Изобретение относится к гену, кодирующему РНК-зависимую РНК-полимеразу (L) вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки и рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей экспрессию указанного гена за счет цитомегаловирусного (CMV) промотора, а также их интеграцию в геном клеток млекопитающих за счет инвертированных повторов, фланкирующих последовательность гена интереса, промоторных элементов и селективного маркера, и может быть использовано в биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине.
Геморрагическая лихорадка Крым-Конго - это особо опасное природно-очаговое трансмиссивное заболевание, вызываемое вирусом Крымско-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), одно из широко распространенных в мире арбовирусных инфекций, также является рекуррентной инфекцией, эндемичной для юга Европейской части России. Вирус ККГЛ относится к семейству Nairoviridae, порядку Bunyavirales. Геном вируса ККГЛ состоит из трех сегментов: малого (S), среднего (М) и большого (L), представленных одноцепочечной РНК отрицательной полярности [1].
Переносчиками вируса являются иксодовые клещи рода Hyalomma, а хозяевами и резервуаром в природе дикие млекопитающие. Ареал распространения вируса ККГЛ, практически совпадает с ареалом распространения клещей рода Hyalomma и охватывает Африку и южную часть Евразии. Для более чем 30 стран была выявлена заболеваемость ККГЛ или же показано наличие вируса ККГЛ в клещах [10].
На данный момент не существует одобренной вакцины, однако имеется множество вакцинных препаратов, которые включают в себя субъединичные антигены, генетически модифицированные растения, вирусные векторы и ДНК-вакцины, экспрессирующие антигены ККГЛ, вирусоподобные частицы (VLP), препараты матричной РНК (мРНК) и инактивированные вирусные частицы [7].
Известно решение по патенту (WO 2020123989, МПК А61К 39/12, опубл. 18.06.2020 г.) [11], где был предложен вариант репликонных вирусных частиц, содержащих все вирусные белки, S- и L-сегменты генома, но не содержащих полноразмерного М-сегмента. Получение вирусных частиц на культуре клеток достигалось путем трансфекции плазмидами pCAGGS, содержащие все три рамки считывания, и минигеномными плазмидами рТ7, содержащие полноразмерные S- и L-сегменты. Для увеличения титра, авторы дополнительно размножали репликонные вирусные частицы, на клеточной культуре Huh7, трансфицированной также pCAGGS-GPC-Oman.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является решение по патенту (US 9109199, МПК А61К 39/12, опубл. 18.08.2015 г.) [12], где описан способ получения репликонных частиц буньявирусов, включая вирус лихорадки долины Рифт и ККГЛ, путем транс-комплементации структурных гликопротеинов Gc и Gn как в присутствии, так и в отсутствии кодирующих областей NSm. Транс-комплементация достигалась путем транзиентной экспрессии полноценных вирусных гликопротеинов в клеточной культуре BHK-21 плазмидой pCAGGS, кодирующей открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ или же путем использования вирусного вектора, кодирующего открытую рамку считывания М-сегмента вируса ККГЛ. В патенте раскрывается подход дизайна репликонных частиц буньявирусов с целью изучения иммунного ответа, разработки средств диагностики буньявирусных инфекций, а также изучения свойств вирусов за пределами помещений класса BSL-4.
Недостатками вышеперечисленных решений является использование дополнительных плазмид или вирусного вектора, которые бы обеспечивали продукцию вирусных гликопротеинов, что может повлечь снижение титра репликонных частиц, а также потерю способности клеточной линии к экспрессии гликопротеинов. Дополнительно, при исключении из вирусной частицы М-сегмента, происходит снижение Т-клеточного ответа, поскольку не обеспечивается внутриклеточный синтез основного структурного антигена. Кроме того, это решение не является технологичным для серийного производства вакцинных препаратов, поскольку при пассировании суспензионных клеточных культур необходима их постоянная трансфекция экспрессионной плазмидой, кодирующей вирусные гликопротеины.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых подходов, обеспечивающих более стабильную экспрессию вирусных генов и их использовании для разработки кандидатных вакцинных препаратов.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом заявленного изобретения является создание рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей интеграцию и стабильную экспрессию РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки и не имеющих недостатков выше приведенных аналогов и прототипа.
Указанный технический результат достигается путем создания гена, кодирующего открытую рамку считывания L-сегмента вируса ККГЛ, который представлен последовательностью SEQ ID NO: 1 длиной 11838 п. н.
Указанный технический результат также достигается созданием рекомбинантной плазмиды pSB3delta-RdRp, которая имеет размер 18270 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 4 целевой ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 длиной 3945 а.к.о., и состоит из следующих элементов:
• ген β-лактамазы (координаты с 17218 по 18078 п.н.) под контролем промотора (координаты с 18079 по 18183 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E. coli;
• точка начала репликации ori плазмидного вектора pUC (координаты с 16459 по 17047 п. н.);
• 5'-ITR и 3'-ITR инвертированные повторы, имеющие координаты с 17 по 241 п.н. и с 15990 по 16214 п.н. соответственно, обеспечивают интеграцию участка плазмиды, заключенного между ними, в геном клеток млекопитающих при помощи транспозазы Sleeping Beauty (SB);
• промотор и энхансер цитомегаловируса человека (CMV) -обеспечивает экспрессию гена по п. 1 в клетках млекопитающих (координаты с 855 по 1438 п.н.);
• chimeric intron - химерный интрон, обеспечивающий эффективную транскрипцию, стабильность и транспорт транскрипта из ядра клетки (координаты с 1574 по 1706 п.н.);
• Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции (координаты с 1751 по 1769 п.н.);
• L protein (RdRp) - открытая рамка считывания гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ (координаты с 1783 по 13620 п.н.);
• IRES2 - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к пуромицину (координаты с 13854 по 14240 п. н.);
• PuroR - ген устойчивости к пуромицину, кодирующий N-ацетил трансферазу (координаты с 14241 по 14843 п. н.);
• bGH poly(A) signal - сигнал полиаденелирования (координаты с 14874 по 15098 п.н.).
Существенными отличиями от прототипа, обеспечивающими достижение технического результата, являются:
1. Промоторный IE-элемент цитомегаловируса (CMV) человека необходим для получения стабильно экспрессирующих линий клеток;
2. Полученная рекомбинантная плазмида является интеграционным вектором, который содержит в своем составе ITRs, фланкирующую последовательность гена интереса, промоторных элементов и селективного маркера. Данная последовательность ITRs узнается транспозазой Sleeping Beauty (SB), с помощью которой происходит интеграция в геном клетки;
3. Ген устойчивости к антибиотику пуромицину позволяет проводить селекцию стабильно экспрессирующих клеточных трансформантов;
4. Вирусный ген РНК-зависимой РНК-полимеразы был получен из эпидемиологически значимого штамма вируса ККГЛ.
Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами. На фиг. 1 обозначена схема амплификации открытой рамки считывания L-сегмента вируса ККГЛ. На фиг. 2 представлена электрофореграмма в 1.5% агарозном геле фрагментов открытых рамок считывания М- и L-сегментов вируса ККГЛ, амплифицированных на матрице кДНК. На фиг. 3 изображена электрофореграмма в 1.5% агарозном геле продуктов overlap extension ПЦР, полученных путем объединения ампликонов, где М - ДНК-маркер 1 Kb М12 (СибЭнзим, Россия), GPC - открытая рамка считывания М-сегмента, RdRp -открытая рамка считывания L-сегмента. На фиг. 4 изображена схема конструкции рекомбинантной плазмиды pSB3delta-RdRp. На фиг. 5 представлена электрофореграмма в 1% агарозном геле фрагментов ДНК после гидролиза плазмид pSB3delta-GPC и pSB3delta-RdRp эндонуклеазами рестрикции XhoI и MluI, где М - ДНК-маркер 1 Kb M12 (СибЭнзим, Россия), GPC - ДНК pSB3delta-GPC, гидролизованная ферментами XhoI - MluI, RdRp - ДНК pSB3delta-RdRp, гидролизованная ферментами XhoI - MluI. На фиг. 6 показаны монослои клеточной линии ВНК-21/13, не подвергавшиеся трансфекции, без добавления (А) и с добавлением (Б) пуромицина с концентрацией 4 мкг/мл. На фиг. 7 показаны популяции клеточных линий ВНК-21/13 через двое (А), через пять (Б) суток и через семь (В) суток после трансфекции плазмидами pSB100X и pSB3delta-RdRp. На фиг. 8 показано электрофоретическое разделение продуктов амплификации внутреннего участка L-сегмента вируса ККГЛ, где М - маркер длин ДНК 1 kb M12 (СибЭнзим, Россия); 1-6 - ампликоны, полученные с использованием раствора выделенных РНК/ДНК с концентрацией ДНК от 0,0625 нг до 50 нг; 7-12 - ампликоны, полученные с использованием образца после обратной транскрипции с концентрацией ДНК от 0,0625 нг до 50 нг; К- - образец отрицательного контроля, содержащий ПЦР-смесь без ДНК-матрицы.
Осуществление изобретения. Первым этапом создания целевых плазмид стал выбор способа экспрессии целевых генов в клеточных культурах. Для этого была выбрана система транспозонов Sleeping Beauty, которая позволяет высокоэффективно осуществляет встройку в геном фрагментов ДНК различной длины, ограниченных опознаваемыми особыми последовательностями - так называемыми инвертированными концевыми повторами (англ. ITR, inverted terminal repeats). Кассета, предназначенная для встройки в геном и ограниченная ITR, доставляется в клетку в составе плазмидного вектора. При одновременной доставке вектора и осуществляющейся в клетке экспрессии транспозазы, кассета вырезается из вектора и встраивается в произвольное место в геноме клетки-хозяина. Таким образом, высокоэффективно осуществляется стабильная трансфекция клеточных культур [8]. Использование клеточных линий, стабильно экспрессирующих вирусные белки, может стать преимуществом при разработке кандидатных ДНК-вакцин и VLP против вируса ККГЛ и других вирусов порядка Bunyavirales.
В качестве целевого гена были выбраны участки, кодирующие РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ (открытая рамка считывания L-сегмента). Такой выбор обусловлен тем, что ген кодирует вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая необходима для репликации вирусной РНК и обеспечения ее ассоциации в RNP-комплексы [6].
Таким образом, данное изобретение может быть использовано для создания принципиально новой системы репликонов, где транскомплементация будет осуществляться при помощи интеграционной плазмиды, кодирующей ген РНК-зависимой РНК-полимеразы.
Пример 1. Получение кДНК копий L-сегментов вируса ККГЛ
Подбор праймеров (Таблица 1) осуществляли с помощью ПО SnapGene v.3.2.1 и Oligo7, используя в качестве референса последовательности М- и L-сегмента вируса ККГЛ изолят Ast199 (последовательности GenBank: КХ056051, КХ056050). Синтез олигонуклеотидных праймеров был проведен биотехнологической компанией «Евроген» (г. Москва). Сайты рестрикции в олигонуклеотидах обозначены подчеркиванием и полужирным шрифтом.
1.1. Выделение вирусной РНК и постановка реакции обратной транскрипции
Выделение тотальной РНК проводили из вируссодержащего материала (инфицированный монослой культуры клеток Vero в лизирующем буфере AVL). Для выделения использовали коммерческий набор QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии рекомендациями производителя. Элюат хранили при минус 20°С; в следующем этапе работы использовали его для постановки обратной транскрипции.
Для получения первой цепи ДНК на матрице вирусной геномной РНК использовали набор RNAscribe RT (Biolabmix, Россия). Для проведения реакции пробирку с смесью необходимых компонентов помещали в амплификатор Thermal Cycler С1000 (BioRad, США) и использовали рекомендуемый производителем температурно-временной профиль.
1.2. Амплификация методом ПЦР кДНК фрагментов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ
Методом ПЦР с использованием специфических праймеров (Таблица 1) были амплифицированы участки, согласно Фиг. 1. Для амплификации использовали высокоточную полимеразу Phusion High-Fidelity (NEB, США), постановку реакции осуществляли согласно рекомендациям производителя. Реакцию для каждого фрагмента проводили в двух повторах с использованием амплификатора Thermal Cycler С1000 с заданным температурно-временным профилем (Таблица 2)
1.3. Выделение ДНК из агарозного геля
После проведения ПЦР, очистку продуктов амплификации ДНК проводили методом электрофореза в 1.5% агарозном геле в трис-ацетатном буфере (ТАЕ×1), окрашивали раствором бромистого этидия в течение 10 мин и проявляли с использованием УФ-трансиллюминатора «UV Transilluminator 2000» (Bio-Rad, США). После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле (фиг. 2) вырезали и выделяли из геля при помощи набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.
1.4. Объединение фрагментов при помощи overlap-extension ПЦР
Концентрацию выделенных ДНК фрагментов измеряли при помощи NanoDrop One (Thermo Scientific, США). После чего, фрагменты смешивали в эквимолярных количествах и осуществляли первый этап (overlap) синтеза кДНК копий, кодирующих ORF L-сегментов с помощью полимеразы Phusion High-Fidelity (NEB, США), используя температурно-временной профиль, представленный в Таблице 3. Второй этап (extension) осуществляли при помощи концевых праймеров, содержащих сайты рестрикции SmaI и MluI (Таблица 1) с заданным температурно-временным профилем (Таблица 4).
Очистку продуктов амплификации ДНК при помощи электрофореза в агарозном геле осуществляли способом, описанным ранее. После визуализации под УФ-излучением фрагменты ДНК необходимой длины, разделенные в агарозном геле (фиг. 3), вырезали и выделяли из геля аналогичным образом.
Пример 2 Получение интеграционной конструкции pSB3delta-RdRp, несущей открытую рамку считывания L-сегмента вируса ККГЛ 2.1. Клонирование ПЦР продуктов, несущих открытую рамку считывания L-сегмента вируса ККГЛ в плазмиду pSB3delta
Для клонирования гена РНК-зависимой РНК-полимеразы в вектор pSB3delta осуществляли ферментативный гидролиз плазмидного вектора и ПЦР продуктов с помощью эндонуклеаз рестрикции SmaI и MluI (NEB, США) с прилагаемыми к ним буферами. Реакционную смесь готовили в соответствии с активностью фермента и концентрацией ДНК. Условия реакции и длительность проведения ферментативного гидролиза ДНК подбирали в соответствии с инструкциями производителя.
Обработанные ферментами ПЦР продукты и вектор pSB3delta разделяли с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле с последующим выделением с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.
Реакцию лигирования проводили 30 минут при 22°С, используя смесь каждого из ПЦР продуктов, векторной плазмиды pSB3delta в эквимолярных количествах и ДНК-лигазы фага Т4 (ThermoFisher, США) в прилагаемом к коммерческому набору реакционном буфере. Полученную ДНК-конструкцию pSB3delta-RdRp (фиг. 4) использовали для трансформации культуры компетентных клеток E. coli штамм NEB Stable (NEB, США). Трансформанты были отобраны с помощью стандартной процедуры ПЦР-скрининга на внутренний участок каждой из вставок.
