СПОСОБ УЛУЧШЕННОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ С ПОМОЩЬЮ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12N1/30 C12M1/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу ферментации для ферментации с помощью микроорганизмов. В частности, настоящее изобретение относится к способу ферментации, характеризующемуся увеличенной выработкой биомассы и увеличенной скоростью роста микроорганизмов, таких как бактериальный штамм, например, метанотрофный бактериальный штамм.

Уровень техники

Известно, что целый ряд микроорганизмов, таких как бактерии, используют газообразный метан путем ферментации. Обычно метанотрофы потребляют метан в качестве единственного источника углерода и энергии. В этом процессе метан может потребляться непосредственно или из природного газа и для этой цели бактериальный консорциум в виде чистой культуры или смешанной культуры необходим для поддержания роста в течение длительных периодов времени в непрерывной культуре.

Традиционно, при выработке или ферментации одноклеточного белка (SCP) из природного газа или метана в качестве единственного источника углерода используют именно метан при условиях начального времени ввода в действие за 5-6 дней до начала непрерывной культивации. Традиционно, выработка биомассы обеспечивается в стационарном состоянии в количестве, равном примерно 1,5-2,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии. Для увеличения эффективности ферментации в случае традиционных способов ферментации процесс использования метана при производстве SCP должен быть очень эффективным.

При традиционных способах ферментации, таких как способы ферментации, включающие метанотрофные бактериальные штаммы, микроорганизмы вырабатывают диоксид углерода (CO₂), который выделяется в ферментационный бульон. Таким образом, CO₂ традиционно считается газообразным отходом. Следовательно, для повышения продуктивности способа ферментации в традиционных способах считают, что CO₂ следует удалять из ферментационного бака, например, из свободного пространства над продуктом U-образного петлевого реактора для повышения продуктивности.

Кроме того, затраты на строительство и производственные расходы для получения источников ферментного белка, например, из животного сырья, довольно велики и одновременно увеличиваются потребность и требования к качеству, стандартности и нормативам и необходимость низкой цены килограмма белка. Следовательно, необходимо организовать прибыльное производство и даже небольшое увеличение эффективности или уменьшение производственных расходов может сильно повлиять на прибыль изготовителя.

Следовательно, в промышленности необходим и привлекателен улучшенный способ ферментации. В частности, в промышленности необходим более эффективный способ ферментации, который приведет к увеличенной выработке биомассы и увеличенной скорости роста микроорганизмов, таких как бактериальный штамм, например, метанотрофный бактериальный штамм, без компромисса по отношению к требованиям промышленности.

Сущность изобретения

Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ ферментации для ферментации с помощью микроорганизмов.

В частности, объектом настоящего изобретения является разработка способа ферментации, характеризующегося увеличенной выработкой биомассы и увеличенной скоростью роста микроорганизмов, таких как бактериальный штамм, например, метанотрофный бактериальный штамм.

Таким образом, одним объектом настоящего изобретения является способ увеличения выработки биомассы и/или скорости роста микроорганизмов в способе ферментации, указанный способ включает стадии:

(i) предоставление одного или большего количества микроорганизмов;

(ii) предоставление субстрата для ферментации, пригодного для ферментации с помощью одного или большего количества микроорганизмов;

(iii) смешивание одного или большего количества микроорганизмов и субстрата для ферментации с получением ферментационного бульона;

(iv) добавление ферментационного бульона в ферментационный бак;

(v) введение по меньшей мере одного газообразного субстрата в ферментационный бульон;

(vi) проведение процедуры ферментации в течение периода ферментации, равного не менее 1 ч;

где по меньшей мере один газообразный субстрат включает один или большее количество парниковых газов, таких как диоксид углерода (CO₂).

Другим объектом настоящего изобретения является способ увеличения выработки биомассы и/или скорости роста микроорганизмов в способе ферментации, указанный способ включает стадии:

(i) предоставление одного или большего количества микроорганизмов;

(ii) предоставление субстрата для ферментации, пригодного для ферментации с помощью одного или большего количества микроорганизмов;

(iii) смешивание одного или большего количества микроорганизмов и субстрата для ферментации с получением ферментационного бульона;

(iv) добавление ферментационного бульона в ферментационный бак;

(v) введение по меньшей мере одного газообразного субстрата в ферментационный бульон;

(vi) проведение процедуры ферментации в течение периода ферментации, равного не менее 1 ч;

где по меньшей мере один газообразный субстрат включает комбинацию двух или большего количества источников углерода.

Еще одним объектом настоящего изобретения является ферментационный бак, включающий вход для введения по меньшей мере одного газообразного субстрата в ферментационный бак, где по меньшей мере один газообразный субстрат включает диоксид углерода (CO₂).

