ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ДОСТАВКА БИОЛОГИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ ДЛЯ ИНДУЦИРОВАНИЯ ТОЛЕРАНТНОСТИ Российский патент 2022 года по МПК C12N15/87 A61K35/18 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] По данной заявке испрашивают приоритет предварительной заявки США № 62/331,368, поданной 3 мая 2016 года, которая, таким образом, включена посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[2] Настоящее раскрытие в целом относится к способам супрессии иммунного ответа или индуцирования толерантности посредством доставки соединения в клетку посредством пропускания клеточной суспензии через деформирующее клетки сужение.

ПРЕДПОСЫЛКИ

[3] Показано, что присутствие антигенов в невоспалительном и апоптозном окружении селезенки индуцирует анергию и толерантность. Один способ обеспечить согласованное представление антигена, представляющего интерес, в этом толерогенном окружении состоит в физическом взаимодействии с красной клеткой крови (RBC).

[4] Однако манипуляция красными клетками крови для того, чтобы ассоциировать антигенный материал, является трудной, учитывая что они имеют неправильную форму (двояковогнутую), являются безъядерными и транскрипционно неактивными. Как результат, стандартные способы трансфекции не работают, и, следовательно, начальное испытание толерогенного потенциала красных клеток крови сосредоточено на конъюгировании материалов с поверхностью эритроцитов (Lorentz et al. Sci. Adv. 2015, 1:e1500112; Grimm et al. Sci Rep. 2015 Oct 29, 5:15907; Kontos et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Jan 2, 110(1):E60-8). Начальная работа с использованием поверхностной конъюгации показала перспективные результаты с модельными антигенами и мышиными моделями диабета 1-го типа, но обладает некоторыми значимыми недостатками. Эти недостатки включают: a) потребность в химически модифицированных антигенах для прикрепления, b) ограниченную площадь поверхности нагрузки, c) иммуногенность.

[5] Таким образом, существует неудовлетворенная потребность в способах внутриклеточной доставки, которые позволяют нагружать антигеном цитоплазму красных клеток крови и управлять мощным иммуносупрессорным ответом для лечения патогенных иммунных ответов, лежащих в основе аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантата. Источники, в которых описаны способы использования микрожидкостных сужений для того, чтобы доставлять соединения в клетки, включают WO2013059343, WO2015023982, WO2016070136, WO2016077761 и PCT/US2016/13113.

[6] Все цитируемые в данном описании ссылки, в том числе патентные заявки и публикации, включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[7] Настоящее изобретение предусматривает способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

[8] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что один или несколько толерогенных факторов проникают в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, где действие указанного одного или нескольких толерогенных факторов вносит вклад в толерогенное окружение и супрессию иммунного ответа.

[9] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и один или несколько толерогенных факторов проникают в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, где процессинг указанного антигена в толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ.

[10] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, который включает пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку, пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку, введение первой безъядерной клетки и второй безъядерной клетки индивидууму, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

[11] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

[12] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ доставки толерогенного фактора в безъядерную клетку, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в клетку, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с толерогенным фактором.

[13] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ введения антигена в толерогенное окружение, включающий доставку безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении.

[14] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ индуцирования толерантности к антигену у индивидуума, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку, введение безъядерной клетки индивидууму, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену.

[15] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ индуцирования толерантности у индивидуума, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, где действие указанного толерогенного фактора вносит вклад в толерогенное окружение, которое индуцирует толерантность.

[16] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ индуцирования толерантности к антигену у индивидуума, который включает пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку, пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку, введение первой безъядерной клетки и второй безъядерной клетки индивидууму, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену.

[17] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ индуцирования толерантности к антигену у индивидуума, включающий введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену.

[18] Определенные аспекты настоящего изобретения предусматривают способ доставки антигена в безъядерную клетку, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в клетку, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с антигеном. В некоторых вариантах осуществления процессинг и представление указанного антигена в толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления процессинг и представление указанного антигена в толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с предыдущими вариантами осуществления, толерогенное окружение располагается в селезенке, печени или лимфатических узлах.

[19] В некоторых вариантах осуществления сужение находится в микрожидкостном канале. В некоторых вариантах осуществления канал имеет ширину сужения приблизительно от 0,25 мкм приблизительно до 4 мкм. В некоторых вариантах осуществления канал имеет ширину сужения приблизительно 4 мкм, приблизительно 3,5 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 2,5 мкм, приблизительно 2 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм или приблизительно 0,25 мкм. В некоторых вариантах осуществления сужение представляет собой пору или находится в поре. В некоторых вариантах осуществления пора находится в поверхности. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой фильтр. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой мембрану. В некоторых вариантах осуществления размер поры составляет приблизительно от 0,5 мкм приблизительно до 4 мкм. В некоторых вариантах осуществления размер поры составляет 4 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 2 мкм, приблизительно 1 мкм или приблизительно 0,5 мкм. В некоторых вариантах осуществления размер сужения является функцией от диаметра безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления размер сужения составляет приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60% или приблизительно 70% от диаметра клетки. В некоторых вариантах осуществления способ осуществляют между приблизительно -5°C и приблизительно 45°C.

[20] Упоминание о диаметре безъядерной клетки обозначает диаметр клетки в текучем веществе до пропускания через сужение, например, как клетка приближается к сужению, если не указано иное.

[21] В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с предыдущими вариантами осуществления, клеточная суспензия содержит смешанную популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия представляет собой цельную кровь. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия содержит очищенную популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия содержит очищенную популяцию безъядерных клеток. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия содержит клетки млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия содержит клетки обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия содержит клетки человека. В некоторых вариантах осуществления безъядерная клетка представляет собой красную клетку крови. В некоторых вариантах осуществления красная клетка крови представляет собой эритроцит. В некоторых вариантах осуществления красная клетка крови представляет собой ретикулоцит. В некоторых вариантах осуществления безъядерная клетка представляет собой тромбоцит.

[22] В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с предыдущими вариантами осуществления, антиген находится в клеточном лизате. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой чужеродный антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой собственный антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген трансплантированного аллотрансплантата. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой микроорганизм. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой жидкий антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой углеводный антиген (например, сахар). В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой модифицированный антиген. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген содержит антиген, слитый с полипептидом. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген содержит антиген, слитый с терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген содержит антиген, слитый с направленным пептидом. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген содержит антиген, слитый с липидом. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген содержит антиген, слитый с углеводом (например, сахаром). В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген, связанный с трансплантированной тканью. В некоторых вариантах осуществления антиген связан с вирусом. В некоторых вариантах осуществления указанную клеточную суспензию приводят в контакт с антигеном до, параллельно или после пропускания через сужение.

[23] В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с предыдущими вариантами осуществления, толерогенный фактор содержит полипептид. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα или TGFβ. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой фрагмент терапевтического полипептида. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой терапевтический пептид. В некоторых вариантах осуществления полипептид конъюгируют с углеводом (например, сахаром). В некоторых вариантах осуществления указанную клеточную суспензию приводят в контакт с толерогенным фактором до, параллельно или после пропускания через сужение. В некоторых вариантах осуществления снижают время полужизни безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления повышают время полужизни безъядерной клетки.

[24] В вариантах осуществления, где иммунный ответ супрессируют, иммунный ответ супрессируют по меньшей мере приблизительно на 25%, приблизительно на 50%, приблизительно на 75%, приблизительно на 100%, приблизительно на 150%, приблизительно на 200% или приблизительно больше чем на 200%. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженный T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную активацию T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную выживаемость T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную пролиферацию T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную функциональность T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает изменение фенотипа T-клеток. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает не костимулированную активацию T-клеток. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает усиленный ответ Treg. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженный B-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления сниженный B-клеточный ответ включает сниженное продуцирование антител. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженное продуцирование цитокинов. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженный аутоиммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженный аллергический ответ. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на трансплантированную ткань. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженный патогенный иммунный ответ на вирус. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на терапевтический носитель.

[25] В вариантах осуществления, где индуцируют толерантность, толерантность может включать сниженный T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную активацию T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную выживаемость T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную пролиферацию T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную функциональность T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает изменение фенотипа T-клеток. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает не костимулированную активацию T-клеток. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает усиленный ответ Treg. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает сниженный B-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления сниженный B-клеточный ответ содержит сниженное продуцирование антител. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает сниженное продуцирование цитокинов. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает сниженный аутоиммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает сниженный аллергический ответ. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает сниженный иммунный ответ на трансплантированную ткань. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает сниженный патогенный иммунный ответ на вирус. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает сниженный иммунный ответ на терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления толерантность включает сниженный иммунный ответ на терапевтический носитель.

[26] В некоторых вариантах осуществления, где модифицированную безъядерную клетку вводят индивидууму, способ дополнительно включает по меньшей мере одно (например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или больше) дополнительное введение модифицированной безъядерной клетки, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления длительность времени между любыми двумя введениями составляет по меньшей мере 1 сутки, 1 неделю, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев или 1 год.

[27] Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к системе, содержащей сужение, клеточную суспензию и антиген, для использования в любом одном из указанных выше способов. Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к системе, содержащей сужение, клеточную суспензию и толерогенный фактор, для использования в любом одном из указанных выше способов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[28] На фиг. 1A и B представлены образцовые гистограммы проточной цитометрии, изображающие флуоресценцию после опосредованной сужением доставки (SQZ) антитела IgG (фиг. 1A) и частиц декстрана (фиг. 1B) в RBC человека по сравнению с эндоцитозными контролями.

[29] На фиг. 2A представлена эффективность доставки после опосредованной сужением доставки антитела IgG и частиц декстрана в RBC человека. На фиг. 2B представлена оценочная жизнеспособность клеток после опосредованной сужением доставки антитела IgG и частиц декстрана в RBC человека.

[30] На фиг. 3A представлены образцовые гистограммы проточной цитометрии, изображающие флуоресценцию после опосредованной сужением доставки антитела IgG в RBC мыши. На фиг. 3B представлена оценочная жизнеспособность клеток после опосредованной сужением доставки антитела IgG в RBC мыши. На фиг. 3C представлена эффективность доставки после опосредованной сужением доставки антитела IgG в RBC мыши.

[31] На фиг. 4A-I представлены образцовые диаграммы FACS, демонстрирующие доставку частиц декстрана в RBC мыши при 2 фунтах/кв. дюйм (фиг. 4D), 4 фунтах/кв. дюйм (фиг. 4E), 6 фунтах/кв. дюйм (фиг. 4F), 10 фунтах/кв. дюйм (фиг. 4G), 20 фунтах/кв. дюйм (фиг. 4H) или с использованием давления ручного шприца (фиг. 4I) по сравнению с эндоцитозным (фиг. 4A), отрицательным контролем (фиг. 4B) и контролем без материала (фиг. 4C).

[32] На фиг. 5A представлена оценочная жизнеспособность клеток после опосредованной сужением доставки частиц декстрана в RBC мыши. На фиг. 5B представлена эффективность доставки после опосредованной сужением доставки антитела IgG или частиц декстрана в RBC мыши. На фиг. 5C представлено геометрическое среднее флуоресценции после опосредованной сужением доставки антитела IgG или частиц декстрана в RBC мыши.

[33] На фиг. 6A представлены образцовые гистограммы проточной цитометрии, изображающие флуоресценцию после опосредованной сужением доставки частиц декстрана в RBC мыши. На фиг. 6B представлена оценочная жизнеспособность клеток после опосредованной сужением доставки частиц декстрана в RBC мыши. На фиг. 6C представлена эффективность доставки после опосредованной сужением доставки частиц декстрана в RBC мыши. На фиг. 6D представлено геометрическое среднее флуоресценции после опосредованной сужением доставки частиц декстрана в RBC мыши.

[34] На фиг. 7 представлена схема плана обработки.

[35] На фиг. 8 представлено число OT-I-специфических T-клеток у мышей из четырех групп обработки.

[36] На фиг. 9 представлен процент селезеночных T-клеток, которые экспрессировали высокие уровни IFNγ (слева), и уровень продуцирования IFNγ (справа).

[37] На фиг. 10 представлены репрезентативные проточные цитограммы для доли OT-I T-клеток среди всех CD8+ T-клеток (верхние диаграммы) и доли чувствительных к IFNγ T-клеток среди OT-I T-клеток (нижние диаграммы).

[38] На фиг. 11A и 11B представлены схемы репрезентативных планов обработки.

[39] На фиг. 12A и 12B представлены схемы репрезентативных планов обработки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[40] Изобретение относится к способам индуцирования толерантности и/или супрессии иммунного ответа у индивидуума посредством пропускания клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, что делает возможной доставку антигена и/или толерогенного фактора в безъядерную клетку. В некоторых вариантах осуществления сужение находится в микрожидкостном канале. В некоторых вариантах осуществления сужение представляет собой пору или находится в поре.

[41] Определенные аспекты настоящего раскрытия относятся к способам индуцирования толерантности и/или супрессии иммунного ответа на антиген у индивидуума, способы включают пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку; и введение безъядерной клетки индивидууму, где представление указанного антигена в толерогенном окружении индуцирует толерантность и/или супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или подавление иммунитета являются антигенспецифическими. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или подавление иммунитета являются не специфическими, в том числе толерантность и/или супрессия иммунного ответа на множество антигенов.

[42] Определенные аспекты настоящего раскрытия относятся к способам индуцирования толерантности и/или супрессии иммунного ответа на антиген у индивидуума, способы включают пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор, находящиеся в контакте с клеткой, проникают в безъядерную клетку; и введение безъядерной клетки индивидууму, тем самым индуцируя толерантность и/или супрессируя иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления указанный антиген представляют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность и/или супрессирует иммунный ответ на антиген. Например, в некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор действует в толерогенном окружении для дополнительного увеличения толерогенных свойств окружения. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор действует в не толерогенном окружении для того, чтобы создавать толерогенное окружение. В некоторых вариантах осуществления указанный антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или подавление иммунитета являются антигенспецифическими. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или подавление иммунитета являются не специфическими, в том числе толерантность и/или супрессия иммунного ответа на множество антигенов.

[43] Определенные аспекты настоящего раскрытия относятся к способам индуцирования толерантности и/или супрессии иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающим пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку; и введение безъядерной клетки индивидууму, тем самым индуцируя толерантность и/или супрессируя иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность и/или супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или подавление иммунитета являются антигенспецифическими. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или подавление иммунитета являются не специфическими, в том числе толерантность и/или супрессия иммунного ответа на множество антигенов.

I. ОБЩИЕ СПОСОБЫ

[44] Способы и процедуры, которые описаны или упомянуты здесь, в целом хорошо известны специалистам в данной области и обычно используются с такими стандартными способами, как, например, широко используемые способы, описанные в Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. ред., 2003); серии Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames и G.R. Taylor ред., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow и Lane ред., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6-е изд., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ред., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ред., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather и P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths и D.G. Newell ред., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir и C.C. Blackwell ред., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller и M.P. Calos ред., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al. ред., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al. ред., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. ред., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty. ред., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd и C. Dean ред., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow и D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti и J. D. Capra ред., Harwood Academic Publishers, 1995); и Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al. ред., J.B. Lippincott Company, 2011).

II. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[45] Для целей интерпретации этого описания применяют следующие определения, и всякий раз, когда уместно, термины, используемые в единственном числе, также включают множественное число, и наоборот. В том случае, если любое определение, изложенное далее, противоречит любому документу, включенному в настоящее описание посредством ссылки, изложенное определение имеет решающее значение.

[46] Как используют в настоящем описании, форма единственного числа включает множественное число, если не указано иное.

[47] Понятно, что аспекты и варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем описании, включают «содержит», «состоит» и «состоит по существу из» аспекты и варианты осуществления.

[48] Термин «приблизительно», как используют в настоящем описании, относится к обычному диапазону ошибки для соответствующего значения, явно известного специалисту в этой области техники. Упоминание о «приблизительном» значении или параметре в настоящем описании включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся к этому значению или параметру per se.

[49] Термин «пора», как используют в настоящем описании, относится к отверстию, в том числе без ограничения, дыре, разрыву, полости, апертуре, пролому, пропуску или перфорации в материале. В некоторых примерах (где указано) термин относится к поре в поверхности по настоящему раскрытию. В других примерах (где указано) пора может относиться к поре в клеточной мембране.

[50] Термин «мембрана», как используют в настоящем описании, относится к избирательному барьеру или листу, содержащему поры. Термин включает гибкую листовидную структуру, которая выполняет функцию границы или подкладки. В некоторых примерах термин относится к поверхности или фильтру, содержащим поры. Этот термин отличается от термина «клеточная мембрана».

[51] Термин «фильтр», как используют в настоящем описании, относится к пористому изделию, которое допускает избирательное пропускание через поры. В некоторых примерах термин относится к поверхности или мембране, содержащей поры.

[52] Термин «гетерогенный», как используют в настоящем описании, относится к чему-то, что смешивают или что является однородным по структуре или композиции. В некоторых примерах термин относится к порам, имеющим различные размеры, геометрические формы или распределения в заданной поверхности.

[53] Термин «гомогенный», как используют в настоящем описании, относится к чему-то, что является согласованным или однородным по структуре или композиции на всем протяжении. В некоторых примерах термин относится к порам, имеющим согласованные размеры, геометрические формы или распределение в заданной поверхности.

[54] Термин «гетерологичный», как используют в настоящем описании, относится к молекуле, которую извлекают из другого организма. В некоторых примерах термин относится к нуклеиновой кислоте или белку, которые обычно не встречаются или не экспрессированы в заданном организме.

[55] Как используют в настоящем описании, термин «ингибировать» может относиться к действию по блокированию, снижению, устранению или иному антагонистическому воздействию на присутствие или активность конкретной мишени. Ингибирование может относиться к частичному ингибированию или полному ингибированию. Например, ингибирование иммунного ответа может относиться к любому действию, ведущему к блокированию, снижению, устранению или любому другому антагонизму в отношении иммунного ответа. В других примерах, ингибирование экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, но не ограничиваясь этим, снижение транскрипции нуклеиновой кислоты, снижение относительного содержания мРНК (например, сайленсинг транскрипции мРНК), разрушение мРНК, ингибирование трансляции мРНК, редактирование генов и так далее. В других примерах ингибирование экспрессии белка может включать, но без ограничения этим, снижение транскрипции нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, снижение стабильности мРНК, кодирующей белок, ингибирование трансляции белка, снижение стабильности белка и так далее.

[56] Как используют в настоящем описании, термин «супрессировать» может относиться к действию по снижению, понижению, запрещению, ограничению, уменьшению или иному сокращению присутствия или активности конкретной мишени. Супрессия может относиться к частичной супрессии или полной супрессии. Например, супрессия иммунного ответа может относиться к любому действию, ведущему к снижению, понижению, запрещению, ограничению, уменьшению или иному сокращению иммунного ответа. В других примерах, супрессия экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, но не ограничиваясь этим, снижение транскрипции нуклеиновой кислоты, снижение относительного содержания мРНК (например, сайленсинг транскрипции мРНК), разрушение мРНК, ингибирование трансляции мРНК и так далее. В других примерах, супрессия экспрессии белка может включать, но без ограничения этим, снижение транскрипции нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, снижение стабильности мРНК, кодирующей белок, ингибирование трансляции белка, снижение стабильности белка и так далее.

