СПОСОБ ЛИОФИЛИЗАЦИИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ Российский патент 2021 года по МПК G01N33/531 

Описание патента на изобретение RU2749355C1

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и, в частности, к способам стабилизации эритроцитарных диагностикумов путем лиофильного высушивания. Изобретение может быть использовано в биотехнологической схеме производства эритроцитарных диагностикумов лиофилизированных.

Разработка способов стабилизации эритроцитарных диагностикумов продолжает оставаться актуальной, так как их применение в лабораторной практике не предусматривает использование дорогостоящих импортных реактивов и оборудования. Жидкие формы выпуска препаратов дешевы и удобны в применении, так как не требуют лишних манипуляций при постановке реакции. Однако недостатком эритроцитарных диагностикумов в жидком виде является короткий срок годности (1 год) и отсутствие возможности осуществлять их транспортировку при критических температурных режимах (не соответствующих требованиям эксплуатационной документации). Нарушение температурного режима при хранении и транспортировке, как в сторону повышения, так и в сторону понижения температуры, могут приводить к полной потере активности. Кроме того, буферные растворы, содержащие клетки крови, чувствительны к присутствию микроорганизмов, поскольку являются хорошими субстратами для роста микробов.

Решить проблему стабилизации биологических препаратов для сохранения исходных свойств возможно применением метода лиофилизации. Сухие препараты - лиофилизаты не претерпевают химических изменений и сохраняют присущие им свойства при длительном хранении и в условиях критических значений температуры, вследствие чего отсутствует необходимость строгого соблюдения требований по транспортировке и хранению, увеличивается срок годности.

Сублимационное высушивание широко применяется для изготовления лиофилизатов микробных взвесей, антигенных фракций различной природы, иммунных сывороток, иммуноглобулинов, вакцин, антибиотиков, гормонов и т.д. Для каждого конкретного препарата подбираются среды высушивания, отрабатываются индивидуальные режимы замораживания и сушки.

Накоплено достаточно данных о стабилизации высушиванием компонентов крови и препаратов, полученных из крови животных. Известен способ получения лиофилизированного препарата - кровь гемолизированная [1]. Препарат охлаждают в ампулах до температуры минус (45±5)°С, с последующим промораживанием (криостабилизацией) 18-20 ч и лиофилизацией в течение 24 ч до конечной температуры материала 25°С, при этом стадия сублимации в среднем составляет 14 ч, десорбции - 10 ч.

Недостатком способа является длительность процесса лиофилизации.

Известен способ получения противотуляремийной гипериммунной сыворотки и способ получения диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового сухого [2]. Установленные в кассеты ампулы с диагностикумом помещают на полки сублимационной камеры аппарата лиофильной сушки "МАСС-5" предварительно охлажденных до температуры минус (30±2)°С. Камеру герметично закрывают. Диагностикум замораживают в течение (2,5±0,5) ч до достижения температуры материала не выше минус 25°С, затем создают в камере вакуум, поддерживаемый в течение всего процесса лиофильного высушивания на уровне 1,1-1Торр (13,33 н/м2). Через (2±0,5) ч включают подогрев всех полок. Через 1 ч полки прогреваются до температуры (28±1)°С, поддерживаемой до конца лиофильного высушивания, при этом температура в ампуле с диагностикумом через (13±1) ч также достигает (28±1)°С, после чего лиофильное высушивание продолжают в течение (6±0,5) ч. Продолжительность лиофильного высушивания диагностикума - (21±1) ч. По окончании процесса ампулы запаивают и контролируют качество сухого диагностикума.

Недостатком способа является то, что замораживание препарата проводится при недостаточно низкой температуре, а резкий подъем температуры полки (через 1 ч полки прогреваются до температуры (28±1)°С), может отрицательно повлиять на качество биоматериала. Следующий недостаток - длительность процесса лиофилизации.

Наиболее близким к предлагаемому способу можно считать следующий известный способ лиофильной сушки эритроцитарного диагностикума [3], включающий глубокое замораживание препарата, перемещение в камеру для лиофилизации и его дальнейшую сублимацию в условиях вакуума с последующим формированием лиофилизата. Препарат переводят в среду высушивания, состоящую из раствора реополиглюкина 15 мас. %, сахарозы 7,5 мас. % в дистиллированной воде. Температура полки и давление в камере для сублимации не изменяются первые 8 ч и составляют соответственно 15°С и 30 Па, затем в течение последующих 14 ч плавно меняются со скоростью (2,6±0,4)°С/ч и (2±0,1) Па/ч до 22°С и 3 Па. При указанных параметрах лиофильное высушивание продолжается не менее 3 ч. Время лиофилизации 22-24 ч.