Еще одним объектом настоящего изобретения является композиция, включающая один или большее количество микроорганизмов, которую можно получить способом, предлагаемым в настоящем изобретении.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлен рост M. capsulatus в ферментационном баке объемом 1 л (a) с использованием традиционного способа с применением метана, фиг. 1a, или с применением комбинации метана и CO₂ в качестве источника углерода. Непрерывную культивацию начинали минимально через 4-5 дней, обычно в среднем через 7-8 дней роста партии с использованием скорости разбавления, равной 0,05 ч^-1. Измерения массы клеток в сухом состоянии (незачерненные квадраты) и оптической плотности культуры (незачерненные кружки) при 550 нм (OD550) показали, что удельная скорость роста максимально равна примерно 0,04 ч^-1 и в среднем равна 0,025. Концентрация биомассы в стационарном состоянии в среднем равна 1,5-2,5 г/л, данные не приведены, и (b) с использованием способа ферментации, предлагаемого в настоящем изобретении. Непрерывную культивацию начинали лишь через 1 день вследствие высокой удельной скорости роста (примерно 0,16 ч^-1; по данным массы клеток в сухом состоянии и OD550) и использовали скорость разбавления, равную 0,05 ч^-1. Концентрация биомассы в стационарном состоянии равнялась не менее 4 г/л, данные не приведены.

Настоящее изобретение ниже описано более подробно.

Подробное описание изобретения

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу ферментации, который был разработан для ферментации с помощью микроорганизмов, таких как бактериальный штамм, например, метанотрофный бактериальный штамм семейства Methylococcaceae или Methylocystaceae, который культивируют в ферментере, содержащем источник углерода, источник азота и неорганические соли. Способ может быть полуаэробным способом (SAP). Способ ферментации может привести к по меньшей мере 4 раз большей скорости роста, чем в традиционных способах ферментации, и/или по меньшей мере в 1,5 раз большей выработке биомассы. Авторы настоящего изобретения неожиданно установили, что диоксид углерода оказывает значительное влияние на увеличенную выработку биомассы и увеличенную скорость роста, обеспечиваемую в настоящем изобретении. Следовательно, способ, предлагаемый в настоящем изобретении, не только приводит к значительному увеличению производства белка (о чем свидетельствует увеличенная выработка биомассы и увеличенная скорость роста) в соответствии с требованиями к производству пищевых продуктов в ближайшем будущем, но настоящее изобретение также показывает, что оно эффективно уменьшает загрязнение окружающей среды, поскольку способ ферментации включает использование парниковых газов, таких как CO₂.

Следовательно, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу увеличения выработки биомассы и/или скорости роста микроорганизмов в способе ферментации, указанный способ включает стадии:

(i) предоставление одного или большего количества микроорганизмов;

(ii) предоставление субстрата для ферментации, пригодного для ферментации с помощью одного или большего количества микроорганизмов;

(iii) смешивание одного или большего количества микроорганизмов и субстрата для ферментации с получением ферментационного бульона;

(iv) добавление ферментационного бульона в ферментационный бак;

(v) введение по меньшей мере одного газообразного субстрата в ферментационный бульон;

(vi) проведение процедуры ферментации в течение периода ферментации, равного не менее 1 ч;

где по меньшей мере один газообразный субстрат включает один или большее количество парниковых газов, таких как диоксид углерода (CO₂).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, газообразный субстрат дополнительно включает алкан, предпочтительно, если алканом является соединение C1.

Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ увеличения выработки биомассы и/или скорости роста микроорганизмов в способе ферментации, указанный способ включает стадии:

(i) предоставление одного или большего количества микроорганизмов;

(ii) предоставление субстрата для ферментации, пригодного для ферментации с помощью одного или большего количества микроорганизмов;

(iii) смешивание одного или большего количества микроорганизмов и субстрата для ферментации с получением ферментационного бульона;

(iv) добавление ферментационного бульона в ферментационный бак;

(v) введение по меньшей мере одного газообразного субстрата в ферментационный бульон;

(vi) проведение процедуры ферментации в течение периода ферментации, равного не менее 1 ч;

где по меньшей мере один газообразный субстрат включает комбинацию двух или большего количества источников углерода.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один газообразный субстрат может включать один или большее количество парниковых газов, таких как диоксид углерода (CO₂).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения газообразный субстрат содержит не менее 0,05% диоксида углерода, например, не менее 0,075% диоксида углерода, например, не менее 0,1% диоксида углерода, например, не менее 0,2% диоксида углерода, например, не менее 0,3% диоксида углерода, например, не менее 0,4% диоксида углерода, например, не менее 0,5% диоксида углерода, например, не менее 0,6% диоксида углерода, например, не менее 0,7% диоксида углерода, например, не менее 0,8% диоксида углерода, например, не менее 0,9% диоксида углерода, например, не менее 1,0% диоксида углерода, например, не менее 1,25% диоксида углерода, например, не менее 1,5% диоксида углерода, например, не менее 1,75% диоксида углерода, например, не менее 2,0% диоксида углерода, например, не менее 2,5% диоксида углерода, например, не менее 3,0% диоксида углерода, например, не менее 3,5% диоксида углерода, например, не менее 4,0% диоксида углерода, например, не менее 4,5% диоксида углерода, например, не менее 5,5% диоксида углерода, например, не менее 6,0% диоксида углерода, например, не менее 6,5% диоксида углерода, например, не менее 7,0% диоксида углерода, например, не менее 7,5% диоксида углерода, например, не менее 8,0% диоксида углерода.

