Производные арглабина, обладающие селективным цитотоксическим действием Российский патент 2023 года по МПК C07D493/04 C07D519/00 A61K31/34 A61K31/422 A61K31/506 A61K31/662 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицинской химии, более детально – к производным арглабина формулы Ia – Ie, обладающим селективным цитотоксическим действием in vitro.

Повышение селективности цитотоксического действия химиотерапевтических препаратов является актуальной задачей современной медицинской химии, поскольку ее решение крайне важно для снижения побочных эффектов, связанных с применением химиотерапевтических препаратов, а также создания препаратов для специфической профилактики онкологических заболеваний. Поэтому обнаружение у заявленных производных арглабина формулы Ia – Ie селективного цитотоксического действия в отношении отдельных раковых клеточных линий в сочетании с низкой цитотоксичностью в отношении нормальных клеточных линий может найти применение при разработке противоопухолевых препаратов таргетного действия, обладающих минимальными побочными эффектами.

Исходное соединение – арглабин [(3aR,4aS,6aS,9aS,9bR)-1,4a-диметил-7-метилиден-5,6,6a,7,9a,9b-гексагидро-3H-оксирено[2′,3′:8,8a]азулено[4,5-b]фуран-8(4aH)-он] 1:

Арглабин используется в медицине в качестве противоопухолевого препарата при лечении рака легкого, печени, кишечника, желудка и молочной железы [Pharmaceutical compositions of arglabin and arglabin derivatives: пат. WO9848789A1 / S. M. Adekenov; заявл. 26.04.1997; опубл. 05.11.1998], [The method of treatment of locally propagated mammary gland cancer: пат. WO9958148A1 / K. J. Musulmanbekow; заявл. 14.05.1998; опубл. 18.11.1999], [Method of treatment of patients with initial liver cancer: пат. WO9964003A1 / K. J. Musulmanbekow; заявл. 09.06.1998; опубл. 16.12.1999]. Арглабин является сесквитерпеновым лактоном класса гвайанолидов, содержащимся в растении полынь гладкая (Artemisia glabella) [Adekenov S. M. Arglabin - A new sesquiterpene lactone from Artemisia glabella. / S. M. Adekenov, M. N. Mukhametzhanov, A. D. Kagarlitskii, A. N. Kupriyanov // Chem. Nat. Compd. – 1982, V. 18, № 5. – P. 623-624]. Противоопухолевая активность арглабина обусловлена конкурентным ингибированием ферментативной активности фарнезилтрансферазы, участвующей в пренилировании Ras-белков [Shaikenov T. E. Arglabin-DMA, a plant derived sesquiterpene, inhibits farnesyltransferase. / T. E. Shaikenov, S. M. Adekenov, R. M. Williams, N. Prashad, F. L. Baker, T. L. Madden, R. Newman // Oncolog. Rep. – 2001, V. 8. – P. 173-182], [Lone S. H. Arglabin: from isolation to antitumor evaluation. / S. H. Lone, K. A. Bhat, M. A. Khuroo // Chem.-Biol. Interact. – 2015, V. 240. – P. 180-198]. Дефарнезилирование Ras-белков тормозит деление и рост опухолевых клеток, поскольку онкогенные формы Ras-белков детектируются при многих злокачественных заболеваниях.

Известно водорастворимое синтетическое производное арглабина – [(3aR,4aS,6aS,7R,9aS,9bR)-7-[(диметиламино)метил]-1,4a-диметил-5,6,6a,7,9a,9b-гексагидро-3H-оксирено[2′,3′:8,8a]азулено[4,5-b]фуран-8(4aH)-он гидрохлорид] 2 [Method for production of hydrochloride 1(10) beta-epoxy-13-dimethylamino-5,7alpha,6,11beta (h)-guaia-3(4)-en-6,12-olide, the lyophilized antitumor preparation "arglabin": пат. EP2069357B1 / S. M. Adekenov; заявл. 19.09.2006; опубл. 26.08.2015], принятое заявителем за прототип, которое отличается от природного арглабина более высокой биодоступностью и лучшими фармакокинетическими свойствами, что позволяет использовать данное производное в химиотерапии опухолевых заболеваний для внутривенного введения.

