Способ получения бруцеллезного диагностикума Российский патент 2024 года по МПК A61K39/10 G01N33/569 

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и биотехнологии, а именно к получению диагностических препаратов, и может быть использовано для получения сухого цветного диагностикума, предназначенного для выявления антител к бруцеллезному антигену в микрореакции агглютинации (MPA) и в пластинчатой реакции агглютинации на стекле.

Получение бруцеллезных диагностикумов, обладающих высокой активностью, специфичностью, удобных в использовании, транспортировке, имеющих длительный срок хранения, время получение которых сокращено, производство отвечает современным требованиям безопасности, остается актуальной задачей.

Известен способ получения бруцеллезного диагностикума, включающий смыв двухсуточной агаровой культуры вакцинного штамма В.abortus 19 В А 0,9% раствором натрия хлорида и доведение до концентрации 20-30 млрд м.к./мл, добавление равного объема 2% раствора формалина с таким расчетом, чтобы микробная взвесь содержала 1% формалина, проведение инактивации при температуре 22°С в течение двух часов, отмывание микробной взвеси от формалина два раза путем центрифугирования при 7000 об/мин в течение 30 мин. Затем в стаканы с отмытой микробной взвесью наливают 0,9% раствор натрия хлорида до первоначального объема и равный объем 0,04% раствора гематоксилина Караци. Флакон со взвесью тщательно встряхивают, помещают в водяную баню, нагретую до температуры 56°С и оставляют на 16-18 часов. После указанной экспозиции окрашенную микробную взвесь освобождают от посторонних примесей (кусочки агара, крупные частицы краски и т.д.) центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость, содержащую окрашенную микробную взвесь, разливают в чистые стаканы и центрифугируют при 7000 об/мин 30 мин. Супернатант сливают в раствор 3% хлорамина. Осадок, содержащий окрашенную микробную массу, ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида рН 7,2 и центрифугируют в тех же условиях. Отмывание окрашенных бактерий повторяют 3-4 раза. В стаканы с отмытыми окрашенными бактериями сначала наливают небольшой объем 0,1% раствора формалина, перемешивают, полученную взвесь переносят в стерильный градуированный флакон и доводят до первоначального объема. Затем добавляют стабилизатор 1,5% водный раствор поливи-нилпирролидона (ПВП) и 7% раствор сахарозы, взятые в соотношении 1:1, или 0,03% раствор карбонатного буфера и 3% раствор сахарозы, взятые в соотношении 1:1 в количестве 0,1 мл на 1 мл диагностикума, и лиофильно высушивают в стандартных условиях. (Патент РФ №2269360, МПК А61К 39/10, G01N 33/569, Опубликовано: 10.02.2006, Бюл. №4). Процесс лиофилизации (стандартные условия лиофилизации) включает замораживание в низкотемпературном холодильнике при температуре охлажденного воздуха минус (45±5)°С, при этом средняя скорость замораживания составляет (0,2-0,5)°С в секунду, а время замораживания при указанной температуре от 10 до 22 часов. После окончания стадии замораживания кассеты (ампулы) с диагностикумом перегружаются в предварительно подготовленный к сушке лиофильный аппарат. Процесс высушивания длится 22-26 часов с таким расчетом, чтобы температура диагностикума перешла нулевую отметку (0°С) на 12-14 часу от начала высушивания (стадия удаления несвязанной воды). Конечная температура досушивания диагностикума (30±2)°С, вакуум в процессе сушки на стадии удаления несвязанной воды от 26 Па до 10 Па, а во время досушивания (5±3) Па. Температура десублиматора в процессе лиофилизации минус (75±5)°С. Общее время процесса лиофилизации, включающего стадии замораживания и сушки составило - 32-48 часов. (Промышленный регламент на производство диагностикума туляремийного цветного сухого для реакции агглютинации (РА) на стекле и микрореакции агглютинации (MPA), ПР 01898090-010-11, срок действия с 14.10.2011 г., с. 51-52).