2.2. Получение плазмидной конструкции pSB3delta-RdRp и подтверждение их структуры при помощи рестрикционного анализа. С помощью бактериологической петли колонию с чашки Петри переносили в пробирку, содержащую 3,5 мл жидкой питательной среды SOB с селективным антибиотиком ампициллином (100 мкг/мл). Далее пробирки помещали в шейкер-инкубатор на 16-18 часов при 170 об/мин, 30°С. Полученную бактериальную суспензию использовали для выделения плазмидной ДНК при помощи набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.
Для подтверждения структуры полученных плазмидных конструкций был проведен гидролиз плазмидной конструкции pSB3delta-RdRp с помощью эндонуклеаз рестрикции XhoI и MluI. Согласно теоретически рассчитанной последовательности при гидролизе плазмиды pSB3delta-RdRp должны появится фрагменты длиной 12799 п. н. и 5471 п. н.
На фиг. 5 представлена электрофореграмма фрагментов ДНК после гидролиза плазмид pSB3delta-GPC и pSB3delta-RdRp эндонуклеазами рестрикции XhoI и MluI в 1% агарозном геле, где:
М - ДНК-маркер 1 Kb М12 (СибЭнзим, Россия)
GPC - ДНК pSB3delta-GPC, гидролизованная ферментами XhoI - MluI
RdRp - ДНК pSB3delta-RdRp, гидролизованная ферментами XhoI - MluI
Из данных, представленных на фиг. 5 видно, что подвижность фрагментов гидролизата плазмид pSB3delta-GPC и pSB3delta-RdRp в 1% агарозном геле относительно маркеров молекулярной массы соответствует подвижности теоретически рассчитанных фрагментов.
2.3. Подтверждение структуры плазмид секвенированием по Сэнгеру Для подтверждения корректной нуклеотидной последовательности полученных образцов использовали метод секвенирования по Сэнгеру. Для постановки реакции использовали набор BrilliantDye Terminator (v3.1) Cycle Sequencing kit (Nimagen, Нидерланды), очищали образцы через Sephadex G-50 Superfine (Cytiva, Швеция) колоночным методом согласно рекомендациям производителя, после чего передавали для проведения капиллярного гель-электрофореза на автоматическом секвенаторе 3500x1 Applied Biosystems (США). Полученные хроматограммы анализировали с использованием программного обеспечения SnapGene 3.2.1.
Пример 3. Липофекция клеточной линии ВНК-21/13 плазмидой pSB100X/pSB3delta-RdRp и подтверждение экспрессии гена РНК-зависимой РНК-полимеразы. Для создания линий клеток, стабильно экспрессирующих ген РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ, была выбрана перевиваемая клеточная линия ВНК-21/13. Для липофекции использовали набор Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, США). Количество взятой для трансфекции плазмидной ДНК в сумме составляло 3 мкг для одной лунки, с соотношением 1 часть плазмиды pSB100X к 9 частям плазмиды pSB3delta-RdRp. Смесь для липофекции готовили согласно рекомендациям производителя. Перед проведением трансфекции делали рассев клеток на культуральном 6-луночном планшете по 2 мл клеточной суспензии с концентрацией 100 тыс. клеток/мл на лунку в питательной ростовой среде DMEM/F-12 с 7%-содержанием фетальной бычьей сыворотки. Планшет инкубировали до получения монослоя клеток с конфлюентностью в 70-90%.
В культуральном 6-луночном планшете, содержащем монослой клеточной линии, делали замену питательной среды DMEM/F-12 на среду с пониженным содержанием сыворотки OptiMEM (2 мл на лунку), после чего вносили по 250 мкл полученной смеси ДНК-липидного комплекса в 3 лунки, распределяя смесь по всей поверхности. В качестве контроля оставляли 3 лунки с монослоем клеток без добавления ДНК-липидного комплекса. После инкубации в течение двух суток при 37°С в СО2-инкубаторе заменяли кондиционированную питательную среду с пониженным содержанием сыворотки OptiMEM на среду DMEM/F-12 с добавлением селективного антибиотика пуромицина с концентрацией 5 мкг/мл. В одну из трех лунок с монослоем клеток, которые не подвергались трансфекции, вносили питательную среду без добавления антибиотика для наблюдения состояния клеточной популяции (фиг. 6). Далее проводили инкубацию при 37°С в CO2-инкубаторе со сменой питательной среды каждые 2-3 дня до получения монослоя трансфицированных клеток с конфлюентностью 70-90% (фиг. 7).
Для подтверждения экспрессии гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ проводили выделение РНК и ДНК из суспензии клеток трансгенной линии BHK-21/13 с помощью набор реагентов «РИБО-преп» (Helicon, Россия). Часть раствора очищенных РНК/ДНК гидролизовали ДНКазой I (NEB, США), свободной от РНКаз, и использовали для получения кДНК методом обратной транскрипции с олигонуклеотидными праймерами F-CCHFV_L_inner и R-CCHFV_L_inner (Таблица 1), соответствующими внутреннему участку L-сегмента (размер 2215 п. н.). Количество ДНК в растворе выделенных РНК/ДНК и образце после обратной транскрипции измеряли на спектрофотометре NanoDrop One (Thermo Scientific, США) и проводили ПЦР с 6 точками 10-кратного разбавления 50 нг ДНК, содержащейся в растворе очищенных РНК/ДНК и в образце с кДНК. По результатам электрофоретического разделения в агарозном геле продуктов амплификации фрагмента можно сделать вывод, что используемые для выделения РНК и ДНК клетки трансгенной линии BHK-21/13 содержали в геноме последовательность гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ. Присутствие РНК в количестве, достаточном для успешной постановки обратной транскрипции со специфическими олигонуклеотидными праймерами, предполагает стабильную экспрессию данного гена в полученной линии клеток (фиг. 8), что подтверждает заявляемый технический результат.
Источники патентной и научно-технической информации:
1. Fields, Bernard N; Knipe, David M; Howley P.M. Fields virology 6th ed. (2013) // Book. 2013. C. 2664.
2. Goedhals D., Paweska J. Т., Burt F.J. Long-lived CD8+T cell responses following Crimean-Congo haemorrhagic fever virus infection // PLoS Neglected Tropical Diseases. 2017. №12 (11). C. e0006149.
3. Hinkula J. [и др.]. Immunization with DNA Plasmids Coding for Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus Capsid and Envelope Proteins and/or Virus-Like Particles Induces Protection and Survival in Challenged Mice // Journal of Virology. 2017. №10 (91).
4. Rodriguez S. E. [и др.]. Vesicular Stomatitis Virus-Based Vaccine Protects Mice against Crimean-Congo Hemorrhagic Fever // Scientific Reports. 2019. №1 (9). C. 1-13.
5. Spengler J.R. [и др.]. Heterologous protection against Crimean-Congo hemorrhagic fever in mice after a single dose of replicon particle vaccine // Antiviral Research. 2019. (170). C. 104573.
6. Sun Y. [и др.]. Bunyavirales ribonucleoproteins: the viral replication and transcription machinery // Critical Reviews in Microbiology. 2018. №5 (44). C. 522-540.