[57] Как используют в настоящем описании, термин «усиливать» может относиться к действию усовершенствования, ускорения, повышения или иного увеличения присутствия или активности конкретной мишени. Например, усиление иммунного ответа может относиться к любому действию, ведущему к усовершенствованию, ускорению, повышению или иному увеличению иммунного ответа. В других примерах усиление экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, но не ограничиваясь этим, увеличение транскрипции нуклеиновой кислоты, увеличение относительного содержания мРНК (например, увеличение транскрипции мРНК), снижение разрушения мРНК, увеличение трансляции мРНК и так далее. В других примерах, усиление экспрессии белка может включать, но без ограничения этим, увеличение транскрипции нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, увеличение стабильности мРНК, кодирующей белок, увеличение трансляции белка, увеличение стабильности белка и так далее.

[58] Как используют в настоящем описании, термин «индуцировать» может относиться к действию инициации, побуждения, стимуляции, установления или иным образом получения результата. Например, индукция иммунного ответа может относиться к любому действию, ведущему к инициации, побуждению, стимуляции, установлению или иным образом получению желаемого иммунного ответа. В других примерах, индукция экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, но не ограничиваясь этим, инициацию транскрипции нуклеиновой кислоты, инициацию трансляции мРНК и так далее. В других примерах, индукция экспрессии белка может включать, но без ограничения этим, увеличение транскрипции нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, увеличение стабильности мРНК, кодирующей белок, увеличение трансляции белка, увеличение стабильности белка и так далее.

[59] Термин «гомологичный», как используют в настоящем описании, относится к молекуле, которую извлекают из того же организма. В некоторых примерах термин относится к нуклеиновой кислоте или белку, которые обычно находятся или экспрессированы в заданном организме.

[60] Термин «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», как используют в настоящем описании, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, в том числе рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, этот термин включает, но не ограничиваясь этим, одно-, двух- или многоцепочечную ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, не природные или дериватизированные нуклеотидные основания. Остов полинуклеотида может содержать сахара и фосфатные группы (как обычно можно найти в РНК или ДНК) или модифицированный или замещенный сахар или фосфатные группы. Остов полинуклеотида может содержать повторяющиеся звенья, такие как N-(2-аминоэтил)-глицин, связанные пептидными связями (т. е. пептидо-нуклеиновая кислота). Альтернативно, остов полинуклеотида может содержать полимер синтетических субъединиц, таких как фосфорамидаты, и, таким образом, может представлять собой олигодезоксинуклеозидный фосфорамидат (P-NH₂) или смешанный фосфорамидатно-фосфодиэфирный олигомер. Кроме того, двухцепочечный полинуклеотид можно получать из одноцепочечного полинуклеотидного продукта химического синтеза или посредством синтеза комплементарной цепи и ренатурирования цепей при подходящих условиях или посредством синтеза комплементарной цепи de novo с использованием ДНК полимеразы и подходящего праймера.

[61] Термины «полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо, чтобы отослать к полимеру аминокислотных остатков, и они не ограничены минимальной длиной. Такие полимеры аминокислотных остатков могут содержать природные или не природные аминокислотные остатки, и включают, но не ограничиваясь этим, пептиды, олигопептиды, димеры, тримеры и мультимеры аминокислотных остатков. И полноразмерные белки, и их фрагменты охвачены определением. Термины также включают постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, сиалирование, ацетилирование, фосфорилирование и т. п. Кроме того, для целей настоящего изобретения, «полипептид» относится к белку, который включает модификации, такие как делеции, добавления и замены (в целом консервативные по природе), в нативной последовательности до тех пор, пока белок сохраняет желаемую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, как при сайт-специфическом мутагенезе, или могут быть случайными, такими как при мутациях у хозяев, которые продуцируют белки, или ошибках из-за ПЦР амплификации.

[62] Для любых структурных и функциональных характеристик, описанных в настоящем описании, в данной области известны способы определения этих характеристик.

III. ПОДАВЛЕНИЕ ИММУНИТЕТА И ТОЛЕРАНТНОСТЬ

[63] В определенных аспектах, изобретение относится к способам супрессии иммунного ответа и/или индуцирования толерантности у индивидуума, включающим пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и/или толерогенное соединение проникает в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

[64] Иммунологическая толерантность представляет собой иммунологическую невосприимчивость к стимуляции антигеном, к которому индуцирована толерантность. Толерантность демонстрируют, когда субъект не восприимчив к последующему стимулу индуцирующим толерантность антигеном. Толерантность могут опосредовать несколько различных механизмов, которые включают апоптоз аутореактивных клеток, индуцирование анергии или отклонение фенотипа лимфоцита. В некоторых вариантах осуществления толерантность может включать невосприимчивость T-клеток, вызывающую деактивацию иммунного ответа на специфический антиген. Толерантность также могут опосредовать регуляторные T-клетки (Treg) через секрецию иммуносупрессорных цитокинов и через контакт-зависимые взаимодействия с молекулами клеточной поверхности или цитотоксическими факторами. Дефекты в толерогенных механизмах могут вносить вклад в аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата, ответы против лекарственных средств и патогенные ответы на вирусную инфекцию. Иммуносупрессия представляет собой снижение активности иммунного ответа. Например, иммуносупрессия может включать, без ограничения, сниженную восприимчивость к стимуляции антигеном, сниженную активацию и пролиферацию клеток иммунной системы, модулированную секрецию цитокинов, сниженную выживаемость клеток иммунной системы или сниженные эффекторные функции клеток иммунной системы. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессия является специфической для заданного антигена. Например, супрессируют иммунный ответ на собственный антиген.

[65] В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют и представляют в толерогенном окружении. Толерогенное окружение может представлять собой местоположение в организме, которое поддерживает формирование толерогенного иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления толерогенное окружение находится в первичной лимфоидной ткани, такой как тимус. В некоторых вариантах осуществления толерогенное окружение находится во вторичной лимфоидной ткани. Образцовые вторичные лимфоидные ткани включают селезенку, лимфатические узлы и лимфоидную ткань слизистых оболочек (MALT). В некоторых вариантах осуществления толерогенное окружение находится в селезенке. В некоторых вариантах осуществления толерогенное окружение находится в не лимфоидной ткани, такой как печень. В некоторых вариантах осуществления толерогенное окружение индуцируют в месте воспаления посредством доставки толерогенного фактора. Например, воспалительное окружение превращают в толерогенное окружение с помощью толерогенного фактора.

[66] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам доставки в безъядерную клетку, где клетка представляет собой клетку млекопитающего. Безъядерные клетки не содержат ядро. В некоторых вариантах осуществления безъядерная клетка представляет собой клетку обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика. В некоторых вариантах осуществления безъядерная клетка представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах осуществления безъядерная клетка представляет собой клетку не млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления безъядерная клетка представляет собой клетку курицы, лягушки, насекомого, рыбы или нематоды. В некоторых вариантах осуществления безъядерная клетка представляет собой красную клетку крови. Красные клетки крови (RBC) представляют собой гибкие овальные двояковогнутые диски с цитоплазмой, богатой биологической молекулой переносчика кислорода гемоглобина. RBC служат в качестве основного средства доставки кислорода и устранения диоксида углерода на всем протяжении организма человека. RBC могут оставаться в циркуляции вплоть до 120 суток, после чего они удаляются из организма через клиренс в селезенке. Ретикулоциты представляют собой безъядерные незрелые (еще не двояковогнутые) красные клетки крови, которые обычно составляют приблизительно 1% красных клеток крови в организме человека. Зрелые красные клетки крови также обозначают как эритроциты. В некоторых вариантах осуществления безъядерная клетка представляет собой тромбоцит. Тромбоциты, также называемые кровяными пластинками, представляют собой компонент крови, функция которого состоит в свертывании крови. Тромбоциты представляют собой двояковыпуклые дискообразные (чечевицеобразные) структуры 2-3 мкм в диаметре.

[67] В некоторых вариантах осуществления представление антигена в толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген или индуцирует толерогенный ответ на антиген. Антигены, получаемые из апоптозных клеток, таких как RBC, которые регулярно удаляются в толерогенном окружении селезенки, могут управлять толерантностью и/или супрессировать иммунный ответ на антигены через удаление (например, уничтожение) или анергию реактивных T-клеток. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или подавление иммунитета являются антигенспецифическими. RBC имеют ограниченный срок жизни и не способны к самовосстановлению, что ведет к гибели RBC посредством эриптоза, процесса, схожего с апоптозом, и впоследствии к удалению из кровотока. В некоторых вариантах осуществления высвобождение антигена может происходить при апоптозе безъядерной клетки в толерогенном окружении, где его впоследствии поглощает, процессирует и представляет антигенпредставляющая клетка. В некоторых вариантах осуществления безъядерную клетку, содержащую антиген, фагоцитирует антигенпредставляющая клетка, такая как макрофаг, и впоследствии происходит процессинг и представление антигена антигенпредставляющей клеткой.

[68] В некоторых вариантах осуществления можно модифицировать время полужизни безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления повышают время полужизни безъядерной клетки. Например, безъядерную можно модифицировать для того, чтобы увеличивать время, которое безъядерная клетка циркулирует в кровотоке перед клиренсом в селезенке. В некоторых вариантах осуществления снижают время полужизни безъядерной клетки. Например, безъядерную клетку можно модифицировать для того, чтобы снижать время, которое безъядерная клетка циркулирует в кровотоке перед клиренсом в селезенке. В некоторых вариантах осуществления измененное соотношение липидов на поверхности безъядерной клетки уменьшает время полужизни безъядерной клетки. Например, присутствие фосфатидилсерина на поверхности безъядерной клетки можно увеличивать для того, чтобы снижать время полужизни безъядерной клетки, например, используя любой известный в данной области способ увеличения поверхностного фосфатидилсерина (см. Hamidi et al., J. Control. Release, 2007, 118(2): 145-60). Экспонирование фосфатидилсерина на внешней клеточной мембране является признаком апоптоза, и его распознают рецепторы на фагоцитах таким образом, который способствует поглощению. В некоторых вариантах осуществления безъядерную клетку инкубируют с липидами прежде, чем доставлять индивидууму. В некоторых вариантах осуществления безъядерную клетку связывают с полимером для того, чтобы снижать время полужизни безъядерной клетки.

[69] В определенных аспектах изобретение относится к способам супрессии иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающим пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, где представление указанного антигена в толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ является антигенспецифическим.

[70] В определенных аспектах изобретение относится к способам супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающим пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, тем самым супрессируя иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления подавление иммунитета является неспецифическим, в том числе супрессия иммунного ответа на множество антигенов.

[71] В определенных аспектах, изобретение относится к способам супрессии иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающим пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникают в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, тем самым супрессируя иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления подавление иммунитета является антигенспецифическим. В некоторых вариантах осуществления подавление иммунитета является неспецифическим, в том числе супрессия иммунного ответа на множество антигенов.

[72] В определенных аспектах, настоящее изобретение предусматривает способы супрессии иммунного ответа на антиген у индивидуума, которые включают пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку, пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку, и введение первой безъядерной клетки и второй безъядерной клетки индивидууму, тем самым супрессируя иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления первую безъядерную клетку и вторую безъядерную клетку вводят одновременно. В некоторых вариантах осуществления первую безъядерную клетку и вторую безъядерную клетку вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления первую безъядерную клетку вводят индивидууму перед введением второй безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления первую безъядерную клетку вводят индивидууму за больше любого из приблизительно 1 минуты, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 5 часов, 6 часов, 12 часов или 24 часов перед введением второй безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления вторую безъядерную клетку вводят индивидууму перед введением первой безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления вторую безъядерную клетку вводят индивидууму за больше любого из приблизительно 1 минуты, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 5 часов, 6 часов, 12 часов или 24 часов перед введением первой безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления подавление иммунитета является антигенспецифическим. В некоторых вариантах осуществления подавление иммунитета является неспецифическим, в том числе супрессия иммунного ответа на множество антигенов.

[73] В определенных аспектах, изобретение относится к способу индуцирования толерантности к антигену у индивидуума, включающему пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, где представление указанного антигена в толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерантность является антигенспецифической.

[74] В определенных аспектах, изобретение относится к способам индуцирования толерантности к антигену у индивидуума, включающим пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, тем самым индуцируя толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, и представление антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерантность является неспецифической, в том числе толерантность ко множеству антигенов.

[75] В определенных аспектах, изобретение относится к способу индуцирования толерантности к антигену у индивидуума, включающему пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникают в безъядерную клетку, и введение безъядерной клетки индивидууму, тем самым индуцируя толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген представляют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерантность является антигенспецифической. В некоторых вариантах осуществления толерантность является неспецифической, в том числе толерантность ко множеству антигенов.

[76] В определенных аспектах, изобретение относится к способам индуцирования толерантности к антигену у индивидуума, которые включают пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку, пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку, и введение первой безъядерной клетки и второй безъядерной клетки индивидууму, тем самым индуцируя толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген представляют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления первую безъядерную клетку и вторую безъядерную клетку вводят одновременно. В некоторых вариантах осуществления первую безъядерную клетку и вторую безъядерную клетку вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления первую безъядерную клетку вводят индивидууму перед введением второй безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления первую безъядерную клетку вводят индивидууму за больше любого из приблизительно 1 минуты, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 5 часов, 6 часов, 12 часов или 24 часов перед введением второй безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления вторую безъядерную клетку вводят индивидууму перед введением первой безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления вторую безъядерную клетку вводят индивидууму за больше любого из приблизительно 1 минуты, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 5 часов, 6 часов, 12 часов или 24 часов перед введением первой безъядерной клетки. В некоторых вариантах осуществления толерантность является антигенспецифической. В некоторых вариантах осуществления толерантность является неспецифической, в том числе толерантность ко множеству антигенов.

[77] В определенных аспектах, изобретение относится к способам индуцирования толерантности к антигену у индивидуума, включающим введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку, где представление указанного антигена в толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерантность является антигенспецифической.

[78] В определенных аспектах, изобретение относится к способам супрессии иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающим введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку, где представление указанного антигена в толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления подавление иммунитета является антигенспецифическим.

[79] В определенных аспектах, изобретение относится к способам индуцирования толерантности к антигену у индивидуума, включающим введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит толерогенный фактор, где толерогенный фактор вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникал в безъядерную клетку, тем самым индуцируя толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерантность является неспецифической, в том числе толерантность ко множеству антигенов.

[80] В определенных аспектах, изобретение относится к способам супрессии иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающим введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит толерогенный фактор, где толерогенный фактор вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникал в безъядерную клетку, тем самым супрессируя иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления подавление иммунитета является неспецифическим, в том числе супрессия иммунного ответа на множество антигенов.

[81] В определенных аспектах, изобретение относится к способам индуцирования толерантности к антигену у индивидуума, включающим введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген и толерогенный фактор, где антиген и толерогенный фактор вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникали в безъядерную клетку, где представление указанного антигена индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления толерантность является антигенспецифической. В некоторых вариантах осуществления толерантность является неспецифической, в том числе толерантность ко множеству антигенов.

[82] В определенных аспектах, изобретение относится к способам супрессии иммунного ответа на антиген у индивидуума, включающим введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген и толерогенный фактор, где антиген и толерогенный фактор вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникали в безъядерную клетку, где представление указанного антигена супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор создает толерогенное окружение или способствует ему, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления подавление иммунитета является антигенспецифическим. В некоторых вариантах осуществления подавление иммунитета является неспецифическим, в том числе супрессия иммунного ответа на множество антигенов.

[83] В определенных аспектах, изобретение относится к способам введения антигена в толерогенное окружение у индивидуума, которые включают доставку безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, и где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку. В некоторых вариантах осуществления антиген представляют в толерогенном окружении. В некоторых вариантах осуществления антиген процессируют в толерогенном окружении.

[84] В определенных аспектах, изобретение относится к способам генерации толерогенного окружения у индивидуума, которые включают доставку безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит толерогенный фактор, где толерогенный фактор вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникал в безъядерную клетку. В некоторых вариантах осуществления представление антигена в толерогенном окружении индуцирует толерантность и/или супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления толерантность и/или подавление иммунитета являются не специфическими, в том числе толерантность и/или супрессия иммунного ответа на множество антигенов.

[85] В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ супрессируют на по меньшей мере любое из приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 100%. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает сниженный T-клеточный ответ. Например, сниженный T-клеточный ответ может включать, без ограничения, сниженную активацию или пролиферацию T-клеток, сниженную выживаемость T-клеток или сниженную функциональность клетки. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную активацию T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную выживаемость T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную пролиферацию T-клеток. В некоторых вариантах осуществления сниженный T-клеточный ответ включает сниженную функциональность T-клеток. Например, сниженная функциональность T-клеток может включать, без ограничения, модулированную секрецию цитокинов, сниженную миграцию T-клеток в места воспаления и сниженную цитотоксическую активность T-клеток. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает сниженное продуцирование и/или секрецию воспалительных цитокинов, и/или увеличенное продуцирование и/или секрецию противовоспалительных цитокинов. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает сниженное продуцирование и/или секрецию одного или нескольких воспалительных цитокинов, выбранных из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона γ (IFNγ) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает сниженное продуцирование и/или секрецию одного или нескольких противовоспалительных цитокинов, выбранных из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα и трансформирующего фактора роста β (TGFβ). В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает изменение фенотипа T-клеток. Например, состояние T-клетки может меняться от провоспалительного фенотипа к регуляторному или противовоспалительному фенотипу. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает не костимулированную активацию T-клеток, которая впоследствии может вести к гибели клеток. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает усиленный ответ Treg. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает сниженный B-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления сниженный B-клеточный ответ включает сниженное продуцирование антител.

[86] В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает сниженный аутоиммунный ответ. Например, сниженный аутоиммунный ответ может включать, без ограничения, сниженный иммунный ответ или индуцированную толерантность к антигену, связанному с диабетом I типа, ревматоидным артритом, псориазом, рассеянным склерозом, нейродегенеративными заболеваниями, которые могут иметь иммунный компонент, такими как Болезнь Альцгеймера, ALS, хорея Гентингтона и болезнь Паркинсона, системная красная волчанка, болезнь Шегрена, болезнь Крона или язвенный колит. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает сниженный аллергический ответ. Например, сниженный аллергический ответ может включать сниженный иммунный ответ или индуцированную толерантность к антигенам, связанным с аллергической астмой, атопическим дерматитом, аллергическим ринитом (сенная лихорадка) или пищевой аллергией. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген, связанный с трансплантированной тканью. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает сниженный иммунный ответ или индуцированную толерантность к трансплантированной ткани. В некоторых вариантах осуществления антиген связан с вирусом. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает сниженный патогенный иммунный ответ или индуцированную толерантность к вирусу. Например, патогенный иммунный ответ может включать цитокиновую бурю, вызванную определенными вирусными инфекциями. Цитокиновая буря представляет собой потенциально смертельную иммунную реакцию, состоящую из контура положительной обратной связи между цитокинами и белыми клетками крови.

