УНИВЕРСАЛЬНАЯ СРЕДА ВЫСУШИВАНИЯ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и в частности, к разработке универсальной среды высушивания для стабилизации эритроцитарных диагностикумов туляремийных, используемой также в качестве разводящей жидкости при постановке реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Метод лиофилизации (сублимации) применяют для производства препаратов, которые нестабильны при изменениях температуры и при длительном хранении. Препараты в лиофилизированной форме становятся более устойчивыми к факторам внешнего воздействия с сохранением первоначальных свойств. Процесс лиофилизации состоит из предварительного замораживания препарата, первичного высушивания, досушивания, укупорки ампул (флаконов) с высушенным препаратом. Для сохранения исходных свойств препаратов в процессе замораживания, лиофильной сушки и последующем хранении используют различные защитные среды (стабилизаторы). Для каждого препарата подбирается индивидуальная среда высушивания, она должна обеспечивать получение качественного сухого материала, иметь структурообразующий эффект, а также позволять проводить постановку РНГА с восстановленным диагностикумом без использования разводящей жидкости с сохранением первоначальных свойств. Качество лиофилизатов можно оценить по следующим основным показателям: характерная структура высушенного материала без признаков микрооттаивания; потеря в массе при высушивании, не превышающая 3%; быстрая растворимость препарата (1-2 мин); исходная вязкость препарата после растворения; рН среды; сохранение активности, специфичности и других свойств препаратов.

В качестве сред высушивания возможно применение желатина, сахарозы, поливинилпирролидона, обеспечивающих мелкопористую, достаточно плотную структуру. В качестве разводящей жидкости при постановке РНГА применяют сыворотку крови животных: нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) или нормальную кроличью сыворотку (НКС), растворы неионных поверхностно-активных веществ (ПАВ) и др.

Известен способ сублимационного высушивания диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового, осуществляемый с использованием защитной среды, со следующим составом (мас. %): сахароза - 10; бычий сывороточный альбумин - 1; натрий тетраборнокислый - 1; янтарная кислота - 0,3; натрия азид - 0,1; дистиллированная вода - остальное [1]. Полученный диагностикум обладает высокой активностью, специфичностью, стабильностью. Недостатком представленного способа является многокомпонентный состав среды с чувствительностью полученного диагностикума не выше 3,12×10⁶ м.к./мл.

Известен способ получения защитной среды для лиофилизации эритроцитарных диагностикумов, состоящий из получения раствора реополиглюкина 15 мас. % и сахарозы 7,5 мас. % в дистиллированной воде [2]. Полученные диагностикумы обладают высокой активностью, стабильностью. Однако, существенным недостатком применения указанной среды высушивания, не имеющей в составе консерванта при наличии высокого содержания углеводов, может стать невозможность продолжительного хранения препарата после восстановления из-за создания благоприятных условий для микробного пророста. Так же в составе среды отсутствуют необходимые для постановки РНГА растворы неионных ПАВ или сыворотки крови животных.

Наиболее близкой к заявляемой универсальной среде можно считать среду высушивания эритроцитарных диагностикумов, также используемую в качестве разводящей жидкости, полученную из раствора белка куриного яйца в 5%-ном растворе натрия фосфорнокислого трехзамещенного 12-водного (Na₃PO₄×12H₂O) (1:2) с последующим кипячением на водяной бане в течение 10 мин, разведением 1:1000 в дистиллированной воде и добавлением азида натрия до 0,001% [3]. Полученные диагностикумы обладают высокой чувствительностью, стабильностью. Недостатком данной среды высушивания является применение в качестве основного компонента биологического материала, такого как, белок куриного яйца, качество и стандартные показатели которого могут изменяться в зависимости от категории и сорта.

Задачей изобретения является получение универсальной среды высушивания, используемой также в качестве разводящей жидкости для постановки РНГА. Это позволит упростить постановку реакции, увеличить срок годности эритроцитарного диагностикума с сохранением его первоначальных характеристик (специфической активности и высокой чувствительности) после регидратации, и расширить температурный диапазон транспортировки потребителям в сравнении с жидкой формой препаратов, выпускаемых ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора по ТУ 9388-023-01897080-2010, 9388-022-01897080-2010.

