Способ тестирования иммунологической толерантности у животных Российский патент 2021 года по МПК A61B5/00 G01N33/53 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, которое может быть использовано в клинической практике для диагностики иммунологической толерантности у животных, в частности к способу оценки иммунологической ареактивности в биологической системе «мать-плод-новорожденный» и использовать иммунологические методы диагностики для выявления различных заболеваний у сельскохозяйственных животных на крупных и мелких животноводческих фермах.

Уровень техники

При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов тестирования иммунологической толерантности у животных путем оценки иммунологической реактивности организма.

Известно множество способов оценки иммунологической реактивности, направленных на изучение различных звеньев иммунной системы, осуществляемых как in vitro, так и in vivo и основанных на выявлении и определении функциональной активности клеток, участвующих в формировании клеточного и гуморального иммунитета, определении иммуноглобулинов и циркулирующих иммунных комплексов, антителозависимой клеточной цитотоксичности, оценке реакций гиперчувствительности замедленного типа, немедленного типа, в частности реакции дегрануляции тучных клеток и базофилов крови.

Однако известные и широко используемые способы оценки иммунологической реактивности макроорганизма не дают полной гарантии и точной оценки индуцированного состояния иммунологической ареактивности к специфическому антигену.

Известен способ определения иммунологической реактивности организма путем воздействия на организм лекарственным веществом (вводят пирогенал в дозе 0,15-0,18 мкг на 1 кг веса) и при повышении температуры до 37,0-37,5°С определяют иммунологическую реактивность в пределах нормы, при 36,6-36,9°С определяют недостаточность иммунологической реактивности (См. Авт.св. СССР №1689857, М.Кл.² G01N 33/53, 1989 г.). Данный способ имеет ряд недостатков, снижающих его информативность. Так, определяемый показатель температуры тела претерпевает существенные изменения, обусловленные не только физиологическими процессами (испарение влаги с поверхности кожи, вентиляция легких и т.д.), но и неконтролируемыми технологическими параметрами (температура и влажность внешнего воздуха, теплопроводность поверхностей). Высокая вариабельность полученных результатов, также снижает информативность таких параметров для суждения о недостаточности иммунологической реактивности.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы (См. Авт.св. СССР №1686364, М.Кл.² G01N 33/53, 1991 г.). Однако для реализации способа требуется дорогостоящее оборудование и биопрепараты. Кроме того, способ недостаточно информативен, а также сложен.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение концентрации иммуноглобулинов и специфических антител в плазме, отличающийся тем, что, дополнительно определяют концентрацию иммуноглобулинов A, G, М и специфических сывороточных антител, сорбированных на форменных элементах крови и по соотношению концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови судят о иммунологической реактивности организма (См. Патент РФ №2126154, М.Кл 2 G01N 33/53, 1999 г.).

Недостаток данного способа в том, что он применим только в специальных лабораторных условиях с применением методов иммунохимии, что сужает диапазон его полезного использования в полевых условиях. Кроме того, определение концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови достаточно сложно технически и требует значительных временных затрат, специального оборудования и реактивов.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение иммунологических показателей клеток крови, по которым судят о состоянии организма (См. Патент РФ №1813213, М.Кл.² G01N 33/53, 1993 г.).

Однако недостатком данного способа является повышенная травматичность, т.к. отбор крови производится из локтевой вены, что особенно сложно для тяжелобольных и в педиатрической практике. Из-за невозможности проведения анализа после длительного хранения проб исключается проведение скрининговых исследований. Способ недостаточно информативен, т.к. позволяет определить предрасположенность к небольшому количеству заболеваний, характеризуется низкой пропускной способностью из-за длительности процесса.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип является способ тестирования иммунологической толерантности у животных, включающий искусственное индуцирование ареактивности к антигену, последующее введение в организм разрешающей дозы антигена и исследование базофилов крови, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, исследуют динамику количественных сдвигов циркулирующих в крови базофилов в течение семи суток после однократного внутрибрюшного введения специфического антигена в разведении 1:50-1:100 в количестве 5 мл на 1 кг массы тела и при содержании количественных параметров на уровне до введения антигена тестируют иммунологическую толерантность.

Несмотря на положительные результаты прототипа, его недостатками является диагностика иммунологической толерантности без выявления и определения значений титра антител и не позволяет достоверно установить наличие и степень тяжести толерантного эффекта в функциональной системе «мать-плод-новорожденный». А по одному виду пула клеток-базофилов не представляется возможным оценить степень резвившейся иммунологической ареактивности к специфическому антигену. Наш способ будет выявлять уже доступные изменения иммунологической реактивности с первых часов жизни у полученного потомства.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа тестирования иммунологической толерантности у животных, направленного на более релевантную оценку ареактивности особей в раннем возрасте до получения от них потомства.

Техническим результатом изобретения является повышение, достоверности лабораторного исследования (неинвазивного пренатального скрининга изоиммунизационных эффектов у потомства) за счет выявления состояния реакции агглютинации между полученной иммунной сывороткой крови потомства и семенем биологического самца производителя. Предлагаемый способ позволяет сформировать группу животных с высоким риском развития иммунологической толерантности.

Технический результат достигается при помощи способа тестирования иммунологической толерантности у животных, при котором с целью оценки иммунологической ареактивности в раннем возрасте, производят иммунизацию производителей их же семенем, затем ставят реакцию агглютинации семени с специфической сывороткой крови потомства в разведении 1:50-1:100, а по степени схожести белков соматических клеток крови и семени тестируют степень толерантного состояния иммунной системы.

От проверяемого производителя берут семя и накапливают его путем глубокого замораживания в жидком азоте. Для иммунизации семя центрифугируют, осадок сперматозоидов трехкратно промывают физиологическим раствором и снова центрифугируют. Осадок разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 и вводят производителю подкожно.