[87] В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой фактор свертывания. Образцовые факторы свертывания включают, без ограничения, фактор VIII и фактор IX. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой антитело. Образцовые терапевтические антитела включают, без ограничения, средства против TNFα, против VEGF, против CD3, против CD20, против IL-2R, против Her2, против RSVF, против CEA, против IL-1β, против CD15, против миозина, против PSMA, против гликопротеина 40 кДа, против CD33, против CD52, против IgE, против CD11a, против EGFR, против C5, против α-4 интегрина, против IL-12/IL-23, против IL-6R и против RANKL. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой фактор роста. Образцовые терапевтические факторы роста включают, без ограничения, эритропоэтин (EPO) и фактор дифференцировки и роста мегакариоцитов (MDGF). В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой гормон. Образцовые терапевтические гормоны включают, без ограничения, инсулин, гормон роста человека и фолликулостимулирующий гормон. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой рекомбинантный цитокин. Образцовые терапевтические рекомбинантные цитокины включают, без ограничения, IFNβ, IFNα и GM-CSF. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на терапевтический носитель. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим носителем является вирус, такой как аденовирус, аденоассоциированный вирус, бакуловирус, вирус герпеса или ретровирус, которые используют для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим носителем является липосома. В некоторых вариантах осуществления терапевтическим носителем является наночастица.

IV. МИКРОЖИДКОСТНЫЕ КАНАЛЫ ДЛЯ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ ДЕФОРМИРУЮЩИХ КЛЕТКИ СУЖЕНИЙ

[88] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам супрессии иммунного ответа или индуцирования толерантности посредством пропускания клеточной суспензии через сужение, где сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген или соединение проникает в клетку, где сужение находится в микрожидкостном канале. В некоторых вариантах осуществления несколько сужений можно помещать параллельно и/или последовательно в микрожидкостный канал. Образцовые микрожидкостные каналы, содержащие деформирующие клетки сужения для использования в способах, раскрытых в настоящем описании, описаны в WO2013059343. Образцовые поверхности, имеющие поры для использования в способах, раскрытых в настоящем описании, описаны в предварительной заявке США 62/214,820, поданной 09/04/2015.

[89] В некоторых вариантах осуществления микрожидкостный канал содержит просвет и выполнен с такой возможностью, что клетка, суспендированная в буфере, может проходить насквозь, где микрожидкостный канал содержит сужение. Микрожидкостный канал можно выполнять из любого одного из множества материалов, в том числе кремния, металла (например, нержавеющей стали), пластмассы (например, полистирола, PET, PETG), керамики, стекла, кристаллических подложек, аморфных подложек или полимеров (например, полиметилметакрилата (PMMA), PDMS, сополимера циклического олефина (COC) и т. д.). Изготовление микрожидкостного канала можно осуществлять любым известным в данной области способом, в том числе сухим травлением, влажным травлением, фотолитографией, литьем под давлением, лазерной абляцией или с использованием масок SU-8.

[90] В некоторых вариантах осуществления сужение в микрожидкостном канале содержит входную часть, центральную точку и выходную часть. В некоторых вариантах осуществления длина, глубина и ширина сужения в микрожидкостном канале могут варьировать. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения в микрожидкостном канале представляет собой функцию от диаметра клетки или кластера клеток. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения в микрожидкостном канале составляет приблизительно от 10% приблизительно до 99% от диаметра клетки. В некоторых вариантах осуществления размер сужения составляет приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от диаметра клетки. В некоторых вариантах осуществления размер сужения составляет приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от длины минимального сечения клетки (например, безъядерной клетки, такой как RBC). В некоторых вариантах осуществления канал имеет ширину сужения приблизительно от 0,25 мкм приблизительно до 4 мкм. В некоторых вариантах осуществления канал имеет ширину сужения приблизительно 4 мкм, приблизительно 3,5 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 2,5 мкм, приблизительно 2 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм или приблизительно 0,25 мкм (включая любые диапазоны между этими значениями). Сечение канала, входная часть, центральная точка и выходная часть также могут варьировать. Например, сечения могут быть круглыми, эллиптическими, в виде удлиненной щели, квадратными, гексагональными или треугольными по форме. Входная часть определяет угол сужения, где угол сужения оптимизируют для того, чтобы снижать засорение канала и оптимизировать увеличенную доставку соединения в клетку. угол выходной части также может варьировать. Например, угол выходной части выполнен с возможностью снижать вероятность турбулентности, которая может вести к неламинарному потоку. В некоторых вариантах осуществления стенки входной части и/или выходной части являются линейными. В других вариантах осуществления стенки входной части и/или выходной части являются криволинейными.

V. ПОВЕРХНОСТЬ, ИМЕЮЩАЯ ПОРЫ ДЛЯ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ ДЕФОРМИРУЮЩИХ КЛЕТКИ СУЖЕНИЙ

[91] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам супрессии иммунного ответа или индуцирования толерантности посредством пропускания клеточной суспензии через сужение, где сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антигенное соединение проникает в клетку, где сужение представляет собой пору или содержится в поре. В некоторых вариантах осуществления пора находится в поверхности. Образцовые поверхности, имеющие поры для использования в способах, раскрытых в настоящем описании, описаны в предварительной заявке США 62/214,820, поданной 09/04/2015.

[92] Поверхности, как раскрыто в настоящем описании, можно выполнять из любого одного из множества материалов и придавать им любую одну из множества форм. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой фильтр. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой мембрану. В некоторых вариантах осуществления фильтр представляет собой тангенциальный поточный фильтр. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой губку или губчатую матрицу. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой матрицу.

[93] В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет собой поверхность с извилистым контуром. В некоторых вариантах осуществления поверхность с извилистым контуром содержит ацетат целлюлозы. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит материал, выбранный из, без ограничения, синтетических или природных полимеров, поликарбоната, кремния, стекла, металла, сплава, нитрата целлюлозы, серебра, ацетата целлюлозы, нейлона, полиэстера, полиэфирсульфона, полиакрилонитрила (PAN), полипропилена, PVDF, политетрафторэтилена, смешанного сложного эфира целлюлозы, фарфора и керамики.

[94] Поверхность, раскрытая в настоящем описании, может иметь любую геометрическую форму, известную в данной области; например, трехмерную форму. Двухмерная форма поверхности может быть, без ограничения, круглой, эллиптической, круговой, квадратной, звездообразной, треугольной, многоугольной, пятиугольной, гексагональной, гептагональной или октагональной. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет круглую форму. В некоторых вариантах осуществления трехмерная форма поверхности является цилиндрической, конической или кубоидальной.

[95] Поверхность может иметь различные ширины сечения и толщины. В некоторых вариантах осуществления ширина сечения поверхности составляет между приблизительно 1 мм и приблизительно 1 м или любую ширину сечения или диапазон ширин сечения между ними. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет определенную толщину. В некоторых вариантах осуществления толщина поверхности однородна. В некоторых вариантах осуществления толщина поверхности переменна. Например, в некоторых вариантах осуществления часть поверхности толще или тоньше, чем другие части поверхности. В некоторых вариантах осуществления толщина поверхности варьирует на приблизительно от 1% приблизительно до 90% или любую процентную долю или диапазон процентных долей между ними. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет толщину между приблизительно 0,01 мкм и приблизительно 5 мм в или любую толщину или диапазон толщин между ними.

[96] В некоторых вариантах осуществления сужение представляет собой пору или находится в поре. Ширина сечения пор связана с типом клетки, подлежащей обработки. В некоторых вариантах осуществления размер поры является функцией от диаметра клетки кластера клеток, подлежащих обработке. В некоторых вариантах осуществления размер поры является таким, что происходит возмущение клетки при пропускании через пору. В некоторых вариантах осуществления размер поры составляет меньше диаметра клетки. В некоторых вариантах осуществления размер поры составляет приблизительно от 10% приблизительно до 99% от диаметра клетки. В некоторых вариантах осуществления размер поры составляет приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от диаметра клетки. Оптимальный размер поры или ширина сечения поры может варьировать в зависимости от применения и/или типа клеток. В некоторых вариантах осуществления размер поры составляет приблизительно от 0,1 мкм приблизительно до 4 мкм. В некоторых вариантах осуществления размер поры составляет приблизительно 4 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 2 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 0,25 мкм или приблизительно 0,1 мкм. В некоторых вариантах осуществления ширина сечения поры равна или меньше любого из приблизительно 4 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 2 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 0,25 мкм или приблизительно 0,1 мкм. Входы и выходы прохода поры могут иметь различные углы. Угол поры можно выбирать для того, чтобы минимизировать засорение поры, пока клетки проходят насквозь. В некоторых вариантах осуществления скорость потока через поверхность составляет между приблизительно 0,001 мл/см²/с приблизительно до 100 л/см²/с или любую скорость или диапазон скоростей между ними. Например, угол входной или выходной части может составлять между приблизительно 0 и приблизительно 90°. В некоторых вариантах осуществления входная или выходная часть может составлять больше 90°. В некоторых вариантах осуществления поры имеют идентичные входные и выходные углы. В некоторых вариантах осуществления поры имеют различные входные и выходные углы. В некоторых вариантах осуществления край поры является гладким, например, скругленным или криволинейным. Гладкий край поры имеет непрерывную, плоскую и ровную поверхность без бугорков, неровностей или шероховатых частей. В некоторых вариантах осуществления край поры является острым. Острый край поры имеет тонкий край, который заострен или находится под острым углом. В некоторых вариантах осуществления проход поры является прямым. Прямой проход поры не содержит кривых, изгибов, углов или других неправильных частей. В некоторых вариантах осуществления проход поры является криволинейным. Криволинейный проход поры изогнут или отклоняется от прямой линии. В некоторых вариантах осуществления проход поры имеет несколько кривых, например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше кривых.

[97] Поры могут иметь любую геометрическую форму, известную в данной области, в том числе двухмерную или трехмерную форму. Геометрическая форма поры (например, форма поперечного сечения) может быть, без ограничения, круглой, эллиптической, округлой, квадратной, звездообразной, треугольной, многоугольной, пятиугольной, гексагональной, гептагональной и октагональной. В некоторых вариантах осуществления сечение поры имеете круглую форму. В некоторых вариантах осуществления трехмерная форма поры является цилиндрической или конической. В некоторых вариантах осуществления пора имеет гофрированную форму входа и выхода. В некоторых вариантах осуществления геометрическая форма поры является гомогенной (т. е. согласованной или правильной) среди пор в заданной поверхности. В некоторых вариантах осуществления геометрическая форма поры является гетерогенной (т. е. вперемешку или варьирующей) среди пор в заданной поверхности.

[98] Поверхности, описанные в настоящем описании, могут иметь диапазон общего числа пор. В некоторых вариантах осуществления поры охватывают приблизительно от 10% приблизительно до 80% общей площади поверхности. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит всего приблизительно от 1,0×10⁵ приблизительно до 1,0×10³⁰ пор или любое число или диапазон чисел между ними. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит между приблизительно 10 и приблизительно 1,0×10¹⁵ пор на мм² площади поверхности.

[99] Поры можно распределять по заданной поверхности многими путями. В некоторых вариантах осуществления поры распределяют параллельно в заданной поверхности. В одном таком примере поры распределяют бок о бок в одном направлении и на одном расстоянии друг от друга в заданной поверхности. В некоторых вариантах осуществления распределение пор является упорядоченным или гомогенным. В одном таком примере поры распределяют по правильному, систематическому паттерну или на одном расстоянии друг от друга в заданной поверхности. В некоторых вариантах осуществления распределение пор является случайным или гетерогенным. В одном таком примере поры распределяют по неправильному неупорядоченному паттерну или на различных расстояниях друг от друга в заданной поверхности. В некоторых вариантах осуществления несколько поверхностей распределяют последовательно. Несколько поверхностей могут быть гомогенным или гетерогенными в отношении размера, геометрической формы и/или грубости поверхности. Несколько поверхностей дополнительно могут содержать поры с гомогенными или гетерогенными размерами, геометрическими формами и/или числом пор, тем самым делая возможной одновременную доставку спектра соединений в клетки различных типов.

[100] В некоторых вариантах осуществления индивидуальная пора имеет однородное измерение по ширине(т. е. постоянную ширину вдоль длины прохода поры). В некоторых вариантах осуществления индивидуальная пора имеет переменную ширину (т. е. увеличивающуюся или уменьшающуюся ширину вдоль длины прохода поры). В некоторых вариантах осуществления поры в заданной поверхности имеют одинаковые глубины индивидуальных пор. В некоторых вариантах осуществления поры в заданной поверхности имеют различные глубины индивидуальных пор. В некоторых вариантах осуществления поры находятся непосредственно смежно друг с другом. В некоторых вариантах осуществления поры отделяют друг от друга определенным расстоянием. В некоторых вариантах осуществления поры отделяют друг от друга расстоянием приблизительно от 0,001 мкм приблизительно до 30 мм или любым расстоянием или диапазоном расстояний между ними.

[101] В некоторых вариантах осуществления поверхность покрывают материалом. Материал можно выбирать из любого материала, известного в данной области, в том числе, без ограничения, тефлона, адгезивного покрытия, поверхностно-активных средств, белков, адгезивных молекул, антител, антикоагулянтов, факторов, которые модулируют клеточную функцию, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов или трансмембранных белков. В некоторых вариантах осуществления поверхность покрывают поливинилпирролидоном. В некоторых вариантах осуществления материал ковалентно прикрепляют к поверхности. В некоторых вариантах осуществления материал нековалентно прикрепляют к поверхности. В некоторых вариантах осуществления происходит высвобождение молекул поверхности при пропускании клеток через поры.

[102] В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет модифицированные химические свойства. В некоторых вариантах осуществления поверхность является гидрофильной. В некоторых вариантах осуществления поверхность является гидрофобной. В некоторых вариантах осуществления поверхность является заряженной. В некоторых вариантах осуществления поверхность является положительно и/или отрицательно заряженной. В некоторых вариантах осуществления поверхность может быть положительно заряженной в некоторых областях и отрицательно заряженной в других областях. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет общий положительный или общий отрицательный заряд. В некоторых вариантах осуществления поверхность может представлять собой любое одно из гладкой, электрополированной, грубой или обработанной плазмой. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит цвиттер-ионное или диполярное соединение. В некоторых вариантах осуществления поверхность является обработанной плазмой.

[103] В некоторых вариантах осуществления поверхность содержится в более крупном модуле. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержится в шприце, таком как пластмассовый или стеклянный шприц. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержится в пластмассовом держателе фильтра. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержится в кончике пипетки.

VI. ВОЗМУЩЕНИЕ КЛЕТОК

[104] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам супрессии иммунного ответа или индуцирования толерантности посредством пропускания клеточной суспензии через сужение, где сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген или соединение проникает в клетку, где возмущение в клетке представляет собой брешь в клетке, которая позволяет перемещать материал снаружи клетки внутрь клетки (например, отверстие, разрыв, полость, апертура, пора, пролом, зазор, перфорация). Деформация может быть обусловлена, например, давлением, индуцируемым механическим напряжением и/или усилием сдвига. В некоторых вариантах осуществления возмущение представляет собой возмущение в клеточной мембране. В некоторых вариантах осуществления возмущение является временным. В некоторых вариантах осуществления возмущение клетки длится приблизительно от 1,0×10^-9 с приблизительно до 2 часов, или любое время или диапазон времен между ними. В некоторых вариантах осуществления возмущение клетки длится в течение приблизительно от 1,0×10^-9 с приблизительно до 1 с, приблизительно от 1 с приблизительно до 1 минуты или приблизительно от 1 минуты приблизительно до 1 часа. В некоторых вариантах осуществления возмущение клетки длится в течение любого одного из приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-2, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-3, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-4, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-5, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-6, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-7 или приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-8 с. В определенном варианте осуществления возмущение клетки длится в течение любого одного из приблизительно от 1,0×10^-8 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-7 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-6 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-5 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-4 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10-3 приблизительно до 1,0×10^-1, или приблизительно от 1,0×10^-2 приблизительно до 1,0×10^-1 с. Возмущение клетки (например, поры или отверстия), создаваемое способами, описанными в настоящем описании, не возникает в результате сборки белковых субъединиц для того, чтобы формировать структуру мультимерной поры, такую как та, которую создают с помощью комплемента или бактериальных гемолизинов.

[105] По мере пропускания клетки через сужение, сужение временно создает повреждения в клеточной мембране, которые вызывают пассивную диффузию материала через возмущение. В некоторых вариантах осуществления клетку деформируют только в течение короткого периода времени, порядка 100 мкс для того, чтобы минимизировать шанс активации апоптозных путей через механизмы клеточной сигнализации, несмотря на то, что возможны другие длительности (например, в диапазоне от наносекунд до часов). В некоторых вариантах осуществления клетку деформируют в течение приблизительно от 1,0×10^-9 с приблизительно до 2 часов или любого времени или диапазона времен между ними. В некоторых вариантах осуществления клетку деформируют в течение приблизительно от 1,0×10^-9 с приблизительно до 1 с, приблизительно от 1 с приблизительно до 1 минуты или приблизительно от 1 минуты приблизительно до 1 часа. В некоторых вариантах осуществления клетку деформируют в течение любого одного из приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-2, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-3, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-4, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-5, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-6, приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-7, или приблизительно от 1,0×10^-9 приблизительно до 1,0×10^-8 с. В определенном варианте осуществления клетку деформируют в течение любого одного из приблизительно от 1,0×10^-8 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-7 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-6 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-5 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-4 приблизительно до 1,0×10^-1, приблизительно от 1,0×10^-3 приблизительно до 1,0×10^-1, или приблизительно от 1,0×10^-2 приблизительно до 1,0×10^-1 с. В некоторых вариантах осуществления деформирование клетки включает деформирование клетки в течение времени в диапазоне от, без ограничения, приблизительно 1 мкс до по меньшей мере приблизительно 750 мкс, например, по меньшей мере приблизительно 1 мкс, 10 мкс, 50 мкс, 100 мкс, 500 мкс или 750 мкс.

[106] В некоторых вариантах осуществления проникновение соединения в клетку происходит одновременно с пропусканием клетки через сужение и/или возмущением клетки. В некоторых вариантах осуществления проникновение соединения в клетку происходит после пропускания клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления проникновение соединения в клетку происходит через порядка минут после пропускания клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления проникновение соединения в клетку происходит через приблизительно от 1,0×10^-2 с до по меньшей мере приблизительно 30 минут после пропускания клетки через сужение. Например, проникновение соединения в клетку происходит через приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 1 с, приблизительно от 1 с приблизительно до 1 минуты или приблизительно от 1 минуты приблизительно до 30 минут после пропускания клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления проникновение соединения в клетку происходит через приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 10 минут, приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 5 минут, приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 1 минуты, приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 50 с, приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 10 с, приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 1 с или приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 0,1 с после пропускания клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления проникновение соединения в клетку происходит через приблизительно от 1,0×10^-1 с приблизительно до 10 минут, приблизительно от 1 с приблизительно до 10 минут, приблизительно от 10 с приблизительно до 10 минуты, приблизительно от 50 с приблизительно до 10 минут, приблизительно от 1 минуты приблизительно до 10 минут или приблизительно от 5 минут приблизительно до 10 минут после пропускания клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления возмущение клетке после ее пропускания через сужение корректируют в пределах порядка приблизительно 5 минут после пропускания клетки через сужение.

