Способ оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов Российский патент 2019 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к аллергологии и иммунологии, в частности к способам оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов, и может быть использовано в медицине и ветеринарии.

Предлагаемый способ может быть использован при: изучении специфичности аллергической реактивности биологических моделей микобактериальных инфекций с использованием морских свинок; определении чувствительности вариантов моделей микобактериальных инфекций; лабораторной диагностике микобактериальных инфекций животных (постановке биологической пробы).

Известен способ оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов (используемый при моделировании туберкулезной аллергии) [Евглевский А.А. Способ моделирования туберкулезной аллергии у животных и птиц. Авторское свидетельство №1452368, 1988 г.], включающий введение в организм морских свинок антигенного состава на основе инактивированных микобактерий туберкулеза и последующее определение аллергической реактивности у морских свинок по проявлению и интенсивности кожной реакции ПЧЗТ (повышенная чувствительность замедленного типа) на введение одной дозы ППД для млекопитающих.

Недостатком данного способа является невозможность оценить специфичность аллергической реактивности на антигенный состав у морских свинок, посредством использования одной дозировки ППД для млекопитающих.

Известен способ оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов [United States Patent US 7579003. HBSAG-BCG combined vaccine for intracutaneous injection and preparation method thereof. Zhi Wang, Xiaolin Zhao, Lihua Yang et. al. 2009] включающий введение морским свинкам комплексного вакцинного препарата содержащего живые микобактерий БЦЖ, и последующую оценку аллергической реактивности организма морских свинок по проявлению и интенсивности кожной реакции ПЧЗТ на введение одной дозы ППД для млекопитающих.

Недостатком данного подхода является невозможность оценить специфичность аллергической реактивности организма морских свинок на вакцинный препарат, посредством использования только одной дозировки ППД для млекопитающих.

Известен способ оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов используемый при диагностики туберкулеза у животных и птицы являющийся прототипом предлагаемого способа, включающий подкожное введение морским свинкам, массой 300-350 грамм, суспензии патологического материала полученного от животных с подозрением на туберкулез и последующую, через 30 суток, оценку по проявлению и интенсивности аллергической реактивности морских свинок на 25 ТЕ (что соответствует дозе 2,5 нг - нанограмм белка) ППД туберкулина для млекопитающих [Животные и птица сельскохозяйственные методы лабораторной диагностики туберкулеза, ГОСТ 26072-89. М.: Изд-во стандартов, 1989. 14 с.].

Недостатком этого способа является невозможность оценить специфичность аллергической реактивности у морских свинок обусловленную сенсибилизацией организма атипичными микобактериями, а также в случае исследования материала содержащего одновременно патогенные и атипичные микобактерий.

Технической задачей является повышение информативности и точности способа оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов. Основной задачей при разработке заявленного способа являлся подбор оптимальных доз ППД для млекопитающих и ППД для птиц позволяющий по проявлению и интенсивности кожной реакции ПЧЗТ оценить аллергическую реактивность морских свинок, сенсибилизированных разными видами микобактерий или микобактериальных антигенов.

Проявление реакции это показатель, характеризующий наличие видимой реакции в виде папулы и/или эритемы средним диаметром 5 или более миллиметров.

Интенсивность реакции показатель характеризует значение среднего диаметра реакции (сумма продольного и поперечного диаметров деленное на два).

Чувствительность модели туберкулезной инфекции - это способность биологической модели характеризовать зависимость дозы туберкулина - интенсивность ПЧЗТ. Выражается наклоном прямой линии проходящей через две точки в системе координат образованные дозой вводимого туберкулина -интенсивностью реакции (тангенс угла).

Техническая задача достигается способом оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов, включающем введение в организм морских свинок альбиносов, или морских свинок с белыми боками исследуемого материала (содержащего микобактерий), или микобактериальные антигены, с последующим, через 30-35 суток, определением по проявлению и интенсивности кожной реакции ПЧЗТ на ППД для млекопитающих (две дозы) и ППД для птиц (две дозы) аллергической реактивности морских свинок, через 24 часа после введения ППД туберкулинов.

Заявленное изобретение отличается от прототипа тем, что для оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов с использованием морских свинок, применяют две дозы ППД для млекопитающих (2,5 нг. белка; 0,1 нг. белка) и две дозы ППД для птиц (2,5 нг. белка; 0,1 нг. белка). При осуществлении способа используют ППД для млекопитающих с номинальной активностью 10000 МЕ/мг, и ППД для птиц с номинальной активностью 50000 МЕ/мг. Две дозы ППД для млекопитающих и две дозы ППД для птиц вводят внутрикожно справа и слева морским свинкам, в предварительно депилированные от шерсти на боковых поверхностях участки кожи в объеме 0,1 см³.