Газообразный субстрат и парниковые газы, например, CO₂, можно ввести в ферментационный бульон. Предпочтительно, количество газообразного субстрата и парниковых газов, например, CO₂, введенных в ферментационный бульон, равно не менее 0,001 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,005 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,01 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,05 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,1 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,13 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,15 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,2 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,25 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,3 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,4 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,5 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,60 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,7 л/мин/л ферментационного бульона, например, не менее 0,75 л/мин/л ферментационного бульона.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения комбинация двух или большего количества источников углерода представляет собой комбинацию одного или большего количества парниковых газов, таких как диоксид углерода (CO₂) с одним или большим количеством алканов.

Алканом предпочтительно является соединение C1 и/или C1 алкан. Предпочтительно, если соединением C1 и/или C1 алканом может быть метан, метанол, природный газ, биогаз, синтез-газ или любая их комбинация. Еще более предпочтительно, если соединением C1 и/или C1 алканом может быть метан.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения газообразный субстрат характеризуется отношением масс диоксид углерода и алкана, составляющим 1 часть диоксида углерода примерно на 1 часть алкана, например, 1 часть диоксида углерода примерно на 1,5 части алкана, 1 часть диоксида углерода примерно на 2 части алкана, 1 часть диоксида углерода примерно на 2,5 части алкана, 1 часть диоксида углерода примерно на 3 части алкана.

Газообразный субстрат дополнительно включает по меньшей мере один источник азота. Предпочтительно по меньшей мере один источник азота можно выбрать из группы, включающей аммиак, нитрат, молекулярный азот и их комбинацию. Предпочтительно, если источник азота является комбинацией аммиака и нитрата.

Газообразный субстрат может дополнительно включать кислород. Предпочтительно, кислород можно предоставить, как атмосферный воздух, чистый кислород или воздух, обогащенный кислородом.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения газообразный субстрат может обладать содержанием кислорода, предпочтительно, атмосферного воздуха, которое в 2-15 раз больше (об./об.) C1 алкан, предпочтительно, метана; например, 3-12 раз больше (об./об.); например, 4-10 раз больше (об./об.); например, 5-9 раз больше (об./об.); например, 6-8 раз больше (об./об.).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения газообразный субстрат может обладать содержанием кислорода, предпочтительно атмосферного воздуха, которое в 5-25 раз больше (об./об.), чем содержание парниковых газов, предпочтительно диоксида углерода; например, 7-20 раз больше (об./об.); например, 9-15 раз больше (об./об.) ; например, 10-14 раз больше (об./об.); например, 11-13 раз больше (об./об.).

В контексте настоящего изобретения термин "субстрат для ферментации" относится к жидкой, предпочтительно водной среде, содержащей растворимые компоненты, необходимые для роста микроорганизмов.

В способе ферментации источник углерода, источник азота и/или источник кислорода предоставляется в газообразном субстрате. Чтобы источник углерода, источник азота и/или источник кислорода стал действительно доступен для микроорганизмов во время проведения способа ферментации газообразный, субстрат следует сделать растворимым в ферментационном бульоне.

Пузырьки газа в жидкостях склонны сливаться друг с другом с образованием более крупных пузырьков (коалесцироваться) и для исключения коалесценции пузырьков газа для повторного диспергирования газов в ферментационном бульоне можно использовать смесители, такие как статические газовые смесители или перегородки.

Количество газа, которое можно с успехом диспергировать в жидкости, может зависеть от гидростатического давления. Поэтому в случае высоких реакторов эффективно использовать несколько положений для ввода газов в нисходящей части. Предпочтительно, если по меньшей мере один статический перемешивающий элемент можно поместить на некотором расстоянии или сразу после каждого входа для диспергирования газа в ферментационном бульоне.

Перемешивание одного или большего количества микроорганизмов и субстрата для ферментации с получением ферментационного бульона можно провести снаружи от ферментационного бака или внутри ферментационного бака. В одном варианте осуществления настоящего изобретения смешивание одного или большего количества микроорганизмов и субстрата для ферментации с получением ферментационного бульона можно провести в ферментационном баке.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ ферментации может представлять собой периодическую ферментацию, периодическую ферментацию с подпиткой или непрерывный способ ферментации. Предпочтительно, если способ ферментации может представлять собой непрерывный способ ферментации.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения непрерывный способ ферментации можно проводить, как хемостатный, pH-статный, продукт-статный или другой непрерывный режим способа ферментации.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ ферментации проводят в аэролифтном реакторе (ферментационный бак представляет собой аэролифтный реактор), петлевом реакторе (ферментационный бак представляет собой петлевой реактор), U-образном реакторе (ферментационный бак представляет собой U-образный реактор) и/или реакторе с механическим перемешиванием (ферментационный бак представляет собой реактор с механическим перемешиванием).

В одном варианте осуществления ферментационный бульон можно перемешивать. Предпочтительно, если ферментационный бак содержит один или большее количество смесителей, пригодных для перемешивания ферментационного бульона. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ферментационный бак включает по меньшей мере один смеситель вблизи от, предпочтительно, ниже по технологической линии от входа для введения газообразного субстрата.