[107] В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток после пропускания через сужение составляет приблизительно от 5% приблизительно до 100%. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток после пропускания через сужение составляет по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. В некоторых вариантах осуществления измеряют жизнеспособность клеток через приблизительно от 1,0×10 2 с по меньшей мере приблизительно до 10 суток после пропускания клетки через сужение. Например, жизнеспособность клеток измеряют через приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 1 с, приблизительно от 1 с приблизительно до 1 минуты, приблизительно от 1 минуты приблизительно до 30 минут или приблизительно от 30 минут приблизительно до 2 часов после пропускания клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток измеряют через приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 2 часов, приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 1 часа, приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 30 минут, приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 1 минуты, приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 30 с, приблизительно 1,0×10^-2 с приблизительно до 1 с или приблизительно от 1,0×10^-2 с приблизительно до 0,1 с после пропускания клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток измеряют через приблизительно от 1,5 часа приблизительно до 2 часов, приблизительно от 1 часа приблизительно до 2 часов, приблизительно от 30 минут приблизительно до 2 часов, приблизительно от 15 минут приблизительно до 2 часов, приблизительно от 1 минуты приблизительно до 2 часов, приблизительно от 30 с приблизительно до 2 часов или приблизительно от 1 с приблизительно до 2 часов после пропускания клетки через сужение. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток измеряют через приблизительно от 2 часов приблизительно до 5 часов, приблизительно от 5 часов приблизительно до 12 часов, приблизительно от 12 часов приблизительно до 24 часов или приблизительно от 24 часов приблизительно до 10 суток после пропускания клетки через сужение.

VII. ПАРАМЕТРЫ ДОСТАВКИ

[108] Множество параметров может влиять на доставку соединения в клетку для супрессии иммунного ответа или индуцирования толерантности с помощью способов, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления клеточную суспензию приводят в контакт с соединением до, параллельно или после пропускания через сужение. Клетку можно пропускать через сужение суспендированной в растворе, который содержит соединение для доставки, хотя соединение можно добавлять в клеточную суспензию после пропускания клеток через сужение. В некоторых вариантах осуществления сужение покрывают соединением, подлежащим доставке.

[109] Примеры параметров, которые могут влиять на доставку соединения в клетку, включают, но не ограничиваясь этим, размеры сужения, входной угол сужения, свойства поверхности сужений (например, грубость, химическая модификация, гидрофильная, гидрофобная и т. д.), рабочие скорости потока (например, время прохождения клетки через сужение), концентрацию клеток, концентрацию соединения в клеточной суспензии и количество времени, которое клетку восстанавливают или инкубируют после пропускания через сужения, могут влиять на проникновение доставляемого соединения в клетку. Дополнительные параметры, влияющие на доставку соединения в клетку, могут включать скорость клетки в сужении, скорость сдвига в сужении, вязкость клеточной суспензии, компонент скорости, который перпендикулярен к скорости потока, и время в сужении. Такие параметры можно разрабатывать для того, чтобы управлять доставкой соединения. В некоторых вариантах осуществления концентрация клеток находится в диапазоне приблизительно от 10 до по меньшей мере приблизительно 10¹² клеток/мл или в любой концентрации или диапазоне концентраций между ними. В некоторых вариантах осуществления концентрации соединения при доставке могут находиться в диапазоне приблизительно от 10 нг/мл приблизительно до 1 г/мл или любой концентрации или диапазоне концентраций между ними. В некоторых вариантах осуществления концентрации соединения при доставке могут находиться в диапазоне приблизительно от 1 пМ до по меньшей мере приблизительно 2 M или любой концентрации или диапазоне концентраций между ними. Композиция клеточной суспензии (например, осмолярность, концентрация солей, содержание сыворотки, концентрация клеток, pH и т.д.) может влиять на доставку соединения для супрессии иммунного ответа или индуцирования толерантности. В некоторых вариантах осуществления водный раствор является изоосмолярным или изотоническим.

[110] Температуру, используемую в способах по настоящему раскрытию, можно корректировать для того, чтобы влиять на доставку соединения и жизнеспособность клеток. В некоторых вариантах осуществления способ осуществляют между приблизительно -5°C и приблизительно 45°C. Например, способы можно осуществлять при комнатной температуре (например, приблизительно 20°C), физиологической температуре (например, приблизительно 37°C), выше физиологической температуры (например, больше приблизительно 37°C и до 45°C или больше) или сниженной температуре (например, приблизительно от -5°C приблизительно до 4°C) или температурах между этими образцовыми температурами.

[111] Можно использовать различные способы, чтобы проводить клетки через сужения. Например, можно прикладывать давление с помощью насоса на входной стороне (например, газовый баллон или компрессор), можно прикладывать вакуум с помощью вакуумного насоса на выходной стороне, можно применять капиллярный эффект через трубку и/или система может быть с подачей самотеком. Также можно использовать поточные системы на основе вытеснения (например, шприцевой насос, перистальтический насос, ручной шприц или пипетка, поршни и т.д.). В некоторых вариантах осуществления клетки пропускают через сужения с помощью положительного давления или отрицательного давления. В некоторых вариантах осуществления клетки пропускают через сужения с помощью постоянного давления или переменного давления. В некоторых вариантах осуществления давление прикладывают с использованием шприца. В некоторых вариантах осуществления давление прикладывают с использованием насоса. В некоторых вариантах осуществления насос представляет собой перистальтический насос или диафрагменный насос. В некоторых вариантах осуществления давление прикладывают с использованием вакуума. В некоторых вариантах осуществления клетки пропускают через сужения с помощью силы тяжести. В некоторых вариантах осуществления клетки пропускают через сужения с помощью центробежной силы. В некоторых вариантах осуществления клетки пропускают через сужения с помощью капиллярного давления.

[112] В некоторых вариантах осуществления поток текучего вещества направляет клетки через сужения. В некоторых вариантах осуществления поток текучего вещества представляет собой турбулентный поток перед пропусканием клеток через сужение. Турбулентный поток представляет собой поток текучего вещества, в котором скорость в заданной точке варьирует неустойчиво по величине и направлению. В некоторых вариантах осуществления поток текучего вещества через сужение представляет собой ламинарный поток. Ламинарный поток включает непрерывный поток в текучем веществе около границы твердого тела, где направление потока в каждой точке остается постоянным. В некоторых вариантах осуществления поток текучего вещества представляет собой турбулентный поток после пропускания клеток через сужение. Скорость, с которой клетки пропускают через сужения, может варьировать. В некоторых вариантах осуществления клетки проходят через сужения при однородной скорости клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки пропускают через сужения при колеблющейся скорости клеток.

[113] В других вариантах осуществления комбинированную обработку используют для того, чтобы супрессировать иммунный ответ или индуцировать толерантность посредством пропускания клеточной суспензии через сужение, где сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген или соединение проникает в клетку, например, способы, описанные в настоящем описании, после чего следует воздействие электрическим полем ниже по потоку от сужения. В некоторых вариантах осуществления клетку пропускают через электрическое поле, создаваемое по меньшей мере одним электродом после пропускания через сужение. В некоторых вариантах осуществления электрическое поле способствует доставке соединений во второе местоположение внутри клетки. Например, комбинацией деформирующего клетки сужения и электрического поля доставляют плазмиду, кодирующую антитело, в клетку, что ведет к продуцированию антитела de novo. В некоторых вариантах осуществления один или несколько электродов находятся вблизи от деформирующего клетки сужения для того, чтобы создавать электрическое поле. В некоторых вариантах осуществления электрическое поле составляет между приблизительно 0,1 кВ/м приблизительно до 100 МВ/м или любое число или диапазон чисел между ними. В некоторых вариантах осуществления интегральную схему используют для обеспечения электрического сигнала, чтобы приводить в действие электроды. В некоторых вариантах осуществления на клетки воздействуют электрическим полем с шириной импульса между приблизительно 1 нс приблизительно до 1 с и периодом между приблизительно 100 нс и приблизительно 10 с или любым временем или диапазоном времен между ними.

VIII. КЛЕТОЧНЫЕ СУСПЕНЗИИ ДЛЯ ДОСТАВКИ В БЕЗЪЯДЕРНЫЕ КЛЕТКИ

[114] Клеточная суспензия может представлять собой смешанную или очищенную популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия представляет собой смешанную популяцию клеток, такую как цельная кровь. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия представляет собой очищенную популяцию клеток, такую как очищенная популяция безъядерных клеток.

[115] Композиция клеточной суспензии (например, осмолярность, концентрация солей, содержание сыворотки, концентрация клеток, pH и т. д.) может влиять на доставку соединения для супрессии иммунного ответа или индуцирования толерантности. В некоторых вариантах осуществления суспензия содержит цельную кровь. Альтернативно, клеточная суспензия представляет собой смесь клеток в физиологическом растворе или физиологической среде, отличной от крови. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия содержит водный раствор. В некоторых вариантах осуществления водный раствор содержит среду клеточной культуры, PBS, соли, сахара, факторы роста, продукты животного происхождения, наполнители, поверхностно-активные средства, смазывающие средства, витамины, аминокислоты, белки, ингибиторы клеточного цикла и/или средство, которое влияет на полимеризацию актина. В некоторых вариантах осуществления среда клеточной культуры представляет собой DMEM, Opti-MEM™, IMDM или RPMI. Дополнительно, буферный раствор может содержать одно или несколько смазывающих средств (плюроники или другие поверхностно-активные средства), которые можно разрабатывать, например, для того, чтобы снижать или устранять засорение поверхности и усовершенствовать жизнеспособность клеток. Образцовые поверхностно-активные средства включают, без ограничения, полоксамеры, полисорбаты, сахара или сахароспирты, такие как маннит, сорбит, сыворотку животного происхождения и белок альбумин. В некоторых вариантах осуществления водный раствор является изоосмолярным или изотоническим. В некоторых вариантах осуществления водный раствор включает плазму.

[116] В некоторых конфигурациях с клетками определенных типов, клетки можно инкубировать в одном или нескольких растворах, которые способствуют доставке соединения во внутреннюю часть клетки. В некоторых вариантах осуществления водный раствор содержит средство, которое влияет на полимеризацию актина. В некоторых вариантах осуществления средство, которое влияет на полимеризацию актина, представляет собой латрункулин A, цитохалазин и/или колхицин. Например, клетки можно инкубировать в растворе для деполимеризации, таком как латрункулин A (0,1 мкг/мл) в течение 1 часа перед доставкой, чтобы деполимеризовать актиновый цитоскелет. В качестве дополнительного примера, клетки можно инкубировать в 10 мкМ колхицине (Sigma) в течение 2 часов перед доставкой, чтобы деполимеризовать сеть микротрубочек.

[117] В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обогащают перед использованием в раскрытых способах. Например, клетки получают из текучего вещества организма, например, периферической крови, и необязательно обогащают или очищают для того, чтобы концентрировать B-клетки. Клетки можно обогащать любыми известными в данной области способами, включая, без ограничения, магнитное разделение клеток, сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или центрифугирование в градиенте плотности.

[118] Вязкость клеточной суспензии также может влиять на способы, раскрытые в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления вязкость клеточной суспензии находится в диапазоне приблизительно от 8,9×10^-4 Па×с приблизительно до 4,0×10^-3 Па×с или составлять любое значение или диапазон значений между ними. В некоторых вариантах осуществления вязкость находится в диапазоне любого одного из приблизительно от 8,9×10^-4 Па×с приблизительно до 4,0×10^-3 Па×с, приблизительно от 8,9×10^-4 Па×с приблизительно до 3,0×10^-3 Па×с, приблизительно от 8,9×10^-4 Па×с приблизительно до 2,0×10^-3 Па×с или приблизительно от 8,9×10^-3 Па×с приблизительно до 1,0×10^-3 Па×с. В некоторых вариантах осуществления вязкость находится в диапазоне любого одного из приблизительно от 0,89 спз приблизительно до 4,0 спз, приблизительно от 0,89 спз приблизительно до 3,0 спз, приблизительно от 0,89 спз приблизительно до 2,0 спз или приблизительно от 0,89 спз приблизительно до 1,0 спз. В некоторых вариантах осуществления наблюдают эффект псевдопластичности, при котором вязкость клеточной суспензии убывает в условиях напряжения сдвига. Вязкость можно измерять любым известный в данной области способом, в том числе без ограничения, вискозиметрами, таким как стеклянный капиллярный вискозиметр или реометры. Вискозиметр измеряет вязкость при одних условиях течения, тогда как реометр используют для того, чтобы измерять вязкости, которые варьируют в зависимости от условий течения. В некоторых вариантах осуществления вязкость измеряют для псевдопластичного раствора, такого как кровь. В некоторых вариантах осуществления вязкость измеряют между приблизительно -5°C и приблизительно 45°C. Например, вязкость измеряют при комнатной температуре (например, приблизительно 20°C), физиологической температуре (например, приблизительно 37°C), выше физиологической температуры (например, больше приблизительно 37°C и до 45°C или больше), пониженной температуре (например, приблизительно от -5°C приблизительно до 4°C) или температурах между этими образцовыми температурами.

IX. АНТИГЕНЫ И ТОЛЕРОГЕННЫЕ ФАКТОРЫ ДЛЯ ТОГО, ЧТОБЫ СУПРЕССИРОВАТЬ ИММУННЫЙ ОТВЕТ ИЛИ ИНДУЦИРОВАТЬ ТОЛЕРАНТНОСТЬ

[119] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к доставке антигенов для того, чтобы супрессировать иммунный ответ или индуцировать толерантность, где антиген доставляют в клетку любым из способов, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой один антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой смесь антигенов. Антиген представляет собой вещество, которое стимулирует специфический иммунный ответ, такой как иммунный ответ, опосредованный клетками или антителами. Антигены связываются с рецепторами, экспрессируемыми клетками иммунной системы, такими как T-клеточные рецепторы (TCR), которые обладают специфичностью к конкретному антигену. Связывание антиген-рецептор впоследствии запускает внутриклеточные пути передачи сигнала, которые ведут к нисходящим иммунным эффекторным путям, таким как активация клетки, продуцирование цитокинов, клеточная миграция, секреция цитотоксических факторов, апоптоз клетки и продуцирование антител.

[120] В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой белковый или полипептидный антиген. В некоторых вариантах осуществления соединение содержит ассоциированный с заболеванием антиген. В некоторых вариантах осуществления антигены извлекают из чужеродных источников, таких как бактерии, грибы, вирусы или аллергены. В некоторых вариантах осуществления антигены извлекают из внутренних источников, таких как собственные белки (т. е. собственные антигены). В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой клеточный лизат. Собственные антигены представляют собой антигены, присутствующие на или в собственных клетках организма. Собственные антигены обычно не стимулируют иммунный ответ, но могут в контексте аутоиммунных заболеваний, таких как диабет I типа или ревматоидный артрит. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой терапевтический полипептид или фрагмент терапевтического полипептида. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство конъюгируют с углеводом. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой фактор свертывания. Образцовые факторы свертывания включают, без ограничения, фактор VIII и фактор IX. Например, антиген может представлять собой белок фактора VIII, используемого при лечении гемофилии. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой антитело. Образцовые терапевтические антитела включают, без ограничения, средства против TNFα, против VEGF, против CD3, против CD20, против IL-2R, против Her2, против RSVF, против CEA, против IL-1β, против CD15, против миозина, против PSMA, против гликопротеина 40 кДа, против CD33, против CD52, против IgE, против CD11a, против EGFR, против C5, против α-4 интегрина, против IL-12/IL-23, против IL-6R и против RANKL. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой фактор роста. Образцовые терапевтические факторы роста включают, без ограничения, эритропоэтин (EPO) и фактор дифференцировки и роста мегакариоцитов (MDGF). В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой гормон. Образцовые терапевтические гормоны включают, без ограничения, инсулин, гормон роста человека и фолликулостимулирующий гормон. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой рекомбинантный цитокин. Образцовые терапевтические рекомбинантные цитокины включают, без ограничения, IFNβ, IFNα и GM-CSF.

[121] В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой антиген трансплантированного аллотрансплантата. Трансплантация аллотрансплантата представляет собой перенос клеток, тканей или органов реципиенту от генетически не идентичного донора того же биологического вида. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой модифицированный антиген. Например, антигены можно сливать с терапевтическими средствами или направленными пептидами. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген сливают с полипептидом. В некоторых вариантах осуществления модифицированный антиген сливают с липидом. В некоторых вариантах осуществления антиген сливают с углеводом. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой небелковый антиген, такой как липид, гликолипид или полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой целый микроорганизм, такой как интактная бактерия.

[122] В некоторых вариантах осуществления антиген связан с вирусом. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой вирусный антиген. Образцовые вирусные антигены включают антигены SARS-CoV и антигены гриппа. В некоторых вариантах осуществления соединение содержит клеточный лизат из ткани, инфицированной неизвестным патогеном. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой терапевтический носитель. В некоторых вариантах осуществления терапевтический носитель представляет собой вирус, такой как аденовирус, аденоассоциированный вирус, бакуловирус, вирус герпеса или ретровирус, используемый для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления терапевтический носитель представляет собой липосому. В некоторых вариантах осуществления терапевтический носитель представляет собой наночастицу.

[123] В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с микроорганизмом; например, бактерий. В некоторых вариантах осуществления супрессированный иммунный ответ и/или индуцированная толерантность включает сниженный патогенный иммунный ответ или индуцированную толерантность к микроорганизму; например, бактерии. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм представляет собой часть микробиома индивидуума. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм может приносить пользу микробиому индивидуума.

[124] В определенных аспектах, изобретение относится к способам доставки антигена в безъядерную клетку, включающим пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в клетку, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с антигеном. В некоторых вариантах осуществления представление антигена в толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления представление указанного антигена в толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену. В некоторых вариантах осуществления антиген доставляют в безъядерную клетку in vitro, ex vivo или in vivo.

[125] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к доставке толерогенных факторов для того, чтобы супрессировать иммунный ответ или индуцировать толерантность, где толерогенный фактор доставляют в клетку любым из способов, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает супрессию иммунного ответа на антиген и/или усиливает индуцирование толерантности к антигену. Например, толерогенный фактор может способствовать толерогенному представлению антигена антигенпредставляющей клеткой. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор вводят одновременно с антигеном. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор и антиген вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит полипептид. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα или TGFβ. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой фрагмент терапевтического полипептида. В некоторых вариантах осуществления полипептид конъюгируют с углеводом. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может включать, без ограничения, мРНК, ДНК, мкРНК или миРНК. Например, толерогенный фактор может включать миРНК для нокдауна экспрессии воспалительных генов. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой последовательность ДНК, которая связывает NFκB и предотвращает активацию NFκB и передачу сигналов ниже по каскаду. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой низкомолекулярное соединение.

[126] В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор модулирует экспрессию и/или активность иммуномодуляторного средства (такого как иммуностимулирующее средство (например, костимулирующая молекула), иммуносупрессорное средство или воспалительная или противовоспалительная молекула). В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует экспрессию и/или активность иммуностимулирующего средства (например, костимулирующей молекулы), усиливает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы, ингибирует экспрессию и/или активность воспалительной молекулы и/или усиливает экспрессию и/или активность противовоспалительной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует активность костимулирующей молекулы. Взаимодействие между костимулирующими молекулами и их лигандами важно для подкрепления и интегрирования передачи TCR сигналов, чтобы стимулировать оптимальную пролиферацию и дифференцировку T-клеток. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор снижает экспрессию костимулирующей молекулы. Образцовые костимулирующие молекулы, экспрессируемые на антигенпредставляющих клетках включают, без ограничения, CD40, CD80, CD86, CD54, CD83, CD79 или лиганд ICOS. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула представляет собой CD80 или CD86. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует экспрессию нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует или модулирует экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор удаляет нуклеиновую кислоту, которая экспрессирует или модулирует экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления делеции нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует или модулирует экспрессию костимулирующей молекулы, достигают через редактирование генов. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует костимулирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой миРНК, которая ингибирует костимулирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность транскрипционного регулятора, который супрессирует экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность белкового ингибитора, который супрессирует экспрессию костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор разрушает костимулирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор помещает костимулирующую молекулу для разрушения. Например, толерогенный фактор может усиливать убиквитинилирование костимулирующей молекулы, тем самым направляя ее на разрушение.