Недостатком способа является длительность процесса лиофилизации.

Целью работы стала оптимизация режимов сублимационного высушивания эритроцитарных диагностикумов и получение качественного препарата с увеличенным сроком годности и возможностью транспортирования при любых значениях температуры.

Все процессы лиофилизации (замораживание, сублимация, досушивание, герметизация) являются обязательными и от правильно подобранных параметров данных процессов зависит получение стабильных препаратов без потери их специфической активности.

Технический результат достигается тем, что серии диагностикумов эритроцитарных (антигенного/иммуноглобулинового) переводят в ранее разработанную нами среду высушивания [4], хорошо перемешивают, разливают в стерильные ампулы марки ШПВ-6 по 1 мл 10% взвеси диагностикума (каждая серия объемом по 50 ампул) и переносят в морозильный стол для замораживания.

Замораживание материала при нормальном атмосферном давлении в морозильном столе является начальным этапом лиофилизации препаратов и должно быть проведено таким образом, чтобы продукт имел желаемую кристаллическую структуру и температура продукта была ниже, чем температура полного затвердевания (эвтектическая). Так, при температурах выше эвтектической точки в присутствии солей в белковых растворах может произойти денатурация белка. Однако слишком низкая температура значительно увеличивает продолжительность процесса сушки. Поэтому замораживание проводили в течение 16-18 ч при оптимальной температуре, которая составила минус (40±1)°С, т.е. ниже эвтектической точки, что позволяет предотвратить оттаивание продукта в процессе лиофилизации.

Для сублимационного высушивания использовали лиофильную установку камерного типа Alpha 2-4 с 2 полками в комплекте и с вакуумным насосом Martin Christ. Первоначально выставляли параметры камеры, запускали в работу насос на 15 мин, быстро перегружали замороженный в ампулах препарат в вакуумную камеру сублимационной установки и включали вакуум.

В лиофильной камере, кроме датчиков контроля температуры продукта, предусмотрены датчики температуры поверхности полок, датчик температуры конденсатора и вакуумный датчик, регистрирующий давление в камере. При включении вакуума происходило снижение давления в камере. На данном этапе отмечалось незначительное изменение температуры замороженного материала за счет отвода тепла сублимации, который осуществлялся при давлении 0,15-0,20 мбар (15-20 Па) в сушильной камере без подвода тепла к просушиваемому материалу. При включении нагрева полок за счет контактного поступления тепла через полку к продукту температура последнего начинала повышаться. Происходило интенсивное испарение влаги из продукта.

Продолжительность процесса сублимационной сушки, во время которого температура высушиваемого материала достигала температуры минус 10°С, составляла 2±0,5 ч. Этот период характеризовался большой интенсивностью тепло- и массообмена. Так как движущей силой процесса сублимации является разность парциального давления насыщенных паров материала и конденсатора или разность соответствующих этим давлениям температур материала и конденсатора. Во время сублимации строго поддерживалось низкое давление в камере, порядка 0,15-0,20 мбар (10-20 Па), с температурой конденсатора (десублиматора) - минус 80-90°С.

Плавное повышение температуры препарата от минус 10°С до 10°С занимало оптимальное для препарата время - 3±0,5 ч.

Этап десорбции, т.е. удаление связанной влаги, происходил медленно, что являлось следствием увеличения энергии связи влаги с материалом. Для диагностикума (50 ампул по 1 мл 10% взвеси в ампуле) - 4±0,5 ч. Температура препарата постоянно росла до значения максимальной температуры досушивания, т.е. равновесного влагосодержания, практически равного остаточной влажности. Оптимальная температура препарата на этом этапе составляет 25-26°С. Терминальный период процесса сушки происходил до момента приближения регистрированных значений к заданным параметрам, которые не менялись в течение 3-4 ч и соответственно равнялись следующим показателям: температура конденсатора - минус 80-90°С; температура полок 30°С, вакуум 15-20 Па, температура продукта 25-26°С, время лиофилизации - 12-13 ч (рисунок 1).

После завершения процесса высушивания препарат извлекали из камеры. Ампулы с препаратом запаивали на газо-кислородной горелке в среде атмосферного воздуха. Отбирали образцы из каждой серии для контроля.

Согласно медико-биологическим требованиям, потеря в массе при высушивании биологических препаратов должна быть не более 3%. Так как все биопрепараты в лиофилизированном состоянии обладают высокой степенью гидрофильности, мы проводили расфасовку и укупорку диагностикума в сухом помещении.

