрессию иммуносупрессорной молекулы.

100. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88, 89 и 98, в котором толерогенный фактор кодирует иммуносупрессорную молекулу.

101. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88, 89 и 98, в котором толерогенный фактор увеличивает активность иммуносупрессорной молекулы.

102. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88, 89 и 98, в котором толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы.

103. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88, 89 и 98, в котором толерогенный фактор увеличивает активность полипептида, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы.

104. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 88, 89 и 98, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер иммуносупрессорной молекулы.

105. Способ по любому из пп. 89 и 98, в котором иммуносупрессорная молекула представляет собой ARG1, NO, NOS2, IDO, IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα или TGFβ.

106. Способ по любому из пп. 1-35 и 42-79, в котором толерогенный фактор ингибирует активность молекулы воспаления.

107. Способ по п. 106, в котором молекулой воспаления является фактор транскрипции при воспалении.

108. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, 106 и 107, в котором толерогенный фактор ингибирует фактор транскрипции при воспалении.

109. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79 и 106-108, в котором толерогенный фактор уменьшает экспрессию фактора транскрипции при воспалении.

110. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79 и 106-108, в котором толерогенный фактор удаляет нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор транскрипции при воспалении.

111. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79 и 106-108, в котором толерогенный фактор увеличивает активность регулятора транскрипции, который подавляет экспрессию фактора транскрипции при воспалении.

112. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79 и 106-108, в котором толерогенный фактор увеличивает активность ингибитора белка, который подавляет экспрессию фактора транскрипции при воспалении.

113. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79 и 106-108, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор фактора транскрипции при воспалении.

114. Способ по любому из пп. 107-113, в котором фактором транскрипции при воспалении является NF-κB, регуляторный фактор интерферона или молекула, связанная с путем передачи сигналов JAK-STAT.

115. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79 и 106-10843, 50-87 и 114-116, в котором толерогенный фактор снижает продукцию и/или секрецию одного или более цитокинов воспаления.

116. Способ по п. 115, в котором один или более цитокинов воспаления выбирают из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), интерферона гамма (IFN-γ) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

117. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79 и 106-108, в котором толерогенный фактор увеличивает продукцию и/или секрецию одного или более противовоспалительных цитокинов.

118. Способ по п. 117, в котором один или более противовоспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α и трансформирующего фактора роста бета (TGFβ).

119. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, в котором толерогенный фактор кодирует модифицированный TCR, содержащий цитоплазматический сигнальный домен, который запускает продукцию иммуносупрессорных цитокинов при связывании с антигеном.

120. Способ по любому из пп. 1-35, 42-79, в котором толерогенный фактор кодирует химерный рецептор антигена, содержащий цитоплазматические сигнальные домены, которые запускают продукцию иммуносупрессорных цитокинов при связывании с антигеном.

121. Способ по любому из пп. 1-35, 42-120, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту.

122. Способ по любому из пп. 1-35, 42-121, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую короткую интерферирующую РНК (siRNA), мРНК, микроРНК (miRNA), длинную некодирующую РНК (lncRNA), тРНК или короткую шпилечную РНК (shRNA).

123. Способ по любому из пп. 1-35, 42-122, в котором толерогенным фактором является плазмида.

124. Способ по любому из пп. 1-35, 42-120, в котором толерогенный фактор включает комплекс белок-нуклеиновая кислота.

125. Способ по любому из пп. 1-35, 42-120 и 124, в котором толерогенный фактор включает полипептид Cas9 и направляющую РНК или донорную ДНК.

126. Способ по любому из пп. 1-35, 42-121, в котором толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид Cas9, и направляющую РНК или донорную ДНК.

127. Способ по любому из пп. 1-35, 42-12043 и 50-128, в котором толерогенный фактор включает полипептид.

128. Способ по любому из пп. 1-35, 42-120 и 127, в котором полипептид представляет собой нуклеазу, белок TALEN, нуклеазу c цинковыми пальцами, мегануклеазу или рекомбиназу CRE.