[127] В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорная молекула представляет собой коингибирующую молекулу, транскрипционный регулятор или иммуносупрессорную молекулу. Коингибирующие молекулы осуществляют отрицательную регуляцию активации лимфоцитов. Образцовые коингибирующие молекулы включают, без ограничения, PD-L1, PD-L2, HVEM, B7-H3, TRAIL, рецепторы иммуноглобулиноподобных транскриптов (ILT) (ILT2, ILT3, ILT4), FasL, CTLA4, CD39, CD73 и B7-H4. В некоторых вариантах осуществления коингибирующая молекула представляет собой PD-L1 или PD-L2. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует коингибирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность транскрипционного регулятора, который усиливает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность полипептида, который увеличивает экспрессию коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер коингибирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует ингибитор коингибирующей молекулы.

[128] В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает экспрессию и/или активность иммуносупрессорной молекулы. Образцовые иммуносупрессорные молекулы включают, без ограничения, аргиназу-1 (ARG1), индоламин-2,3-диоксигеназу (IDO), простагландин E2 (PGE2), индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS), оксид азота (II) (NO), синтазу оксида азота 2 (NOS2), тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP), вазоактивный кишечный пептид (VIP), фактор роста гепатоцитов (HGF), трансформирующий фактор роста β (TGFβ), IFNα, IL-4, IL-10, IL-13 и IL-35. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессорная молекула представляет собой NO или IDO. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует иммуносупрессорную молекулу. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность транскрипционного регулятора, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность полипептида, который усиливает экспрессию иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер иммуносупрессорной молекулы. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует негативный регулятор иммуносупрессорной молекулы.

[129] В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует экспрессию и/или активность воспалительной молекулы. В некоторых вариантах осуществления воспалительная молекула представляет собой воспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует воспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор снижает экспрессию воспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления воспалительный фактор транскрипции представляет собой NFκB, регуляторный фактор интерферона (IRF) или молекулу, связанную с путем передачи сигнала JAK-STAT. Путь NFκB представляет собой прототипный путь передачи провоспалительного сигнала, который опосредует экспрессию провоспалительных генов, в том числе цитокинов, хемокинов и адгезивных молекул. Регуляторные факторы интерферона (IRF) образуют семейство факторов транскрипции, которые могут регулировать экспрессию провоспалительных генов. Путь передачи сигнала JAK-STAT передает информацию от внеклеточных сигналов цитокинов в ядро, что ведет к транскрипции ДНК и экспрессии генов, участвующих в пролиферации и дифференцировке иммунных клеток. Система JAK-STAT состоит из рецептора клеточной поверхности, киназ Janus (JAK) и белков преобразователей сигналов и активаторов транскрипции (STAT). Образцовые молекулы JAK-STAT включают, без ограничения, JAK1, JAK2, JAK3, Tyk2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 (STAT5A и STAT5B) и STAT6. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает экспрессию белка супрессора передачи сигналов цитокинов (SOCS). Белки SOCS могут ингибировать передачу сигналов через путь JAK-STAT. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор ингибирует экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей воспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор удаляет нуклеиновую кислоту, кодирующую воспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность транскрипционного регулятора, который супрессирует экспрессию воспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает активность белкового ингибитора, который супрессирует экспрессию воспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор воспалительного фактора транскрипции.

[130] В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает экспрессию и/или активность противовоспалительной молекулы. В некоторых вариантах осуществления противовоспалительная молекула представляет собой противовоспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает противовоспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор увеличивает экспрессию противовоспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор усиливает экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей противовоспалительный фактор транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор снижает активность транскрипционного регулятора, который супрессирует экспрессию противовоспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор снижает активность белкового ингибитора, который супрессирует экспрессию противовоспалительного фактора транскрипции. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую энхансер противовоспалительного фактора транскрипции.

[131] В определенных аспектах, изобретение относится к способам доставки толерогенного фактора в безъядерную клетку, включающим пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в клетку, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с толерогенным фактором. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор доставляют в безъядерную клетку in vitro, ex vivo или in vivo.

[132] В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой нуклеиновую кислоту. Образцовые нуклеиновые кислоты включают, без ограничения, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, ДНК, рекомбинантную ДНК, кДНК, геномную ДНК, РНК, миРНК, мРНК, saRNA, мкРНК, lncRNA, tRNA, гидовую РНК и shRNA. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота гомологична нуклеиновой кислоте в клетке. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота гетерологична нуклеиновой кислоте в клетке. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой плазмиду. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой терапевтическую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую миРНК, мРНК, мкРНК, lncRNA, tRNA или shRNA. Например, толерогенный фактор может включать миРНК для нокдауна экспрессии воспалительных генов. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой последовательность ДНК, которая связывает NFκB и предотвращает активацию NFκB и передачу сигналов ниже по каскаду.

[133] В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит полипептид. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления белок или полипептид представляет собой терапевтический белок, антитело, слитый белок, антиген, синтетический белок, репортерный маркер или селективный маркер. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой редактирующий гены белок или нуклеазу, такие как нуклеаза с цинковыми пальцами (ZFN), подобная активатору транскрипции эффекторная нуклеаза (TALEN), мегануклеаза, рекомбиназа CRE, транспозаза, РНК-направляемая эндонуклеаза (например, фермент CAS9), ДНК-направляемая эндонуклеаза или фермент интеграза. В некоторых вариантах осуществления слитые белки могут включать, без ограничения, химерные белковые лекарственные средства, такие как конъюгаты антител и лекарственных средств, или рекомбинантные слитые белки, такие как белки, меченные GST или стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой фактор транскрипции. Образцовые факторы транскрипции включают, без ограничения, Oct5, Sox2, c-Myc, Klf-4, T-bet, GATA3, FoxP3 и RORγt. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα или TGFβ. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой фрагмент терапевтического полипептида. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой пептидо-нуклеиновую кислоту (PNA).

[134] В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит комплекс белка и нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой комплекс белка и нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления комплексы белка и нуклеиновой кислоты, такие как короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR)-Cas9, используют в приложениях редактирования генома. Эти комплексы содержат домены, связывающие ДНК с конкретной последовательностью, в комбинации с неспецифическими расщепляющими ДНК нуклеазами. Эти комплексы делают возможным направленное редактирование генома, в том числе добавление, разрушение или изменение последовательности конкретного гена. В некоторых вариантах осуществления модифицированный CRISPR используют для блокирования или индуцирования транскрипции целевого гена. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит белок Cas9 и гидовую РНК или донорную ДНК. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas9, и гидовую РНК или донорную ДНК. В некоторых вариантах осуществления комплекс редактирования генов направленно воздействует на экспрессию костимулирующей молекулы (например, CD80 и/или CD86).

[135] В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой слияние внеклеточного распознающего домена (например, антигенсвязывающего домена), трансмембранного домена и одного или нескольких внутриклеточных сигнальных доменов. При контакте с антигеном внутриклеточная сигнальная часть CAR может инициировать иммуносупрессорный или связанный с толерогенностью ответ в клетке иммунной системы. В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой химерный T-клеточный антигенный рецептор. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен CAR представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (scFv). В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует модифицированный TCR, содержащий цитоплазматические сигнальные домены, которые запускают продуцирование иммуносупрессорных цитокинов при связывании с антигеном. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор кодирует химерный антигенный рецептор, содержащий цитоплазматические сигнальные домены, которые запускают продуцирование иммуносупрессорных цитокинов при связывании с антигеном.

[136] В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор содержит низкомолекулярное соединение. В некоторых вариантах осуществления толерогенный фактор представляет собой низкомолекулярное соединение. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярное соединение ингибирует активность костимулирующей молекулы, усиливает активность коингибирующей молекулы и/или ингибирует активность воспалительной молекулы. Образцовые низкомолекулярные соединения включают, без ограничения, фармацевтические средства, метаболиты или радионуклиды. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой терапевтическое лекарственное средство и/или цитотоксическое средство. В некоторых вариантах осуществления соединение содержит наночастицу. Примеры наночастиц включают наночастицы золота, квантовые точки, углеродные нанотрубки, наногильзы, дендримеры и липосомы. В некоторых вариантах осуществления наночастица содержит или связана (ковалентно или нековалентно) с терапевтической молекулой. В некоторых вариантах осуществления наночастица содержит нуклеиновую кислоту, такую как мРНК или кДНК.

[137] В некоторых вариантах осуществления доставляемое соединение очищают. В некоторых вариантах осуществления соединение состоит по меньшей мере приблизительно на 60% по массе (сухой массе) из соединения, представляющего интерес. В некоторых вариантах осуществления очищенное соединение состоит по меньшей мере приблизительно на 75%, 90% или 99% из соединения, представляющего интерес. В некоторых вариантах осуществления очищенное соединение состоит по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% или 100% (масс./масс.) из соединения, представляющего интерес. Чистоту определяют любыми известными способами, в том числе, без ограничения, колоночной хроматографией, тонкослойной хроматографией, HPLC анализом, ЯМР, масс-спектрометрией или SDS-PAGE. Очищенную ДНК или РНК определяют как ДНК или РНК, которая не содержит экзогенные нуклеиновые кислоты, углеводы и липиды.

[138] В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой промежуточное соединение. Промежуточное соединение может представлять собой молекулярную частицу, которую формируют из предшествующих промежуточных соединений и которая вступает в дополнительную реакцию для получения конечного продукта реакции. В некоторых вариантах осуществления промежуточное соединение представляет собой предшественник белка или пропротеин, который расщепляет фермент для получения зрелой функциональной формы белка. В некоторых вариантах осуществления промежуточное соединение представляет собой неактивный предшественник фермента или зимоген, который требует модификации или расщепления для получения активного фермента.

X. ПРИМЕНЕНИЯ

[139] В некоторых аспектах, изобретение относится к способам лечения пациента посредством введения безъядерной клетки, модифицированной посредством пропускания через сужение так, что соединение проникает в клетку, пациенту. В некоторых вариантах осуществления лечение включает несколько (например, любое из 2, 3, 4, 5, 6 или больше) стадий введения таких модифицированных безъядерных клеток пациенту. В некоторых вариантах осуществления клетку выделяют у пациента, модифицируют в соответствии с раскрытыми способами и вводят обратно пациенту. Например, популяцию безъядерных клеток выделяют у пациента, пропускают через сужение, чтобы добиваться доставки соединения и затем повторно вливают пациенту для увеличения терапевтического иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления клетку выделяют у индивидуума, модифицируют в соответствии с раскрытыми способами и вводят обратно индивидууму. Например, популяцию безъядерных клеток выделяют у индивидуума, пропускают через сужение, чтобы добиваться доставки соединения и затем повторно вливают пациенту для того, чтобы супрессировать иммунный ответ или индуцировать толерантность у индивидуума.

[140] В некоторых вариантах осуществления безъядерную клетку выделяют у универсального донора крови (например, донора крови группы 0) и затем хранят и/или замораживают для последующей опосредованной сужением доставки и введения индивидууму. В некоторых вариантах осуществления антиген выделяют у индивидуума, доставляют в безъядерную клетку, выделенную у универсального донора, и вводят индивидууму. В некоторых вариантах осуществления безъядерную клетку выделяют у донора крови и затем хранят и/или замораживают для последующей опосредованной сужением доставки и введения индивидууму с типом крови, совпадающим с донором крови. В некоторых вариантах осуществления антиген выделяют у индивидуума, доставляют в безъядерную клетку, выделенную у донора крови, и вводят индивидууму.

[141] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения индивидуума посредством введения клетки, модифицированной посредством пропускания через сужение так, что соединение проникает в клетку, индивидууму. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой аутологичную клетку. Например, безъядерную клетку выделяют у индивидуума (например, пациента), модифицируют в соответствии с раскрытыми способами и вводят обратно индивидууму. В некоторых вариантах осуществления клетку выделяют у индивидуума, модифицируют в соответствии с раскрытыми способами и вводят обратно тому же индивидууму. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой аллогенную клетку. Например, клетку выделяют у другого индивидуума, модифицируют в соответствии с раскрытыми способами и вводят первому индивидууму (например, пациенту). В некоторых вариантах осуществления пул клеток от нескольких индивидуумов модифицируют в соответствии с раскрытыми способами и вводят первому индивидууму (например, пациенту). В некоторых вариантах осуществления клетку выделяют у индивидуума, модифицируют в соответствии с раскрытыми способами и вводят другому индивидууму. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток выделяют у индивидуума (пациента) или другого индивидуума, пропускают через сужение, чтобы добиваться доставки соединения, и затем повторно вливают пациенту, чтобы увеличивать терапевтический ответ.

[142] В некоторых вариантах осуществления лечение включает несколько (например, любое из 2, 3, 4, 5, 6 или больше) стадий введения модифицированных безъядерных клеток, как раскрыто в настоящем описании, индивидууму. Например, в некоторых вариантах осуществления предоставлен способ лечения индивидуума посредством введения клетки, модифицированной посредством пропускания через сужение так, что соединение проникает в клетку, индивидууму 2, 3, 4, 5, 6 или больше раз. В некоторых вариантах осуществления длительность времени между любыми двумя последовательными введениями клеток составляет по меньшей мере приблизительно 1 сутки (например, по меньшей мере приблизительно любое из 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 1 года или дольше, включая любые диапазоны между этими значениями).

[143] Любые из способов, описанных выше, осуществляют in vitro, ex vivo или in vivo. Для применений in vivo, устройство можно имплантировать в просвет сосуда, например, соосный стент в артерии или вене. В некоторых вариантах осуществления способы используют в качестве части прикроватной системы для обработки клеток пациента ex vivo и незамедлительного повторного введения клеток пациенту. Такие способы можно использовать в качестве средства супрессии иммунного ответа или индуцирования толерантности у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способ может реализовать минимально обученный техник в типичной больничной лаборатории. В некоторых вариантах осуществления можно использовать систему лечения, управляемую пациентом. В некоторых вариантах осуществления способ реализуют с использованием подключаемой системы обработки крови, в которой кровь непосредственно отводят от пациента, пропускают через сужение, что ведет к доставке соединения в клетки крови, и осуществляют трансфузию непосредственно обратно пациенту после обработки.

XI. СИСТЕМЫ И НАБОРЫ

[144] В некоторых аспектах, изобретение относится к системе, содержащей сужение, клеточной суспензии и соединению для использования в способах, раскрытых в настоящем описании. Система может включать любой вариант осуществления, описанный для способов, раскрытых выше, включая микрожидкостные каналы или поверхность, имеющую поры, чтобы обеспечивать деформирующие клетки сужения, клеточные суспензии, возмущения клеток, параметры доставки, соединения и/или применения и т. д. В определенном варианте осуществления, деформирующие клетки сужения имеют размеры для доставки в безъядерные клетки. В некоторых вариантах осуществления параметры доставки, такие как рабочие скорости потока, концентрация клеток и соединения, скорость клеток в сужении и композиция клеточной суспензии (например, осмолярность, концентрация солей, содержание сыворотки, концентрация клеток, pH и т.д.), оптимизируют для максимального ответа соединения для супрессии иммунного ответа или индуцирования толерантности.

[145] Также предусмотрены наборы или промышленные изделия для использования в доставке соединения для того, чтобы супрессировать иммунный ответ или индуцировать толерантность. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат композиции, описанные в настоящем описании (например, микрожидкостный канал или поверхность, содержащая поры, клеточные суспензии и/или соединения) в подходящей упаковке. Подходящие упаковочные материалы известны в данной области, и включают, например, флаконы (такие как герметизированные флаконы), сосуды, ампулы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, герметизированные мешки Mylar или пластмассовые мешки) и т. п. Эти промышленные изделия дополнительно можно стерилизовать и/или герметизировать.

[146] Настоящее раскрытие также предусматривает наборы, содержащие компоненты способов, описанных в настоящем описании, которые дополнительно могут содержать инструкцию(и) для осуществления указанных способов для того, чтобы супрессировать иммунный ответ или индуцировать толерантность. Наборы, описанные в настоящем описании, дополнительно могут включать другие материалы, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями для осуществления любых способов, описанных в настоящем описании; например, инструкции для супрессии иммунного ответа или индуцирования толерантности.

XII. ОБРАЗЦОВЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[147] Вариант осуществления 1. Способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку; и

b. введение безъядерной клетки индивидууму,

где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

[148] Вариант осуществления 2. Способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку; и

b. введение безъядерной клетки индивидууму,

где указанный толерогенный фактор вносит вклад в толерогенное окружение, которое супрессирует иммунный ответ.

[149] Вариант осуществления 3. Способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку; и

b. введение безъядерной клетки индивидууму,

где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении и где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

[150] Вариант осуществления 4. Способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, который включает:

a. пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку,

b. пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку,

c. введение первой безъядерной клетки и второй безъядерной клетки индивидууму,

где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении и где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

[151] Вариант осуществления 5. Способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

[152] Вариант осуществления 6. Способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген и толерогенный фактор, где антиген и толерогенный фактор вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникали в безъядерную клетку, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении и где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

[153] Вариант осуществления 7. Способ доставки толерогенного фактора в безъядерную клетку, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в клетку, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с толерогенным фактором.

[154] Вариант осуществления 8. Способ введения антигена в толерогенное окружение, включающий доставку безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении.

[155] Вариант осуществления 9. Способ введения антигена и толерогенного фактора в толерогенное окружение, который включает доставку безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген и толерогенный фактор, где антиген и толерогенный фактор вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникали в безъядерную клетку, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении.

[156] Вариант осуществления 10. Способ индуцирования антигенспецифической толерантности у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку; и

b. введение безъядерной клетки индивидууму,

где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену.

[157] Вариант осуществления 11. Способ индуцирования толерантности у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку; и

b. введение безъядерной клетки индивидууму,

где указанный толерогенный фактор вносит вклад в толерогенное окружение, которое индуцирует толерантность.

[158] Вариант осуществления 12. Способ индуцирования толерантности у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникают в безъядерную клетку; и

b. введение безъядерной клетки индивидууму,

где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении и где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену.

[159] Вариант осуществления 13. Способ индуцирования антигенспецифической толерантности у индивидуума, который включает:

a. пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку,

b. пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает в безъядерную клетку,

c. введение первой безъядерной клетки и второй безъядерной клетки индивидууму,

где указанный антиген и указанные толерогенные факторы процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену.

[160] Вариант осуществления 14. Способ индуцирования антигенспецифической толерантности у индивидуума, включающий введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену.

[161] Вариант осуществления 15. Способ индуцирования антигенспецифической толерантности у индивидуума, включающий введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген и толерогенный фактор, где антиген и толерогенный фактор вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникали в безъядерную клетку, где указанный антиген процессируют в толерогенном окружении и где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену.

[162] Вариант осуществления 16. Способ доставки антигена в безъядерную клетку, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в клетку, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с антигеном.

[163] Вариант осуществления 17. Способ доставки антигена и толерогенного фактора в безъядерную клетку, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникают в клетку, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с антигеном и толерогенным фактором.

