СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ АММОНИЕВОЙ СОЛИ, ОБЛАДАЮЩЕЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2021 года по МПК C07D487/18 A61K31/53 A61P35/00 

Изобретение относится к органической химии, конкретно к получению 1-(1,3-диоксоланил-2-метил)-3,5,7-триаза-1-азониатрицикло[3.3.1.1^3.7]декан бромида, который может применяться в качестве биоактивных препаратов.

Четвертичные аммониевые соли, содержащие гетероциклические фрагменты, широко могут применяться в качестве дезинфицирующих средств в медицине, текстильной, пищевой промышленности и биоцидов благодаря их относительно низкой токсичности для человека и широкой специфичности противоопухолевого действия (Валиев В.Ф., Раскильдина Г.З., Озден И.В., Мещерякова С.А., Спирихин Л.В., Злотский С.С. Синтез производных пиримидин-2,4(1Н,3Н)-дионов, содержащих N-алкильные заместители // Журнал общей химии. 2017. Т. 87, вып. 8. С. 1386-1389; Chanawanno K., Chantrapromma S., Anantapong Т., Kanjana-Opas A., Fun Н.-K. Synthesis, structure and in vitro antibacterial activities of new hybrid disinfectants quaternary ammonium compounds: Pyridinium and quinolinium stilbene benzenesulfonates // Eur. J. Med. Chem. 2010. V. 45. P. 4199-4208; Btock S.S. Disinfection, Sterilization and Preservation. Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, U.S.A. 2001. P. 283-319).

Известен способ, принятый нами за прототип, получения четвертичных солей пиридиния, которые обладают противомикробным и противогрибковым действием (патент США 7612097 (2009).

Недостатками прототипа являются проведение синтеза в нескольких стадиях, продолжительность реакции, высокая стоимость катализатора и низкий выход продуктов (не выше 50%).

Технической задачей предлагаемого изобретения является расширение ассортимента соединений, обладающих противоопухолевой активностью и низкой токсичностью одновременно, и разработка способа их получения.

Указанная задача решается тем, что способ получения 1-(1,3-диоксоланил-2-метил)-3,5,7-триаза-1-азониатрицикло[3.3.1.1^3.7]декан бромида, согласно изобретению, проводят взаимодействием уротропина с 2-бромметил-1,3-диоксоланом при температуре 60°С в течение 4 часов.

Реакцию уротропина с 2-бромметил-1,3-диоксоланом проводят при следующем соотношении компонентов, мол.%: уротропин 50; 2-бромметил-1,3-диоксолан 50.

Способ осуществляется следующим образом.

В круглодонную колбу емкостью 100 мл, снабженную обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, помещали раствор 1 г (0.007 моль) гексаметилентетрамина I (уротропина) в 10 мл хлороформа и при перемешивании прибавляли раствор 1.4 г (0.007 моль) 2-бромметил-1,3-диоксолана II в 10 мл хлороформа. Мольное соотношение уротропин: 2-бромметил-1,3-диоксолан = 1:1. Реакционную смесь кипятили на водяной бане при 60°С в течение 4 часов, затем охлаждали и добавляли равное по объему количество сухого гексана. Выпавший осадок отфильтровывали, тщательно промывали сухим гексаном и высушивали в вакууме при температуре 35-40°С.

Исходные реагенты должны соответствовать следующим требованиям:

- Уротропин - ГОСТ 1381-73;

- 2-Бромметил-1,3-диоксолан - ГОСТ 4360-63-8;

- Хлороформ - ГОСТ 20015-88;

- Гексан-ГОСТ П0-54-3.

Выход 1-(1,3-диоксоланил-2-метил)-3,5,7-триаза-1-азониатрицикло [3.3.1.1^3.7]декан бромида (III) - 67%. Белый порошок, Т_пл. = 33°С. Спектр ЯМР ¹Н (в CDCl₃, в δ, м.д.): 2.53 с (2Н, CH₂), 3.55-3.62 м (4Н, 2CH₂), 4.42 д (2Н, СН₂, J=12.1), 4.46 д (2Н, CH₂, J=12.1), 4.59 д( 2Н, СН₂, J=12.1), 5.17 д (6Н, 3СН₂, J=9.5), 5.55 т (1Н, СН, J=5.2), спектр ЯМР ¹³С (в CDCl₃, в δ, м.д.): 58.15 (СН₂), 70.06 (3CH₂), 74.07 (2СН₂), 79.39 (3СН), 124.45 (СН).

Из приведенного примера видно, что предлагаемый способ позволяет достигнуть выхода 1-(1,3-диоксоланил-2-метил)-3,5,7-триаза-1-азониатрицикло [3.3.1.1^3.7]декан бромида 67%, что обеспечит их широкое использование в качестве биоактивных препаратов.

