КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ЛЕГОЧНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ Российский патент 2021 года по МПК A61K38/17 A61K38/35 A61K47/68 C07K14/71 A61P7/00 A61P11/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета согласно предварительным заявкам США с серийными номерами 62/362955, поданной 15 июля 2016 года; 62/453888, поданной 2 февраля 2017 года; и 62/510403, поданной 24 мая 2017 года. Раскрытия указанных заявок включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.

Предпосылки создания изобретения

Легочная гипертензия (ЛГ) представляет собой заболевание, характеризующееся высоким кровяным давлением в сосудистой сети легких, включая легочные артерии, легочные вены и легочные капилляры. Как правило, ЛГ определяется как среднее легочное артериальное (ЛА) давление ≥25 мм рт.ст. в состоянии покоя или ≥30 мм рт.ст. при физической нагрузке [Hill et al., Respiratory Care 54 (7): 958-68 (2009)]. Основным симптомом ЛГ является затрудненное дыхание или одышка, и другие симптомы включают усталость, головокружение, обмороки, периферические отеки (отек стопы, ног или лодыжек), посинение губ и кожи, боль в груди, стенокардию, головокружение при физическом напряжении, непродуктивный кашель, учащенный пульс и сердцебиение. ЛГ может быть тяжелым заболеванием, вызывающим сердечную недостаточность, которая является одной из наиболее распространенных причин смерти у людей с легочной гипертензией. Послеоперационная легочная гипертензия может быть осложнением многих видов хирургических операций или процедур и представляет проблему, связанную с высокой смертностью.

ЛГ можно классифицировать на основании различных проявлений заболевания, сходных по патофизиологическим механизмам, клиническим проявлениям и терапевтическим подходам [Simonneau et al., JACC 54 (1): S44-54 (2009)]. Клиническая классификация ЛГ была впервые предложена в 1973 году, а последняя обновленная клиническая классификация была одобрена Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) в 2008 году. Согласно обновленной клинической классификации ЛГ, существует пять основных групп ЛГ: легочная артериальная гипертензия (ЛАГ), характеризующаяся давлением заклинивания в ЛА ≤15 мм рт.ст.; ЛГ вследствие заболевания левых отделов сердца (также известная как легочная венозная гипертензия или застойная сердечная недостаточность), характеризующаяся давлением заклинивания в ЛА > 15 мм рт.ст.; ЛГ из-за заболеваний легких и/или гипоксии; хроническая тромбоэмболическая ЛГ; и ЛГ с неясной или многофакторной этиологией [Simonneau et al., JACC 54(1): S44-54 (2009); Hill et al., Respiratory Care 54(7): 958-68 (2009)]. ЛАГ дополнительно классифицируется как идиопатическая ЛАГ (ИЛАГ), спорадическое заболевание при отсутствии семейной истории ЛАГ или идентифицированного фактора риска; наследственная ЛАГ; индуцированная лекарственными средствами и токсинами ЛАГ; ЛАГ, ассоциированная с заболеваниями соединительной ткани, ВИЧ-инфекцией, портальной гипертензией, врожденными пороками сердца, шистосомозом и хронической гемолитической анемией; и персистирующая ЛГ новорожденных [Simonneau et al., JACC 54(1): S44-54 (2009)]. Диагностика различных типов ЛГ требует проведения серии анализов.

Как правило, лечение ЛГ зависит от причины или классификации ЛГ. Если ЛГ вызвана известным лекарственным средством или медицинским состоянием, она известна как вторичная ЛГ, и ее лечение обычно направлено на основное заболевание. Лечение легочной венозной гипертонии обычно включает оптимизацию функции левого желудочка путем введения диуретиков, бета-блокаторов и ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента или восстановления или замены митрального клапана или клапана аорты. Терапии ЛАГ включают легочные вазодилататоры, дигоксин, диуретики, антикоагулянты и кислородную терапию. Легочные вазодилататоры нацелены на различные пути, включая путь простациклина (например, простациклины, в том числе внутривенный эпопростенол, подкожный или внутривенный трепростинил и ингаляционный илопрост), путь оксида азота (например, ингибиторы фосфодиэстеразы-5, включая силденафил и тадалафил) и путь эндотолотелина-1 (например, антагонисты рецепторов эндотелина, включая пероральный бозентан и пероральный амбризентан) [Humbert, M. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 179:650-6 (2009); Hill et al., Respiratory Care 54(7):958-68 (2009)]. Однако существующие терапии не обеспечивают лечение ЛГ, и они не лечат непосредственно основную причину, такую как ремоделирование сосудов и мускуляризация кровеносных сосудов, наблюдаемую у многих пациентов с ЛГ.

Таким образом, существует огромная нереализованная потребность в эффективных терапиях легочной гипертензии. Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение способов лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести ЛГ, в частности, лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких ЛГ-ассоциированных осложнений.

Сущность изобретения

Отчасти данные, представленные в настоящей заявке, демонстрируют, что антагонисты(ингибиторы) GDF/BMP можно использовать для лечения легочной гипертензии. Например, было показано, что растворимый полипептид ActRIIA и гетеродимер ALK4:ActRIIB можно использовать индивидуально для снижения кровяного давления, сердечной гипертрофии и массы легких в модели монокроталин-индуцированной легочной артериальной гипертензии (ЛАГ). Аналогичные положительные эффекты наблюдали для полипептида ActRIIA в модели ЛАГ с Sugen гипоксией. Гистологический анализ также показал, что полипептид ActRIIA оказывал удивительное и существенное действие на уменьшение ремоделирования сосудов и мускуляризации кровеносных сосудов в обеих моделях монокротал-индуцированной и Sugen гипоксия-ассоциированной ЛАГ. Более того, и полипептид ActRIIA и гетеродимер ALK4:ActRIIB, к удивлению, имели больший эффект на улучшение различных осложнений ЛАГ по сравнению с силденафилом, который является препаратом, одобренным для лечения ЛАГ. Таким образом, настоящим изобретением установлено, что антагонисты сигнальных путей ActRII (ActRIIA и ActRIIB) можно использовать для уменьшения тяжести легочной гипертензии. Хотя растворимые полипептиды ActRIIa и гетеромультимеры ALK4:ActRIIB могут влиять на легочную гипертензию через механизм, отличный от антагонизма ActRIIA/B лигандов, настоящее раскрытие тем не менее демонстрирует, что желательные терапевтические средства можно выбрать на основании антагонистической активности в отношении сигналов ActRII. Поэтому, в некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает способы применения различных антагонистов сигнального пути ActRII для лечения гипертензии, особенно легочной гипертензии, в том числе, например, антагонистов, которые ингибируют один или несколько ActRIIA/B лигандов [например, активин (активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15 и BMP10]; антагонистов, которые ингибируют один или несколько рецепторов типа I и/или типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 и ALK5); и антагонистов, которые ингибируют один или несколько компонентов нисходящего сигнального пути (например, Smad белки, такие как Smad 2 и 3). В контексте настоящей заявки такие антагонисты сигнальных путей имеют общее название "антагонисты GDF/BMP" или "ингибиторы GDF/BMP". Соответственно, изобретение обеспечивает, частью, композиции антагонистов GDF/BMP и способы для лечения легочной гипертензии (например, ЛАГ), особенно для лечения одного или нескольких осложнений легочной гипертензии (например, повышенного кровяного давления, гипертрофии сердца, сосудистого ремоделирования и мускуляризации сосудов). Антагонисты GDF/BMP для использования в соответствии со способами и применениями по изобретению включают, например, ловушки для лигандов (например, растворимые полипептиды ActRIIA, полипептиды ActRIIB, ALK4:ActREB гетеродимеры, фоллистатиновые полипептиды и полипептиды FLRG), антитела-антагонисты, малые молекулы-антагонисты и нуклеотидные антагонисты. Необязательно, антагонисты GDF/BMP можно использовать в комбинации с одной или несколькими поддерживающими терапиями и/или дополнительными активными средствами для лечения легочной гипертензии.

В некоторых аспектах, изобретение относится к способам лечения легочной артериальной гипертензии, включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида ActRIIA. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% (например, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентична аминокислотной последовательности, которая начинается с любой из аминокислот 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 SEQ ID NO: 9 и заканчивается любой из аминокислот 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 или 135 SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% (например, по меньшей мере на 70%,75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% (например, по меньшей мере на 70%,75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA представляет собой слитый белок, включающий ActRIIA домен и один или несколько полипептидных доменов, которые гетерологичны ActRIIA. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA представляет собой слитый белок, включающий Fc домен иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления Fc домен иммуноглобулина представляет собой Fc домен IgG1 иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления ActRIIA слитый белок также включает линкерный домен, расположенный между полипептидным ActRIIA доменом и одним или несколькими гетерологичными доменами (например, Fc домен иммуноглобулина). В некоторых вариантах осуществления линкерный домен выбран из группы, состоящей из: TGGG (SEQ ID NO: 23), TGGGG (SEQ ID NO: 21), SGGGG (SEQ ID NO: 22), GGGGS (SEQ ID NO: 25), GGG (SEQ ID NO: 19), GGGG (SEQ ID NO: 20) и SGGG (SEQ ID NO: 24). В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA является частью гомодимерного белкового комплекса. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA является гликозилированным. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA имеет паттерн гликозилирования, получаемый путем экспрессии в клетке яичника китайского хомячка. В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает легочное артериальное давление у пациента. В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает легочное артериальное давление у пациента по меньшей мере на 10% (например, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или по меньшей мере 80%). В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает желудочковую гипертрофию у пациента. В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает желудочковую гипертрофию у пациента по меньшей мере на 10% (например, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или по меньшей мере 80%). В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает гипертрофию гладких мышц у пациента. В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает гипертрофию гладких мышц у пациента по меньшей мере на 10% (например, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или по меньшей мере 80%). В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает мускуляризацию легочных артериол у пациента. В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает мускуляризацию легочных артериол у пациента по меньшей мере на 10% (например, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или по меньшей мере 80%). В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает легочное сосудистое сопротивление у пациента. В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает легочное сосудистое сопротивление у пациента по меньшей мере на 10% (например, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или по меньшей мере 80%). В некоторых вариантах осуществления введение полипептида ActRIIA снижает легочное сосудистое сопротивление у пациента по меньшей мере на 25-30%. В некоторых вариантах осуществления пациент имеет легочную артериальную гипертензию и имеет легочную гипертензию функционального класса II или класса III в соответствии с системой функциональной классификации Всемирной Организации Здравоохранения для легочной гипертензии. В некоторых вариантах осуществления пациент имеет легочную артериальную гипертензию, которая классифицируется как один или несколько подтипов, выбранных из группы, состоящей из: идиопатической или наследственной легочной артериальной гипертензи, индуцированной лекарствами и/или токсинами легочной гипертензии, легочной гипертензии, ассоциированной с заболеванием соединительной ткани, и легочной гипертензии, ассоциированной с врожденными системно-легочными шунтами по меньшей мере через 1 год после восстановления шунта. В некоторых вариантах осуществления пациент принимал один или несколько вазодилататоров. В некоторых вариантах осуществления пациент принимал одно или несколько средств, выбранных из группы, состоящей из: ингибиторов фосфодиэстеразы 5 типа, стимуляторов растворимой гуанилатциклазы, агониста рецепторов простациклина и антагонистов рецепторов эндотелина. В некоторых вариантах осуществления одно или несколько средств выбраны из группы, состоящей из бозентана, силденафила, берапроста, мацитентана, селексипага, эпопростенола, трепростинила, илопроста, амбризентана и тадалафила. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение одного или нескольких вазодилататоров. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение одного или нескольких средств, выбранных из группы, состоящей из: ингибиторов фосфодиэстеразы 5 типа, стимуляторов растворимой гуанилатциклазы, агониста рецепторов простациклина и антагонистов рецепторов эндотелина. В некоторых вариантах осуществления одно или несколько средств выбраны из группы, состоящей из бозентана, силденафила, берапроста, мацитентана, селексипага, эпопростенола, трепростинила, илопроста, амбризентана и тадалафила. В некоторых вариантах осуществления пациент за 6 минут проходит расстояние от 150 до 400 метров. В некоторых вариантах осуществления способ увеличивает расстояние, которое пациент проходит за 6 минут, по меньшей мере на 10 метров (например, по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 или больше чем 400 метров). В некоторых вариантах осуществления пациент имеет уровень гемоглобина от >8 до <15 г/дл. В некоторых вариантах осуществления способ задерживает клиническое ухудшение легочной артериальной гипертензии. В некоторых вариантах осуществления способ задерживает клиническое ухудшение легочной гипертензии в соответствии с системой функциональной классификации Всемирной Организации Здравоохранения для легочной гипертензии. В некоторых вариантах осуществления способ снижает риск госпитализации из-за одного или нескольких осложнений, ассоциированных с легочной артериальной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIA связываются с одним или несколькими лигандами, выбранными из группы, состоящей из: активина A, активина B, GDF11, GDF8, BMP10 и BMP6.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения легочной гипертензии, включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP или комбинации антагонистов GDF/BMP. В некоторых аспектах изобретение относится к способам профилактики легочной гипертензии, включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP или комбинации антагонистов GDF/BMP. В некоторых аспектах изобретение относится к способам уменьшения скорости прогрессирования легочной гипертензии, включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP или комбинации антагонистов GDF/BMP. В некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает способ лечения интерстициального легочного заболевания, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP, где антагонист GDF/BMP ингибирует один или несколько из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и ALK7. В некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает способ лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких осложнений интерстициального легочного заболевания, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP, где антагонист GDF/BMP ингибирует один или несколько из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и ALK7. В некоторых вариантах осуществления интерстициальное легочное заболевание представляет собой идиопатический фиброз легких. В некоторых аспектах изобретение относится к способам уменьшения тяжести легочной гипертензии, включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP или комбинации антагонистов GDF/BMP. В некоторых аспектах изобретение относится к способам лечения одного или нескольких осложнений (например, пролиферация клеток гладких мышц и/или эндотелиальных клеток в легочной артерии, ангиогенез в легочной артерии, одышка, боль в груди, легочное сосудистое ремоделирование, гипертрофия правого желудочка и фиброз легких) легочной гипертензии, включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP или комбинации антагонистов GDF/BMP. В некоторых аспектах изобретение относится к способам профилактики одного или нескольких осложнений легочной гипертензии (например, пролиферация клеток гладких мышц и/или эндотелиальных клеток в легочной артерии, ангиогенез в легочной артерии, одышка, боль в груди, легочное сосудистое ремоделирование, гипертрофия правого желудочка и фиброз легких), включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP или комбинации антагонистов GDF/BMP. В некоторых аспектах изобретение относится к способам уменьшения скорости прогрессирования одного или нескольких осложнений легочной гипертензии (например, пролиферация клеток гладких мышц и/или эндотелиальных клеток в легочной артерии, ангиогенез в легочной артерии, одышка, боль в груди, легочное сосудистое ремоделирование, гипертрофия правого желудочка и фиброз легких), включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP или комбинации антагонистов GDF/BMP. В некоторых аспектах изобретение относится к способам уменьшения тяжести одного или нескольких осложнений легочной гипертензии (например, пролиферация клеток гладких мышц и/или эндотелиальных клеток в легочной артерии, ангиогенез в легочной артерии, одышка, боль в груди, легочное сосудистое ремоделирование, гипертрофия правого желудочка и фиброз легких), включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP или комбинации антагонистов GDF/BMP. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления способы, описанные в настоящей заявке, относятся к пациенту, имеющему легочную артериальную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящей заявке, относятся к пациенту, имеющему легочное артериальное давление (ЛАД) в состоянии покоя по меньшей мере 25 мм рт.ст. (например, по меньшей мере 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мм рт.ст.). В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящей заявке, снижают ЛАД у пациента, имеющего легочную гипертензию. Например, способ может снижать ЛАД по меньшей мере на 3 мм рт.ст. (например, по меньшей мере на 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20 или 25 мм рт.ст.) у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящей заявке, снижают легочное сосудистое сопротивление у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящей заявке, повышают давление заклинивания в капиллярах легочной артерии у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящей заявке, повышают конечное диастолическое давление в левом желудочке у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящей заявке, повышают (улучшают) способность переносить физические нагрузки (способность, переносимость) у пациента, имеющего легочную гипертензию. Например, способ может увеличивать проходимое за 6 минут пациентом, имеющим легочную гипертензию, расстояние, необязательно увеличивая проходимое за 6 минут расстояние по меньшей мере на 10 метров (например, по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или больше метров). Кроме того, способ может снижать индекс одышки Борга (BDI) у пациента, что необязательно можно оценивать после теста с 6-минутной ходьбой. В некоторых вариантах осуществления способ снижает индекс одышки Борга (BDI) у пациента по меньшей мере на 0,5 индексных пунктов (например, по меньшей мере на 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 индексных пунктов). В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящей заявке, относятся к пациенту, имеющему легочную гипертензию класса I, класса II, класса III или класса IV, согласно классификации Всемирной Организации Здравоохранения. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящей заявке, относятся к задержке клинического прогрессирования (ухудшения) легочной гипертензии (например, прогрессирования, определяемого на основании стандарта Всемирной Организации Здравоохранения). В некоторых вариантах осуществления способ предотвращает или задерживает прогрессирование класса легочной гипертензии (например, предотвращает или задерживает прогрессирование легочной гипертензии от класса I до класса II, от класса II до класса III или от класса III до класса IV, согласно классификации Всемирной Организации Здравоохранения). В некоторых вариантах осуществления способ промотирует или увеличивает регрессию класса легочной гипертензии (например, промотирует или увеличивает регрессию легочной гипертензии от класса IV до класса III, от класса III до класса II или от класса II до класса I, согласно классификации Всемирной Организации Здравоохранения). В некоторых вариантах осуществления пациенту также вводят одну или несколько поддерживающих терапий или активные средства для лечения легочной гипертензии в дополнение к одному или нескольким антагонистам GDF/BMP. Например, пациенту также можно вводить одну или несколько поддерживающих терапий или активные средства, выбранные из группы, состоящей из следующих: простациклин и его производные (например, эпопростенол, трепростинил и илопрост); агонисты простациклиновых рецепторов (например, селексипаг); агонисты эндотелиновых рецепторов (например, телин, амбрисентан, мацитентан и босентан); блокаторы кальциевых каналов (например, амлодипин, дилтиазем и нифедипин; антикоагулянты (например, варфарин); диуретики; кислородная терапия; предсердная септостомия; легочная тромбоэндартеректомия; ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (например, силденафил и тадалафил); активаторы растворимой гуанилатциклазы (например, цинацигват и риоцигват); ингибиторы ASK-1 (например, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-нафто[1,2,3-de]хинилин-2,7-дионы, NQDI-1; 2-тиоксо-тиазолидины, 5-бром-3-(4-оксо-2-тиоксо-тиазолидин-5-илиден)-1,3-дигидро-индол-2-он); антагонисты NF-κB (например, dh404, CDDO-эпоксид; 2,2-дифторпропионамид; С28 имидазол (CDDO-Im); 2-циано-3,12-диоксоолеан-1,9-диен-28овая кислота (CDDO); 3-ацетилолеаноловая кислота; 3-трифторацетилолеаноловая кислота; 28-метил-3-ацетилолеанан; 28-метил-3-трифторацетилолеанан; 28-метилоксиолеаноловая кислота; SZC014; SCZ015; SZC017; ПЭГилированные производные олеаноловой кислоты; 3-О-(бета-D-глюкопиранозил)олеаноловая кислота; 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловая кислота; 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→2)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловая кислота; 28-О-бета-D-глюкопиранозиловый эфир 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловой кислоты; 28-О-бета-D-глюкопиранозиловый эфир 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→2)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловой кислоты; 3-О-[а-L-рамнопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловая кислота; 28-О-бета-D-глюкопиранозиловый эфир 3-О-[альфа-L-рамнопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловой кислоты; 28-О-β-D-глюкопиранозил-олеаноловая кислота; 3-О-β-D-глюкопиранозил(1→3)-β-D- глюкопиранозидуроновая кислота (CS1); 3-О-β-D-глюкопиранозил(1→3)-β-D-глюкопиранозидуроновая кислота (CS2); метил 3,11-диоксоолеан-12-ен28-олат (DIOXOL); ZCVI₄-2; бензил 3-дегидрокси-1,2,5-оксадиазоло[3',4':2,3]олеанолат), легочная и/или сердечная трансплантация. В некоторых вариантах осуществления пациенту также можно вводить полипептид BMP9. В некоторых вариантах осуществления полипептид BMP9 представляет собой зрелый BMP9 полипептид. В некоторых вариантах осуществления полипептид BMP9 включает полипептид продомена BMP9. В некоторых вариантах осуществления полипептид BMF9 вводят в виде фармацевтического препарата, который необязательно может включать полипептид продомена BMP9. В таких BMP9 фармацевтических препаратах, включающих полипептид продомена BMP9, полипептид BMP9 может быть нековалентно ассоциирован с полипептидом продомена BMP9. В некоторых вариантах осуществления BMP9 фармацевтические препараты по существу не включают, или не включают, полипептид продомена BMP9. В некоторых вариантах осуществления пациенту также можно вводить олеаноловую кислоту или ее производное.

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере GDF11 (например, антагонист GDF11). Ингибирующие эффекты на GDF11 можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере GDF11. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере GDF11 с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют GDF11, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, полипептиды FLRG и ALK4:ActREB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует GDF11, может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере GDF8 (например, антагонист GDF8). Ингибирующие эффекты на GDF8 можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере GDF8. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере GDF8 с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют GDF8, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, полипептиды FLRG и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует GDF8, может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере GDF3 (например, антагонист GDF3). Ингибирующие эффекты на GDF3 можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере GDF3. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере GDF3 с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют GDF3, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, полипептиды FLRG и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует GDF3, может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере BMP6 (например, антагонист BMP6). Ингибирующие эффекты на BMP6 можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере BMP6. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов по изобретению может связываться с по меньшей мере GDF6 с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют BMP6, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, FLRG полипептиды и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует BMP6, может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере BMP15 (например, антагонист BMP15). Ингибирующие эффекты на BMP15 можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере BMP15. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере GDF11 с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют BMP15, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, FLRG полипептиды и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует BMP15, может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере BMP10 (например, антагонист BMP10). Ингибирующие эффекты на BMP10 можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере BMP10. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению связывается с по меньшей мере BMP10 с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют BMP10, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды и FLRG полипептиды и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры FLRG полипептиды), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует BMP10, может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE) (например, антагонист активина). Ингибирующие эффекты в отношении активина можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере активином. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению связывается с по меньшей мере активином с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют активин, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, FLRG полипептиды и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует активин, может также ингибировать один или несколько из следующих: BMP15 GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере активин B. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, по существу не связывается с активином A (например, связывается с активином A с K_D больше чем 10^-7 М или имеет относительно незначительное связывание, например, около 10^-8 М или около 10^-9 М) и/или не ингибирует активность активина A. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере активин B, но по существу не связывается с активином A (например, связывается с активином A с K_D больше чем 10^-7 М или имеет относительно незначительное связывание, например, около 10^-8 М или около 10^-9 М) и/или не ингибирует активность активина A.

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере ActRII (например, ActRIIA и/или ActRIIB) (например, антагонист ActRII). Ингибирующие эффекты на ActRII можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере ActRII. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению связывается с по меньшей мере ActRII с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют ActRII, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, FLRG полипептиды и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует ActRII, может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере ALK4 (например, антагонист ALK4). Ингибирующие эффекты на ALK4 можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере ALK4. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению связывается с по меньшей мере GDF11 с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют ALK4, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, FLRG полипептиды и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует ALK4, может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере ALK5 (например, антагонист ALK5). Ингибирующие эффекты на ALK5 можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере ALK5. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению связывается с по меньшей мере GDF11 с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют ALK5, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, FLRG полипептиды и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует ALK5, может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK7, ALK4 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3)

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере ALK7 (например, антагонист ALK7). Ингибирующие эффекты на ALK7 можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере ALK7. Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению связывается с по меньшей мере ALK7 с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют ALK7, можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, FLRG полипептиды и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует ALK7, может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5, ALK4 и один или несколько Smad (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой средство, которое ингибирует по меньшей мере один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). Ингибирующие эффекты в отношении Smad можно определить, например, с использованием клеточного анализа, включая анализы, описанные в настоящей заявке (например, репортерный анализ Smad сигнального пути). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению может связываться с по меньшей мере одним или несколькими Smad белками (например, Smad 2 и 3). Лиганд-связывающую активность можно определить, например, с использованием анализа аффинности связывания, включая анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, по изобретению связывается по меньшей мере с одним или несколькими Smad белками (например, Smad 2 и 3) с K_D по меньшей мере 1×10^-7 М (например, по меньшей мере 1×10^-8 М, по меньшей мере 1×10^-9 М, по меньшей мере 1×10^-10 М, по меньшей мере 1×10^-11 М или по меньшей мере 1×10^-12 М). Как описано в настоящей заявке, различные антагонисты GDF/BMP, которые ингибируют один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3), можно использовать в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, включая, например, ловушки для лигандов (например, полипептиды ActRII, ловушки GDF, фоллистатиновые полипептиды, FLRG полипептиды и ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), антитела, малые молекулы, нуклеотидные последовательности и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антагонист GDF/BMP, или комбинация антагонистов, который ингибирует один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3), может также ингибировать один или несколько из следующих: активин (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK5 и ALK4.

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой полипептид ActRII. Термин "полипептид ActRII " в общем смысле относится к природным полипептидам ActRIIA и ActRIIB, а также их усечениям и вариантам, таким как описанные в настоящей заявке (например, полипептиды-ловушки GDF). Предпочтительно полипептиды ActRII включают, состоят по существу из или состоят из диганд-связывающего домена полипептида ActRII или его модифицированной формы (варианта). Например, в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA включает, состоит по существу из или состоит из ActRIIA лиганд-связывающего домена полипептида ActRIIA, например, части внеклеточного домена ActRIIA. Подобным образом, полипептид ActRIIB может включать, состоять по существу из или состоять из ActRIIB лиганд-связывающего домена полипептида ActRIIB, например, части внеклеточного домена ActRIIB. Предпочтительно полипептиды ActRII для использования в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, являются растворимыми полипептидами.

В некоторых аспектах, изобретение относится к композициям, включающим полипептид ActRIIA, и их применениям. Например, в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA по изобретению включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности аминокислот 30-110 SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA по изобретению включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична части ActRIIA, начинающейся с остатка, соответствующего любой из аминокислот 21-30 (например, начинающейся с любой из аминокислот 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) SEQ ID NO: 9, и заканчивающейся в положении, соответствующем любой из аминокислот 110-135 (например, заканчивающейся любой из аминокислот 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 или 135) SEQ ID NO: 9. В других вариантах осуществления полипептид ActRIIA может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9. В других вариантах осуществления полипептид ActRIIA может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. В некоторых других вариантах осуществления полипептид ActRIIA может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых других вариантах осуществления полипептид ActRIIA может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA может включать, состоять по существу из или состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA может включать, состоять по существу из или состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39.

В других аспектах, изобретение относится к композициям, включающим полипептид ActRIIB, и их применениям. Например, в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB по изобретению включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности аминокислот 29-109 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности аминокислот 29-109 SEQ ID NO: 1, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту [природную (E или D) или искусственную кислую аминокислоту] в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности аминокислот 25-131 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности аминокислот 25-131 SEQ ID NO: 1, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, начинающейся в положении остатка, соответствующего любой из аминокислот 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 SEQ ID NO: 1, и заканчивающейся в положении остатка, соответствующего любой из аминокислот 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 или 134 SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, начинающейся в положении остатка, соответствующего любой из аминокислот 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 SEQ ID NO: 1, и заканчивающейся в положении остатка, соответствующего любой из аминокислот 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 или 134 SEQ ID NO: 1, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. В некоторых других вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. В некоторых других вариантах осуществления, ActRIIB полипептид может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В других вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 4. В других вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 5. В других вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 6. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 69. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 74. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 74, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 77, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. Еще в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 79. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIB может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 79, где полипептид ActRIIB включает кислую аминокислоту в положении 79 в соответствии с SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIB для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, не включают кислую аминокислоту в положении, соответствующем L79 SEQ ID NO: 1.

Как описано в настоящей заявке, полипептиды ActRII, полипептиды ALK4 и их варианты (ловушки GDF) могут представлять собой гомомультимеры, например, гомодимеры, гомотримеры, гомотетрамеры, гомопентамеры и гомомультимерные комплексы высшего порядка. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления полипептиды ActRII и их варианты являются гомодимерами. В некоторых вариантах осуществления ActRII полипептидные димеры, описанные в настоящей заявке, включают первый полипептид ActRII, ковалентно или нековалентно ассоциированный с вторым полипептидом ActRII, где первый полипептид включает ActRII домен и аминокислотную последовательность первого члена (или второго члена) взаимодействующей пары (например, константный домен иммуноглобулина), а второй полипептид включает полипептид ActRII и аминокислотную последовательность второго члена (или первого члена) взаимодействующей пары.

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой ALK4:ActRIIB гетеромультимер. Как описано в настоящей заявке, было обнаружено, что ALK4:ActRIIB гетеродимер белкового комплекса имеет другой профиль/селективность связывания с лигандом по сравнению с соответствующими ActRIIB и ALK4 гомодимерами. В частности, ALK4:ActRIIB гетеродимер демонстрирует повышенное связывание с активином B по сравнению с любым гомодимером, сохраняет сильное связывание с активином A, GDF8 и GDF11, как наблюдали с ActRIIB гомодимером, и демонстрирует по существу пониженное связывание с BMP9, BMP10 и GDF3. В частности, BMP9 демонстрирует от низкой до вообще не поддающейся определению аффинности в отношении ALK4:ActRIIB гетеродимера, тогда как этот лиганд сильно связывается с ActRIIB гомодимером. Подобно ActRIIB гомодимеру, ALK4:ActRIIB гетеродимер сохраняет промежуточный уровень связывания с BMP6. См. Фиг. 19. Эти результаты поэтому демонстрируют, что ALK4:ActRIIB гетеродимеры являются более селективными антагонистами (ингибиторами) активина A, активина B, GDF8 и GDF11 по сравнению с ActRIIB гомодимерами. Соответственно, ALK4:ActRIIB гетеродимер будет более полезным, чем ActRIIB гомодимер для некоторых применений, где такой селективный антагонизм является полезным. Примеры включают терапевтические применения, где желательно сохранить антагонизм одного или нескольких из активина (например, активина A, активина B, активина AB, активина AC), GDF8 и GDF11, но минимизировать антагонизм одного или нескольких из BMP9, BMP10 и GDF3. Кроме того, было показано, что ALK4:ActRIIB гетеродимер лечит ЛАГ у пациента. Не желая связывать это с конкретными механизмами действия, ожидают, что ALK4:ActRIIB гетеромультимеры, а также их варианты, которые связываются с по меньшей мере одним или несколькими из активина (например, активина A, активина B, активина AB и активина AC), GDF8 и/или GDF11, будут полезными средствами для промотирования полезных эффектов у пациентов с ЛАГ.

Поэтому настоящее изобретение обеспечивает гетеромультимерные комплексы (гетеромультимеры), включающие по меньшей мере один полипептид ALK4 и по меньшей мере один ActRIIB полипептид (ALK4:ActRIIB гетеромультимеры), а также их применения. Предпочтительно полипептиды ALK4 включают лиганд-связывающий домен ALK4 рецептора, например, часть внеклеточного домена ALK4. Подобным образом, полипептиды ActRIIB, как правило, включают лиганд-связывающий домен ActRIIB рецептора, например, часть внеклеточного домена ActRIIB. Предпочтительно, такие ALK4 и ActRIIB полипептиды, а также образуемые ими гетеромультимеры являются растворимыми.

В некоторых аспектах, ALK4:ActRIIB гетеромультимер включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 34-101 SEQ ID NO: 100. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимер включает ALK4 аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 101. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимер включает аминокислотную последовательность ALK4, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 105. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимер включает аминокислотную последовательность ALK4, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 122. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают аминокислотную последовательность ALK4, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 124. В других вариантах осуществления ALK4: ActRIIB гетеромультимеры включают аминокислотную последовательность ALK4, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 116. В некоторых других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимер включает аминокислотную последовательность ALK4, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 117. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают аминокислотную последовательность ALK4, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 111. В некоторых других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимер включает аминокислотную последовательность ALK4, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 113.

В некоторых аспектах, ALK4:ActRIIB гетеромультимер включает аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 29-109 SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимер включает аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 3. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 5. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимер включает аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 6. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 118. Еще в некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимер включает аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 120. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 114. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры могут включать аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 115. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 108. В других вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры могут включать аминокислотную последовательность ActRIIB, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 110. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры не включают ActRIIB полипептид, включающий кислую аминокислоту (например, E или D) в положении, соответствующем L79 SEQ ID NO: 1.

Как описано в настоящей заявке, ALK4:ActRIIB гетеромультимерные структуры включают, например, гетеродимеры, гетеротримеры, гетеротетрамеры, гетеропентамеры и гетеромультимерные комплексы высшего порядка. См., например, Фиг. 21-23. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры являются гетеродимерами. В некоторых аспектах, ALK4 и/или ActRIIB полипептиды могут представлять собой слитые белки.

В некоторых аспектах, полипептиды ActRII, полипептиды ALK4, включая их варианты (например, ловушки GDF), могут представлять собой слитые белки. Например, в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRII (или ALK4) может представлять собой слитый белок, включающий ActRII (или ALK4) полипептидный домен и один или несколько гетерологичных (не-ActRII) полипептидных доменов. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRII (или ALK4) может представлять собой слитый белок, который содержит, в качестве одного домена, аминокислотную последовательность, происходящую из ActRII (или ALK4) полипептида (например, лиганд-связывающий домен ActRII (или ALK4) рецептора или его вариант), и один или несколько гетерологичных доменов, которые обеспечивают желаемое свойство, такое как улучшенная фармакокинетика, более легкая очистка, целенаправленное воздействие на конкретные ткани и т.д. Например, домен слитого белка может повышать одно или несколько из следующих свойств: стабильность in vivo, период полужизни in vivo, поглощение/введение, локализация или дистрибуция в ткани, образование белковых комплексов, мультимеризация слитого белка и/или очистка. Необязательно, ActRII (или ALK4) полипептидный домен слитого белка соединен непосредственно (слит) с одним или несколькими гетерологичными полипептидными доменами, или промежуточная последовательность, такая как линкер, может быть расположена между аминокислотной последовательностью ActRII (или ALK4) полипептида и аминокислотной последовательностью одного или нескольких гетерологичных доменов. В некоторых вариантах осуществления ActRII (или ALK4) слитый белок включает относительно неструктурированный линкер, расположенный между гетерологичным доменом и ActRII (или ALK4) доменом. Этот неструктурированный линкер может соответствовать неструктурированной области примерно из 15 аминокислот в С-концевой части внеклеточного домена ActRII (или ALK4), или он может представлять собой искусственную последовательность между 3 и 15, 20, 30, 50 или больше аминокислот, которые относительно свободны от вторичной структуры. Линкер может содержать большое количество глициновых и/или пролиновых остатков и может, например, содержать повторяющиеся последовательности треонина/серина и глицинов. Примеры линкеров включают, но не ограничиваются этим, последовательности TGGG (SEQ ID NO: 23), SGGG (SEQ ID NO: 24), TGGGG (SEQ ID NO: 21), SGGGG (SEQ ID NO: 22), GGGGS (SEQ ID NO: 25), GGGG (SEQ ID NO: 20) и GGG (SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах осуществления ActRII (или ALK4) слитые белки могут включать константный домен иммуноглобулина, включая, например, Fc часть иммуноглобулина. Например, аминокислотную последовательность, которая происходит из Fc домена IgG (IgG1, JgG2, IgG3 или IgG4), IgA (IgA1 или IgA2), IgE или IgM иммуноглобулина. Например, Fc часть иммуноглобулинового домена может включать, состоять по существу из или состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична любой из SEQ ID NO: 14-18. Такие иммуноглобулиновые домены могут включать одну или несколько модификаций аминокислот (например, делеции, добавления и/или замены), которые придают измененную Fc активность, например, снижают одну или несколько Fc эффекторных функций. В некоторых вариант осуществления ActRII (или ALK4) слитый белок включает аминокислотную последовательность, описанную в формуле A-B-C. Например, B часть представляет собой усеченный по N- и С-концу полипептид ActRII (или ALK4), например, как описано в настоящей заявке. A и C части могут независимо представлять собой ноль, одну или больше чем одну аминокислоту, и обе части A и C гетерологичны B. A и/или C части могут быть присоединены к B части через линкерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления ActRII (или ALK4) слитый белок включает лидерную последовательность. Лидерная последовательность может представлять собой нативную лидерную последовательность ActRII (или ALK4) или гетерологичную лидерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления лидерная последовательность представляет собой лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (TPA) (например, SEQ ID NO: 34).

Полипептид ActRII или полипептид ALK4, включая их варианты, может включать субпоследовательность очистки, такую как эпитопная метка, FLAG метка, полигистидиновая последовательность и GST-слияние. Необязательно, полипептид ActRII или полипептид ALK4 включает один или несколько модифицированных аминокислотных остатков, выбранных из следующих: гликозилированная аминокислота, ПЭГилированная аминокислота, фарнезилированная аминокислота, ацетилированная аминокислота, биотинилированная аминокислота и/или аминокислота, конъюгированная с липидной группой. Полипептиды ActRII и полипептиды ALK4 могут включать по меньшей мере один N-связанный сахар, и могут включать два, три или больше N-связанных сахаров. Такие полипептиды также могут включать O-связанные сахара. Как правило, предпочтительно, когда полипептиды ActRII и ALK4 экспрессируются в клеточной линии млекопитающего, которая опосредует соответствующе природное гликозилирование полипептида, чтобы таким образом уменьшить вероятность неблагоприятного иммунного ответа у пациента. Полипептиды ActRII и ALK4 могут продуцироваться в различных клеточных линиях, которые гликозилируют белок так, как является подходящим для использования пациентом, включая сконструированные клетки насекомых или дрожжей и клетки млекопитающих, такие как COS клетки, CHO клетки, HEK клетки и NSO клетки. В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRII или ALK4 является гликозилированным и имеет паттерн гликозилирования, получаемый из линии клеток яичников китайского хомячка. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRII или ALK4 по изобретению демонстрируют период полужизни в сыворотке по меньшей мере 4, 6, 12, 24, 36, 48 или 72 часов у млекопитающего (например, мыши или человека). Необязательно, полипептиды ActRII или ALK4 могут демонстрировать период полужизни в сыворотке по меньшей мере 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25 или 30 дней у млекопитающего (например, мыши или человека).

В некоторых аспектах, изобретение обеспечивает фармацевтические препараты, включающие один или несколько антагонистов GDF/BMP по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтический препарат также может включать одно или несколько дополнительных активных средств, таких как соединение, которое используют для лечения легочной гипертензии, в частности, для лечения или профилактики одного или нескольких осложнений легочной гипертензии (например, пролиферации клеток гладких мышц и/или эндотелиальных клеток в легочной артерии, ангиогенеза в легочной артерии, одышки, боли в груди, легочного сосудистого ремоделирования, гипертрофии правого желудочка и фиброза легких), включая, например, вазодилататоры, такие как простациклин, эпопростенол и силденафил; агонисты эндотелиновых рецепторов, такие как босентан; блокаторы кальциевых каналов, такие как амлодипин, дилтиазем и нифедипин; антикоагулянты, такие как варфарин; диуретики; BMP9 полипептиды; BMP 10 полипептиды; бардоксолон метил; и олеаноловую кислоту. Как правило, фармацевтический препарат предпочтительно не содержит пирогенов (то есть не содержит пирогенов в той степени, которая требуется нормативными актами, регулирующими качество продуктов для терапевтического применения).

В некоторых случаях, когда вводят антагонист GDF/BMP, или комбинацию антагонистов, по изобретению для лечения расстройств или состояний, описанных в настоящей заявке, может быть желательно контролировать эффекты на эритроциты во время введения антагониста GDF/BMP или определить или скорректировать дозировку антагониста GDF/BMP, чтобы уменьшить нежелательные эффекты на эритроциты. Например, повышение уровня эритроцитов, уровня гемоглобина или уровня гематокрита может вызвать нежелательное повышение артериального давления.

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP для использования в соответствии со способами и применениями по изобретению представляет собой антитело или комбинацию антител. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с по меньшей мере ActRII (ActRIIA и/или ActRIIB). В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ActRII, ингибирует сигнальный путь ActRII, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ActRII, ингибирует связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов, рецепторов типа I или ко-рецепторов с ActRII. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ActRII, ингибирует связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов с ActRII, выбранных из группы, состоящей из: активина (например, активина A, активина B, активина C, активина AB, активина AC, активина BC, активина E, активина AE и активина BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP 10 и GDF3. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с по меньшей мере ALK4. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ALK4, ингибирует передачу сигнала ALK4, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ALK4, ингибирует связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов, рецепторов типа II или ко-рецепторов с ALK4. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ALK4, ингибирует связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов с ALK4, выбранных из группы, состоящей из активина (например, активина A, активина B, активина C, активина AB, активина AC, активина BC, активина E, активина AE и активина BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10 и GDF3. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с по меньшей мере ALK5. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ALK5, ингибирует передачу сигнала ALK5, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ALK5, ингибирует связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов, рецепторов типа II или ко-рецепторов с ALK5. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ALK5, ингибирует связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов с ALK5, выбранных из группы, состоящей из: активина (например, активина A, активина B, активина C, активина AB, активина AC, активина BC, активина E, активина AE и активина BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10 и GDF3. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с по меньшей мере ALK7. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ALK7, ингибирует передачу сигнала ALK7, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ALK7, ингибирует связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов, рецепторов типа II или ко-рецепторов с ALK7. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ALK7, ингибирует связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов с ALK7, выбранных из группы, состоящей из: активина (например, активина A, активина B, активина C, активина AB, активина AC, активина BC, активина E, активина AE и активина BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP 10 и GDF3. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с по меньшей мере GDF11. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с GDF11, ингибирует сигнальный путь ActRII, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с GDF11, ингибирует связывание GDF11-ActRII и/или связывание GDF11-ALK (например, связывание GDF11-ALK4, GDF11-ALK5 и/или GDF11-ALK7). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с по меньшей мере GDF8. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с GDF8, ингибирует сигнальный путь ActRII, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с GDF8, ингибирует связывание GDF8-ActRII и/или связывание GDF8-ALK (например, связывание GDF8-ALK4, GDF8-ALK5 и/или GDF8-ALK7). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с по меньшей мере BMP6. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с BMP6, ингибирует сигнальный путь ActRII, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с BMP6, ингибирует связывание BMP6-ActRII и/или связывание BMP6-ALK (например, связывание BMP6-ALK4, BMP6-ALK5 и/или BMP6-ALK7). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с по меньшей мере BMP15. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с BMP15, ингибирует сигнальный путь ActRII, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с BMP15, ингибирует связывание BMP15-ActRII и/или связывание BMP15-ALK (например, связывание BMP15-ALK4, BMP15-ALK5 и/или BMP15-ALK7). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с по меньшей мере GDF3. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с GDF3, ингибирует сигнальный путь ActRII, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с GDF3, ингибирует связывание GDF3-ActRII и/или связывание GDF3-ALK (например, связывание GDF3-ALK4, GDF3-ALK5 и/или GDF3-ALK7). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с по меньшей мере BMP10. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с BMP10, ингибирует сигнальный путь ActRII, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с BMP10, ингибирует связывание BMP10-ActRII и/или связывание BMP10-ALK (например, связывание BMP10-ALK4, BMP10-ALK5 и/или BMP10-ALK7). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с активином (например, активином A, активином B, активином C, активином AB, активином AC, активином BC, активином E, активином AE и активином BE). В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с активином (например, активином A, активином B, активином C, активином AB, активином AC, активином BC, активином E, активином AE и активином BE), ингибирует сигнальный путь ActRII, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с активином (например, активином A, активином B, активином C, активином AB, активином AC, активином BC, активином E, активином AE и активином BE), ингибирует связывание активин-ActRII и/или связывание активин-ALK (например, связывание активин-ALK4, активин-ALK5 и/или активин-ALK7). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с активином B. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с активином B, ингибирует сигнальный путь ActRII, необязательно как измерено в клеточном анализе, таком как анализы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с активином B, ингибирует связывание активин B-ActRII и/или связывание активин B-ALK (например, связывание активин B-ALK4, активин B-ALK5 и/или активин B-ALK7). В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой мультиспецифическое антитело, или комбинацию мультиспецифических антител, которое связывается с одним или несколькими из ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK5, ALK7, GDF11, GDF8, активина, BMP6, GDF3, BMP10 и BMP15. В некоторых аспектах, мультиспецифическое антитело или комбинация мультиспецифических антител ингибирует передачу сигнала в клеточном анализе одного или нескольких из: ActRIIB, GDF11, GDF8, активина, BMP6, GDF3, BMP 10 и BMP15. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой одноцепочечное антитело, F(ab')₂ фрагмент, одноцепочечное диатело, тандемный одноцепочечный Fv фрагмент, тандемное одноцепочечное диатело или слитый белок, включающий одноцепочечное диатело и по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина.