7. Tipih Т., Burt F.J. Crimean-congo hemorrhagic fever virus: Advances in vaccine development // BioResearch Open Access. 2020. №1 (9). C. 137-150.
8. Tschorn N., Berg K., Stitz J. Transposon vector-mediated stable gene transfer for the accelerated establishment of recombinant mammalian cell pools allowing for high-yield production of biologies // Biotechnology Letters. 2020. №7 (42). C. 1103-1112.
9. Zhang J. [и др.]. Fine mapping epitope on glycoprotein Gc from Crimean-Congo hemorrhagic fever virus // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 2019. (67). C. 24-31.
10. Куличенко A.H. [и др.]. Крымская геморрагическая лихорадка в Евразии в XXI веке: эпидемиологические аспекты // Эпидемиол. и инф. бол. Акт. вопр. 2012. (3). С. 42-53.
11. WO 2020123989, МПК А61К 39/12, опубл. 18.06.2020 г. (аналог).
12. US 9109199, МПК А61К 39/12, опубл. 18.08.2015 г. (прототип).
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный
центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
(ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)
<120> Ген, кодирующий открытую рамку считывания L-сегмента ККГЛ, и
рекомбинантная конструкция, обеспечивающая экспрессию
РНК-зависимой РНК-полимеразы (L) вируса Крым-Конго геморрагической лихорадки.
<160> 2
<210> SEQ ID NO:1
<211> 11838 п.н.
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Нуклеотидная последовательность искусственного гена, кодирующего
РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ.
<400> 1
ATGGACTTCT TGAGGAACCT TGATTGGACT CAGGTGATTG CTGGTCAATA TGTGACCAAC 60
CCTAGGTTCA ATATCTCCGA TTACTTCGAG ATTGTGCGGC AGCCTGGTGA TGGGAACTGC 120
TTCTACCACA GCATAGCTGA GCTAACCATG CCCAACAAAA CAGCCCACTC ATATCACAAC 180
ATCAAACATC TGACCGAGTT GGCAGCAAGG AAGTATTACC AAGAGGAGCC TGAGGCTAAG 240
CTTGTTGGCC TGAGTTTGGA AGATTACCTT AAGAGGATGC TGTCTGACAA CGAGTGGGGG 300
TCAACTCTTG AGGCATCCAT GCTGGCCAAA GAAATGGGCA TTACAATAAT CATTTGGACT 360
GTTGCTGCCA GTGATGAAGT GGAGGCAGGC ATAAAATTCG GAGACGGTGA TGTGTTTACA 420
GCTGTGAACC TTCTGCACTC TGGGCAAACA CATTTTGATG CTCTTAGAAT ACTGCCACAG 480
TTTGAAACAG ACACGAGGGA GGCCTTGAGT TTGGTAGATA AGGTTATAGC TGTGGATCAG 540
TTGACATCAT CCTCTAGTGA TGAGCTGCAA GACTATGAAG ATCTTGCTTT AGCACTCACA 600
AGTGTGGAAG AACCGTATAG GCGGTCAAGC TTGGATGAAG TCACTCTGTC CAGGAAACAA 660
GCAGAGCTAT TGAGGCAGAA GGCATCTCAG TTGTCTAAAT TGGTCAACAA AAGTCAGAAC 720
ATACCGACTA GAGTCGGCAG GGTCTTGGAC TGCATGTTTA ACTGCAAACT ATGTGTTGAG 780
ATATCAGCTG ACACTTTAAT TCTAAGACCA GAATCCAAAG AGAGAATTGG CGAAGTCATG 840
TCATTGCGGC AGCTAGGGCA CAAATTGCTG ACACGAGACA AACAAATCAA GCAGGAATTC 900
TCTAGAATGA AACTTTATGT TACCAAAGAT TTGCTGGACC ATCTAGATGT TGGTGGGCTG 960
TTGAGGGCTG CCTTCCCTGG AACAGGAATA GAAAGGCATA TACAGCTGCT ACACTCTGAG 1020
ATGATACTGG ACATCTGTAC TGTGTCACTT GGCATCATGT TGTCAACATT CTTGTACGGC 1080
TCTAACAATA AGAACAAGAA AAAGTTCATT ACTAACTGTC TGCTCAGTAC AGCTCTGTCT 1140
GGAAAGAAGG TGTACAAGGT TCTCGGCAAC CTAGGAAATG AACTGTTGTA TAAGGCACCC 1200
AGAAAGGCCT TAGCAACTGT CTGTAGTGCC TTATTTGGGA AGCAGATAAA CAAGCTTCAG 1260
AACTGCTTTA GAACCATAAG CCCTGTTAGC TTACTTGCAT TAAGAAATCT GGATTTTGAC 1320
TGTCTAAGTG TACAGGACTA TAGTGGCATG ATAGAAAGTA TGTCCAAATT GGATAACACT 1380
GATGTTGAAT TCAATCACAG GGAGATAGCT GATCTCAATC AATTAACTTC CCGGCTCATT 1440
ACATTAAGAA AAGAGAAAGA CACTGACCTC CTTAAACAAT GGTTTCCTGA GAGTGACCTC 1500
ACCCGCAGAA GCACCAGGAA TATCGCAAAC GCAGAGGAAT TTATCATATC TGAGTTCTTC 1560
AAAAAGAAGG ATATCATGAA ATTCATCAGC ACCTCAGGAA GGGCAATGAG TGCAGGCAAG 1620
ATTGGTAACG TCCTTTCCTA CGCACATAAC CTTTACTTGA GTAAGTCTAG TTTAAATATG 1680
ACCTCTGAGG ACATATCACA GCTTCTGATC GAGATCAAGA GATTGTATGC TCTTCAAGAA 1740
GATTCTGAAG TAGAGCCGAT AGCTATAATT TGTGATGGCA TAGAAAGCAA TATGAAACAG 1800
TTGTTTGCTA TACTGCCTCC TGACTGTGCA AGAGAGTGTG AGGTCCTCTT TGATGACATA 1860
AGAAACTCTC CAACGCACAG TACAGCCTGG AAACATGCCC TTCGGTTAAA AGGGACCGCA 1920
TATGAGGGTC TGTTTGCAAA CTGCTACGGA TGGCAATACA TTCCAGAAGA TATCAAACCA 1980
AGCCTGACCA TGTTGATACA GACTTTGTTT CCTGACAAGT TTGAAGATTT CTTAGATCGA 2040