Оценку качества готовых лиофилизатов проводили по следующим показателям: внешний вид (структура и цвет таблетки в ампуле); растворимость (регидратация), цветность и прозрачность; значение рН после растворения; потеря в массе при высушивании; чувствительность и специфичность препарата в РНГА.

1. Внешний вид. Сухой препарат представляет собой аморфную массу коричневого цвета в форме таблетки, без признаков микрооттаивания.

2. Растворимость. Содержимое ампулы с препаратом полностью растворяется в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, время растворения 1-2 мин. После растворения - жидкость насыщенно-коричневого цвета. При отстаивании в течение 2-3 ч образовалось два слоя: бесцветная прозрачная надосадочная жидкость и осадок коричневого цвета, разбивающийся при встряхивании.

3. рН раствора 6,5±0,2.

4. Потеря в массе при высушивании не более 2,5±0,2%.

5. Чувствительность и специфичность препаратов.

Для диагностикума эритроцитарного туляремийного антигенного установлена чувствительность (набор выявлял в РНГА специфические антитела в сыворотке диагностической туляремийной агглютинирующей в разведении 1:20000 - макрометодом и 1:10000 - микрометодом и в реакции нейтрализации антител (РНАт) культуры F. tularensisB концентрациях, эквивалентных по отраслевому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России 7,8×105м.к./мл макрометодом и 1,56×106 м.к./мл - микрометодом) и специфичность (набор не давал положительных результатов в РНГА с гетерологичными диагностическими сыворотками: холерной 01 адсорбированной сухой для реакции агглютинации (РА), поливалентной сальмонеллезной адсорбированной сухой О- для РА (А, В, С, Д, Е) и бруцеллезной адсорбированной агглютинирующей сухой в разведении до их титра).

Для диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового установлена чувствительность, диагностикум обеспечивает выявление в РНГА F.tularensis в концентрациях, эквивалентных по отраслевому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России 1,95×105-3,9×105 м.к./мл макрометодом и 7,8×105-1,56×106 м.к./мл микрометодом; в реакции нейтрализации антигена (РНАг) - антитела в сыворотке диагностической туляремийной агглютинирующей в разведении не менее 1:16000 - макрометодом, не менее 1:8000 - микрометодом) и специфичность (набор не давал положительных результатов в РНГА с гетерологичными штаммами: В. abortus 544, В. melitensis 16-М, В. suis 1330, Y. enterocolitica 64, 178, 383 в концентрациях, эквивалентных по отраслевому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России 1,0×108 м.к./мл).

Таким образом, отработан эффективный режим лиофилизации (12-13 ч): замораживание препаратов при температуре минус (40±1)°С, сокращение времени удаления не только свободной, но и связанной воды в препарате за счет глубокого вакуума -15-20 Па, плавного (до 25-26°С) подвода тепла и низкой температуры конденсатора - минус 80-90°С, тем самым исключено оттаивание и вспенивание препарата при сохранении физико-химических (растворимость, прозрачность, цветность, потеря в массе при высушивании) и иммунобиологических свойств препаратов (чувствительность, специфичность), по всем показателям полностью удовлетворяющим требованиям нормативной документации.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Получали 50 мл 10% взвеси диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового туляремийного. Для этого диагностикум центрифугировали и осадок растворяли в среде высушивания, состоящей из 50 мл полиглюкина (6% раствора декстрана) с 1,6 мл твин-80 в разведении 1:50 и 5 мг азида натрия [4], замораживали 16-18 ч при температуре минус (40±1)°С и лиофилизировали, при постепенном подъеме температуры полки, до конечной температуры материала 25°С, выдерживали при данных параметрах 3 ч. Общее время лиофилизации - 12 ч. Герметизацию ампул после лиофилизации осуществляли в атмосфере осушенного очищенного воздуха при нормальном атмосферном давлении.

После чего препарат помещали в условия разных температурных режимов (24°С, 37°С, минус 4°С) и контролировали каждые 3 месяца в течение 1,5 лет (срок наблюдения). Лиофилизированный диагностикум растворяли в 0,9% растворе натрия хлорида и контролировали в РНГА. Препарат сохранял свою первоначальную чувствительность и специфичность. Отрицательного влияния различных температур не выявлено. Чувствительность - препарат обеспечивает выявление в РНГА F.tularensis в концентрациях, эквивалентных по отраслевому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России_1,95×105-3,9×105 м.к./мл макрометодом и 7,8×105-1,56×106 м.к./мл микрометодом, при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами.