Одним путем увеличения растворимости газообразного субстрата в ферментационном бульоне является увеличение гидростатического давления. В одном варианте осуществления настоящего изобретения давление в ферментационном бульоне и газообразном субстрате увеличивается, так что превышение давления по сравнению с давлением снаружи от ферментационного бака составляет не менее 1,5 бар; такое как не менее 1,75 бар; например, не менее 2,0 бар; такое как не менее 2,5 бар; например, не менее 3,0 бар; такое как не менее 3,5 бар; например, не менее 4,0 бар; такое как не менее 4,5 бар; например, не менее 5,0 бар; такое как не менее 5,5 бар; например, не менее 6,0 бар; такое как не менее 7,0 бар; например, не менее 8,0 бар; такое как не менее 9,0 бар; например, не менее 10,0 бар.

Комбинация различных условий ферментации зависит от микроорганизмов, растущих в ферментационном баке.

Микроорганизм выбран из группы, включающей бактериальную клетку, клетку гриба, клетку водоросли или животную клетку. Предпочтительно, если микроорганизмом может быть бактериальная клетка.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения бактериальная клетка может быть метанотрофной бактериальной клеткой.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения бактериальная клетка может быть метанотрофной бактериальной клеткой, выбранной из штамма Methylococcus.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения штаммом Methylococcus может быть Methylococcus capsulatus.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения бактериальная клетка (предпочтительно, при росте в присутствии природного газа) выбрана из группы, включающей M. capsulatus; Alcaligen acidovorans (предпочтительно NCIMB 13287); Bacillus firmus (предпочтительно NCIMB 13280); и/или Aneurobacillus danicus (предпочтительно NCIMB 13288). Предпочтительно, если бактериальная клетка является комбинацией M. capsulatus; Alcaligen acidovorans (предпочтительно NCIMB 13287); Bacillus firmus (предпочтительно NCIMB 13280); и Aneurobacillus danicus (предпочтительно NCIMB 13288).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментацию можно начать с использованием комбинации диоксида углерода (CO₂) и (a) метанотрофных бактерий и метана или (b) метанотрофных бактерий, Alcaligen acidovorans (предпочтительно NCIMB 13287); Bacillus firmus (предпочтительно NCIMB 13280); и/или Aneurobacillus danicus (предпочтительно NCIMB 13288) и природногогаза. После этой статической процедуры ферментация может продолжаться в виде стационарного состояния ферментации, когда источником углерода является природный газ, Alcaligen acidovorans (предпочтительно NCIMB 13287); Bacillus firmus (предпочтительно NCIMB 13280); и/или Aneurobacillus danicus (предпочтительно NCIMB 13288) добавляют, если они не добавлены ранее, и дополнительного добавления CO₂.

Как отмечено выше, способ, предлагаемый в настоящем изобретении, приводит к увеличенной выработке биомассы и увеличенной скорости роста микроорганизмов, таких как бактериальный штамм, например, метанотрофный бактериальный штамм.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ, предлагаемый в настоящем изобретении, обеспечивает скорость роста микробов во время проведения способа ферментации, равную не менее 0,04 ч^-1, например, не менее 0,05 ч^-1, например, не менее 0,06 ч^-1, например, не менее 0,08 ч^-1, например, не менее 0,10 ч^-1, например, не менее 0,12 ч^-1, например, не менее 0,14 ч^-1, например, не менее 0,15 ч^-1, например, не менее 0,16 ч^-1, например, не менее 0,17 ч^-1, например, не менее 0,18 ч^-1, например, не менее 0,19 ч^-1, например, не менее 0,20 ч^-1, например, не менее 0,22 ч^-1, например, не менее 0,25 ч^-1, например, не менее 0,27 ч^-1, например, не менее 0,30 ч^-1, например, не менее 0,32 ч^-1, например, не менее 0,35 ч^-1, например, не менее 0,37 ч^-1.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 2,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 2,6 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 2,7 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 2,8 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 2,9 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 3,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 3,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 4,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 4,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 5,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 5,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 6,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 6,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 7,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 7,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 10,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 12,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 15,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 17,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 20,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 22,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 25,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 27,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии например, можно обеспечить выработку биомассы, равную не менее 30,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии.

Авторы настоящего изобретения установили, что в дополнение к увеличенной выработке биомассы и увеличенной скорости роста, что большую выработку биомассы (или максимальную выработку биомассы (выраженную в г/л в пересчете на массу в сухом состоянии) можно получить значительно быстрее, чем традиционными способами. Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения большую выработку биомассы (или максимальную выработку биомассы (выраженную в г/л в пересчете на массу в сухом состоянии) можно получить менее, чем за 5 дней, например, менее, чем за 4 дня, например, менее, чем за 3 дня, например, менее, чем за 2 дня, например, менее, чем за 24 ч, например, менее, чем за 20 ч, например, менее, чем за 16 ч, например, менее, чем за 14 ч, например, менее, чем за 12 ч, например, менее, чем за 10 ч, например, менее, чем за 8 ч.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения выработку биомассы, равную не менее 3,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, обеспечивают менее, чем за 24 ч, например, выработку биомассы, равную не менее 4,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, обеспечивают менее, чем за 20 ч, например, выработку биомассы, равную не менее 4,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, обеспечивают менее, чем за 14 ч, например, выработку биомассы, равную не менее 5,0 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, обеспечивают менее, чем за 10 ч, например, выработку биомассы, равную не менее 5,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, обеспечивают менее, чем за 8 ч.