Из исследованного уровня техники в области медицинской химии выявлено, что синтетическое производное 2, как и исходный арглабин 1, обладают высокой цитотоксичностью в отношении различных раковых клеточных линий, однако их цитотоксичность в отношении нормальных клеточных линий также является высокой, т.е. указанные препараты не обладают селективным действием.

На дату представления заявочных материалов из исследованного уровня техники по патентным и научным базам данных заявителем не выявлена информация о производных арглабина, которые одновременно проявляли бы высокую цитотоксичность на раковых клетках и низкую цитотоксичность на нормальных клетках.

Техническим результатом заявленного технического решения является разработка новых производных арглабина, позволяющих достигнуть понижения цитотоксичности производных арглабина в отношении нормальных клеток с сохранением высокого цитотоксического эффекта против раковых клеток.

Сущностью заявленного технического решения являются производное арглабина формулы Iб:

.

Производное арглабина формулы Iв:

.

Производное арглабина формулы Iд:

.

Производное арглабина формулы Iе:

.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг.1, Фиг.2.

На Фиг.1 представлена Таблица 1, в которой приведены значения IC₅₀ арглабина и его производных в отношении раковых и нормальных клеточных линий различного генеза.

На Фиг.2 представлена Таблица 2, в которой приведены цитотоксические эффекты (мкМ) и значения индекса селективности (SI) производных арглабина.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Для достижения заявленного технического результата за рабочую гипотезу принято, что функционализация природного арглабина по реакции Михаэля, включающей присоединение пронуклеофильного реагента по экзоциклической углерод-углеродной кратной связи лактона 1, будет способствовать возникновению селективности, поскольку образующиеся аддукты в ходе метаболизма в опухолевых клетках могли бы подвергаться ретро-реакции Михаэля с высвобождением арглабина in situ, не затрагивая существенным образом функции нормальных клеток.

Эффективный синтез широкой серии таких аддуктов стал возможен благодаря обнаружению высокой каталитической активности третичных фосфинов для функционализации α-метилен-γ-бутиролактонов, к числу которых относится арглабин [Salin A. V. Phosphine-catalyzed Michael additions to α-methylene-γ-butyrolactones. / A. V. Salin, D. R. Islamov // Org. Biomol. Chem. – 2019, V. 17, № 31. – P. 7293-7299.]. Синтез аддуктов ранее не представлялся возможным на основе методов, основанных на кислотно-основном и металлокомплексном катализе, ввиду наличия различных реакционноспособных функциональных групп в составе арглабина.

Заявленный технический результат достигается тем, что арглабин природного происхождения 1 подвергают функционализации по экзоциклической углерод-углеродной кратной связи одним из пронуклеофильных реагентов: диэтилмалонатом 3, триэтилфосфоноацетатом 4, О,О'-диэтилцианометилфосфонатом 5, дибензилфосфитом 6, 2-оксазолидиноном 7, урацилом 8, – используя в качестве органокатализатора коммерчески доступный три-н-бутилфосфин формулы н-Bu₃P, что приводит к образованию продуктов моно-, либо бисприсоединения Ia – Ie.

Синтез соединений Ia – Iе проводят в растворе ацетонитрила, либо N,N-диметилформамида при 20 °С в течение 1 часа в присутствии 10 мол.% н-Bu₃P. Молярное соотношение реагентов зависит от структуры используемого пронуклеофила 3-8. Методики синтеза и выделения целевых продуктов представлены ниже. Абсолютная конфигурация новым асимметрическим углеродным центрам в продуктах Ia – Iе была приписана по аналогии с другими производными арглабина, для которых имеются данные рентгеноструктурного анализа [Salin A. V. Phosphine-catalyzed Michael additions to α-methylene-γ-butyrolactones. / A. V. Salin, D. R. Islamov // Org. Biomol. Chem. – 2019, V. 17, № 31. – P. 7293-7299].