[164] Вариант осуществления 18. Способ по варианту осуществления 16 или 17, в котором процессинг и представление указанного антигена в толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

[165] Вариант осуществления 19. Способ по варианту осуществления 16 или 17, в котором процессинг и представление указанного антигена в толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену.

[166] Вариант осуществления 20. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8, 10 и 13-19, в котором по меньшей мере один дополнительный антиген вводят в клетку.

[167] Вариант осуществления 21. Способ по любому из вариантов осуществления 2-4, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 15 и 17, в котором по меньшей мере один дополнительный толерогенный фактор вводят в клетку.

[168] Вариант осуществления 22. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 8-15, 18 и 19, в котором толерогенное окружение располагается в селезенке, печени или лимфатических узлах.

[169] Вариант осуществления 23. Способ по любому из вариантов осуществления 1-22, где сужение находится в микрожидкостном канале.

[170] Вариант осуществления 24. Способ по любому из вариантов осуществления 1-23, в котором канал имеет ширину сужения приблизительно от 0,25 мкм приблизительно до 4 мкм.

[171] Вариант осуществления 25. Способ по любому из вариантов осуществления 1-24, в котором канал имеет ширину сужения приблизительно 4 мкм, 3,5 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 2,5 мкм, приблизительно 2 мкм, приблизительно 1,5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм или приблизительно 0,25 мкм.

[172] Вариант осуществления 26. Способ по любому из вариантов осуществления 1-22, в котором сужение представляет собой пору или содержится в поре.

[173] Вариант осуществления 27. Способ по варианту осуществления 26, в котором пора находится в поверхности.

[174] Вариант осуществления 28. Способ по варианту осуществления 27, в котором поверхность представляет собой фильтр.

[175] Вариант осуществления 29. Способ по варианту осуществления 27, в котором поверхность представляет собой мембрану.

[176] Вариант осуществления 30. Способ по любому из вариантов осуществления 26-29, в котором размер поры составляет приблизительно от 0,5 мкм приблизительно до 4 мкм.

[177] Вариант осуществления 31. Способ по любому из вариантов осуществления 26-30, в котором размер поры составляет 4 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 2 мкм, приблизительно 1 мкм или приблизительно 0,5 мкм.

[178] Вариант осуществления 32. Способ по любому из вариантов осуществления 1-31, в котором размер сужения является функцией диаметра безъядерной клетки.

[179] Вариант осуществления 33. Способ по любому из вариантов осуществления 1-32, в котором размер сужения составляет приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60% или приблизительно 70% от диаметра клетки.

[180] Вариант осуществления 34. Способ по любому из вариантов осуществления 1-33, в котором способ осуществляют между приблизительно -5°C и приблизительно 45°C.

[181] Вариант осуществления 35. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, 7, 10-13 и 16-34, в котором клеточная суспензия содержит смешанную популяцию клеток.

[182] Вариант осуществления 36. Способ по варианту осуществления 35, в котором клеточная суспензия представляет собой цельную кровь.

[183] Вариант осуществления 37. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, 7, 10-13 и 16-34, в котором клеточная суспензия содержит очищенную популяцию клеток.

[184] Вариант осуществления 38. Способ по варианту осуществления 37, в котором клеточная суспензия содержит очищенную популяцию безъядерных клеток.

[185] Вариант осуществления 39. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, 7, 10-13 и 16-38, в котором клеточная суспензия содержит клетки млекопитающих.

[186] Вариант осуществления 40. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, 7, 10-13 и 16-39, в котором клеточная суспензия содержит клетки обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика.

[187] Вариант осуществления 41. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, 7, 10-13 и 16-39, в котором клеточная суспензия содержит клетки человека.

[188] Вариант осуществления 42. Способ по любому из вариантов осуществления 1-41, в котором безъядерная клетка представляет собой красную клетку крови.

[189] Вариант осуществления 43. Способ по варианту осуществления 42, в котором красная клетка крови представляет собой эритроцит.

[190] Вариант осуществления 44. Способ по варианту осуществления 42, в котором красная клетка крови представляет собой ретикулоцит.

[191] Вариант осуществления 45. Способ по любому из вариантов осуществления 1-41, в котором безъядерная клетка представляет собой тромбоцит.

[192] Вариант осуществления 46. Способ по любому из вариантов осуществления 1-45, в котором безъядерная клетка представляет собой клетку млекопитающего.

[193] Вариант осуществления 47. Способ по любому из вариантов осуществления 1-46, в котором безъядерная клетка представляет собой клетку обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика.

[194] Вариант осуществления 48. Способ по любому из вариантов осуществления 1-46, в котором безъядерная клетка представляет собой клетку человека.

[195] Вариант осуществления 49. Способ по любому из вариантов осуществления 1-5, 8-14 и 22-48, в котором безъядерная клетка от индивидуума.

[196] Вариант осуществления 50. Способ по любому из вариантов осуществления 1-5, 8-14 и 22-48, в котором безъядерная клетка от другого индивидуума.

[197] Вариант осуществления 51. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген находится в клеточном лизате.

[198] Вариант осуществления 52. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген представляет собой чужеродный антиген.

[199] Вариант осуществления 53. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген представляет собой собственный антиген.

[200] Вариант осуществления 54. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген представляет собой антиген трансплантированного аллотрансплантата.

[201] Вариант осуществления 55. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген представляет собой белок или полипептид.

[202] Вариант осуществления 56. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген представляет собой лизат.

[203] Вариант осуществления 57. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген представляет собой микроорганизм.

[204] Вариант осуществления 58. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген представляет собой жидкий антиген.

[205] Вариант осуществления 59. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген представляет собой углеводный антиген.

[206] Вариант осуществления 60. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-59, в котором антиген представляет собой модифицированный антиген.

[207] Вариант осуществления 61. Способ по варианту осуществления 60, в котором модифицированный антиген содержит антиген, слитый с полипептидом.

[208] Вариант осуществления 62. Способ по варианту осуществления 60 или 61, в котором модифицированный антиген содержит антиген, слитый с терапевтическим средством.

[209] Вариант осуществления 63. Способ по варианту осуществления 60 или 61, в котором модифицированный антиген содержит антиген, слитый с направленным пептидом.

[210] Вариант осуществления 64. Способ по варианту осуществления 60 или 61, в котором модифицированный антиген содержит антиген, слитый с липидом.

[211] Вариант осуществления 65. Способ по варианту осуществления 60 или 61, в котором модифицированный антиген содержит антиген, слитый с углеводом.

[212] Вариант осуществления 66. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген представляет собой антиген, связанный с трансплантированной тканью.

[213] Вариант осуществления 67. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 5, 8-10 и 13-50, в котором антиген связан с вирусом.

[214] Вариант осуществления 68. Способ по любому из вариантов осуществления 1, 4, 10, 13 и 16-67, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с антигеном до, параллельно или после пропускания через сужение.

[215] Вариант осуществления 69. Способ по любому из вариантов осуществления 2-4, 7, 11-13 и 22-68, в котором толерогенный фактор содержит полипептид.

[216] Вариант осуществления 70. Способ по варианту осуществления 69, в котором полипептид представляет собой IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα или TGFβ.

[217] Вариант осуществления 71. Способ по варианту осуществления 69, в котором полипептид представляет собой терапевтический полипептид.

[218] Вариант осуществления 72. Способ по варианту осуществления 69, в котором полипептид представляет собой фрагмент терапевтического полипептида.

[219] Вариант осуществления 73. Способ по варианту осуществления 69, в котором полипептид представляет собой терапевтический пептид.

[220] Вариант осуществления 74. Способ по варианту осуществления 69, в котором полипептид конъюгируют с углеводом.

[221] Вариант осуществления 75. Способ по любому из вариантов осуществления 2-4, 7, 11-13 и 22-74, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с толерогенным фактором до, параллельно или после пропускания через сужение.

[222] Вариант осуществления 76. Способ по любому из варианта осуществления 1-75, в котором время полужизни безъядерной клетки уменьшают.

[223] Вариант осуществления 77. Способ по любому из варианта осуществления 1-75, в котором время полужизни безъядерной клетки увеличивают.

[224] Вариант осуществления 78. Способ по любому из варианта осуществления 1-6, 18 и 22-77, в котором иммунный ответ супрессируют по меньшей мере приблизительно на 10%, приблизительно на 15%, приблизительно на 20%, приблизительно на 25%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 75%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90% или приблизительно на 100%.

[225] Вариант осуществления 79. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-78, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженное продуцирование и/или секрецию одного или нескольких воспалительных цитокинов.

[226] Вариант осуществления 80. Способ по варианту осуществления 79, в котором один или несколько воспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона γ (IFNγ) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

[227] Вариант осуществления 81. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-78, в котором супрессированный иммунный ответ включает увеличенное продуцирование и/или секрецию одного или нескольких противовоспалительных цитокинов.

[228] Вариант осуществления 82. Способ по варианту осуществления 81, в котором один или несколько противовоспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα и трансформирующего фактора роста β (TGFβ).

[229] Вариант осуществления 83. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-78, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный T-клеточный ответ.

[230] Вариант осуществления 84. Способ по варианту осуществления 83, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную активацию T-клеток.

[231] Вариант осуществления 85. Способ по варианту осуществления 83 или 84, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную выживаемость T-клеток.

[232] Вариант осуществления 86. Способ по любому из вариантов осуществления 83-85, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную пролиферацию T-клеток.

[233] Вариант осуществления 87. Способ по любому из вариантов осуществления 83-86, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную функциональность T-клеток.

[234] Вариант осуществления 88. Способ по любому из вариантов осуществления 83-87, в котором сниженный T-клеточный ответ включает изменение фенотипа T-клеток.

[235] Вариант осуществления 89. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-88, в котором супрессированный иммунный ответ включает не костимулированную активацию T-клеток.

[236] Вариант осуществления 90. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-89, в котором супрессированный иммунный ответ включает усиленный ответ Treg.

[237] Вариант осуществления 91. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-90, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный B-клеточный ответ.

[238] Вариант осуществления 92. Способ по варианту осуществления 91, в котором сниженный B-клеточный ответ включает сниженное продуцирование антител.

[239] Вариант осуществления 93. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-92, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженное продуцирование цитокинов.

[240] Вариант осуществления 94. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-93, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный аутоиммунный ответ.

[241] Вариант осуществления 95. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-94, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный аллергический ответ.

[242] Вариант осуществления 96. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-95, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на трансплантированную ткань.

[243] Вариант осуществления 97. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-95, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный патогенный иммунный ответ на вирус.

[244] Вариант осуществления 98. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-95, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на терапевтическое средство.

[245] Вариант осуществления 99. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, 18 и 22-95, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на терапевтический носитель.

[246] Вариант осуществления 100. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15 и 19-77, в котором толерантность включает сниженное продуцирование и/или секрецию одного или нескольких воспалительных цитокинов.

[247] Вариант осуществления 101. Способ по варианту осуществления 100, в котором один или несколько воспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона γ (IFNγ) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

[248] Вариант осуществления 102. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15 и 19-77, в котором толерантность включает увеличенное продуцирование и/или секрецию одного или нескольких противовоспалительных цитокинов.

[249] Вариант осуществления 103. Способ по варианту осуществления 102, в котором один или несколько противовоспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα и трансформирующего фактора роста β (TGFβ).

[250] Вариант осуществления 104. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15 и 19-77, в котором толерантность включает сниженный T-клеточный ответ.

[251] Вариант осуществления 105. Способ по варианту осуществления 104, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную активацию T-клеток.

[252] Вариант осуществления 106. Способ по варианту осуществления 104 или 105, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную выживаемость T-клеток.

[253] Вариант осуществления 107. Способ по любому из вариантов осуществления 104-106, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную пролиферацию T-клеток.

[254] Вариант осуществления 108. Способ по любому из вариантов осуществления 104-107, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную функциональность T-клеток.

[255] Вариант осуществления 109. Способ по любому из вариантов осуществления 104-108, в котором сниженный T-клеточный ответ включает изменение фенотипа T-клеток.

[256] Вариант осуществления 110. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15, 19-77 и 104-109, в котором толерантность включает не костимулированную активацию T-клеток.

[257] Вариант осуществления 111. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15, 19-77 и 104-110, в котором толерантность включает усиленный ответ Treg.

[258] Вариант осуществления 112. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15, 19-77 и 104-111, в котором толерантность включает сниженный B-клеточный ответ.

[259] Вариант осуществления 113. Способ по варианту осуществления 112, в котором сниженный B-клеточный ответ включает сниженное продуцирование антител.

[260] Вариант осуществления 114. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15, 19-77 и 104-113, в котором толерантность включает сниженное продуцирование цитокинов.

[261] Вариант осуществления 115. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15, 19-77 и 104-114, в котором толерантность включает сниженный аутоиммунный ответ.

[262] Вариант осуществления 116. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15, 19-77 и 104-115, в котором толерантность включает сниженный аллергический ответ.

[263] Вариант осуществления 117. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15, 19-77 и 104-116, в котором толерантность включает сниженный иммунный ответ на трансплантированную ткань.

[264] Вариант осуществления 118. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15, 19-77 и 104-116, в котором толерантность включает сниженный патогенный иммунный ответ на вирус.

[265] Вариант осуществления 119. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15, 19-77 и 104-116, в котором толерантность включает сниженный иммунный ответ на терапевтическое средство.

[266] Вариант осуществления 120. Способ по любому из вариантов осуществления 10-15, 19-77 и 104-116, в котором толерантность включает сниженный иммунный ответ на терапевтический носитель.

[267] Вариант осуществления 121. Способ по любому из вариантов осуществления 1-120, в котором способ повторяют по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз.

[268] Вариант осуществления 122. Способ по варианту осуществления 121, в котором длительность времени между любыми двумя повторениями способа составляет по меньшей мере 1 сутки, 1 неделю, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев или 1 год.

[269] Вариант осуществления 123. Система, содержащая сужение, клеточную суспензию и антиген, для использования в способах по любому из вариантов осуществления 1, 4, 10, 13 и 16-120.

[270] Вариант осуществления 124. Система, содержащая сужение, клеточную суспензию и толерогенный фактор, для использования в способах по любому из вариантов осуществления 2-4, 7, 11-13 и 22-120.

ПРИМЕРЫ

[271] Следующие примеры приведены с целью иллюстрирования различных вариантов осуществления раскрытия и не предназначены ограничивать настоящее раскрытие каким-либо образом. Специалист в данной области без труда признает, что настоящее раскрытие хорошо адаптировано для осуществления целей и достижения указанных конечных результатов и преимуществ, а также тех целей, конечных результатов и преимуществ, неотъемлемых для настоящего описания. Изменения в этом и других использованиях, которые входят в сущность раскрытия, как определено объемом формулы изобретения, придут на ум специалистам в данной области.

Пример 1: Опосредованная сужением доставка декстрана и антитела IgG в RBC человека

ВВЕДЕНИЕ

[272] Для того чтобы оценивать опосредованную фильтром доставку молекул в безъядерные клетки, RBC человека, смешанные с флуоресцентными частицами декстрана или антителом IgG, пропускали через шприцевые фильтры, содержащие поры определенных размеров, и внутриклеточную доставку частиц оценивали через FACS анализ.

Материалы и способы

[273] Поликарбонатные мембранные фильтры с размером поры 2 мкм в диаметре с коммерческой комбинацией фильтра и держателя (фильтры COTS) получали из STERLITECH™. RBC человека выделяли из цельной крови или лейкоредукционного кольца с использованием способа разделения в градиенте фиколла и ресуспендировали в желаемой концентрации (50-500 M/мл) в Optimem. Поликарбонатный мембранный фильтр подвешивали в Optimem с использованием пинцета, чтобы увлажнять мембранный фильтр. Пластмассовый держатель фильтра открывали, фильтр помещали на внутреннюю поверхность с блестящей стороной, обращенной вверх, и держатель фильтра снова закрывали. Частицы декстрана и антитело IgG суспендировали 0,1 мг/мл. 1 мл клеток, смешанных с частицами декстрана или антителом IgG, добавляли в держатель фильтра при комнатной температуре. Вручную давление пальцем на шприц использовали, чтобы проводить клетки через фильтр. Прошедшее через фильтр собирали в 15 мл пробирку Falcon или пробирку FACS. Перед FACS анализом, все образцы центрифугировали и промывали три раза при 400 rcf в течение 4 минут при 4°C для того, чтобы удалять внеклеточные декстраны. Для подготовки к FACS анализу выполняли следующие стадии. Получали FACS буфер (PBS+конечная концентрация: 1% FBS+2 мМ EDTA) и в каждую пробирку добавляли 400 мкл FACS буфера и ресуспендировали клетки. Прямое рассеяние, боковое рассеяние при проточной цитометрии и напряжения флуоресцентного канала корректировали для того, чтобы визуализировать все клеточные события, и сообщали о≥10000 событий/образец. Клетки, смешанные с частицами декстрана или антителом IgG, но не прошедшие через фильтры, использовали в качестве контроля для доставки через эндоцитоз. Эти клетки имели контакт с красителем, но не проходили через фильтры. Все другие стадии для эндоцитозных контролей были аналогичными.

Результаты

[274] RBC, смешанные с 10 кДа частицами декстрана Alexa Fluor® 647 или 150 кДа антителом IgG, конъюгированным с Alexa Fluor® 647, пропускали через поры фильтра размером 2 мкм. Образцовые гистограммы проточной цитометрии, показывающие увеличенную доставку флуоресцентного декстрана и IgG после опосредованной сужением доставки (SQZ) в сравнении с эндоцитозным контролем, представлены на фиг. 1A и B. Эффективность доставки, как показывает процентная доля клеток, положительных по частицам декстрана, при доставке антитела IgG после фильтра, представлена на фиг. 2A. Эффективность доставки антитела IgG составляла 88,6%, и эффективность доставки частиц декстрана составляла 95,6% после фильтровальной доставки, по сравнению с <10% эффективностью доставки для обеих молекул в эндоцитозных контролях.

[275] Измеряли жизнеспособность клеток после фильтровальной доставки. Оценочная жизнеспособность клеток, как показывает процентная доля клеток, присутствующих в субпопуляции FSC и SSC после фильтровальной доставки, представлена на фиг. 2B. Оценочная жизнеспособность клеток, в которые доставляли антитело IgG, составляла 68,8%, и оценочная жизнеспособность клеток, в которые доставляли частицы декстрана, составляла 63,3% после фильтровальной доставки.

[276] Достигали опосредованной сужением доставки частиц декстрана и антитела IgG в RBC человека.

Пример 2: Опосредованная сужением доставка декстрана и антитела IgG в RBC мыши

ВВЕДЕНИЕ

[277] Для того чтобы оценивать опосредованную фильтром доставку молекул в безъядерные клетки, RBC мыши, смешанные с флуоресцентными частицами декстрана или антителом IgG, пропускали через шприцевые фильтры, содержащие поры определенного размера, и оценивали внутриклеточную доставку частиц через FACS анализ.