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP представляет собой низкомолекулярный ингибитор или комбинацию низкомолекулярных ингибиторов. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере ActRII (например, ActRIIA и/или ActRIIB). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере ALK4. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере ALK5. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере ALK7. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере GDF11. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере GDF8. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере BMP6. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере BMP15. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере BMP10. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере GDF3. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере активина (например, активина A, активина B, активина C, активина AB, активина AC, активина BC, активина E, активина AE и активина BE). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере активина B. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере одного или нескольких Smad белков (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP представляет собой нуклеиновокислотный ингибитор или комбинацию нуклеиновокислотных ингибиторов. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере ActRII (например, ActRIIA и/или ActRIIB). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере ALK4. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере ALK5. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере ALK7. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере GDF11. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере GDF8. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере BMP6. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере BMP15. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере BMP10. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере GDF3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере активина (например,активина A, активина B, активина C, активина AB, активина AC, активина BC, активина E, активина AE и активина BE). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере активина B. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновокислотный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере одного или нескольких Smad (например, Smad 2 и 3).

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP представляет собой фоллистатиновый полипептид. В некоторых вариантах осуществления фоллистатиновый полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления фоллистатиновый полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления фоллистатиновый полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления фоллистатиновый полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления фоллистатиновый полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30.

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP представляет собой FLRG полипептид. В некоторых вариантах осуществления FLRG полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает выравнивание внеклеточных доменов человеческого ActRIIB (SEQ ID NO: 2) и человеческого ActRIIA (SEQ ID NO: 10) с остатками, которые установлены в настоящем изобретении, на основании полного анализа различных ActRIIB и ActRIIA кристаллических структур, для непосредственного контакта с лигандом, указанным в рамках.

Фиг. 2 показывает множественное выравнивание последовательностей различных ActRIIB белков позвоночных (SEQ ID NO: 53-58) и человеческого ActRIIA (SEQ ID NO: 59), а также консенсусную ActRII последовательность, выведенную из выравнивания (SEQ ID NO: 60).

Фиг. 3 показывает множественное выравнивание последовательностей различных ActRIIA белков позвоночных и человеческого ActRIIA (SEQ ID NO: 61-68).

Фиг. 4 показывает множественное выравнивание последовательностей Fc доменов из человеческих IgG изотипов с использованием Clustal 2.1. Шарнирные области подчеркнуты пунктирной линией. Двойное подчеркивание указывает примеры положений, сконструированных в IgG1 Fc для промотирования асимметричного спаривания цепей, и соответствующие положения в отношении других изотипов IgG2, IgG3 и IgG4.

Фиг. 5 показывает очистку ActRIIA-hFc, экспрессированного в CHO клетках. Белок очищается в виде единственного четко определенного пика, как показано колоночной хроматографией с распределением по размерам (верхняя панель) и ДСН-ПААГ с кумасси окрашиванием (нижняя панель) (левый ряд: молекулярно-массовые стандарты; правый ряд: ActRIIA-hFc).

Фиг. 6 показывает связывание ActRIIA-hFc с активином (верхняя панель) и GDF-11 (нижняя панель), измеренное при помощи Biacore™ анализа.

Фиг. 7 показывает полную, непроцессированную аминокислотную последовательность для ActRIIB(25-131)-hFc (SEQ ID NO: 69). TPA лидер (остатки 1-22) и внеклеточный домен дважды усеченного ActRIIB (остатки 24-131, с использованием нумерации на основании нативной последовательности в SEQ ID NO: 1) подчеркнуты. Выделен глутамат, выявленный путем секвенирования как являющийся N-концевой аминокислотой зрелого слитого белка, который находится в положении 25 относительно SEQ ID NO: 1.

Фиг. 8A и 8B показывают нуклеотидную последовательность, кодирующую ActRIIB(25-131)-hFc (кодирующая цепь показана наверху, SEQ ID NO: 70, а комплемент показан внизу 3'-5', SEQ ID NO: 71). Последовательности, кодирующие TPA лидер (нуклеотиды 1-66) и внеклеточный домен ActRIIB (нуклеотиды 73-396) подчеркнуты. Также показана соответствующая аминокислотная последовательность для ActRIIB(25-131).

Фиг. 9A и 9B показывают альтернативную нуклеотидную последовательность, кодирующую ActRIIB(25-131)-hFc (кодирующая цепь показана наверху, SEQ ID NO: 72, а комплемент показан внизу 3'-5', SEQ ID NO: 73). Эта последовательность обеспечивает больший уровень экспрессии белка в исходных трансформантах, ускоряя процесс развития клеточной линии. Последовательности, кодирующие TPA лидер (нуклеотиды 1-66) и внеклеточный домен ActRIIB (нуклеотиды 73-396) подчеркнуты, и выделены замены в нуклеотидной последовательности ECD дикого типа (см. Фиг. 8). Также показана соответствующая аминокислотная последовательность для ActRIIB(25-131).

Фиг. 10 показывает полную аминокислотную последовательность для ActRIIB (L79D 20-134)-hFc (SEQ ID NO: 74) ловушки GDF, включающую TPA лидерную последовательность (двойное подчеркивание), внеклеточный домен ActRIIB (остатки 20-134 в SEQ ID NO: 1; одинарное подчеркивание) и hFc домен. Замена аспартатом в положении 79 в нативной последовательности подчеркнута двумя линиями и выделена, также как и глицин, выявленный путем секвенирования как являющийся N-концевым остатком в зрелом слитом белке.

Фиг. 11A и 11B показывают нуклеотидную последовательность, кодирующую ActRIIB(L79D 20-134)-hFc. SEQ ID NO: 75 соответствует смысловой цепи, а SEQ ID NO: 76 соответствует антисмысловой цепи. TPA лидер (нуклеотиды 1-66) подчеркнут двумя линиями, а ActRIIB внеклеточный домен (нуклеотиды 76-420) подчеркнут одной линией.

Фиг. 12 показывает полную аминокислотную последовательность для усеченного ActRIIB (L79D 25-131)-hFc ловушки GDF (SEQ ID NO: 77), включающую TPA лидер (двойное подчеркивание), внеклеточный домен усеченного ActRIIB (остатки 25-131 в SEQ ID NO: 1; одинарное подчеркивание) и hFc домен. Замена аспартатом в положении 79 в нативной последовательности подчеркнута двумя линиями и выделена, также как и глутамат, выявленный путем секвенирования как являющийся N-концевым остатком в зрелом слитом белке.

Фиг. 13 показывает аминокислотную последовательность для усеченного ActRIIB(L79D 25-131)-hFc ловушки GDF без лидерной последовательности (SEQ ID NO: 78). Внеклеточный домен усеченного ActRIIB(остатки 25-131 в SEP ID NO: 1) подчеркнут. Замена аспартатом в положении 79 в нативной последовательности подчеркнута двумя линиями и выделена, также как и глутамат, выявленный путем секвенирования как являющийся N-концевым остатком в зрелом слитом белке.

Фиг. 14 показывает аминокислотную последовательность для усеченного ActRIIB(L79D 25-131) ловушки GDF без лидерной последовательности, hFc домена и линкера (SEQ ID NO: 79). Замена аспартатом в положении 79 в нативной последовательности выделена, также как и глутамат, выявленный путем секвенирования как являющийся N-концевым остатком в зрелом слитом белке.

Фиг. 15A и 15B показывают нуклеотидную последовательность, кодирующую ActRIIB(L79D 25-131)-hFc. SEQ ID NO: 80 соответствует смысловой цепи, а SEQ ID NO: 81 соответствует антисмысловой цепи. TPA лидер подчеркнута двумя линиями (нуклеотиды 1-66), а внеклеточный домен усеченного ActRIIB(нуклеотиды 76-396) подчеркнут одной линией. Также показана аминокислотная последовательность для внеклеточного домена ActRIIB (остатки 25-131 в SEQ ID NO: 1).

Фиг. 16A и 16B показывают альтернативную нуклеотидную последовательность, кодирующую ActRIIB(L79D 25-131)-hFc. SEQ ID NO: 82 соответствует смысловой цепи, а SEQ ID NO: 83 соответствует антисмысловой цепи. TPA лидер (нуклеотиды 1-66) подчеркнут двумя линиями, внеклеточный домен усеченного ActRIIB (нуклеотиды 76-396) подчеркнут, и замены в нуклеотидной последовательности дикого типа внеклеточного домена подчеркнуты двумя линиями и выделены (ср. с SEQ ID NO: 81, Фиг. 15). Также показана аминокислотная последовательность для внеклеточного домена ActRIIB (остатки 25-131 в SEQ ID NO: 1).

Фиг. 17 показывает нуклеотиды 76-396 (SEQ ID NO: 84) альтернативной нуклеотидной последовательности, показанной на Фиг. 16 (SEQ ID NO: 82). Такие же нуклеотидные замены, которые указаны на Фиг. 16, также подчеркнуты и выделены. SEQ ID NO: 84 кодирует только внеклеточный домен усеченного ActRIIB (соответствующий остаткам 25-131 в SEQ ID NO: 1) с L79D заменой, например, ActRIIB(L79D 25-131).

Фиг. 18 показывает множественное выравнивание последовательностей ALK4 белков различных позвоночных и человеческого ALK4 (SEQ ID NO: 126-132).

Фиг. 19 представляет сравнительные данные связывания лигандов для ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимерного белкового комплекса по сравнению с ActRIIB-Fc гомодимером и ALK4-Fc гомодимером. Для каждого белкового комплекса лиганды классифицированы по k_off, конатанты скорости реакции, которая тесно коррелирует с ингибированием лиганд-опосредованной передачи сигнала, и перечислены в порядке уменьшения аффинности связывания (наиболее сильно связанные лиганды указаны наверху). Слева желтая, красная, зеленая и синяя линии указывают величину константы скорости диссоциации. Жирные черные линии указывают лиганды, связывание которых с гетеродимером повышается или остается неизменным по сравнению с гомодимером, тогда как пунктирные красные линии указывают по существу пониженное связывание по сравнению с гомодимером. Как показано, ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимер демонстрирует повышенное связывание с активином B по сравнению с любым гомодимером, сохраняет сильное связывание с активином A, GDF8 и GDF11, как наблюдали с ActRIIB-Fc гомодимером, и демонстрирует по существу пониженное связывание с BMP9, BMP10 и GDF3. Подобно ActRIIB-Fc гомодимеру, гетеродимер сохраняет средний уровень связывания с BMP6.

Фиг. 20 представляет сравнительные ИК₅₀ данные ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимер/ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc гомодимер, определенные при помощи анализа репортерного гена A-204, как описано в настоящей заявке. ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимер ингибирует сигнальные пути активина A, активина B, GDF8 и GDF11 подобно ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc гомодимеру. Однако ингибирование ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимером сигнальных путей BMP9 и BMP10 существенно ниже по сравнению с ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc гомодимером. Эти данные демонстрируют, что ALK4:ActRIIB гетеродимеры являются более селективными антагонистами активина A, активина B, GDF8 и GDF11 по сравнению с соответствующими ActRIIB:ActRIIB гомодимерами.

Фиг. 21A и 21B представляют два схематических примера гетеромерных белковых комплексов, включающих полипептиды рецептора типа I и рецептора типа II. Фиг. 21A показывает гетеродимерный белковый комплекс, включающий один слитый полипептид рецептора типа I и один слитый полипептид рецептора типа II, который может быть собран ковалентно или нековалентно через домен мультимеризации, содержащийся в каждой полипептидной цепи. Два собранных домена мультимеризации составляют взаимодействующую пару, которая может быть управляемой или неуправляемой. Фиг. 21B показывает гетеротетрамерный белковый комплекс, включающий два гетеродимерных комплекса, как показано на Фиг. 21A. Могут предусматриваться комплексы высшего порядка.

Фиг. 22 представляет схематический пример гетеромерного белкового комплекса, включающего полипептид рецептора типа I (указан как "I") (например, полипептид, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен внеклеточному домену белка ALK4 человека или других видов, например, которые описаны в настоящей заявке) и полипептид рецептора типа II (указан как "II") (например, полипептид, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен внеклеточному домену белка ActRIIB человека или других видов, например, которые описаны в настоящей заявке). В проиллюстрированных вариантах осуществления полипептид рецептора типа I является частью слитого полипептида, который включает первый член взаимодействующей пары ("C₁"), а полипептид рецептора типа II является частью слитого полипептида, который включает второй член взаимодействующей пары ("C₂"). В каждом слитом полипептиде, линкер может быть расположен между полипептидом рецептора типа I или типа II и соответствующим членом взаимодействующей пары. Первый и второй члены взаимодействующей пары могут представлять собой управляемую (асимметричную) пару, означающую, что члены этой пары вступают в ассоциацию преимущественно друг с другом, а не в самоассоциацию, или взаимодействующая пара может быть неуправляемой, и это означает, что члены этой пары могут вступать в ассоциацию друг с другом или в самоассоциацию без существенного предпочтения и могут иметь одинаковые или разные аминокислотные последовательности. Традиционные Fc слитые белки и антитела являются примерами неуправляемых взаимодействующих пар, тогда как ряд сконструированных Fc доменов был сконструирован как управляемые (асимметричные) взаимодействующие пары [например, Spiess et al (201S) Molecular Immunology 67(2A): 95-106].

Фиг. 23A-23D представляют схематические примеры гетеромерных белковых комплексов, включающих полипептид ALK4 (например, полипептид, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен внеклеточному домену белка ALK4 человека или других видов, например, которые описаны в настоящей заявке) и полипептид ActRIIB (например, полипептид, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен внеклеточному домену белка ActRIIB человека или других видов, например, которые описаны в настоящей заявке). В проиллюстрированных вариантах осуществления полипептид ALK4 является частью слитого полипептида, который включает первый член взаимодействующей пары ("C₁"), а полипептид ActRIIB является частью слитого полипептида, который включает второй член взаимодействующей пары ("C₂"). Подходящие взаимодействующие пары включали, например, взаимодействующие пары тяжелых цепей и/или легких цепей иммуноглобулинов, их усечения и варианты, например, описанные в настоящей заявке [например, Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A):95-106]. В каждом слитом полипептиде, линкер может быть расположен между полипептидом ALK4 или ActRIIB и соответствующим членом взаимодействующей пары. Первый и второй члены взаимодействующей пары могут быть неуправляемыми, и это означает, что члены этой пары могут вступать в ассоциацию друг с другом или в самоассоциацию без существенного предпочтения и могут иметь одинаковые или разные аминокислотные последовательности. См. Фиг. 23A. Альтернативно, взаимодействующая пара может представлять собой управляемую (асимметричную) пару, означающую, что члены этой пары вступают в ассоциацию преимущественно друг с другом, а не в самоассоциацию. См. Фиг. 23B. Могут предусматриваться комплексы высшего порядка. См. Фиг. 23C и 23D.

Подробное описание изобретения

1. Общее описание

TGF-β суперсемейство состоит из более чем 30 секретируемых факторов, включая TGF-бета, активины, белки Nodal, костные морфогенетические белки (BMP), факторы роста и дифференцировки (GDF) и антимюллеров гормон (AMH) [Weiss et al. (2013) Developmental Biology, 2(1): 47-63]. Члены суперсемейства, которые встречаются как у позвоночных, так и у беспозвоночных, повсеместно экспрессируются в различных тканях и функционируют на самых ранних стадиях развития на протяжении всей жизни животного. Действительно, белки суперсемейства TGF-β являются ключевыми медиаторами самообновления стволовых клеток, гаструляции, дифференцировки, морфогенеза органов и гомеостаза тканей взрослых. В соответствии с этой повсеместной активностью, аберрантная передача сигналов суперсемейства TGF-бета связана с широким спектром патологий человека, включая, например, аутоиммунное заболевание, сердечно-сосудистое заболевание, фиброзное заболевание и рак.

Лиганды суперсемейства TGF-бета имеют одинаковую димерную структуру, в которой центральная 3-1/2 витковая спираль одного мономера упаковывается по вогнутой поверхности, образованной бета-цепями другого мономера. Большинство членов семейства TGF-бета дополнительно стабилизированы межмолекулярной дисульфидной связью. Эти дисульфидные связи проходят через кольцо, образованное двумя другими дисульфидными связями, образуя так называемый "цистеиновый узловой" мотив [Lin et al. (2006) Reproduction 132: 179-190; и Hinck et al. (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870].

Передача сигналов суперсемейства TGF-бета опосредуется гетеромерными комплексами серин/треонинкиназных рецепторов типа I и типа II, которые фосфорилируют и активируют находящиеся на пути ниже SMAD-белки (например, SMAD-белки 1, 2, 3, 5 и 8) после стимуляции лигандом [Massague (2000) Nat Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178]. Эти рецепторы типа I и типа II представляют собой трансмембранные белки, состоящие из лиганд-связывающего внеклеточного домена с областью, богатой цистеином, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с предсказанной серин/треонинкиназной специфичностью. Как правило, рецепторы типа I опосредуют внутриклеточную передачу сигналов, тогда как рецепторы типа II необходимы для связывания лигандов суперсемейства TGF-бета. Рецепторы типа I и типа II образуют стабильный комплекс после связывания с лигандом, что приводит к фосфорилированию рецепторов типа I рецепторами типа II.

Семейство TGF-бета можно подразделить на две филогенетические ветви на основании рецепторов типа I, с которыми они связываются, и белков Smad, которые они активируют. Одна из них представляет собой недавно появившуюся ветвь, которая включает, например, TGF-бета, активины, GDF8, GDF9, GDF11, BMP3 и белки Nodal, которые передают сигналы через рецепторы типа I, которые активируют Smad 2 и 3 [Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870]. Другая ветвь включает более отдаленно родственные белки суперсемейства и включает, например, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF1, GDF5, GDF6 и GDF7, которые передают сигналы через Smad 1, 5 и 8.

Активины являются членами суперсемейства TGF-бета, и они были первоначально обнаружены в качестве регуляторов секреции фолликулостимулирующего гормона, но впоследствии были охарактеризованы различные репродуктивные и непродуктивные роли. Существует три основных формы активинов (A, B и AB), которые являются гомо/гетеродимерами двух близкородственных β-субъединиц (β_Aβ_A, β_Bβ_B и β_Aβ_B, соответственно). Геном человека также кодирует активин C и активин E, которые преимущественно экспрессируются в печени, и также известны гетеродимерные формы, содержащие β_С или β_Е. В TGF-бета суперсемействе активины являются уникальными и многофункциональными факторами, которые могут стимулировать продукцию гормонов в клетках яичников и плаценты, поддерживать выживание нервных клеток, положительно или отрицательно влиять на ход клеточного цикла в зависимости от типа клеток и индуцировать мезодермальную дифференцировку по меньшей мере в эмбрионах амфибий [DePaolo et al. (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al. (1997) Curr Biol. 7:81-84; и Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963]. В некоторых тканях передача сигналов активина антагонизируется его родственным гетеродимером, ингибином. Например, при регуляции секреции фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) из гипофиза активин способствует синтезу и секреции ФСГ, а ингибин снижает синтез и секрецию ФСГ. Другие белки, которые могут регулировать биоактивность активина и/или связываться с активином, включают фоллистатин (FS), родственный фоллистатину белок (FSRP, также известный как FLRG или FSTL3) и α₂-макроглобулин).

Как описано в настоящей заявке, средства, которые связываются с "активином A", являются средствами, которые специфически связываются с β_A субъединицей, как в контексте выделенной β_A субъединицы, так и в виде димерного комплекса (например, β_Aβ_A гомодимера или β_Aβ_B гетеродимера). В случае гетеродимерного комплекса (например, β_Aβ_B гетеродимера), средства, которые связываются с "активином A", являются специфическими для эпитопов, присутствующих в β_A субъединице, но не связываются с эпитопами, присутствующими в не-β_A субъединице комплекса (например, в β_B субъединице комплекса). Подобным образом, средства, раскрытые в настоящей заявке, которые антагонизируют (ингибируют) "активин A", представляют собой средства, которые ингибируют одну или несколько активностей, опосредованных β_A субъединицей, как в контексте выделенной β_A субъединицы, так в виде димерного комплекса (например, β_Aβ_A гомодимера или β_Aβ_B гетеродимера). В случае β_Aβ_B гетеродимеров, средства, которые ингибируют "активин A", представляют собой средства, которые специфически ингибируют одну или несколько активностей β_A субъединицы, но не ингибируют активность не-β_A субъединицы комплекса (например, β_B субъединицы комплекса). Этот принцип применим также к средствам, которые связываются с и/или ингибируют "активин B", "активин C" и "активин E". Средства, раскрытые в настоящей заявке, которые антагонизируют "активин AB", представляют собой средства, которые ингибируют одну или несколько активностей, опосредованных β_A субъединицей, и одну или несколько активностей, опосредованных β_B субъединицей.

BMPs и GDFs вместе образуют семейство включающих цистеиновые узлы цитокинов, имеющих общую для них укладку суперсемейства TGF-бета [Rider et al. (2010) Biochem J., 429(1): 1-12]. Это семейство включает, например, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP2a, BMP3, BMP3b (также известный как GDF10), BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP8a, BMP8b, BMP9 (также известный как GDF2), BMP10, BMP11 (также известный как GDF11), BMP12 (также известный как GDF7), BMP13 (также известный как GDF6), BMP14 (также известный как GDF5), BMP15, GDF1, GDF3 (также известный как VGR2), GDF8 (также известный как миостатин), GDF9, GDF15 и декапентаплегические. Помимо способности индуцировать костеообразование, что дало BMP их название, BMP/GDF проявляют морфогенетическую активность в развитии широкого ряда тканей. Гомо- и гетеродимеры BMP/GDF взаимодействуют с комбинациями димеров рецепторов типа I и типа II, образуя множество возможных сигнальных комплексов, что приводит к активации одного из двух конкурирующих наборов транскрипционных факторов SMAD. BMP/GDF имеют высокоспецифические и локализованные функции. Они регулируются различными путями, включая ограничение экспрессии BMP/GDF в процессе развития и через секрецию некоторых специфических белков-антагонистов BMP, которые связываются с высокой аффинностью с цитокинами. Любопытно, что многие из этих антагонистов напоминают лиганды суперсемейства TGF-бета.

Фактор роста и дифференцировки-8 (GDF8) также известен как миостатин. GDF8 является отрицательным регулятором массы скелетных мышц и высоко экспрессируется в развивающихся и взрослых скелетных мышцах. Нулевая мутация GDF8 у трансгенных мышей характеризуется выраженной гипертрофией и гиперплазией скелетных мышц [McPherron et al. Nature (1997) 387:83-90]. Подобное увеличение массы скелетных мышц явно выражено при природных мутациях GDF8 у крупного рогатого скота и, что поразительно, у людей [Ashmore et al. (1974) Growth, 38:501-507; Swatland and Kieffer, J. Anim. Sci. (1994) 38:752-757; McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461; Kambadur et al. Genome Res. (1997) 7:910-915; и Schuelke et al. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8]. Исследования также показали, что мышечная атрофия, ассоциированная с ВИЧ-инфекцией у людей, сопровождается увеличением экспрессии белка GDF8 [Gonzalez-Cadavid et al., PNAS (1998) 95:14938-43]. Кроме того, GDF8 может модулировать продукцию мышечно-специфических ферментов (например, креатинкиназы) и модулировать пролиферацию миобластов [Публикация международной патентной заявки № WO 00/43781]. Пропептид GDF8 может нековалентно связываться с димером зрелого домена GDF8, инактивируя его биологическую активность [Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263:6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; и Brown et al. (1990) Growth Factors, 3:35-43]. Другие белки, которые связываются с GDF8 или структурно родственными белками и ингибируют их биологическую активность, включают фоллистатин и, потенциально, фоллистатин-родственные белки [Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232].

GDF11, также известный как BMP11, является секретируемым белком, который экспрессируется в хвостовых зачатках, зачатках конечностей, верхнечелюстных и нижнечелюстных дугах и ганглиях дорсальных корешков в процессе развития мышей [McPherron et al. (1999) Nat Genet, 22: 260-264; и Nakashima et al. (1999) Mech. Dev., 80: 185-189]. GDF11 играет уникальную роль в формировании паттерна как мезодермальных, так и нервных тканей [Gamer et al. (1999) Dev Biol., 208: 222-32]. Было показано, что GDF11 является отрицательным регулятором хондрогенеза и миогенеза в развивающейся конечности цыпленка [Gamer et al. (2001) Dev Biol., 229: 407-20]. Экспрессия GDF11 в мышцах также указывает на его роль в регуляции роста мышц аналогично GDF8. Кроме того, экспрессия GDF11 в головном мозге дает основание предположить, что GDF11 также может обладать активностями, которые связаны с функцией нервной системы. Интересно, что GDF11, как было обнаружено, ингибирует нейрогенез в обонятельном эпителии [Wu et al. (2003) Neuron., 37:197-207]. Следовательно, GDF11 может иметь применение in vitro и in vivo в лечении таких заболеваний, как мышечные заболевания и нейродегенеративные заболевания (например, боковой амиотрофический склероз).

Как продемонстрировано в настоящей заявке, растворимый полипептид ActRIIA и ALK4:ActRIIB гетеродимер, которые оба связываются с различными ActRIIA- и ActRIIB-взаимодействующими лигандами, являются эффективными для снижения кровяного давления и гипертрофии сердца в модели ЛАГ. Не желая связывать это с каким-либо конкретным механизмом, предполагается, что эффекты этих средств вызваны преимущественно антагонистическим эффектом на передачу сигналов ActRIIA/B. Независимо от механизма, из данных, представленных в настоящей заявке, очевидно, что антагонисты ActRIIA/B сигнальных путей (антагонисты GDF/BMP) действительно снижают кровяное давление, уменьшают гипертрофию сердца и имеют другие положительные эффекты при лечении легочной гипертензии. Следует отметить, что кровяное давление и гипертрофия являются динамическими состояниями, где изменения зависят от баланса факторов, которые повышают кровяное давление и гипертрофию, и факторов, которые снижают кровяное давление и гипертрофию. Кровяное давление и гипертрофию сердца можно уменьшить путем увеличения факторов, которые снижают кровяное давление и гипертрофию сердца, уменьшения факторов, которые промотируют повышенное кровяное давление и гипертрофию сердца, или обоими способами. Термины "снижение кровяного давления" или "уменьшение гипертрофии сердца" относятся к наблюдаемым физическим изменениям кровяного давления и сердечной ткани, и предполагается, что они являются нейтральными, что касается механизма возникновения изменений.

Считают, что крысиные модели для ЛАГ, которые использовали в исследованиях, описанных в настоящей заявке, предсказывают эффективность у человека, и поэтому настоящее изобретение обеспечивает способы применения полипептидов ActRIIA, гетеромультимеров ALK4:ActREB и других антагонистов GDF/BMP для лечения легочной гипертензии (например, ЛАГ), в частности, лечения, профилактики или уменьшения тяжести или продолжительности одного или нескольких осложнений легочной гипертензии, у человека. Как раскрыто в настоящей заявке, термин "антагонисты GDF/BMP" относится к различным средствам, которые можно использовать в качестве антагонистов сигнального пути ActRIIA/B, включая, например, антагонистов, которые ингибируют один или несколько ActRIIA/B лигандов [например, активин (активин A, активин B, активин AB, активин C, активин AC, активин BC, активин E, активин AE и/или активин BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10]; антагонистов, которые ингибируют один или несколько рецепторов типа I и/или типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 и ALK5); и антагонистов, которые ингибируют один или несколько компонентов нисходящего сигнального пути (например, Smad белки, такие как Smad 2 и 3). Антагонисты GDF/BMP для использования в соответствии со способами и применениями по изобретению включают различные формы, например, ловушки для лигандов (например, растворимые полипептиды ActRIIA, полипептиды ActRIIB, гетеродимеры ALK4:ActRIIB, фоллистатиновые полипептиды и FLRG полипептиды), антитела-антагонисты (например, антитела, которые ингибируют один или несколько из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7 и ALK5), низкомолекулярные антагонисты [например, малые молекулы, которые ингибируют один или несколько из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, ALK5 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3)] и нуклеотидные антагонисты [например, нуклеотидные последовательности, которые ингибируют один или несколько из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK7, ALK5 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3)].

Термины, используемые в настоящем описании, как правило, имеют свои обычные значения, принятые в данной области техники, в контексте настоящего раскрытия и в конкретном контексте, где используется каждый термин. Некоторые термины обсуждаются ниже или в другом разделе описания для обеспечения дополнительных указаний для специалистов-практиков при описании композиций и способов по изобретению, а также указаний, касающихся их получения и применения. Объем или значение любого использования термина будет очевиден из конкретного контекста, в котором он используется.

"Гомологичный" во всех его грамматических формах и вариациях правописания относится к взаимосвязи между двумя белками, которые имеют "общее происхождение", включая белки из суперсемейств в одном и том же виде организма, а также гомологичные белки из другого вида организма. Такие белки (и их кодирующие нуклеиновые кислоты) имеют гомологию последовательностей, что отражается в сходстве их последовательностей, выраженном либо в виде процента идентичности, либо присутствием специфических остатков или мотивов и консервативных положений. Однако при обычном использовании и в настоящей заявке термин "гомологичный", когда при нем имеется наречие, такое как "высоко", может относиться к сходству последовательностей и может относиться или не относиться к общему происхождению.

Термин "сходство последовательностей" во всех его грамматических формах относится к степени идентичности или соответствия между последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот, которые могут иметь или не иметь общее происхождение.

"Процент (%) идентичности последовательности" по отношению к эталонной полипептидной (или нуклеотидной) последовательности определяется как процент аминокислотных остатков (или нуклеиновых кислот) в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам (или нуклеиновым кислотам) в эталонной полипептидной (нуклеотидной) последовательности, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может достигаться различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения значения (%) идентичности последовательностей аминокислот (нуклеиновых кислот) получают с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была создана Genentech, Inc., а программный код был подан вместе с документацией пользователя в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где она зарегистрирована под регистрационным номером авторского права США № TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна от Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., или может быть скомпилирована из программного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для использования в операционной системе UNIX, включая цифровую UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются.

"Проявлять агонизм" во всех его грамматических формах относится к процессу активации белка и/или гена (например, путем активации или усиления экспрессии гена этого белка или индуцируя переход неактивного белка в активное состояние) или повышения активности белка и/или гена.

"Проявлять антагонизм" во всех его грамматических формах относится к процессу ингибирования белка и/или гена (например, путем ингибирования или уменьшения экспрессии гена этого белка или индуцируя переход активного белка в неактивное состояние) или снижения активности белка и/или гена.

Термины "около" и "приблизительно", используемые в связи с числовым значением во всех разделах описания и в формуле изобретения, означают интервал точности, известный и приемлемый для специалиста в данной области техники. Как правило, такой интервал точности составляет ±10%. Альтернативно, и особенно в биологических системах, термины "около" и "приблизительно" могут означать значения, которые отличаются в пределах порядка величины от заданного значения, предпочтительно в ≤5 раз и более, предпочтительно в ≤2 раза.

Числовые диапазоны, раскрытые в настоящей заявке, включают числа, определяющие диапазоны. Термины, определяемые артиклем "а" и "an", включают также множественное число, если контекст, в котором этот термин используется, явно не указывает иное. Термины, определяемые артиклем "а" (или "an"), а также термины "один или несколько" и "по меньшей мере один" могут использоваться взаимозаменяемо. Кроме того, "и/или" в контексте настоящей заявки следует понимать как конкретное раскрытие каждого из двух или более указанных признаков или компонентов с другим или без него. Таким образом, термин "и/или", используемый в фразе, такой как "A и/или B", предназначен для включения "A и B", "A или B", "A" (только) и "B" (только). Аналогичным образом, термин "и/или", используемый в такой фразе, как "A, B и/или C", предназначен для охвата каждого из следующих аспектов: A, B и C; А, В или С; А или С; А или В; B или C; А и С; А и В; B и C; A (только); B (только); и С (только).

В данном описании слово "включать" или его варианты, такие как "включает" или "включающий", следует понимать как включение указанной целочисленной переменной или групп целочиселенных переменных, но не исключение какой-либо другой целочисленной переменной или группы целочисленных переменных.

2. Полипептиды ActRII, полипептиды ALK4, гетеромультимеры ALK4:ActRIIB и их варианты

В некоторых аспектах, изобретение относится к полипептидам ActRII и их применениям (например, для лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии или одного или нескольких осложнений легочной гипертензии) и/или интерстициального легочного заболевания (например, идиопатического фиброза легких). В контексте настоящей заявки термин "ActRII" относится к семейству рецепторов активина типа II. Это семейство включает активиновый рецептор типа IIA (ActRIIA) и активиновый рецептор типа IIB (ActRIIB).

В контексте настоящей заявки термин "ActRIIB" относится к семейству белков активиновых рецепторов типа IIB (ActRIIB) из любого вида и вариантам, являющимся производными таких ActRIIB белков в результате мутагенеза или других модификаций. Указание на ActRIIB в настоящей заявке следует понимать как относящееся к любой из идентифицированных на данный момент форм. Члены ActRIIB семейства, как правило, представляют собой трансмембранные белки, состоящие из лиганд-связывающего внеклеточного домена, включающего богатую цистеином область, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с предсказанной серин/треонинкиназной активностью.

Термин "ActRIIB полипептид" включает полипептиды, включающие любой природный полипептид, являющийся членом ActRIIB семейства, а также любые его варианты (включая мутанты, фрагменты, слияния и пептидомиметические формы), которые сохраняют полезную активность. Примеры таких вариантных полипептидов ActRIIB представлены в настоящем раскрытии, а также в публикациях международных патентных заявок №№ WO 2006/012627, WO 2008/097541, WO 2010/151426 и WO 2011/020045, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. Нумерация аминокислот для всех ActRIIB-родственных полипептидов, описанных в настоящей заявке, основана на нумерации последовательности человеческого ActRIIB белка-предшественника, представленной ниже (SEQ ID NO: 1), если конкретно не указано иное.

Последовательность белка-предшественника человеческого ActRIIB является следующей:

Сигнальный пептид подчеркнут одной линией; внеклеточный домен выделен жирным шрифтом; а потенциальные эндогенные сайты N-связанного гликозилирования подчеркнуты двумя линиями.

Последовательность процессированного (зрелого) внеклеточного полипептида ActRIIB является следующей:

В некоторых вариантах осуществления белок может продуцироваться с "SGR… " последовательностью на N-конце. С-концевой "хвост" внеклеточного домена подчеркнут одной линией. Последовательность с делетированным "хвостом" (Δ15 последовательность) является следующей:

Форма ActRIIB с аланином в положении 64 SEQ ID NO: 1 (A64) также описана в литературе. См., например, Hilden et al. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170. Авторы настоящего изобретения убедились, что ActRIIB-Fc слитый белок, включающий внеклеточный домен ActRIIB с A64 заменой, обладает относительно низкой аффинностью в отношении активина и GDF11. Наоборот, такой же ActRIIB-Fc слитый белок с аргинином в положении 64 (R64) обладает аффинностью в отношении активина и GDF11 в диапазоне от низких наномолярных до высоких пикомолярных значений. Поэтому последовательности с R64 используют в качестве референсных последовательностей "дикого типа" для человеческого ActRIIB в настоящем изобретении.

Форма ActRIIB с аланином в положении 64 является следующей:

Сигнальный пептид подчеркнут одной линией, а внеклеточный домен выделен жирным шрифтом.

Последовательность процессированного (зрелого) внеклеточного ActRIIB полипептида альтернативной A64 формы является следующей:

В некоторых вариантах осуществления белок может продуцироваться с "SGR…" последовательностью на N-конце. С-концевой "хвост" внеклеточного домена подчеркнут одной линией. Последовательность с делетированным "хвостом" (Δ15 последовательность) является следующей:

Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок-предшественник ActRIIB человека, показана ниже (SEQ ID NO: 7), представляющая нуклеотиды 25-1560 из референсной последовательности Genbank NM_001106.3, которые кодируют аминокислоты 1-513 предшественника ActRIIB. Показанная последовательность представляет аргинин в положении 64, и она может быть модифицирована для включения аланина вместо этого. Сигнальная последовательность подчеркнута.

Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая процессированный внеклеточный человеческий полипептид ActRIIB, является следующей (SEQ ID NO: 8). Показанная последовательность представляет аргинин в положении 64 и может быть модифицирована для включения аланина вместо этого.

Выравнивание аминокислотных последовательностей внеклеточного домена человеческого ActRIIB и внеклеточного домена человеческого ActRIIA проиллюстрировано на Фиг. 1. Это выравнивание указывает аминокислотные остатки в обоих рецепторах, которые, как считается, непосредственно контактируют с ActRII лигандами. Например, композитные ActRII структуры показали, что ActRIIB-лиганд связывающий карман определяется, частью, остатками Y31, N33, N35, L38 по T41, E47, E50, Q53 по K5S, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 по N83, Y85, R87, A92 и E94 по F101. Ожидается, что в этих положениях консервативные мутации должны быть переносимы.

Кроме того, ActRIIB является высококонсервативным среди позвоночных, при этом большие участки внеклеточного домена являются полностью консервативными. Например, Фиг. 2 показывает множественное выравнивание последовательностей внеклеточного домена человеческого ActRIIB по сравнению с различными ActRIIB ортологами. Многие из лигандов, которые связываются с ActRIIB, также являются высококонсервативными. Соответственно, из этих выравниваний можно предсказать ключевые аминокислотные положения в лиганд-связывающем домене, которые являются важными для нормальных активностей связывания ActRIIB-лиганд, а также предсказать аминокислотные положения, которые могут быть приемлемыми для замены без существенного изменения нормальных активностей связывания ActRIIB-лиганд. Поэтому активный вариантный полипептид ActRIIB человека, полезный в соответствии со способами по настоящему изобретению, может включать одну или несколько аминокислот в соответствующих положениях из последовательности ActRIIB другого позвоночного или может включать остаток, который подобен остатку в последовательностях человека или других позвоночных. Не будучи ограничивающими, следующие примеры иллюстрируют этот подход к определению активного варианта ActRIIB. L46 в человеческом внеклеточном домене (SEQ ID NO: 2) представляет собой валин в ActRIIB лягушки Xenopus (SEQ ID NO: 58), и поэтому это положение может быть изменено и необязательно может быть изменено на другой гидрофобный остаток, такой как V, I или F, или неполярный остаток, такой как A. E52 в человеческом внеклеточном домене представляет собой К у вида Xenopus, указывая на то, что этот сайт может быть устойчивым к большому количеству различных изменений, включая полярные остатки, такие как E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y и возможно A. T93 в человеческом внеклеточном домене представляет собой K у вида Xenopus, указывая на то, что в этом положении допустимы широкие структурные вариации, при этом предпочтительны полярные остатки, такие как S, K, R, E, D, H, G, P, G и Y. F108 в человеческом внеклеточном домене представляет собой Y у вида Xenopus, и поэтому Y или другая гидрофобная группа, такая как I, V или L, должна быть приемлемой. E111 в человеческом внеклеточном домене представляет собой K у вида Xenopus, указывая на то, что заряженные остатки будут допустимы в этом положении, включая D, R, K и H, также как Q и N. R112 в человеческом внеклеточном домене представляет собой K у вида Xenopus, указывая на то, что основные остатки допустимы в этом положении, включая R и H. A в положении 119 в человеческом внеклеточном домене является относительно низко консервативным и проявляется как P у грызунов и V у Xenopus, таким образом, по существу, любая аминокислота должна быть приемлемой в этом положении.

Кроме того, ActRII белки были охарактеризованы в известном уровне техники в соответствии со структурными и функциональными характеристиками, в частности, что касается связывания с лигандом [Attisano et al. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald et al (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph et al. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson et al. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; а также в патентах США №№: 7709605, 7612041 и 7842663]. В дополнение к раскрытию, содержащемуся в настоящей заявке, эти ссылочные документы содержат достаточно указаний, как получить ActRIIB варианты, которые сохраняют одну или несколько обычных активностей (например, лиганд-связывающую активность).

Например, определяющий структурный мотив, известный как трехпальцевая токсиновая складка, является важным для связывания лиганда рецепторами типа I и типа II и образован консервативными цистеиновыми остатками, расположенными в различных положениях во веклеточном домене каждого мономерного рецептора [Greenwald et al., (1999) Nat Struct Biol 6: 18-22; и Hinck (2012) FEBS Lett 586: 1860-1870]. Соответственно, коровые лиганд-связывающие домены человеческого ActRIIB, демаркированные наиболее удаленными из этих консервативных цистеинов, соответствуют положениям 29-109 SEQ ID NO: 1 (предшественник ActRIIB). Структурно менее упорядоченные аминокислоты, фланкирующие эти цистеин-демаркированные коровые последовательности, могут быть усечены на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 остатков по N-концу и/или на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатка по С-концу, не вызывая обязательного изменения связывания с лигандом. Примеры внеклеточных доменов ActRIIB для N-концевого и/или C-концевого усечения включают SEQ ID NO: 2, 3, 5 и 6.

Attisano et al. показали, что делеция пролинового узла на С-конце внеклеточного домена ActRIIB снижает аффиность рецептора в отношении активина. Слитый белок ActRIIB-Fc, содержащий аминокислоты 20-119 представленной SEQ ID NO: 1, "ActRIIB (20-119)-Fc", имеет пониженное связывание с GDF11 и активином по сравнению с ActRIIB (20-134)-Fc, который включает область пролинового узла и полный околомембранный домен (см., например, патент США №7842663). Однако белок ActRIIB (20-129)-Fc сохраняет аналогичную, но несколько меньшую активность по сравнению с диким типом, даже если область пролинового узла нарушена.