Пример 2. Выполняли аналогично примеру 1, за исключением того, что получали диагностикум эритроцитарный антигенный туляремийный. Лиофилизированный диагностикум растворяли в 0,9% растворе натрия хлорида и ставили РНГА. Препарат сохранял свою первоначальную чувствительность и специфичность. Отрицательного влияния различных температур не выявлено. Чувствительность препарата в РНГА сохранялась и составила 1:20000 - макрометодом, при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными сыворотками.

Таким образом, для предотвращения разрушения жидких эритроцитарных диагностикумов во время транспортировки при температуре ниже регламентированных, препараты стабилизировали путем добавления к ним защитной среды при осуществлении лиофилизации с отработанным режимом сушки. Разработанный способ позволяет ускорить и упростить процесс получения стабильных диагностикумов при сокращении материальных и трудовых затрат, увеличивая срок годности препаратов.

При оценке качества серий лиофилизированных эритроцитарных диагностикумов, полученных по разработанной технологии лиофилизации на протяжении 18 мес установлено отсутствие изменений показателей качества. Изучение стабильности препаратов в процессе хранения продолжается. Минимальный срок годности полученных препаратов составляет 1,5 года (срок наблюдения) и может быть увеличен при накоплении экспериментальных данных, в то время как срок годности жидких препаратов - 1 год. Лиофилизированные эритроцитарные диагностикумы, полученные заявляемым способом, при хранении стабильно сохраняют физико-химические и иммунобиологические свойства (таблица 1, таблица 2).

Используемая литература

1. Патент РФ №2455014 Способ получения лиофилизированного препарата кровь гемолизированная. - Опубл. 10.07.2012. Бюл. №19.

2. Патент РФ №2240822. Способ получения противотуляремийной гипериммунной сыворотки и способ получения диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового сухого. - Опубл. 27.11.2004. Бюл. №33.

3. Патент РФ №2476791. Способ лиофильной сушки эритроцитарного диагностикума. - Опубл.27.02.2013. Бюл. №2.

4. Патент РФ №2708636 Универсальная среда высушивания для стабилизации эритроцитарных диагностикумов туляремийных. - Опубл. 10.12.2019. Бюл. №34.

Похожие патенты RU2749355C1

название год авторы номер документа
УНИВЕРСАЛЬНАЯ СРЕДА ВЫСУШИВАНИЯ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ 2019
  • Жарникова Ирина Викторовна
  • Курчева Светлана Александровна
  • Жданова Елена Владимировна
  • Тюменцева Ирина Степановна
  • Афанасьев Евгений Николаевич
  • Жарникова Татьяна Владимировна
  • Старцева Ольга Леонидовна
  • Кошкидько Александра Геннадьевна
  • Геогджаян Анна Самвеловна
  • Гаркуша Юлия Юрьевна
RU2708636C1
СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ТУЛЯРЕМИЙНОГО 2020
  • Жарникова Ирина Викторовна
  • Кошкидько Александра Геннадьевна
  • Курчева Светлана Александровна
  • Жданова Елена Владимировна
  • Старцева Ольга Леонидовна
  • Тюменцева Ирина Степановна
  • Афанасьев Евгений Николаевич
  • Семирчева Анастасия Александровна
  • Геогджаян Анна Самвеловна
  • Красовская Татьяна Леонидовна
RU2747420C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ РАЗВОДЯЩЕЙ ЖИДКОСТИ И СРЕДЫ ВЫСУШИВАНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ И ЛАТЕКСНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ 2009
  • Жарникова Ирина Викторовна
  • Тюменцева Ирина Степановна
  • Афанасьев Евгений Николаевич
  • Зайцев Александр Алексеевич
  • Жарникова Татьяна Владимировна
  • Левченко Наталья Витальевна
  • Кочарян Анна Самвеловна
RU2395094C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОТУЛЯРЕМИЙНОЙ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ЭРИТРОЦИТАРНОГО ТУЛЯРЕМИЙНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО СУХОГО 2002
  • Левчук Б.А.
  • Пятков В.А.
  • Пекшев А.В.
  • Кузнецов С.Л.
RU2240822C2
СПОСОБ ЛИОФИЛЬНОЙ СУШКИ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА 2011
  • Пушкарь Владимир Георгиевич
  • Новицкая Ирина Вячеславовна
  • Кулаков Михаил Яковлевич
  • Павлова Ксения Александровна
  • Степурина Анастасия Михайловна
RU2476791C1
ДИАГНОСТИКУМ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНЫЙ ЭРИТРОЦИТАРНЫЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫЙ 2008
  • Бывалов Андрей Анатольевич
  • Елагин Георгий Дмитриевич
  • Печёнкин Денис Валерьевич
RU2377308C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ЭРИТРОЦИТАРНОГО САПНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО 2017
  • Савина Елена Владимировна
  • Новицкая Ирина Вячеславовна
  • Храпова Наталья Петровна
  • Кулаков Михаил Яковлевич
  • Топорков Андрей Владимирович
  • Викторов Дмитрий Викторович
RU2658434C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО ПРЕПАРАТА КРОВЬ ГЕМОЛИЗИРОВАННАЯ 2011
  • Аленкина Татьяна Владимировна
  • Красичков Геннадий Гаврилович
  • Синицына Наталия Викторовна
  • Костылева Наталья Ивановна
  • Иванов Юрий Васильевич
  • Никифоров Алексей Константинович
RU2455014C1
Способ получения бруцеллезного полистирольного латексного диагностикума 2022
  • Курноскина Мария Михайловна
  • Жарникова Ирина Викторовна
  • Русанова Диана Владимировна
  • Курчева Светлана Александровна
  • Кошкидько Александра Геннадьевна
  • Даурова Алина Викторовна
  • Пономаренко Дмитрий Григорьевич
  • Жданова Елена Владимировна
  • Жарникова Татьяна Владимировна
  • Беседин Артём Викторович
RU2798124C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНЫХ АНТИГЕННЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БРУЦЕЛЛЕЗА, ТУЛЯРЕМИИ 2021
  • Евченко Анна Юрьевна
  • Жарникова Ирина Викторовна
  • Курчева Светлана Александровна
  • Русанова Диана Владимировна
  • Пономаренко Дмитрий Григорьевич
  • Катибина Ирина Сергеевна
  • Кошкидько Александра Геннадьевна
  • Жарникова Татьяна Владимировна
  • Курноскина Мария Михайловна
  • Жданова Елена Владимировна
  • Семирчева Анастасия Александровна
RU2777803C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 749 355 C1