ACCCAGTTGC ATCCAGAGTT CAGAGATTTA ACTCCTGACT TTTCGCTTAC ACAAAAGGTT 2100
CATTTCAAAA GAAATCAGAT ACCTAGTGTT GAAAATGTGC AAATCTCCAT TGATGTAACA 2160
CTGCCTGAAT CTGTGGAGGC AGTGCCGGTG ACAGAAAGAA AAATGTTCCC TCTGCCTGAA 2220
ACTCCACTGA GTGAGGTGCA TTCAATAGAG CGCATTATGG AAAATTTTTC CCGCCTTATG 2280
CATGGTGGAA GACTTTCAGC CAAGGAAAAA GATGGAGATC TTGCAGAACA AGGCAACCAG 2340
CAAAGCGCCG TTGAACACGA GAGTCCAAGC ATCTCGGCCT TCAGGGACTA TGGAGAGAGA 2400
GGAATAGTTG AGGAGAATCA CATGAGGCTT AGTGAAGAAG ATCAGCTGGA AACAAGGCAG 2460
CTGCTGTTGG TAGAAGTTGG TTTTCAAACT GATATCGATG GGAAAATAAG GACAGACCAC 2520
AAGAAATGGA AGGATATTTT AAAGCTGTTA GAGTTGCTAG GAATCAAATG CTCTTTTATC 2580
GCCTGTGCCG ACTGCTCGTC TACACCGCCA GATAGATGGT GGATTACGGA GGACAGAGTA 2640
CGAGTCTTAA AGAATTCAGT CAGTTTCCTC TTTAATAAAC TCTCTAGGAA CTCACCTACA 2700
GAGGTAACTG ACATAGTTGT TGGAGCTATA AGTACTCAAA AGGTTAGGAG TTACCTAAAG 2760
GCAGGAACTG CAACAAAAAC CCCTGTGTCG ACAAAAGACG TTCTGGAGAC TTGGGAAAAA 2820
ATGAAAGAGC ACATACTAAA TAGGCCAACA GGATTAACAC TGCCTGCCAG TTTGGAACAG 2880
GCTATGCGCA AAGGACTGGT TGAAGGTGTG GTTATCTCCA AGGAAGGTTC TGAATCATGC 2940
ATCAACATGT TGAAAGAAAA TTTGGATCGA ATAACTGATG AATTCGAGCG AACAAAATTT 3000
AAACATGAAC TAACTCAGAA TGTTACTACT AGTGAAAAAT TGCTGTTTAG CTGGTTGAGT 3060
GAAGATATCA AATCATCGAG ATGCACTGAG TGCCTCACCA ACATAAAGAA AGCCGTTGAC 3120
GAGACTGCCA ACTTGTCTGA GAAGATTGAG CTGCTTGCAT ATAATCTTCA ACTCGTTAGT 3180
CATTGCAGCA ACTGTCACCC CAATGGTGTG AGTATTAGCA ACACATCTAA TGTATGCAAG 3240
AGGTGCCCTA AAATAGAAGT AGTTAGTCAT TGCGAAAATA AAGGCTTTGA GGACAGCAAT 3300
GAATGCTTAA CAGATCTAGA CAGGCTTGTT AGGCTCACAT TACCAGGAAA AACTGAGAAG 3360
GAGAGAAGAG TCAAACGCAA TGTGGAATAC CTTATAAAAC TGATGATGAG CATGTCAGGC 3420
ATTGATTGCA TAAAATATCC CACAGGACAG CTCATCACCC ATGGAAGGGT GAGTGCAAAA 3480
CATAACGATG GAAATTTGAA AGACAGGAGT GAGGACGATC AAAGGCTAGC CGAGAAGATA 3540
GACACTGTTA GGAAGGAGCT CTCAGAATCC AAACTAAAAG ATTATTCAAC TTATGCAAGA 3600
GGGGTGATAA CAAATTCACT AAAAAACCTC TCAAAGCAGG GTAAGTCAAA GTGTTCTGTG 3660
CCGAGGTCTT GGCTTGAAAA GATATTGTTT GACTTAAAGG TGCCCACTAA AGACGAGGAA 3720
GTGCTTATAA ACATTAGAAA CTCATTGAAA GCTAGATCTG AGTTTGTTAG AAACAACGAT 3780
AAACTACTCA TAAGGTCAAA AGAAGAGTTA AAAAAATGTT TTGATGTGCA ATCATTTAAA 3840
CTAATGAAAA ACAAGCAACC TGTGCCTTTT CAAGTTGACT GTATACTGTT TAAAGAAGTG 3900
GCAGCTGAGT GCATGAAGAG GTACATCGGC ACACCTTATG AAGGAATTAT CGACACCTTA 3960
GTTTCTCTGA TTAATGTTCT GACAAGGTTC ACCTGGTTTC AAGAGGTGGT GCTATATGGT 4020
AAAATATGTG AGACCTTTCT GAGATGTTGT ACAGAATTTA ATAGGTCAGG GGTTAAACTA 4080
GTCAAGGTAA GGCACTGTGA CATTAACCTA TCAGTCAAAT TGCCATCGAA CAAAAAAGAG 4140
AACATGTTAT GTTGTATATA CAGTGGCAAC ATGGAGCTCT TGCAAGGACC TTTCTATTTG 4200
AACAGGAGAC AAGCTGTCCT CGGTTCTTCA TACCTTTACA TTGTTATTAC ACTTTACATA 4260
CAAGTAATGC AGCAGTATAG GTGTCTAGAA GTTATAAACA GTGTAAATGA AAAAACATTG 4320
CAAGACATTG AAAATCACTC CATGACTTTG CTAGAAGATG CATTCAAGGA ACTCACTTTT 4380
GCTCTTGAGG GTAGGTTTGA AGAATCTTAC AAAATACGGA CCTCTAGGTG TAAAGCTAGC 4440
GGGAACTTCT TAAACAGAAG CAGTAGAGAC CACTTTATAA GCATTGTCTC AGGCTTGAAC 4500
CTGGTTTATG GCTTCCTCAT AAAAGATAAC TTATTGGCTA ATTCTCAGCA ACAGAATAAA 4560
CAACTACAAA TGCTTCGTTT TGGCATGCTT GCGGGGCTTA GTAGGCTTGT TTGCCCTAAT 4620
GAGCTAGGGA AAAAGTTTTC GACAAGTTGT AGAAGGATTG AAGACAACAT TGCAAGACTT 4680
TACCTACAAA CATCCATATA TTGTTCAGTC AGAGACGTGG AAGACAATAT TAAGCACTGG 4740
AAGCAAAGAG ATCTATGCCC TGAAGTGACC ATTCCATGCT TTACAGTCTA TGGCACCTTC 4800
ATCAACAGCG ACAGACAGCT TATCTTTGAC ATTTACAATG TGCATATATA CAATAAAGAA 4860
ATGGATAATT TTGACGAAGG ATGTATCAGC GTCTTAGAAG AAACAGCAGA AAGACATATG 4920
CTTTGGGAAC TCGATCTGAT GAACTCACTT TGCTCTGACG AAAAAAGAGA TGCTAGAACC 4980
GCAAGATTAT TACTAGGTTG CCCAAATGTG AGGAAAGCTG CAAACAAAGA AGGGAAAAAG 5040
CTATTGAAGT CAAACAGCGA CACATCCACT GATACACAAA GCATTACTTC CGAGGTGTCA 5100
GACAGAAGGT CCTACAGCTC AAGCAAGAGT AGAATCCGTA GTATTTTTGG TAGGTACAAC 5160
TCTCAGAAAA AACCATTTGA ATTAAGGTCA GGTCTCGAAG TCTTTAATGA CCCTTTCAAT 5220
GATTATCAGC AAGCAATAAC AGACATTTGT CAATTTTCTG AGTATACACC AAACAAGGAG 5280
AGCATTTTGA AGGACTGTCT TCAAATCATA CGGAAAAACC CTAGCCACAC AATGGGTTCT 5340