Таким образом, ожидается, что внеклеточные домены ActRIIB, которые заканчиваются аминокислотами 134, 133, 132, 131, 130 и 129 (в соответствии с SEQ ID NO: 1), все будут активными, но конструкции, заканчивающиеся на 134 или 133, могут быть наиболее активными. Подобным образом, ожидается, что мутации по любому из остатков 129-134 (в соответствии с SEQ ID NO: 1) не будут изменять аффинность связывания лиганда существенным образом. В подтверждение этого, в данной области известно, что мутации P129 и P130 (в соответствии с SEQ ID NO: 1) существенно не снижают связывание лиганда. Следовательно, полипептид ActRIIB по настоящему изобретению может оканчиваться уже аминокислотой 109 (конечный цистеин), однако, формы, заканчивающиеся на 109 или 119 или между ними (например, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 или 119), как ожидается, будут иметь пониженное связывание с лигандом. Аминокислота 119 (в соответствии с SEQ ID NO: 1) является низкоконсервативной, и поэтому она легко может быть изменена или усечена. Полипептиды ActRIIB, заканчивающиеся на 128 (в соответствии с SEQ ID NO: 1) или дальше, должны сохранять лиганд-связывающую активность. Полипептиды ActRIIB, оканчивающиеся на 119 или 127 или между ними (например, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 или 127), в соответствии с SEQ ID NO: 1, будут обладать связывающей способностью на промежуточном уровне. Любая из этих форм может быть желательной для использования, в зависимости от клинических или экспериментальных условий.

Ожидают, что на N-конце ActRIIB белок, начинающийся с аминокислоты 29 или ранее (в соответствии с SEQ ID NO: 1), будет сохранять лиганд-связывающую активность. Аминокислота 29 представляет собой исходный цистеин. Мутация аланина в аспарагин в положении 24 (в соответствии с SEQ ID NO: 1) вводит последовательность N-связанного гликозилирования без существенного влияния на связывание лиганда [патент США №7842663]. Это подтверждает, что мутации в области между сигнальным отщепляемым пептидом и цистеин-сшитой областью, соответствующей аминокислотам 20-29, являются хорошо переносимыми. В частности, полипептиды ActRIIB, начинающиеся в положениях 20, 21, 22, 23 и 24 (в соответствии с SEQ ID NO: 1), должны сохранять общую активность связывания с лигандом, а полипептиды ActRIIB, начинающиеся в положениях 25, 26, 27, 28 и 29 (в соответствии с SEQ ID NO: 1), также, как ожидается, сохранят лиганд-связывающую активность. Например, в патенте США №7842663 было продемонстрировано, что, к удивлению, конструкция ActRIIB, начинающаяся с 22, 23, 24 или 25, будет иметь наибольшую активность.

Взятая в совокупности, общая формула для активной части (например, лиганд-связывающей части) ActRIIB включает аминокислоты 29-109 SEQ ID NO: 1. Поэтому ActRIIB полипептиды могут, например, включать, состоять по существу из или состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична части ActRIIB, начинающейся с остатка, соответствующего любой из аминокислот 20-29 (например, начинающейся с любой из аминокислот 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29) SEQ ID NO: 1, и заканчивающейся в положении, соответствующем любой из аминокислот 109-134 (например, заканчивающейся любой из аминокислот 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 или 134) SEQ ID NO: 1. Другие примеры включают полипептиды, которые начинаются в положении 20-29 (например, любом из положений 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29) или 21-29 (например, любом из положений 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29) SEQ ID NO: 1 и заканчиваются в положении 119-134 (например, любом из положений 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 или 134), 119-133 (например, любом из положений 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 или 133), 129-134 (например, любом из положений 129, 130, 131, 132, 133 или 134) или 129-133 (например, любом из положений 129, 130, 131, 132 или 133) SEQ ID NO: 1. Другие примеры включают конструкции, которые начинаются в положении 20-24 (например, любом из положений 20, 21, 22, 23 или 24), 21-24 (например, любом из положений 21, 22, 23 или 24) или 22-25 (например, любом из положений 22, 22, 23 или 25) SEQ ID NO: 1 и заканчиваются в положении 109-134 (например, любом из положений 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 12S, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 или 134), 119-134 (например, любом из положений 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 или 134) или 129-134 (например, любом из положений 129, 130, 131, 132, 133 или 134) SEQ ID NO: 1. Варианты в этих пределах также предусматриваются, в частности, такие, которые включают, состоят по существу из или состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична соответствующей части SEQ ID NO: 1.

Варианты, описанные в настоящей заявке, можно комбинировать различными способами. В некоторых вариантах осуществления варианты ActRIIB включают не более 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 15 консервативных аминокислотных изменений в лиганд-связывающем кармане, необязательно ноль, одно или несколько неконсервативных изменений в положениях 40, 53, 55, 74, 79 и/или 82 в лиганд-связывающем кармане. Сайты вне связывающего кармана, в которых вариабельность может быть особенно хорошо переносимой, включают амино и карбокси концы внеклеточного домена (как отмечено выше) и положения 42-46 и 65-73 (в соответствии с SEQ ID NO: 1). Изменение аспарагина на аланин в положении 65 (N65A), по-видимому, не уменьшает связывание с лигандом в эталонном R64 [патент США №7842663]. Это изменение, вероятно, устраняет гликозилирование по N65 в эталонном A64, таким образом демонстрируя, что значительное изменение в этой области, вероятно, будет допустимым. Хотя изменение R64A является плохо переносимым, R64K является хорошо переносимым, и, таким образом, другой основной остаток, такой как H, допустим в положении 64 [патент США №7842663]. Кроме того, результаты программы мутагенеза, описанной в известном уровне техники, показывают, что существуют аминокислотные положения в ActRIIB, которые часто предпочтительны как консервативные. В соответствии с SEQ ID NO: 1, они включают положение 80 (кислая или гидрофобная аминокислота), положение 78 (гидрофобная и, в частности, триптофан), положение 37 (кислая и, в частности, аспарагиновая или глутаминовая кислота), положение 56 (основная аминокислота), положение 60 (гидрофобная аминокислота, в частности, фенилаланин или тирозин). Таким образом, изобретение обеспечивает каркас из аминокислот, которые могут быть консервативными в ActRIIB полипептидах. Другие положения, которые возможно будет желательно сделать консервативными, являются следующими: положение 52 (кислая аминокислота), положение 55 (основная аминокислота), положение 81 (кислая), 98 (полярная или заряженная, в частности, E, D, R или K), все в соответствии с SEQ ID NO: 1.

Ранее было продемонстрировано, что добавление дополнительного сайта N-связанного гликозилирования (N-X-S/T) во внеклеточный домен ActRIIB является хорошо переносимым (см., например, патент США №7842663). Поэтому N-X-S/T последовательности, как правило, можно вводить в положениях за пределами лиганд-связывающего кармана, определенного на Фиг.1, в полипептиде ActRIIB по настоящему изобретению. Особенно подходящие сайты для введения не-эндогенных N-X-S/T последовательностей включают аминокислоты 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 или 129-134 (в соответствии с SEQ ID NO: 1). N-X-S/T последовательности также могут быть введены в линкер между последовательностью ActRIIB и Fc доменом или другим компонентом слияния, а также необязательно в сам компонент слияния. Такой сайт может быть введен с минимальными усилиями путем введения N в правильное положение относительно предсуществующего S или T, или путем введения S или T в положение, соответствующее предсуществующему N. Таким образом, желательные изменения которые могут создать сайт N-связанного гликозилирования: A24N, R64N, S67N (возможно, в сочетании с изменением N6SA), E105N, R12N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S и R112T (в соответствии с SEQ ID NO: 1). Любой S, который, как предсказывают, будет гликозилированным, может быть изменен на T без создания иммуногенного сайта в результате защиты, обеспечиваемой гликозилированием. Аналогично, любой T, который, как прогнозируют, будет гликозилированным, может быть изменен на S. Таким образом, предусматриваются изменения S67T и S44T (в соответствии с SEQ ID NO: 1). Аналогичным образом, в варианте A24N можно использовать изменение S26T. Соответственно, полипептид ActRIIB по настоящему изобретению может представлять собой вариант, имеющий одну или несколько дополнительных не-эндогенных консенсусных последовательностей N-связанного гликозилирования, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антагонистам (ингибиторам) GDF/BMP, которые включают полипептид ActRIIB, который включает фрагменты, функциональные варианты и их модифицированные формы, а также их применениям (например, лечение или профилактика ЛГ или одного или нескольких ЛГ-ассоциированных осложнений). Предпочтительно полипептиды ActRIIB являются растворимыми (например, включают внеклеточный домен ActRIIB). В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIB антагонизируют активность (например, Smad-передачу сигналов) одного или нескольких GDF/BMP лигандов [например, GDF11, GDF8, активина (активин A, активин B, активин AB, активин C, активин E) BMP6, GDF3, BMP 15 и BMP10]. Поэтому в некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIB связываются с одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (активин A, активин B, активин AB, активин C, активин E) BMP6, GDF3, BMP15 и BMP10]. В некоторых вариантах осуществления ActRIIB полипептиды по изобретению включают, состоят по существу из или состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична части ActRIIB, начинающейся с остатка, соответствующего аминокислотам 20-29 (например, начинающейся с любой из аминокислот 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29) SEQ ID NO: 1, и заканчивающейся в положении, соответствующем аминокислотам 109-134 (например, заканчивающейся любой из аминокислот 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 или 134) SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления ActRIIB полипептиды включают, состоят или состоят по существу из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 29-109 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления ActRIIB полипептиды по изобретению включают, состоят или состоят по существу из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 29-109 SEQ ID NO: 1, где положение, соответствующее L79 SEQ ID NO: 1, представляет собой кислую аминокислоту (природные кислые аминокислоты D и E или искусственная кислая аминокислота). В некоторых вариантах осуществления ActRIIB полипептиды по изобретению включают, состоят или состоят по существу из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 25-131 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления ActRIIB полипептиды по изобретению включают, состоят или состоят по существу из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 25-131 SEQ ID NO: 1, где положение, соответствующее L79 SEQ ID NO: 1, представляет собой кислую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления ActRIIB полипептиды по изобретению включают, состоят или состоят по существу из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 40, 42, 45, 46, 47, 48, 69, 74, 77, 78, 79, 108, 110, 114, 115, 118 и 120. В некоторых вариантах осуществления ActRIIB полипептиды по изобретению включают, состоят или состоят по существу из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 40, 42, 45, 46, 47, 48, 69, 74, 77, 78, 79, 108, 110, 114, 115, 118 и 120, где положение, соответствующее L79 SEQ ID NO: 1, представляет собой кислую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления ActRIIB полипептиды по изобретению включают, состоят или состоят по существу из по меньшей мере одного полипептида ActRIIB, где положение, соответствующее L79 SEQ ID NO: 1, не является кислой аминокислотой (т.е. не является природными кислыми аминокислотами D или E или искусственным кислым аминокислотом остатком).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам ActRIIA. В контексте настоящей заявки термин "ActRIIA" относится к семейству белков активиновых рецепторов типа IIA (ActRIIA) из любого вида и вариантам, являющимся производными таких ActRIIA белков в результате мутагенеза или другой модификации. Указание на ActRIIA в настоящей заявке следует понимать как относящееся к любой из идентифицированных на данный момент форм. Члены ActRIIA семейства, как правило, представляют собой трансмембранные белки, состоящие из лиганд-связывающего внеклеточного домена, включающего богатую цистеином область, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с предсказанной серин/треонинкиназной активностью.

Термин "полипептид ActRIIA" включает полипептиды, включающие любой природный полипептид из членов ActRIIA семейства, а также любые их варианты (включая мутанты, фрагменты, слияния и пептидомиметические формы), которые сохраняют полезную активность. Примеры таких вариантных полипептидов ActRIIA представлены в настоящем раскрытии, а также в публикациях международных патентных заявок №№ WO 2006/012627 и WO 2007/062188, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.

Нумерация аминокислот для всех ActRII A-родственных полипептидов, описанных в настоящей заявке, представлена на основании нумерации последовательности белка-предшественника человеческого ActRIIA, представленной ниже (SEQ ID NO: 9), если конкретно не указано иное.

Каноническая последовательность белка-предшественника ActRIIA человека является следующей:

Сигнальный пептид подчеркнут одной линией; внеклеточный домен выделен жирным шрифтом; а потенциальные эндогенные сайты N-связанного гликозилирования подчеркнуты двумя линиями.

Последовательность процессированного (зрелого) внеклеточного полипептида ActRIIA является следующей:

С-концевой "хвост" внеклеточного домена подчеркнут одной линией. Последовательность с делетированным "хвостом" (Δ15 последовательность) является следующей:

Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок-предшественник ActRIIA человека, показана ниже (SEQ ID NO: 12), представляющая нуклеотиды 159-1700 из референсной последовательности Genbank NM_001616.4. Сигнальная последовательность подчеркнута.

Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая процессированный растворимый (внеклеточный) человеческий полипептид ActRIIA, является следующей:

ActRIIA является высококонсервативным среди позвоночных, при этом большие участки внеклеточного домена являются полностью консервативными. Например, Фиг. 3 показывает множественное выравнивание последовательностей внеклеточного домена человеческого ActRIIA по сравнению с различными ActRIIA ортологами. Многие из лигандов, которые связываются с ActRIIA, также высококонсервативны. Соответственно, из этих выравниваний можно предсказать ключевые аминокислотные положения в лиганд-связывающем домене, которые являются важными для нормальных активностей связывания ActRIIA-лиганд, а также предсказать аминокислотные положения, которые могут перенести замену без существенного изменения нормальных активностей связывания ActRIIA-лиганд. Поэтому активный человеческий вариантный полипептид ActRIIA, полезный в соответствии со способами по настоящему изобретению, может включать одну или несколько аминокислот в соответствующих положениях из последовательности ActRIIA другого позвоночного или может включать остаток, который аналогичен остатку в последовательностях человека или других позвоночных.

Не будучи ограничивающими, следующие примеры иллюстрируют этот подход к определению активного варианта ActRIIA. Как проиллюстрировано на Фиг. 3, F13 в человеческом внеклеточном домене представляет собой Y в ActRIIA Ovis aries (домашней овцы) (SEQ ID NO: 62), Gallus gallus (домашней курицы) (SEQ ID NO: 65), Bos Taurus (дикого быка) (SEQ ID NO: 66), Tyto alba (сипухи обыкновенной) (SEQ ID NO: 67) и Myotis davidii (ночницы степной) (SEQ ID NO: 68), указывая на то, что ароматические остатки допустимы в этом положении, включая F, W и Y. Q24 в человеческом внеклеточном домене представляет собой R в ActRIIA Bos Taurus, указывая на то, что заряженные остатки будут допустимы в этом положении, включая D, R, K, H и E. S95 в человеческом внеклеточном домене представляет собой F в ActRIIA Gallus gallus и Tyto alba, указывая на то, что этот сайт может выдержать множество различных изменений, включая полярные остатки, так как E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y и, возможно, гидрофобный остаток, такой как L, I или F. E52 в человеческом внеклеточном домене представляет собой D в ActRIIA Ovis aries, указывая на то, что кислые остатки допустимы этом положении, включая D и E. P29 в человеческом внеклеточном домене является относительно низкоконсервативным, наблюдаемый как S в ActRIIA Ovis aries и L в ActRIIA Myotis davidii, таким образом, по существу любая аминокислота должна быть приемлемой в этом положении.

Кроме того, как обсуждается выше, ActRII белки были охарактеризованы в известном уровне техники в соответствии со структурными и функциональными характеристиками, в частности, что касается связывания с лигандом [Attisano et al. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald et al (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph et al. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson et al. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; а также в патентах США №№: 7709605, 7612041 и 7842663]. В дополнение к раскрытию, содержащемуся в настоящей заявке, эти ссылочные документы содержат достаточно указаний, как получить ActRII варианты, которые сохраняют одну или несколько обычных активностей (например, лиганд-связывающую активность).

Например, определяющий структурный мотив, известный как трехпальцевая токсиновая складка, является важным для связывания лиганда рецепторами типа I и типа II и образован консервативными цистеиновыми остатками, расположенными в различных положениях во веклеточном домене каждого мономерного рецептора [Greenwald et al., (1999) Nat Struct Biol 6: 18-22; и Hinck (2012) FEBS Lett 586: 1860-1870]. Соответственно, коровые лиганд-связывающие домены человеческого ActRIIA, демаркированные наиболее удаленными из этих консервативных цистеинов, соответствуют положениям 30-110 SEQ ID NO: 9 (предшественник ActRIIA). Поэтому структурно менее упорядоченные аминокислоты, фланкирующие эти цистеин-демаркированные коровые последовательности, могут быть усечены примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 остатков по N-концу и примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатков по С-концу, не вызывая обязательного изменения связывания с лигандом. Примеры усечений внеклеточных ActRIIA доменов включают SEQ ID NO: 10 и 11.

Соответственно, общая формула для активной части (например, связывающейся с лигандом) ActRIIA представляет собой полипептид, который включает, состоит по существу из или состоит из аминокислот 30-110 SEQ ID NO: 9. Поэтому полипептиды ActRIIA могут, например, включать, состоять по существу из или состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична части ActRIIA, начинающейся с остатка, соответствующего любой из аминокислот 21-30 (например, начинающейся с любой из аминокислот 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) SEQ ID NO: 9, и заканчивающейся в положении, соответствующем любой из аминокислот 110-135 (например, заканчивающейся любой из аминокислот 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 или 135) SEQ ID NO: 9. Другие примеры включают конструкции, которые начинаются в положении, выбранном из 21-30 (например, начинаются с любой из аминокислот 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), 22-30 (например, начинаются с любой из аминокислот 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), 23-30 (например, начинаются с любой из аминокислот 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), 24-30 (например, начинаются с любой из аминокислот 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) SEQ ID NO: 9, и заканчиваются в положении, выбранном из 111-135 (например, заканчиваются любой из аминокислот 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 или 135), 112-135 (например, заканчиваются любой из аминокислот 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 или 135), 113-135 (например, заканчиваются любой из аминокислот 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 или 135), 120-135 (например, заканчиваются любой из аминокислот 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 или 135), 130-135 (например, заканчиваются любой из аминокислот 130, 131, 132, 133, 134 или 135), 111-134 (например, заканчиваются любой из аминокислот 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 или 134), 111-133 (например, заканчиваются любой из аминокислот 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 или 133), 111-132 (например, заканчиваются любой из аминокислот 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 или 132) или 111-131 (например, заканчиваются любой из аминокислот 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 или 131) SEQ ID NO: 9. Варианты в этих пределах также предусматриваются, особенно те, которые включают, состоят по существу из или состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична соответствующей части SEQ ID NO: 9. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полипептид ActRIIA может включать, состоять по существу из или состоять из полипептида, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен аминокислотам 30-110 SEQ ID NO: 9. Необязательно, ActRIIA полипептиды включают полипептид, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен аминокислотам 30-110 SEQ ID NO: 9 и включает не больше чем 1, 2, 5, 10 или 15 консервативных аминокислотных изменений в лиганд-связывающем кармане.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антагонистам (ингибиторам) GDF/BMP, которые включают полипептид ActRIIA, который включает фрагменты, функциональные варианты и их модифицированные формы, а также к их применениям (например, для повышения иммунного ответа у пациента, нуждающегося в этом, и лечения рака). Предпочтительно, полипептиды ActRIIA являются растворимыми (например, внеклеточный домен ActRIIA). В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIA ингибируют (например, Smad-передача сигналов) один или несколько GDF/BMP лигандов [например, GDF11, GDF8, активин (активин A, активин B, активин AB, активин C, активин E) BMP6, GDF3, BMP15 и/или BMP10]. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIA связываются с одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (активин A, активин B, активин AB, активин C, активин E) BMP6, GDF3, BMP15 и/или BMP10]. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIA по изобретению включают, состоят по существу из или состоят из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична части ActRIIA, начинающейся с остатка, соответствующего аминокислотам 21-30 (например, начинающейся с любой из аминокислот 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) SEQ ID NO: 9, и заканчивающейся в положении, соответствующем любой из аминокислот 110-135 (например, заканчивающейся любой из аминокислот 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 или 135) SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIA включают, состоят или состоят по существу из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 30-110 SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRIIA включают, состоят или состоят по существу из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 21-135 SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления ActRII A полипептиды включают, состоят или состоят по существу из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 9, 10, 11, 32, 36 и 39.

В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к полипептидам-ловушкам GDF (также указаны "ловушки GDF"). В некоторых вариантах осуществления ловушки GDF по настоящему изобретению являются вариантными полипептидами ActRII (например, полипептиды ActRIIA и ActRIIB), которые включают одну или несколько мутаций (например, аминокислотные добавления, делеции, замены и их комбинации) во внеклеточном домене (также указан как лиганд-связывающий домен) полипептида ActRII (например, "дикого типа" или немодифицированного полипептида ActRII) таким образом, чтобы вариантный полипептид ActRII имел одну или несколько измененных лиганд-связывающих активностей по сравнению с соответствующим полипептидом ActRII дикого типа. В предпочтительных вариантах осуществления полипептиды-ловушки GDF по настоящему изобретению сохраняют по меньшей мере одну аналогичную активность, как у соответствующего полипептида ActRII дикого типа. Например, предпочтительные ловушки GDF связываются с GDF11 и/или GDF8 и ингибируют (например, антагонизируют) их функцию. В некоторых вариантах осуществления ловушки GDF по настоящему изобретению также связываются содним или несколькими лигандами GDF/BMP и ингибируют их. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает полипептиды-ловушки GDF, которые имеют измененную специфичность связывания в отношении одного или нескольких ActRII лигандов.

Для иллюстрации, можно выбрать одну или несколько мутаций, которые повышают селективность измененного лиганд-связывающего домена в отношении GDF11 и/или GDF8 по сравнению с одним или несколькими ActRII-связывающимися лигандами, такими как активины (активин A, активин B, активин AB, активин C и/или активин E), в частности, активин A. Необязательно, измененный лиганд-связывающий домен имеет отношение K_d для связывания активина к K_d для связывания GDF11 и/или GDF8, которое по меньшей мере в 2, 5, 10, 20, 50, 100 или даже 1000 раз больше по сравнению с отношением для лиганд-связывающего домена дикого типа. Необязательно, измененный лиганд-связывающий домен имеет отношение ИК₅₀ для ингибирования активина к ИК₅₀ для ингибирования GDF11 и/или GDF8, которое по меньшей мере в 2, 5, 10, 20, 50, 100 или даже 1000 раз больше по сравнению с отношением для лиганд-связывающего домена дикого типа. Необязательно, измененный лиганд-связывающий домен ингибирует GDF11 и/или GDF8 с ИК₅₀ по меньшей мере в 2, 5, 10, 20, 50, 100 или даже 1000 раз меньше, чем ИК₅₀ для ингибирования активина.

Аминокислотные остатки белков ActRIIB (например, E39, K55, Y60, K74, W78, L79, D80 и F101 в соответствии с SEQ ID NO: 1) находятся в лиганд-связывающем кармане ActRIIB и способствуют опосредованному связыванию с его лигандами, включая, например, активин A, GDF11 и GDF8. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает полипептиды-ловушки GDF, включающие измененный лиганд-связывающий домен (например, GDF8/GDF11-связывающий домен) ActRIIB рецептора, который включает одну или несколько мутаций по этим аминокислотным остаткам.

В качестве конкретного примера, положительно заряженный аминокислотный остаток Asp (D80) лиганд-связывающего домена ActRIIB может быть мутирован в другой аминокислотный остаток с образованием полипептида-ловушки GDF, который преимущественно связывается с GDF8, но не с активином. Предпочтительно, D80 остаток в соответствии с SEQ ID NO: 1 изменяется на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из следующих: незаряженный аминокислотный остаток, отрицательно заряженный аминокислотный остаток и гидрофобный аминокислотный остаток. В качестве другого конкретного примера, гидрофобный остаток L79 SEQ ID NO: 1 может быть изменен для придания измененных активин-GDF11/GDF8 связывающих свойств. Например, L79P замена снижает связывание GDF11 в большей степени, чем связывание активина. В отличие от этого, замена L79 кислой аминокислотой [аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой; замена L79D или L79E] сильно снижает аффинность к связыванию активина A, сохраняя при этом аффинность к связыванию GDF11. В иллюстративных вариантах осуществления в способах, описанных в настоящей заявке, используют полипептид-ловушку GDF, который представляет собой вариантный полипептид ActRIIB, включающий кислую аминокислоту (например, D или E) в положении, соответствующем положению 79 SEQ ID NO: 1, необязательно в комбинации с одной или несколькими дополнительными аминокислотными заменами, добавлениями или делециями.

В некоторых аспектах, изобретение относится к полипептидам ALK4 и их применению. В контексте настоящей заявки термин "ALK4" относится к семейству белков активиновый рецептор-подобной киназы-4 из любого вида и вариантам, являющимся производными таких ALK4 белков в результате мутагенеза или другой модификации. Указание на ALK4 в настоящей заявке следует понимать как относящееся к любой из идентифицированных на данный момент форм. Члены ALK4 семейства, как правило, представляют собой трансмембранные белки, состоящие из лиганд-связывающего внеклеточного домена с богатой цистеином областью, трансмембранного домена и цитоплазматического домена с предсказанной серин/треонинкиназной активностью.

Термин "ALK4 полипептид" включает полипептиды, включающие любой природный полипептид из членов ALK4 семейства, а также любые его варианты (включая мутанты, фрагменты, слияния и пептидомиметические формы), которые сохраняют полезную активность.

Нумерация аминокислот для всех ALK4-родственных полипептидов, описанных в настоящей заявке, основана на нумерации последовательности белка-предшественника ALK4 человека, представленной ниже (SEQ ID NO: 100), если конкретно не указано иное.

Последовательность белка-предшественника ALK4 человека (NCBI Ref Seq NP_004293) является следующей:

Сигнальный пептид подчеркнут одной линией, а внеклеточный домен выделен жирным шрифтом.

Последовательность процессированного внеклеточного человеческого полипептида ALK4 является следующей:

Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок-предшественник ALK4, показана ниже (SEQ ID NO: 102), соответствующая нуклеотидам 78-1592 из референсной последовательности Genbank NM_004302.4. Сигнальная последовательность подчеркнута, а внеклеточный домен выделен жирным шрифтом.

Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая внеклеточный полипептид ALK4, является следующей:

Альтернативная изоформа последовательности белка-предшественника ALK4 человека, изоформа В (NCBI Ref Seq NP_064732.3) является следующей:

Внеклеточный домен выделен жирным шрифтом

Последовательность процессированного внеклеточного человеческого полипептида ALK4 является следующей:

Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок-предшественник ALK4, показана ниже (SEQ ID NO: 106), соответствующая нуклеотидам 186-1547 из референсной последовательности Genbank NM_020327.3. Нуклеотиды, кодирующие внеклеточный домен, выделены жирным шрифтом.

Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая внеклеточный полипептид ALK4 (изоформа В), является следующей:

ALK4 является высококонсервативным среди позвоночных, при этом большие участки внеклеточного домена являются полностью консервативными. Например, Фиг. 18 показывает множественное выравнивание последовательностей внеклеточного домена человеческого ALK4 по сравнению с различными ALK4 ортологами. Многие из лигандов, которые связываются с ALK4, также являются высококонсервативными. Соответственно, из этих выравниваний можно предсказать ключевые аминокислотные положения в лиганд-связывающем домене, которые являются важными для нормальных активностей связывания ALK4-лиганд, а также предсказать аминокислотные положения, которые могут быть приемлемыми для замены без существенного изменения нормальных активностей связывания ALK4-лиганд. Поэтому активный человеческий ALK4 вариантный полипептид, полезный в соответствии со способами по настоящему изобретению, может включать одну или несколько аминокислот в соответствующих положениях из последовательности ALK4 другого позвоночного или может включать остаток, который подобен остатку в последовательностях человека или других позвоночных.

Не будучи ограничивающими, следующие примеры иллюстрируют этот подход к определению активного варианта ALK4. Как проиллюстрировано на Фиг. 18, V6 в человеческом внеклеточном домене ALK4 (SEQ ID NO: 126) представляет собой изолейцин в ALK4 Mus muculus (SEQ ID NO: 130), и, таким образом, это положение может быть изменено, и необязательно может быть изменено на другой гидрофобный остаток, такой как L, I или F, или неполярный остаток, такой как A, как наблюдается в ALK4 Gallus gallus (SEQ ID NO: 129). E40 в человеческом внеклеточном домене представляет собой K в ALK4 Gallus gallus, указывая на то, что этот сайт может выдержать множество различных изменений, включая полярные остатки, такие как E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, и возможно неполярный остаток, такой как A. S15 в человеческом внеклеточном домене представляет собой D в ALK4 Gallus gallus, указывая на то, что широкая структурная вариация допустима в этом положении, при этом предпочтительны полярные остатки, такие как S, T, R, E, K, H, G, P, G и Y. E40 в человеческом внеклеточном домене представляет собой K в ALK4 Gallus gallus, указывая на то, что заряженные остатки будут допустимы в этом положении, включая D, R, K, H, а также Q и N. R80 в человеческом внеклеточном домене представляет собой K в ALK4 Condylura cristata (звездоноса)(SEQ ID NO: 127), указывая на то, что основные остатки допустимы в этом положении, включая R, K и H. Y77 в человеческом внеклеточном домене представляет собой F в ALK4 Sus scrofa (дикого кабана) (SEQ ID NO: 131), указывая на то, что ароматические остатки допустимы в этом положении, включая F, W и Y. P93 в человеческом внеклеточном домене является относительно низкоконсервативным, наблюдаемый как S в ALK4 Erinaceus europaeus (ежа обыкновенного) (SEQ ID NO: 128) и N в ALK4 Gallus gallus, таким образом, по существу любая аминокислота должна быть приемлемой в этом положении.

Кроме того, ALK4 белки были охарактеризованы в известном уровне техники в соответствии со структурными и функциональными характеристиками, в частности, что касается связывания с лигандом [например, Harrison et al. (2003) J Biol Chem 278(23):21129-21135; Romano et al. (2012) J Mol Model 18(8): 3617-362S; и Calvanese et al. (2009) 15(3): 175-183]. В дополнение к раскрытию, содержащемуся в настоящей заявке, эти ссылочные документы содержат достаточно указаний, как получить ALK4 варианты, которые сохраняют одну или несколько обычных активностей (например, лиганд-связывающую активность).

Например, определяющий структурный мотив, известный как трехпальцевая токсиновая складка, является важным для связывания лиганда рецепторами типа I и типа II и образован консервативными цистеиновыми остатками, расположенными в различных положениях во веклеточном домене каждого мономерного рецептора [Greenwald et al., (1999) Nat Struct Biol 6: 18-22; и Hinck (2012) FEBS Lett 586: 1860-1870]. Соответственно, коровые лиганд-связывающие домены человеческого ALK4, демаркированные наиболее удаленными из этих консервативных цистеинов, соответствуют положениям 34-101 SEQ ID NO: 100 (предшественник ALK4). Структурно менее упорядоченные аминокислоты, фланкирующие эти цистеин-демаркированные коровые последовательности, могут быть усечены на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 остатка по N-концу и/или на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатков по С-концу, не вызывая обязательного изменения связывания с лигандом. Примеры внеклеточных доменов ALK4 для N-концевого и/или C-концевого усечения включают SEQ ID NO: 101 и 105.

Соответственно, общая формула для активной части (например, лиганд-связывающей части) ALK4 включает аминокислоты 34-101 в соответствии с SEQ ID NO: 100. Поэтому полипептиды ALK4 могут, например, включать, состоять по существу из или состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична части ALK4, начинающейся с остатка, соответствующего любой из аминокислот 24-34 (например, начинающейся с любой из аминокислот 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34) SEQ ID NO: 100, и заканчивающейся в положении, соответствующем любой из аминокислот 101-126 (например, заканчивающейся любой из аминокислот 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 или 126) SEQ ID NO: 100. Другие примеры включают конструкции, которые начинаются в положении 24-34 (например, любом из положений 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34), 25-34 (например, любом из положений 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34) или 26-34 (например, любом из положений 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34) SEQ ID NO: 100, и заканчиваются в положении 101-126 (например, любом из положений 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 или 126), 102-126 (например, любом из положений 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 или 126), 101-125 (например, любом из положений 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 или 125), 101-124 (например, любом из положений 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123 или 124), 101-121 (например, любом из положений 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 или 121), 111-126 (например, любом из положений 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 или 126), 111-125 (например, любом из положений 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 или 125), 111-124 (например, любом из положений 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123 или 124), 121-126 (например, любом из положений 121, 122, 123, 124, 125 или 126), 121-125 (например, любом из положений 121, 122, 123, 124 или 125), 121-124 (например, любом из положений 121, 122, 123 или 124) или 124-126 (например, любом из положений 124, 125 или 126) SEQ ID NO: 100. Варианты в этих пределах также предусматриваются, особенно те, которые имеют идентичность по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% с соответствующей частью SEQ ID NO: 100.

Варианты, описанные в настоящей заявке, можно комбинировать различными способами. В некоторых вариантах осуществления ALK4 варианты включают не больше чем 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 15 консервативных аминокислотных изменений в лиганд-связывающем кармане. Сайты вне связывающего кармана, в которых вариабельность может быть особенно хорошо переносимой, включают амино и карбокси концы внеклеточного домена (как отмечено выше)

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антагонистам BMP/GDF, которые являются гетеромультимерами, включающими по меньшей мере один полипептид ALK4, который включает фрагменты, функциональные варианты и их модифицированные формы, а также к их применениям (например, для лечения, профилактики или уменьшения тяжести ЛАГ или одного или нескольких осложнений ЛАГ). Предпочтительно, полипептиды ALK4 являются растворимыми (например, внеклеточный домен ALK4). В некоторых вариантах осуществления гетеромультимеры, включающие полипептид ALK4, ингибируют (например, Smad-передача сигналов) один или несколько лигандов TGFβ суперсемейства [например, GDF11, GDF8, активин (активин A, активин B, активин AB, активин C, активин E) BMP6, GDF3, BMP 10 и/или BMP9]. В некоторых вариантах осуществления гетеромультимеры, включающие полипептид ALK4, связываются с одним или несколькими лигандами TGFβ суперсемейства [например, GDF11, GDF8, активином (активин A, активин B, активин AB, активин C, активин E) BMP6, GDF3, BMP 10 и/или BMP9]. В некоторых вариантах осуществления гетеромультимеры включают по меньшей мере один полипептид ALK4, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100% идентичен аминокислотам 34-101 в соответствии с SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах осуществления гетеромультимеры включают по меньшей мере один ALK4 полипептид, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100, 101, 104, 10S, 111, 113, 116, 117, 122 и 124. В некоторых вариантах осуществления гетеромультимер включает по меньшей мере один ALK4 полипептид, который состоит или состоит по существу из по меньшей мере одного полипептида ALK4, который по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122 и 124.

В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к гетеромультимерным комплексам, включающим один или несколько полипептидов ALK4 рецептора (например, SEQ ID No: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117, 122 и 124 и их варианты) и один или несколько полипептидов ActRIIB рецептора (например, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 73, 77, 78, 108, 110, 114, 115, 118 и 120 и их варианты), которые как правило, указаны в настоящей заявке как "ALK4:ActRIIB гетеромультимерные комплексы" или "ALK4:ActRIIB гетеромультимеры", а также к их применениям (например, для усиления иммунного ответа у пациента, нуждающегося в этом, и лечения рака). Предпочтительно, ALK4:ActRIIB гетеромультимеры являются растворимыми [например, гетеромультимерный комплекс включает растворимую часть (домен) ALK4 рецептора и растворимую часть (домен) ActRIIB рецептора]. Как правило, внеклеточные домены ALK4 и ActRIIB соответствуют растворимой части этих рецепторов. Поэтому в некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают внеклеточный домен ALK4 рецептора и внеклеточный домен ActRIIB рецептора. В некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры ингибируют (например, Smad-передача сигналов) один или несколько лигандов TGFβ суперсемейства [например, GDF11, GDF8, активин (активин A, активин B, активин AB, активин C, активин E) BMP6, GDF3, BMP 10 и/или BMP9]. В некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры связываются с одним или несколькими лигандами TGFβ суперсемейства [например, GDF11, GDF8, активином (активин A, активин B, активин AB, активин C, активин E) BMP6, GDF3, BMP 10 и/или BMP9]. В некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают по меньшей мере один полипептид ALK4, который включает, состоит по существу из или состоит из последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100, 101, 104, 105, 111, 113, 116, 117,, 122 и 124. В некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимерные комплексы по изобретению включают по меньшей мере один полипептид ALK4, который включает, состоит по существу из, состоит из последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична части ALK4, начинающейся с остатка, соответствующего любой из аминокислот 24-34, 25-34 или 26-34 SEQ ID NO: 100, и заканчивающейся в положении 101-126, 102-126, 101-125, 101-124, 101-121, 111-126, 111-125, 111-124, 121-126, 121-125, 121-124 или 124-126 SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают по меньшей мере один полипептид ALK4, который включает, состоит по существу из, состоит из последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 34-101 в соответствии с SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах осуществления ALK4-ActRIIB гетеромультимеры включают по меньшей мере один полипептид ActRIIB, который включает, состоит по существу из, состоит из последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 73, 77, 78, 108, 110, 114, 115, 118 и 120. В некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимерные комплексы по изобретению включают по меньшей мере один полипептид ActRIIB, который включает, состоит по существу из, состоит из последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична части ActRIIB, начинающейся с остатка, соответствующего любой из аминокислот 20-29, 20-24, 21-24, 22-25 или 21-29, и заканчиваются в положении 109-134, 119-134, 119-133, 129-134 или 129-133 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают по меньшей мере один полипептид ActRIIB, который включает, состоит по существу из, состоит из последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 29-109 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимеры включают по меньшей мере один полипептид ActRIIB, который включает, состоит по существу из, состоит из последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 25-131 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления ALK4:ActRIIB гетеромультимерные комплексы по изобретению включают по меньшей мере один полипептид ActRIIB, где положение, соответствующее L79 SEQ ID NO: 1, не является кислой аминокислотой (т.е. не-природными D или E аминокислотными остатками или искусственным кислым аминокислотным остатком). ALK4:ActRIIB гетеромультимеры по изобретению включают, например, гетеродимеры, гетеротримеры, гетеротетрамеры и другие олигомерные структуры высшего порядка. См., например, Фиг. 21-23. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления гетеромультимерные комплексы по изобретению представляют собой ALK4:ActRIIB гетеродимеры.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии рассматривается создание функциональных вариантов путем модификации структуры полипептида ActRII и/или ALK4 для таких целей, как повышение терапевтической эффективности или стабильности (например, срока годности и устойчивости к протеолитическому разложению in vivo). Варианты могут быть получены путем аминокислотной замены, делеции, добавления или их комбинации. Например, разумно ожидать, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или аналогичная замена аминокислоты структурно родственной аминокислотой (например, консервативные мутации) не будут оказывать существенного влияния на биологическую активность получаемой молекулы. Консервативными заменами являются такие, которые происходят в семействе аминокислот, которые являются родственными по их боковым цепям. Может ли изменение аминокислотной последовательности полипептида по изобретению привести к функциональному гомологу, легко можно определить путем оценки способности вариантного полипептида вызывать ответ в клетках таким же образом, как полипептид дикого типа, или связываться с одним или несколькими TGF-бета-лигандами, включая, например, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, белок Nodal, глиальный нейротрофический фактор (GDNF), нейротурин, артемин, персефин, MIS и Lefty.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии рассматриваются конкретные мутации полипептида ActRII и/или ALK4, чтобы таким образом изменить гликозилирование полипептида. Такие мутации могут быть выбраны так, чтобы обеспечить введение или элиминирование одного или нескольких сайтов гликозилирования, таких как O-связанные или N-связанные сайты гликозилирования. Сайты распознавания связанного с аспарагином гликозилирования обычно содержат трипептидную последовательность, аспарагин-Х-треонин или аспарагин-Х-серин (где "Х" означает любую аминокислоту), которая специфически распознается соответствующими клеточными ферментами гликозилирования. Изменение также можно осуществить путем добавления одного или нескольких сериновых или треониновых остатков, или замены ими, к последовательности полипептида (для O-связанных сайтов гликозилирования). Различные аминокислотные замены или делеции в одном или обоих из первого или третьего аминокислотных положений сайта распознавания гликозилирования (и/или аминокислотная делеция во втором положении) приводят к отсутствию гликозилирования в модифицированной трипептидной последовательности. Другим средством увеличения количества углеводных фрагментов в полипептиде является химическое или ферментативное связывание гликозидов с полипептидом. В зависимости от способа связывания, который используют, сахар(сахара) может присоединяться к (а) аргинину и гистидину; (b) свободным карбоксильным группам; (c) свободным сульфгидрильным группам, таким как в цистеине; (d) свободным гидроксильным группам, таким как присутствующие в серине, треонине или гидроксипролине; (е) ароматическим остаткам, таким как фенилаланиновые, тирозиновые или триптофановые остатки; или (f) амидной группе глутамина. Удаление одного или нескольких углеводных фрагментов, присутствующих в полипептиде, можно осуществить химически и/или ферментативно. Химическое дегликозилирование может включать, например, воздействие на полипептид соединением трифторметансульфокислоты или эквивалентным соединением. Эта обработка приводит к расщеплению большей части или всех сахаров, кроме связывающего сахара (N-ацетилглюкозамин или N-ацетилгалактозамин), при этом аминокислотная последовательность остается интактной. Ферментативное расщепление углеводных остатков на полипептидах можно осуществить путем использования множества эндо- и экзогликозидаз, как описано Thotakura et al. [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]. Последовательность полипептида может быть скорректирована подходящим образом в зависимости от типа используемой системы экспрессии, поскольку клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых и растений все могут вводить различные паттерны гликозилирования, на которые может влиять аминокислотная последовательность пептида. Как правило, экспрессию полипептидов по настоящему изобретению для применения для человека можно осуществить в клеточной линии млекопитающего, которая обеспечивает соответствующее гликозилирование, такой как клеточные линии HEK293 или CHO, хотя, как ожидают, другие экспрессирующие клеточные линии млекопитающих также будут полезными.

Настоящее раскрытие также рассматривает способ получения мутантов, в частности, наборов комбинаторных мутантов полипептида ActRII и/или ALK4, а также усеченных мутантов. Пулы комбинаторных мутантов особенно полезны для идентификации последовательностей функционально активных (например, GDF/BMP лиганд-связывающих) ActRII. Целью скрининга таких комбинаторных библиотек может быть создание, например, вариантов полипептидов, которые имеют измененные свойства, такие как измененные фармакокинетические или измененные лиганд-связывающие свойства. Различные скрининговые анализы представлены ниже, и такие анализы можно использовать для оценки вариантов. Например, варианты ActRII и/или ALK4 и гетеромультимеры, включающие их, можно скринировать на способность связываться с одним или несколькими GDF/BMP лигандами (такими как BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/M1C1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, активин A, активин B, активин AB, активин AC, белок Nodal, глиальный нейротрофический фактор (GDNF), нейротурин, артемин, персефин, MIS и Lefty) для предотвращения связывания GDF/BMP лиганда с полипептидом ActRII и/или ALK4, а также их гетеромультимерами, и/или чтобы препятствовать передаче сигнала, вызываемой GDF/BMP лигандом.