Краткое описание чертежей и иных материалов

В таблице 1, приведена схема инъекций различных видов животных для постановки реакции агглютинации.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа тестирования иммунологической толерантности у животных.

Пример 1.

По первому примеру приведены данные (см. таблицу 1), где указаны объемы семени, впрыскиваемые различным видам животных подкожно. Интервал между 1-й и 2-й инъекциями 5 дней, между 2-й и 3-й - 7 дней. Через 10 дней после последней инъекции у производителя берут кровь, из которой готовят иммунную специфическую сыворотку. Для постановки реакции агглютинации между активными сперматозоидами и сывороткой крови потомства в 10 пробах делают разбавления сыворотки физиологическим раствором в кратных соотношениях от 1:50 до 1:100, в одиннадцатой-контрольной-физиологический раствор. Затем сыворотку семенной жидкости центрифугируют с последующей трехкратной промывкой его физиологическим раствором. Каплю отмытого семени разбавляют 1,5 мл физиологического раствора для получения рабочей смеси. В каждую из 10 проб к сыворотке добавляют одну каплю рабочей смеси и помещают в термостат при 37°С на 30 мин, после чего производят читку реакции. По выраженности реакции устанавливают степень схожести между белками соматических клеток крови и семени, а, следовательно, и степень передачи свойств производителя своему потомству. Положительная реакция проявляется в данном исполнении при аглютинации в разведении 1:50.

Пример 2.

По второму варианту исполнения способа интервал между 1-й и 2-й инъекциями 5 дней, между 2-й и 3-й - 7 дней. Через 10 дней после последней инъекции у производителя берут кровь, из которой готовят иммунную сыворотку. Для постановки реакции агглютинации между активными сперматозоидами и сывороткой крови потомства в 10 пробах делают разбавления сыворотки физиологическим раствором в кратных соотношениях от 1:100 до 1:200, в одиннадцатой-контрольной-физиологический раствор.

Затем сыворотку семенной жидкости центрифугируют с последующей трехкратной промывкой его физиологическим раствором. Каплю отмытого семени разбавляют 1,5 мл физиологического раствора для получения рабочей смеси. В каждую из 10 проб к сыворотке добавляют одну каплю рабочей смет и помещают в термостат при 37°С на 30 мин, после чего производят читку реакции. По выраженности реакции устанавливают степень схожести между белками соматических клеток крови и семени, а, следовательно, и степень передачи свойств производителя своему потомству. Положительная реакция проявляется в данном исполнении при аглютинации с разведением 1:150.

Пример 3.

Согласно третьего варианта исполнения способа интервал между 1-й и 2-й инъекциями 5 дней, между 2-й и 3-й - 7 дней. Через 10 дней после последней инъекции у производителя берут кровь, из которой готовят иммунную сыворотку. Для постановки реакции агглютинации между активными сперматозоидами и сывороткой крови потомства в 10 пробах делают разбавления сыворотки физиологическим раствором в кратных соотношениях от 1:300 до 1:500, в одиннадцатой-контрольной-физиологический раствор.

Затем сыворотку семенной жидкости центрифугируют с последующей трехкратной промывкой его физиологическим раствором. Каплю отмытого семени разбавляют 1,5 мл физиологического раствора для получения рабочей смеси. В каждую из 10 проб к сыворотке добавляют одну каплю рабочей смет и помещают в термостат при 37°С на 30 мин, после чего производят читку реакции. По выраженности реакции устанавливают степень схожести между белками соматических клеток крови и семени, а, следовательно, и степень передачи свойств производителя своему потомству. Положительная реакция проявляется в данном исполнении при аглютинации с разведением 1:400.

Установлено минимальное разведение специфической сыворотки выявляющие динамику количественных сдвигов реагентов реакции аглютинации по первому примеру исполнения на уровне 1:50. Использование предлагаемого способа оценки производителей сельскохозяйственных животных до появления потомства в данном исполнении, дает возможность упрощенно и достоверно определить их степень толерантного состояния иммунной системы.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, иммунологии, и может быть использовано для тестирования иммунологической толерантности у животных. С целью оценки иммунологической ареактивности в раннем возрасте производят иммунизацию производителей их же семенем. Интервал между 1-й и 2-й инъекциями - 5 дней, между 2-й и 3-й - 7 дней. Через 10 дней после последней инъекции у производителя берут кровь, из которой готовят иммунную специфическую сыворотку. Затем ставят реакцию агглютинации семени со специфической иммунной сывороткой в разведении 1:50-1:500, и по степени схожести белков соматических клеток крови и семени тестируют степень толерантного состояния иммунной системы. Способ обеспечивает возможность повышения достоверности лабораторного исследования (неинвазивного пренатального скрининга изоиммунизационных эффектов у потомства) за счет выявления состояния реакции агглютинации между полученной иммунной сывороткой крови потомства и семенем биологического самца производителя, что позволяет сформировать группу животных с высоким риском развития иммунологической толерантности. 1 табл., 3 пр.

Способ тестирования иммунологической толерантности у животных, отличающийся тем, что с целью оценки иммунологической ареактивности в раннем возрасте производят иммунизацию производителей их же семенем, интервал между 1-й и 2-й инъекциями - 5 дней, между 2-й и 3-й - 7 дней, через 10 дней после последней инъекции у производителя берут кровь, из которой готовят иммунную специфическую сыворотку, затем ставят реакцию агглютинации семени со специфической иммунной сывороткой в разведении 1:50-1:500, и по степени схожести белков соматических клеток крови и семени тестируют степень толерантного состояния иммунной системы.