Поставленная задача решается приготовлением среды высушивания, представляющей собой раствор, имеющий в составе: полиглюкин, представляющий собой 6% коллоидный раствор полимера декстрана с молекулярной массой 60000±10000, который предохраняет эритроцитарные диагностикумы от разрушения во время замораживания и позволяет получить мелкопористую структуру материала с хорошей растворимостью; неионный ПАВ (раствор твин-80), позволяющий после растворения препарата проводить постановку РНГА с использованием 0,9% раствора натрия хлорида, исключив приготовление разводящей жидкости; азид натрия - дает возможность использовать препарат длительное время после растворения (более 1 мес. - срок наблюдения). Следующим этапом является подготовка препарата к лиофилизации: в осадок отцентрифугированного эритроцитарного диагностикума вводят подготовленный раствор с последующим розливом, замораживанием, сублимационным высушиванием, герметизацией и маркировкой ампул с полученным продуктом.

На заключительном этапе лиофилизаты подвергают контрольным исследованиям для подтверждения соответствия требованиям, заложенным в нормативных документах на готовую продукцию.

Технический результат изобретения заключается в приготовлении среды высушивания диагностикумов эритроцитарных туляремийных, используемой также в качестве разводящей жидкости при постановке реакции, которую готовят следующим образом: к 50 мл полиглюкина (ЛС-001462 от 31.03.2006 г.) добавляют 1,6 мл 2,0% раствора твин-80 (Sigma-Aldrich, США) приготовленного в 0,9% растворе натрия хлорида и 5 мг азида натрия (ГОСТ 84-1420-77), перемешивают до полного растворения компонентов. Затем колбу с раствором выдерживают 15-20 мин при (22±4)°С. При подготовке к лиофилизации диагностикумы эритроцитарные туляремийные, приготовленные в качестве экспериментальных серий в соответствии с утвержденными нормативными документами центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин, образовавшийся осадок ресуспендируют в равном объеме свежеприготовленного раствора среды высушивания при встряхивании 15-20 мин.

Разработанная среда высушивания позволит создать оптимальные условия для предотвращения агрегации эритроцитов, сохранить первоначальные свойства диагностикумов эритроцитарных туляремийных в течение всего срока хранения (не менее 1 года - срок наблюдения 18 мес.), не зависимо от условий транспортировки, и проводить реакцию, после регидратации содержимого ампул с препаратом, в 0,9% растворе натрия хлорида без введения в реакцию разводящей жидкости.

При отработанных параметрах были получены препараты с чувствительностью в РНГА 1×10⁵ м.к./мл для иммуноглобулинового диагностикума и 1:40000 - для антигенного, при отсутствии перекрестных реакций с контрольными гетерологичными штаммами и сыворотками, что полностью удовлетворяет требованиям нормативной документации на эритроцитарные диагностикумы.

Для контроля использовали штаммы из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» (Francisella (F.) tularensis 15 НИИЭГ, F. tularensis F. tularensis 144/713, F. tularensis 319/38, F. tularensis 122, Brucella abortus 19 BA, Yersinia enterocolitica 383, Salmonella typhymurium 9640, Escherihia coli 113-3) и коммерческие сыворотки (сыворотка диагностическая туляремийная сухая, сыворотка диагностическая холерная 01 адсорбированная сухая, сыворотка диагностическая сальмонеллезная О-поливалентная редких групп, сыворотка диагностическая бруцеллезная поливалентная жидкая).