Активность полипептидов ActRII, полипептидов ALK4 и ALK4:ActRIIB гетеродимеров также можно оценить в клеточном или in vivo анализах. Например, оценивают эффект полипептида ActRII, полипептида ALK4 или ALK4:ActRIIB гетеродимера на экспрессию генов, вовлеченных в патогенез ЛГ. Это можно, при необходимости, осуществить в присутствии одного или нескольких рекомбинантных лигандных белков (например, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP 8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF#BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, белок Nodal, глиальный нейротрофический фактор (GDNF), нейротурин, артемин, персефин, MIS и Lefty), и клетки можно трансфицировать таким образом, чтобы продуцировать полипептид ActRII, полипептид ALK4 или ALK4:ActRIIB гетеродимер и, необязательно, GDF/BMP лиганд. Подобным образом, полипептид ActRII, полипептид ALK4 или ALK4:ActRIIB гетеродимер можно вводить мыши или другому животному и можно оценивать эффекты на патогенез ЛГ с использованием способов, признанных в данной области техники. Подобным образом, активность полипептида ActRII, полипептида ALK4 или ALK4:ActRIIB гетеродимера или их варианта может быть испытана в клетках-предшественниках клеток крови на любой эффект на рост этих клеток, например, с использованием анализов, описанных в настоящей заявке, и хорошо известных из уровня техники. SMAD-респонсивный репортерный ген можно использовать в таких клеточных линиях для отслеживания эффектов на нисходящий сигнальный путь.

Могут быть получены комбинаторные варианты, которые обладают повышенной селективностью или, как правило, повышенной эффективностью по сравнению с эталонным полипептидом ActRII, полипептидом ALK4 или гетеродимером ALK4:ActRIIB. Такие варианты, когда они экспрессируются из рекомбинантных ДНК-конструкций, могут использоваться в протоколах генной терапии. Аналогичным образом, мутагенез может привести к вариантам, которые имеют резко отличающиеся внутриклеточные периоды полужизни по сравнению с соответствующиим немодифицированным полипептидом ActRII, полипептидом ALK4 или гетеродимером ALK4:ActRIIB. Например, измененный белок можно сделать либо более устойчивым, либо менее устойчивым к протеолитическому разложению или другим клеточным процессам, которые приводят к разрушению или иной инактивации немодифицированного полипептида. Такие варианты и гены, которые их кодируют, можно использовать для изменения уровней полипептидного комплекса путем модуляции периода полужизни полипептида. Например, короткий период полужизни может вызывать более кратковременные биологические эффекты и, будучи частью индуцибельной системы экспрессии, может обеспечивать более жесткий контроль уровней рекомбинантного полипептидного комплекса в клетке. В слитом белке Fc можно осуществить мутации в линкере (если он присутствует) и/или в Fc части для изменения периода полужизни полипептида ActRII, полипептида ALK4 или гетеродимера ALK4:ActRIIB.

Комбинаторную библиотеку можно получить с использованием вырожденной библиотеки генов, кодирующих библиотеку полипептидов, каждый из которых включает, по меньшей мере, часть потенциальных последовательностей полипептида ActRII, полипептида ALK4 или гетеродимера ALK4:ActRIIB. Например, смесь синтетических олигонуклеотидов может быть ферментативно лигирована в последовательности генов так, чтобы вырожденный набор нуклеотидных последовательностей, кодирующих потенциальный ActRII и/или ALK4, мог экспрессироваться в виде отдельных полипептидов или, альтернативно, в виде набора более крупных слитых белков (например, для фагового дисплея).

Существует много способов, которыми можно получить библиотеку потенциальных гомологов из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Химический синтез вырожденной генной последовательности может быть осуществлен в автоматическом ДНК синтезаторе, а затем синтетические гены могут быть лигированы в подходящий вектор для экспрессии. Синтез вырожденных олигонуклеотидов хорошо известен в данной области [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; и Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. Такие методы используют в направленной эволюции других белков [Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; а также патенты США №№: 5223409, 5198346 и 5096815].

Альтернативно, другие формы мутагенеза можно использовать для получения комбинаторной библиотеки. Например, полипептиды ActRII, полипептиды ALK4 и ALK4:ActRIIB гетеродимеры по изобретению могут быть образованы и выделены из библиотеки методом скрининга с использованием, например, аланин-сканирующего мутагенеза [Ruf et al. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al. (1994) J. Biol. Chem, 269:3095-3099; Balint et al. (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al. (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al. (1993) J. Biol. Chem, 268:2888-2892; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30:10832-10838; и Cunningham et al. (1989) Science 244:1081-1085], линкер-сканирующего мутагенеза [Gustin et al. (1993) Virology 193:653-660; и Brown et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al. (1982) Science 232:316], насыщающего мутагенеза [Meyers et al, (1986) Science 232:613]; ПЦР мутагенеза [Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; или случайного мутагенеза, включая химический мутагенез [Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; и Greener et al. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]. Линкер-сканирующий мутагенез, особенно в комбинаторных условиях, является привлекательным способом для идентификации усеченных (биоактивных) форм полипептидов ActRII, полипептидов ALK4 или ALK4:ActRILB гетеродимеров.

В данной области техники известно множество различных методов для скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, созданных точечными мутациями и усечениями, а также для скрининга библиотек кДНК на генные продукты, имеющие определенное свойство. Такие методы, как правило, могут быть адаптированы для быстрого скрининга библиотек генов, генерируемых комбинаторным мутагенезом полипептидов ActRII. Наиболее широко используемые методы скрининга больших библиотек генов обычно включают клонирование библиотеки генов в реплицируемые векторы экспрессии, трансформацию соответствующих клеток при помощи полученной библиотеки векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, в которых детекция желаемой активности облегчает относительно легкое выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого выявляют. Предпочтительные анализы включают анализы связывания лиганда (например, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, активина A, активина B, активина C, активина E, активина AB, активина AC, белка Nodal, глиального нейротрофического фактора (GDNF), нейротурина, артемина, персефина, MIS и Lefty) и/или анализы лиганд-опосредованной клеточной сигнализации.

Как должно быть понятно специалистам в данной области, большинство из описанных мутаций, вариантов или модификаций, описанных в настоящей заявке, можно осуществить на науклеиновокислотном уровне или, в некоторых случаях, путем пост-трасляционной модификации или химического синтеза. Такие методы хорошо известны в данной области, и некоторые из них описаны в настоящей заявке. Частью, настоящее раскрытие идентифицирует функционально активные части (фрагменты) и варианты полипептидов ActRII, полипептидов ALK4 или ALK4:ActRIIB гетеродимеров, которые можно использовать как руководство для получения и использования других вариантных полипептидов ActRII в объеме изобретений, описанных в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления функционально активные фрагменты полипептидов ActRII, полипептидов ALK4 и гетеродимеров ALK4:ActRIIB по настоящему изобретению могут быть получены путем скрининга полипептидов, рекомбинантно полученных из соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды ActRII и/или ALK4. Кроме того, фрагменты можно химически синтезировать с использованием методов, известных в данной области техники, таких как традиционная твердофазная f-Moc или t-Boc химия Меррифльда. Фрагменты могут быть получены (рекомбинантно или химическим синтезом) и протестированы для идентификации тех пептидильных фрагментов, которые могут функционировать как антагонисты (ингибиторы) рецепторов ActRII и/или ALK4 и/или одного или нескольких лигандов (таких как BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-βI, TGF-p2, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, белок Nodal, глиальный нейротрофический фактор (GDNF), нейротурин, артемин, персефин, MIS и Lefty).

В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRII, полипептид ALK4 и/или гетеродимер ALK4:ActRIIB по настоящему изобретению может дополнительно включать посттрансляционные модификации в дополнение к любой, естественно присутствующей в полипептиде ActRII, полипептиде ALK4 или гетеродимере ALK4:ActRIIB. Такие модификации включают, но не ограничиваются этим, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. В результате, полипептид ActRII, полипептид ALK4 или гетеродимер ALK4:ActRIIB могут содержать не-аминокислотные элементы, такие как полиэтиленгликоли, липиды, полисахарид или моносахарид и фосфаты. Влияние таких не-аминокислотных элементов на функциональность полипептида-ловушки лиганда можно определить, как описано в настоящей заявке для других вариантов ActRII, AKL4 и ALK4:ActRIIB. Когда полипептид по изобретению продуцируется в клетках путем расщепления зарождающейся формы полипептида, посттрансляционный процессинг также может быть важен для правильной укладки и/или функции белка. Различные клетки (например, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 или HEK293) имеют специфические клеточные механизмы и характерные механизмы для таких посттрансляционных активностей и могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга полипептидов ActRII.

В некоторых аспектах, полипептиды ActRII и ALK4 по настоящему изобретению включают слитые белки, имеющие по меньшей мере часть (домен) полипептида ActRII или ALK4 и одну или несколько гетерологичных частей (доменов). Хорошо известные примеры таких слитых доменов включают, но не ограничиваются этим, полигистидин, Glu-Glu, глутатион-S-трансферазу (GST), тиоредоксин, белок A, белок G, константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (Fc), мальтоза-связывающий белок (MBP) или человеческий сывороточный альбумин. Домен слияния может быть выбран так, чтобы придать желаемое свойство. Например, некоторые домены слияния особенно полезны для выделения слитых белков при помощи аффинной хроматографии. Для целей аффинной очистки используются соответствующие матрицы для аффинной хроматографии, такие как, глутатион-, амилаза- и никель- или кобальт- конъюгированные смолы. Многие из таких матриц доступны в форме "набора", например, система очистки Pharmacia GST и система QIAexpress™ (Qiagen), которые могут использоваться с партнерами слияния (HIS₆). В качестве другого примера, домен слияния может быть выбран так, чтобы облегчить детекцию полипептида ActRII или ALK4. Примеры таких доменов детекции включают различные флуоресцентные белки (например, GFP), а также "эпитопные метки", которые обычно представляют собой короткие пептидные последовательности, для которых имеется специфическое антитело. Хорошо известные эпитопные метки, для которых легко доступны специфические моноклональные антитела, включают FLAG, гем-агглютинин (HA) вируса гриппа и c-myc метки. В некоторых случаях домены слияния имеют сайт расщепления протеазой, такой как фактор Ха или тромбин, который позволяет соответствующей протеазе частично расщеплять слитые белки с высвобождением из них, таким образом, рекомбинантных белков. Высвобожденные белки затем могут быть отделены от домена слияния путем последующего хроматографического разделения. Другие типы доменов слияния, которые могут быть выбраны, включают мультимеризующие (например, димеризующие, тетрамеризирующие) домены и функциональные домены (которые обеспечивают дополнительную биологическую функцию), включая, например, константные домены из иммуноглобулинов (например, Fc-домены).

В некоторых аспектах, полипептиды ActRII и ALK4 по настоящему изобретению содержат одну или несколько модификаций, которые способны "стабилизировать" полипептиды. Под "стабилизацией" подразумевается все, что увеличивает период полужизни in vitro, период полужизни в сыворотке, независимо от того, происходит ли это из-за уменьшения деструкции, уменьшения выведения почками или другого фармакокинетического эффекта препарата. Например, такие модификации увеличивают срок хранения полипептидов, увеличивают период полужизни полипептидов в кровотоке и/или уменьшают протеолитическое разложение полипептидов. Такие стабилизирующие модификации включают, но не ограничиваются этим, слитые белки (включая, например, слитые белки, включающие ActRII полипептидный (или ALK4 полипептидный)домен и стабилизирующий домен), модификации сайта гликозилирования (включая, например, добавление сайта гликозилирования к полипептиду по изобретению) и модификации углеводного фрагмента (включая, например, удаление углеводных фрагментов из полипептида по настоящему изобретению). Используемый в настоящей заявке термин "стабилизирующий домен" относится не только к домену слияния (например, Fc-домену иммуноглобулина), как в случае слитых белков, но также включает небелковые модификации, такие как углеводный фрагмент или небелковый фрагмент, такой как полиэтиленгликоль. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления полипептид ActRII (или полипептид ALK4) слит с гетерологичным доменом, который стабилизирует полипептид (домен-"стабилизатор"), предпочтительно с гетерологичным доменом, который повышает стабильность полипептида in vivo. Известно, что слияния с константным доменом иммуноглобулина (например, Fc-доменом) придают желаемые фармакокинетические свойства широкому спектру белков. Аналогичным образом, слияния с человеческим сывороточным альбумином могут придавать желательные свойства.

Пример природной аминокислотной последовательности, которую можно использовать для Fc части человеческого IgG1 (G1Fc), показан ниже (SEQ ID NO: 14). Пунктирной линией подчеркнута шарнирная область, а сплошной линией подчеркнуты положения с природными вариантами. Частью, изобретение обеспечивает полипептиды, включающие, состоящие по существу из или состоящие из аминокислотных последовательностей с идентичностью 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO: 14. Природные варианты в G1Fc могут включать E134D и M136L в соответствии с системой нумерации, используемой в SEQ ID NO: 14 (см. Uniprot P01857).

Необязательно, IgG1 Fc домен имеет одну или несколько мутаций по остаткам, таким как Asp-265, лизин 322 и Asn-434. В некоторых случаях мутантный IgG1 Fc домен, имеющий одну или несколько из этих мутаций (например, Asp-265 мутацию), имеет пониженную способность связывания с Fcγ рецептором по сравнению с Fc доменом дикого типа. В других случаях мутантный Fc домен, имеющий одну или несколько из этих мутаций (например, Asn-434 мутацию), имеет повышенную способность связывания с MHC класса I-родственным Fc-рецептором (FcRN) по сравнению с IgG1 Fc доменом дикого типа.

Пример природной аминокислотной последовательности, которую можно использовать для Fc части человеческого IgG2 (G2Fc), показан ниже (SEQ ID NO: 15). Пунктирной линией подчеркнута шарнирная область, а двойное подчеркивание указывает положения, где имеются противоречия в базе данных в последовательности (в соответствии с UniProt P01859). Частью, изобретение обеспечивает полипептиды, включающие, состоящие по существу из или состоящие из аминокислотных последовательностей с идентичностью 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO: 15.

Два примера аминокислотных последовательностей, которые можно использовать для Fc-части человеческого IgG3 (G3Fc), показанные ниже. Шарнирная область в G3Fc может быть в четыре раза длиннее, чем в других цепях Fc, и содержит три идентичных сегмента из 15 остатков, которым предшествует аналогичный сегмент из 17 остатков. Первая последовательность G3Fc, показанная ниже (SEQ ID NO: 16), содержит короткую шарнирную область, состоящую из одного сегмента из 15 остатков, тогда как вторая последовательность G3Fc (SEQ ID NO: 17) содержит полноразмерную шарнирную область. В каждом случае пунктирной линией подчеркнута шарнирная область, а сплошной линией подчеркнуты положения с природными вариантами в соответствии с UniProt P01859. Частью, изобретение обеспечивает полипептиды, включающие, состоящие по существу из или состоящие из аминокислотных последовательностей с идентичностью 70%, 75%, 80%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO: 16 и 17.

Природные варианты в G3Fc (например, см. Uniprot P01860) включают E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y, преобразованные в систему нумерации, используемую в SEQ ID NO: 16, и настоящее раскрытие обеспечивает слитые белки, включающие G3Fc домены, содержащие один или несколько из этих вариантов. Кроме того, ген человеческого иммуноглобулина IgG3 (IGHG3) демонстрирует структурный полиморфизм, характеризующийся различными длинами шарнирной области [см. Uniprot P01859]. В частности, в варианте WIS отсутствует часть V-области и вся СН1 область. Он содержит дополнительную межцепочечную дисульфидную связь в положении 7, в дополнение к 11, обычно присутствующей в шарнирной области. В варианте ZUC отсутствует часть V-области, вся СН1 область и часть шарнирной области. Вариант OMM может представлять собой аллельную форму или другой подкласс гамма-цепи. Настоящее раскрытие обеспечивает дополнительные слитые белки, включающие G3Fc домены, содержащие один или несколько из этих вариантов.

Пример природной аминокислотной последовательности, которую можно использовать для Fc части человеческого IgG4 (G4Fc), показан ниже (SEQ ID NO: 18). Пунктирной линией подчеркнута шарнирная область. Частью, изобретение обеспечивает полипептиды, включающие, состоящие по существу из или состоящие из аминокислотных последовательностей с идентичностью 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO: 18.

Различные генноинженерные мутации в домене Fc представлены в отношении последовательности GIFc (SEQ ID NO: 14), и аналогичные мутации в G2Fc, G3Fc и G4Fc могут быть получены из их выравнивания с GIFc на Фиг. 4. Из-за неравных длин шарнирной области аналогичные положения Fc, основанные на выравнивании изотипа (Фиг. 4), имеют разные номера аминокислот в SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17 и 18. Также должно быть понятно, что данное аминокислотное положение в последовательности иммуноглобулина, состоящей из шарнирной, C_H2 и C_H3 (например, SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17 и 18) областей, будет указано другим номером, чем то же положение, когда нумерация охватывает весь константный домен тяжелой цепи IgG1 (состоящий из C_H1, шарнирной, C_H2 и C_H3 областей), как в базе данных Uniprot. Например, соответствие между выбранными C_H3 положениями в последовательности GIFc человека (SEQ ID NO: 14), константном домене тяжелой цепи человеческого IgG1 (Uniprot P01857) и тяжелой цепи человеческого IgG1 является следующим.

Соответствие C_H3 положений в различных системах нумерации GIFc (нумерация начинается с первого треонина в шарнирной области) Константный домен тяжелой цепи IgG1 (нумерация начинается с С_Н1) Тяжелая цепь IgG1 (EU нумерационная схема Kabat et al., 1991*) Y127 Y232 Y349 S132 S237 S354 E134 E239 E356 T144 T249 T366 L146 L251 L368 K170 K275 K392 D177 D282 D399 Y185 Y290 Y407 K187 K292 K409 * Kabat et al.(eds) 1991; pp. 688-696 in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th ed., Vol. 1, NIH, Bethesda, MD.

В некоторых аспектах, полипептиды, раскрытые в настоящей заявке, могут образовывать белковые комплексы, включающие по меньшей мере один ALK4 полипептид, связанный, ковалентно или нековалентно, с по меньшей мере одним полипептидом ActRIIB. Предпочтительно полипептиды, раскрытые в настоящей заявке, образуют гетеродимерные комплексы, хотя также включены гетеромультимерные комплексы высшего порядка (гетеромультимеры), такие как, но не ограничиваясь этим, гетеротримеры, гетеротетрамеры и другие олигомерные структуры (см., например, Фиг. 21-23). В некоторых вариантах осуществления полипептиды ALK4 и/или ActRIIB включают по меньшей мере один домен мультимеризации. Как раскрыто в настоящей заявке, термин "домен мультимеризации" относится к аминокислоте или последовательности аминокислот, которые промотируют ковалентное или нековалентное взаимодействие между по меньшей мере первым полипептидом и по меньшей мере вторым полипептидом. Полипептиды, раскрытые в настоящей заявке, могут быть связаны ковалентно или нековалентно с доменом мультимеризации. Предпочтительно, домен мультимеризации промотирует взаимодействие между первым полипептидом (например, полипептидом ALK4) и вторым полипептидом (например, полипептидом ActRIIB) для промотирования образования гетеромультимера (например, образования гетеродимера) и необязательно препятствует или иным образом оказывает негативное влияние на образование гомомультимера (например, образование гомодимера), повышая таким образом выход желаемого гетеромультимера (см., например, Фиг. 22).

Многие способы, известные в данной области, можно использовать для получения гетеромультимеров ALK4:ActRIIB. Например, не встречающиеся в природе дисульфидные связи можно сконструировать путем замены в первом полипептиде (например, полипептиде ALK4) природной аминокислоты свободный тиол-содержащим остатком, таким как цистеин, таким образом, чтобы свободный тиол взаимодействовал с другим свободный тиол-содержащим остатком во втором полипептиде (например, полипептиде ActRIIB), чтобы образовалась дисульфидная связь между первым и вторым полипептидом. Дополнительные примеры взаимодействий, способствующих образованию гетеромультимера, включают, но не ограничиваются этим, ионные взаимодействия, например, описанные в Kjaergaard et al., WO2007147901; эффекты электростатического взаимодействия, например, описанные в Kannan et al., US 8592562; межспиральные взаимодействия, например, описанные в Christensen et al., U.S.20120302737; лейциновые молнии, например, описанные в Pack & Plueckthun, (1992) Biochemistry 31: 1579-1584; и мотивы спираль-виток-спираль, например, описанные в Pack et al, (1993) Bio/Technology 11:1271-1277. Связывание различных сегментов можно осуществить, например, через ковалентное связывание, такое как химическое сшивание, пептидные линкеры, дисульфидные мостики и т.д., или аффинные взаимодействия, например, с использованием методов авидин-биотин или лейциновая молния.

В некоторых аспектах, домен мультимеризации может включать один компонент взаимодействующей пары. В некоторых вариантах осуществления полипептиды, раскрытые в настоящей заявке, могут образовывать белковые комплексы, включающие первый полипептид, ковалентно или нековалентно связанный с вторым полипептидом, где первый полипептид включает аминокислотную последовательность полипептида ALK4 и аминокислотную последовательность первого члена взаимодействующей пары, а второй полипептид включает аминокислотную последовательность полипептида ActRIIB и аминокислотную последовательность второго члена взаимодействующей пары. Взаимодействующая пара может представлять собой любые две полипептидные последовательности, которые взаимодействуют с образованием комплекса, в частности, гетеродимерного комплекса, хотя рабочие варианты осуществления также могут использовать взаимодействующую пару, которая может образовывать гомодимерный комплекс. Один член взаимодействующей пары может быть слит с полипептидом ALK4 или ActRIIB, как описано в настоящей заявке, включая например, полипептидную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 101 и 103. Взаимодействующая пара может быть выбрана для придания улучшенного свойства/активности, например, большего периода полужизни в сыворотке, или для действия в качестве адаптора, к которому присоедяется другой фрагмент для обеспечения улучшенного свойства/активности. Например, группа полиэтиленгликоля может быть присоединена к одному или обоим компонентам взаимодействующей пары для обеспечения улучшенного свойства/активности, например, большего периода полужизни в сыворотке.

Первый и второй члены взаимодействующей пары могут представлять собой асимметричную пару, что означает, что члены пары преимущественно вступают в ассоциацию друг с другом, а не в самоассоциацию. Соответственно, первый и второй члены асимметричной взаимодействующей пары могут связываться с образованием гетеродимерного комплекса (см., например, Фиг. 22). Альтернативно, взаимодействующая пара может быть ненаправляемой, что означает, что члены пары могут вступать в ассоциацию друг с другом или в самоассоциацию без существенного предпочтения и, таким образом, могут иметь одинаковые или разные аминокислотные последовательности. Соответственно, первый и второй члены ненаправляемой взаимодействующей пары могут вступать в ассоциацию с образованием гомодимерного комплекса или гетеродимерного комплекса. Необязательно, первый член взаимодействующей пары (например, асимметричной пары или ненаправляемой взаимодействующей пары) ковалентно связывается со вторым членом взаимодействующей пары. Необязательно, первый член взаимодействующей пары (например, асимметричной пары или ненаправляемой взаимодействующей пары) нековалентно связывается со вторым членом взаимодействующей пары.

В качестве конкретных примеров, настоящее изобретение обеспечивает слитые белки, включающие ALK4 или ActRIIB, слитый с полипептидом, включающим константный домен иммуноглобулина, такой как домен CH1, CH2 или CH3, происходящий из человеческого IgG1, IgG2, IgG3 и/или IgG4, который был модифицирован, чтобы способствовать образованию гетеромультимера. Проблема, которая возникает в крупномасштабном производстве асимметричных белков на основе иммуноглобулинов из одной клеточной линии, известна как "ассоциация цепей". Как заметно при производстве биспецифических антител, проблема ассоциации цепей связана с проблемой эффективного продуцирования желаемого многоцепочечного белка из множества комбинаций, которые по существу возникают, когда в одной клеточной линии образуются разные тяжелые цепи и/или легкие цепи. [Klein et al. (2012) mAbs 4: 653-663]. Эта проблема является наиболее острой, когда две разные тяжелые цепи и две разные легкие цепи продуцируются в одной и той же клеточной линии, и в этом случае имеется всего 16 возможных комбинаций цепей (хотя некоторые из них идентичны), когда обычно требуется только одна. Тем не менее, тот же принцип является причиной снижения выхода желаемого многоцепочечного слитого белка, который включает только две разные (асимметричные) тяжелые цепи.

В данной области техники известны различные способы, которые увеличивают желаемое спаривание Fc-содержащих слитых полипептидных цепей в одной клеточной линии для получения предпочтительного асимметричного слитого белка с приемлемыми выходами [Klein et al (2012) mAbs 4: 653-663; и Spiess et al. (2015) Molecular Immunology 67 (2A): 95-106]. Способы получения желаемого спаривания Fc-содержащих цепей включают, но не ограничиваются этим, спаривание на основе заряда (электростатическое взаимодействие), стерическое спаривание "выступы-во-впадины", SEEDbody спаривание и спаривание на основе лейциновой молнии [Ridgway et al. (1996) Protein Eng 9: 617-621; Merchant et al. (1998) Nat Biotech 16: 677-681; Davis et al. (2010) Protein Eng Des Sel 23: 195-202; Gunasekaran et al (2010); 285: 19637-19646; Wranik et al. (2012) J Biol Chem. 287: 43331-43339; US 5932448; WO 1993/011162; WO 2009/089004 и WO 2011/034605]. Как описано в настоящей заявке, эти способы можно использовать для получения гетеромультимерных комплексов ALK4-Fc:ActRIIB-Fc. См., например, Фиг. 23.

ALK4:ActRIIB гетеромультимеры и способ их получения были описаны ранее. См., например, WO 2016/164497, полное раскрытие которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Должно быть понятно, что различные элементы слитых белков (например, слитые белки Fc иммуноглобулина) могут быть расположены любым способом, который согласуется с желаемой функциональностью. Например, ActRII полипептидный (или ALK4 полипептидный) домен может находиться на С-конце относительно гетерологичного домена, или, альтернативно, гетерологичный домен может находиться на С-конце относительно ActRII полипептидного (или ALK4 полипептидного) домена. ActRII полипептидный (или ALK4 полипептидный) домен и гетерологичный домен необязательно должны быть смежными в слитом белке, и дополнительные домены или аминокислотные последовательности могут быть включены по C- или N-концу любого домена, либо между доменами.

Например, слитый белок ActRII (или ALK4) рецептора может включать аминокислотную последовательность, описанную в формуле A-B-C. B часть соответствует ActRII (или ALK4) полипептидному домену. A и C части независимо могут представлять собой ноль, одну или больше чем одну аминокислоту, и обе A и C части, когда присутствуют, гетерологичны B части. A и/или C части могут быть присоединены к B части через линкерную последовательность. Линкер может быть богат глицином (например, 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 глициновых остатка) или глициновыми и пролиновыми остатками и может, например, содержать одну последовательность из треонина/серина и глицинов или повторяющиеся последовательности из треонина/серина и/или глицинов, например, GGG (SEQ ID NO: 19), GGGG (SEQ ID NO: 20), TGGGG (SEQ ID NO: 21), SGGGG (SEQ ID NO: 22), TGGG (SEQ ID NO: 23), SGGG (SEQ ID NO: 24) или GGGGS (SEQ ID NO: 25) синглеты или повторы. В некоторых вариантах осуществления слитый белок ActRII (или ALK4) включает аминокислотную последовательность, описанную в формуле A-B-C, где A представляет собой лидерную (сигнальную) последовательность, B состоит из ActRII (или ALK4) полипептидного домена, и C представляет собой полипептидную часть, которая улучшает одно или несколько из стабильности in vivo, периода полужизни in vivo, поглощения/введения, локализации или дистрибуции в ткани, образования белковых комплексов и/или очистку. В некоторых вариантах осуществления слитый белок ActRII (или ALK4) включает аминокислотную последовательность, описанную в формуле A-B-C, где A представляет собой лидерную последовательность TPA, B состоит из полипептидного домена ActRII (или ALK4) рецептора, и C представляет собой Fc домен иммуноглобулина. Предпочтительные слитые белки включают аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 32, 36, 39, 40, 42, 45, 46, 48, 69, 74, 77, 78, 108, 110, 111, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 122 и 124.

В предпочтительных вариантах осуществления полипептиды ActRII, полипептиды ALK4 и гетеромультимеры ALK4:ActRIIB для использования в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, являются выделенными полипептидами. Как используется в настоящей заявке, выделенный белок или полипептид представляет собой белок, который был отделен от компонента его естественной среды. В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению очищен до чистоты более 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, как определено, например, методом электрофореза (например, SDS-PAGE, изоэлектрическое фокусирование (IEF) капиллярный электрофорез) или хроматографией (например, ионообменная или обращенно-фазовая ВЭЖХ). Способы оценки чистоты хорошо известны из уровня техники [см., например, Flatman et al., (2007) J. Chromatogr. B 848: 79-87]. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRII, полипептиды ALK4 и гетеромультимеры ALK4:ActRIIB для использования в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, являются рекомбинантными полипептидами.

Полипептиды ActRII, полипептиды ALK4 и гетеромультимеры ALR4:ActRIIB по настоящему изобретению можно получить различными способами, известными в данной области техники. Например, полипептиды по настоящему изобретению можно синтезировать с использованием стандартных методов химии белков, таких как описанные в Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Veriag, Berlin (1993) и Grant G.A. (ed.), Synthetic peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992). Кроме того, коммерчески доступны автоматизированные пептидные синтезаторы (например, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Альтернативно, полипептиды по изобретению, включая их фрагменты или варианты, могут быть получены рекомбинантными методами с использованием различных систем экспрессии (например, E.coli, клеток яичника китайского хомячка (CHO), клеток COS, бакуловируса), как хорошо известно в данной области. В еще одном варианте осуществления модифицированные или немодифицированные полипептиды по изобретению могут быть получены путем расщепления рекомбинантно полученных полноразмерных полипептидов ActRII с использованием, например, протеазы, например трипсина, термолизина, химотрипсина, пепсина или спаренная основная аминокислота-превращающего фермента (PACE). Компьютерный анализ (с использованием коммерчески доступной программы, например, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) можно использовать для идентификации сайтов протеолитического расщепления. Альтернативно, такие полипептиды могут быть получены из рекомбинантно образованных полноразмерных полипептидов ActRII или ALK4 с использованием химического расщепления (например, цианогенбромид, гидроксиламин и т.д.).

3. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды ActRII и ALK4 и их варианты

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенные и/или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды ActRII и/или ALK4 (включая их фрагменты, функциональные варианты и слитые белки). Например, SEQ ID NO: 7 кодирует природный человеческий полипептид предшественника ActRIIB (вариант R64, описанный выше), тогда как SEQ ID NO: 8 кодирует процессированный внеклеточный домен ActRIIB (вариант R64, описанный выше). Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Такими нуклеиновыми кислотами могут быть молекулы ДНК или РНК. Эти нуклеиновые кислоты можно использовать, например, в способах получения полипептидов-ловушек для лигандов на основе ActRII, как описано в настоящей заявке.

Как используется в настоящей заявке, выделенная нуклеиновая кислота (кислоты) относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат эту молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в хромосомном местоположении, которое отличается от ее естественного хромосомного положения.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды ActRII или ALK4 по изобретению, как должно быть понятно, включают нуклеиновые кислоты, которые являются вариантами любой из SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 и 135. Вариантные нуклеотидные последовательности включают последовательности, которые отличаются одной или несколькими нуклеотидными заменами, добавлениями или делециями, включая аллельные варианты, и поэтому будут включать кодирующую последовательность, которая отличается от нуклеотидной последовательности, определенной в любой из SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 и 135.

В некоторых вариантах осуществления полипептиды ActRII или ALK4 по изобретению кодируются выделенными и/или рекомбинантными нуклеиновокислотными последовательностями, которые по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны любой из SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 и 135. Специалистам в данной области должно быть понятно, что нуклеиновокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны последовательностям комплементарным SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 и 135 и их вариантам, также входят в объем настоящего изобретения. В других вариантах осуществления нуклеиновокислотные последовательности по изобретению могут быть выделенными, рекомбинантными и/или слитыми с гетерологичной нуклеотидной последовательностью, или в библиотеке ДНК.

В других вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению также включают нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 и 135, комплементарными последовательностями SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 и 135 или их фрагментами. Как обсуждалось выше, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что подходящие условия жесткости, которые способствуют гибридизации ДНК, могут варьироваться. Специалист в данной области техники легко поймет, что подходящие условия жесткости, которые способствуют гибридизации ДНК, могут варьироваться. Например, можно осуществить гибридизацию при 6,0 × хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) при температуре около 45°C с последующей промывкой 2,0 × SSC при 50°C. Например, концентрация соли на стадии промывки может быть выбрана от низкой жесткости около 2,0 × SSC при 50°С до высокой жесткости около 0,2 × SSC при 50°С. Кроме того, температуру на стадии промывки можно увеличить от условий низкой жесткости при комнатной температуре, около 22°С, до условий высокой жесткости при около 65°С. И температура, и соль могут варьироваться, или температура или концентрация соли могут поддерживаться постоянными, в то время как другая переменная изменяется. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в условиях низкой жесткости 6 × SSC при комнатной температуре с последующей промывкой при 2 × SSC при комнатной температуре.

Выделенные нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислот, представленных в SEQ ED NO: 7, 8, 12, 13, 37, 43, 49, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 103, 106, 107, 109, 112, 119, 121, 123 и 135, для вырождения в генетическом коде также находятся в пределах объема настоящего раскрытия. Например, ряд аминокислот обозначается более чем одним триплетом. Кодоны, которые определяют одну и ту же аминокислоту, или синонимы (например, CAU и CAC являются синонимами для гистидина), могут приводить к "молчащим" мутациям, которые не влияют на аминокислотную последовательность белка. Однако ожидается, что полиморфизмы последовательностей ДНК, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях рассматриваемых белков, будут существовать среди клеток млекопитающих. Специалистам в данной области будет понятно, что эти вариации в одном или нескольких нуклеотидах (примерно до 3-5% нуклеотидов) нуклеиновых кислот, кодирующих конкретный белок, могут существовать среди индивидуумов данного вида из-за природной аллельной вариации. Любые и все такие нуклеотидные варианты и возникающие в результате аминокислотные полиморфизмы входят в объем настоящего раскрытия.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть функционально связаны с одной или несколькими регуляторными нуклеотидными последовательностями в экспрессирующей конструкции. Регуляторные нуклеотидные последовательности, как правило, должны соответствовать клетке-хозяину, используемой для экспрессии. Различные типы подходящих экспрессирующих векторов и подходящих регуляторных последовательностей известны в данной области и могут использоваться в различных клетках-хозяевах. Типично, одна или несколько регуляторных нуклеотидных последовательностей могут включать, но не ограничиваются этим, промоторные последовательности, лидерные или сигнальные последовательности, сайты связывания рибосом, последовательности начала и окончания транскрипции, последовательности начала и окончания трансляции, а также последовательности энхансеров или активаторов. Конститутивные или индуцибельные промоторы, известные в данной области, предусматриваются настоящим изобретением. Промоторы могут быть либо природными промоторами, либо гибридными промоторами, которые объединяют элементы более чем одного промотора. Экспрессирующая конструкция может присутствовать в клетке в эписоме, такой как плазмида, или экспрессирующая конструкция может быть вставлена в хромосому. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии содержит селектируемый маркерный ген, позволяющий осуществлять селекцию трансформированных клеток-хозяев. Селектируемые маркерные гены хорошо известны в данной области и могут варьироваться в зависимости от используемой клетки-хозяина.

В некоторых аспектах, рассматриваемая нуклеиновая кислота по настоящему изобретению представлена в экспрессирующем векторе, включающем нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид ActRII и/или ALK4, и функционально связана по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью. Регуляторные последовательности хорошо известны в данной области и выбраны для непосредственной экспрессии полипептида ActRII и/или ALK4. Соответственно, термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии. Примеры регуляторных последовательностей описаны в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Например, любая из широкого ряда последовательностей контроля экспрессии, которые контролируют экспрессию последовательности ДНК, когда она функционально связана с ней, может использоваться в этих векторах для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих полипептид ActRII и/или ALK4. Такие полезные последовательности для контроля экспрессии включают, например, ранние и поздние промоторы SV40, tet промотор, промотор гена немедленного раннего ответа аденовируса или цитомегаловируса, RSV промоторы, lac систему, trp систему, TAC или TRC систему, T7 промотор, экспрессия которого направляется Т7 РНК-полимеразой, основные участки оператора и промотора лямбда фага, контрольные области белка оболочки fd, промотор для 3-фосфоглицират-киназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например, Pho5, промоторы факторов α-скрещивания дрожжей, многогранный промотор бакуловирусной системы и другие последовательности, о которых известно, что они контролируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и их различные комбинации. Должно быть понятно, что конструкция вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, и/или тип белка, экспрессия которого жалательна. Кроме того, следует учитывать число копий вектора, способность контролировать это количество копий и экспрессию любого другого белка, кодируемого этим вектором, такого как антибиотические маркеры.

Рекомбинантная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть получена путем лигирования клонированного гена или его части в вектор, подходящий для экспрессии либо в прокариотических клетках, эукариотических клетках (дрожжи, птицы, насекомые или млекопитающие), либо и в тех и в других. Экспрессирующие носители для продуцирования рекомбинантного полипептида ActRII и/или ALK4 включают плазмиды и другие векторы. Например, подходящие векторы включают плазмиды следующих типов: плазмиды, происходящие из pBR322, плазмиды, происходящие из pEMBL, плазмиды, происходящие из pEX, плазмиды, происходящие из pBTac, и плазмиды, происходящие из pUC, для экспрессии в прокариотических клетках, таких как E.coli.

Некоторые векторы экспрессии млекопитающих содержат как прокариотические последовательности, способствующие размножению вектора в бактериях, так и одну или несколько эукариотических единиц транскрипции, которые экспрессируются в эукариотических клетках. Векторы, происходящие из pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo и pHyg, являются примерами векторов экспрессии млекопитающего, подходящих для трансфекции эукариотических клеток. Некоторые из этих векторов модифицированы последовательностями из бактериальных плазмид, таких как pBR322, для облегчения репликации и выбора лекарственной резистентности как в прокариотических, так и в эукариотических клетках. С другой стороны, производные вирусов, такие как вирус бычьей папилломы (BPV-1) или вирус Эпштейна-Барра (pHEBo, происходящий из pREP и p205), можно использовать для тринзиентной экспрессии белков в эукариотических клетках. Примеры других вирусных (включая ретровирусные) систем экспрессии можно найти ниже в описании систем доставки генной терапии. Различные способы, используемые для получения плазмид и трансформации организмов-хозяев, хорошо известны в данной области. Другие подходящие системы экспрессии как для прокариотических, так и для эукариотических клеток, а также общие рекомбинантные процедуры описаны, например, в Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). В некоторых случаях может быть желательным экспрессировать рекомбинантные полипептиды с использованием бакуловирусной системы экспрессии. Примеры таких бакуловирусных систем экспрессии включают векторы, происходящие из pVL (такие как pVL1392, pVL1393 и pVL941), векторы, происходящие из pAcUW (такие как pAcUW1), и векторы, происходящие из pBlueBac (такие как β-gal, содержащий pBlueBac III).

В предпочтительном варианте осуществления вектор будет сконструирован для продукции рассматриваемых полипептидов ActRII и/или ALK4 в клетках CHO, например, вектор Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, CA), векторы pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) и pCI-neo векторы (Promega, Madison, Wisc.). Как должно быть очевидно, рассматриваемые генные конструкции можно использовать для того, чтобы вызвать экспрессию рассматриваемых полипептидов ActRII в клетках, размножаемых в культуре, например, для продуцирования белков, включая слитые белки или варианты белков, для очистки.

Настоящее раскрытие также относится к клетке-хозяину, трансфицированной рекомбинантным геном, включающим кодирующую последовательность для одного или нескольких полипептидов ActRII и/или ALK4. Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой. Например, полипептид ActRII и/или ALK4 по изобретению может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как клетки Е. coli, клетки насекомых (например, с использованием бакуловирусной системы экспрессии), дрожжей или клетки млекопитающих [например, клеточная линия яичников китайского хомячка (СНО). Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области.

Соответственно, настоящее раскрытие также относится к способам получения рассматриваемых полипептидов ActRII и/или ALK4. Например, клетку-хозяина, трансфицированную экспрессирующим вектором, кодирующим полипептид ActRII и/или ALK4, можно культивировать в соответствующих условиях, чтобы обеспечить возможность экспрессии полипептида ActRII и/или ALK4. Полипептид может секретироваться и может быть выделен из смеси клеток и среды, содержащей полипептид. Альтернативно, полипептид ActRII и/или ALK4 можно сохранить цитоплазматически или в мембранной фракции, а клетки собрать, лизировать и выделить белок. Клеточная культура включает клетки-хозяева, среду и другие побочные продукты. Подходящие среды для культивирования клеток хорошо известны в данной области техники. Полипептиды по настоящему изобретению можно выделить из среды для культивирования клеток, клеток-хозяев, или и тех и других, с использованием методов, известных в данной области для очистки белков, включая ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафильтрацию, электрофорез, иммуноаффинную очистку с использованием антител, специфических для конкретных эпитопов полипептидов ActRII и/или ALK4, и аффинную очистку при помощи агента, который связывается с доменом, слитым с полипептидом ActRII (например, колонку с белком A можно использовать для очистки ActRII-Fc и/или ALK4-Fc слитых белков). В некоторых вариантах осуществления полипептид ActRII и/или ALK4 представляет собой гибридный белок, содержащий домен, который облегчает его очистку.

В некоторых вариантах осуществления очистка достигается с использованием нескольких стадий колоночной хроматографии, включая, например, три или более из следующих, в любом порядке: хроматография с использованием белка А, хроматография с использованием Q-сефарозы, хроматография с использованием фенилсефарозы, эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография. Очистку можно завершить фильтрацией вирусов и буферным обменом. Белок ActRII и/или ALK4 может быть очищен до чистоты >90%, >95%, >96%, >98% или >99%, как определено эксклюзионной хроматографией, и >90%, >95%, >96%, >98% или >99%, как определено методом SDS PAGE. Целевой уровень чистоты должен быть таким, который достаточен для достижения желаемых результатов в системах млекопитающих, в частности, отличных от человека приматов, грызунов (мышей) и человека.

В другом варианте осуществления гибридный ген, кодирующий лидерную последовательность для очистки, такой как последовательность поли-(His)/энтерокиназного сайта расщепления на N-конце желаемой части рекомбинантного полипептида ActRII и/или ALK4, может обеспечить возможность очистки экспрессированного слитого белка методом аффинной хроматографии с использованием Ni²⁺ металл-содержащей смолы. Лидерная последовательность для очистки может быть затем удалена путем обработки энтерокиназой с получением очищенного полипептида ActRII и/или ALK4. См., например Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411: 177; и Janknecht et al. (1991) PNAS USA 88: 8972.