Материалы и способы

[278] Поликарбонатные мембранные фильтры с размером поры диаметром 1 мкм и 2 мкм с коммерческой комбинацией фильтра и держателя (фильтры COTS) получали из STERLITECH™. Цельную кровь центрифугировали и клетки ресуспендировали при желаемой концентрации (100-500 M/мл) в Optimem. Поликарбонатный мембранный фильтр подвешивали в Optimem с использованием пинцета, чтобы увлажнять мембранный фильтр. Пластмассовый держатель фильтра открывали, фильтр помещали на внутреннюю поверхность блестящей стороной обращенной вверх, и держатель фильтра закрывали. Суспендировали частицы декстрана и антитело IgG 0,1 мг/мл. 1 мл клеток, смешанных с частицами декстрана или антитело IgG, добавляли в держатель фильтра при комнатной температуре. Вручную давление пальцем на шприц использовали, чтобы проводить клетки через фильтр. Альтернативно используют систему с управляемым давлением для того, чтобы проводить 200 мкл клеток, смешанных с частицами декстрана или антителом IgG, через фильтр. Прошедшее через фильтр собирали в 15 мл пробирку Falcon или пробирку FACS. Перед FACS анализом, все образцы центрифугировали и промывали три раза при 1000 rfc в течение 10 минут при 24°C для того, чтобы удалять внеклеточные декстраны. Для подготовки к FACS анализу, выполняли следующие стадии. Получали FACS буфер (PBS+конечная концентрация: 1% FBS+2 мМ EDTA) и в каждую пробирку добавляли 400 мкл FACS буфера и ресуспендировали клетки. Прямое рассеяние, боковое рассеяние при проточной цитометрии и напряжения флуоресцентного канала корректировали для того, чтобы визуализировать все клеточные события, и сообщали о≥10000 событий/образец. Клетки, смешанные с частицами декстрана или антителом IgG, но не прошедшие через фильтры, использовали в качестве контроля для доставки через эндоцитоз. Эти клетки имели контакт с красителем, но не проходили через фильтры. Все другие стадии для эндоцитозных контролей аналогичны. NC образцы (без контакта) не имели контакта с красителем, но подвергались тем же стадиям, что и экспериментальные образцы, но не проходили через фильтры.

Результаты

[279] RBC мыши, смешанные с антителом IgG (150 кДа), пропускали через поры фильтра размером 1 мкм и 2 мкм с использованием давления ручного шприца. Образцовые гистограммы проточной цитометрии, изображающие флуоресценцию после опосредованной сужением доставки (SQZ), в сравнении с эндоцитозными (эндо), отрицательными контролями (NC) и контролями без материалов, представлены на фиг. 3A. Контроль «без материалов» не имел контакта с антителом IgG, но его подвергали тем же стадиям, что и экспериментальные образцы, и проходил через фильтр.

[280] Жизнеспособность клеток измеряли после фильтровальной доставки. Оценочная жизнеспособность клеток, как показывает процентная доля клеток, присутствующих в субпопуляции FSC и SSC, после фильтровальной доставки антитела IgG с использованием давления ручного шприца, представлена на фиг. 3B, причем опосредованная фильтром доставка снижает оценочную жизнеспособность на ~70% по сравнению с контролями, но ведет к повышенной в 4-12 раз эффективности доставки антитела IgG, как показано на фиг. 3C.

[281] RBC, смешанные с 70 кДа частицами декстрана Alexa Fluor® 488 и антителом IgG (150 кДа), конъюгированным с Alexa Fluor® 647, пропускали через поры фильтра размером 2 мкм с использованием системы с управляемым давлением на 2 фунтах/кв. дюйм, 4 фунтах/кв. дюйм, 6 фунтах/кв. дюйм, 10 фунтах/кв. дюйм, 20 фунтах/кв. дюйм или с использованием давления ручного шприца. Образцовые гистограммы проточной цитометрии представлены на фиг. 4A-I, изображающей флуоресценцию после опосредованной сужением доставки (SQZ - фиг. 4D-I) в сравнении с эндоцитозным (эндо - фиг. 4A), отрицательным контролем (NC - фиг. 4B) и контролем без материала (фиг. 4C). Эти данные показывали, что опосредованная фильтром доставка вела к вплоть до 55% увеличению доставки декстрана и IgG, относительно эндо, NC и контроля без материала. Также измеряли жизнеспособность клеток после фильтровальной доставки. Оценочная жизнеспособность клеток, как показывала процентная доля клеток, присутствующих в субпопуляции FSC и SSC, после фильтровальной доставки частиц декстрана, представлена на фиг. 5A. Эффективность доставки, как показывала процентная доля клеток, положительных по частицам декстрана или антителу IgG, после фильтровальной доставки представлена на фиг. 5B. Геометрическое средне флуоресценции после фильтровальной доставки частиц декстрана или антитела IgG представлено на фиг. 5C.

[282] RBC, смешанные с 70 кДа частицами декстрана Alexa Fluor® 488, пропускали через поры фильтра размером 2 мкм с использованием системы с управляемым давлением при 10 фунтах/кв. дюйм, 12 фунтах/кв. дюйм, 14 фунтах/кв. дюйм, 16 фунтах/кв. дюйм или 18 фунтах/кв. дюйм. Образцовые гистограммы проточной цитометрии, изображающие флуоресценцию после опосредованной сужением доставки (SQZ) в сравнении с эндоцитозным (эндо) и отрицательным (NC) контролями, представлены на фиг. 6A. Жизнеспособность клеток измеряли после фильтровальной доставки. Оценочная жизнеспособность клеток, как показывала процентная доля клеток, присутствующих в субпопуляции FSC и SSC, после фильтровальной доставки частиц декстрана, представлена на фиг. 6B. Эффективность доставки, как показывала процентная доля клеток, положительных по частицам декстрана после фильтровальной доставки, представлена на фиг. 6C. Геометрическое среднее флуоресценции после фильтровальной доставки частиц декстрана представлено на фиг. 6D.

[283] Достигали опосредованной сужением доставки частиц декстрана и антитела IgG в RBC мыши.

Пример 3: Опосредованная сужением доставка антигена в RBC для индуцирования толерантности

[284] Проводили серию экспериментов для того, чтобы демонстрировать индуцирование толерантности с использованием модельного антигена и трансгенных T-клеток.

[285] RBC смешивают с антигеном OVA и пропускают через сужение в микрожидкостном канале, или через поверхность, содержащую поры. Давление, температуру и композицию буфера оптимизируют для того, чтобы добиваться доставки. Затем OVA-нагруженные RBC вводят CD45.1 мыши с CFSE-меченными адоптивно перенесенными OT-I клетками. Альтернативно OT-I T-клетки активируют ex vivo перед переносом в CD45.1 мышь. Через 9 суток, чтобы сделать возможным толерогенное представление и последующую делецию T-клеток, мышей стимулируют растворимым OVA и LPS. Через 4 суток после стимуляции, селезенку и дренирующие лимфатические узлы анализируют на OT-I пролиферацию.

Пример 4: Опосредованная сужением доставка антигена в RBC для индуцирования толерантности

[286] Для того чтобы определять способность RBC, содержащих антиген, доставленный с помощью SQZ, индуцировать антиген-зависимую толерантность in vivo, с помощью проточной цитометрии измеряли число антигенспецифических T-клеток и уровни воспалительного цитокина IFNγ.

Материалы и способы

[287] Мышам-реципиентам C57BL/6J (CD45.1) адоптивно переносили 1 M OVA-специфических OT-I T-клеток на мышь от самок OT-I мышей-доноров (CD45.2) в сутки 0. В сутки 1 (примирование) и 6 (стимулирование) у мышей C57BL/6J собирали RBC, и RBC инкубировали с целым белком OVA или OVA доставляли с помощью условий фильтр-опосредованной SQZ, после чего следовала инъекция мышам-реципиентам 20-125 M RBC/мышь. Контрольные животные не получали инъекцию (наивные) или получали инъекцию с PBS (контроль стимула) или свободным OVA (10 мкг/животное - контроль толерантности). Антигенная стимуляция происходила в сутки 15 с использованием внутрикожной инъекции 10 мкг белка OVA+50 нг LPS/мышь у стимулированных животных, по сравнению с наивными (без антигена или LPS). OT-I T-клеточный ответ на антигенную стимуляцию измеряли с помощью проточной цитометрии числа OT-I T-клеток и внутриклеточного окрашивания IFNγ в сутки 19. Схема плана обработки представлена на фиг. 7, а группы обработки сведены в таблицу 1.

Таблица 1

Группа Сутки 0 Сутки 1 и 5 Сутки 15 Наивные Адоптивный перенос OT-I Контроль стимула Адоптивный перенос OT-I PBS OVA+LPS Контроль толерантности Адоптивный перенос OT-I Белок OVA OVA+LPS RBC эндо Адоптивный перенос OT-I RBC, которые инкубировали с OVA без сужения OVA+LPS RBC-SQZ Адоптивный перенос OT-I RBC, которые подвергали SQZ с использованием OVA и сужения OVA+LPS

Результаты

[288] Число OT-I-специфических T-клеток измеряли у мышей, которых стимулировали антигеном (OVA) и адъювантом (LPS), для групп, которые обрабатывали или с использованием RBC, которые инкубировали с белком OVA (RBC эндо) или подвергали внутриклеточной доставке белка OVA посредством SQZ (RBC-SQZ) (фиг. 8). Эти условия сравнивали у животных, которые не встречались с антигеном, адъювантом или RBC (наивные), или мышей, которых обрабатывали свободным белком OVA (контроль толерантности) или PBS (контроль стимула), после чего следовал стимул антигеном + адъювантом. Значительно снижали число OT-I T-клеток как в дренирующих лимфатических узлах, так и в селезенке (****P<0,0001), у мышей, примированных/стимулированных с использованием RBC, которые проходили SQZ с белком OVA, по сравнению с контролем стимула. Эти мыши показывали число OT-I T-клеток, схожее с наивными мышами или контролем толерантности, тогда как обработка с использованием RBC, которые инкубировали с белком OVA, не отличалась от контроля стимула.

[289] Для того чтобы оценивать функциональный эффект SQZ RBC-опосредованной толерантности, оказываемый на функцию T-клеток, % селезеночных T-клеток, которые экспрессировали высокие уровни IFNγ (фиг. 9, слева), и уровень продуцирования IFNγ на клетку (фиг. 9, справа; на основе всех CD44hi клеток) у OT-I T-клеток, повторно стимулированных пептидом SIINFEKL (SEQ ID № 1) (активный эпитоп OVA), оценивали для всех групп посредством внутриклеточного окрашивания цитокинов. OT-I T-клетки от мышей, которых обрабатывали с использованием RBC после опосредованной сужением доставки OVA, демонстрировали умеренное, но значимое, снижение среди клеток с высокой экспрессией IFNγ (**P<0,005) и выраженное снижение продуцирования IFNγ (****P<0,0001) по сравнению с контролем стимула, причем снижение более выражено, чем в контроле толерантности (свободный Ova; **P<0,005). Однако RBC, которые инкубировали с белком OVA, не демонстрировали снижение продуцирования IFNγ относительно контроля стимула.

[290] Репрезентативные проточные цитограммы (фиг. 10, сводка в таблице 2) для доли OT-I T-клеток среди всех CD8+ T-клеток и доли чувствительных к IFNγ T-клеток среди OT-I T-клеток показывают, что образцы RBC-SQZ имели меньше OT-I и более слабый IFNγ-ответ относительно контроля стимула и условий RBC эндо.

Таблица 2

Группа % OT-I специфических клеток % экспрессирующих IFNγ Наивные 0,49 7,07 Контроль стимула 8,13 76,0 Контроль толерантности 1,38 64,2 RBC эндо 11,7 75,8 RBC-SQZ 1,45 57,1

Пример 5: опосредованная CD4+/CD8+ толерантность

[291] Для того чтобы определять способность красных клеток крови (RBC), содержащих антиген, доставленный посредством SQZ, индуцировать CD4- и/или CD8-опосредованную T-клеточную антиген-зависимую толерантность in vivo, с помощью проточной цитометрии измеряют число антигенспецифических T-клеток и уровни воспалительного цитокина IFNγ.

Материалы и способы

[292] Мышам-реципиентам C57BL/6J (CD45.1+) адоптивно переносят 1 M OVA-специфических CD8+ OT-I и 2-4 M CD4+ OT-II T-клеток (и те и другие CD45.2+) на мышь от самок мышей-доноров в сутки 0. В сутки 1 (примирование) и 6 (стимулирование) у мышей C57BL/6J собирают RBC, и RBC инкубируют с целым белком OVA или OVA доставляют с помощью условий SQZ, после чего следует инъекция мышам-реципиентам 20-125 M RBC/мышь. Контрольные животные получают инъекцию или PBS (контроль стимула) или свободного OVA (10 мкг/животное - контроль толерантности). Антигенная стимуляция происходит в сутки 15 с использованием внутрикожной инъекции 10 мкг белка OVA+50 нг LPS/мышь стимулированным животным. Дренирующие лимфатические узлы и селезенки каждой мыши анализируют в сутки 19 и с помощью проточной цитометрии измеряют OT-I и OT-II T-клеточный ответ на антигенную стимуляцию по числу OT-I и OT-II T-клеток и анализам внутриклеточного окрашивания IFNγ и ELISpot. Схема репрезентативного плана обработки представлена на фиг. 7, а группы обработки сведены в таблицу 3.

Таблица 3

Группа Сутки 0 Сутки 1 и 5 Сутки 8 Контроль стимула Адоптивный перенос OT-I и OT-II PBS OVA+LPS Контроль толерантности Адоптивный перенос OT-I и OT-II Белок OVA OVA+LPS RBC эндо Адоптивный перенос OT-I и OT-II RBC, которые инкубировали с OVA без сужения OVA+LPS RBC-SQZ Адоптивный перенос OT-I и OT-II RBC, которые инкубировали с использованием OVA и сужения OVA+LPS

Пример 6A: профилактика в мышиной модели диабета I типа

Введение

[293] Для того чтобы определять способность RBC, содержащих антиген, доставленный посредством SQZ, индуцировать антиген-зависимую толерантность в профилактической модели мышиного диабета I типа in vivo, уровни глюкозы крови измеряют еженедельно с течением времени после индуцирования толерантности.

Материалы и способы

[294] Мышей NOD/ShiltJ обрабатывают с использованием RBC в возрасте 10 недель. В сутки 0 (примирование) и 5 (стимулирование), у мышей NOD/ShiltJ собирают RBC, и RBC инкубируют с пептидом 9-23 B-цепи инсулина (InsB9-23: CKKGSSHLVEALYLVCGERG, SEQ ID № 2) или InsB9-23 доставляют с помощью условий SQZ, после чего следует инъекция мышам-реципиентам 20-125 M RBC/мышь. Контрольные животные получают инъекцию PBS (контроль стимула). Измерения глюкозы крови осуществляют еженедельно, начиная с суток 7 после обработки (возраст 11 недель). Мышей считают больными диабетом, когда их уровень глюкозы крови превышает 260 мг/дл, как измеряют с помощью Bayer Contour Diabetes Meter/Glucose Test Strip. Схема репрезентативного плана обработки представлена на фиг. 11A, и группы обработки сведены в таблицу 4.

Таблица 4

Группа Сутки 0 и 5 Контроль стимула PBS APC эндо APC, которые инкубировали с InsB9-23 APC-SQZ APC, которые подвергали SQZ с InsB9-23

Пример 6B: терапия в мышиной модели диабета I типа

Введение

[295] Для того чтобы определять способность RBC, содержащих антиген, доставленный посредством SQZ, индуцировать антиген-зависимую толерантность в лечебной модели мышиного диабета I типа in vivo, уровни глюкозы крови измеряют еженедельно с течением времени после индуцирования толерантности у мышей.

Материалы и способы

[296] Чтобы индуцировать быстрое начало T1D у реципиентов, у мышей BDC2.5 NOD собирают CD4 T-клетки, активированные ex vivo с использованием пептида миметопа p31 (YVRPLWVRME, SEQ ID № 3), в течение 4 суток и адоптивно переносят (5 M клеток/мышь) нормогликемическим NOD реципиентам. Индуцирование толерантности начинают через 8 часов после адоптивного перенос и повторяют каждые 3 суток на протяжении всего 3 доз. Реципиентов обрабатывают с использованием PBS (контроль стимула) или 20-125 M RBC, которые инкубировали с p31 (RBC эндо) или в которые доставляли p31 посредством SQZ (RBC-SQZ). Глюкозу крови измеряют каждые сутки с помощью Bayer Contour Diabetes Meter/Glucose Test Strip. Мышей считают больных диабетом, когда их уровень глюкозы крови превышает 260 мг/дл. Схема репрезентативного плана обработки представлена на фиг. 11B, и группы обработки сведены в таблицу 5.

Таблица 5

Группа Сутки 0 и 5 Контроль стимула PBS APC эндо APC, которые инкубировали с InsB9-23 APC-SQZ APC, которые подвергали SQZ с InsB9-23

Пример 7A: профилактика при аутоиммунном нарушении типа MS у мышей

Введение

[297] Для того чтобы определять способность RBC, содержащих антиген, доставленный посредством SQZ, индуцировать антиген-зависимую толерантность в профилактической модели аутоиммунного нарушения типа MS у мышей in vivo, клиническую оценку подвижности определяют ежедневно с течением времени.

Материалы и способы

[298] Самок мышей C57BL/6 (в возрасте 10-12 недель) обрабатывают с использованием RBC перед индуцированием экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE). В сутки -7 (примирование) и -2 (стимулирование) у мышей C57BL/6 собирают RBC, и RBC инкубируют с пептидом 35-55 миелинового олигодендроцитарного гликопротеина (MOG35-55: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKGS, SEQ ID № 4) без сужения или пептидом OVA323-339 (отрицательный контроль: ISQAVHAAHAEINEAGRGS, SEQ ID № 5), или пептид MOG35-55 доставляют в RBC с помощью условий SQZ, после чего следует инъекция мышам-реципиентам 20-125 M RBC/мышь. В сутки 0 EAE индуцируют посредством введения MOG35-55 в CFA и токсина коклюша в PBS (набор Гука). Мышей оценивают ежедневно, начиная с суток 7, причем клиническую оценку определяют следующим образом: 1 - вялый хвост; 2 - частичный паралич задней ноги; 3 - полный паралич задней ноги; 4 - полный паралич задней и частичный передней ноги; и 5 - умирает. Схема репрезентативного плана обработки представлена на фиг. 12A, а группы обработки сведены в таблицу 6.

Таблица 6

Группа Сутки -7 Сутки 0 (индуцирование EAE) Контроль стимула APC, которые подвергали SQZ с OVA323-339 MOG35-55+токсин коклюша APC эндо APC, которые инкубировали с MOG35-55 MOG35-55+токсин коклюша APC-SQZ APC, которые подвергали SQZ с MOG35-55 MOG35-55+токсин коклюша

Пример 7B: терапия аутоиммунного нарушения типа MS у мышей

Введение

[299] Для того чтобы определять способность RBC, содержащих антиген, доставленный посредством SQZ, индуцировать антиген-зависимую толерантность в модели развившегося аутоиммунного нарушения типа MS у мышей in vivo, клиническую оценку подвижности оценивают ежедневно с течением времени.