TTTGAGCTGA TCCAGGCAAT TTCAGAGTTC GGCATGAGTA AATTTCCTCC AGAGAACATA 5400
GACAAGGCAA GGAGAGACCC AAAGAACTGG GTCAGCATCT CTGAAGTTAC TGAAACAACA 5460
AGTATAGTAG CATCACCCAA AACTCATATG ATGCTCAAAG ATTGTTTTAA AATTATACTA 5520
GGTACTGAGA ATAAGAAGAT AGTTAAAATG CTTCGAGGGA AGCTAAAAAA ACTCGGCGCT 5580
ATCTCTACAA ACATAGAGAT TGGGAAAAGG GATTGCTTGG ATTTACTCAG CACGGTAGAT 5640
GGTCTGACAG ACCAACAGAA AGAAAACATT GTGAATGGGA TATTTGAGCC TTCAAAGCTG 5700
TCCTTCTATC ACTGGAAAGA GTTGATCAGA AAGAATATTG ATGAAGTTTT ACTTACCGAA 5760
GATGGAAATC TGATCTTCTG CTGGCTAAAG ACAATCTCTT CTTCAGTCAA AGGAAGTTTG 5820
AAGAAGAAAC TCAAGTTCAT GAATGTAAAT TCCCCGGAAC TGATGCCAGA GAACTGTCTC 5880
TTTTCTAGTG AAGAATTCAA TGAGTTGATC AAACTGAAGA AGCTTCTCCT CAACGAGCAA 5940
CAAGATGAAC AGGAGCTGAA ACAGGACCTT TTGATATCTT CTTGGATTAA GTGCATAACA 6000
GCCTGTAAAG ATTTTGCAAG CATCAATGAC AAGGTTCAGA AATTCATTTA CCACCTTTCT 6060
GAAGAGCTGT ATGACATAAG GCTACAGCAC CTGGAACTGT CAAAGCTTAA GCAAGAACAC 6120
CCTAGTGTCA GCTTCACTAA GGAAGAGGTC TTAATAAAGC GACTAGAGAA AATTTTCCTA 6180
AAGCAGCACA ATCTGGAAAT TATGGAGACA GTAAATCTTA TATTCTTTGC CGCTCTTTCA 6240
GCTCCCTGGT GCTTACACTA CAAAGCACTA GAGTCTTATC TAGTGAGACA TCCAGAGATA 6300
CTCGACTGTG GATCTAAAGA GGACTGTAAG CTCACTTTGC TTGATCTGTC AGTTTCTAAG 6360
CTCTTAGTCT GTTTGTATCG AAAAGATGAC AATGAACTAA CAAATAGCTC AAGTCTGAAA 6420
CTTGGGTTTC TAGTAAAGTA TGCTGTTACC TTATTCACAT CCAATGGTGA ACCTTTTTCG 6480
CTTAGCCTAA ATGATGGGGG TTTAGATCTT GACCTGCACA AGACTACTGA CGAAAAGCTA 6540
CTACATCAGA CAAAGATAGT TTTTGCTAAA ATTGGTCTGT CTGGAAATAG TTATGATTTC 6600
ATCTGGACTA CTCAAATGAT AGCAAATAGC AACTTTAATG TATGCAAGAG ATTGACTGGA 6660
AGGAGTACCG GAGAGAGGCT TCCAAGAAGT GTCAGAAGCA AGGTCATTTA TGAGATGGTA 6720
AAACTTGTAG GTGAGACAGG CATGGCAATA CTACAACAGT TAGCTTTTGC ACAGGCACTA 6780
AATTACGAAC ACCGTTTCTA TGCAGTCTTA GCACCTAAGG CACAGCTAGG AGGAGCAAGA 6840
GATCTGTTGG TGCAAGAAAC TGGGACTAAG GTTATGCATG CAACAACTGA AATGTTCAGT 6900
AGAAACCTCT TAAAAACAAC ATCAGATGAT GGCCTTACCA ACCCGCATCT TAAAGAAACA 6960
ATCCTTAATG TTGGATTAGA CTGCCTTACC AACATGCGAA ATCTTGATGG AAAGCCCATA 7020
AGTGAAGGTA GCAACTTGGT CAATTTCTAC AAAGTCATAT GTATCTCAGG TGATAATACC 7080
AAATGGGGCC CAATACACTG CTGTTCCTTC TTTTCCGGCA TGATGCAGCA GGTCCTGAAA 7140
AATGTTCCAG ATTGGTGCTC ATTTTATAAA TTAACATTTA TTAAGAACTT GTGCAGGCAG 7200
GTAGAGATAC CTGCTGGTAG TATTAAGAAG ATCTTGAATG TCCTTAGATA CAAGCTGTGC 7260
AGCAAAGGAG GTGTAGAGCA ATATAGTGAA GAGGATCTAA GGAAACTGTT GGCAGATAAT 7320
TTAGACAGTT GGGACGGAAA TGACACAGTT AAGTTTTTAG TTACAACCTA TATAAGCAAA 7380
GGACTCATGG CGTTAAACAG TTACAACCAT ATGGGTCAGG GTATTCACCA TGCAACATCT 7440
TCAATATTAA CTTCTCTAGC TGCTGTGCTC TTTGAGGAGC TGGCAATTTT TTATCTTAAA 7500
AAAAGCCTAC CCCAGACAAC AGTACATGTT GAACATGCCG GCAGTTCAGA TGATTACGCA 7560
AAGTGCATAG TGGTAACTGG TATATTATCC AAAGAGCTCT ACTCTCAATA CGATGAAACA 7620
TTCTGGAAAC ATGCCTGTAG ACTTAAGAAC TTCACAGCTG CAGTACAAAG ATGTTGTCAA 7680
ATGAAAGATA GCGCCAAGAC TTTAGTGAGC GACTGTTTCC TTGAATTTTA TAGCGAATTT 7740
ATGATGGGCT ATAGAGTAAC GCCTGCTGTG ATCAAATTCA TGTTCACTGG ACTTATAAAC 7800
AGCTCTGTGA CCTCTCCTCA GAGTTTGATG CAGGCATGCC AAGTTTCGTC CCAACAAGCA 7860
ATGTATAATA GCGTTCCTCT TGTCACCAAT ACCACCTTCA CACTATTGAG GCAGCAAATT 7920
TTCTTTAACC ATGTTGAGGA TTTTATCAGA AGGTACGGCA TATTAACTCT TGGGACTTTG 7980
TCTCCCTTTG GTAGGCTGTT TGTACCAACC TACTCTGGGT TAGTTAGCTC GGCGGTTGCC 8040
TTGGAAGATG CTGAAGTCAT TGCTAGAGCA GCTCAGACAC TTCACATGAA CAGTGTGTCG 8100
ATACAGTCAA GCAGCTTGAC CACATTAGAC AGCTTAAGTA GCAGTAGGAC AAGTTCCACA 8160
GTTGAAGATA GCAGCAGTGT GAGCGACACC ACTGTTGCTT CTCATGATTC AGGATCGTCA 8220
TCCTCCAGCT TCTCTTTTGA GCTCAATAGG CCTCTGTCCG AAACTGAACT ACAATTCATC 8280
AAAGCATTAA GTAGCCTCAA ATCCACACAA GCTTGTGAAG TAATTCAGAA TAGAATTACA 8340
GGCCTTTATT GCAATAGCAA TGAGGGGCCT CTTGATAGGC ACAATGTTGT TTACAGCAGC 8400
AGGATGGCAG ATTCTTGCGA TTGGCTAAGA GATGGTAAGA GAAGAGGGAA TCTGGAACTA 8460
GCAAATAGGA TTCAGTCTGT GCTGTGTGTT TTGATAGCAG GGTACTACAG ATCATTTGGA 8520
GGTGAAGGAA CCGAAAAACA GGTAAAGGCA TCACTGAATA GAGATGACAA CAAAATCATC 8580
GAGGACCCCA TGATACAATT AATTCCAGAG AAGCTGAGGA GAGAGCTGGA GAGGTTAGGT 8640