Далее заявителем приведены примеры осуществления заявленного технического решения.

Пример 1. Синтез диэтил-2,2-бис(((1aS,3aS,4S,6aS,6bR,9aR)-1a,7-диметил-5-оксо-2,3,3a,4,5,6a,6b,9-октагидро-1aH-оксирено[2',3':8,8a]азулено[4,5-b]фуран-4-ил)метил)малоната Ia.

К смеси диэтилмалоната 3 (0.32 г, 2 ммоль) с арглабином 1 (0.984 г, 4 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) быстро добавляют н-Bu₃P (0.040 г, 0.2 ммоль), и реакционную смесь выдерживают при 20 °С в течение 1 часа. Затем растворитель удаляют при пониженном давлении, продукт очищают колоночной хроматографией (SiO₂, элюент – н-гексан/EtOAc=4:1, R_f = 0.39). Выход: 84% (1.09 г), бесцветные кристаллы, Т_пл. 195-197 °С (с разложением), [α]_D²⁶= +86.7 (c 2.00; CHCl₃).

ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 5.55 (уш. с, 1H), 4.30 (кв, J = 7.1 Гц, 1H), 4.27 (кв, J = 7.2 Гц, 1H), 4.08 – 3.99 (м, 3H) перекрывается с 4.07 (кв, J = 7.2 Гц, 1H), 2.84 – 2.71 (м, 4H), 2.37 – 2.30 (м, 2H), 2.18 – 2.09 (м, 8H), 1.93 – 1.83 (м, 4H) перекрывается с 1.91 (уш. с, 6H), 1.49 – 1.37 (м, 4H), 1.33 (с, 6H), 1.24 (т, J = 7.2 Гц, 6H). ЯМР ¹³C{¹H} (100.6 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 177.8, 170.5, 140.6, 124.8, 82.7, 72.4, 62.6, 62.0, 56.6, 53.6, 52.2, 42.5, 39.5, 33.5, 22.7, 22.3, 18.3, 13.9. ИК ν (см^–1): 2991, 2968, 2951, 2926, 2897, 2859, 2833, 1772, 1756, 1720, 1437, 1372, 1343, 1313, 1284, 1268, 1255, 1209, 1193, 1163, 1147, 1134, 1116, 1100, 1070, 1042, 1029, 1013, 992, 961, 924, 882, 858, 821, 807, 788, 773, 721, 682, 671, 655, 640, 595, 579, 551, 508, 492. Масс-спектр (HRMS-ESI): m/z рассчитано для C₃₇H₄₉O₁₀⁺ [M+H]⁺: 653.3321, найдено: 653.3326.

Пример 2. Синтез этил-2-(диэтоксифосфорил)-3-((1aS,3aS,4S,6aS,6bR,9aR)-1a,7-диметил-5-оксо-2,3,3a,4,5,6a,6b,9-октагидро-1aH-оксирено[2',3':8,8a]азулено[4,5-b]фуран-4-ил)-2-(((1aS,3aS,4S,6aS,6bR,9aR)-1a,7-диметил-5-оксо-2,3,3a,4,5,6a,6b,9-октагидро-1aH-оксирено[2',3':8,8a]азулено[4,5-b]фуран-4-ил)метил)пропаноата Iб.

К смеси триэтилфосфоноацетата 4 (0.448 г, 2 ммоль) с арглабином 1 (1.476 г, 6 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) быстро добавляют н-Bu₃P (0.040 г, 0.2 ммоль), и реакционную смесь выдерживают при 20 °С в течение 1 часа. Затем растворитель удаляют при пониженном давлении, продукт очищают колоночной хроматографией (SiO₂, элюент – н-гексан/EtOAc=2:1, R_f = 0.50). Выход: 93% (1.33 г), белый порошок, Т_пл. 118-119°С, [α]_D²²= +37.8 (c 2.00; CHCl₃).

ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 5.55 (с, 2H), 4.33 – 4.10 (м, 6H), 4.06 – 3.96 (м, 2H), 2.93 – 2.71 (м, 6H), 2.56 (ддд, J = 17.9, 15.1, 6.2 Гц, 1H), 2.25 (тд, J = 15.1, 7.5 Гц, 1H), 2.19 – 1.78 (м, 15H), 1.70 – 1.57 (м, 2H), 1.54 – 1.20 (м, 18H). ЯМР ¹³C{¹H} (100.6 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 178.6, 177.8, 170.7, 140.7, 124.8, 124.7, 82.5, 82.4, 72.5, 72.4, 63.72, 63.66, 62.6 (д, J = 4.0 Гц), 62.2, 62.0 (д, J = 7.0 Гц), 54.1, 53.6, 52.5, 52.2, 50.8 (д, J = 140.8 Гц), 42.44, 42.42, 42.33, 42.28, 39.5, 34.42, 34.40, 33.7, 33.6, 32.90, 32.86, 22.72, 22.70, 22.6, 22.4, 18.4, 18.3, 16.6 (д, J = 6.0 Гц), 16.5 (д, J = 6.0 Гц), 14.0. ЯМР ³¹P{¹H} (162 MГц, CDCl₃, δ м. д.): 24.7. ИК ν (см^–1): 2925, 1773, 1723, 1437, 1375, 1314, 1238, 1213, 1167, 1150, 1119, 1096, 1053, 1016, 960, 858, 806, 762, 680, 663, 649, 581, 546, 510. Масс-спектр (HRMS-ESI): m/z рассчитано для C₃₈H₅₄O₁₁P⁺ [M+H]⁺: 717.3399, найдено: 717.3404.

Пример 3. Синтез диэтил-(2-циано-1,3-бис((1aS,3aS,4S,6aS,6bR,9aR)-1a,7-диметил-5-оксо-2,3,3a,4,5,6a,6b,9-октагидро-1aH-оксирено[2',3':8,8a]азулено[4,5-b]фуран-4-ил)пропан-2-ил)фосфоната Iв.

К смеси О,О'-диэтилцианометилфосфоната 5 (0.354 г, 2 ммоль) с арглабином 1 (1.23 г, 5 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) быстро добавляют н-Bu₃P (0.040 г, 0.2 ммоль), и реакционную смесь выдерживают при 20 °С в течение 1 часа. Затем растворитель удаляют при пониженном давлении, продукт очищают колоночной хроматографией (SiO₂, элюент – н-гексан/EtOAc=1:1, R_f = 0.43). Выход: 91% (1.22 г), белый порошок, Т_пл. 124-125 °С, [α]_D²³= +52.0 (c 1.01; CHCl₃).

ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 5.60 – 5.53 (м, 2H), 4.41 – 4.23 (м, 4H), 4.14 (т, J = 10.0 Гц, 1H), 4.07 (т, J = 10.0 Гц, 1H), 2.95-2.67 (м, 5H), 2.67 – 2.51 (м, 2H), 2.25 – 1.67 (м, 11H) перекрывается с 1.92 (уш. с, 6H), 1.65 – 1.19 (м, 4H) перекрывается с 1.40 (дт, J = 7.1, 1.7 Гц, 6H), 1.34 (с, 3H), 1.33 (с, 3H). ЯМР ¹³C{¹H} (100.6 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 177.8, 177.6, 140.6, 140.3, 125.0, 124.9, 118.3 (д, J = 16.1 Гц), 83.0, 82.8, 72.4, 72.3, 65.0 (д, J = 8.0 Гц), 64.8 (д, J = 7.0 Гц), 62.7, 62.5, 53.4, 52.1, 52.0, 51.9, 43.6 (д, J = 7.0 Гц), 43.4 (д, J = 5.0 Гц), 40.4 (д, J = 142.9 Гц), 39.54, 39.55, 33.4, 33.2, 30.8 (д, J = 4.0 Гц), 30.7 (д, J = 4.0 Гц), 22.8, 22.7, 22.3, 18.32, 18.29, 16.5 (д, J = 6.0 Гц). ЯМР ³¹P{¹H} (162 MГц, CDCl₃, δ м. д.): 20.4. ИК ν (см^–1): 2926, 1772, 1435, 1379, 1319, 1257, 1211, 1167, 1120, 1012, 960, 853, 810, 753, 664, 643, 575, 511. Масс-спектр (HRMS-ESI): m/z рассчитано для C₃₆H₄₉NO₉P⁺ [M+H]⁺: 670.3140, найдено: 670.3145.