Активность полученного по способу-прототипу бруцеллезного диагностикума: в МРА титр антител составлял 1:3000±200, в пластинчатой реакции на стекле сыворотка в дозах 0,04; 0,02; 0,01 дает положительную реакцию на четыре креста. Срок годности диагностикума 5 лет.

Недостатком данного способа является длительное время получения диагностикума (за счет длительного процесса лиофилизации). Кроме того, длительная лиофилизация приводит к пересушиванию диагностикума (время высушивания 22-26 часов). Пересушивание диагностикума снижает его чувствительность (активность), способствует долгому растворению диагностикума в дистилированной воде, что неудобно в работе и удлиняет постановки реакции МРА и РА на стекле.

Задача изобретения - сокращение времени получения диагностикума, за счет сокращения времени лиофилизации, получение диагностикума имеющего более высокую чувствительность, более стабильного, что увеличивает срок годности, более удобного в работе.

Технический результат достигается тем, что способ получения бруцеллезного диагностикума включает смыв микробной массы В. abortus 19 В А 0,9% раствором натрия хлорида, доведение концентрации микробной массы до 30 млрд м.к./мл, инактивацию микробной взвеси 1% раствором формалина, окрашивание микробной взвеси 0,04%) раствором гематоксилина Караци, при определенных условиях. После окрашивания осуществляют отмывку микробной массы. После этого к осадку добавляют 0,1% раствор формалина до первоначального объема и стабилизатор в количестве 0,1 мл на 1 мл полученного диагностикума. Затем диагностикум разливают по ампулам (по 1 мл) и лиофильно высушивают. I стадия лиофилизации - замораживание осуществляется на предварительно охлажденных полках лиофильной установки, при этом температура полок составляет минус (45±5)°С, скорость замораживания (8-10)°С в минуту, время замораживания 60±15 минут. Два часа добавляется для холодовой закалки диагностикума, необходимой для равномерного промораживания всего объема диагностикума в ампуле. Общая продолжительность замораживания 3±0,25 часа. Следующий этап лиофилизации - высушивание - начинается сразу же после окончания замораживания. Режим ведения подогрева устанавливается с таким расчетом, чтобы температура диагностикума прошла нулевую отметку (0°С) к 10 часу от начала высушивания. Конечная температура досушивания диагностикума (30±2)°С, вакуум в процессе сушки на стадии удаления несвязанной воды от 26 до 10 Па, а во время досушивания (5±3) Па. При этом общая продолжительность высушивания составляет 16-20 часов.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается тем, что замораживание диагностикума осуществляют на предварительно охлажденных до минус (45±5)°С полках лиофильной установки, скорость замораживания (8-10)°С в минуту, время замораживания 3±0,25 часа, а сразу после окончания замораживания устанавливают режим подогрева с таким расчетом, чтобы температура диагностикума прошла нулевую отметку (0°С) к 10 часу от начала высушивания, при этом конечная температура досушивания диагностикума (30±2)°С, вакуум в процессе сушки на стадии удаления несвязанной воды от 26 Па до 10 Па, а во время досушивания (5±3) Па, при этом общая продолжительность высушивания составляет 16-20 часов.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию изобретения «новизна».

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найдены способы получения диагностикумов, которые включают предлагаемые режимы, а именно, данные режимы позволяют достичь поставленную цель - сократить время получения диагностикума, получить диагностикум, который имеет высокую чувствительность, длительный срок годности (6 лет), имеет хорошую растворимость, удобен в работе и при транспортировке. Сокращаются сроки получения результатов реакций (МРА и РА на стекле) при использовании предлагаемого диагностикума.