Для проведения нового способа, предлагаемого в настоящем изобретении, разработан новый ферментационный бак. Так, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предоставлен ферментационный бак. Ферментационный бак включает вход для введения по меньшей мере одного газообразного субстрата в ферментационный бак, где по меньшей мере один газообразный субстрат включает диоксид углерода (CO₂).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментационный бак представляет собой аэролифтный реактор, петлевой реактор, U-образный реактор или реактор с механическим перемешиванием.

Для увеличения количества растворенных газов (растворенного газообразного субстрата) ферментационный бак, предлагаемый в настоящем изобретении, может дополнительно включать одно или большее количество перемешивающих устройств. Предпочтительно, если одно или большее количество перемешивающих устройств может представлять собой статическое перемешивающее устройство или перегородки, и/или активное перемешивающее устройство.

Для дополнительного улучшения способа ферментации ферментационный бак может дополнительно включать один или большее количество сенсоров. Указанные сенсоры могут быть пригодными для определения газов (таких как CO₂, метан, кислород и т. п.), питательных веществ, минеральных веществ, pH и т. п.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения один или большее количество сенсоров представляют собой сенсор для определения CO₂.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения один или большее количество сенсоров представляют собой сенсор для определения растворенного CO₂.

Способ, предлагаемый в настоящем изобретении, можно использовать для превращения парниковых газов, таких как CO₂, в биомассу и/или белки, и/или для уменьшения содержания парниковых газов, таких как CO₂, в среде.

Следует отметить, что варианты осуществления и признаки, описанные в контексте одного из объектов настоящего изобретения, также относятся к другим объектам настоящего изобретения.

Настоящее изобретение описано более подробно в следующих неограничивающих примерах.

Примеры

Пример 1

Задачей примера 1 является демонстрация увеличенной выработки биомассы и увеличенной скорости роста, полученной в настоящем изобретении. Ферментации проводят в виде и периодической ферментации, и в стационарном состоянии при непрерывной культивации с использованием полуаэробного способа проведено сопоставление с традиционными способами.

Материалы и способы:

Использовали штамм метанотрофных бактерий (Methylococcus capsulatus). Этот штамм (NCIMB 11132) получен у фирмы NCIMB (National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria, Aberdeen, Scotland) и его использовали в настоящем исследовании для обоих способов ферментации, предлагаемых в настоящем изобретении, и традиционных способов ферментации. Также получены три других штамма, Alcaligen acidovorans (NCIMB 13287), Bacillus firmus (NCIMB 13280) и Aneurobacillus danicus (NCIMB 13288) и их использовали в настоящем исследовании вместе с M. capsulatus, когда в качестве источника углерода использовали природный газ.

В способе, предлагаемом в настоящем изобретении, штаммы можно было добавлять непосредственно в процесс ферментации (добавляют в виде исходного раствора в глицерине), и непрерывную культивацию можно начать уже через 1 день периодической ферментации, тогда как традиционную ферментацию с использованием такой же величины инокулята проводили в течение не менее 5-7 дней в периодической фазе до того, когда можно было перейти в режим непрерывной культивации.

Использованными источниками углерода были метан (эксперимент 1A), метан и CO₂ (эксперимент 1B), или природный газ и CO₂ (эксперимент 1c).

Источники азота, использованными в экспериментах, были нитрат, аммиак или нитрат аммония.

Культивацию, проводимую в экспериментах (способом, предлагаемым в настоящем изобретении, и традиционным способом) выполняли в ферментерах периодического действия, обладающих рабочим объемом минимальной среды, равным 1 л, в трех биологических репликах, и начинали непрерывную культивацию. Ферментеры (ферментационные баки) обрабатывали в автоклаве с частью компонентов минимальной среды. Затем отдельно добавляли другую часть минимальной среды, обработанной в автоклаве, ферментационные баки инокулировали с помощью 5% промытой прекультуры. Скорость аэрации составляла 1,5 объема воздуха на 1 объем суспензии культуры в минуту (об/об/мин). Использовали поток метана 0,36 л/мин для традиционного эксперимента 1a и в эксперименте 1b использовали поток метана 0,23 л/мин, и в эксперименте 1c использовали поток природного газа 0,29 л/мин для способа, предлагаемого в настоящем изобретении. Для способа, предлагаемого в настоящем изобретении, 0,145 л/мин CO₂ вводили для эксперимента 1c, и 0,13 л/мин CO₂ вводили для эксперимента 1b. pH среды поддерживали равным 6,8 путем автоматического добавления 2 н. NaOH или 2 н. H₂SO₄ и температуру поддерживали равной 42°C в течение всей культивации. Калибровку растворенного кислорода проводили путем подачи воздуха и N₂. Скорость перемешивания поддерживали равной 600 оборотов в минуту (об/мин). Скорость разбавления во время непрерывной культивации равнялась 0,05 ч^-1.