Пример 4. Синтез дибензил(((1aS,3aS,4S,6aS,6bR,9aR)-1a,7-диметил-5-оксо-2,3,3a,4,5,6a,6b,9-октагидро-1aH-оксирено[2',3':8,8a]азулено[4,5-b]фуран-4-ил)метил)фосфоната Iг.

К смеси дибензилфосфита 6 (1.048 г, 4 ммоль) с арглабином 1 (0.984 г, 5 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) быстро добавляют н-Bu₃P (0.081 г, 0.4 ммоль), и реакционную смесь выдерживают при 20 °С в течение 1 часа. Затем растворитель удаляют при пониженном давлении, остаток несколько раз промывают диэтиловым эфиром и высушивают при пониженном давлении. Выход: 98% (1.99 г), белый порошок, Т_пл. 106-107 °С, [α]_D²⁷= +67.4 (c 2.00; CHCl₃).

ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 7.39 – 7.31 (м, 10H), 5.54 (уш. с, 1H), 5.08 – 4.90 (м, 4H), 3.95 (т, J = 10.1 Гц, 1H), 2.79 – 2.64 (м, перекрывающиеся сигналы 2H), 2.45 (дддд, J = 23.7, 12.4, 5.4, 5.4 Гц, 1H), 2.35 (ддд, J = 19.0, 16.0, 5.4 Гц, 1H), 2.14 – 2.02 (м, перекрывающиеся сигналы 3H), 1.97 – 1.90 (м, 1H), 1.89 (уш. с, 3H), 1.82 – 1.74 (м, 1H), 1.70 – 1.56 (м, 1H), 1.37 – 1.27 (м, 1H), 1.27 (с, 3H). ЯМР ¹³C{¹H} (100.6 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 176.9 (д, J = 9.5 Гц), 140.5, 136.0, 128.6 (д, J = 6.9 Гц), 128.3 (д, J = 4.3 Гц), 124.8, 82.8, 72.3, 67.7 (д, J = 6.3 Гц), 67.4 (д, J = 6.3 Гц), 62.6, 52.3 (д, J = 4.5 Гц), 52.2, 41.2 (д, J = 4.4 Гц), 39.5, 33.1, 24.4 (д, J = 144.4 Гц), 22.6, 22.5, 18.3. ЯМР ³¹P{¹H} (162 MГц, CDCl₃, δ м. д.): 29.2. ИК ν (см^–1): 3032, 2932, 1772, 1497, 1451, 1432, 1407, 1384, 1318, 1246, 1231, 1190, 1177, 1119, 1081, 1047, 1025, 991, 970, 919, 866, 856, 807, 784, 735, 717, 696, 674, 663, 646, 614, 597, 576, 538, 520, 494, 464. Масс-спектр (HRMS-ESI): m/z рассчитано для C₂₉H₃₄O₆P⁺ [M+H]⁺: 509.2088, найдено: 509.2093.

Пример 5. Синтез 3-(((1aS,3aS,4R,6aS,6bR,9aR)-1a,7-диметил-5-оксо-2,3,3a,4,5,6a,6b,9-октагидро-1aH-оксирено[2',3':8,8a]азулено[4,5-b]фуран-4-ил)метил)оксазолидин-2-она Iд.