Проявление реакции ПЧЗТ только на дозу 2,5 нг белка или дозы 2,5 белка и 0,1 нг белка ППД для млекопитающих свидетельствует о развитии сенсибилизации морских свинок вызванной типичными микобактериями.

Проявление реакции ПЧЗТ только на дозу 2,5 нг белка или дозы 2,5 белка и 0,1 нг белка ППД для птиц свидетельствует о развитии сенсибилизации морских свинок вызванной атипичными микобактериями.

Одновременное проявление реакции на одну дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих и на одну дозу 2,5 нг белка ППД для птиц предполагает сравнение значений между собой. При интенсивности реакции выше на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих, в сравнении с дозой 2,5 нг белка ППД для птиц свидетельствует о сенсибилизации типичными микобактериями. При интенсивности реакции ниже на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих, в сравнении с дозой 2,5 нг белка ППД для птиц свидетельствует о сенсибилизации атипичными микобактериями.

Одновременное проявление реакции на дозы 2,5 нг белка и 0,1 нг белка ППД для млекопитающих и на дозу 2,5 нг белка ППД для птиц и при интенсивности реакции на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих больше интенсивности реакции на дозу 2,5 нг белка ППД для птиц свидетельствует о развитии сенсибилизации морских свинок вызванной типичными микобактериями.

Одновременное проявление реакции на дозы 2,5 нг белка и 0,1 нг белка ППД для птиц и на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих и при интенсивности реакции на дозу 2,5 нг белка ППД для птиц больше интенсивности реакции на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих свидетельствует о развитии сенсибилизации морских свинок вызванной атипичными микобактериями.

Одновременное проявление кожной реакции ПЧЗТ на две дозы ППД для млекопитающих и две дозы ППД для птиц свидетельствует о сенсибилизации животных типичными и атипичными микобактериями, а также при снижении специфичности аллергической реактивности морских свинок обусловленную использованием термически инактивированных микобактерий.

Одновременное использование ППД туберкулина для млекопитающих и ППД туберкулина для птиц для определения аллергической реактивности организма морских свинок по проявлению и интенсивности кожной реакции ПЧЗТ соотносятся с требованиями международного эпизоотического бюро (МЭБ) при осуществлении дифференциально - диагностических исследований туберкулеза у животных [OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines. - 2012. - P. 359-369.].

Примеры осуществления способа.

Пример 1. Проводится оценка специфичности аллергической реактивности двух вариантов биологической модели микобактериальной инфекции, согласно настоящего способа и прототипа. Первый вариант предполагает введение морским свинкам термически инактивированных микобактерий [методика описана в авторском свидетельстве №1452368. Евглевский А.А. Способ моделирования туберкулезной аллергии у животных и птиц. Авторское свидетельство №1452368, 1988 г.]. Второй вариант предполагает введение морским свинкам авирулетных микобактерий М. bovis штамм БЦЖ [методика описана в ГОСТ 16739-88. Туберкулин сухой очищенный (ППД) для млекопитающих. - М: Изд-во стандартов. 21 с.]. Результаты оценки специфичности аллергической реактивности биологической модели предполагающей использование термически инактивированных микобактерий, через 24 часа после введения ППД туберкулинов см. табл. 1.

Результаты оценки биологической модели предполагающей использование живых авирулетных микобактерий М. bovis штамм БЦЖ, через 24 часа после введения ППД туберкулинов см. табл. 2.

Из полученных результатов видно, что модель микобактериальной инфекции предполагающая использование термически инактивированных микобактерий характеризуется проявлением кожной реакции ПЧЗТ на две дозы ППД для млекопитающих и две дозы ППД для птиц. При этом интенсивность реакции на используемые дозы ППД туберкулина для млекопитающих выше в отношении реакции на соответствующие дозы ППД для птиц у животных сенсибилизированных суспензией содержащей инактивированные микобактерий М. bovis. Данная модель характеризуется низкой специфичностью аллергической реактивности. Использование прототипа не позволяет оценить специфичность аллергической реактивности модели предполагающей использование термически инактивированных микобактерий.

Модель микобактериальной инфекции, предполагающая использование живых авирулентных микобактерий М. bovis штамм БЦЖ характеризуется проявлением кожной реакции ПЧЗТ на две дозы ППД для млекопитающих и одну дозу ППД для птиц. Согласно прототипу выявляется реакция на дозу ППД для млекопитающих.