Методы создания слитых генов хорошо известны. По существу, соединение различных фрагментов ДНК, кодирующих разные полипептидные последовательности, осуществляют в соответствии с общепринятыми методами, используя тупые или зигзагообразные концы для лигирования, расщепление рестрикционным ферментом для получения соответствующих концов, введение липких концов при необходимости, обработку щелочной фосфатазой во избежание нежелательного присоединения и ферментативное лигирование. В другом варианте слитый ген может быть синтезирован обычными методами, включая автоматические ДНК синтезаторы. Альтернативно, ПЦР-амплификацию фрагментов гена можно осуществить с использованием якорных праймеров, которые вызывают образование комплементарных липких концов между двумя последовательными фрагментами гена, которые затем могут подвергаться отжигу для образования химерной последовательности гена. См., например, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992.

4. Антагонистические антитела

В некоторых аспектах, антагонист GDF/BMP для использования в соответствии со способами и применениями, раскрытыми в настоящей заявке, представляет собой антитело (антагонистическое антитело к GDF/BMP) или комбинацию антител. Антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, может связываться с, например, одним или несколькими ActRII лигандами (такими как активин, GDF8, GDF11, BMP6, BMP15, BMP10 и/или GDF3), ActRII рецептором (ActRIIA и/или ActRIIB), рецептором типа I (ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или ко-рецептором. Как описано в настоящей заявке, антагонистические антитела к GDF/BMP можно использовать отдельно или в комбинации с одним или несколькими поддерживающими терапиями или активными средствами для лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии (ЛГ), в частности, лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких ЛГ-ассоциированных осложнений.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере активин (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE). Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере активином. В контексте настоящей заявки антитело к активину (или антитело против активина), как правило, относится к антителу, которое связывается с активином с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на активин. В некоторых вариантах осуществления степень связывания антитело против активина с неродственным, не-активиновым белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с активином, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа взаимодействия или аффинности связывания белка. В некоторых вариантах осуществления антитело против активина связывается с эпитопом активина, который является консервативным среди активина из различных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело против активина связывается с человеческим активином. В некоторых вариантах осуществления антитело против активина может ингибировать связывание активина с рецептором типа I и/или типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и, таким образом, ингибирует активин-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления антитело против активина может ингибировать связывание активина с ActRII ко-рецептором и, таким образом, ингибирует активин-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). Следует отметить, что активин A имеет последовательность гомологичную активину B, и поэтому антитела, которые связываются с активином A, в некоторых случаях, также могут связываются с и/или ингибировать активин B, что также относится к антителам против активина B. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к мультиспецифическому антителу (например, би-специфическому антителу), и его применению, которое связывается с активином и также связывается с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 и BMP6], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с активином, не связывается или по существу не связывается с BMP9 (например, связывается с BMP9 с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с активином, не связывается или по существу не связывается с активином A (например, связывается с активином A с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает антитело против активина и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими дополнительными лигандами GDF/BMP суперсемейства [например, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6 и BMP15], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIfi, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против активина, не включает антитело к BMP9. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против активина, не включает антитело против активина A.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере активин B. Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере активином B. В контексте настоящей заявки антитело к активину B (или против активина B), как правило, относится к антителу, которое связывается с активином B с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на активин B. В некоторых вариантах осуществления степень связывания антитела против активина B с неродственным, не являющимся активином B белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с активином, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа взаимодействия или аффинности связывания белка. В некоторых вариантах осуществления антитело против активина B связывается с эпитопом активина B, который является консервативным среди активина B из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело против активина B связывается с человеческим активином B. В некоторых вариантах осуществления антитело против активина B может ингибировать связывание активина B с рецептором типа I и/или типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и, таким образом, ингибирует активин B-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления антитело против активина B может ингибировать связывание активина B с ко-рецептором и, таким образом, ингибирует активин B-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). Следует отметить, что активин B имеет последовательность гомологичную активину A, и поэтому антитела, которые связываются с активином B, в некоторых случаях, также могут связываться с и/или ингибировать активин A. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к мультиспецифическому антителу (например, би-специфическому антителу), и его применению, которое связывается с активином B и также связывается с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 и BMP6], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с активином B, не связывается или по существу не связывается с BMP9 (например, связывается с BMP9 с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с активином B, не связывается или по существу не связывается с активином A (например, связывается с активином A с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает антитело против активина B и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10 и BMP15], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против активина B, не включает антитело к BMP9. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против активина B, не включает антитело против активина A.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере GDF8. Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере GDF8. В контексте настоящей заявки антитело против GDF8 (или анти-GDF8 антитело), как правило, относится к антителу, которое связывается с GDF8 с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на GDF8. В некоторых вариантах осуществления степень связывания антитела против GDF8 с неродственным, не-GDF8 белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с GDF8, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа взаимодействия или аффинности связывания белка. В некоторых вариантах осуществления антитело против GDF8 связывается с эпитопом GDF8, который является консервативным среди GDF8 из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-GDF8 антитело связывается с человеческим GDF8. В некоторых вариантах осуществления антитело против GDF8 может ингибировать связывание GDF8 с рецептором типа I и/или типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и, таким образом, ингибирует GDF8-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления антитело против GDF8 может ингибировать связывание GDF8 с ко-рецептором и, таким образом, ингибирует GDF8-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). Следует отметить, что GDF8 имеет высокую гомологию последовательности с GDF11, и поэтому антитела, которые связываются с GDF8, в некоторых случаях, также могут связываться с GDF11 и/или ингибировать GDF11. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к мультиспецифическому антителу (например, би-специфическому антителу), и его применениям, которое связывается с GDF8 и также связывается с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE, активин BE), GDF11, GDF3, BMP15, BMP10 и BMP6], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с GDF8, не связывается или по существу не связывается с BMP9 (например, связывается с BMP9 с K_D больше чем 1×10^7- M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с GDF8, не связывается или по существу не связывается с активином A (например, связывается с активином A с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает GDF8 антитело и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE, активин BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP 10 и BMP 15], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело к GDF8, не включает антитело к BMP9. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против GDF8, не включает антитело против активина A.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере GDF11. Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере GDF11. В контексте настоящей заявки антитело против GDF11 (или анти-GDF11 антитело), как правило, относится к антителу, которое связывается с GDF 11 с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на GDF11. В некоторых вариантах осуществления степень связывания антитела против GDF11 с неродственным, не-GDF11 белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с GDF11, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа взаимодействия или аффинности связывания белка. В некоторых вариантах осуществления антитело против GDF11 связывается с эпитопом GDF11, который является консервативным среди GDF11 из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-GDF11 антитело связывается с человеческим GDF11. В некоторых вариантах осуществления антитело против GDF11 может ингибировать связывание GDF11 с рецептором типа I и/или типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и, таким образом, ингибирует GDF11-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления антитело против GDF11 может ингибировать связывание GDF11 с ко-рецептором и, таким образом, ингибирует GDF11-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). Следует отметить, что GDF11 имеет высокую гомологию последовательности с GDF8, и поэтому антитела, которые связываются с GDF11, в некоторых случаях, также могут связываться с и/или ингибировать GDF8. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к мультиспецифическому антителу (например, би-специфическому антителу), и его применению, которое связывается с GDF11 и также связывается с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE, активин BE), GDF8, GDF3, BMP15, BMP 10 и BMP6], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с GDF11, не связывается или по существу не связывается с BMP9 (например, связывается с BMP9 с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с GDF11, не связывается или по существу не связывается с активином A (например, связывается с активином A с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9M). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает антитело против GDF11 и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE, активин BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP 10 и BMP15], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против GDF11, не включает антитело против BMP9. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против GDF11, не включает антитело против активина A.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере BMP6. Поэтому в некоторых вариантах осуществления, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере BMP6. В контексте настоящей заявки антитело против BMP6 (или анти-BMP6 антитело), как правило, относится к антителу, которое может связываться с BMP6 с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на BMP6. В некоторых вариантах осуществления степень связывания антитела против BMP6 с неродственным, не-BMP6 белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с BMP6, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа взаимодействия или аффинности связывания белка. В некоторых вариантах осуществления антитело против BMP6 связывается с эпитопом BMP6, который является консервативным среди BMP6 из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-BMP6 антитело связывается с человеческим BMP6. В некоторых вариантах осуществления антитело против BMP6 может ингибировать связывание BMP6 с рецептором типа I и/или типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и, таким образом, ингибирует BMP6-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления антитело против BMP6 может ингибировать связывание BMP6 с ко-рецептором и, таким образом, ингибирует BMP6-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к мультиспецифическому антителу (например, би-специфическому антителу), и его применению, которое связывается с BMP6 и также связывается с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE, активин BE), GDF8, GDF3, BMP15, BMP 10 и GDF11], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с BMP6, не связывается или по существу не связывается с BMP9 (например, связывается с BMP9 с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с BMP6, не связывается или по существу не связывается с активином A (например, связывается с активином A с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает антитело против BMP6 и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE, активин BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP 10 и BMP15], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против BMP6, не включает антитело против BMP9. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против BMP6, не включает антитело против активина A.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере GDF3. Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере GDF3. В контексте настоящей заявки антитело против GDF3 (или анти-GDF3 антитело), как правило, относится к антителу, которое может связываться с GDF3 с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на GDF3. В некоторых вариантах осуществления степень связывания антитела против GDF3 с неродственным, не-GDF3 белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с GDF3, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа взаимодействия или аффинности связывания белка. В некоторых вариантах осуществления антитело против GDF3 связывается с эпитопом GDF3, который является консервативным среди GDF3 из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-GDF3 антитело связывается с человеческим GDF3. В некоторых вариантах осуществления антитело против GDF3 может ингибировать связывание GDF3 с рецептором типа I и/или типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и, таким образом, ингибирует GDF3-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления антитело против GDF3 может ингибировать связывание GDF3 с ко-рецептором и, таким образом, ингибирует GDF3-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к мультиспецифическому антителу (например, би-специфическому антителу), и его применению, которое связывается с GDF3 и также связывается с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE, активин BE), GDF8, BMP6, BMP15, BMP 10 и GDF11], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK,5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с GDF3, не связывается или по существу не связывается с BMP9 (например, связывается с BMP9 с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с GDF3, не связывается или по существу не связывается с активином A (например, связывается с активином A с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает антитело против GDF3 и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE, активин BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP10 и BMP15], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против GDF3, не включает антитело против BMP9. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против GDF3, не включает антитело против активина A.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере BMP15. Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере BMP15. В контексте настоящей заявки антитело против BMP15 (или анти-BMP 15 антитело), как правило, относится к антителу, которое может связываться с BMP15 с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для направленного воздействия на BMP15. В некоторых вариантах осуществления степень связывания антитела против BMP15 с неродственным, не-BMP15 белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с BMP15, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа взаимодействия или аффинности связывания белка. В некоторых вариантах осуществления антитело против BMP15 связывается с эпитопом BMP15, который является консервативным среди BMP15 из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-BMP15 антитело связывается с человеческим BMP15. В некоторых вариантах осуществления антитело против BMP15 может ингибировать связывание BMP15 с рецептором типа I и/или типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и, таким образом, ингибирует BMP15-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления антитело против BMP15 может ингибировать связывание BMP15 с ко-рецептором и, таким образом, ингибирует BM15-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к мультиспецифическому антителу (например, би-специфическому антителу), и его применению, которое связывается с BMP15 и также связывается с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP 10 и BMP6], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с BMP15, не связывается или по существу не связывается с BMP9 (например, связывается с BMP9 с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с BMP15, не связывается или по существу не связывается с активином A (например, связывается с активином A с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает антитело против BMP15 и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE), GDF8, GDF3 BMP6, BMP10 и GDF11], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против BMP15, не включает антитело против BMP9. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против BMP15, не включает антитело против активина A.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере BMP10. Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере BMP10. В контексте настоящей заявки антитело против BMP10 (или анти-BMP10 антитело), как правило, относится к антителу, которое может связываться с BMP10 с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на BMP10. В некоторых вариантах осуществления степень связывания антитела против BMP10 с неродственным, не-BMP10 белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с BMP10, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа взаимодействия или аффинности связывания белка. В некоторых вариантах осуществления антитело против BMP10 связывается с эпитопом BMP10, который является консервативным среди BMP10 из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-BMP10 антитело связывается с человеческим BMP10. В некоторых вариантах осуществления антитело против BMP10 может ингибировать связывание BMP10 с рецептором типа I и/или типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и, таким образом, ингибирует BMP10-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления антитело против BMP10 может ингибировать связывание BMP10 с ко-рецептором и, таким образом, ингибирует BMP10-опосредованную передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к мультиспецифическому антителу (например, би-специфическому антителу), и его применению, которое связывается с BMP10 и также связывается с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE), GDF8, GDF11, GDF3 и BMP6], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с BMP10, не связывается или по существу не связывается с BMP9 (например, связывается с BMP9 с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело, которое связывается с BMP10, не связывается или по существу не связывается с активином A (например, связывается с активином A с K_D больше чем 1×10^-7 M или имеет относительно незначительное связывание, например, около 1×10^-8 M или около 1×10^-9 M). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает антитело против BMP10 и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими дополнительными GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE), GDF8, GDF3 BMP6, BMP10 и GDF11], одним или несколькими рецепторами типа I и/или рецепторами типа II (например, ActRUA, ActRIIB, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или одним или несколькими ко-рецепторами. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против BMP10, не включает антитело против BMP9. В некоторых вариантах осуществления комбинация антител, которая включает антитело против BMP10, не включает антитело против активина A.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере ActRIIB. Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере ActRIIB. В контексте настоящей заявки антитело против ActRIIB (анти-ActRIIB антитело), как правило, относится к антителу, которое связывается с ActRIIB с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на ActRIIB. В некоторых вариантах осуществления степень связывания анти-ActRIIB с неродственным, не-ActRIIB белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с ActRIIB, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа белок-белкового взаимодействия или аффинности связывания. В некоторых вариантах осуществления анти-ActRIIB антитело связывается с эпитопом ActRIIB, который является консервативным среди ActRIIB из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-ActRIIB антитело связывается с человеческим ActRIIB. В некоторых вариантах осуществления анти-ActRIIB антитело может ингибировать связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов [например, GDF8, активина (такого как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE), GDF11, BMP6, GDF3, BMP 10 и BMP 15] с ActRIIB. В некоторых вариантах осуществления анти-ActRIIB антитело представляет собой мультиспецифическое антитело (например, би-специфическое антитело), которое связывается с ActRIIB и одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC) GDF3, BMP6 и BMP10], рецептором типа I (например, ALK4, ALK5 и/или ALK7), ко-рецептором и/или дополнительным рецептором типа II (например, ActRIIA). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает анти-ActRIIB антитело и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE) BMP6, GDF3 и BMP10], ко-рецепторами, рецепторами типа I (например, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или дополнительными рецепторами типа II (например, ActRIIA). Следует отметить, что ActRIIB имеет сходство последовательности с ActRIIA, и поэтому антитела, которые связываются с ActRIIB, в некоторых случаях, также могут связываться с и/или ингибировать ActRIIA.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере ActRIIA. Поэтому, в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере ActRIIA. В контексте настоящей заявки антитело к ActRIIA (анти-ActRIIA антитело), как правило, относится к антителу, которое связывается с ActRIIA с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на ActRIIA. В некоторых вариантах осуществления степень связывания анти-ActRIIA с неродственным, не-ActRIIA белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с ActRIIA, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа белок-белкового взаимодействия или аффинности связывания. В некоторых вариантах осуществления анти-ActRIIA антитело связывается с эпитопом ActRIIA, который является консервативным среди ActRIIA из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-ActRIIA антитело связывается с человеческим ActRIIA. В некоторых вариантах осуществления анти-ActRIIA антитело может ингибировать связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов [например, GDF8, активина (такого как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE) GDF11, BMP6, GDF3, BMP 10 и BMP 15] с ActRIIA. В некоторых вариантах осуществления анти-ActRIIA антитело представляет собой мультиспецифическое антитело (например, би-специфическое антитело), которое связывается с ActRIIA и одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC) GDF3, BMP6 и BMP10], рецептором типа I (например, ALK4, ALK5 и/или ALK7), ко-рецептором и/или дополнительным рецептором типа II (например, ActRIIB). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает анти-ActRIIA антитело и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE) BMP6 и BMP10], ко-рецепторами, рецепторами типа I (например, ALK4, ALK5 и/или ALK7) и/или дополнительными рецепторами типа II (например, ActRIIB). Следует отметить, что ActRIIA имеет сходство последовательности с ActRIIB, и поэтому антитела, которые связываются с ActRIIA, в некоторых случаях, также могут связываться с и/или ингибировать ActRIIB.

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере ALK4. Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере ALK4. В контексте настоящей заявки антитело против ALK4 (анти-ALK4 антитело), как правило, относится к антителу, которое связывается с ALK4 с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на ALK4. В некоторых вариантах осуществления степень связывания анти-ALK4 с неродственным, не-ALK4 белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с ALK4, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа белок-белкового взаимодействия или аффинности связывания. В некоторых вариантах осуществления анти-ALK4 антитело связывается с эпитопом ALK4, который является консервативным среди ALK4 из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-ALK4 антитело связывается с человеческим ALK4. В некоторых вариантах осуществления анти-ALK4 антитело может ингибировать связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов [например, GDF8, активина (такого как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE) GDF11, BMP6, GDF3, BMP 10 и BMP 15] с ALK4. В некоторых вариантах осуществления анти-ALK4 антитело представляет собой мультиспецифическое антитело (например, би-специфическое антитело), которое связывается с ALK4 и одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC) GDF3, BMP6 и BMP10], рецептором типа II (например, ActRIIA и/или ActRIIB), ко-рецептором и/или дополнительным рецептором типа I (например, ALK5 и/или ALK7). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает анти-ALK4 антитело и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE) BMP6 и BMP10], ко-рецепторами, рецепторами типа II (например, ActRIIA и/или ActRIIB) и/или дополнительными рецепторами типа I (например, ALK5 и/или ALK7).

В некоторых аспектах, антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере ALK5. Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере ALK5. В контексте настоящей заявки антитело против ALK5 (анти-ALK5 антитело), как правило, относится к антителу, которое связывается с ALK5 с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на ALK5. В некоторых вариантах осуществления степень связывания анти-ALK5 с неродственным, не-ALK5 белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с ALK5, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа белок-белкового взаимодействия или аффинности связывания. В некоторых вариантах осуществления анти-ALK5 антитело связывается с эпитопом ALK5, который является консервативным среди ALK5 из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-ALK5 антитело связывается с человеческим ALK5. В некоторых вариантах осуществления анти-ALK5 антитело может ингибировать связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов [например, GDF8, активина (такого как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE) GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 и BMP15] с ALK5. В некоторых вариантах осуществления анти-ALK5 антитело представляет собой мультиспецифическое антитело (например, би-специфическое антитело), которое связывается с ALK5 и одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC) GDF3, BMP6 и BMP10], рецептором типа II (например, ActRIIA и/или ActRBB), ко-рецептором и/или дополнительным рецептором типа I (например, ALK4 и/или ALK7). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает анти-ALK5 антитело и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE) BMP6 и BMP10], ко-рецепторами, рецепторами типа II (например, ActRIIA и/или ActRIIB) и/или дополнительными рецепторами типа I (например, ALK4 и/или ALK7).

В некоторых аспектах антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, представляет собой антитело, которое ингибирует по меньшей мере ALK7. Поэтому в некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к GDF/BMP, или комбинация антител, связывается с по меньшей мере ALK7. В контексте настоящей заявки антитело против ALK7 (анти-ALK7 антитело), как правило, относится к антителу, которое связывается с ALK7 с достаточной аффинностью, таким образом, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на ALK7. В некоторых вариантах осуществления степень связывания анти-ALK7 с неродственным, не-ALK7 белком составляет меньше чем около 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или меньше чем около 1% от связывания антитела с ALK7, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA), Biacore или другого анализа белок-белкового взаимодействия или аффинности связывания. В некоторых вариантах осуществления анти-ALK7 антитело связывается с эпитопом ALK7, который является консервативным среди ALK7 из разных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления анти-ALK7 антитело связывается с человеческим ALK7. В некоторых вариантах осуществления анти-ALK7 антитело может ингибировать связывание одного или нескольких GDF/BMP лигандов [например, GDF8, активина (такого как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE) GDF11, BMP6, GDF3, BMP10 и BMP15] с ALK7. В некоторых вариантах осуществления анти-ALK7 антитело представляет собой мультиспецифическое антитело (например, би-специфическое антитело), которое связывается с ALK7 и одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC) GDF3, BMP6 и BMP10], рецептором типа II (например, ActRIIA и/или ActRIIB), ко-рецептором и/или дополнительным рецептором типа I (например, ALK4 и/или ALK5). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к комбинациям антител и их применениям, где комбинация антител включает анти-ALK7 антитело и одно или несколько дополнительных антител, которые связываются с, например, одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, GDF11, GDF8, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и активин BE) BMP6 и BMP 10], ко-рецепторами, рецепторами типа II (например, ActRIIA и/или ActRIIB) и/или дополнительными рецепторами типа I (например, ALK4 и/или ALK5).

Термин антитело используется в настоящей заявке в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь этим, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антиген-связывающую активность. Фрагмент антитела относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которое связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются этим, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител [см., например, Hudson et al. (2003) Nat Med. 9:129-134; Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994); WO 93/16185; и Патенты США №№ 5571894; 5587458; и 5869046]. Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя антиген-связывающими сайтами, которые могут быть бивалентными или биспецифескими [см., например, EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al. (2003) Nat Med. 9: 129-134 (2003); и Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]. Триатела и тетратела также описаны в Hudson et al. (2003) Nat Med. 9:129-134. Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, включающие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело [см., например, патент США №6248516]. Антитела, раскрытые в настоящей заявке, могут быть поликлональными антителами или моноклональными антителами. В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению включают метку, прикрепленную к ним и которую можно обнаружить (например, метка может представлять собой радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению представляют собой выделенные антитела. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению представляют собой рекомбинантные антитела.

Антитела по настоящему изобретению могут быть любого класса. Класс антитела относится к типу константного домена или константной области, которую содержит его тяжелая цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю.

Как правило, антитело для использования в способах, раскрытых в настоящей заявке, специфически связывается с его антигеном-мишенью, предпочтительно с высокой аффинностью связывания. Аффинность может быть выражена в виде значения K_D и отражает истинную аффинность связывания (например, с минимальными эффектами авидности). Как правило, аффинность связывания измеряется in vitro, либо в бесклеточном, либо в клеточном анализе. Любой из различных анализов, известных в данной области, включая раскрытые в настоящее заявке, можно использовать для получения значений аффинности связывания, включая, например, Biacore, анализ связывания радиоактивно меченного антигена (RIA) и ELISA. В некоторых вариантах осуществления антитела, раскрытые в настоящей заявке, связывается с их антигенами-мишенями (например, ActRIIB, ActRIIA, ALK4, ALK5, ALK7, активином, GDF11, GDF8, GDF3, BMP15, BMP10 и/или BMP6) с по меньшей мере K_D 1×10^-7 или сильнее, 1×10^-8 или сильнее, 1×10^-9 или сильнее, 1×10^-10 или сильнее, 1×10^-11 или сильнее, 1×10^-12 или сильнее, 1×10^-13 или сильнее или 1×10^-14 или сильнее.

В некоторых вариантах осуществления K_D измеряют при помощи RIA, осуществляемого с Fab-версией представляющего интерес антитела и его антигена-мишени, как описано в следующем анализе. Аффинность связывания Fabs к антигену в растворе измеряют путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией радиоактивно меченного антигена (например, ¹²⁵I-меченного) в присутствии серии титрований немеченого антигена, затем захвата связанного антигена на покрытом анти-Fab-антителом планшете [см., например, Chen et al. (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881]. Для установления условий для анализа многолуночные планшеты (например, MICROTITER^® от Thermo Scientific) покрывают (например, в течение ночи) захватывающим анти-Fab антителом (например, от Cappel Labs) и затем блокируют бычьим сывороточным альбумином, предпочтительно при комнатной температуре (приблизительно 23°С). В неадсорбирующем планшете радиоактивно меченный антиген смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab [например, в соответствии с оценкой анти-VEGF антитела, Fab-12, в Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599]. Затем представляющий интерес Fab инкубируют, предпочтительно в течение ночи, но инкубация может продолжаться дольше (например, около 65 часов), чтобы убедиться, что достигнуто равновесие. Смеси затем переносят в захватывающий планшет для инкубации, предпочтительно при комнатной температуре в течение примерно одного часа. Затем раствор удаляют и планшет несколько раз промывают, предпочтительно смесью полисорбата 20 и PBS. Когда планшеты высыхают, добавляют сцинтиллятор (например, MICROSCTNT^® от Packard) и планшеты считывают на гамма-счетчике (например, TOPCOUNT^® от Packard).

В соответствии с другим вариантом осуществления K_D измеряют с использованием поверхностного плазмонного резонансного с использованием, например, BIACORE^® 2000 или BIACORE^® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) с иммобилизованными антигенными CM5 чипами при примерно 10 единицах ответа (RU). Вкратце, биосенсорные чипы на основе карбоксиметилированного декстрана (CM5, BIACORE, Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Например, антиген может быть разбавлен 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (около 0,2 мкМ) перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/мин до достижения примерно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После инъекции антигена вводят 1М этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для измерения кинетики вводят двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 до 500 нМ) в PBS с 0,05% поверхностно-активного вещества полисорбата 20 (TWEEN-20^®) (PBST) при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) рассчитывают, например, с использованием простой однозначной модели связывания Ленгмюра (BIACORE® Evaluation Software version 3.2) путем одновременного подбора сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесная константа диссоциации (K_D) рассчитывается как отношение k_off/k_on [см., например, Chen et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881]. Если скорость ассоциации превышает, например, 10⁷ M^-1 сек^-1, как определено указанным выше методом поверхностного плазмонного резонанса, тогда скорость ассоциации можно определить с использованием метода гашения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности эмиссии флуоресценции (например, возбуждение=295 нм; испускание=340 нм, полоса пропускания 16 нм) 20 нМ антитела против антигена (Fab форма) в PBS в присутствии возрастающих концентраций антигена, измеренных в спектрометре, таком как спектрофотометр с остановкой потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-AMINCO^® серии 8000 (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.

Фрагменты антител могут быть получены различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продуцирование рекомбинантными клетками-хозяевами (например, E.coli или фаг), как описано в настоящей заявке. Нуклеиново-кислотные и аминокислотные последовательности человеческого ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, активина (активин A, активин B, активин C и активин E), GDF11, GDF8, BMP15, GDF3, BMP10 и BMP6 известны в данной области техники. Кроме того, различные способы получения антител хорошо известны в данной области, некоторые из которых описаны в настоящей заявке. Поэтому антагонисты антител для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть рутинным образом получены специалистами в данной области техники на основе знаний в данной области техники и представленного в настоящей заявке раскрытия.

В некоторых вариантах осуществления антитело, представленное в настоящей заявке, представляет собой химерное антитело. Химерное антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из определенного источника или вида, тогда как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или вида. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США №4816567; и Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. США, 81:6851-6855. В некоторых вариантах осуществления химерное антитело включает не-человеческую вариабельную область (например, вариабельную область, происходящую от мыши, крысы, хомяка, кролика или нечеловеческого примата, такого как обезьяна) и человеческую константную область. В некоторых вариантах осуществления химерное антитело представляет собой антитело с "переключенным классом", в котором класс или подкласс был изменен по сравнению с исходным антителом. Обычно химерные антитела включают их антиген-связывающие фрагменты.

В некоторых вариантах осуществления химерное антитело, представленное в настоящей заявке, представляет собой гуманизированное антитело. Гуманизированное антитело относится к химерному антителу, включающему аминокислотные остатки из не-человеческих гипервариабельных областей (HVR) и аминокислотные остатки из человеческих каркасных областей (FR). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело будет включать по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из HVR (например, CDR) соответствуют HVR не-человеческого антитела, и все или по существу все из FR соответствуют FR человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может включать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. "Гуманизированная форма" антитела, например, не-человеческого антитела, относится к антителу, которое подверглось гуманизации. Гуманизированные антитела и способы их получения рассматриваются, например, в Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633, а также описаны, например, в Riechmann et al., (1988) Nature 332: 323-329; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; патентах США №№5821337; 7527791; 6982321; и 7087409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34 [описывающий SDR (a-CDR) прививку]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 (описывающий "изменение поверхности"); Dall'Acqua et al. (2005) Methods 36:43-60 (описывающий "FR шаффлинг"); Osbourn et al. (2005) Methods 36:61-68; и Klimka et al Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (описывающий подход "управляемого выбора" к FR шаффлингу). Человеческие каркасные области, которые можно использовать для гуманизации, включают, но не ограничиваются этим: каркасные области, выбранные с использованием метода "наилучшего соответствия" [см., например, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296]; каркасные области, происходящие из консенсусной последовательности человеческих антител определенной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепи [см., например, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; и Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]; человеческие зрелые (соматически мутированные) каркасные области или каркасные области из зародышевой линии человека [см., например, Almagro and Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633]; и каркасные области, полученные путем скрининга FR библиотек [см., например, Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684; и Rosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618].

В некоторых вариантах осуществления антитело, представленное в настоящей заявке, представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных методов, известных в данной области. Человеческие антитела описаны в общих чертах в van Dijk and van de Winkel (2008) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459. Например, человеческие антитела могут быть получены введением иммуногена (например, полипептида GDF11, полипептида активина B, полипептида ActRIIA или полипептида ActRIIB) трансгенному животному, модифицированному для продукции интактных человеческих антител или интактных антител с человеческими вариабельными областями в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные обычно содержат все или часть локусов иммуноглобулина человека, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулина или которые присутствуют вне хромосом или случайным образом интегрированы в хромосомы животного. У таких трансгенных животных эндогенные локусы иммуноглобулина обычно инактивированы. Для обзора способов получения человеческих антител от трансгенных животных см., например, Lonberg (2005) Nat Biotech. 23: 1117-1125; патенты США №6075181 и 6150584 (описывающие технологию XENOMOUSE™); патент США № 5770429 (описывающий технологию HuMab^®); патент США №7041870 (описывающий технологию K-M MOUSE^®); и публикацию патентной заявки США №2007/0061900 (описывающую технологию VelociMouse^®). Человеческие вариабельные области из интактных антител, генерируемых такими животными, могут быть дополнительно модифицированы, например, путем объединения с другой константной областью человека.

Человеческие антитела, представленные в настоящей заявке, также могут быть получены гибридомными методами. Были описаны клеточные линии человеческой миеломы и гетеромиеломы мыши для продуцирования человеческих моноклональных антител [см., например, [см., например, Kozbor J. Immunol., (1984) 133: 3001; Brodeur et al. (1987) Monoclonal Antibody Production Methods and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York; и Boemer et al. (1991) J. Immunol., 147: 86]. Человеческие антитела, полученные с использованием гибридомной технологии на основе B-клеток человека, также описаны в Li et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562. Дополнительные методы включают методы, описанные, например, в патенте США №7188926 (описывающем продукцию моноклональных человеческих IgM антител из гибридомных клеточных линий) и Ni, Xiandai Mianyixue (2006) 26 (4):265-268 (2006) (описывающем человеко-человеческие гибридомы). Технология человеческих гибридом (технология Trioma) также описана в Vollmere and Biandlein (2005) Histol. Histopathol., 20 (3):927-937 (2005) и Vollmere and Biandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27 (3):185-91. Человеческие антитела, представленные в настоящей заявке, также могут быть получены путем выделения последовательностей вариабельного домена клона Fv, выбранных из библиотек фаговых дисплеев человеческого происхождения. Такие последовательности вариабельного домена затем могут быть объединены с желаемым человеческим константным доменом. Методы выбора человеческих антител из библиотек антител известны в данной области и описаны настоящей заявке.

Например, антитела по настоящему изобретению можно выделить путем скрининга комбинаторных библиотек на антитела с желаемой активностью или активностями. Различные способы известны в данной области для создания библиотек фаговых дисплеев и скрининга таких библиотек на антитела, обладающие желаемыми характеристиками связывания. Такие способы рассматриваются, например, в Hoogenboom et al (2001) Methods in Molecular Biology 178: 1-37, O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N J., а также описаны, например, в the McCaf&rty et al. (1991) Nature 348:552-554; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al. (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; Marks and Bradbury (2003) Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J.; Sidhu etal. (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472; и Lee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132.

В некоторых методах фагового дисплея репертуары VH и VL генов по отдельности клонируют при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рандомизированно рекомбинируют в библиотеках фагов, которые затем можно скринировать на антиген-связывающий фаг, как описано в Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455. Фаг типично содержит фрагменты антител, либо в виде одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов, либо в виде Fab фрагментов. Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают высокоаффинные антитела к иммуногену (например, ActRIIA, ActRIIB, активин, GDF11, GDF8, BMP15, GDF3 или BMP6) без необходимости конструирования гибридом. Альтернативно, наивный репертуар может быть клонирован (например, от человека), чтобы обеспечить единый источник антител к широкому спектру не-собственных, а также собственных антигенов без какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al. (1993) EMBO J, 12: 725-734. Наконец, наивные библиотеки также могут быть созданы синтетически путем клонирования неперегруппированных сегментов V-гена из стволовых клеток и использования ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, для кодирования высоко вариабельных CDR3 областей и для осуществления перегруппировки in vitro, как описано в Hoogenboom and Winter (1992) J. Mol. Biol., 227:381-388. Патентные публикации, описывающие фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например, патент США №5750373 и патентные публикации США №№2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.

В некоторых вариантах осуществления антитело, представленное в настоящей заявке, представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифичное антитело. Мультиспецифические антитела (типично моноклональные антитела), которые имеют специфичность связывания, по меньшей мере, для двух разных эпитопов (например, двух, трех, четырех, пяти или шести или более) на одном или более (например, двух, трех, четырех, пяти, шести или больше) антигенов.

Способы получения муспецифичных антител включают, но не ограничиваются этим, рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелой цепи/легкой цепи иммуноглобулина, имеющих разные специфичности [см., например, Milstein and Cuello (1983) Nature 305: 537; международную патентную публикацию № WO 93/08829; и Traunecker et al. (1991), EMBO J. 10: 3655, и патент США №5731168 (технология "выступы-во-впадины")]. Мультиспецифические антитела также могут быть получены путем создания эффектов электростатического взаимодействия для получения Fc-гетеродимерных молекул антител (см., Например, WO 2009/089004A1); сшивания двух или более антител или фрагментов [см., например, патент США №4676980; и Brennan et al. (1985) Science, 229: 81]; использования лейциновых молний для получения биспецифических антител [см., например, Kostelny et al. (1992) J. Immunol., 148 (5): 1547-1553]; использования технологии "диатела" для получения фрагментов биспецифических антител [см., например, Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448]; использования одноцепочечных Fv (sFv) димеров [см., например, Gruber et al. (1994) J. Immunol., 152: 5368]; и получения триспецифических антител (см., например, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60). Мультиспецифические антитела можно получить в виде полноразмерных антител или фрагментов антител. Также включены сконструированные антитела с тремя или более функциональными антиген-связывающими сайтами, включая мультивалентные антитела-"осьминоги" [см., например, US 2006/0025576 A1].

В некоторых вариантах осуществления антитело, раскрытое в настоящей заявке, представляет собой моноклональное антитело. Моноклональное антитело относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих природные мутации или возникающие в процессе получения препаратов моноклональных антител, такие варианты обычно присутствуют в небольших количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных эпитопов, каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одного эпитопа на антигене. Таким образом, определение "моноклональный" указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующий продукции антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии со способами по настоящему изобретению можно получить различными методами, включая, но не ограничиваясь этим, гибридомный метод, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы, использующие трансгенных животных, содержащих все или часть локусов иммуноглобулина человека, такие методы и другие типичные методы получения моноклональных антител описаны в настоящей заявке.

Например, используя иммуногены, происходящие из активина, антибелковые/антипептидные антисыворотки или моноклональные антитела могут быть получены по стандартным протоколам [см., например, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (1988) Cold Spring Harbor Press: 1988]. Млекопитающее, такое как мышь, хомяк или кролик, может быть иммунизировано иммуногенной формой полипептида активина, антигенным фрагментом, который способен вызывать ответ антитела, или слитым белком. Методы придания иммуногенности белку или пептиду включают конъюгирование с носителями или другие методики, хорошо известные в данной области. Иммуногенную часть полипептида активина можно вводить в присутствии адъюванта. Процесс иммунизации можно отслеживать путем определения титров антител в плазме или сыворотке. Стандартный ELISA или другие иммуноанализы можно использовать с иммуногеном в качестве антигена для оценки уровней продукции антител и/или уровня аффинности связывания.

После иммунизации животного антигенным препаратом активина можно получить антисыворотку и, если необходимо, из сыворотки можно выделить поликлональные антитела. Для получения моноклональных антител можно собрать клетки, продуцирующие антитела (лимфоциты), иммунизированного животного и осуществить слияние с использованием стандартных процедур слияния соматических клеток с иммортализованными клетками, такими как клетки миеломы, для получения клеток гибридомы. Такие методики хорошо известны в данной области и включают, например, метод гибридом [см., например, Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-497], метод с использованием гибридных B-клеток человека [см., например, Kozbar et al. (1983) Immunology Today, 4:72] и метод EBV-гибридомы для получения человеческих моноклональных антител [Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96]. Можно осуществить иммунохимический скрининг клеток гибридомы на продуцирование антител, специфически реагирующих с полипептидом активина, и моноклональных антител, выделенных из культуры, включающей такие клетки гибридомы.

В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных модификаций могут быть введены в Fc-область антитела, представленного в настоящей заявке, с получением таким образом варианта Fc-области. Вариант Fc-области может включать последовательность Fc-области человека (например, Fc-область человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), включающую аминокислотную модификацию (например, замену, делецию и/или добавление) в одном или нескольких аминокислотах положениях.

Например, в настоящем раскрытии рассматривается вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желательным кандидатом для применений, в которых период полужизни антитела in vivo важен, но при этом некоторые эффекторные функции [например, комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) и антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC)] являются ненужными или вредными. Можно осуществить анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo для подтверждения снижения/истощения активности CDC и/или ADCC. Например, можно осуществить анализы связывания с Fc-рецептором (FcR), чтобы убедиться, что антитело не связывается с FcyR (следовательно, вероятно, не обладает ADCC активностью), но сохраняет способность связываться с FcRn. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK клеток, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках в общем виде описана, например, в Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492. Неограничивающие примеры анализов in vitro для оценки ADCC активности представляющей интерес молекулы описаны в патенте США No. №5500362; Hellstrom, I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7059-7063]; Hellstrom, I. et al. (198S) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1499-1502; патенте США №5821337; Bruggemann, М. et al. (1987) J. Exp. Med. 166: 1351-1361. Альтернативно, можно использовать нерадиоактивные анализы (например, ACTI™, нерадиоактивный анализ цитотоксичности для проточной цитометрии; CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; и CytoTox 96^® нерадиоактивный анализ цитотоксичности, Promega, Madison, Wis.). Подходящие для таких анализов эффекторные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные киллерные (NK) клетки. Альтернативно или дополнительно, ADCC активность представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, на животной модели, такой как описанная в Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 652-656. Также можно осуществить анализы связывания Clq для подтверждения того, что антитело не способно связывать Clq и, следовательно, не обладает CDC активностью [см., например, ELISA для связывания Clq и C3c в WO 2006/029879 и WO 2005/100402]. Для оценки активации комплемента можно осуществить анализ CDC [см., например, Gazzano-Santoro et al. (1996) J. Immunol. Methods 202: 163; Cragg, M.S. et al. (2003) Blood 101:1045-1052; и Cragg, M.S., M.J. Glennie (2004), Blood 103: 2738-2743]. Определения связывания FcRn и клиренса/периода полужизни in vivo также можно осуществить с использованием способов, известных в данной области [см., например, Petkova, S.B. et al. (2006) Intl. Immunol. 18 (12): 1759-1769]. Антитела по настоящему изобретению с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или нескольких остатков Fc-области 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (патент США №6737056). Такие Fc-мутанты включают Fc-мутанты с заменами в двух или более аминокислотных положениях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый "DANA" Fc-мутант с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патент США №7332581).

В некоторых вариантах осуществления может быть желательным создание антител с сконструированными цистеиновыми остатками, например, "thioMAbs" в которых один или несколько остатков в антителе заменены цистеиновыми остатками. В конкретных вариантах осуществления замененные остатки присутствуют в доступных сайтах антитела. При замене этих остатков цистеином реакционноспособные тиольные группы, таким образом, располагаются в доступных сайтах антитела и могут использоваться для конъюгирования антитела с другими фрагментами, такими как лекарственные фрагменты или фрагменты лекарственное средство-линкер, для создания иммуноконъюгата, как описано далее в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления любой один или несколько из следующих остатков могут быть заменены цистеином: V205 (нумерация по Кабату) легкой цепи; А118 (EU нумерация) тяжелой цепи; и S400 (EU нумерация) Fc области тяжелой цепи. Сконструированные антитела с цистеинами можно получить, как описано, например, в патенте США №7522541.

Кроме того, методы, используемые для скрининга антител с целью выявления желаемого антитела, могут влиять на свойства полученного антитела. Например, если антитело должно использоваться для связывания антигена в растворе, может быть желательно протестировать связывание в растворе. Доступно множество различных методик для тестирования взаимодействий между антителами и антигенами для выявления особенно желательных антител. Такие методы включают ELISA, анализы связывания с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса (например, анализ связывания Biacore, Biacore AB, Uppsala, Sweden), сэндвич-анализы (например, система парамагнитных шариков IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), вестерн-блоты, анализы иммунопреципитации и иммуногистохимические анализы.

В некоторых вариантах осуществления рассматриваются варианты аминокислотной последовательности антител и/или связывающих полипептидов, представленных в настоящей заявке. Например, может быть желательно улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела и/или связывающего полипептида. Варианты аминокислотной последовательности антитела и/или связывающего полипептида могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело и/или связывающий полипептид, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела и/или связывающего полипептида. Возможна любая комбинация делеции, вставки и замены для достижения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками, например, связывание с мишенью (например, связывание с активином, таким как активин Е и/или активин С).

Можно осуществить изменения (например, замены) в HVRs, например, для улучшения аффинности антител. Такие изменения можно осуществить в "горячих точках" HVR, то есть остатках, кодируемых кодонами, которые подвергаются мутации с высокой частотой в процессе соматического созревания [см., например, Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol.207: 179-196 (2008)], и/или SDRs (a-CDRs), при этом полученный вариант VH или VL тестируют на аффинность связывания. Созревание аффинности путем конструирования и повторного выбора из вторичных библиотек описано в данной области техники [см., например, Hoogenboom et aL, Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ (2001). В некоторых вариантах осуществления созревания аффинности вводится разнообразие в вариабельные гены, выбранные для созревания, любым из множества способов (например, ПЦР с ошибками, перестановка цепей или олигонуклеотид-направленный мутагенез). Затем создается вторичная библиотека. Затем библиотеку подвергают скринингу для выявления любых вариантов антител с желаемой аффинностью. Другой способ введения разнообразия включает HVR-направленные подходы, в которых несколько HVR остатков (например, 4-6 остатков одновременно) рандомизированы. HVR остатки, участвующие в связывании антигена, могут быть конкретно идентифицированы, например, с использованием аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. CDR-H3 и CDR-L3, в частности, часто являются мишенями.