К смеси 2-оксазолидинона 7 (0.348 г, 4 ммоль) с арглабином 1 (0.984 г, 4 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) быстро добавляют н-Bu₃P (0.081 г, 0.4 ммоль), и реакционную смесь выдерживают при 20 °С в течение 1 часа. Затем растворитель удаляют при пониженном давлении, продукт очищают колоночной хроматографией (SiO₂, элюент – н-гексан/EtOAc=1:1, R_f = 0.71). Выход: 87% (1.16 г), белый порошок, Т_пл. 87-88 °С, [α]_D²⁵= +71.2 (c 1.00; CHCl₃). ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 5.58 (уш. с, 1H), 4.39 – 4.25 (м, 2H), 4.08 (т, J = 10.2 Гц, 1H), 3.79 – 3.59 (м, 3H), 3.49 (дд, J = 14.8, 3.3 Гц, 1H), 2.87 (д, J = 10.7 Гц, 1H), 2.81 – 2.71 (м, 1H), 2.39 (дт, J = 12.9, 3.7 Гц, 1H), 2.19 – 2.09 (м, 2H), 2.05 – 1.96 (м, 1H), 1.96 – 1.87 (м, 4H), 1.69 – 1.55 (м, 1H), 1.51 – 1.37 (м, 1H), 1.33 (с, 3H). ЯМР ¹³C{¹H} (100.6 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 177.1, 159.6, 140.3, 125.1, 83.3, 72.5, 62.9, 62.3, 52.5, 49.1, 46.9, 46.5, 41.3, 39.6, 33.5, 22.7, 22.5, 18.3. ИК ν (см^–1): 2929, 1780, 1746, 1735, 1501, 1488, 1437, 1415, 1367, 1326, 1309, 1265, 1231, 1209, 1190, 1168, 1143, 1113, 1086, 1061, 1029, 999, 964, 946, 930, 897, 871, 822, 795, 769, 745, 689, 665, 650, 618, 596, 568, 510, 498, 459. Масс-спектр (HRMS-ESI): m/z рассчитано для C₁₈H₂₄NO₅⁺ [M+H]⁺: 334.1649, найдено: 334.1654.

Пример 6. Синтез 1-(((1aS,3aS,4R,6aS,6bR,9aR)-1a,7-диметил-5-оксо-2,3,3a,4,5,6a,6b,9-октагидро-1aH-оксирено[2',3':8,8a]азулено[4,5-b]фуран-4-ил)метил)пиримидин-2,4(1H,3H)-диона Iе.

К смеси урацила 8 (0.448 г, 4 ммоль) с арглабином 1 (0.984 г, 4 ммоль) в N,N-диметилформамиде (5 мл) быстро добавляют н-Bu₃P (0.081 г, 0.4 ммоль), и реакционную смесь выдерживают при 20 °С в течение 1 часа. Затем растворитель удаляют при пониженном давлении, продукт очищают колоночной хроматографией (SiO₂, элюент – C₆H₆/EtOAc=1:3, R_f = 0.63). Выход: 97% (1.39 г), бесцветные кристаллы, Т_пл. 201-202 °С (с разложением), [α]_D²⁵= +101.5 (c 1.00; CHCl₃). ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 8.71 (с, 1H), 7.52 (д, J = 8.0 Гц, 1H), 5.70 (дд, J = 8.0, 2.3 Гц, 1H), 5.61 – 5.55 (м, 1H), 4.18 – 4.05 (м, 2H), 3.98 (дд, J = 14.5, 3.0 Гц, 1H), 2.89 – 2.70 (м, 2H), 2.56 (ддд, J = 12.7, 5.3, 2.9 Гц, 1H), 2.21 – 2.09 (м, 2H), 2.02 – 1.87 (м, 5H), 1.56 – 1.41 (м, 2H), 1.34 (с, 3H). ЯМР ¹³C{¹H} (100.6 МГц, CDCl₃, δ м. д.): 176.4, 163.2, 151.2, 146.0, 140.1, 125.2, 102.4, 83.5, 72.4, 62.8, 52.4, 49.5, 46.7, 44.8, 39.6, 33.5, 22.7, 22.6, 18.2. ИК ν (см^–1): 3006, 2960, 2923, 2876, 2819, 2051, 1769, 1693, 1661, 1467, 1446, 1431, 1411, 1399, 1377, 1364, 1338, 1319, 1293, 1238, 1215, 1195, 1184, 1178, 1170, 1150, 1125, 1093, 1062, 1033, 1003, 974, 962, 892, 869, 860, 826, 804, 786, 766, 737, 726, 681, 668, 652, 636, 613, 592, 571, 550, 537, 525, 509, 497, 457. Масс-спектр (HRMS-ESI): m/z рассчитано для C₁₉H₂₃N₂O₅⁺ [M+H]⁺: 359.1602, найдено: 359.1607.