Реферат патента 2021 года СПОСОБ ЛИОФИЛИЗАЦИИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стабилизации эритроцитарных диагностикумов путем лиофильного высушивания. Перед замораживанием и лиофилизацией диагностикумы центрифугируют и осадок ресуспендируют в равном объеме среды высушивания. Замораживают препараты при температуре минус (40±1)°С; время удаления не только свободной, но и связанной воды в препарате, во время лиофилизации, сокращается за счет глубокого вакуума - 15-20 Па, плавного (до 25°С) подвода тепла и низкой температуры конденсатора - минус 80-90°С, тем самым исключено оттаивание и вспенивание препарата. Изобретение позволяет увеличить срок годности препарата с сохранением его качественных характеристик. При рентабельном режиме лиофилизации (12-13 ч). 2 табл., 1 ил.

Формула изобретения RU 2 749 355 C1

Способ лиофилизации эритроцитарного туляремийного диагностикума, включающий глубокое замораживание препарата, перемещение его в камеру для лиофилизации и его дальнейшую сублимацию в условиях вакуума с последующим формированием лиофилизата, отличающийся тем, что замораживание препаратов проводилось при температуре минус (40±1)°С; лиофилизация осуществлялась при сокращении времени удаления не только свободной, но и связанной воды в препарате за счет глубоко вакуума - 15-20 Па, плавного (до 25°С) подвода тепла и низкой температуры конденсатора - минус 80-90°С и при указанных параметрах выдерживают 12-13 часов.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2021 года RU2749355C1

СПОСОБ ЛИОФИЛЬНОЙ СУШКИ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА 2011
  • Пушкарь Владимир Георгиевич
  • Новицкая Ирина Вячеславовна
  • Кулаков Михаил Яковлевич
  • Павлова Ксения Александровна
  • Степурина Анастасия Михайловна
RU2476791C1
УНИВЕРСАЛЬНАЯ СРЕДА ВЫСУШИВАНИЯ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ 2019
  • Жарникова Ирина Викторовна
  • Курчева Светлана Александровна
  • Жданова Елена Владимировна
  • Тюменцева Ирина Степановна
  • Афанасьев Евгений Николаевич
  • Жарникова Татьяна Владимировна
  • Старцева Ольга Леонидовна
  • Кошкидько Александра Геннадьевна
  • Геогджаян Анна Самвеловна
  • Гаркуша Юлия Юрьевна
RU2708636C1
US 6294365 B1,25.09.2001.

RU 2 749 355 C1

Авторы

Кошкидько Александра Геннадьевна

Жарникова Ирина Викторовна

Курчева Светлана Александровна

Жданова Елена Владимировна

Семирчева Анастасия Александровна

Геогджаян Анна Самвеловна

Жарникова Татьяна Владимировна

Старцева Ольга Леонидовна

Богданова Юлия Викторовна

Даты

2021-06-09Публикация

2020-07-17Подача