В некоторых вариантах осуществления замены, вставки или делеции могут происходить в одном или нескольких HVR, при условии, что такие изменения существенно не снижают способность антитела связываться с антигеном. Например, консервативные изменения (например, консервативные замены, как предусмотрено в настоящей заявке), которые существенно не снижают аффинность связывания, могут быть осуществлены в HVR. Такие изменения могут быть за пределами "горячих точек" HVR или SDR. В некоторых вариантах осуществления вариантных последовательностей VH и VL, представленных выше, каждая HVR либо не изменяется, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

Полезный метод идентификации остатков или областей антитела и/или связывающего полипептида, который может быть нацелен на мутагенез, называется "аланин-сканирующий мутагенез", как описано Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. В этом методе остаток или группа целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином) для определения влияет ли это на взаимодействие антитело-антиген. Дальнейшие замены могут быть введены в положениях аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к исходным заменам. Альтернативно, или дополнительно, определяют кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут подвергаться направленному воздействию или могут быть делетированы как кандидаты на замену. Варианты можно скринировать для определения имеют ли они желаемые свойства.

Вставки в аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбокси-концевые слияния длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности из одного или нескольких аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние N- или C-конца антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который увеличивает период полужизни антитела в сыворотке.

В некоторых вариантах осуществления антитело и/или связывающий полипептид, представленные в настоящей заявке, могут быть дополнительно модифицированы для содержания дополнительных непротеиновых фрагментов, которые известны в данной области и легко доступны. Группы, подходящие для дериватизации антитела и/или связывающего полипептида, включают, но не ограничиваются этим, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничиваются этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиминокислоты (гомополимеры или статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликоль-пропионовый альдегид может иметь преимущества при производстве из-за его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, прикрепленных к антителу и/или связывающему полипептиду, может варьироваться, и если присоединено более одного полимера, они могут быть одинаковыми или разными молекулами. Как правило, количество и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, можно определить с учетом факторов, включающих, но не ограничивающихся этим, конкретные свойства или функции антитела и/или связывающего полипептида, которые необходимо улучшить, независимо от того, будет ли использоваться производное антитела и/или связывающее полипептидное производное в терапии в определенных условиях.

5. Малые молекулы-антагонисты

В других аспектах, антагонист GDF/BMP для использования в соответствии со способами и применениями, описанными в настоящей заявке, представляет собой малую молекулу (низкомолекулярный антагонист GDF/BMP) или комбинацию низкомолекулярных антагонистов. Низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, может ингибировать, например, один или несколько GDF/BMP лигандов (например, активин, GDF11, GDF8, GDF3, BMP6, BMP10 и/или BMP15), рецептор типа I (например, ALK4, ALK5 и/или ALK7), рецептор типа II (например, ActRIIB и/или ActRIIA), ко-рецептор и/или один или несколько факторов передачи сигналов (например, Smad белки, такие как Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует передачу сигнала, опосредованную одним или несколькими GDF/BMP лигандами, например, как определено в клеточном анализе, например, описанном в настоящей заявке. Как описано в настоящей заявке, низкомолекулярные антагонисты GDF/BMP можно использовать, отдельно или в комбинации с одной или несколькими поддерживающими терапиями или активными средствами, для лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии (ЛГ), в частности, лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких ЛГ-ассоциированных осложнений.

В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере GDF11, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере GDF8, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF11, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере активин (активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере активин B, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере BMP6, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), GDF3, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере BMP15, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), GDF3, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере GDF3, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере BMP10, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере ActRIIA, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере ActRIIB, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере ALK4, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере ALK5, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, BMP10, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, ингибирует по меньшей мере ALK7, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, BMP10 и один или несколько Smad белков (например, Smads 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, как раскрыто в настоящей заявке, не ингибирует или по существу не ингибирует BMP9. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный антагонист GDF/BMP, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, как раскрыто в настоящей заявке, не ингибирует или по существу не ингибирует активин A.

Низкомолекулярные антагонисты GDF/BMP могут быть прямыми или непрямыми ингибиторами. Например, непрямой низкомолекулярный антагонист, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, может ингибировать экспрессию (например, транскрипцию, трансляцию, секрецию из клеток или их комбинацию) по меньшей мере одного или нескольких GDF/BMP лигандов [например, активина (такого как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин B, активин BC, активин AE или активин BE), GDF11, BMP15, BMP6, GDF3, BMP10 и/или GDF8], рецептора типа I (например, ALK4, ALK5 и/или ALK7), рецепторов типа II (например, ActRIIA и/или ActRIIB), ко-рецептора и/или одного или нескольких компонентов нисходящего сигнального пути (например, белки Smad). Альтернативно, прямой низкомолекулярный антагонист, или комбинация низкомолекулярных антагонистов, может непосредственно связываться, и ингибировать, например, с одним или несколькими GDF/BMP лигандами [например, активином (таким как активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин B, активин BC, активин AE или активин BE), GDF11, BMP15, BMP6, GDF3, BMP10 и/или GDF8], рецептором типа I (например, ALK4, ALK5 и/или ALK7), рецепторами типа II (например, ActRIIA и/или ActRIIB), ко-рецептором и/или одним или несколькимио компонентами нисходящего сигнального пути (например, белки Smad). Комбинации одного или нескольких непрямых и одного или нескольких прямых низкомолекулярных антагонистов GDF/BMP можно использовать в соответствии со способами, раскрытыми в настоящей заявке.

Идентификацию и химический синтез связывающихся низкомолекулярных антагонистов по настоящему изобретению можно осуществить с использованием известных методов (см., например, публикации PCT №№ WO 00/00823 и WO 00/39585). Как правило, низкомолекулярные антагонисты по настоящему изобретению обычно имеют размер меньше чем около 2000 Дальтон, альтернативно, меньше чем около 1500, 750, 250 или 200 Дальтон, при этом такие органические малые молекулы способны связываться, в частности, предпочтительно с полипептидом, описанным в настоящей заявке. Эти низкомолекулярные антагонисты могут быть идентифицированы без чрезмерного экспериментирования с использованием хорошо известных методов. В этой связи, необходимо отметить, что методы для скрининга органических низкомолекулярных библиотек для определения молекул, которые способны связываться с полипептидной мишенью, хорошо известны в данной области (см., например, международные патентные публикации №№ WO 00/00823 и WO 00/39585.).

Связывающиеся органические малые молекулы по настоящему изобретению могут представлять собой, например, альдегиды, кетоны, оксимы, гидразоны, семикарбазоны, карбазиды, первичные амины, вторичные амины, третичные амины, N-замещенные гидразины, гидразиды, спирты, простые эфиры, тиолы, тиоэфиры, дисульфиды, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, мочевины, карбаматы, карбонаты, кетали, тиокетали, ацетали, тиоацетали, арилгалогениды, арилсульфонаты, алкилгалогениды, алкилсульфонаты, ароматические соединения, гетероциклические соединения, анилины, алкены, алкины, диолы, аминоспирты, оксазолидины, оксазолины, тиазолидины, тиазолины, енамины, сульфонамиды, эпоксиды, азиридины, изоцианаты, сульфонилхлориды, диазосоединения и хлорангидриды кислот.

6. Полинуклеотидные антагонисты

В других аспектах, антагонист GDF/BMP для использования в соответствии со способами и применениями, раскрытыми в настоящей заявке, представляет собой полинуклеотид (полинуклеотидный антагонист GDF/BMP) или комбинацию полинуклеотидов. Полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, может ингибировать, например, один или несколько GDF/BMP лигандов (например, активин, GDF11, GDF8, GDF3, BMP6, BMP10 и/или BMP15), рецепторы типа I (например, ALK4, ALK5 и/или ALK7), рецепторы типа II (например, ActRIIA и/или ActRIIB), ко-рецептор и/или компонент нисходящего сигнального пути (например, Smad). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует передачу сигнала, опосредованную одним или несколькими GDF/BMP лигандами, например, как определено в клеточном анализе, например, описанном в настоящей заявке. Как описано в настоящей заявке, полинуклеотидные антагонисты GDF/BMP можно использовать, отдельно или в комбинации с одной или несколькими поддерживающими терапиями или активными средствами для лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии (ЛГ), в частности, лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких ЛГ-ассоциированных осложнений

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере GDF11, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере GDF8, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF11, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере активин (активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере активин B, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере BMP6, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), GDF3, GDF11, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере BMP15, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), GDF3, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере GDF3, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере BMP10, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере ActRIIA, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере ActRIIB, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере ALK4, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK5, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере ALK5, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, BMP10, ALK7 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, ингибирует по меньшей мере ALK7, необязательно также ингибируя один или несколько из GDF8, активина (например, активин A, активин B, активин C, активин E, активин AB, активин AC, активин BC, активин AE и/или активин BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, BMP10 и один или несколько Smad белков (например, Smad 2 и 3). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, раскрыто в настоящей заявке не ингибирует или по существу не ингибирует BMP9. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидный антагонист GDF/BMP, или комбинация полинуклеотидных антагонистов, как раскрыто в настоящей заявке. не ингибирует или по существу не ингибирует активин A.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные антагонисты по настоящему изобретению могут представлять собой антисмысловую нуклеиновую кислоту, молекулу РНКи [например, малую интерферирующую РНК (миРНК), малую шпилечную РНК (мшРНК), микроРНК (микроРНК)], аптамер и/или рибозим. Нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности человеческого GDF11, GDF8, активина (активин A, активин B, активин C и активин E), BMP6, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, BMP 15 и белков Smad известны в данной области. Кроме того, в данной области хорошо известны многие различные способы получения полинуклеотидных антагонистов. Поэтому специалисты в данной области могут рутинным образом получить полинуклеотидные антагонисты для использования в соответствии с настоящим раскрытием на основании знаний в данной области техники и представленного раскрытия.

Антисмысловую технологию можно использовать для контроля экспрессии генов посредством антисмысловой ДНК или РНК или посредством образования тройной спирали. Антисмысловые методы обсуждаются, например, в Okano (1991) J. Neurochem. 56:560; Oligodeoxynucleoudes as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988). Образование тройной спирали обсуждается, например, в Cooney et al. (1988) Science 241:456; и Dervan et al., (1991) Science 251:1300. Методы основаны на связывании полинуклеотида с комплементарной ДНК или РНК. В некоторых вариантах осуществления антисмысловые нуклеиновые кислоты включают последовательность одноцепочечной РНК или ДНК, которая комплементарна по меньшей мере части РНК транскрипта гена, раскрытого в настоящей заявке. Однако абсолютная комплементарность, хотя и является предпочтительной, необязательна.

Как указано выше, последовательность "комплементарна по меньшей мере части РНК" означает последовательность, обладающую достаточной комплементарностью, чтобы быть способной гибридизоваться с РНК, образуя стабильный дуплекс; в случае двухцепочечных антисмысловых нуклеиновых кислот гена, раскрытого в настоящей заявке, можно осуществить анализ одной цепи дуплексной ДНК или анализ образования триплекса. Способность к гибридизации будет зависеть как от степени комплементарности, так и от длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. Как правило, чем больше гибридизирующаяся нуклеиновая кислота, тем больше она может содержать ошибочных спариваний оснований с РНК, и все же образует стабильный дуплекс (или триплекс в зависимости от обстоятельств). Специалист в данной области может установить допустимую степень ошибочного спаривания, используя стандартные процедуры для определения температуры плавления гибридизованного комплекса.

Полинуклеотиды, которые комплементарны 5'-концу транскрипта, например, 5'-нетранслируемая последовательность вплоть до и включая кодон инициации AUG, должны работать наиболее эффективно при ингибировании трансляции. Однако было показано, что последовательности, комплементарные 3'-нетранслируемым последовательностям мРНК, также эффективны в ингибировании трансляции мРНК [см., например, Wagner R., (1994) Nature 372:333-335]. Таким образом, олигонуклеотиды, комплементарные либо 5'-, либо 3'-нетранслируемым некодирующим областям гена по изобретению, можно использовать в антисмысловом подходе для ингибирования трансляции эндогенной мРНК. Полинуклеотиды, комплементарные 5'-нетранслируемой области мРНК, должны включать комплемент AUG старт-кодона. Антисмысловые полинуклеотиды, комплементарные кодирующим областям мРНК, являются менее эффективными ингибиторами трансляции, но могут быть использованы в соответствии со способами по настоящему изобретению. Независимо от того, предназначены ли они для гибридизации с 5'-, 3'- или кодирующей областью мРНК по изобретению, антисмысловые нуклеиновые кислоты должны иметь длину по меньшей мере шесть нуклеотидов, и предпочтительно представляют собой олигонуклеотиды, имеющие длину в пределах от 6 до примерно 50 нуклеотидов. В конкретных аспектах, олигонуклеотид имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 17 нуклеотидов, по меньшей мере 25 нуклеотидов или по меньшей мере 50 нуклеотидов.

В одном варианте осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота по настоящему изобретению продуцируется внутриклеточно путем транскрипции из экзогенной последовательности. Например, вектор или его часть транскрибируют с образованием антисмысловой нуклеиновой кислоты (РНК) гена по настоящему изобретению. Такой вектор будет содержать последовательность, кодирующую желаемую антисмысловую нуклеиновую кислоту. Такой вектор может оставаться эписомальным или стать хромосомно интегрированным, при условии, что его можно транскрибировать для получения желаемой антисмысловой РНК. Такие векторы можно сконструировать с использованием технологии рекомбинантных ДНК, стандартной в данной области. Векторы могут быть плазмидными, вирусными или другими, известными в данной области, используемыми для репликации и экспрессии в клетках позвоночных. Экспрессия последовательности, кодирующей желаемые гены по настоящему изобретению или их фрагменты, может осуществляться посредством любого промотора, известного в данной области для действия в клетках позвоночных, предпочтительно человека. Такие промоторы могут быть индуцибельными или конститутивными. Такие промоторы включают, но не ограничиваются этим, область раннего промотора SV40 [см., например, Benoist and Chambon (1981) Nature 290:304-310], промотор, содержащийся в 3'-длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса [см., например, Yamamoto et al. (1980) Cell 22:787-797], тимидиновый промотор герпеса [см., например, Wagner et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445] и регуляторные последовательности гена металлотионеина [см., например, Brinster, et al. (1982) Nature 296: 39-42].

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные антагонисты являются молекулами интерферирующей РНК (РНКи), которые нацелены на экспрессию одного или нескольких из: GDF11, GDF8, активин (активин A, активин B, активин C и активин E), BMP6, GDF3, ActRIIA, ActRIIB, BMP10, ALK4, ALK5, ALK7, BMP15 и белки Smad. РНКи относится к экспрессии РНК, которая вмешивается в экспрессию мРНК-мишени. В частности, РНКи делает молчащим целевой ген посредством взаимодействия со специфической мРНК через миРНК (малую интерферирующую РНК). Комплекс дцРНК затем является мишенью для деградации клеткой. Молекула миРНК представляет собой двухцепочечный РНК-дуплекс длиной от 10 до 50 нуклеотидов, который препятствует экспрессии целевого гена, который является достаточно комплементарным (например, идентичность с геном по меньшей мере 80%). В некоторых вариантах осуществления молекула миРНК включает нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична нуклеотидной последовательности гена-мишени.

Дополнительные молекулы РНКи включают малую шпилечную РНК (мшРНК); также малую интерферирующую шпилечную и микроРНК (микроРНК). Молекула мшРНК содержит смысловую и антисмысловую последовательности из целевого гена, соединенные петлей. мшРНК транспортируется из ядра в цитоплазму и разрушается вместе с мРНК. Промоторы Pol III или U6 можно использовать для экспрессии молекул РНК для РНКи. Paddison et al. [Genes & Dev. (2002) 16:948-958, 2002] использовали небольшие молекулы РНК, уложенные в виде шпилек, в качестве средства воздействия на РНКи. Соответственно, такие молекулы малых шпилечных РНК (мшРНК) также полезны для использования в способах, описанных в настоящей заявке. Длина "стебля" и петли функциональных мшРНК варьируется; Длина стебля может варьироваться от 25 до 30 нуклеотидов, а размер петли может быть от 4 до 25 нуклеотидов, не влияя на активность сайленсинга. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что эти мшРНК напоминают двухцепочечные РНК (дцРНК) продукты РНКазы DICER и, в любом случае, обладают одинаковой способностью ингибировать экспрессию конкретного гена. Экспрессию мшРНК можно осуществить из лентривирусного вектора. миРНК представляет собой одноцепочечную РНК длиной примерно от 10 до 70 нуклеотидов, которая первоначально транскрибируется в виде пре-миРНК, характеризующейся структурой "стебель-петля", которая впоследствии процессируется в зрелую миРНК после дополнительного процессинга посредством RISC.

Молекулы, которые опосредуют РНКи, в том числе миРНК, могут быть получены in vitro путем химического синтеза (Hohjoh, FEBS Lett 521: 195-199, 2002), гидролизом дцРНК (Yang et al., Proc Nad Acad Sci USA 99: 9942-9947, 2002), путем транскрипции in vitro при помощи РНК-полимеразы Т7 (Donzeet et al., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002) и путем гидролиза двухцепочечной РНК с использованием нуклеазы, такой как РНКаза E.coli Y (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 9942-9947, 2002).

В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотидные антагонисты, включающие, но не ограничивающиеся этим, ДНК ловушку, двухцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК, связанную в комплекс ДНК, инкапсулированную ДНК, вирусную ДНК, плазмидную ДНК, "голую" РНК, инкапсулированную РНК, вирусную РНК, двухцепочечную РНК, молекулу, способную генерировать РНК-интерференцию, или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные антагонисты по настоящему изобретению представляют собой аптамеры. Аптамеры представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, включая молекулы двухцепочечной ДНК и одноцепочечной РНК, которые связываются, и которые образуют третичные структуры, которые специфически связываются, с молекулой-мишенью. Получение и терапевтическое применение аптамеров хорошо известны в данной области (см., например, патент США №5475096). Дополнительную информацию об аптамерах можно найти в публикации патентной заявки США №20060148748. Нуклеиновокислотные аптамеры выбирают с использованием способов, известных в данной области, например, через Систематическую Эволюцию Лигандов способом Экспоненциального Обогащения (SELEX). SELEX представляет собой метод эволюции in vitro молекул нуклеиновых кислот с высокоспецифичным связыванием с молекулами-мишенями, как описано, например, в патентах США №№5475096; 5580737; 5567588; 5707796; 5763177; 6011577; и 6699843. Другой способ скрининга для идентификации аптамеров описан в патенте США №5270163. Способ SELEX основан на способности нуклеиновых кислот образовывать разнообразные двумерные и трехмерные структуры, а также на химической универсальности, присущей нуклеотидным мономерам, для действия в качестве лигандов (образующих специфические пары связывания) практически с любым химическим соединением, мономерным или полимерным, включая другие молекулы нуклеиновых кислот и полипептиды. Молекулы любого размера или состава могут служить мишенями. Метод SELEX включает отбор из смеси олигонуклеотидов-кандидатов и поэтапные итерации связывания, разделения и амплификации с использованием одной и той же общей схемы отбора для достижения желаемой аффинности связывания и селективности. Исходя из смеси нуклеиновых кислот, которая может включать сегмент рандомизированной последовательности, метод SELEX включает стадии контактирования смеси с мишенью в условиях, благоприятных для связывания; отделение несвязанных нуклеиновых кислот от тех нуклеиновых кислот, которые специфически связаны с молекулами-мишенями; диссоциацию комплексов нуклеиновая кислота-мишень; амплификацию нуклеиновых кислот, диссоциированных из комплексов нуклеиновая кислота-мишень, с получением обогащенной лигандом смеси нуклеиновых кислот. Стадии связывания, разделения, диссоциации и амплификации повторяют с использованием такого количества циклов, которое необходимо для получения нуклеиновокислотных лигандов, которые связываются с высокой аффинностью и специфичностью с молекулой-мишенью.

Как правило, такие связывающиеся молекулы вводят животному отдельно [см., например, O'Connor (1991) J. Neurochem. 56:560], но такие связывающиеся молекулы также могут экспрессироваться in vivo из полинуклеотидов, поглощенных клеткой-хозяином и экспрессируемых in vivo [см., например, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)].

7. Фоллистатиновые и FLRG антагонисты

В других аспектах, антагонист GDF/BMP представляет собой фоллистатин или FLRG полипептид. Как описано в настоящей заявке, фоллистатин и/или FLRG полипептиды можно использовать для лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии (ЛГ), в частности, лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких ЛГ-ассоциированных осложнений.

Термин "фоллистатиновый полипептид" включает полипептиды, включающие любой природный полипептид фоллистатина, а также любые их варианты (включая мутанты, фрагменты, слияния и пептидомиметические формы), которые сохраняют полезную активность, а также включает любой функциональный мономер или мультимер фоллистатина. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления фоллистатиновые полипептиды по изобретению связываются с и/или ингибируют активность активина, в частности, активина A. Варианты фоллистатинаовых полипептидов, которые сохраняют свойства связывания активина, можно идентифицировать на основании предыдущих исследований, включающих взаимодействия фоллистатина и активина. Например, WO 2008/030367 раскрывает специфические домены фоллистатина ("FSDs"), которые, как было показано, являются важными для связывания активина. Как показано ниже в SEQ ID NO: 28-30, N-концевой домен фоллистатина ("FSND" SEQ ID NO: 28), FSD2 (SEQ ID NO: 30) и в меньшей степени FSD1 (SEQ ID NO: 29) представляют собой иллюстративные домены в фоллистатине, которые являются важными для связывания активина. Кроме того, способы получения и анализа библиотеки полипептидов описаны выше в контексте полипептидов ActRII, и такие способы также относятся к получению и анализу вариантов фоллистатина. Фоллистатиновые полипептиды включают полипептиды, происходящие из последовательности любого известного фоллистатина, имеющего последовательность идентичную по меньшей мере на около 80% последовательности фоллистатинового полипептида, и необязательно имеющую идентичность по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше. Примеры фоллистатинаовых полипептидов включают зрелый фоллистатиновый полипептид или более короткие изоформы или другие варианты человеческого фоллистатинового полипептида-предшественника (SEQ ID NO: 26), как описано, например, в WO 2005/025601.

Изоформа FST344 человеческого фоллистатинового полипептида-предшественника представляет собой следующую:

Сигнальный пептид подчеркнут; также подчеркнуты последние 27 остатков, которые представляют собой С-концевое удлинение, отличающее эту изоформу фоллистатина от более короткой изоформы фоллистатина FST317, показанной ниже.

Изоформа FST317 человеческого фоллистатинового полипептида-предшественника представляет собой следующую:

Сигнальный пептид подчеркнут.

Последовательность N-концевого домена фоллистатина (FSND) представляет собой следующую:

Последовательности FSD1 и FSD2 являются следующими:

В других аспектах, средство для применения в соответствии со способам, раскрытыми в настоящей заявке, представляет собой фоллистатин-подобный ген (FLRG), также известный как фоллистатин-подобный белок 3 (FSTL3). Термин "FLRG полипептид" включает полипептиды, включающие любой природный полипептид FLRG, а также любые их варианты (включая мутанты, фрагменты, слияния и пептидомиметические формы), которые сохраняют полезную активность. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления FLRG полипептиды по изобретению связываются с активином и/или ингибируют активность активина, в частности, активина A. Варианты FLRG полипептидов, которые сохраняют свойства связывания активина, можно идентифицировать с использованием рутинных способов для анализа взаимодействий FLRG и активина (см., например, US 6537966). Кроме того, способы получения и анализа библиотеки полипептидов описаны выше в контексте полипептидов ActRII, и такие способы также относятся к получению и анализу вариантов FLRG. FLRG полипептиды включают полипептиды, происходящие из последовательности любого известного FLRG, имеющего последовательность идентичную по меньшей мере на около 80% последовательности FLRG полипептида, и необязательно имеющую идентичность по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше.

Человеческий FLRG полипептид-предшественник (предшественник фоллистатин-подобного белка 3) является следующим:

Сигнальный пептид подчеркнут.

В некоторых вариантах осуществления функциональные варианты или модифицированные формы фоллистатиновых полипептидов и FLRG полипептидов включают слитые белки, имеющие по меньшей мере часть фоллистатинового полипептида или FLRG полипептида и один или несколько слитых доменов, таких как, например, домены, которые облегчают выделение, детекцию, стабилизацию или мультимеризацию полипептида. Подходящие слитые домены подробно обсуждаются выше в связи с полипептидами ActRII. В некоторых вариантах осуществления антагонистическое средство по настоящему изобретению представляет собой слитый белок, включающий активин-связывающую часть фоллистатинового полипептида, слитую с Fc-доменом. В другом варианте осуществления антагонистическое средство по изобретению представляет собой слитый белок, включающий активин-связывающую часть FLRG полипептида, слитую с Fc-доменом.

8. Скрининговые анализы

В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к применению рассматриваемых антагонистов GDF/BMP (например, полипептидов ActRII и их вариантов) для идентификации соединений (средств), которые можно использовать для лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии (ЛГ), в частности, лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких ЛГ-ассоциированных осложнений.

Существует множество подходов к скринингу терапевтических средств для лечения ЛГ путем нацеливания на передачу сигналов (например, Smad-передачу сигналов) одного или нескольких лигандов GDF/BMP. В некоторых вариантах осуществления можно осуществить высокопроизводительный скрининг соединений для идентификации средств, которые нарушают опосредованные GDF/BMP лигандами эффекты на выбранную клеточную линию. В некоторых вариантах осуществления анализ осуществляют для скрининга и идентификации соединений, которые специфически ингибируют или уменьшают связывание лиганда GDF/BMP (например, активин A, активин B, активин AB, активин C, GDF3, BMP6, GDF8, GDF1S, GDF11 или BMP10) с его партнером по связыванию, таким как рецептор типа II ((например, ActRIIA и/или ActRIIB). Альтернативно, анализ можно использовать для идентификации соединений, которые усиливают связывание GDF/BMP лиганда с его партнером по связыванию, таким как рецептор типа II. В другом варианте осуществления соединения могут быть идентифицированы по их способности взаимодействовать с рецептором типа II.

Различные форматы анализа будут достаточными, и, в свете настоящего раскрытия, те, которые явным образом не описаны в настоящей заявке, будут, тем не менее, понятны специалистам в данной области техники. Как описано в настоящей заявке, испытываемые соединения (средства) по изобретению могут быть получены любым комбинаторным химическим способом. Альтернативно, соединения по настоящему изобретению могут представлять собой природные биомолекулы, синтезированные in vivo или in vitro. Соединения (средства), которые должны быть испытаны на их способность действовать в качестве модуляторов роста ткани, могут продуцироваться, например, бактериями, дрожжами, растениями или другими организмами (например, природными продуктами), могут быть получены химическим путем (например, небольшие молекулы, включая пептидомиметики) или получены рекомбинантно. Испытываемые соединения, рассматриваемые в настоящем изобретении, включают непептидильные органические молекулы, пептиды, полипептиды, пептидомиметики, сахара, гормоны и молекулы нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления испытываемое средство представляет собой малую органическую молекулу, имеющую молекулярную массу менее чем около 2000 Дальтон.

Испытываемые соединения по настоящему изобретению могут быть представлены в виде отдельных, дискретных молекул или представлены в библиотеках большей сложности, например, полученных при помощи комбинаторной химии. Эти библиотеки могут включать, например, спирты, алкилгалогениды, амины, амиды, сложные эфиры, альдегиды, простые эфиры и другие классы органических соединений. Испытываемые соединения могут быть представлены в систему испытаний в изолированной форме или в виде смесей соединений, особенно на начальных стадиях скрининга. Необязательно, соединения могут быть необязательно дериватизированы другими соединениями и содержать дериватизирующие группы, которые облегчают выделение соединений. Неограничивающие примеры дериватизирующих групп включают биотин, флуоресцеин, дигоксигенин, зеленый флуоресцентный белок, изотопы, полигистидин, магнитные шарики, глутатион-S-трансферазу (GST), фотоактивируемые сшивающие агенты или любые их комбинации.

Во многих программах скрининга лекарственных средств, в которых тестируются библиотеки соединений и природных экстрактов, желательны высокопроизводительные анализы, чтобы максимизировать количество исследуемых соединений в течение определенного периода времени. Анализы, которые осуществляют в бесклеточных системах, например, которые могут быть получены с очищенными или полуочищенными белками, часто являются предпочтительными в качестве "первичных" скринингов, поскольку они могут быть созданы для обеспечения быстрого проявления и относительно легкого обнаружения изменения в молекулярной мишени, которое опосредовано испытываемым соединением. Кроме того, эффекты клеточной токсичности или биодоступности испытываемого соединения, как правило, могут игнорироваться в системе in vitro, вместо этого анализ фокусируется главным образом на эффекте лекарственного средства на молекулярную мишень, что может проявляться в изменении аффинности связывания между лигандом GDF/BMP (например, таким как активин A, активин B, активин AB, активин C, GDF8, GDF15, GDF11, GDF3, BMP6 или BMP 10) и его партнером по связыванию, таким как рецептор типа II ((например, ActRIIA и/или ActRIIB).

Просто для проиллюстрации, в типичном скрининговом анализе настоящего раскрытия представляющее интерес соединение контактирует с выделенным и очищенным полипептидом ActRIIB, который обычно способен связываться с лигандом ActRIIB, в зависимости от цели анализа. Затем к смеси соединения и полипептида ActRIIB добавляют композицию, содержащую лиганд ActRIIB (например, GDF11). Детекция и количественное определение комплексов ActRIIB/ActRIIB-лиганд обеспечивает средства для определения эффективности соединения в отношении ингибирования (или потенцирования) комплексообразования между полипептидом ActRIIB и его связывающим белком. Эффективность соединения можно оценить путем построения кривых зависимости доза-ответ на основании данных, полученных с использованием различных концентраций испытуемого соединения. Кроме того, также можно осуществить контрольный анализ, чтобы обеспечить базовый уровень для сравнения. Например, в контрольном анализе выделенный и очищенный лиганд ActRIIB добавляют к композиции, содержащей полипептид ActRIIB, и образование комплекса ActRIIB/лиганд ActRIIB количественно определяют в отсутствие испытываемого соединения. Должно быть понятно, что, как правило, порядок добавления в смесь реагентов может варьироваться, и их можно смешивать одновременно. Кроме того, вместо очищенных белков можно использовать клеточные экстракты и лизаты для создания подходящей бесклеточной системы анализа.

Образование комплекса между GDF/BMP лигандом и связывающимся с ним белком можно определить различными способами. Например, модуляция образования комплексов может быть определена количественно с использованием, например, детектируемых меченых белков, таких как радиоактивно-меченный (например, ³²P, ³⁵S, 1⁴C или ³Н), флуоресцентно-меченный (например, FITC) или ферментативно-меченный полипептид ActRIIB и/или его связывающий белок, с использованием иммуноанализа или хроматографического определения.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает использование анализов поляризации флуоресценции и анализов передачи энергии флуоресцентного резонанса (FRET) при измерении, прямо или косвенно, степени взаимодействия между GDF/BMP лигандом и связывающимся с ним белком. Кроме того, другие способы детекции, например, основанные на оптических волноводах (см., например, публикацию РСТ WO 96/26432 и патент США №5677196), поверхностном плазмонном резонансе (SPR), датчиках поверхностного заряда и датчиках поверхностной силы, совместимы со многими вариантами осуществления настоящего изобретения.

Кроме того, настоящее раскрытие предусматривает использование анализа взаимодействия ловушки, также известного как "двухгибридный анализ", для идентификации средств, которые нарушают или потенцируют взаимодействие между GDF/BMP лигандом и его партнером по связыванию. См., например, патент США №5283317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; и Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). В конкретном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает использование обратных двухгибридных систем для идентификации соединений (например, малых молекул или пептидов), которые разобщают взаимодействия между GDF/BMP лигандом и связывающимся с ним белком [см., например, Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27: 919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17: 374-81; и патенты США №№5525490; 5955280; и 5965368],

В некоторых вариантах осуществления соединения по настоящему изобретению идентифицируют по их способности взаимодействовать с GDF/BMP лигандом. Взаимодействие между соединением и GDF/BMP лигандом может быть ковалентным или нековалентным. Например, такое взаимодействие можно идентифицировать на уровне белка с использованием биохимических методов in vitro, в том числе фотосшивки, связывания радиоактивно-меченного лиганда и аффинной хроматографии [см., например, Jakoby WB et al. (1974) Methods in Enzymology 46:1]. В некоторых случаях, можно осуществить скрининг соединений в основанном на механизме анализе, таком как анализ для детекции соединений, которые связываются с GDF/BMP лигандом. Это может включать твердофазное или жидкофазное связывание. Альтернативно, ген, кодирующий GDF/BMP лиганд, можно трансфицировать при помощи репортерной системы (например, β-галактозидазы, люциферазы или зеленого флуоресцентного белка) в клетку и скрининировать против библиотеки, предпочтительно путем высокопроизводительного скрининга, или с отдельными членами библиотеки. Можно использовать другие анализы связывания на основе механизма; например, анализы связывания, которые определяют изменения свободной энергии. Анализы связывания можно осуществить с мишенью, фиксированной на лунке, шарике или чипе или захваченной иммобилизованным антителом или разделенной капиллярным электрофорезом. Связанные соединения можно обнаружить обычно с использованием колориметрических конечных точек или флуоресценции или поверхностного плазмонного резонанса.

9. Терапевтические применения

Частью, настоящее изобретение относится к способам лечения легочной гипертензии (например, легочной артериальной гипертензи), включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP (например, антагониста одного или нескольких из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и одного или нескольких белков Smad). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы лечения одного или нескольких осложнений легочной гипертензии (например, пролиферации клеток гладких мышц и/или эндотелиальных клеток в легочной артерии, ангиогенеза в легочной артерии, одышки, боли в груди, легочного сосудистого ремоделирования, гипертрофии правого желудочка и фиброза легких), включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы профилактики одного или нескольких осложнений легочной гипертензии, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы уменьшения скорости прогрессирования легочной гипертензии, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы уменьшения скорости прогрессирования одного или нескольких осложнений легочной гипертензии, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы уменьшения тяжести легочной гипертензии, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы уменьшения тяжести одного или нескольких осложнений легочной гипертензии, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP Необязательно, способы, раскрытые в настоящей заявке, для лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии, в частности, лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких осложнений легочной гипертензии, могут дополнительно включать введение пациенту одной или нескольких поддерживающих терапий или дополнительных активны средств для лечения легочной гипертензии. Например, пациенту также можно вводить одну или несколько поддерживающих терапий или активные средства, выбранные из группы, состоящей из следующих: простациклин и его производные (например, эпопростенол, трепростинил и илопрост); агонисты простациклиновых рецепторов (например, селексипаг); агонисты эндотелиновых рецепторов (например, телин, амбрисентан, мацитентан и босентан); блокаторы кальциевых каналов (например, амлодипин, дилтиазем и нифедипин; антикоагулянты (например, варфарин); диуретики; кислородная терапия; предсердная септостомия; легочная тромбоэндартеректомия; ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (например, силденафил и тадалафил); активаторы растворимой гуанилатциклазы (например, цинацигват и риоцигват); ингибиторы ASK-1 (например, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-нафто[1,2,3-de]хинилин-2,7-дионы, NQDI-1; 2-тиоксо-тиазолидины, 5-бром-3-(4-оксо-2-тиоксо-тиазолидин-5-илиден)-1,3-дигидро-индол-2-он); антагонисты NF-κB (например, dh404, CDDO-эпоксид; 2,2-дифторпропионамид; С28 имидазол (CDDO-Im); 2-циано-3,12-диоксоолеан-1,9-диен-28овая кислота (CDDO); 3-ацетилолеаноловая кислота; 3-трифторацетилолеаноловая кислота; 28-метил-3-ацетилолеанан; 28-метил-3-трифторацетилолеанан; 28-метилоксиолеаноловая кислота; SZC014; SCZ015; SZC017; ПЭГилированные производные олеаноловой кислоты; 3-О-(бета-D-глюкопиранозил)олеаноловая кислота; 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловая кислота; 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→2)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловая кислота; 28-О-бета-D-глюкопиранозиловый эфир 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловой кислоты; 28-О-бета-D-глюкопиранозиловый эфир 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→2)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловой кислоты; 3-О-[а-L-рамнопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловая кислота; 28-О-бета-D-глюкопиранозиловый эфир 3-О-[альфа-L-рамнопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловой кислоты; 28-О-β-D-глюкопиранозил-олеаноловая кислота; 3-О-β-D-глюкопиранозил(1→3)-β-D- глюкопиранозидуроновая кислота (CS1); 3-О-β-D-глюкопиранозил(1→3)-β-D-глюкопиранозидуроновая кислота (CS2); метил 3,11-диоксоолеан-12-ен28-олат (DIOXOL); ZCVI₄-2; бензил 3-дегидрокси-1,2,5- оксадиазоло[3',4':2,3]олеанолат), легочная и/или сердечная трансплантация. В некоторых вариантах осуществления пациенту также можно вводить BMP9 полипептид. В некоторых вариантах осуществления BMP9 полипептид представляет собой зрелый BMP9 полипептид. В некоторых вариантах осуществления BMP9 полипептид включает полипептид продомена BMP9. В некоторых вариантах осуществления BMF9 полипептид вводят в виде фармацевтического препарата, который необязательно может включать полипептид продомена BMP9. В таких BMP9 фармацевтических препаратах, включающих полипептид продомена BMP9, полипептид BMP9 может быть нековалентно ассоциирован с полипептидом продомена BMP9. В некоторых вариантах осуществления BMP9 фармацевтические препараты по существу не включают, или не включают, полипептид продомена BMP9. Полипептиды BMP9 (зрелые или про-полипептиды), полипептиды продомена BMP9, включающие их фармацевтические композиции, а также способы получения таких полипептидов и фармацевтические композиции описаны, например, в WO 2013/152213, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. В контексте настоящей заявки терапевтическое средство, которое "предотвращает" расстройство или состояние, относится к соединению, которое, в статистическом образце, снижает частоту расстройства или состояния в обработанном образце по сравнению с необработанным контрольным образцом или задерживает начало или снижает тяжесть одного или нескольких симптомов расстройства или состояния по сравнению с необработанным контрольным образцом.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения интерстициального легочного заболевания (например, идиопатического легочного фиброза), включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества любого из антагонистов GDF/BMP, раскрытых в настоящей заявке (например, антагониста один или несколько из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и одного или нескольких белков Smad). В некоторых вариантах осуществления интерстициальное легочное заболевание представляет собой легочный фиброз. В некоторых вариантах осуществления интерстициальное легочное заболевание вызывается одним из следующих: силикоз, асбестоз, бериллиоз, гиперчувствительный пневмонит, употребление лекарств (например, антибиотики, химиотерапевтические средства, антиаритмические средства, статины), системный склероз, полимиозит, дерматомиозит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, инфекция (например, атипичная пневмония, пневмоцистная пневмония, туберкулез, хламидийный трахоматис и/или респираторно-синцитиальный вирус), лимфогенный карциноматоз, курение сигарет или расстройство развития. В некоторых вариантах осуществления интерстициальное легочное заболевание является идиопатическим (например, саркоидоз, идиопатический легочный фиброз, синдром Хаммана-Рича и/или антисинтетазный синдром). В конкретных вариантах осуществления интерстициальное легочное заболевание представляет собой идиопатический легочный фиброз. В некоторых вариантах осуществления лечение идиопатического легочного фиброза вводят в комбинации с дополнительным терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из пирфенидона, N-ацетилцистеина, преднизона, азатиоприна, нинтеданиба, их производных и их комбинаций.

Термин "лечение", как он используется в настоящей заявке, включает улучшение или устранение состояния, как только оно было установлено. В любом случае, профилактика или лечение могут быть понятны при поставке диагноза лечащим врачом или другим медицинским работником, а также предполагаемый результат введения терапевтического средства.

Как правило, лечение или профилактика заболевания или состояния, описанного в настоящей заявке, достигается путем введения антагониста GDF/BMP в эффективном количестве. Эффективное количество средства относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата. Терапевтически эффективное количество средства по настоящему изобретению может варьироваться в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела индивидуума и способность средства вызывать желательный ответ у индивидуума. Профилактически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата.

Термины "субъект", "индивидуум" или "пациент" взаимозаменяемы во всех разделах описания и обычно относятся к млекопитающим. Млекопитающие включают, но не ограничиваются этим, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и отличных от человека приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс).

Легочная гипертензия (ЛГ) ранее была классифицирована как первичная (идиопатическая) или вторичная. Недавно Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) классифицировала легочную гипертензию как подразделяющуюся на пять групп: Группа 1: легочная артериальная гипертензия (ЛАГ); Группа 2: легочная гипертензия с заболеванием левых отделов сердца; Группа 3: легочная гипертензия с заболеванием легких и/или гипоксемией; Группа 4: легочная гипертензия вследствие хронического тромботического и/или эмболического заболевания; и группа 5: различные состояния (например, саркоидоз, гистиоцитоз X, лимфангиоматоз и сдавливание легочных сосудов). См., например, Rubin (2004) Chest 126:7-10.

В некоторых аспектах, изобретение относится к способам лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии (например, лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких осложнений легочной гипертензии), включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP (например, антагониста одного или нескольких из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и одного или нескольких белков Smad). В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациентам с легочной гипертензией, которые имеют легочную артериальную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациентам с легочной гипертензией, которые имеют легочную гипертензию с заболеванием левых отделов сердца. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациентам с легочной гипертензией, которые имеют легочное заболевание и/или гипоксемию. В некоторых вариантах осуществления способ к пациентам с легочной гипертензией, которые имеют хроническое тромботическое и/или эмболическое заболевание. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациентам с легочной гипертензией, которые имеют саркоидоз, гистиоцитоз X или лимфангиоматоз и сдавление легочных сосудов.

Легочная артериальная гипертензия является серьезным, прогрессирующим и опасным для жизни заболеванием легочной сосудистой системы, характеризующимся глубоким сужением сосудов и аномальной пролиферацией клеток гладких мышц в стенках легочных артерий. Сильное сужение кровеносных сосудов в легких приводит к очень высокому давлению легочной артерии. Эти высокие давления мешают сердцу прокачивать кровь через легкие для насыщения кислородом. Пациенты с ЛАГ страдают от сильной одышки, поскольку сердце изо всех сил пытается качать против этих высоких давлений. У пациентов с ЛАГ обычно развивается значительное увеличение сопротивления легочных сосудов (PVR) и устойчивое повышение давления в легочной артерии (PAP), что в конечном итоге приводит к недостаточности правого желудочка и смерти. Пациенты с диагнозом ЛАГ имеют плохой прогноз и одинаково ухудшенное качество жизни, со средней продолжительностью жизни от 2 до 5 лет с момента постановки диагноза, при отсутствии лечения.

Различные факторы способствуют патогенезу легочной гипертензии, включая пролиферацию клеток легких, которая может способствовать ремоделированию сосудов (то есть гиперплазии). Например, ремоделирование легочных сосудов происходит главным образом за счет пролиферации эндотелиальных клеток артерий и клеток гладких мышц у пациентов с легочной гипертензией. Считается, что сверхэкспрессия различных цитокинов способствует легочной гипертензии. Кроме того, было обнаружено, что легочная гипертензия может возникать из-за гиперпролиферации клеток гладких мышц легочной артерии и эндотелиальных клеток легочной артерии. И кроме того, прогрессирующая ЛАГ может характеризоваться мускуляризацией легочных артериол, концентрическим утолщением интимы и закупоркой просвета сосудов пролиферирующими эндотелиальными клетками. Pietra et al., J. Am. Coll. Cardiol., 43:255-325 (2004).