129. Способ по любому из пп. 1-35, 42-120 и 127, в котором полипептид представляет собой фермент транспозазу или интегразу.

130. Способ по любому из пп. 1-35, 42-120 и 127, в котором полипептидом является антитело.

131. Способ по любому из пп. 1-35, 42-120 и 127, в котором полипептидом является фактор транскрипции.

132. Способ по любому из пп. 1-35, 42-120, в котором толерогенный фактор представляет собой небольшую молекулу.

133. Способ по любому из пп. 1-35, 42-120, в котором толерогенный фактор представляет собой наночастицу.

134. Способ по любому из пп. 1-35, 42-133, в котором указанная клеточная суспензия соприкасается с толерогенным фактором до, одновременно или после прохождения через сужение.

135. Способ по любому из пп. 1-2 и 4-134, в котором иммунный ответ подавляется на по крайней мере приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 100%.

136. Способ по любому из пп. 1-2 и 4-135, в котором подавленный иммунный ответ включает снижение продукции и/или секреции одного или более цитокинов воспаления.

137. Способ по п. 136, в котором один или более цитокинов воспаления выбирают из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), интерферона гамма (IFN-γ) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

138. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-135, в котором подавленный иммунный ответ включает увеличение продукции и/или секреции одного или более противовоспалительных цитокинов.

139. Способ по п. 138, в котором один или более противовоспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α и трансформирующего фактора роста бета (TGFβ).

140. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-135, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный Т-клеточный ответ.

141. Способ по п. 140, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение активации Т-клеток.

142. Способ по любому из пп. 140, 141, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение выживаемости Т-клеток.

143. Способ по любому из пп. 140-142, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение пролиферации Т-клеток.

144. Способ по любому из пп. 140-143, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение функциональности Т-клеток.

145. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-144, в котором подавленный иммунный ответ включает усиленный Treg ответ.

146. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-145, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный В-клеточный ответ.

147. Способ по п. 146, в котором уменьшенный В-клеточный ответ включает снижение продукции антител.

148. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-147, в котором подавленный иммунный ответ включает снижение продукции цитокинов.

149. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-148, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенную аутоиммунную реакцию.

150. Способ по п. 149, где уменьшенная аутоиммунная реакция включает уменьшенную аутоиммунную реакцию против антигена, связанного с диабетом I типа, ревматоидным артритом, псориазом, рассеянным склерозом, болезнью Крона или язвенным колитом.

151. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-149, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенную аллергическую реакцию.

152. Способ по любому из пп. 1-9, 12-35, 42-71 и 74, в котором антиген представляет собой пищевой аллерген.

153. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-149, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенную аллергическую реакцию на пищевой аллерген.

154. Способ по любому из пп. 1-9, 12-35, 42-70, в котором антиген представляет собой антиген, связанный с трансплантированной тканью.

155. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-154, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против трансплантированной ткани.

156. Способ по любому из пп. 1-9, 12-35 и 42-70, в котором антиген связан с вирусом.

157. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-156, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный патогенный иммунный ответ против вируса.

158. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-157, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического средства.

159. Способ по п. 158, где терапевтическое средство представляет собой фактор свертывания крови.

160. Способ по п. 159, где фактор свертывания крови представляет собой фактор VIII и фактор IX.

161. Способ по п. 158, где терапевтическое средство представляет собой гормон.

162. Способ по п. 159, где терапевтический гормон представляет собой инсулин, гормон роста человека или фолликулостимулирующий гормон.

163. Способ по любому из пп. 1, 2 и 4-16, в котором подавленный иммунный ответ включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического носителя.

164. Способ по п. 163, где терапевтический носитель представляет собой вирус.

165. Способ по пп. 156, 157 и 164, где вирус представляет собой одно или более из аденовируса, аденоассоциированного вируса, бакуловируса, вируса герпеса или ретровируса.

166. Способ по п. 165, где вирус представляет собой аденоассоциированный вирус.

167. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35 и 42-134, в котором толерантность включает снижение продукции и/или секреции одного или более цитокинов воспаления.

168. Способ по п. 167, в котором один или более цитокинов воспаления выбирают из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), интерферона гамма (IFN-γ) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

169. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35 и 42-134, в котором толерантность включает увеличение продукции и/или секреции одного или более противовоспалительных цитокинов.

170. Способ по п. 169, в котором один или более противовоспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFN-α и трансформирующего фактора роста бета (TGFβ).

171. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35 и 42-134, в котором толерантность включает уменьшенный Т-клеточный ответ.

172. Способ по п. 171, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение активации Т-клеток.

173. Способ по любому из пп. 171, 172, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение выживаемости Т-клеток.

174. Способ по любому из пп. 171-173, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение пролиферации Т-клеток.

175. Способ по любому из пп. 171-174, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает снижение функциональности Т-клеток.

176. Способ по любому из пп. 171-175, в котором уменьшенный Т-клеточный ответ включает изменение фенотипа Т-клеток.

177. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35, 42-134 и 171-176, в котором толерантность включает некостимулированную активацию Т-клетки.

178. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35, 42-134 и 171-177, в котором толерантность включает усиленный Treg ответ.

179. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35, 42-134 и 171-178, в котором толерантность включает уменьшенный В-клеточный ответ.

180. Способ по п. 179, в котором уменьшенный В-клеточный ответ включает снижение продукции антител.

181. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35, 42-134 и 171-180, в котором толерантность включает снижение продукции цитокинов.

182. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35, 42-134 и 171-181, в котором толерантность включает уменьшенную аутоиммунную реакцию.

183. Способ по п. 182, где уменьшенная аутоиммунная реакция включает индуцированную толерантность против антигена, связанного с диабетом I типа, ревматоидным артритом, псориазом, рассеянным склерозом, болезнью Крона или язвенным колитом.

184. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35, 42-134 и 171-183, 2, 5, 6, 23-43, 50-142 и 179-191, в котором толерантность включает уменьшенную аллергическую реакцию.

185. Способ по п. 184, в котором толерантность включает уменьшенную аллергическую реакцию на пищевой аллерген.

186. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35, 42-134 и 171-185, в котором толерантность включает уменьшенный иммунный ответ против трансплантированной ткани.

187. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35, 42-134 и 171-186, в котором толерантность включает уменьшенный патогенный иммунный ответ против вируса.

188. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35, 42-134 и 171-187, в котором толерантность включает уменьшенный иммунный ответа против терапевтического средства.

189. Способ по п. 188, где терапевтическое средство представляет собой фактор свертывания крови.

190. Способ по п. 189, где фактор свертывания крови представляет собой фактор VIII и фактор IX.

191. Способ по п. 188, где терапевтическое средство представляет собой гормон.

192. Способ по п. 191, где терапевтический гормон представляет собой инсулин, гормон роста человека или фолликулостимулирующий гормон.

193. Способ по любому из пп. 1, 2, 15-35, 42-134 и 171-192, в котором толерантность включает уменьшенный иммунный ответ против терапевтического носителя.

194. Способ по п. 193, где терапевтический носитель представляет собой вирус.

195. Способ по п. 187 или 194, где вирус представляет собой одно или более из аденовируса, аденоассоциированного вируса, бакуловируса, вируса герпеса или ретровируса.

196. Способ по п. 195, где вирус представляет собой аденоассоциированный вирус.

197. Способ по любому из пп. 1-196, который повторяют по крайней мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз.

198. Способ по п. 197, в котором продолжительность времени между любыми двумя повторениями способа составляет по крайней мере 1 день, 1 неделю, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев или 1 год.

199. Система, содержащая сужение, иммунную клетку, антиген и/или толерогенный фактор, для применения в способах по любому из пп. 1-35 и 42-198.

200. Система, содержащая сужение, иммунную клетку и соединение, кодирующее нефункциональный цитокин-связывающий белок, для применения в способах по любому из пп. 36-199.