Данный способ может быть использован в лабораторном и промышленном производстве при выпуске диагностических препаратов.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом: для приготовления бруцеллезного диагностикума двухсуточную агаровую культуру вакцинного штамма В.abortus 19 ВА смывают 0,9% раствором натрия хлорида и доводят до концентрации 30 млрд м.к./мл (по ОСО 42-28-85 П) соответствующего года выпуска, добавляют равный объем 2% раствора формалина с таким расчетом, чтобы микробная взвесь содержала 1% формалина. Инактивацию проводят при температуре 22°С в течение двух часов. Через два часа формалинизированную микробную взвесь отмывают от формалина дважды путем центрифугирования при 7000 об/мин в течение 30 мин, соблюдая правила безопасности при работе с условно-заразным материалом. Затем в стаканы с отмытой микробной взвесью наливают 0,9% раствор натрия хлорида до первоначального объема и равный объем 0,04% раствора гематоксилина Караци. Флакон со взвесью тщательно встряхивают, помещают в водяную баню, нагретую до температуры 56°С и оставляют на 19±1 ч. После указанной экспозиции окрашенную микробную взвесь освобождают от посторонних примесей (кусочки агара, крупные частицы краски и т.д.) центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 минут.Надосадочную жидкость, содержащую окрашенную микробную взвесь, разливают в чистые стаканы и центрифугируют при 7000 об/мин 30 мин. Супернатант сливают в раствор 3% хлорамина. Осадок, содержащий окрашенную микробную массу, ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида рН 7,2 и центрифугируют в тех же условиях. Отмывание окрашенных бактерий повторяют 3-4 раза, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. В стаканы с отмытыми окрашенными бактериями сначала наливают небольшой объем 0,1% раствора формалина, перемешивают, полученную взвесь переносят в стерильный градуированный флакон и доводят до первоначального объема. Затем добавляют стабилизатор 0,03% раствор карбонатного буфера и 3% раствор сахарозы в количестве 0,1 мл на 1 мл диагностикума, и лиофильно высушивают следующим образом: I стадия лиофилизации - замораживание осуществляется на предварительно охлажденных полках лиофильной установки, куда помещаются ампулы с диагностикумом, при этом температура полок составляет минус (45±5)°С, скорость замораживания (8-10)°С в минуту, время замораживания до температуры минус (45±5)°С составило 60±15 минут. Два часа добавляется для холодовой закалки диагностикума, необходимой для равномерного промораживания всего объема диагностикума в ампуле. Общая продолжительность замораживания 3±0,25 часа. Следующий этап лиофилизации - высушивание - начинается сразу же после окончания замораживания. Режим ведения подогрева устанавливается с таким расчетом, чтобы температура диагностикума прошла нулевую отметку (0°С) к 10 часу от начала высушивания. Конечная температура досушивания диагностикума (30±2)°С, вакуум в процессе сушки на стадии удаления несвязанной воды от 26 Па до 10 Па, а во время досушивания (5±3) Па. При этом общая продолжительность высушивания составляет 16-20 часов.

Получают стабильный сухой цветной антигенный бруцеллезный диагностикум с рабочим разведением 1:16-1:18.

Благодаря предлагаемому режиму лиофилизации освобождается одна единица технологического оборудования (низкотемпературный шкаф). Исключение в процессе замораживания диагностикума применения низкотемпературного морозильного шкафа позволяет сократить время замораживания, т.к. эффективность замораживания диагностикума в шкафу низкая, ввиду применения конвективного метода охлаждения (замораживание охлажденным воздухом), средняя скорость замораживания не превышает 0,5°С в минуту. Окончательное время замораживания до температуры (45±5)°С в морозильном шкафу составляет не менее 10 часов.

В предлагаемом способе замораживание бруцеллезного диагностикума производится непосредственно на полках сублимационного аппарата контактным методом, что значительно сокращает время замораживания и время высушивания. Согласно ранее использованной технологии, заложенной в регламенте производства (способ-прототип), время замораживания составляло от 10 до 22-х часов, по предлагаемому способу время составляет 2 часа 45 минут - 3 часа 15 минут. Время высушивания также сократилось с 22-24 часов до 16-20 часов.