Результаты

Эксперимент Источник(и) углерода Источник азота μ a b c d e Эксперимент 1A (без CO₂) CH₄ NaNO₃ ПФ 0,024±0,0003 0,46±0,003 0,003±0,0002 0 0,05±0,0015 0,1±0,006 СФ 0,05 1,27±0,01 0,006±0,0006 0 0,05±0,005 0,04±0,004 CH₄ NH₃ ПФ 0,024±0,0003 0,18±0,01 0,001±0 0 0,03±0,0001 0,03±0,003 СФ 0,05 1,41±0,005 0,007±2,52E-05 0 0,06±0,0002 0,05±0,0006 CH₄ NH₄NO₃ ПФ 0,024±0,0007 0,15±0,008 0,001±5,77E-05 0 0,03±0,001 0,04±0,002 СФ 0,05 1,27±0,002 0,007±2,85E-05 0 0,06±0,0003 0,05±0,0003 Эксперимент 1B (с CH₄+CO₂) CH4+CO₂ NaNO3 ПФ 0,16±0,003 0,67±0,003 0,05±0,003 0,47±0,018 0,77±0,005 0 СФ 0,05 1,66±0,01 0,06±0,002 0,03±0,003 0,18±0,003 0 CH4+CO₂ NH₃ ПФ 0,16±0,005 0,59±0,002 0,05±0,001 0,39±0,03 0,68±0,04 0 СФ 0,05 1,52±0,002 0,06±0,001 0,06±0,001 0,18±0,003 0 CH4+CO₂ NH₄NO₃ ПФ 0,16±0,004 0,44±0,0013 0,04±0,0006 0,35±0,008 0,5±0,013 0 СФ 0,05 1,52±0,005 0,06±7,58E-05 0,07±0,003 0,18±0,001 0 Эксперимент 1C (с природным газом +CO₂) NG+ CO₂ NaNO₃ ПФ 0,16±0,0016 0,68±0,013 0,05±0,0009 0,34±0,025 0,85±0,017 0 СФ 0,05 2,05±0,002 0,09±0,004 0,03±0,004 0,3±0,013 0 NG+ CO₂ NH₃ ПФ 0,16±0,0017 0,69±0,0023 0,05±0,0013 0,36±0,021 0,79±0,02 0 СФ 0,05 1,95±0,0013 0,09±0,0001 0,04±0,008 0,27±0,0006 0 NG+ CO₂ NH₄NO₃ ПФ 0,16±0,002 0,68±0,005 0,05±0,0001 0,35±0,005 0,68±0,007 0 СФ 0,05 1,93±0,001 0,09±0,0007 0,04±0,0055 0,28±0,0025 0

В этой таблице приведены экспериментальные значения для биологической культивации с помощью только M. capsulatus или тройной культивации с помощью M. capsulatus в комбинации с Alcaligen acidovorans (NCIMB 13287), Bacillus firmus (NCIMB 13280) и Aneurobacillus danicus (NCIMB 13288). СФ означает ферментацию в стационарном состоянии. ПФ означает периодическую ферментацию. Буквы a, b, c, d и e являются стехиометрическими коэффициентами соответствующих соединений в молях на 1 моль потребленного метана. Буква "μ" обозначает удельную скорость роста.

Обсуждение

Теоретическое стехиометрическое соотношение для химического превращения во время ферментации можно представить следующим образом:

CH₄+aO₂+bNaNO₃/NH₃/NH₄NO₃+cCO₂ -> dCH_1,8O_0,5N_0,2+eCO₂+fH₂O

CH₄ означает метан; O₂ означает кислород; NaNO₃ означает нитрат натрия; NH₃ означает аммиак; NH₄NO₃ означает нитрат аммония; CO₂ означает диоксид углерода; CH_1,8O_0,5N_0,2 означает биомассу; и H₂O означает воду.

Буквы a, b, c, d, e и f являются стехиометрическими коэффициентами соответствующих соединений в молях на 1 моль потребленного метана.

Теоретический расчет стехиометрического баланса проводили для способа с использованием или без использования диоксида углерода (CO₂) для разных источников азота.

В этой таблице приведены теоретические значения для разных уравнений при использовании разных источников углерода и азота:

Способ Источник(и) углерода Источник азота a b c d* e f Без CO₂ CH₄ NaNO₃ 1,22 0,104 0 0,52 0,48 1,532 CH₄ NH₃ 1,45 0,104 0 0,52 0,48 1,69 CH₄ NH₄NO₃ 1,35 0,052 0 0,52 0,48 1,64 С CO₂ CH₄+CO₂ NaNO₃ 1,22 0,104 0,13 0,52 0,61 1,532 CH₄+CO₂ NH₃ 1,454 0,104 0,247 0,52 0,727 1,688 CH₄+CO₂ NH₄NO₃ 0,65 0,052 0,195 0,52 0,675 1,532

*Предполагается, что для выхода биомассы в зависимости от потребления метана - коэффициент выхода (d) равен 0,52 (моль/моль).