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. При подготовке к лиофилизации 50 мл 5% диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового туляремийного приготовленного в качестве экспериментальной серии согласно утвержденным нормативным документам (ПР №01897080-15-10) центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин и образовавшийся осадок растворяют в свежеприготовленном растворе среды высушивания, состоящем из 50 мл полиглюкина с добавлением 1,6 мл 2,0% раствора твин-80, приготовленного в 0,9% растворе натрия хлорида, имеющей температуру (22±4)°С и 5 мг азида натрия, перемешивают до полного растворения содержимого. Колбу с раствором выдерживают 15-20 мин при (22±4)°С, замораживают при температуре минус 40°С и лиофилизируют в соответствии с разработанными протоколами сублимационного высушивания. После проведения контрольных исследований полученных экспериментальных серий, проводят испытания по определению стабильности показателей качества препарата, в условиях, отличающихся от традиционных условий хранения (5±3)°С. Для этого образцы изготовленного диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового туляремийного сухого выдерживали при различных температурных режимах (22±4°С, 37±1°С и минус 4±1°С) и контролировали каждые 3 месяца в течение 18 мес. (срок наблюдения) на соответствие показателей качества требованиям нормативной документации. При постановке РНГА (макрометодом по традиционной схеме, без использования разводящей жидкости) с испытуемыми экспериментальными сериями отмечается полное сохранение первоначальных физико-химических свойств препарата (при встряхивании - гомогенная взвесь коричневого цвета без признаков конгломерации), его активности и специфичности. Отрицательного влияния вышеуказанных температур на результаты контролируемых показателей не выявлено. Активность диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового туляремийного в РНГА с контрольными штаммами вида Francisella tularensis составила 1×10⁵ м.к./мл. При контроле специфичности отмечалось отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными штаммами.

Пример 2. Выполняли аналогично примеру 1, за исключением того, что получали экспериментальные серии диагностикума эритроцитарного антигенного туляремийного в соответствии с утвержденными нормативными документами (ПР №01897080-14-10). Получены результаты, аналогичные примеру 1. Активность диагностикума эритроцитарного антигенного туляремийного сухого с контрольной сывороткой туляремийной в РНГА составила 1:40000. При контроле специфичности отмечалось отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными сыворотками.

Таким образом, с целью стабилизации основных свойств жидких форм эритроцитарных препаратов была разработана универсальная среда высушивания для получения лиофилизированных форм эритроцитарных диагностикумов туляремийных, позволяющая сохранять первоначальные свойства препарата в течение установленного срока хранения (не менее 1 года - срок наблюдения), не зависимо от температурных условий транспортировки. Описанная среда высушивания может с успехом быть использована в качестве разводящей жидкости в РНГА, упрощая постановку реакции при увеличении срока годности (не менее 1 мес. - срок наблюдения) регидратированных препаратов с сохранением их специфической активности. При отработанных параметрах получены диагностикумы эритроцитарные туляремийные (иммуноглобулиновые/антигенные) с высокой специфической активностью, что полностью удовлетворяет установленным требованиям нормативной документации.

Список литературы

1. Кузнецов С.Л., Левчук Б.А., Пекшев А.В., Пятков В.А. Способ получения противотуляремийной гипериммунной сыворотки и способ получения диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового сухого. Патент №2240822 от 27.11.2004.

2. Пушкарь В.Г., Новицкая И.В., Кулаков М.Я., Павлова К.А., Степурина A.M. Способ лиофильной сушки эритроцитарного диагностикума. Патент №2476791 от 27.02.2013.

3. Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Зайцев А.А., Жарникова Т.В., Левченко Н.В., Кочарян А.С. Способ получения раствора, используемого в качестве разводящей жидкости и среды высушивания эритроцитарных и латексных диагностикумов. Патент №2395094. Опубликовано 20.07.2010. Бюл. №20.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Раскрыта универсальная среда высушивания для стабилизации эритроцитарных диагностикумов туляремийных, используемая также в качестве разводящей жидкости, состоящая из 50 мл полиглюкина с добавлением 1,6 мл 2,0% раствора твин-80, приготовленного в 0,9% растворе натрия хлорида, и 5 мг азида натрия с последующим перемешиваем до полного растворения компонентов при температуре (22±4)°С. Изобретение позволяет упростить постановку реакции за счет использования среды для высушивания в качестве разводящей жидкости, увеличить срок годности эритроцитарного диагностикума с сохранением его первоначальных характеристик после регидратации и расширить температурный диапазон транспортировки потребителям в сравнении с жидкой формой препаратов. 2 пр.

Универсальная среда высушивания для стабилизации эритроцитарных диагностикумов туляремийных, используемая одновременно в качестве разводящей жидкости и среды высушивания диагностикумов, состоящая из 50 мл полиглюкина с добавлением 1,6 мл 2,0% раствора твин-80, приготовленного в 0,9% растворе натрия хлорида, и 5 мг азида натрия, с последующим перемешиванием при температуре (22±4)°С до полного растворения компонентов.