Кроме того, в предлагаемом нами способе исключается процедура перегрузки диагностикума из низкотемпературного шкафа в лиофильную установку, что также сокращает время и повышает удобство работы

Пример 1. Двухсуточную агаровую культуру бруцелл штамма В.abortus 19 ВА смывают 0,9% раствором натрия хлорида и доводят до концентрации 30 млрд м.к. в 1 мл взвеси по оптическому стандарту мутности и инактивируют 1% раствором формалина. Инактивацию проводят при температуре 22°С в течение двух часов. Через два часа формалинизированную микробную взвесь отмывают от формалина дважды путем центрифугирования при 7000 об/мин в течение 30 мин, соблюдая правила безопасности при работе с условно-заразным материалом. В стаканы с отмытой микробной взвесью наливают 0,9% раствор натрия хлорида до первоначального объема и равный объем 0,04% раствора гематоксилина Караци. Флакон со взвесью тщательно встряхивают, помещают в водяную баню, нагретую до температуры 56°С, и оставляют на19±1 ч. После указанной экспозиции окрашенную микробную взвесь освобождают от посторонних примесей (кусочки агара, крупные частицы краски и т.д.) центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость, содержащую окрашенную микробную взвесь, разливают в чистые стаканы и центрифугируют при 7000 об/мин 30 мин. Супернатант сливают в раствор 3% хлорамина. Осадок, содержащий окрашенную микробную массу, ресуспендируют 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,2 и центрифугируют при тех же условиях. Отмывание окрашенных бактерий повторяют 4 раза. В стаканы с отмытыми окрашенными бактериями наливают 0,1% раствор формалина, перемешивают, полученную взвесь переносят в стерильный градуированный флакон и доводят до первоначального объема. Перед лиофильным высушиванием добавляют стабилизатор - 0,03% раствор карбонатного буфера и 3% раствор сахарозы в дозе 0,1 мл на 1 мл диагностикума. Диагностикум разливают в ампулы по 1 мл и лиофилизируют следующим образом: замораживание диагностикума осуществляют на предварительно охлажденных до минус 40°С полках лиофильной установки, скорость замораживания 10°С в минуту, время замораживания 2 часа 45 минут. Сразу после окончания замораживания устанавливают режим подогрева с таким расчетом, чтобы температура диагностикума прошла нулевую отметку (0°С) к 10 часу от начала высушивания, при этом конечная температура досушивания диагностикума 28°С, вакуум в процессе сушки на стадии удаления несвязанной воды от 26 Па до 10 Па, а во время досушивания 2 Па, при этом общая продолжительность высушивания составляет 16 часов. Приготовленный по предлагаемому способу сухой диагностикум имеет рабочее разведение 1:16.

Чувствительность (активность) бруцеллезного диагностикума, полученного по предлагаемому способу, проверяли в МРА и на стекле с коммерческой бруцеллезной сывороткой. В МРА чувствительность составила 1:5120. На стекле - чувствительность диагностикума составляет 4 креста в разведении сыворотки 1:10.

Специфичность полученного диагностикума проверяли в МРА с коммерческими сыворотками: Escherichia coli (сыворотки "О" - коли агглютинирующие), Vibrio cholerae (холерная диагностическая агглютинирующая O1 сыворотка), Francisella tularensis (туляремийная диагностическая агглютинирующая сыворотка), Yersinia enterocolitica (сыворотка диагностическая к вирулентным Yersinia enterocolitica адсорбированная кроличья сухая для РА на стекле), Salmonella Typhimurium (поливалентная сальмонеллезная адсорбированная сухая О - для РА (А, В, С, Д, Е) до 1/10 титра. На стекле специфичность диагностикума отрицательна.

Кроме того, чувствительность полученного по предлагаемому способу диагностикума проверяли при его хранении. В течение 6 лет диагностикум сохранял свою активность (чувствительность): Через 6 лет чувствительность в МРА составила 1:5120. На стекле - чувствительность диагностикума составила 4 креста в разведении сыворотки 1:10.