GTCTCCAGAA TGGAAGTTGA TGAACTAATG CCGAGCATCA GCCCTGATGA CACCTTAGCC 8700
CAGCTTGTGG CAAAAAAGCT TATTAGCCTC AATGTTTCGA CGGAAGAGTA CTCGGCTGAA 8760
GTGTCTAGAC TTAAACAAAC GCTAACAGCC CGAAATGTTT TGCATGGGTT GGCTGGAGGA 8820
ATTAAGGAGC TATCGCTCCC AATATACACG ATATTCATGA AATCTTACTT CTTCAAAGAC 8880
AACGTCTTCT TATCACTAAC AGACAGATGG TCTACCAAGC ACAGTACAAA CTATCGTGAT 8940
AGTTGCGGCA AACAATTAAC CGGTAGAATA ATAACCAAGT ACACTCACTG GTTGGACACC 9000
TTTCTAGGCT GCTCGGTCTC CATTAACAGG CATACTACTG TTAAAGAACC CTCTTTATTT 9060
AATCCAAATA TCAGGTGTGT TAACCTAATC ACATTTGAAG ACGGTCTGAG AGAACTATCA 9120
GTAATACAGA GTCATCTCAA AGTCTTTGAG AATGAATTTA CCAACTTAAA CCTTCAGTTC 9180
TCCGACCCAA ACAGACAGAA ACTTAGAATA GTTGAGTCTA GACCTGCGGA ATCTGAGCTA 9240
GAGGCGAACC GTGCAGTAAT TGTTAAGACC AAATTGTTCT CAGCAACAGA ACAAGTACGA 9300
CTATCCAACA ATCCTGCAGT TGTCATGGGC TATTTATTGG ATGAATCAGC AATTTCTGAA 9360
GTCAAACCCA CCAAGGTTGA CTTCTCAAAT TTACTTAAAG ATCGCTTTAA AATAATGCAG 9420
TTTTTTCCCT CGGTGTTCAC TTTGATTAAG ATGTTGACAG ATGAATCATC GGACTCAGAA 9480
AGGAATGGCC TTAGTCCAGA CTTGCAACAA GTTGCAAGGT ACTCAAACCA TTTAACCCTG 9540
CTCAGCAGGA TGATACAGCA AGCAAAGCCA ACCGTGACGG TTTTCTACAT GCTGAAAGGT 9600
AACTTGATGA ACACAGAGCC GACAGTTGCT GAGCTTGTCA GCTATGGTAT AAAGGAAGGT 9660
AGGTTTTATA GGCTCTCAGA CACTGGAATT GATGCAAGCA CATATTCTGT GAAATACTGG 9720
AAAATTCTTC ACTGCATTTC TGCCATTGGA TGTTTGCCTT TGAGTCAAGC AGACAAGTCT 9780
TCACTACTTA TGAGTTTCTT GAACTGGAGG GTGAACATGG ACATTAGAAC TTCTGACTGT 9840
CCGCTATCTA GTCATGAGGC AAGCATACTG AGTGAGTTTG ATGGACAAGT TATCGCTAAT 9900
ATACTTGCAA GTGAATTGAG CTCTGTAAAA CGAGATTCTG AACGTGAAGG GTTAACTGAT 9960
CTCCTTGATT ATCTGAACTC ACCCACTGAA CTGTTGAAGA AGAAGCCCTA TTTAGGGACA 10020
ACTTGCAAGT TCAACACCTG GGGTGACTCA AATAGATCTG GGAAATTCAC ATACAGCAGC 10080
AGATCTGGAG AATCCATTGG AATCTTCATT GCAGGAAAAT TGCACATCCA TCTCTCATCT 10140
GAGTCCATTG CCTTATTGTG TGAAACTGAA AGACAAGTGC TATCTTGGAT GAGCAAAAGG 10200
AGAACTGAGG TGATGACCAA AGAACAGCAC CAATTGTTCC TGAGCCTCCT TCCCCAGTCA 10260
CATGAATGTT TACAAAAGCA CAAGGACGGC AGCGCACTAT CGGTCATACC TGACAGCAGC 10320
AACCCCCGAC TACTTAAATT TGTACCTCTC AAAAAAGGTC TAGCAGTGGT AAAAATCAAA 10380
AAACAAATTT TAACAGTGAA GAAACAGGTC GTGTTTGATG CTGAGAGCGA GCCTAGACTG 10440
CAGTGGGGAC ATGGTTGCTT GTCCATTGTT TACGATGAAA CTGACACTCA AACCACATAC 10500
CACGAAAATC TTTTGAAAGT GAAGCAGCTT GTTGACTGCT CTACAGATAG GAAGAAGCTT 10560
TTACCCCGGT CAGTGTTTTC TGATTCCAAA GTCGTTCTCT CAAGGATCAA GTTCAAGACA 10620
GAGCTTCTTC TTAATTCACT GACACTGCTC CACTGTTTTT TAAAACATGC TCCTAGTGAT 10680
GCCATAATGG AGGTAGAGAG TAAGAGCAGC TTGCTGCACA AGTACCTCAA ATCAGGAGGT 10740
GTCAGACAGC GAAACACTGA AGTACTCTTC AGAGAGAAGT TAAACAAGGT TGTTATAAAA 10800
GACAATCTCG AACAAGGTGT AGAAGAGGAA ATTGAGTTTT GCAATAACCT GACCAAGACC 10860
GTTTCAGAGA ACCCGCTACC ACTCAGCTGT TGGTCTGAAG TTCAAAACTA CATTGAAGAC 10920
ATAGGCTTCA ACAATGTGCT TGTTAACATT GACAGAAACA CAGTGAAAAG TGAACTTTTG 10980
TGGAAATTTA CGTTAGACAC TAATGTAAGC ACCACAAGCA CTATTAAAGA TATGAGGACA 11040
CTGGTATCCT ACGTCAGTAC TGAAACCATC CCTAAGTTCT TGCTTGCATT CCTTCTTTAC 11100
GAAGAAGTAT TGATGAACCT AGTCAACCAG TGTAAGGCAG TAAAGGAACT CATCAACAGT 11160
ACAGGACTTT CAGACTTGGA ACTAGAAAGC TTGCTTACTT TCTGCACTTT CTATTTCCAA 11220
AATGAATGCA GTAGGAGAGA TGGACCTAGA TGTTCCTTTG CAGCACTATT AAGCCTAGTT 11280
CATGAAGATT GGCAAAAGAT AGGGAGAAAT ATCCTTGTTC GTGCAAACAA TGAGCTAGGC 11340
GATGTGTCAC TGAAGGTTAA TATTGTCTTG GTACCCCTCA AGGACATGTC CAAACCAAAG 11400
CCTGAAAGAG TGGTTATAGC CAGGAGGTCG TTAAATCATG CACTATCCTT AATGTTTCTG 11460
GACGAGATGT CATTGCCTGA GCTGAAGTCT TTGTCAGTGA ACTGCAAAAT GGGGAACTTT 11520
GAGGGGCAGG AGTGCTTTGA GTTTACTATT CTAAAGGACA ACAGCACAAG GCTAGATTAC 11580
AATAAGTTGA TTGACCATTG TGTGGATATG GAAAAAAAGA GGGAAGCAGT TAGAGCAGTA 11640
GAGGATTTGA TTCTGATGTT AACAGGCAAG GCAGTCAAAC CTAGTACTGT GACACAAATT 11700
GAACACAAGG ATGAGCAGTG TCAGGAGCAA ATAAGCTTGG ATGACCTAAT GGCAAGTGAT 11760
ACAGCGATAG ACTTGCCTGA CAGGGAAGCA GAAGCCCTTA AAACAGGAAA CCTTGGCTTT 11820
AACTGGGATT CAGATTGA 11838
<210> SEQ ID NO:2
<211> 3945 а.к.о.