Предлагаемая аммониевая соль обладает противоопухолевым действием в отношении раковых клеточных линий (M-Hela; А549; HuTu 80; WI38 - VA 13 subline 2RA; Chang liver) на уровне противоопухолевого препарата «Арглабин».

В отличие от препарата сравнения аммониевая соль не проявляет цитотоксических свойств на нормальных клетках печени человека, а также обладает более низкой токсичностью на нормальных клетках эмбрионального легкого человека (WI38).

Биологическое тестирование

Для проведения экспериментов используют опухолевые культуры клеток М-Hela клон 11 (эпителиоидная карцинома шейки матки, сублиния Hela., клон М-Hela; А 549 - карцинома легкого человека; HuTu 80 - аденокарцинома двенадцатиперстной кишки человека; WI38 - VA 13 subline 2RA - легкое эмбриона человека; Chang liver - клетки печени человека. Клеточные линии были получены из коллекций Института цитологии РАН (Санкт-Петербург) и НИИ вирусологии РАМН (Москва).

Цитотоксическое действие определяют путем подсчета жизнеспособных клеток с помощью многофункциональной системы Cytell Cell Imaging (GE Helthcare Life Science, Швеция), используя приложение Cell Viability BioApp, которое позволяет точно подсчитать количество клеток, оценить их жизнеспособность на основании интенсивности флуоресценции (Voloshina A.D., Semenov V.E., Strobykina A.S., Kulik N.V., Krylova E.S., Zobov V.V., and Reznik V.S. Synthesis and Antimicrobial and Toxic Properties of Novel 1,3-Bis(alkyl)-6-Methyluracil Derivatives Containing 1,2,3- and 1,2,4-Triazolium Fragments // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2017. Vol. 43. N. 2. - P. 170-176). Для культивирования клеток используют стандартную питательную среду «Игла» производства Московского института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова фирмы «ПанЭко» с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% заменимых аминокислот (NEAA).

Рассев клеток проводят на 96-луночную панель фирмы «Eppendorf» в концентрации 100 тыс. кл/мл в каждую лунку в объеме 150 мкл среды и культивируют в CO₂-инкубаторе при 37°С. Через 24 ч после посадки клеток в лунки отбирают культуральную среду, а в лунку вносят 150 мкл раствора изучаемого препарата в заданных разведениях. Разведение соединения готовят непосредственно в ростовой питательной среде. Цитотоксическое действие исследуемого соединения определяют в концентрациях 1-100 мкМ. Степень подавления роста клеток под влиянием тестируемого агента вычисляют по формуле:

N%=(1 - Опыт/Контроль) × 100

Далее по кривой зависимости роста культуры клеток от концентрации соединения определяют ИК₅₀, то есть концентрацию препарата, вызывающие гибель 50% жизнеспособных клеток. Соединение нового класса считается цитотоксически активным при ИК₅₀ < 100 мкМ (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. Год выпуска: 2012. Автор: Миронов А.Н.).

Значения ИК₅₀ аммониевой соли представлены в таблице.

Из таблицы видно, что четвертичная аммониевая соль обладает противоопухолевым действием в отношении раковых клеточных линий на уровне препарата «Арглабин». Против нормальных клеточных линий человека соединение III оказалось менее токсичным, особенно в отношении клеток Chang liver (значения ИК50 ≥ 100 мкМ). Аммониевая соль проявила избирательное действие в отношении клеток карциномы легкого человека (А-549) при более низкой токсичности на нормальных клетках эмбриона легкого (WI38). Значение ИК50 на WI38 в 2 раза выше, чем на клетках А-549.

Основываясь на представленных выше результатах можно сделать заключение, что четвертичная аммониевая соль на основе 2-бромметил-1,3-диоксолана и уротропина демонстрирует высокое противоопухолевое действие в сочетании с низкой цитотоксичностью по сравнению с препаратом «Арглабин» и может применяться при разработке новых противоопухолевых препаратов.

Настоящее изобретение относится к органической химии, а именно к способу получения 1-(1,3-диоксоланил-2-метил)-3,5,7-триаза-1-азониатрицикло[3.3.1.1^3,7]декан бромида. Способ включает взаимодействие уротропина с 2-бромметил-1,3-диоксоланом при температуре 60°С в течение 4 часов при следующем соотношении компонентов, мол.%: уротропин 50; 2-бромметил-1,3-диоксолан 50. Технический результат заключается в получение соединения 1-(1,3-диоксоланил-2-метил)-3,5,7-триаза-1-азониатрицикло [3.3.1.1^3,7] декан бромида, которое обладает противоопухолевой активностью. 1 табл.

Способ получения 1-(1,3-диоксоланил-2-метил)-3,5,7-триаза-1-азониатрицикло[3.3.1.1^3,7]декан бромида взаимодействием уротропина с 2-бромметил-1,3-диоксоланом при температуре 60°С в течение 4 часов при следующем соотношении компонентов, мол.%: уротропин 50; 2-бромметил-1,3-диоксолан 50.