Пример 2. Двухсуточную агаровую культуру бруцелл штамма В.abortus 19 В А смывают 0,9% раствором хлорида натрия и доводят до концентрации 20 млрд м.к. в 1 мл взвеси по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича и инактивируют 1% раствором формалина. Инактивацию проводят при температуре 22°С в течение двух часов. Через два часа формалинизированную микробную взвесь отмывают от формалина два раза путем центрифугирования при 7000 об/мин в течение 30 мин, соблюдая правила безопасности при работе с условно-заразным материалом. В стаканы с отмытой микробной взвесью наливают 0,9% раствор натрия хлорида до первоначального объема. Во флаконы с отмытой микробной взвесью наливают равный объем 0,04% раствора гематоксилина Караци. Флакон со взвесью тщательно встряхивают, помещают в водяную баню, нагретую до температуры 56°С и оставляют на 16 часов. После указанной экспозиции окрашенную микробную взвесь освобождают от посторонних примесей (кусочки агара, крупные частицы краски и т.д.) центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость, содержащую окрашенную микробную взвесь, разливают в чистые стаканы и центрифугируют при 7000 об/мин 30 мин. Супернатант сливают в 3% раствор хлорамина. Осадок, содержащий окрашенную микробную массу, ресуспендируют 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,2 и центрифугируют при тех же условиях. Отмывание окрашенных бактерий повторяют 3 раза. В стаканы с отмытыми окрашенными бактериями наливают 0,1% раствор формалина, перемешивают, полученную взвесь переносят в стерильный градуированный флакон и доливают до первоначального объема. Перед лиофильным высушиванием добавляют стабилизатор - 1,5% водный раствор ПВП и 7% раствор сахарозы, взятые в соотношении 1:1 в дозе 0,1 мл на 1 мл диагностикума. Диагностикум разливают в ампулы по 1 мл и лиофильно высушивают следующим образом: замораживание осуществляют на предварительно охлажденных полках лиофильной установки, при этом температура полок составляет минус 50°С, скорость замораживания 8°С в минуту, время замораживания 1 час 15 минут. Два часа добавляют для холодовой закалки диагностикума, необходимой для равномерного промораживания всего объема диагностикума в ампуле. Общая продолжительность замораживания 3 часа 15 минут. После окончания замораживания начинают высушивание. Режим ведения подогрева устанавливают с таким расчетом, чтобы температура диагностикума прошла нулевую отметку (0°С) к 10 часу от начала высушивания. Конечная температура досушивания диагностикума 32°С, вакуум в процессе сушки на стадии удаления несвязанной воды от 26 Па до 10 Па, а во время досушивания 8 Па. Общая продолжительность высушивания составляет 20 часов.

Получают стабильный сухой цветной антигенный бруцеллезный диагностикум с рабочим разведением 1:18.

Чувствительность (активность) бруцеллезного диагностикума, полученного по предлагаемому способу, проверяли в МРА и на стекле с коммерческой бруцеллезной сывороткой. В МРА чувствительность составила 1:5120. На стекле - чувствительность диагностикума составляет 4 креста в разведении сыворотки 1:10.

Специфичность полученного диагностикума проверяли в МРА с коммерческими сыворотками: Escherichia coli (сыворотки "О" - коли агглютинирующие), Vibrio cholerae (холерная диагностическая агглютинирующая Ol сыворотка), Francisella tularensis (туляремийная диагностическая агглютинирующая сыворотка), Yersinia enterocolitica (сыворотка диагностическая к вирулентным Yersinia enterocolitica адсорбированная кроличья сухая для РА на стекле), Salmonella Typhimurium (поливалентная сальмонеллезная адсорбированная сухая О - для РА (А, В, С, Д, Е) до 1/10 титра. На стекле специфичность диагностикума отрицательна.