В некоторых аспектах, изобретение относится к способам лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии (например, лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких осложнений легочной гипертензии), включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP (например, антагониста одного или нескольких из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и одного или нескольких белков Smad), где пациент имеет легочное артериальное давление в состоянии покоя (ЛАД) по меньшей мере 25 мм рт.ст. (например, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мм рт.ст.). В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациентам, имеющим ЛАД в покое по меньшей мере 25 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациентам, имеющим ЛАД в покое по меньшей мере 30 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациентам, имеющим ЛАД в покое по меньшей мере 35 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациентам, имеющим ЛАД в покое по меньшей мере 40 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациентам, имеющим ЛАД в покое по меньшей мере 45 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациентам, имеющим ЛАД в покое по меньшей мере 50 мм рт.ст.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам доведения одного или нескольких гемодинамических параметров у пациента с ЛГ до более нормального уровня (например, нормального по сравнению со здоровыми людьми того же возраста и пола), включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP (например, антагониста одного или нескольких из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и одного или нескольких белков Smad). В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению ЛАД. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению ЛАД у пациента по меньшей мере на 3 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению ЛАД у пациента по меньшей мере на 5 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению ЛАД у пациента по меньшей мере на 7 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению ЛАД у пациента по меньшей мере на 10 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению ЛАД у пациента по меньшей мере на 12 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению ЛАД у пациента по меньшей мере на 15 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению ЛАД у пациента по меньшей мере на 20 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению ЛАД у пациента по меньшей мере на 25 мм рт.ст. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению легочного сосудистого сопротивления (PVR). В некоторых вариантах осуществления способ относится к повышению легочного капиллярного давления заклинивания (PCWP). В некоторых вариантах осуществления способ относится к повышению конечного диастолического давления в левом желудочке (LVEDP).

В некоторых аспектах, изобретение относится к способам лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких осложнений легочной гипертензии, включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP (например, антагониста одного или нескольких из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и одного или нескольких белков Smad). В некоторых вариантах осуществления способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести клеточной пролиферации в легочной артерии у пациента с легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести пролифераци гладкомышечных и/или эндотелиальных клеток в легочной артерии у пациента с легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести ангиогенеза в легочной артерии у пациента с легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления способ относится к повышению физической активности пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести одышки у пациента с легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести боли в груди у пациента с легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести слабости у пациента с легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести фиброза легких у пациента с легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести фиброза у пациента с легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести легочного сосудистого ремоделирования у пациента с легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести гипертрофии правого желудочка у пациента с легочной гипертензией.

В некоторых аспектах, изобретение относится к способам повышения способности пациента, имеющего легочную гипертензию, переносить физические нагрузки, включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP (например, антагониста одного или нескольких из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и одного или нескольких белков Smad). Можно использовать любой подходящий показатель способности переносить физические нагрузки. Например, способность переносить физические нагрузки в тесте с 6-минутной ходьбой (6MWT), который измеряет расстояние, которое субъект может пройти за 6 минут, т.е. проходимое за 6 минут расстояние (6MWD), часто используют для оценки тяжести легочной гипертензии и прогрессирования заболевания. Индекс одышки Борга (BDI) представляет собой цифровую шкалу для оценки ощущаемой одышки (затруднения дыхания). Она измеряет степень одышки, например, после завершения 6MWT, где BDI оценка 0 означает отсутствие одышки, а оценка 10 означает макисмальную одышку. В некоторых вариантах осуществления способ относится к увеличению 6MWD по меньшей мере на 10 метров у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к увеличению 6MWD по меньшей мере на 20 метров у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к увеличению 6MWD по меньшей мере на 30 метров у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к увеличению 6MWD по меньшей мере на 40 метров у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к увеличению 6MWD по меньшей мере на 50 метров у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к увеличению 6MWD по меньшей мере на 60 метров у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к увеличению 6MWD по меньшей мере на 70 метров у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к увеличению 6MWD по меньшей мере на 80 метров у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к увеличению 6MWD по меньшей мере на 90 метров у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к увеличению 6MWD по меньшей мере на 100 метров у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 0,5 индексных пункта у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 1 индексный пункт у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 1,5 индексных пункта у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 2 индексных пункта у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 2,5 индексных пункта у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 3 индексных пункта у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 3,5 индексных пункта у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 4 индексных пункта у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 4,5 индексных пункта у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 5 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 5,5 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 6 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 6,5 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 7 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 7,5 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 8 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 8,5 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 9 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 9,5 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BDI по меньшей мере на 3 индексных пункта у пациента, имеющего легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления способ относится к снижению BD1 на 10 индексных пунктов у пациента, имеющего легочную гипертензию.

Легочная гипертензия на исходном уровне может быть легкой, умеренной или тяжелой, что измеряется, например, по функциональному классу Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), который является показателем тяжести заболевания у пациентов с легочной гипертензией. Функциональная классификация ВОЗ является адаптацией системы Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA) и обычно используется для качественной оценки переносимости физической активности, например, при мониторинге прогрессирования заболевания и ответа на лечение (Rubin (2004) Chest 126: 7-10). В системе ВОЗ признаны четыре функциональных класса: класс I: легочная гипертензия без результирующего ограничения физической активности; обычная физическая активность не вызывает чрезмерной одышки или усталости, боли в груди или обморока; Класс II: легочная гипертензия, приводящая к небольшому ограничению физической активности; пациент комфортно отдыхает; обычная физическая активность вызывает чрезмерную одышку или усталость, боль в груди или почти обморок; Класс III: легочная гипертензия, приводящая к заметному ограничению физической активности; пациент комфортно отдыхает; менее чем обычная деятельность вызывает чрезмерную одышку или усталость, боль в груди или близость к обмороку; Класс IV: легочная гипертензия, приводящая к неспособности выполнять какие-либо физические нагрузки без симптомов; у пациента проявляются признаки сердечной недостаточности; одышка и/или усталость может присутствовать даже в состоянии покоя; дискомфорт усиливается при любой физической нагрузке.

В некоторых аспектах, изобретение относится к способам лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии (например, лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких осложнений легочной гипертензии), включающим введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP (например, антагониста одного или нескольких из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и одного или нескольких белков Smad), где пациент имеет легочную гипертензию класса I, класса II, класса III или класса IV, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациенту, который имеет легочную гипертензию класса I, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациенту, который имеет легочную гипертензию класса II, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к профилактике или задержке прогрессирования легочной гипертензии у пациента от класса I до класса II, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к промотированию или повышению регрессии легочной гипертензии у пациента от класса II до класса I, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациенту, который имеет легочную гипертензию класса III, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к профилактики или задержке прогрессирования легочной гипертензии у пациента от класса II до класса III, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к промотированию или повышению регрессии легочной гипертензии у пациента от класса III до класса II, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к промотированию или повышению регрессии легочной гипертензии у пациента от класса III до класса I, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к пациенту, который имеет легочную гипертензию класса IV, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к профилактики или задержке прогрессирования легочной гипертензии у пациента от класса III до класса IV, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к промотированию или повышению регрессии легочной гипертензии у пациента от класса IV до класса III, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к промотированию или повышению регрессии легочной гипертензии у пациента от класса IV до класса II, согласно классификации ВОЗ. В некоторых вариантах осуществления способ относится к промотированию или повышению регрессии легочной гипертензии у пациента от класса IV до класса I, согласно классификации ВОЗ.

Не существует известного лечения легочной гипертензии; Современные методы лечения направлены на продление жизни пациента и повышение качества жизни пациента. Современные способы лечения легочной гипертензии включают введение сосудорасширяющих средств, таких как простациклин, эпопростенол и силденафил; антагонистов рецепторов эндотелина, таких как босентан; блокаторов кальциевых каналов, таких как амлодипин, димазем и нифедипин; антикоагулянтов, таких как варфарин; и диуретиков. Лечение легочной гипертензии также осуществляют с использованием кислородной терапии, предсердной септостомии, легочной тромбоэндартерэктомии и трансплантации легкого и/или сердца. Каждый из этих методов, однако, имеет один или несколько недостатков, которые могут включать недостаточную эффективность, серьезные побочные эффекты, низкое соблюдение пациентом режима лечения и высокую стоимость. В некоторых аспектах, способ относится к лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии (например, лечению, профилактике или уменьшению скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких осложнений легочной гипертензии) и включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста GDF/BMP (например, антагониста одного или нескольких из активина, GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP15, BMP10, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7 и одного или нескольких белков Smad) в комбинации (например, введение одновременно или в разное время, но, как правило, таким образом, чтобы достичь перекрывающихся фармакологических/физиологических эффектов) с одним или несколькими дополнительными активными средствами и/или поддерживающими терапиями для лечения легочной гипертензии (например, вазодилататоры, такие как простациклин, эпопростенол и силденафил; агонисты эндотелиновых рецепторов, такие как босентан; блокаторы кальциевых каналов, такие как амлодипин, дилтиазем и нифедипин; антикоагулянты, такие как варфарин; диуретики; кислородная терапия; предсердная септостомия; легочная тромбоэндартеректомия: и трансплантация легкого и/или сердца); BMP9 полипептидами; BMP10 полипептидами; бардоксолонметилом или его производным; олеаноловой кислотой или ее производным.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы оказания медицинской помощи пациенту, который уже принимал лечение или является кандидатом для лечения одним или несколькими антагонистами GDF/BMP по настоящему изобретению (например, ловушками для лигандов, такими как полипептиды ActRIIA, полипептиды ActRIIB и полипептиды-ловушки GDF) путем измерения одного или нескольких гематологических параметров у пациента. Гематологические параметры могут использоваться для оценки подходящей дозировки для пациента, который является кандидатом для лечения антагонистом по настоящему изобретению, для мониторинга гематологических параметров во время лечения, для оценки того, следует ли корректировать дозировку во время лечения одним или несколькими антагонистами по настоящему изобретению, и/или для оценки подходящей поддерживающей дозы одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению. Если один или несколько гематологических параметров находятся за пределами нормального уровня, введение одного или нескольких антагонистов GDF/BMP можно уменьшить, приостановить или прекратить.

Гематологические параметры, которые можно измерить в соответствии со способами, представленными в настоящей заявке, включают, например, уровни эритроцитов, кровяное давление, запасы железа и другие вещества, обнаруживаемые в жидкостях организма, которые коррелируют с повышенными уровнями эритроцитов, с использованием известных в данной области методов. Такие параметры можно определить с использованием образца крови пациента. Повышение уровня эритроцитов, гемоглобина и/или уровня гематокрита может вызвать повышение артериального давления.

В одном варианте осуществления, если один или несколько гематологических параметров находятся за пределами нормы или выше нормы у пациента, который является кандидатом на лечение одним или несколькими антагонистами GDF/BMP, тогда начало введения одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению может быть отложено до тех пор, пока гематологические параметры не вернутся к нормальному или приемлемому уровню либо естественным образом, либо посредством терапевтического вмешательства. Например, если пациент-кандидат является гипертоником или находится в предгипертоническом состоянии, тогда пациента можно лечить средством, снижающим кровяное давление, чтобы снизить у пациента кровяное давление. Можно использовать любое средство, снижающее артериальное давление, подходящее для индивидуального состояния пациента, включая, например, диуретики, адренергические ингибиторы (включая альфа-блокаторы и бета-блокаторы), вазодилататоры, блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) или блокаторы ангиотензиновых II рецепторов. В качестве альтернативы, артериальное давление можно лечить, используя режим диеты и физических упражнений. Подобным образом, если у пациента-кандидата запасы железа ниже нормы или на нижнем пределе нормы, пациента можно лечить с использованием соответствующего режима диеты и/или приема препаратов железа до тех пор, пока запасы железа у пациента не вернутся к нормальному или приемлемому уровню. Для пациентов с более высокими, чем обычно, уровнями эритроцитов и/или уровнями гемоглобина, введение одного или нескольких антагонистов по изобретению может быть отложено до тех пор, пока уровни не вернутся к нормальному или приемлемому уровню.

В некоторых вариантах осуществления, если один или несколько гематологических параметров находятся за пределами нормы или находятся на верхнем пределе нормы у пациента, который является кандидатом на лечение одним или несколькими антагонистами GDF/BMP, тогда начало введения можно не откладывать. Однако количество доз или частоту введения одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению можно установлить так, чтобы уменьшить риск неприемлемого увеличения гематологических параметров, возникающего при введении одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению. Альтернативно, для пациента может быть разработан терапевтический режим, который объединяет один или несколько антагонистов GDF/BMP с терапевтическим средством, которое регулирует нежелательный уровень гематологического параметра. Например, если у пациента повышенное кровяное давление, тогда может быть разработан терапевтический режим, включающий введение одного или нескольких антагонистов GDF/BMP и средства, снижающего кровяное давление. Для пациента, имеющего более низкие, чем желаемые, запасы железа, может быть разработан терапевтический режим, включающий один или несколько антагонистов GDF/BMP по изобретению и препарат железа.

В одном варианте осуществления, базовый параметр(параметры) для одного или нескольких гематологических параметров могут быть установлен для пациента, который является кандидатом на лечение одним или несколькими антагонистами GDF/BMP по настоящему изобретению, с соответствующей схемой введения, установленной для этого пациента на основе базового значения(значений). В качестве альтернативы, установленные базовые параметры, основанные на истории болезни пациента, могут использоваться для информирования пациента о соответствующем режиме введения антагониста. Например, если у здорового пациента установленное базовое артериальное давление, которое превышает установленный нормальный диапазон, может не быть необходимости приводить артериальное давление пациента в диапазон, который считается нормальным для общей популяции, перед лечением одним или более антагонистами по настоящему изобретению. Базовые значения у пациента для одного или нескольких гематологических параметров перед лечением одним или несколькими антагонистами GDF/BMP по изобретению также можно использовать в качестве соответствующих сравнительных значений для мониторинга любых изменений гематологических параметров во время лечения одним или несколькими антагонистами по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления один или несколько гематологических параметров измеряют у пациентов, которых лечат одним или несколькими антагонистами GDF/BMP. Гематологические параметры можно использовать для мониторинга пациента во время лечения и обеспечения возможности корректировки или прекращения введения одного или нескольких антагонистов по изобретению или дополнительного введения другого терапевтического средства. Например, если введение одного или нескольких антагонистов GDF/BMP приводит к повышению артериального давления, уровня эритроцитов или уровня гемоглобина или уменьшению запасов железа, тогда можно уменьшить дозу или частоту введения одного или нескольких антагонистов по изобретению, чтобы уменьшить эффекты одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению на один или несколько гематологических параметров. Если введение одного или нескольких антагонистов GDF/BMP приводит к изменению одного или нескольких гематологических параметров, которые являются неблагоприятными для пациента, то введение одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению может быть прекращено либо временно, до возвращения гематологического параметра (параметров) к приемлемому уровню, либо совсем. Подобным образом, если один или несколько гематологических параметров не возвращаются к приемлемому уровню после уменьшения дозы или частоты введения одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению, тогда введение может быть прекращено. В качестве альтернативы уменьшению или прекращению введения одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению, или в дополнение к этому, пациенту можно вводить дополнительное терапевтическое средство, которое воздействует на нежелательный уровень гематологического параметра (параметров), такое как, например, средство для снижения кровяного давления или препарат железа. Например, если пациент, которого лечат одним или несколькими антагонистами GDF/BMP, имеет повышенное кровяное давление, тогда введение одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению может продолжаться на том же уровне, и к схеме лечения добавляют средство, снижающее кровяное давление, введение одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению можно уменьшить (например, количество и/или частоту введения), и к схеме лечения добавляют средство, снижающее кровяное давление, или введение одного или нескольких антагонистов по настоящему изобретению может быть прекращено, и пациента можно лечить средством, снижающим кровяное давление.

10. Фармацевтические композиции

Терапевтические средства, описанные в настоящей заявке (например, антагонисты GDF/BMP), можно сформулировать в фармацевтические композиции. Фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением можно формулировать обычным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей или эксципиентов. Такие композиции, как правило, по существу не содержат пирогенов, что соответствует большинству нормативных требований.

В некоторых вариантах осуществления терапевтические способы по настоящему изобретению включают введение композиции системно или местно в виде имплантата или устройства. При введении терапевтическая композиция для применения в настоящем изобретении находится в по существу апирогенной или апирогенной, физиологически приемлемой форме. Терапевтически полезные средства, отличные от антагонистов GDF/BMP, которые также могут быть необязательно включены в композицию, как описано выше, можно вводить одновременно или последовательно с рассматриваемыми соединениями в способах, раскрытых в настоящей заявке.

Как правило, белковые терапевтические средства, раскрытые в настоящей заявке, будут вводить парентерально, и особенно внутривенно или подкожно. Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, могут включать один или несколько антагонистов GDF/BMP в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями или стерильными порошками, которые можно преобразовать в стерильные инъекционные растворы или дисперсии непосредственно перед применением, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты, растворенные вещества, которые делают композицию изотонической с кровью предполагаемого реципиента, или суспендирующие агенты или загустители. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, путем использования материалов для покрытия, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем использования поверхностно-активных веществ.

Композиции и лекарственные формы могут, если желательно, быть представлены в упаковке или дозирующем устройстве, которое может содержать одну или несколько стандартных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, включать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство могут содержать приложенные к ним инструкции по введению.

Кроме того, композиция может быть инкапсулирована, или ее можно вводить в форме для доставки на определенный участок ткани. В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению могут включать матрицу, способную доставлять одно или несколько терапевтических соединений (например, антагонисты GDF/BMP) к определенному участку ткани, обеспечивая структуру для развивающейся ткани и оптимально способную к повторному абсорбированию в организм. Например, матрица может обеспечивать медленное высвобождение антагониста GDF/BMP. Такие матрицы могут быть образованы из материалов, используемых в настоящее время для других имплантируемых медицинских применений.

Выбор материала матрицы основан на биосовместимости, биоразлагаемости, механических свойствах, внешнем виде и контактных свойствах. Конкретное применение рассматриваемых композиций будет определять соответствующую лекарственную форму. Потенциальные матрицы для композиций могут быть биоразлагаемыми и химически определенными, такими как сульфат кальция, трикальцийфосфат, гидроксиапатит, полимолочная кислота и полиангидриды. Другие потенциальные материалы являются биоразлагаемыми и биологически четко определенными, такие как костный или кожный коллаген. Другие матрицы состоят из чистых белков или компонентов внеклеточного матрикса. Другие потенциальные матрицы не являются биоразлагаемыми и химически определенными, например, спеченный гидроксиапатит, биостекло, алюминаты или другая керамика. Матрицы могут состоять из комбинаций любых из вышеуказанных типов материалов, таких как полимолочная кислота и гидроксиапатит или коллаген и трикальцийфосфат. Биокерамика может изменяться, что касается композиции, например, как в кальций-алюминий-фосфате, и обработки для изменения размера пор, размера частиц, формы частиц и способности к биоразложению.

В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению могут предусматривать пероральное введение, например, в форме капсул, саше, пилюль, таблеток, пастилок (с использованием ароматизированной основы, обычно сахарозы и аравийской укамеди или трагаканта), порошков, гранул, или в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости, или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле, или в виде эликсира или сиропа, или в виде пастилок (с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь), и/или в виде жидкостей для полоскания рта и т.п., каждая из которых содержит предварительно определенное количество средства в качестве активного ингредиента. Средство также можно вводить в виде болюса, электуария или пасты.

В твердых лекарственных формах для перорального введения (капсулы, таблетки, пилюли, драже, порошки, гранулы и т.п.) одно или несколько терапевтических соединений по настоящему изобретению могут быть смешаны с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или дикальцийфосфат и/или любой из следующих: (1) наполнители или создающие объем вещества, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) связующие, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или аравийская камедь; (3) увлажнители, такие как глицерин; (4) разрыхлители, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (5) замедляющие растворение вещества, такие как парафин; (6) ускорители абсорбции, такие как четвертичные аммониевые соединения; (7) смачивающие вещества, такие как, например, цетиловый спирт и глицерин моностеарат; (8) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина; (9) смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси, и (10) красители. В случае капсул, таблеток и пилюль фармацевтические композиции могут также содержать буферные вещества. Твердые композиции подобного типа также можно использовать в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах с использованием таких эксципиентов, как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активному ингредиенту жидкие лекарственные фермы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, масло семян хлопчатника, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана и их смеси. Помимо инертных разбавителей пероральные композиции могут также включать вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества, эмульгаторы и суспендирующие вещества, подсластители, отдушки, красители, ароматизаторы и консерванты.

Суспензии, в дополнение к активным соединениям, могут содержать суспендирующие вещества, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбита, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант и их смеси.

Композиции по изобретению могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгаторы и диспергирующие вещества. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечить путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательно включить в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированную абсорбцию инъецируемой фармацевтической формы можно получить путем включения веществ, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Должно быть понятно, что режим дозирования будет определяться лечащим врачом с учетом различных факторов, которые модифицируют действие рассматриваемых соединений по изобретению (например, антагонистов GDF/BMP). Различные факторы включают, но не ограничиваются этим, возраст, пол и режим питания пациента, тяжесть заболевания, время введения и другие клинические факторы. Необязательно, доза может варьироваться в зависимости от типа матрицы, используемой при восстановлении, и типов соединений в композиции. Добавление других известных факторов роста к конечной композиции также может влиять на дозу. Прогресс можно отслеживать путем периодической оценки роста и/или восстановления кости, например, с использованием рентгеновского анализа (включая DEXA), гистоморфометрических определений и тетрациклиновой метки.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к генной терапии для продукции антагонистов GDF/BMP in vivo. Такая терапия может достигать своего терапевтического эффекта путем введения полинуклеотидных последовательностей антагониста GDF/BMP в клетки или ткани, имеющие нарушения, перечисленные выше. Доставка полинуклеотидных последовательностей антагониста GDF/BMP может осуществляться с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, такого как химерный вирус или коллоидная дисперсионная система. Для терапевтической доставки полинуклеотидных последовательностей антагонистов GDF/BMP предпочтительным является использование липосом для направленной доставки.

Различные вирусные векторы, которые можно использовать для генной терапии, как описано в настоящей заявке, включают аденовирус, вирус герпеса, вирус коровьей оспы или, предпочтительно, РНК вирус, такой как ретровирус. Предпочтительно ретровирусный вектор представляет собой производное мышиного или птичьего ретровируса. Примеры ретровирусных векторов, в которые может быть вставлен один чужеродный ген, включают, но не ограничиваются этим: вирус лейкоза мышей Молони (MoMuLV), вирус саркомы мышей Харви (HaMuSV), вирус опухоли молочной железы мышей (MuMTV) и вирус саркомы Рауса (RSV). Ряд дополнительных ретровирусных векторов может включать несколько генов. Все эти векторы могут переносить или включать ген для селектируемого маркера, чтобы можно было идентифицировать и генерировать трансдуцированные клетки. Ретровирусные векторы можно сделать мишень-специфическими путем присоединения, например, сахара, гриколипида или белка. Предпочтительная направленная доставка достигается при помощи антител. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что определенные полинуклеотидные последовательности можно вставить в ретровирусный геном или присоединить к вирусной оболочке, чтобы обеспечить мишень-специфическую доставку ретровирусного вектора, содержащего антагонист GDF/BMP. В предпочтительном варианте осуществления вектор нацеливают на кость или хрящ.

Альтернативно, клетки культуры ткани могут быть непосредственно трансфицированы плазмидами, кодирующими структурные гены ретровирусов gag, pol и env, путем обычной трансфекции фосфатом кальция. Эти клетки затем трансфицируют векторной плазмидой, содержащей представляющие интерес гены. Полученные клетки высвобождают ретровирусный вектор в культуральную среду.

Другой системой направленной доставки полинуклеотидов-антагонистов GDF/BMP является коллоидная дисперсионная система. Коллоидные дисперсионные системы включают макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, шарики и системы на основе липидов, включая эмульсии масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой по настоящему изобретению является липосома. Липосомы представляют собой искусственные мембранные везикулы, которые полезны в качестве средств доставки in vitro и in vivo. РНК, ДНК и интактные вирионы могут быть инкапсулированы в водном пространстве и доставляться к клеткам в биологически активной форме (см., например, Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Способы эффективного переноса генов с использованием липосомного носителя известны в данной области, см., например, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. Композиция липосомы обычно представляет собой комбинацию фосфолипидов, обычно в комбинации со стероидами, особенно холестерином. Другие фосфолипиды или другие липиды также можно использовать. Физические характеристики липосом зависят от pH, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов.

Примеры липидов, полезных для получения липосом, включают фосфатидильные соединения, такие как фосфатидилглицерин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфинголипиды, цереброзиды и ганглиозиды. Иллюстративные фосфолипиды включают яичный фосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин и дистеароилфосфатидилхолин. Направленная доставка при помощи липосом также возможна на основе, например, органоспецифичности, клеточной специфичности и органелл-специфичности, и известна в данной области.

Настоящее раскрытие обеспечивает композиции, которые могут варьироваться, чтобы включать кислоты и основания для регулирования pH; и буферные агенты для поддержания рН в узком диапазоне.

ПРИМЕРЫ

Изобретение, которое было описано в общем виде, будет более понятно при рассмотрении следующих примеров, которые включены исключительно в целях иллюстрации некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения изобретения.

Пример 1: Слитые белки ActRIIa-Fc

Был сконструирован растворимый слитый белок ActRIIA, который содержит внеклеточный домен человеческого ActRIIa, слитый с человеческим или мышиным Fc доменом, с минимальным линкером между ними. Конструкции указаны как ActRIIA-hFc и ActRIIA-mFc, соответственно.

ActRIIA-hFc показан ниже как очищенный из CHO клеточных линий (SEQ ID NO: 32)

ActRIIA-hFc и ActRIIA-mFc белки были экспрессированы в CHO клеточных линиях. Рассматривали три разные лидерные последовательности:

(i) Меллитин из яда медоносной пчелы (HBML):

(ii) Тканевый активатор плазминогена (TPA):

(iii) Нативная:

Выбранная форма использует TPA лидерную последовательность и имеет следующую непроцессированную аминокислотную последовательность:

Этот полипептид кодируется следующей нуклеиновокислотной последовательностью:

Как ActRIIA-hFc, так и ActRHA-mFc замечательно поддаются рекомбинантной экспрессии. Как показано на Фиг. 5, белок был очищен в виде единственного четко определенного пика белка. N-концевое секвенирование выявило одну последовательность -ILGRSETQE (SEQ ID NO: 38). Очистку можно осуществить с использованием ряда стадий колоночной хроматографии, включая, например, три или более из следующих, в любом порядке: хроматография с белком А, хроматографии на Q-сефарозе, хроматографии на фенилсефарозе, эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография. Очистка может быть завершена фильтрацией вирусов и буферным обменом. Белок ActRIIA-hFc очищали до чистоты >98%, как определено методом эксклюзионной хроматографии, и >95%, как определено методом SDS PAGE.

ActRIIA-hFc и ActRHA-mFc показали высокое сродство к лигандам. GDF11 или активин А иммобилизировали на чипе Biacore™ CM5 с использованием стандартной процедуры связывания амина. Белки ActRIIA-hFc и ActRIIA-mFc загружали в систему и измеряли связывание. ActRIIA-hFc, связывался с активином с константой диссоциации (K_D) 5×10^-12 и связывался с GDFll с K_D 9,96×10^-9. См. Фиг. 6. Используя аналогичный анализ связывания, ActRIIA-hFc был определен как имеющий от высокого до умеренного сродства к другим лигандам суперсемейства TGF-β, включая, например, активин B, GDF8, BMP6 и BMP10. ActRIIA-mFc вел себя аналогично.

ActRIIA-hFc был очень стабильным в фармакокинетических исследованиях. Крысам вводили 1 мг/кг, 3 мг/кг или 10 мг/кг белка ActRIIA-hFc, и уровни белка в плазме измеряли через 24, 48, 72, 144 и 168 часов. В отдельном исследовании крысам вводили дозу 1 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг. У крыс ActRIIA-hFc имел период полужизни в сыворотке 11-14 дней, и уровни в кровотоке лекарственного средства были достаточно высокими через две недели (11 мкг/мл, 110 мкг/мл или 304 мкг/мл для начальных введений 1 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг, соответственно). У обезьян cynomolgus период полужизни в плазме был значительно выше чем 14 дней, а уровень в кровотоке лекарственного средства составлял 25 мкг/мл, 304 мкг/мл или 1440 мкг/мл для начального введения 1 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг соответственно.

Пример 2: Характеризация белка ActRIIA-hFc

Слитый белок ActRIIA-hFc экспрессировали в стабильно трансфицированных клетках CHO-DUKX B11 из вектора pAUM (SV40ori/энхансер, промотор CMV) с использованием лидерной последовательности тканевого плазминогена SEQ ID NO: 34. Белок, очищенный, как описано выше в примере 1, имел последовательность SEQ ID NO: 32. Fc часть представляет собой последовательность Fc человеческого IgG1, как показано в SEQ ID NO: 32. Анализ белка показывает, что гибридный белок ActRIIA-hFc образуется в виде гомодимера с дисульфидной связью.

Материал, экспрессируемый клетками CHO, имеет более высокое сродство к лиганду активина B, чем о котором сообщалось для слитого белка ActRIIa-hFc, экспрессируемого в клетках 293 человека [см. Del Re et al. (2004) J Biol Chem. 279 (51):53126-53135]. Кроме того, использование ТРА лидерной последовательности обеспечивало продукцию, чем другие лидерные последовательности, и, в отличие от ActRIIA-Fc, экспрессируемого с нативным лидером, обеспечивало очень чистую N-концевую последовательность. Использование природной лидерной последовательности приводило к двум основным видам ActRIIA-Fc, каждый из которых имел свою N-концевую последовательность.

Пример 3: Альтернативные белки ActRIIA-Fc

Различные варианты ActRIIA, которые можно использовать в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, описаны в международной патентной заявке, опубликованной под номером WO 2006/012627 (см. например, стр. 55-58), включенной в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. Альтернативная конструкция может иметь делецию С-концевого хвоста (конечные 15 аминокислот внеклеточного домена ActRIIA. Последовательность для такой конструкции представлена ниже (Fc часть подчеркнута) (SEQ ID NO: 39):

Пример 4: Образование слитых белков ActRIIB-Fc

Авторы настоящего изобретения сконструировали растворимый ActRIIB слитый белок, который содержит внеклеточный домен человеческого ActRIIB, слитый с человеческим или мышиным Fc доменом, с минимальным линкером между ними. Конструкции указаны как ActRIIB-hFc и ActRIIB-mFc, соответственно.

ActRIIB-hFc показан ниже как очищенный из CHO клеточных линий (SEQ ID NO: 40):

Белки ActRIIB-hFc и ActRIIB-mFc были экспрессированы в CHO клеточных линиях. Рассматривали три разные лидерные последовательности: (i) Меллитин из яда медоносной пчелы (HBML), (ii) Тканевый активатор плазминогена (TPA) и (iii) Нативная:

Выбранная форма использует TPA лидер и имеет следующую непроцессированную аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 42):

Этот полипептид кодируется следующей нуклеиновокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 43):

N-концевое секвенирование продуцированного CHO клетками материала выявило основную последовательность -GRGEAE (SEQ ID NO: 44). Примечательно, что другие конструкции, о которых сообщалось в литературе, начинаются с -SGR.. последовательности.

Очистку можно осуществить с использованием ряда стадий колоночной хроматографии, включая, например, три или более из следующих, в любом порядке: хроматография с белком А, хроматографии на Q-сефарозе, хроматографии на фенилсефарозе, эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография. Очистка может быть завершена фильтрацией вирусов и буферным обменом.

ActRIIB-Fc слитые белки также экспрессировали в HEK293 клетках и COS клетках. Хотя материал из всех клеточных линий и приемлемые условия культивирования обеспечивали белок с активностью наращивания мышечной массы in vivo, наблюдали вариабельность активности, возможно, связанную с выбором клеточной линии и/или условиями культивирования.

Заявители создали серию мутаций во внеклеточном домене ActRIIB и продуцировали эти мутантные белки в виде растворимых слитых белков между внеклеточным ActRIIB и Fc доменом. Исходный слитый белок ActRIIB-Fc имеет последовательность SEQ ID NO: 40.

Различные мутации, включая N- и C-концевые усечения, были введены в исходный белок ActRIIB-Fc. Исходя из представленных в настоящей заявке данных, ожидается, что в этих конструкциях, если они экспрессируются при помощи TPA лидера, будет отсутствовать N-концевой серин. Мутации были созданы во внеклеточном домене ActRIIB при помощи ПЦР мутагенеза. После ПЦР фрагменты очищали через колонку Qiagen, расщепляли при помощи Sfol и Agel и очищали из геля. Эти фрагменты лигировали в вектор экспрессии pAID4 (см. WO 2006/012627) так, чтобы при лигировании он создавал гибридную химеру с человеческим IgG1. После трансформации в E.coli DH5 альфа собирали колонии и выделяли ДНК. Для мышиных конструкций (mFc) человеческий IgG1 заменяли мышиным IgG2a. Последовательности всех мутантов были выверены. Все мутанты продуцировали в клетках HEK293T путем транзиентной трансфекции. Вкратце, в центрифуге объемом 500 мл клетки HEK293T помещали при 6×10⁵ клеток/мл в среду Freestyle (Invitrogen) в объеме 250 мл и выращивали в течение ночи. На следующий день эти клетки обрабатывали комплексом ДНК:PEI (1:1) при конечной концентрации ДНК 0,5 мкг/мл. Через 4 часа добавляли 250 мл среды и клетки выращивали в течение 7 дней. Кондиционированную среду собирали путем замедления вращения клеток и концентрировали.

Мутанты очищали с использованием различных методов, включая, например, колонку с белком А, и элюировали при помощи глицинового буфера с низким рН (3,0). После нейтрализации их диализовали против PBS.

Мутанты также продуцировали в клетках СНО по аналогичной методике. Мутанты испытывали в анализах связывания и/или биоанализах, описанных в WO 2008/097541 и WO 2006/012627, включенных в настоящую заявку посредством ссылки. В некоторых случаях анализы осуществляли с кондиционированной средой, а не с очищенными белками. Дополнительные варианты ActRIIB описаны в патенте США №7842663.

Заявитель создал слитый белок ActRIIB(25-131)-hFc, который включает внеклеточный домен человеческого ActRIIB с N-концевыми и С-концевыми усечениями (остатки 25-131 нативного белка SEQ ID NO: 1), слитый по N-концу с TPA лидерной последовательностью, заменяющей натривный ActRIIB лидер, и по C-концу с человеческим Fc доменом через минимальный линкер (три глициновых остатка) (Фиг. 7). Нуклеотидная последовательность, кодирующая этот слитый белок, показана на Фиг. 8. Заявители модифицировали кодоны и обнаружили вариантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ActRIIB(25-131)-hFc, что обеспечило существенное улучшение уровней экспрессии исходных трансформантов (Фиг. 9).

Зрелый белок имеет следующую аминокислотную последовательность (N-конец подтвержден N-концевым секвенированием (SEQ ID NO: 45):

Экспрессированную молекулу очищали с использованием ряда стадий колоночной хроматографии, включая, например, три или более из следующих, в любом порядке: хроматография с использованием белка А, хроматография с использованием Q-сефарозы, хроматография с использованием фенилсефарозы, эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография. Очистку можно завершить фильтрацией вирусов и буферным обменом.

Сродство нескольких лигандов к ActRIIB(25-131)-hFc и его полноразмерному аналогу ActRIIB(20-134)-hFc оценивали in vitro с использованием устройства Biacore™, и результаты приведены в таблице ниже. Значения Kd были получены с помощью установившейся аффинной аппроксимации благодаря очень быстрой ассоциации и диссоциации комплекса, что препятствовало точному определению k_on и k_off. ActRIIB(25-131)-hFc связывался с, например, активином A, активином B и GDF11 с высокой аффинностью.

Сродство форм ActRIIB-hFc к лигандам:

Слитая конструкция Активин А
(е-11) Активин В
(е-11) GDF11
(е-11) ActRIIB(20-134)-hFc 1,6 1,2 3,6 ActRIIB(25-131)-hFc 1,8 1,2 3,1

Пример 5: Создание ловушки GDF

Ловушку GDF конструировали следующим образом. Полипептид, содержащий модифицированный внеклеточный домен ActRIIB (аминокислоты 20-134 SEQ ID NO: 1 с L79D заменой) со значительно пониженным связыванием активина A относительно GDF11 и/или миостатина (как следствие замены лейцина на аспартат в положении 79 в SEQ ID NO: 1) сливали с человеческим или мышиным Fc доменом с минимальным линкером между ними. Конструкции обозначаются как ActRIIB(L79D 20-134)-hFc и ActRIIB (L79D 20-134)-mFc, соответственно. Альтернативные формы с глутаматом, а не с аспартатом в положении 79 получают аналогичным образом (L79E). Альтернативные формы с аланином, а не с валином в положении 226 в соответствии с SEQ ID NO: 64, представленной ниже, также были получены и были эквивалентными в испытаниях во всех отношениях. Аспартат в положении 79 (относительно SEQ ID NO: 1) указан ниже двойным подчеркиванием. Валин в положении 226 относительно SEQ ID NO: 64 также указан ниже двойным подчеркиванием.

ActRIIB(L79D 20-134)-hFc ловушки GDF показан ниже как очищенный из СНО клеточных линий (SEQ ID NO: 46).

Происходящая из ActRIIB часть ловушки GDF имеет аминокислотную последовательность, показанную ниже (SEQ ID NO: 47), и эту часть можно использовать в виде мономера или в виде не слитого с Fc белка в виде мономера, димера или комплекса высшего порядка.

Белок ловушки GDF экспрессировали в СНО клеточных линиях.

Рассматривали три разные лидерные последовательности: (i) Меллитина яда медоносной пчелы (HBML), (ii) Тканевого активатора плазминогена (TPA) и (iii) Нативную.

Выбранная форма использует ТРА лидер и имеет следующую непроцессированную аминокислотную последовательность:

Этот полипептид кодируется следующей нуклеиновокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 49):

Очистка достигается с использованием нескольких стадий колоночной хроматографии, включая, например, три или более из следующих, в любом порядке: хроматография с использованием белка А, хроматография с использованием Q-сефарозы, хроматография с использованием фенилсефарозы, эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография. Очистку можно завершить фильтрацией вирусов и буферным обменом. В примере схемы очистки среду для культивирования клеток пропускают через колонку с белком А, промывают в 150 мМ Трис/NaCl (рН 8,0), затем промывают в 50 мМ Трис/NaCl (рН 8,0) и элюируют 0,1 М глицином, рН 3,0. Элюат с низким pH поддерживают при комнатной температуре в течение 30 минут в качестве стадии очистки от вирусов. Затем элюат нейтрализуют и пропускают через ионообменную колонку с Q-сефарозой и промывают в 50 мМ Tris pH 8,0, 50 мМ NaCl и элюируют в 50 мМ Tris pH 8,0, с концентрацией NaCl от 150 мМ до 300 мМ. Затем элюат подвергают обмену в 50 мМ Трис рН 8,0, 1,1 М сульфата аммония и пропускают через колонку с фенилсефарозой, промывают и элюируют в 50 мМ Трис рН 8,0 с сульфатом аммония между 150 и 300 мМ. Элюат диализуют и фильтруют для использования.

Дополнительные ловушки GDF (слитые белки ActRIIB-Fc, модифицированные таким образом, чтобы уменьшить отношение связывания активина A относительно связывания миостатина или GDF11) описаны в WO 2008/097541 и WO 2006/012627, включенных в настоящую заявку посредством ссылки.

Пример 6: Биоанализ для определения GDF11- и активин-опосредованной передачи сигналов

Анализ репортерного гена A-204 использовали для оценки эффектов белков ActRIIB-Fc и ловушек GDF на передачу сигналов GDF-11 и активином А. Клеточная линия: рабдомиосаркома человека (происходящая из мышц). Репортерный вектор: pGL3(CAGA)12 (описанный в Dennler et al, 1998, EMBO 17:3091-3100). Мотив CAGA12 присутствует в TGF-бета респонсивных генах (например, ген PAI-1), поэтому этот вектор широко используется для факторов, передающих сигналы через SMAD2 и 3.

День 1: A-204 клетки помещают в 48-луночный планшет.

День 2: A-204 клетки трансфицируют 10 мкг pGL3(CAGA)12 или pGL3(CAGA)12(10 мкг)+pRLCMV (1 мкг) и Fugene.

День 3: Добавляют факторы (разбавленные в среде+0,1% BSA). Необходимо осуществить предварительную инкубацию ингибиторов с факторами в течение 1 часа перед добавлением в клетки. Через шесть часов клетки промывают PBS и лизируют.

Затем осуществляют люцифразный анализ. В отсутствие каких-либо ингибиторов активин А показал 10-кратную стимуляцию экспрессии репортерного гена и ED50 ~2 нг/мл. GDF-11: 16-кратная стимуляция, ED50: ~1,5 нг/мл.

ActRIIB(20-134) является сильным ингибитором, например, активности активина A, GDF-8 и GDF-11 в этом анализе. Как описано ниже, варианты ActRIIB также испытывали в этом анализе.

Пример 7: Клеточный анализ активности ActRIIB-Fc вариантов

Активность белков ActRIIB-Fc и ловушек GDF испытывали в клеточном анализе, как описано выше. Результаты приведены в таблице ниже. Некоторые варианты испытывали в различных конструкциях с усечениями по C-концу. Как обсуждалось выше, усечения на пять или пятнадцать аминокислот вызывало снижение активности. Ловушки GDF (варианты L79D и L79E) продемонстрировали существенную потерю ингибирования активина A при сохранении почти ингибирования GDF11 дикого типа.

Связывание растворимого ActRIIB-Fc с GDF11 и активином A:

Варианты ActRIIB-Fc Часть ActRIIB (соответствует аминокислотам SEQ ID NO: 1) Активность ингибирования GDF11 Активность ингибирования активина R64 20-134 +++
(прибл. 10^-8 М K_I) +++
(прибл. 10^-8 М K_I) A64 20-134 +++
(прибл. 10^-6 М K_I) +++
(прибл. 10^-6 М K_I) R64 20-129 +++ +++ R64 K74A 20-134 ++++ ++++ R64 A24N 20-134 +++ +++ R64 A24N 20-119 ++ ++ R64 A24N K74A 20-119 + + R64 L79P 20-134 + + R64 L79P K74A 20-134 + + R64 L79D 20-134 +++ + R64 L79E 20-134 +++ + R64K 20-134 +++ +++ R64K 20-129 +++ +++ R64 P129S P131A 20-134 +++ +++ R64N 20-134 + + + Низкая активность (прибл. 1×10^-6 K_I)
++ Умеренная активность (прибл. 1×10^-7 K_I)
+++ Хорошая (дикий тип) активность (прибл. 1×10^-8 K_I)
++++ Больше чем активность дикого типа

A24N вариант имеет активность в клеточном анализе (выше), которая эквивалентна молекуле дикого типа. A24N вариант и любой из других вариантов, испытанных выше, можно объединять с молекулами-ловушками GDF, например, L79D и L79E варианты.

Пример 8: Связывание GDF11 и активина A

Связывание некоторых белков ActRIIB-Fc и ловушек GDF с лигандами испытывали в анализе Biacore™.