Мягкие условия, большая скорость, высокие выходы целевых продуктов в сочетании с хемо- и диастереоселективностью осуществленных реакций доказывают высокую эффективность три-н-бутилфосфина как катализатора для функционализации природного арглабина с помощью пронуклеофильных реагентов.

Пример 7. Определение цитотоксичности заявленных производных арглабина.

Арглабин 1, его известное производное 2 и новые производные Ia – Iе были протестированы на цитотоксичность в отношении широкого спектра раковых и нормальных клеточных линий различного генеза.

Использованы следующие раковые клеточные линии:

– М-HeLa клон 11 (эпителиоидная карцинома шейки матки, сублиния HeLa, клон M-HeLa);

– T98G – глиобластома человека;

– HepG2 – карцинома печени человека;

– PANC-1 – карцинома поджелудочной железы человека;

– HuTu 80 – аденокарцинома двенадцатиперстной кишки человека;

– MCF-7 – аденокарцинома молочной железы человека (плевральная жидкость);

– A 549 – карцинома легкого человека;

– PC3 – клеточная линия аденокарцинома предстательной железы из ATCC (American Type Cell Collection, USA; CRL 1435);

– SK-OV-3 – аденокарцинома яичника человека;

– DU-145 – карцинома простаты человека;

– A 375 – меланома кожи человека из клеточного репозитория CLS Cell Lines Service.

Из нормальных клеточных линий использованы:

– WI38 – VA 13 subline 2RA – легкое эмбриона человека из коллекции Института цитологии РАН (Санкт-Петербург);

– Chang liver – клетки печени человека из коллекции и НИИ вирусологии РАМН (Москва).

Цитотоксическое действие на клетки определяли с помощью колориметрического метода клеточной пролиферации – МТТ-теста. НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель (МТТ) – 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый сине-фиолетовый формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Количество образовавшегося формазана пропорционально числу клеток с активным метаболизмом.

Клетки высевали на 96-луночный планшет фирмы Nunc в концентрации 5×10³ клеток на лунку в объеме 100 мкл среды и культивировали в CO₂-инкубаторе при 37°C до образования монослоя. Затем питательную среду удаляли и в лунки добавляли по 100 мкл растворов исследуемого соединения в заданных разведениях, которые готовили непосредственно в питательной среде с добавлением 5% диметилсульфоксида для улучшения растворимости. Исследования проводили в диапазоне концентраций (1-100 мкМ). После 48 ч инкубации клеток с тестируемыми соединениями питательную среду из планшетов удаляли и добавляли 100 мкл питательной среды без сыворотки с МТТ в концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 4 ч при 37°C. По окончании инкубации среду с МТТ удаляли и для растворения образовавшихся кристаллов формазана вносили по 100 мкл диметилсульфоксида в каждую лунку. Оптическую плотность регистрировали при 540 нм на микропланшетном ридере Invitrologic (Новосибирск, Россия). Эксперименты для всех соединений повторяли трижды.

Расчет IC₅₀ – концентрации тестируемого соединения, вызывающей подавление роста клеток на 50%, производился с помощью программы: MLA – «Quest Graph™ IC50 Calculator» [MLA – «Quest Graph™ IC50 Calculator». AAT Bioquest, Inc, 26 January, 2022, https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator]. Соединение нового класса считается цитотоксически активным при IC₅₀<100 мкМ [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. / под ред. Миронова А.Н. – М.: 2012, 944 с.].