M. capsulatus выращивали отдельно или вместе с 3 другими штаммами бактерий (Alcaligen acidovorans (NCIMB 13287), Bacillus firmus (NCIMB 13280) и Aneurobacillus danicus (NCIMB 13288)) при 2 разных условиях (с CO₂ (способ, предлагаемый в настоящем изобретении) или без CO₂ (традиционные способы)) и с разными типами источников азота (нитрат, аммиак или нитрат аммония) в специальной минимальной среде. Оптическую плотность и массу клеток в сухом состоянии для биомассы, а также потребление метана и диоксида углерода (CO₂) определяли каждые 2-3 ч в периодической фазе в способе, предлагаемом в настоящем изобретении. Вследствие более медленного роста частота отбора образцов для традиционного способа, в котором отсутствует CO₂, была меньше. Скорость роста, обеспечиваемая в способе без использования CO₂, не обнаруживает увеличения и для роста необходимо не менее 6 дней (данные не приведены), тогда как при использовании источника углерода, такого как природный газ, вместе с CO₂ происходит намного более быстрый рост при максимальной удельной скорости роста, равной 0,16 ч^-1 (см. таблицу с результатами). Такой же результат получен при использовании U-образного петлевого ферментера с рабочим объемом, равным 100 л.

На фиг. 1 представлен рост M. capsulatus в ферментационном баке объемом 1 л (a) при использовании традиционного способа с применением метана в качестве единственного источника углерода. Непрерывную культивацию начинали через 4-5 дней роста в периодическом режиме с использованием скорости разбавления, равной 0,05 ч^-1. Измерения массы клеток в сухом состоянии и оптической плотности культуры при 550 нм (OD550) показали, что удельная скорость роста равна примерно 0,04 ч^-1, Концентрация биомассы в стационарном состоянии равна 2-2,5 г/л, данные не приведены, и (b) при использовании способа ферментации, предлагаемого в настоящем изобретении. Непрерывную культивацию начинали лишь через 1 день вследствие высокой удельной скорости роста (примерно 0,16 ч^-1; по данным массы клеток в сухом состоянии и OD550) и использовали скорость разбавления, равную 0,05 ч^-1. Концентрация биомассы в стационарном состоянии равна 4 г/л, данные не приведены.

Эти результаты ясно показывают, что культивацию микроорганизмов, таких как метанотрофные бактерии (methylococcaceae), например, M. capsulatus при добавлении CO₂, предлагаемом в настоящем изобретении, можно значительно улучшить и что производственные расходы в пересчете на 1 г белка можно значительно уменьшить по сравнению с традиционными способами ферментации.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ увеличения выработки биомассы и/или скорости роста микроорганизмов в способе ферментации (варианты) и ферментационный бак. Способ включает предоставление включающих метанотрофную бактериальную клетку микроорганизмов, предоставление субстрата для ферментации, смешивание микроорганизмов и субстрата, добавление ферментационного бульона в ферментационный бак, введение газообразного субстрата в ферментационный бульон и проведение процедуры ферментации в течение периода ферментации, равного не менее 1 часа. Причем газообразный субстрат включает CO₂, где количество вводимого в ферментационный бульон CO₂ равно не менее 0,001 л/мин/л ферментационного бульона. В одном варианте способа газообразный субстрат включает комбинацию двух или большего количества источников углерода. Ферментационный бак включает вход для введения газообрзного субстрата и представляет собой аэролифтный реактор, петлевой реактор или U-образный реактор, где вход выполнен с возможностью введения CO₂ в количестве, равном не менее 0,001 л/мин/л ферментационного бульона. Изобретения обеспечивают увеличенную выработку биомассы и скорость роста микроорганизмов. 3 н. и 30 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Способ увеличения выработки биомассы и/или скорости роста микроорганизмов в способе ферментации, указанный способ включает стадии:

(i) предоставление одного или большего количества микроорганизмов, где микроорганизм включает бактериальную клетку и бактериальная клетка включает метанотрофную бактериальную клетку;

(ii) предоставление субстрата для ферментации, пригодного для ферментации с помощью одного или большего количества микроорганизмов;

(iii) смешивание одного или большего количества микроорганизмов и субстрата для ферментации с получением ферментационного бульона;

(iv) добавление ферментационного бульона в ферментационный бак;

(v) введение по меньшей мере одного газообразного субстрата в ферментационный бульон;

(vi) проведение процедуры ферментации в течение периода ферментации, равного не менее 1 часа;

где по меньшей мере один газообразный субстрат включает диоксид углерода (CO₂), и где количество CO₂, вводимого в ферментационный бульон, равно не менее 0,001 л/мин/л ферментационного бульона.

2. Способ по п. 1, в котором газообразный субстрат дополнительно включает соединение C1.