Таким образом, модель предполагающая использование живых авирулентных микобактерий М. bovis штамм БЦЖ характеризуется высокой специфичностью аллергической реактивности. Использование прототипа не позволяет оценить специфичность аллергической реактивности моделей микобактериальных инфекций.

Пример 2. Проводится оценка чувствительности модели микобактериальной инфекции. Используется модель микобактериальной инфекции опосредованная внутрикожным введением живых авирулентных микобактерий [методика описана в ГОСТ 16739-88. Туберкулин сухой очищенный (ППД) для млекопитающих. - М: Изд-во стандартов. 21 с.]. Результаты интенсивности кожной реакции ПЧЗТ, через 24 часа после введения ППД туберкулинов см. табл. 3.

Определяя тангенс угла в отношении каждого животного с использованием значений интенсивности кожной реакции ПЧЗТ на 2 дозы ППД для млекопитающих (предлагаемый способ) получаются следующие значения: №1 - 0,8; №2 - 2,29; №3 - 3,75. Из чего следует, что морская свинка номер 3 характеризуется наибольшей чувствительностью. Таким образом, предлагаемый способ позволяет охарактеризовать чувствительность модели микобактериальной инфекции.

Пример 3. Проводится лабораторная диагностика микобактериальной инфекции животных, путем постановки биологической пробы с использованием морских свинок. Для чего от животного (корова) с подозрением на развитие микобактериальной инфекции (положительная аллергическая проба), отобрали биологический материал (кусочки лимфатических узлов) и приготовили суспензию по методу Аликаевой [Животные и птица сельскохозяйственные методы лабораторной диагностики туберкулеза, ГОСТ 26072-89. М.: Изд-во стандартов, 1989. 14 с.]. Суспензию в дозе 1 см³ подкожно в область паха ввели 5 морским свинкам, массой 300-500 гр. Через 30 дней, после введения суспензии 3 морским свинкам (согласно предлагаемого способа) на правой и левой боковых поверхностях депилировали шерсть размером 100 × 40 мм. Через 24 часов, после депиляции внутрикожно справа инъецировали две дозы ППД для млекопитающих (2,5 нг белка; 0,1 нг белка), расстояние между инъекциями 30 мм, слева инъецировали две дозы ППД для птиц (2,5 нг белка; 0,1 нг белка), расстояние между инъекциями 30 мм. Другим 2 морским свинкам (согласно прототипа) депилировали шерсть на боковой поверхности слева размером 40×40 мм и внутрикожно вводили ППД туберкулин для млекопитающих в дозе 0,5 нг белка. Через 24 часа, после инъекций туберкулинов осуществили учет реакции у всех животных. Результаты исследования, через 24 часа после введения ППД туберкулинов см. табл. 4.

Согласно предлагаемому способу одновременное проявление реакции на дозы 2,5 нг белка и 0,1 нг белка ППД для млекопитающих и на дозу 2,5 нг белка ППД для птиц и при интенсивности реакции на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих больше интенсивности реакции на дозу 2,5 нг белка ППД для птиц свидетельствует о развитии сенсибилизации морских свинок вызванной типичными микобактериями.

Прототип также предполагает наличие типичных микобактерий, но, учитывая то, что некоторые не типичные микобактерий способны вызывать состояние ПЧЗТ, точность прототипа ниже, в сравнении с предлагаемым способом. Последующие бактериологические исследования позволили типи-ровать возбудитель, выделенный из биологического материала как М. bovis.

Пример 4. Проводится лабораторная диагностика микобактериальной инфекции животных, путем постановки биологической пробы, с использованием морских свинок. Для чего от животного (корова) с подозрением на развитие микобактериальной инфекции (положительная аллергическая проба), отобрали материал (кусочки лимфатических узлов) и приготовили суспензию по методу Аликаевой [Животные и птица сельскохозяйственные методы лабораторной диагностики туберкулеза, ГОСТ 26072-89. М.: Изд-во стандартов, 1989. 14 с.]. Суспензию в дозе 1 см³ подкожно в область паха ввели 5 морским свинкам, массой 300-500 гр. Через 30 дней, после введения суспензии 3 морским свинкам (согласно предлагаемого способа) на правой и левой боковых поверхностях депилировали шерсть размером 100 × 40 мм. Через 24 часов, после депиляции внутрикожно справа инъецировали две дозы ППД для млекопитающих (2,5 нг белка; 0,1 нг белка), расстояние между инъекциями 30 мм, слева инъецировали две дозы ППД для птиц (2,5 нг. белка; 0,1 нг. белка), расстояние между инъекциями 30 мм. Другим 2 морским свинкам (согласно прототипу) депилировали шерсть на боковой поверхности слева размером 40×40 мм и внутрикожно вводили ППД туберкулин для млекопитающих в дозе 0,5 нг. белка. Через 24 часа, после инъекций туберкулинов осуществили учет реакции у всех животных. Результаты исследования, через 24 часа после введения ППД туберкулинов см. табл. 5.