В Таблице 1 на Фиг.1 представлены значения IC₅₀ в мкМ арглабина и его производных. Из полученных данных видно, что арглабин 1 и его производное 2 проявляют цитотоксическое действие в отношении всех опухолевых линий, использованных в экспериментах, в диапазоне концентраций IC₅₀ от 11.3 до 28.0 мкМ. Однако в отношении нормальных линий клеток Chang liver и WI38 цитотоксичность у соединений 1 и 2 также очень высокая (12.0 и 8.5 мкМ для 1 и 10.0 и 32.0 мкМ для 2 соответственно), то есть они не обладают селективным действием против раковых клеток, что соответствует существующему уровню развития медицинской химии.

Заявленные производные арглабина Ia – Iе также проявили цитотоксический эффект во всем диапазоне исследуемых концентраций. Соединения Ia, Iб, Iг и Iд показали наиболее высокую цитотоксичность в отношении аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu 80 (13.3, 26.9, 16.4 и 14.5 мкМ соответственно); соединение Iв – в отношении аденокарциномы молочной железы MCF-7 (18.3 мкМ), глиобластомы T98G (16.9 мкМ) и меланомы A 375 (19.8 мкМ); соединения Iг и Iе – в отношении карциномы шейки матки M-HeLa (10.3 и 21.6 мкМ соответственно). Следует отдельно подчеркнуть высокий (по сравнению с соединениями 1 и 2) цитотоксический эффект производного Iв (16.9 мкМ) в отношении линии глиобластомы T98G, которая в настоящий момент является наиболее агрессивной быстрорастущей злокачественной опухолью головного мозга человека.

Как отмечено выше, важным критерием для оценки цитотоксического действия является также селективность соединения в отношении раковых клеток. Для оценки цитотоксического эффекта были рассчитаны индексы селективности (SI) как отношение значения IC₅₀ для нормальных клеток печени (Chang liver) и значения IC₅₀ для раковых клеток (Таблица 2). Соединения с SI≥3 считаются селективными [11].

Как видно из Таблицы 2, соединения Ia и Iд являются высокоселективными в отношении аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu 80 с индексами селективности 4.7 и 5.4 соответственно, у соединения Iб селективность в отношении данного вида опухоли ниже и составляет 1.5. Соединение Iе является селективным в отношении раковой линии M-HeLa (SI=3.3). Соединение Iг селективно по отношению к двум раковым линиям – M-HeLa (SI=5.0) и HuTu 80 (SI=3.2). Соединение Iв проявляет селективность в отношении сразу трех опухолевых линий: MCF-7 (SI=3.0), T98G (SI=3.2) и A 375 (SI=2.7). При этом референтные соединения 1 и 2 значительно уступают ведущим соединениям по селективности (SI≤1).

Таким образом, полученные практические результаты подтверждают справедливость принятой рабочей гипотезы и доказывают наличие селективного цитотоксического действия у производных арглабина Ia – Iе, что в дальнейшем может быть использовано для создания противоопухолевых препаратов таргетного действия.

Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно: получены новые производные арглабина формулы Iб, Iв, Iд, Iе, обладающие по сравнению с исходным арглабином 1 и его водорастворимым производным 2 более низкой цитотоксичностью в отношении нормальных клеток с сохранением высокого цитотоксического эффекта против раковых клеток.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью отличительных признаков, обеспечивающих достижение заявленных результатов.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как заявителем впервые выявлены соединения, обладающие высокой цитотоксичностью по отношению к клеткам преимущественно злокачественных новообразований, что не является очевидным для специалиста в данной области науки и техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как может быть реализовано на любом специализированном предприятии с использованием стандартного оборудования.

Изобретение относится к области органической и медицинской химии, а именно к производным арглабина формул Iб, Iв, Iд, Iе. Технический результат – получены новые соединения, которые могут найти применение в медицине в качестве противоопухолевых препаратов таргетного действия, обладающих низкой цитотоксичностью в отношении нормальных клеточных линий. 4 н.п. ф-лы, 2 ил., 7 пр.

1. Производное арглабина формулы Iб

.

2. Производное арглабина формулы Iв

.

3. Производное арглабина формулы Iд

.

4. Производное арглабина формулы Iе

.