ActRIIB-Fc варианты или белок дикого типа захватывали на системе с использованием анти-hFc антитела. Инжектировали лиганды и давали им растечься на захваченных рецепторных белках. Результаты представлены в таблицах ниже.

Лиганд-связывающая специфичность IIB вариантов.

GDF11 Белок K_on (1/Mc) K_off(1/с) KD (M) ActRIIB(20-134)-hFc 1,34е-6 1,13е-4 8,42е-11 ActRIIB(A24N 20-134)-hFc 1,21е-6 6,35е-5 5,19е-11 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 6,7е-5 4,39е-4 6,55е-10 ActRIIB(L79E 20-134)-hFc 3,8е-5 2,74е-4 7,16е-10 ActRIIB(R64K 20-134)-hFc 6,77е-5 2,41е-5 3,5е-11 GDF8 ActRIIB(20-134)-hFc 3,69е-5 3,45е-5 9,35е-11 ActRIIB(A24N 20-134)-hFc ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 3,85е-5 8,3е-4 2,15е-9 ActRIIB(L79E 20-134)-hFc 3,74е-5 9е-4 2,41е-9 ActRIIB(R64K 20-134)-hFc 2,25е-5 4,71е-5 2,1е-10 ActRIIB(R64K 20-129)-hFc 9,74е-4 2,09е-4 2,15е-9 ActRIIB(P129S, P130R 20-134)-hFc 1,08е-5 1,8е-4 1,67е-9 ActRIIB(K74A 20-134)-hFc 2,8е-5 2,03е-5 7,18е-11 Активин А ActRIIB(20-134)-hFc 5,94е6 1,59е-4 2,68е-11 ActRIIB(A24N 20-134)-hFc 3,34е6 3,46е-4 1,04е-10 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc Низкое связывание ActRIIB(L79E 20-134)-hFc Низкое связывание ActRIIB(R64K 20-134)-hFc 6,82е6 3,25е-4 4,76е-11 ActRIIB(R64K 20-129)-hFc 7,46е6 6,28е-4 8,41е-11 ActRIIB(P129S, P130R 20-134)-hFc 5,02е6 4,17е-4 3,31е-11

Эти данные, полученные в бесклеточном анализе, подтверждают данные клеточного анализа, демонстрирующие, что вариант A24N сохраняет лиганд-связывающую активность, сходную с активностью молекулы ActRIIB(20-134)-hFc, и что молекула L79D или L79E сохраняет связывание с миостатином и GDF11, но демонстрирует заметно пониженное (не поддающееся количественному определению) связывание с активином А.

Другие варианты были получены и испытаны, как описано в WO 2006/012627 (включена в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте). См., например, стр. 59-60, с использованием лигандов, связанных с устройством, и проливая рецептор на связанные лиганды. Примечательно, что K74Y, K74F, K74I (и, по-видимому, другие гидрофобные замены на K74, такие как K74L) и D80I вызывают уменьшение отношения связывания активина A (ActA) к связыванию GDF11 по сравнению с молекулой K74 дикого типа. Таблица данных, относящихся к этим вариантам, приведена ниже:

Связывание вариантов растворимого ActRIIB-Fc с GDF11 и активином A (анализ Biacore™)

ActRIIB ActA GDF11 WT(64A) KD=1,8e-7M
(+) KD=2,6e-7M
(+) WT(64R) na KD=8,6e-8M
(+++) +15 KD ~2,6e-8M
(+++) KD=1,9e-8M
(++++) E37A * * R40A - - D54A - * K55A ++ * R56A * * K74A KD=4,35e-9M
++++++ KD=5,3e-9M
+++++ K74Y * -- K74F * -- K74I * -- W78A * * L79A + * D80K * * D80R * * D80A * * D80F * * D80G * * D80M * * D80N * * D80I * -- F82A ++ - * Связывание не наблюдали
-- <1/5 связывания WT
- ~1/2 связывания WT
+ WT
++ <2× увеличенное связывание
+++ ~5× увеличенное связывание
++++ ~10× увеличенное связывание
+++++ ~40× увеличенное связывание

Пример 9: Создание ловушки GDF с усеченным внеклеточным доменом ActRIIB

Ловушка GDF, указанная как ActRIIB(L79D20-134)-hFc, была получена путем N-концевого слияния лидера TPA с внеклеточным доменом ActRIIB (остатки 20-134 в SEQ ID NO: 1), содержащим замену лейцина на аспартат (по остатку 79 в SEQ ID NO: 1), и С-концевого слияния человеческого Fc-домена с минимальным линкером (три глициновых остатка) (Фиг. 10; SEQ ID NO: 74). Нуклеотидная последовательность, соответствующая этому слитому белку, показана на Фиг. 11 (SEQ ID NO: 75, смысловая цепь; и SEQ ID NO: 76, антисмысловая цепь).

Ловушка GDF с укороченным внеклеточным доменом ActRIIB, указанная как ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, была получена путем N-концевого слияния лидера TPA с укороченным внеклеточным доменом (остатки 25-131 в SEQ ID NO: 1), содержащим замену лейцина на аспартат (по остатку 79 в SEQ ID NO: 1), и С-концевого слияния человеческого Fc-домена с минимальным линкером (три глициновых остатка) (Фиг. 12, SEQ ID NO: 77). Последовательность очищенной из клеток формы ActRIIB (L79D 25-131)-hFc представлена на Фиг. 13 (SEQ ID NO: 78). Одна нуклеотидная последовательность, кодирующая этот слитый белок, показана на Фиг. 15 (SEQ ID NO: 80) вместе с ее комплементарной последовательностью (SEQ ID NO: 81), а альтернативная нуклеотидная последовательность, кодирующая точно такой же слитый белок, показана на Фиг. 16 (SEQ ID NO: 82), а также ее комплементарная последовательность (SEQ ID NO: 83).

Пример 10: Селективное связывания лиганда ловушкой GDF с дважды усеченным внеклеточным доменом ActRIIB

Аффинность ловушек GDF и других белков ActRIIB-hFc в отношении некоторых лигандов оценивали in vitro с использованием устройства Biacore™. Результаты представлены в таблице ниже. Значения Kd были получены с помощью установившейся аффинной аппроксимации благодаря очень быстрой ассоциации и диссоциации комплекса, что препятствовало точному определению k_on и k_off.

Селективность вариантов ActRIIB-hFc в отношении лигандов:

Слитая конструкция Активин А
(Kd е-11) Активин В
(Kd е-11) GDF11
(Kd е-11) ActRIIB(L79 20-134)-hFc 1,6 1,2 3,6 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 1350,0 78,8 12,3 ActRIIB(L79 25-131)-hFc 1,8 1,2 3,1 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 2290,0 62,1 7,4

Ловушка GDF с усеченным внеклеточным доменом ActRIIB(L79D 2S-131)-hFc по селективности в отношении лиганда равна или превосходит более длинный вариант ActRIIB(L79D 20-134)-hFc, с явной потерей связывания активина A, частичной потерей связывания активина B и почти полным сохранением связывания GDF11 по сравнению с ActRIIB-hFc аналогами, в которых отсутствует замена L79D. Примечательно, что только усечение (без замены L79D) не изменяло селективность среди лигандов, показанных в настоящей заявке [ср. ActRIIB(L7925-131)-hFc с ActRIIB(L7920-134)-hFc]. ActRIIB(L79D 25-131)-hFc также сохраняет сильное до промежуточного уровня связывание с GDF8 лигандом Smad 2/3 сигнального пути и BMP6 и BMP10 лигандами Smad 1/5/8.

Пример 11: Ловушка GDF, происходящая из ActRIIB5

Были сообщения об альтернативной растворимой форме ActRIIB (обозначенной как ActRIIB5), в которой экзон 4, включая трансмембранный домен ActRIIB, был заменен другой С-концевой последовательностью (см., например, WO 2007/053775).

Последовательность нативного человеческого ActRIIB5 без лидера является следующей:

Замену лейцина на аспартат или другие аминокислотные замены можно осуществить по природному положению 79 (подчеркнуто), как описано для конструирования варианта ActRIIB5(L79D), который имеет следующую последовательность:

Этот вариант может быть связан с человеческим Fc (подчеркнут двумя линиями) с TGGG линкером (подчеркнут одной линией) с получением человеческого слитого белка ActRIIB5(L79D)-hFc со следующей последовательностью:

Эта конструкция может быть экспрессирована в СНО клетках.

Пример 12: Создание ALK4-Fc:ActRIIB гетеродимера

Был сконструирован гетеромерный комплекс ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, включающий внеклеточные домены человеческого ActRIIB и человеческого ALK4, каждый из которых отдельно слит с Fc доменом с линкером, расположенным между внеклеточным доменом и Fc доменом. Отдельные конструкции указаны как слитый полипептид ActRIIB-Fc и слитый полипептид ALK4-Fc, соответственно, и последовательности для каждого представлены ниже.

Подходы для промотирования образования гетеромерных комплексов ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, в отличие от гомодимерных комплексов ActRIIB-Fc или ALK4-Fc, заключаются во внесении изменений в аминокислотные последовательности Fc доменов для направления на образование асимметричных гетеромерных комплексов. Многие другие подходы к созданию асимметричных взаимодействующих пар с использованием Fc доменов описаны в настоящем раскрытии.

В одном подходе, проиллюстрированном в полипептидных последовательностях ActRIIB-Fc и ALK4-Fc SEQ ID NO: 108 и 110 и SEQ ID No: 111 и 113, соответственно, Fc домен изменен для введения катионных аминокислот на стороне взаимодействия, тогда как другой Fc домен изменен для введения анионных аминокислот на стороне взаимодействия. Слитый полипептид ActRIIB-Fc и слитый полипептид ALK4-Fc оба используют лидер тканевого активатора плазминогена (ТРА).

Последовательность полипептида ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 108) показана ниже:

Лидерная (сигнальная) последовательность и линкер подчеркнуты. Для промотирования образования ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимера, а не какого-либо из возможных гомодимерных комплексов, две аминокислотные замены (замена кислых аминокислот лизином) можно ввести в Fc домен слитого белка ActRIIB, как указано двойным подчеркиванием выше. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 108 необязательно может быть с лизином (K), удаленным с C-конца.

Этот слитый белок ActRIIB-Fc кодируется следующей нуклеиновокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 109):

Зрелый слитый полипептид ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 110) является следующим, и он необязательно может быть с лизином (K), удаленным с C-конца.

Комплементарная форма слитого полипептида ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 111) является следующей:

Лидерная последовательность и линкер подчеркнуты. Для направления образования гетеродимера с слитым полипептидом ActRIIB-Fc SEQ ID NO: 108 и 110, представленным выше, две аминокислотные замены (замена лизинов аспарагиновой кислотой) можно ввести в Fc домен слитого полипептида ALK4-Fc, как показано двойным подчеркиванием выше. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 111 необязательно может быть с лизином (K), добавленным на C-конце.

Этот слитый белок ALK4-Fc кодируется следующей нуклеиновой кислотой (SEQ ID NO: 112):

Последовательность зрелого ALK4-Fc слитого белка (SEQ ID NO: 113) является следующей и необязательно может быть с лизином (K), добавленным на C-конце.

Белки ActRIIB-Fc и ALK4-Fc SEQ ID NO: 110 и SEQ ID NO: 113, соответственно, могут быть ко-экспрессированы и очищены из клеточной линии СНО с образованием гетеромерного комплекса, включающего ALK4-Fc:ActRIIB-Fc.

В другом подходе, для промотирования образования гетеромультимерных комплексов с использованием асимметричных слитых белков Fc домены Fc изменяют для введения комплементарных гидрофобных взаимодействий и дополнительной межмолекулярной дисульфидной связи, как показано в последовательностях полипептидов ActRIIB-Fc и ALK4-Fc SEQ ID NO: 114 и 115 и SEQ ID NO: 116 и 117, соответственно. Слитый полипептид ActRIIB-Fc и слитый полипептид ALK4-Fc, каждый, используют лидер тканевого активатора плазминогена (TPA).

Последовательность полипепта ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 114) показана ниже:

Лидерная (сигнальная) последовательность и линкер подчеркнуты. Для промотирования образования гетеродимера ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, а не какого-либо из возможных гомодимерных комплексов, две аминокислотные замены (замена серина цистеином и треонина тритофаном) можно ввести в Fc-домен слитого белка, как показано двойным подчеркиванием выше. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 114 необязательно может быть с лизином (K), удаленным с С-конца.

Зрелый слитый полипептид ActRIIB-Fc является следующим:

Комплементарная форма слитого полипептида ALK4-Fc (SEQ ID NO: 116) является следующей и необязательно может быть с лизином (K), удаленным из C-конца.

Лидерная последовательность и линкер подчеркнуты. Для направления образования гетеродимера со слитым полипептидом ActRIIB-Fc SEQ ID NO: 114 и 115, показанным выше, четыре аминокислотные замены могут быть введены в Fc-домен слитого полипептида ALK4, как показано выше двойным подчеркиванием. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 116 необязательно может быть с лизином (K), удаленным из C-конца.

Последовательность зрелого слитого белка ALK4-Fc является следующей и необязательно может быть с лизином (K), удаленным из C-конца.

Белки ActRIIB-Fc и ALK4-Fc SEQ ID NO: 115 и SEQ ID NO: 117, соответственно, могут быть коэкспрессированы и очищены из клеточной линии CHO с образованием гетеромерного комплекса, включающего ALK4-Fc:ActRIIB-Fc.

Очистку различных комплексов ALK4-Fc:ActRIIB-Fc можно осуществить с использованием ряда стадий колоночной хроматографии, включая, например, три или более из следующих, в любом порядке: хроматография с белком А, хроматографии на Q-сефарозе, хроматографии на фенилсефарозе, эксклюзионная хроматография и катионообменная хроматография. Очистка может быть завершена фильтрацией вирусов и буферным обменом.

В другом подходе, для промотирования образования гетеромультимерных комплексов с использованием асимметричных слитых Fc белков Fc домены изменяют для введения комплементарных гидрофобных взаимодействий, дополнительной межмолекулярной дисульфидной связи и электростатических различий между двумя Fc-доменами для облегчения очистки на основе полного молекулярного заряда, как показано в полипептидных последовательностях ActRIIB-Fc и ALK4-Fc SEQ ID NO: 118-121 и 122-125, соответственно. Каждый из слитого полипептида ActREB-Fc и слитого полипептида ALK4-Fc используют лидер активатора тканевого плазминогена (TPA).

Последовательность полипептида ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 118) показана ниже:

Лидерная последовательность и линкер подчеркнуты. Для промотирования образовани ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимера, а не какого-либо из возможных гомодимерных комплексов, две аминокислотные замены (замена серина цистеином и треонина триптофаном) можно ввести в Fc домен слитого белка, как показано двойным подчеркиванием выше. Для облегчения очистки ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимера две аминокислотные замены (замена лизинов кислой аминокислотой) также можно ввести в Fc домен слитого белка, как показано двойным подчеркиванием выше. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 118 необязательно может быть с лизином, добавленным на C-конце.

ActRIIB-Fc слитый белок кодируется следующей нуклеиновой кислотой (SEQ ID NO: 119):

Зрелый слитый полипептид ActRIIB-Fc является следующим (SEQ ID NO: 120) и необязательно может быть с лизином, добавленным на C-конце:

Этот слитый полипептид ActRIIB-Fc кодируется следующей нуклеиновой кислотой (SEQ ID NO: 121):

Комплементарная форма слитого полипептида ALK4-Fc (SEQ ID NO: 122) является следующей и необязательно может быть с лизином, удаленным с С-конца.

Лидерная последовательность и линкер подчеркнуты. Для направления образования гетеродимера с ActRIIB-Fc слитым полипептидом SEQ ID NO: 118 и 120, представленным выше, четыре аминокислотные замены (замена тирозина цистеином, треонина серином, лейцина аланином и тирозина валином) можно ввести в Fc домен слитого полипептида ALK4, как показано двойным подчеркиванием выше. Для облегчения очистки ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимера две аминокислотные замены (замена аспарагина аргинином и аспартата аргинином) также можно ввести в Fc домен слитого полипептида ALK4-Fc, как показано двойным подчеркиванием выше. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 122 необязательно может быть с лизином, удаленным с C-конца.

Этот слитый полипептид ALK4-Fc кодируется следующей нуклеиновой кислотой (SEQ ID NO: 123):

Последовательность зрелого слитого полипептида ALK4-Fc является следующей (SEQ ID NO: 124) и необязательно может быть с лизином, удаленным с С-конца

Этот слитый полипептид ALK4-Fc кодируется следующей нуклеиновой кислотой (SEQ ID NO: 125):

Белки ActRIIB-Fc и ALK4-Fc SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 124, соответственно, могут быть коэкспрессированы и очищены из клеточной линии CHO с образованием гетеромерного комплекса, включающего ALK4-Fc:ActRIIB-Fc.

Очистку различных комплексов ALK4-Fc:ActRIIB-Fc можно осуществить с использованием ряда стадий колоночной хроматографии, включая, например, три или более из следующих, в любом порядке: хроматография с белком А, хроматографии на Q-сефарозе, хроматографии на фенилсефарозе, эксклюзионная хроматография, катионообменная хроматография, аффинная хроматография на основе эпитопов (например, с антителом или функционально эквивалентным лигандом, направленным против эпитопа на ALK4 или ActRIIB) и мультимодальная хроматография (например, со смолой, содержащей как электростатические, так и гидрофобные лиганды). Очистка может быть завершена фильтрацией вирусов и буферным обменом.

Пример 13. Профиль связывания с лигандами ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимера по сравнению с ActRIIB-Fc гомодимером и ALK4-Fc гомодимером

Анализ связывания на основе Biacore™ использовали для сравнения селективности связывания с лигандами гетеродимерного комплекса ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, описанного выше, с селективностью гомодимерных комплексов ActRIIB-Fc и ALK4-Fc. Гетеродимер ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, гомодимер ActRIIB-Fc и гомодимер ALK4-Fc независимо захватывали в систему с использованием анти-Fc антитела. Инжектировали лиганды и давали им растечься по захваченному рецепторному белку. Результаты представлены в таблице ниже, где скорости диссоциации лиганда (k_d), наиболее показательные для эффективных ловушек лиганда, обозначены серой штриховкой.

Профиль связывания с лигандами ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимера по сравнению с ActRIIB-Fc гомодимером и ALK4-Fc гомодимером Лиганд гомодимер ActRIIB-Fc гомодимер ALK4-Fc гетеродимер ALK4-Fc:ActRIIB-Fc k_a (1/Mc) k_d
(1/c) K_D
(пМ) k_a (1/Mc) k_d
(1/c) K_D
(пМ) k_a (1/Mc) k_d
(1/c) K_D
(пМ) Активин А 1,2×10⁷ 2,3×10^-4 19 5,8×10⁵ 1,2×0^-2 20000 1,3×10⁷ 1,5×10^-4 12 Активин В 5,1×10⁶ 1,0×10^-4 20 Отсутствие связывания 7,1×10⁶ 4,0×10^-5 6 BMP6 3,2×10⁷ 6,8×10^-3 190 --- 2,0×10⁶ 5,5×10^-3 2700 BMP9 1,4×10⁷ 1,1×10^-3 77 --- Транзиентное* 3400 BMP10 2,3×10⁷ 2,6×10^-4 11 --- 5,6×10⁷ 4,1×10^-3 74 GDF3 1,4×10⁶ 2,2×10^-3 1500 --- 3,4×10⁶ 1,7×10^-2 4900 GDF8 8,3×10⁵ 2,3×10^-4 280 1,3×10⁵ 1,9×10^-3 15000 ** 3,9×10⁵ 2,1×10^-4 550 GDF11 5,0×10⁷ 1,1×10^-4 2 5,0×10⁶ 4,8×10^-3 270 ** 3,8×10⁷ 1,1×10^-4 3 * Промежуточное значение из-за транзиентной природы взаимодействия; ** Очень низкий сигнал; --- Не испытывали

Эти сравнительные данные связывания демонстрируют, что гетеродимер ALK4-Fc:ActRIIB-Fc имеет измененный профиль связывания/селективность по сравнению с любым из гомодимеров ActRIIB-Fc или ALK4-Fc. ALK4-Fc:ActRIIB-Fc гетеродимер демонстрирует повышенное связывание с активином B по сравнению с любым из гомодимеров, сохраняет сильное связывание с активином A, GDF8 и GDF11, как наблюдается с гомодимером ActRIIB-Fc, и демонстрирует существенно пониженное связывание с BMP9, BMP10 и GDF3. В частности, BMP9 демонстрирует низкую или вообще не наблюдаемую аффинность к гетеродимеру ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, в то время как этот лиганд сильно связывается с гомодимером ActRIIB-Fc. Подобно гомодимеру ActRIIB-Fc, гетеродимер сохраняет промежуточный уровень связывания с BMP6. См. Фиг. 19.

Кроме того, анализ репортерного гена A-204 использовали для оценки эффектов гетеродимера ALK4-Fc:ActRIIB-Fc и гомодимера ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc на передачу сигналов активином A, активином B, GDF11, GDF8, BMP10 и BMP9. Клеточная линия: рабдомиосаркома человека (мышечного происхождения). Репортерный вектор pGL3(CAGA)12 (как описано в Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100). Мотив CAGA12 присутствует в TGFβ-респонсивных генах, (ген PAI-1), поэтому этот вектор широко используется для факторов, передающих сигналы через Smad2 и 3. Пример анализа репортерного гена A-204 описан ниже.

День 1: Распределить клетки A-204 в 48-луночном планшете.

День 2: Трансфекция А-204 клеток при помощи 10 мкг pGL3(CAGA)12 или pGL3(CAGA)12(10 мкг)+pRLCMV (1 мкг) и Fugene.

День 3: Добавить факторы (разбавленные в среде+0,1% BSA). Необходимо осуществить предварительную инкубацию ингибиторов с факторами в течение примерно одного часа перед добавлением к клеткам. Примерно через шесть часов клетки промывают PBS и затем лизируют.

Следуя указанным выше стадиям, осуществляли анализ репортерного гена люциферазы.

Было определено, что и гетеродимер ALK4-Fc:ActRIIB-Fc и гомодимер ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc являются сильными ингибиторами активина A, активина B, GDF11 и GDF8 в этом анализе. В частности, как можно видеть из сравнительных данных ИК₅₀ гомодимера/гетеродимера, показанных на Фиг. 19, гетеродимер ALK4-Fc:ActRIIB-Fc ингибирует сигнальные пути активина A, активина B, GDF8 и GDF11 таким же образом, как и гомодимер ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc. Однако ингибирование сигнальных путей BMP9 и BMP10 гетеродимером ALK4-Fc:ActRIIB-Fc существенно ниже по сравнению с гомодимером ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc. Эти данные согласуются с обсуждаемыми выше данными связывания, где было обнаружено, что как гетеродимер ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, так и гомодимер ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc демонстрируют сильное связывание с активином A, активином B, GDF8 и GDF11, но BMP10 и BMP9 имеют существенно пониженную аффинность к гетеродимеру ALK4-Fc:ActRIIB-Fc по сравнению с гомодимером ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc.

Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что гетеродимер ALK4-Fc:ActRIIB-Fc является более селективным антагонистом активина A, активина B, GDF8 и GDF11 по сравнению с гомодимером ActRIIB-Fc. Соответственно, гетеродимер ALK4-Fc:ActRIIB-Fc будет более полезным, чем гомодимер ActRIIB-Fc, в определенных применениях, где такой селективный антагонизм является выгодным. Примеры включают терапевтические применения, где желательно сохранить антагонизм одного или нескольких из активина A, активина B, активина AC, GDF8 и GDF11, но минимизировать антагонизм одного или нескольких из BMP9, BMP10, GDF3 и BMP6.

Пример 14: Эффекты полипептида ActRII и гетеродимера ALK4:ActRIIB на легочную гипертензию в монокроталиновой крысиной модели

Эффекты слитого белка ActRIIA-mFc (гомодимер ActRIIA-mFc, описанный в примере 1), гетеродимера ALK4-Fc-ActRIIB-Fc (описанный в примерах 12 и 13) и силденафила (ингибитор фосфодиэстеразы-5, одобренный для лечения ЛАГ) исследовали в крысиной модели легочной артериальной гипертензии (ЛАГ). В этой модели крысы Sprague Dawley получали подкожную инъекцию монокроталина (MCT) для индукции ЛАГ за 24 часа до начала терапии.

Крыс разделяли на разные группы обработки (по 10 крыс на группу): 1) обработка MCT (60 мг/кг интраперитонеально (и/п) в виде разовой дозы в день 1 исследования) и Tris-забуференный физиологический раствор (и/п 1 мл/кг через каждые три дня) (группа обработки носителем), 2) обработка полипептидом ActRIIA-mFc (10 мг/кг, и/п введение через каждые три дня) и МСТ (60 мг/кг и/п в виде разовой дозы в день 1 исследования), 3) обработка гетеродимером ALK4-Fc:ActRIIB-Fc (10 мг/кг, и/п введение через каждые три дня) и МСТ (60 мг/кг, и/п введение в виде разовой дозы в день 1 исследования), 4) обработка силденафилом (30 мг/кг перорально два раза в день) и МСТ (60 мг/кг, и/п введение в виде разовой дозы в день 1 исследования), и 5) контрольные крысы (Tris-забуференный физиологический раствор 1 мл/кг, и/п введение через каждые три дня). Крыс обрабатывали в течение 28 дней. Массу тела регистрировали до введения первой дозы в день 1, а затем еженедельно на протяжении всего исследования.

В день 28 крыс анестезировали интраперитонеальной инъекцией кетамина/ксилазина (80/10 мг/кг). На шее делали разрез, яремную вену изолировали и лигировали антериально. Заполненный жидкостью нагнетающий катетер вводили в правую яремную вену для измерения легочного артериального давления (ЛАД). Еще один разрез делали в паховой области и бедренную артерию изолировали и лигировали антериально. Катетер Millar вводили в бедренную артерию для измерения систолического артериального давления, диастолического давления и частоты сердечных сокращений. Среднее артериальное давление и артериальное давление в правом легком контролировали с использованием системы сбора данных Notocord HEM (Croissy sur Seine, Fmace) v3.5 в течение приблизительно 5-10 минут до получения стабильных показателей. Во время измерений крыс поддерживали при температуре приблизительно 37°С на грелке-подушке и температуру тела контролировали в течение всей процедуры при помощи ректального температурного зонда. В конце процедуры крыс умерщвляли и удаляли сердце и легкие. Сердце взвешивали целиком. Затем предсердия удаляли и левый желудочек с перегородкой (LV+S) отделяли от правого желудочка (RV). Желудочки взвешивали отдельно. Гипертрофию оценивали, частью, путем расчета RV/LV+S. Легкие также взвешивали.

По сравнению с контрольными животными, у крыс, получавших монокроталин (группа обработки носителем), наблюдали снижение массы тела, повышенное ЛАД, гипертрофию правого отдела сердца и повышенную массу легких, что указывает на установившуюся ЛАГ. У крыс, обрабатываемых силденафилом, не было никакого улучшения массы тела по сравнению с обрабатываемыми монокроталином крысами. Однако обработка силденафилом действительно снижала повышенное ЛАД на 30%, уменьшала гипертрофию правого отдела сердца на 18,5% и уменьшала массу легких на 10% по сравнению с крысами, обрабатываемыми монокроталином. К удивлению, было обнаружено, что как ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, так и ActRIIA-mFc имеют существенно больший эффект в лечение ЛАГ в этой модели по сравнению с силденафилом. Например, обработка при помощи ALK4-Fc:ActRIIB-Fc приводила к повышению массы тела (+5,1%), уменьшению повышенного ЛАД на 44,6%, уменьшению гипертрофии правого отдела сердца на 39,6% и уменьшению массы легкого на 19,0%. Хотя обработка при помощи ActRIIA-mFc не показала улучшения массы тела, она имела существенные эффекты в лечении других осложнений ЛАГ. Например, обработка при помощи ActRIIA-Fc приводила к снижению повышенного ЛАД на 68%, уменьшению гипертрофии правого отдела сердца на 47,1% и снижению массы легких на 18,4%.

Аналогичные тенденции наблюдали в отношении мускуляризации сосудов на основе гистопатологической оценки. После окрашивания образцов ткани для детекции αSMA/эластина 100 легочных артериол, имеющих размер от 10 до 50 мкм, на животное классифицировали как немускуляризированные, частично мускуляризированные или полностью мускуляризированные. Было установлено, что легочные артериолы обработанных носителем крыс были на 62,3% полностью мускуляризированными, на 36,4% частично мускуляризированными и на 1,4% немускуляризированными. Обработка силденафилом имела только очень небольшой эффект на уменьшение мускуляризации сосудов (например, легочные артериолы были на 57,9% полностью мускуляризированными, на 41,6% частично мускуляризированными и на 0,9% немускуляризированными). В отличие от этого, обработка при помощи ActRIIA-mFc приводила к значительному снижению сосудистой мускуляризации по сравнению с животными, получавшими силденафил (например, легочные артериолы были на 25,8% полностью мускуляризированными, на 66,9% частично мускуляризированными и на 7,3% немускуляризированными по сравнению с животными, получавшими носитель). Гистопатологическую оценку гипертрофии гладких мышц легочных артериол также регистрировали следующим образом: 0 (нормальная), 1 (минимальная), 2 (легкая), 3 (средняя) или 4 (выраженная). Крысы, которых обрабатывали носителем, имели среднюю оценку гипертрофии гладких мышц от умеренной до выраженной (оценка 3,8). Снова наблюдали, что обработка силденафилом имела очень небольшой эффект на гипертрофию, со средней оценкой 3 (средняя). При этом, у животных, получавших ActRIIA-mFc, наблюдали значительное снижение гипертрофии гладких мышц (средняя оценка 1,6) по сравнению с животными, получавшими носитель и силденафил. В целом, обработка при помощи ActRIIA-mFc существенно уменьшала мускуляризацию и гипертрофию сосудов в этой модели ЛАГ.

Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что как ActRIIA-mFc, так и ALK4-Fc:ActRIIB-Fc эффективны для облегчения различных осложнений ЛАГ в этой монокроталин-индуцированной модели. В частности, как ActRIIA-mFc, так и ALK4-Fc:ActRIIB-Fc имели больший эффект уменьшения артериального давления, гипертрофии правого отдела сердца и мускуляризации сосудов, чем эффект, наблюдаемый для силденафила, который является одобренным препаратом для лечения ЛАГ. Кроме того, данные показывают, что другие антагонисты GDF/BMP, особенно те, которые обладают активностями, сходными с ActRIIA-mFc и ALK4-Fc:ActRIIB-Fc, могут быть полезны для лечения ЛАГ, особенно для профилактики или уменьшении тяжести различных осложнений ЛАГ.

Пример 15: Эффекты полипептида ActRII и гетеродимера ALK4:ActRIIB на легочную гипертензию в крысиной модели с Sugen гипоксией

Эффекты слитого белка ActRIIA-mFc (гомодимера ActRIIA-mFc, описанно в Примере 1, и силденафила (ингибитор фосфодиэстеразы-5, одобренный для лечения ЛАГ) дополнительно исследовали в модели Sugen гипоксия-индуцированной ЛАГ. В этой модели крысам вводят суточные дозы семаксаниба и помещают в среду с низким содержанием кислорода (приблизительно 13% кислорода) для индукции ЛАГ за 24 часа до начала терапии.

Крыс разделяли на разные группы обработки (по 10 крыс на группу): 1) обработка семаксанибом (200 мг/кг подкожно (п/к) в виде однократной дозы ежедневно)/гипоксия и Tris-забуференным физиологическим раствором (вводили и/п при 1 мл/кг через каждые три дня) (группа обработки носителем), 2) обработка полипептидом ActRIIA-mFc (10 мг/кг и/п через каждые три дня) и семаксанибом (200 мг/кг п/к в виде однократной дозы ежедневно)/гипоксия, 3) обработка силденафилом (30 мг)/кг перорально два раза в день) и семаксанибом (200 мг/кг п/к в виде однократной дозы ежедневно)/гипоксия, и 4) контрольные крысы (Tris-забуференный физиологический раствор и/п при 1 мг/кг через каждые три дня). Крыс обрабатывали в течение 28 дней. Массу тела регистрировали до введения первой дозы в день 1, а затем еженедельно на протяжении всего исследования.

В день 28 крыс анестезировали интраперитонеальной инъекцией кетамина/ксилазина (80/10 мг/кг). На шее делали разрез, яремную вену изолировали и лигировали антериально. Заполненный жидкостью нагнетающий катетер вводили в правую яремную вену для измерения легочного артериального давления (ЛАД). Еще один разрез делали в паховой области и бедренную артерию изолировали и лигировали антериально. Катетер Millar вводили в бедренную артерию для измерения систолического артериального давления, диастолического давления и частоты сердечных сокращений. Среднее артериальное давление и артериальное давление в правом легком контролировали с использованием системы сбора данных Notocord HEM (Croissy sur Seine, Fmace) v3.5 в течение приблизительно 5-10 минут до получения стабильных показателей. Во время измерений крыс поддерживали при температуре приблизительно 37°С на грелке-подушке и температуру тела контролировали в течение всей процедуры при помощи ректального температурного зонда. В конце процедуры крыс умерщвляли и удаляли сердце и легкие. Сердце взвешивали целиком. Затем предсердия удаляли и левый желудочек с перегородкой (LV+S) отделяли от правого желудочка (RV). Желудочки взвешивали отдельно. Гипертрофию оценивали, частью, путем расчета RV/LV+S. Легкие также взвешивали.

По сравнению с контрольными животными, у крыс, обрабатываемых семаксинибом/гипоксия (группа обработки носителем) наблюдали снижение массы тела, повышенное ЛАД, гипертрофию правого отдела сердца и повышенную массу легких, что указывает на установившуюся ЛАГ. Обработка силденафилом приводила к снижению среднего легочного артериального давления на 22,4% и уменьшению гипертрофии правого отдела сердца на 10% по сравнению с животными, которых обрабатывали носителем. И опять было обнаружено, что ActRIIA-mFc обработка имела существенно больший эффект в лечении ЛАГ в этой модели по сравнению с силденафилои. Например, ActRIIA-mFc обработка приводила к снижению среднего легочного артериального давления на 51,3% и уменьшению гипертрофии правого отдела сердца на 53,5% по сравнению с животными, которых обрабатывали носителем.

Аналогичные тенденции наблюдали в отношении мускуляризации сосудов на основе гистопатологической оценки. После окрашивания образцов ткани для детекции αSMA/эластина 100 легочных артериол, имеющих размер от 10 до 50 мкм, на животное классифицировали как немускуляризированные, частично мускуляризированные или полностью мускуляризированные. Было установлено, что легочные артериолы обработанных носителем крыс были на 72,5% полностью мускуляризированными, на 27,4% частично мускуляризированными и на 0,1% немускуляризированными. Обработка силденафилом имела только очень небольшой эффект на уменьшение мускуляризации сосудов (например, легочные артериолы были на 67,4% полностью мускуляризированными, на 31,6% частично мускуляризированными и на 1,0% немускуляризированными) по сравнению с животными, получавшими носитель. В отличие от этого, обработка при помощи ActRIIA-mFc приводила к значительному снижению сосудистой мускуляризации по сравнению с животными, получавшими силденафил (например, легочные артериолы были на 29,3% полностью мускуляризированными, на 69,3% частично мускуляризированными и на 1,4% немускуляризированными по сравнению с животными, обработанными носителем). Гистопатологическую оценку гипертрофии гладких мышц легочных артериол также регистрировали следующим образом: 0 (нормальная), 1 (минимальная), 2 (легкая), 3 (средняя) или 4 (выраженная). Крысы, которых обрабатывали носителем, имели среднюю оценку гипертрофии гладких мышц от умеренной до выраженной (оценка 3,6). Снова наблюдали, что обработка силденафилом имела очень небольшой эффект на гипертрофию со средней оценкой 3 (средняя). При этом, у животных, получавших ActRIIA-mFc, наблюдали значительное снижение гипертрофии гладких мышц (средняя оценка 1,4) по сравнению с животными, получавшими силденафил. В целом, обработка при помощи ActRIIA-mFc существенно уменьшала мускуляризацию и гипертрофию сосудов в этой модели ЛАГ.

Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что ActRHA-mFc эффективен для уменьшения различных осложнений ЛАГ в модели Sugen гипоксии. В частности, ActRIIA-mFc имел больший эффект уменьшения артериального давления, гипертрофии правого отдела сердца и мускуляризации сосудов, чем эффект, наблюдаемый для силденафила, который является одобренным препаратом для лечения ЛАГ. Кроме того, данные показывают, что другие антагонисты GDF/BMP, особенно те, которые обладают активностями, сходными с ActRIIA-mF, могут быть полезны для лечения ЛАГ, особенно для профилактики или уменьшении тяжести различных осложнений ЛАГ.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

Все публикации и патенты, указанные в настоящей заявке, включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте, как если бы каждая отдельная публикация или патент были специально и индивидуально указаны для включения посредством ссылки.

Хотя были обсуждены конкретные варианты осуществления изобретения, приведенное выше описание является иллюстративным, а не ограничивающим. Многие изменения будут очевидны для специалистов в данной области техники после рассмотрения настоящего описания и формулы изобретения, представленной ниже. Полный объем изобретения должен определяться посредством ссылки на формулу изобретения вместе с полным объемом ее эквивалентов и описание вместе с такими вариантами.

Изобретение относится к антагонистам GDF/BMP для лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести легочной гипертензии (ЛГ), в частности лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести одного или нескольких ЛГ-ассоциированных осложнений. Изобретение также обеспечивает способы применения антагонистов GDF/BMP для лечения, профилактики или уменьшения скорости прогрессирования и/или тяжести различных состояний, включающих, но не ограничивающихся этим, легочное сосудистого ремоделирование, фиброз легких и гипертрофию правого желудочка. Изобретение также обеспечивает способы применения антагониста GDF/BMP для снижения систолического давления в правом желудочке у субъекта, нуждающегося в этом. 21 з.п. ф-лы, 23 ил., 15 пр.

1. Способ лечения легочной артериальной гипертензии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32.

2. Способ по п. 1, где пациент имеет легочное артериальное давление (ЛАД) в покое по меньшей мере 25 мм рт.ст. (например, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мм рт.ст.).

3. Способ по п. 1 или 2, где способ снижает ЛАД у пациента, уменьшает мускуляризацию легочных артериол у пациента; уменьшает легочное сосудистое сопротивление у пациента; снижает легочное сосудистое сопротивление у пациента; повышает давление заклинивания легочных капилляров; повышает конечное диастолическое давление в левом желудочке; повышает способность пациента переносить физические нагрузки; увеличивает проходимое пациентом за 6 минут расстояние; и/или снижает индекс одышки Борга (BDI) у пациента.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где пациент имеет легочную гипертензию функционального класса II или класса III, как признано Всемирной Организацией Здравоохранения.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где способ предотвращает или задерживает прогрессирование функционального класса легочной гипертензии.

6. Способ по п. 4 или 5, где способ промотирует или увеличивает регрессию функционального класса легочной гипертензии.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где полипептид является частью гомодимерного белкового комплекса.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где полипептид является гликозилированным.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где полипептид связывается с одним или более лигандами, выбранными из группы, состоящей из: активина A, активина B и GDF11.

15. Способ по любому из пп. 1-14, также включающий введение пациенту дополнительного активного средства и/или поддерживающей терапии для лечения легочной гипертензии.

16. Способ по п. 15, где дополнительное активное средство и/или поддерживающая терапия для лечения легочной гипертензии выбраны из группы, состоящей из следующих: простациклин и его производные (например, эпопростенол, трепростинил и илопрост); агонисты простациклиновых рецепторов (например, селексипаг); агонисты эндотелиновых рецепторов (например, телин, амбрисентан, мацитентан и босентан); блокаторы кальциевых каналов (например, амлодипин, дилтиазем и нифедипин; антикоагулянты (например, варфарин); диуретики; кислородная терапия; предсердная септостомия; легочная тромбоэндартеректомия; ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (например, силденафил и тадалафил); активаторы растворимой гуанилатциклазы (например, цинацигват и риоцигват); ингибиторы ASK-1 (например, CIIA; SCH79797; GS-4997; MSC2032964A; 3H-нафто[1,2,3-de]хинилин-2,7-дионы, NQDI-1; 2-тиоксо-тиазолидины, 5-бром-3-(4-оксо-2-тиоксо-тиазолидин-5-илиден)-1,3-дигидро-индол-2-он); антагонисты NF-κB (например, dh404, CDDO-эпоксид; 2,2-дифторпропионамид; С28 имидазол (CDDO-Im); 2-циано-3,12-диоксоолеан-1,9-диен-28-овая кислота (CDDO); 3-ацетилолеаноловая кислота; 3-трифторацетилолеаноловая кислота; 28-метил-3-ацетилолеанан; 28-метил-3-трифторацетилолеанан; 28-метилоксиолеаноловая кислота; SZC014; SCZ015; SZC017; ПЭГилированные производные олеаноловой кислоты; 3-О-(бета-D-глюкопиранозил)олеаноловая кислота; 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловая кислота; 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→2)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловая кислота; 28-О-бета-D-глюкопиранозиловый эфир 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловой кислоты; 28-О-бета-D-глюкопиранозиловый эфир 3-О-[бета-D-глюкопиранозил-(1→2)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловой кислоты; 3-О-[а-L-рамнопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловая кислота; 28-О-бета-D-глюкопиранозиловый эфир 3-О-[альфа-L-рамнопиранозил-(1→3)-бета-D-глюкопиранозил]олеаноловой кислоты; 28-О-β-D-глюкопиранозил-олеаноловая кислота; 3-О-β-D-глюкопиранозил(1→3)-β-D-глюкопиранозидуроновая кислота (СS1); олеаноловая кислота 3-О-β-D-глюкопиранозил(1→3)-β-D-глюкопиранозидуроновая кислота (СS2); метил 3,11-диоксоолеан-12-ен28-олат (DIOXOL); ZCVI₄-2; бензил 3-дегидрокси-1,2,5-оксадиазоло[3',4':2,3]олеанолат), легочная и/или сердечная трансплантация.

17. Способ по любому из пп. 1-16, где пациент принимал лечение одним или несколькими вазодилататорами.

18. Способ по любому из пп. 1-16, где пациент принимал лечение одним или несколькими средствами, выбранными из группы, состоящей из: вазодилататоров, ингибиторов фосфодиэстеразы 5 типа, стимуляторов растворимой гуанилатциклазы, агониста рецепторов простациклина и антагонистов рецепторов эндотелина.

19. Способ по п. 18, где одно или несколько средств выбраны из группы, состоящей из: бозентана, силденафила, берапроста, мацитентана, селексипага, эпопростенола, трепростинила, илопроста, амбризентана и тадалафила.

20. Способ по любому из пп. 1-19, где способ дополнительно включает введение одного или нескольких вазодилататоров.

21. Способ по любому из пп. 1-20, где способ дополнительно включает введение одного или нескольких средств, выбранных из группы, состоящей из: ингибиторов фосфодиэстеразы 5 типа, стимуляторов растворимой гуанилатциклазы, агониста рецепторов простациклина и антагонистов рецепторов эндотелина.

22. Способ по п. 21, где одно или несколько средств выбраны из группы, состоящей из: бозентана, силденафила, берапроста, мацитентана, селексипага, эпопростенола, трепростинила, илопроста, амбризентана и тадалафила.