Материалы и способы

[300] У самок мышей C57BL/6 (в возрасте 10-12 недель) индуцируют экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) посредством введения MOG35-55 в CFA и токсина коклюша в PBS (набор Гука) в сутки 0. Затем мышей обрабатывают с использованием RBC в сутки начала EAE, который возникает, когда мыши получают оценки ≥1 на основе следующих критериев подвижности. В сутки ~11/12 (примирование) и ~17/18 (стимулирование) у мышей C57BL/6 собирают RBC, и RBC инкубируют с пептидом 35-55 миелинового олигодендроцитарного гликопротеина (MOG35-55: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKGS, SEQ ID № 4) без сужения или пептидом OVA323-339 (отрицательный контроль: ISQAVHAAHAEINEAGRGS, SEQ ID № 5), или пептид MOG35-55 доставляют в RBC с помощью условий SQZ, после чего следует инъекция мышам-реципиентам 20-125 M RBC/мышь. Мышей оценивают ежедневно, начиная с суток 19, причем клиническую оценку определяют следующим образом: 1 - вялый хвост; 2 - частичный паралич задней ноги; 3 - полный паралич задней ноги; 4 - полный паралич задней и частичный передней ноги; и 5 - умирает. Схема репрезентативного плана обработки представлена на фиг. 12B, и группы обработки сведены в таблицу 7.

Таблица 7

Группа Сутки -7 Сутки 0 (индуцирование EAE) Контроль стимула APC, которые подвергали SQZ с OVA323-339 MOG35-55+токсин коклюша APC эндо APC, которые инкубировали с MOG35-55 MOG35-55+токсин коклюша APC-SQZ APC, которые подвергали SQZ с MOG35-55 MOG35-55+токсин коклюша

Список последовательностей

SEQ ID № Последовательность Описание 1 SIINFEKL CD8+ активный эпитоп OVA 2 CKKGSSHLVEALYLVCGERG Пептид 9-23 B-цепи (InsB9-23) 3 YVRPLWVRME Пептид миметопа p31 4 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKGS Пептид 35-55 миелинового олигодендроцитарного гликопротеина (MOG35-55) 5 ISQAVHAAHAEINEAGRGS Пептид OVA323-339

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и предусматривает способы индуцирования толерантности и/или супрессии иммунного ответа на антиген посредством пропускания клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и/или толерогенный фактор проникает в клетку. В некоторых вариантах осуществления безъядерную клетку доставляют индивидууму и антиген доставляют в толерогенное окружение и процессируют в нем, чтобы индуцировать толерантность и/или супрессировать иммунный ответ на антиген. 9 н. и 133 з.п.ф-лы, 12 ил., 7 табл., 7 пр.

1. Способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку; и

b. введение безъядерной клетки индивидууму,

где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки;

где указанный антиген процессирован и представлен в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

2. Способ индуцирования антигенспецифической толерантности у индивидуума, включающий:

a. пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в безъядерную клетку; и

b. введение безъядерной клетки индивидууму,

где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки;

где указанный антиген процессирован и представлен в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность на антиген.

3. Способ по п.2, в котором безъядерная клетка дополнительно содержит толерогенный фактор, и способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникают в безъядерную клетку; и где указанный толерогенный фактор способствует созданию толерогенной среды, которая подавляет иммунный ответ.

4. Способ по п.1, в котором безъядерная клетка дополнительно содержит толерогенный фактор, и способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникают в безъядерную клетку; и где указанный толерогенный фактор способствует созданию толерогенной среды, которая индуцирует толерантность.

5. Способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, который включает:

a. пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую безъядерную клетку, через сужение, где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в первую безъядерную клетку,

b. пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую безъядерную клетку, через сужение, где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки; где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает во вторую безъядерную клетку,

c. введение первой безъядерной клетки и второй безъядерной клетки индивидууму,

где указанный антиген процессирован и представлен в толерогенном окружении и где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген; и где указанный толерогенный фактор способствует созданию толерогенной среды, которая подавляет иммунный ответ.

6. Способ супрессии индуцирования антигенспецифической толерантности у индивидуума, который включает:

a. пропускание первой клеточной суспензии, содержащей первую безъядерную клетку, через сужение, где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки, где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникает в первую безъядерную клетку,

b. пропускание второй клеточной суспензии, содержащей вторую безъядерную клетку, через сужение, где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки; где указанное сужение деформирует клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что толерогенный фактор проникает во вторую безъядерную клетку,

c. введение первой безъядерной клетки и второй безъядерной клетки индивидууму,

где указанный антиген процессирован и представлен в толерогенном окружении и где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность на антиген; и где указанный толерогенный фактор способствует созданию толерогенной среды, которая индуцирует толерантность.

7. Способ супрессии иммунного ответа у индивидуума, включающий введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку, где указанный антиген процессирован и представлен в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

8. Способ индуцирования антигенспецифической толерантности у индивидуума, включающий введение безъядерной клетки индивидууму, где безъядерная клетка содержит антиген, где антиген вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген проникал в безъядерную клетку, где указанный антиген процессирован и представлен в толерогенном окружении, где представление указанного антигена в указанном толерогенном окружении индуцирует толерантность на антиген.

9. Способ по п.7, в котором безъядерная клетка содержит антиген и толерогенный фактор, где антиген и толерогенный фактор вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникали в безъядерную клетку, и где указанный толерогенный фактор способствует созданию толерогенной среды, которая подавляет иммунный ответ.

10. Способ по п.8, в котором безъядерная клетка содержит антиген и толерогенный фактор, где антиген и толерогенный фактор вводили в безъядерную клетку посредством пропускания безъядерной клетки через сужение, где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки, где указанное сужение деформировало клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникали в безъядерную клетку, и,где указанный толерогенный фактор способствует созданию толерогенной среды, которая индуцирует толерантность.

11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что антиген вводят в толерогенную среду.

12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что антиген и толерогенный фактор вводят в толерогенную среду.

13. Способ доставки антигена и толерогенного фактора в безъядерную клетку, включающий пропускание клеточной суспензии, содержащей безъядерную клетку, через сужение, где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки, где указанное сужение деформирует безъядерную клетку, тем самым вызывая возмущение в клетке так, что антиген и толерогенный фактор проникают в клетку, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с антигеном и толерогенным фактором.

14. Способ по п. 13, в котором процессинг и представление указанного антигена в толерогенном окружении супрессирует иммунный ответ на антиген.

15. Способ по п. 13, в котором процессинг и представление указанного антигена в толерогенном окружении индуцирует толерантность к антигену.

16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором по меньшей мере один дополнительный антиген вводят в клетку.

17. Способ по любому из пп. 2-6 и 9-16, в котором по меньшей мере один дополнительный толерогенный фактор вводят в клетку.

18. Способ по любому из пп. 1-12 и 14-17, в котором толерогенное окружение располагается в селезенке, печени или лимфатических узлах.

19. Способ по любому из пп. 1-18, где сужение находится в микрожидкостном канале.

20. Способ по любому из пп. 1-19, где канал имеет ширину сужения приблизительно от 0,25 мкм приблизительно до 4 мкм.

21. Способ по любому из пп. 1-20, где канал имеет ширину сужения приблизительно 4 мкм, 3,5 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 2,5 мкм, приблизительно 2 мкм, приблизительно 1,5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм или приблизительно 0,25 мкм.

22. Способ по любому из пп. 1-18, где сужение представляет собой пору или находится в поре.

23. Способ по п. 22, в котором пора находится в поверхности.

24. Способ по п. 23, в котором поверхность представляет собой фильтр.

25. Способ по п. 23, в котором поверхность представляет собой мембрану.

26. Способ по любому из пп. 22-25, в котором размер поры составляет приблизительно от 0,5 мкм приблизительно до 4 мкм.

27. Способ по любому из пп. 22-26, в котором размер поры составляет 4 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 2 мкм, приблизительно 1 мкм или приблизительно 0,5 мкм.

28. Способ по любому из пп. 1-27, в котором размер сужения составляет приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60% или приблизительно 70% от диаметра клетки.

29. Способ по любому из пп. 1-28, где способ осуществляют между приблизительно -5°C и приблизительно 45°C.

30. Способ по любому из пп. 1-6 и 13-29, в котором клеточная суспензия содержит смешанную популяцию клеток.

31. Способ по п. 30, в котором клеточная суспензия представляет собой цельную кровь.

32. Способ по любому из пп. 1-6 и 13-29, в котором клеточная суспензия содержит очищенную популяцию клеток.

33. Способ по п. 32, в котором клеточная суспензия содержит очищенную популяцию безъядерных клеток.

34. Способ по любому из пп. 1-6 и 13-33, в котором клеточная суспензия содержит клетки млекопитающих.

35. Способ по любому из пп. 1-6 и 13-34, в котором клеточная суспензия содержит клетки обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика.

36. Способ по любому из пп. 1-6 и 13-34, в котором клеточная суспензия содержит клетки человека.

37. Способ по любому из пп. 1-36, в котором безъядерная клетка представляет собой красную клетку крови.

38. Способ по п. 37, в котором красная клетка крови представляет собой эритроцит.

39. Способ по п. 37, в котором красная клетка крови представляет собой ретикулоцит.

40. Способ по любому из пп. 1-36, в котором безъядерная клетка представляет собой тромбоцит.

41. Способ по любому из пп. 1-40, в котором безъядерная клетка представляет собой клетку млекопитающего.

42. Способ по любому из пп. 1-41, в котором безъядерная клетка представляет собой клетку обезьяны, мыши, собаки, кошки, лошади, крысы, овцы, козы, свиньи или кролика.

43. Способ по любому из пп. 1-41, в котором безъядерная клетка представляет собой клетку человека.

44. Способ по любому из пп. 1-12 и 16-43, в котором безъядерная клетка от индивидуума.

45. Способ по любому из пп. 1-12 и 16-43, в котором безъядерная клетка от другого индивидуума.

46. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген находится в клеточном лизате.

47. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген представляет собой чужеродный антиген.

48. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген представляет собой собственный антиген.

49. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген представляет собой антиген трансплантированного аллотрансплантата.

50. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген представляет собой белок или полипептид.

51. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген представляет собой лизат.

52. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген представляет собой микроорганизм.

53. Способ по любому из пп. 1-45, 47 и 50, в котором антигеном является пищевой аллерген.

54. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген представляет собой жидкий антиген.

55. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген представляет собой углеводный антиген.

56. Способ по любому из пп. 1-55 в котором антиген представляет собой модифицированный антиген.

57. Способ по п. 56, в котором модифицированный антиген содержит антиген, слитый с полипептидом.

58. Способ по п. 56 или 57, в котором модифицированный антиген содержит антиген, слитый с терапевтическим средством.

59. Способ по п. 56 или 57, в котором модифицированный антиген содержит антиген, слитый с направленным пептидом.

60. Способ по п. 56 или 57, в котором модифицированный антиген содержит антиген, слитый с липидом.

61. Способ по п. 56 или 57, в котором модифицированный антиген содержит антиген, слитый с углеводом.

62. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген представляет собой антиген, связанный с трансплантированной тканью.

63. Способ по любому из пп. 1-45, в котором антиген связан с вирусом.

64. Способ по п.63, в котором вирусом является один или несколько из аденовируса и аденоассоциированного вируса, бакуловируса, вируса герпеса или ретровируса.

65. Способ по п.63, в котором вирусом является аденоассоциированный вирус.

66. Способ по любому из пп. 1-65, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с антигеном до, параллельно или после пропускания через сужение.

67. Способ по любому из пп. 2-6 и 9-66, в котором толерогенный фактор содержит полипептид.

68. Способ по п. 67, в котором полипептид представляет собой IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα или TGFβ.

69. Способ по п. 67, в котором полипептид представляет собой терапевтический полипептид.

70. Способ по п. 67, в котором полипептид представляет собой фрагмент терапевтического полипептида.

71. Способ по п. 67, в котором полипептид представляет собой терапевтический пептид.

72. Способ по п. 67, в котором полипептид конъюгируют с углеводом.

73. Способ по любому из пп. 2-6 и 9-72, где указанную клеточную суспензию приводят в контакт с толерогенным фактором до, параллельно или после пропускания через сужение.

74. Способ по любому из пп. 1-73, в котором время полужизни безъядерной клетки уменьшают.

75. Способ по любому из пп. 1-73, в котором время полужизни безъядерной клетки увеличивают.

76. Способ по любому из пп. 1-12, 14 и 16-75, в котором иммунный ответ супрессируют по меньшей мере приблизительно на 10%, приблизительно на 15%, приблизительно на 20%, приблизительно на 25%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 75%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90% или приблизительно на 100%.

77. Способ по любому из пп. 1-3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-76, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженное продуцирование и/или секрецию одного или нескольких воспалительных цитокинов.

78. Способ по п. 77, в котором один или несколько воспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона-гамма (IFNγ) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

79. Способ по любому из пп. 1-3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-76, в котором супрессированный иммунный ответ включает увеличенное продуцирование и/или секрецию одного или нескольких противовоспалительных цитокинов.

80. Способ по п. 79, в котором один или несколько противовоспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα и трансформирующего фактора роста β (TGFβ).

81. Способ по любому из пп. 1-3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-76, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный T-клеточный ответ.

82. Способ по п. 81, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную активацию T-клеток.

83. Способ по п. 81 или 82, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную выживаемость T-клеток.

84. Способ по любому из пп. 81-83, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную пролиферацию T-клеток.

85. Способ по любому из пп. 81-84, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную функциональность T-клеток.

86. Способ по любому из пп. 81-85, в котором сниженный T-клеточный ответ включает изменение фенотипа T-клеток.

87. Способ по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-86, в котором супрессированный иммунный ответ включает не костимулированную активацию T-клеток.

88. Способ по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-87, в котором супрессированный иммунный ответ включает усиленный ответ Treg.

89. Способ по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-88, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный B-клеточный ответ.

90. Способ по п. 89, в котором сниженный B-клеточный ответ включает сниженное продуцирование антител.

91. Способ по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-90, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженное продуцирование цитокинов.

92. Способ по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-91, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный аутоиммунный ответ.

93. Способ по п.92, в котором сниженный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ против антигена, связанного с диабетом I типа, ревматоидным артритом, псориазом, рассеянным склерозом, системной красной волчанкой, болезнью Шегрена, болезнью Крона, язвенным колитом или нейродегенеративным заболеванием, которое может иметь иммунный компонент.

94. Способ по п.93, в котором нейродегенеративным заболеванием является болезнь Альцгеймера, ALS, хорея Гентингтона или болезнь Паркинсона.

95. Способ по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-94, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный аллергический ответ.

96. Способ по п.95, в котором сниженный иммунный ответ включает сниженный аллергический ответ против пищевого аллергена.

97. Способ по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-96, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на трансплантированную ткань.

98. Способ по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-96, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный патогенный иммунный ответ на вирус.

99. Способ по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-96, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на терапевтическое средство.

100. Способ по п.99, в котором терапевтическое средство представляет собой фактор свертывания.

101. Способ по п.100, в котором фактор свертывания представляет собой фактор VIII и фактор IX.

102. Способ по п.99, в котором терапевтическое средство представляет собой гормон.

103. Способ по п.102, в котором гормон представляет собой инсулин, гормон роста человека или фолликулостимулирующий гормон.

104. Способ по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14 и 16-103, в котором супрессированный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ на терапевтический носитель.

105. Способ по п.104, в котором терапевтический носитель представляет собой вирус.

106. Способ по п.98 или 105, в котором вирусом является один или несколько из аденовируса и аденоассоциированного вируса, бакуловируса, вируса герпеса или ретровируса.

107. Способ по п.106 в котором вирусом является аденоассоциированный вирус.

108. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14 и 15-75, в котором толерантность включает сниженное продуцирование и/или секрецию одного или нескольких воспалительных цитокинов.

109. Способ по п. 108, в котором один или несколько воспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из интерлейкина-1 (IL-1), IL-12 и IL-18, фактора некроза опухоли (TNF), интерферона-гамма (IFNγ) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

110. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14 и 15-75, в котором толерантность включает увеличенное продуцирование и/или секрецию одного или нескольких противовоспалительных цитокинов.

111. Способ по п. 110, в котором один или несколько противовоспалительных цитокинов выбирают из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IFNα и трансформирующего фактора роста β (TGFβ).

112. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14 и 15-75, в котором толерантность включает сниженный T-клеточный ответ.

113. Способ по п. 112, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную активацию T-клеток.

114. Способ по п. 112 или 113, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную выживаемость T-клеток.

115. Способ по любому из пп. 112-114, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную пролиферацию T-клеток.

116. Способ по любому из пп. 112-115, в котором сниженный T-клеточный ответ включает сниженную функциональность T-клеток.

117. Способ по любому из пп. 112-116, в котором сниженный T-клеточный ответ включает изменение фенотипа T-клеток.

118. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 112-117, в котором толерантность включает не костимулированную активацию T-клеток.

119. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 112-118, в котором толерантность включает усиленный ответ Treg.

120. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 108-119, в котором толерантность включает сниженный B-клеточный ответ.

121. Способ по п. 120, в котором сниженный B-клеточный ответ включает сниженное продуцирование антител.

122. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 108-121, в котором толерантность включает сниженное продуцирование цитокинов.

123. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 108-122, в котором толерантность включает сниженный аутоиммунный ответ.

124. Способ по п.123, в котором сниженный иммунный ответ включает сниженный иммунный ответ против антигена, связанного с диабетом I типа, ревматоидным артритом, псориазом, рассеянным склерозом, системной красной волчанкой, болезнью Шегрена, болезнью Крона, язвенным колитом или нейродегенеративным заболеванием, которое может иметь иммунный компонент.

125. Способ по п.124, в котором нейродегенеративным заболеванием является болезнь Альцгеймера, ALS, хорея Гентингтона или болезнь Паркинсона.

126. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 108-125, в котором толерантность включает сниженный аллергический ответ.

127. Способ по п.126, в котором сниженный иммунный ответ включает сниженный аллергический ответ против пищевого аллергена.

128. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 108-127, в котором толерантность включает сниженный иммунный ответ на трансплантированную ткань.

129. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 108-127, в котором толерантность включает сниженный патогенный иммунный ответ на вирус.

130. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 108-127, в котором толерантность включает сниженный иммунный ответ на терапевтическое средство.

131. Способ по п.130, в котором терапевтическое средство представляет собой фактор свертывания.

132. Способ по п.131, в котором фактор свертывания представляет собой фактор VIII и фактор IX.

133. Способ по п.130, в котором терапевтическое средство представляет собой гормон.

134. Способ по п.133, в котором гормон представляет собой инсулин, гормон роста человека или фолликулостимулирующий гормон.

135. Способ по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 108-127, в котором толерантность включает сниженный иммунный ответ на терапевтический носитель.

136. Способ по п.135, в котором терапевтический носитель представляет собой вирус.

137. Способ по п.129 или 136, в котором вирусом является один или несколько из аденовируса и аденоассоциированного вируса, бакуловируса, вируса герпеса или ретровируса.

138. Способ по п.137, в котором вирусом является аденоассоциированный вирус.

139. Способ по любому из пп. 1-138, где способ повторяют по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз.

140. Способ по п. 139, в котором длительность времени между любыми двумя повторениями способа составляет по меньшей мере 1 сутки, 1 неделю, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев или 1 год.

141. Система для супрессии иммунного ответа у индивидуума, содержащая:

(a) сужение,

(b) клеточную суспензию, содержащую безъядерную клетку, и

(c) антиген или антиген и толерогенный фактор;

для использования в способах по любому из пп. 1, 3, 5, 7, 9, 11-12, 14, 16-107 и 139-140;

где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки.

142. Система для индуцирования антиген-специфической толерантности у индивидуума, содержащая:

(a) сужение,

(b) клеточную суспензию, содержащую безъядерную клетку, и

(c) антиген или антиген и толерогенный фактор;

для использования в способах по любому из пп. 2, 4, 6, 8, 10, 11-12, 14, 15-75 и 108-140;

где размер сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% диаметра безъядерной клетки.