Кроме того, чувствительность полученного по предлагаемому способу диагностикума проверяли при его хранении. В течение 6 лет диагностикум сохранял свою активность (чувствительность): Через 6 лет чувствительность в МРА составила 1:5120. На стекле - чувствительность диагностикума составила 4 креста в разведении сыворотки 1:10.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить время получения диагностикума. При этом диагностикум, полученный по предлагаемому способу, более чувствителен по сравнению с диагно-стикумом, полученным по способу-прототипу, более стабилен, имеет более длительный срок годности (6 лет). Кроме того, предлагаемый способ позволяет получить диагностикум, который лучше (быстрее) растворяется и за счет этого сокращается время постановки МРА, и реакции агглютинации на стекле.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения бруцеллезного диагностикума, включающий смыв двухсуточной культуры бруцелл штамма Brucella abortus 19 ВА 0,9%-ным раствором натрия хлорида, доведение до концентрации 20-30 млрд. м.к. в 1 мл взвеси, инактивацию микробной взвеси 1%-ным раствором формалина при 22°С в течение 2 ч, с последующим отмыванием и центрифугированием, добавление 0,9%-ного раствора натрия хлорида, 0,04%-ного раствора гематоксилина Караци, перемешивание, прогревание 16-18 ч до 56°С, центрифугирование, отделение надосадочной жидкости, ресуспендирование полученного осадка в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, центрифугирование, добавление к осадку 0,1%-ного раствора формалина и стабилизатора в количестве 0,1 мл на 1 мл полученного диагностикума, выбранного из группы: 1,5%-ный раствор поливинилпирролидона и 7%-ный раствор сахарозы в соотношении 1:1 или 0,03%-ный карбонатный буфер и 3%-ный раствор сахарозы в соотношении 1:1 и лиофилизацию, включающую стадии замораживания и высушивания, при этом замораживание диагностикума осуществляют на предварительно охлажденных до минус 45±5°С полках лиофильной установки, скорость замораживания 8-10°С/мин, время замораживания 3±0,25 ч, а сразу после окончания замораживания устанавливают режим подогрева с таким расчетом, чтобы температура диагностикума прошла нулевую отметку 0°С к 10 часу от начала высушивания, при этом конечная температура досушивания диагностикума 30±2°С, вакуум в процессе сушки на стадии удаления несвязанной воды от 26 Па до 10 Па, а во время досушивания 5±3 Па. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности диагностикума и увеличение срока его годности. 2 пр.

Способ получения бруцеллезного диагностикума, включающий смыв двухсуточной культуры бруцелл штамма Brucella abortus 19 ВА 0,9%-ным раствором натрия хлорида, доведение до концентрации 20-30 млрд м.к. в 1 мл взвеси, инактивацию микробной взвеси 1%-ным раствором формалина при температуре 22°С в течение двух часов, двукратное отмывание центрифугированием при 7000 об/мин в течение 30 мин, добавление 0,9%-ного раствора натрия хлорида до первоначального объема и равного объема 0,04%-ного раствора гематоксилина Караци, перемешивание, прогревание до температуры 56°С в течение 16-18 ч, центрифугирование окрашенной взвеси при 2000 об/мин 15 мин, отделение надосадочной жидкости и центрифугирование ее при 7000 об/мин 30 мин, ресуспендирование полученного осадка в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и центрифугирование при тех же условиях 3-4 раза, добавление к осадку 0,1%-ного раствора формалина до первоначального объема и стабилизатора в количестве 0,1 мл на 1 мл полученного диагностикума, выбранного из группы: 1,5%-ный раствор поливинилпирролидона и 7%-ный раствор сахарозы в соотношении 1:1 или 0,03%-ный карбонатный буфер и 3%-ный раствор сахарозы в соотношении 1:1 и лиофилизацию, включающую стадии замораживания и высушивания, отличающийся тем, что замораживание диагностикума осуществляют на предварительно охлажденных до минус 45±5°С полках лиофильной установки, скорость замораживания 8-10°С в минуту, время замораживания 3±0,25 часа, а сразу после окончания замораживания устанавливают режим подогрева с таким расчетом, чтобы температура диагностикума прошла нулевую отметку 0°С к 10 часу от начала высушивания, при этом конечная температура досушивания диагностикума 30±2°С, вакуум в процессе сушки на стадии удаления несвязанной воды от 26 Па до 10 Па, а во время досушивания 5±3 Па.