Согласно предлагаемому способу проявление более интенсивной реакции на дозу 2,5 нг. ППД для птиц, в сравнении с ППД для млекопитающих свидетельствует о сенсибилизации морских свинок атипичными микобактериями.

Использование прототипа не позволяет сделать заключение о развитии микобактериальной инфекции обусловленной атипичными микобактериями, в то время как использование предлагаемого способа позволяет заключить, что животное инфицировано атипичными микобактериями. Последующие бактериологические исследования биологического материала позволили идентифицировать возбудитель как М. scrofulaceum (II группа по Ranyon).

Предложенный способ прост в исполнении, является более точным и информативным в сравнении с прототипом.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов. Для этого вводят в организм морских свинок-альбиносов или морских свинок с белыми боками материал, содержащий микобактерии или микобактериальные антигены. Последующее определение аллергической реактивности морских свинок, через 30-35 суток, осуществляется по проявлению и интенсивности кожной реакции ПЧЗТ через 24 часа после внутрикожного введения в правую боковую поверхность двух доз ППД для млекопитающих, содержащих 2,5 нг белка и 0,1 нг белка, а в левую боковую поверхность двух доз ППД для птиц, содержащих 2,5 нг белка и 0,1 нг белка. Изобретение обеспечивает повышение информативности и точности способа оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов. 5 табл., 4 пр.

Способ оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий и микобактериальных антигенов, включающий введение в организм морских свинок-альбиносов или морских свинок с белыми боками материала, содержащего микобактерии или микобактериальные антигены, отличающийся тем, что последующее определение аллергической реактивности морских свинок, через 30-35 суток, осуществляется по проявлению и интенсивности кожной реакции ПЧЗТ через 24 часа после внутрикожного введения в правую боковую поверхность двух доз ППД для млекопитающих, содержащих 2,5 нг белка и 0,1 нг белка, а в левую боковую поверхность двух доз ППД для птиц, содержащих 2,5 нг белка и 0,1 нг белка, следующим образом:

- проявление реакции ПЧЗТ только на дозу 2,5 нг белка или дозы 2,5 белка и 0,1 нг белка ППД для млекопитающих свидетельствует о развитии сенсибилизации морских свинок, вызванной типичными микобактериями;

- проявление реакции ПЧЗТ только на дозу 2,5 нг белка или дозы 2,5 белка и 0,1 нг белка ППД для птиц свидетельствует о развитии сенсибилизации морских свинок, вызванной атипичными микобактериями;

- одновременное проявление реакции на одну дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих и на одну дозу 2,5 нг белка ППД для птиц предполагает сравнение значений между собой, при интенсивности реакции выше на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих в сравнении с дозой 2,5 нг белка ППД для птиц свидетельствует о сенсибилизации типичными микобактериями, при интенсивности реакции ниже на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих в сравнении с дозой 2,5 нг белка ППД для птиц свидетельствует о сенсибилизации атипичными микобактериями;

- одновременное проявление реакции на дозы 2,5 нг белка и 0,1 нг белка ППД для млекопитающих и на дозу 2,5 нг белка ППД для птиц, и при интенсивности реакции на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих больше интенсивности реакции на дозу 2,5 нг белка ППД для птиц свидетельствует о развитии сенсибилизации морских свинок, вызванной типичными микобактериями;

- одновременное проявление реакции на дозы 2,5 нг белка и 0,1 нг белка ППД для птиц и на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих, и при интенсивности реакции на дозу 2,5 нг белка ППД для птиц больше интенсивности реакции на дозу 2,5 нг белка ППД для млекопитающих свидетельствует о развитии сенсибилизации морских свинок, вызванной атипичными микобактериями;

- одновременное проявление кожной реакции ПЧЗТ на две дозы ППД для млекопитающих и две дозы ППД для птиц свидетельствует о сенсибилизации животных типичными и атипичными микобактериями, а также о снижении специфичности аллергической реактивности морских свинок, обусловленном использованием термически инактивированных микобактерий.