3. Способ увеличения выработки биомассы и/или скорости роста микроорганизмов в способе ферментации, указанный способ включает стадии:

(i) предоставление одного или большего количества микроорганизмов, где микроорганизм включает бактериальную клетку и бактериальная клетка включает метанотрофную бактериальную клетку;

(ii) предоставление субстрата для ферментации, пригодного для ферментации с помощью одного или большего количества микроорганизмов;

(iii) смешивание одного или большего количества микроорганизмов и субстрата для ферментации с получением ферментационного бульона;

(iv) добавление ферментационного бульона в ферментационный бак;

(v) введение по меньшей мере одного газообразного субстрата в ферментационный бульон;

(vi) проведение процедуры ферментации в течение периода ферментации, равного не менее 1 часа;

где по меньшей мере один газообразный субстрат включает комбинацию двух или большего количества источников углерода.

4. Способ по п. 3, в котором комбинация двух или большего количества источников углерода представляет собой комбинацию одного или большего количества парниковых газов с одним или большим количеством C1 алканов.

5. Способ по любому из пп. 3 или 4, где комбинация двух или большего количества источников углерода включает комбинацию диоксида углерода (CO₂) и метана.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором смешивание одного или большего количества микроорганизмов и субстрата для ферментации с получением ферментационного бульона проводят в ферментационном баке.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором ферментационный бульон перемешивают.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где способ ферментации проводят в аэролифтном реакторе, петлевом реакторе, U-образном реакторе или реакторе с механическим перемешиванием.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором давление в ферментационном бульоне и газообразном субстрате увеличивается, так что превышение давления по сравнению с давлением снаружи от ферментационного бака составляет не менее 1,5 бар.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором метанотрофная бактериальная клетка выбрана из числа Methylococcus.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где способ ферментации представляет собой периодическую ферментацию, периодическую ферментацию с подпиткой или непрерывный способ ферментации.

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где непрерывный способ ферментации проводят как хемостатный, pH-статный, продукт-статный или другой непрерывный режим способа ферментации.

13. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором газообразный субстрат содержит не менее 0,05% диоксида углерода.

14. Способ по любому из пп. 2-13, в котором C1 представляет собой алкан.

15. Способ по любому из пп. 2-14, в котором соединение C1 и/или алкан представляет собой метан, метанол, природный газ или любую их комбинацию.

16. Способ по п. 15, в котором газообразный субстрат характеризуется соотношением масс диоксид углерода и алкана, составляющим 1 часть диоксида углерода на 1 часть алкана.

17. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором газообразный субстрат дополнительно включает по меньшей мере один источник азота.

18. Способ по п. 17, в котором по меньшей мере один источник азота выбран из группы, включающей аммиак, нитрат, молекулярный азот и их комбинацию; предпочтительно, если источник азота является комбинацией аммиака и нитрата.

19. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором газообразный субстрат дополнительно включает кислород.

20. Способ по п. 19, в котором кислород предоставляется как атмосферный воздух, чистый кислород или воздух, обогащенный кислородом.

21. Способ по п. 19, в котором газообразный субстрат обладает содержанием кислорода, предпочтительно атмосферного воздуха, которое в 2-15 раз больше (об./об.), чем содержание C1 алкана.

22. Способ по любому из пп. 19-21, в котором газообразный субстрат обладает содержанием кислорода, предпочтительно атмосферного воздуха, которое в 5-25 раз больше (об./об.), чем содержание диоксида углерода (CO₂).

23. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором скорость роста микробов во время проведения способа ферментации равна не менее 0,04 ч^-1.

24. Способ по любому из пп. 3-23, в котором количество CO₂, вводимого в ферментационный бульон, равно не менее 0,001 л/мин/л ферментационного бульона.

25. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором обеспечивается выработка биомассы, равная не менее 2,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии.

26. Способ по п. 25, в котором выработку биомассы обеспечивают менее чем за 5 дней.

27. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором выработку биомассы, равную не менее 3,5 г/л в пересчете на массу в сухом состоянии, обеспечивают менее чем за 24 часа.

28. Ферментационный бак, включающий вход для введения по меньшей мере одного газообразного субстрата в ферментационный бак, где по меньшей мере один газообразный субстрат включает диоксид углерода (CO₂), причем ферментационный бак представляет собой аэролифтный реактор, петлевой реактор или U-образный реактор, причем вход выполнен с возможностью введения CO₂ в количестве, равном не менее 0,001 л/мин/л ферментационного бульона.

29. Ферментационный бак по п. 28, где ферментационный бак дополнительно включает одно или большее количество перемешивающих устройств.

30. Ферментационный бак по п. 29, в котором одно или большее количество перемешивающих устройств представляет собой статическое перемешивающее устройство и/или активное перемешивающее устройство.

31. Ферментационный бак по любому из пп. 28-30, где ферментационный бак дополнительно включает один или большее количество датчиков.

32. Ферментационный бак по п. 31, в котором один или большее количество датчиков представляет собой датчик для определения CO_2.

33. Ферментационный бак по п. 31 или 32, в котором один или большее количество датчиков представляет собой датчик для определения растворенного CO₂.