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аминокислотная последовательность РНК-зависимой РНК-полимеразы
вируса ККГЛ
<400> 2
MDFLRNLDWT QVIAGQYVTN PRFNISDYFE IVRQPGDGNC FYHSIAELTM PNKTAHSYHN 60
IKHLTELAAR KYYQEEPEAK LVGLSLEDYL KRMLSDNEWG STLEASMLAK EMGITIIIWT 120
VAASDEVEAG IKFGDGDVFT AVNLLHSGQT HFDALRILPQ FETDTREALS LVDKVIAVDQ 180
LTSSSSDELQ DYEDLALALT SVEEPYRRSS LDEVTLSRKQ AELLRQKASQ LSKLVNKSQN 240
IPTRVGRVLD CMFNCKLCVE ISADTLILRP ESKERIGEVM SLRQLGHKLL TRDKQIKQEF 300
SRMKLYVTKD LLDHLDVGGL LRAAFPGTGI ERHIQLLHSE MILDICTVSL GIMLSTFLYG 360
SNNKNKKKFI TNCLLSTALS GKKVYKVLGN LGNELLYKAP RKALATVCSA LFGKQINKLQ 420
NCFRTISPVS LLALRNLDFD CLSVQDYSGM IESMSKLDNT DVEFNHREIA DLNQLTSRLI 480
TLRKEKDTDL LKQWFPESDL TRRSTRNIAN AEEFIISEFF KKKDIMKFIS TSGRAMSAGK 540
IGNVLSYAHN LYLSKSSLNM TSEDISQLLI EIKRLYALQE DSEVEPIAII CDGIESNMKQ 600
LFAILPPDCA RECEVLFDDI RNSPTHSTAW KHALRLKGTA YEGLFANCYG WQYIPEDIKP 660
SLTMLIQTLF PDKFEDFLDR TQLHPEFRDL TPDFSLTQKV HFKRNQIPSV ENVQISIDVT 720
LPESVEAVPV TERKMFPLPE TPLSEVHSIE RIMENFSRLM HGGRLSAKEK DGDLAEQGNQ 780
QSAVEHESPS ISAFRDYGER GIVEENHMRL SEEDQLETRQ LLLVEVGFQT DIDGKIRTDH 840
KKWKDILKLL ELLGIKCSFI ACADCSSTPP DRWWITEDRV RVLKNSVSFL FNKLSRNSPT 900
EVTDIVVGAI STQKVRSYLK AGTATKTPVS TKDVLETWEK MKEHILNRPT GLTLPASLEQ 960
AMRKGLVEGV VISKEGSESC INMLKENLDR ITDEFERTKF KHELTQNVTT SEKLLFSWLS 1020
EDIKSSRCTE CLTNIKKAVD ETANLSEKIE LLAYNLQLVS HCSNCHPNGV SISNTSNVCK 1080
RCPKIEVVSH CENKGFEDSN ECLTDLDRLV RLTLPGKTEK ERRVKRNVEY LIKLMMSMSG 1140
IDCIKYPTGQ LITHGRVSAK HNDGNLKDRS EDDQRLAEKI DTVRKELSES KLKDYSTYAR 1200
GVITNSLKNL SKQGKSKCSV PRSWLEKILF DLKVPTKDEE VLINIRNSLK ARSEFVRNND 1260
KLLIRSKEEL KKCFDVQSFK LMKNKQPVPF QVDCILFKEV AAECMKRYIG TPYEGIIDTL 1320
VSLINVLTRF TWFQEVVLYG KICETFLRCC TEFNRSGVKL VKVRHCDINL SVKLPSNKKE 1380
NMLCCIYSGN MELLQGPFYL NRRQAVLGSS YLYIVITLYI QVMQQYRCLE VINSVNEKTL 1440
QDIENHSMTL LEDAFKELTF ALEGRFEESY KIRTSRCKAS GNFLNRSSRD HFISIVSGLN 1500
LVYGFLIKDN LLANSQQQNK QLQMLRFGML AGLSRLVCPN ELGKKFSTSC RRIEDNIARL 1560
YLQTSIYCSV RDVEDNIKHW KQRDLCPEVT IPCFTVYGTF INSDRQLIFD IYNVHIYNKE 1620
MDNFDEGCIS VLEETAERHM LWELDLMNSL CSDEKRDART ARLLLGCPNV RKAANKEGKK 1680
LLKSNSDTST DTQSITSEVS DRRSYSSSKS RIRSIFGRYN SQKKPFELRS GLEVFNDPFN 1740
DYQQAITDIC QFSEYTPNKE SILKDCLQII RKNPSHTMGS FELIQAISEF GMSKFPPENI 1800
DKARRDPKNW VSISEVTETT SIVASPKTHM MLKDCFKIIL GTENKKIVKM LRGKLKKLGA 1860
ISTNIEIGKR DCLDLLSTVD GLTDQQKENI VNGIFEPSKL SFYHWKELIR KNIDEVLLTE 1920
DGNLIFCWLK TISSSVKGSL KKKLKFMNVN SPELMPENCL FSSEEFNELI KLKKLLLNEQ 1980
QDEQELKQDL LISSWIKCIT ACKDFASIND KVQKFIYHLS EELYDIRLQH LELSKLKQEH 2040
PSVSFTKEEV LIKRLEKIFL KQHNLEIMET VNLIFFAALS APWCLHYKAL ESYLVRHPEI 2100
LDCGSKEDCK LTLLDLSVSK LLVCLYRKDD NELTNSSSLK LGFLVKYAVT LFTSNGEPFS 2160
LSLNDGGLDL DLHKTTDEKL LHQTKIVFAK IGLSGNSYDF IWTTQMIANS NFNVCKRLTG 2220
RSTGERLPRS VRSKVIYEMV KLVGETGMAI LQQLAFAQAL NYEHRFYAVL APKAQLGGAR 2280
DLLVQETGTK VMHATTEMFS RNLLKTTSDD GLTNPHLKET ILNVGLDCLT NMRNLDGKPI 2340
SEGSNLVNFY KVICISGDNT KWGPIHCCSF FSGMMQQVLK NVPDWCSFYK LTFIKNLCRQ 2400
VEIPAGSIKK ILNVLRYKLC SKGGVEQYSE EDLRKLLADN LDSWDGNDTV KFLVTTYISK 2460
GLMALNSYNH MGQGIHHATS SILTSLAAVL FEELAIFYLK KSLPQTTVHV EHAGSSDDYA 2520
KCIVVTGILS KELYSQYDET FWKHACRLKN FTAAVQRCCQ MKDSAKTLVS DCFLEFYSEF 2580
MMGYRVTPAV IKFMFTGLIN SSVTSPQSLM QACQVSSQQA MYNSVPLVTN TTFTLLRQQI 2640
FFNHVEDFIR RYGILTLGTL SPFGRLFVPT YSGLVSSAVA LEDAEVIARA AQTLHMNSVS 2700
IQSSSLTTLD SLSSSRTSST VEDSSSVSDT TVASHDSGSS SSSFSFELNR PLSETELQFI 2760
KALSSLKSTQ ACEVIQNRIT GLYCNSNEGP LDRHNVVYSS RMADSCDWLR DGKRRGNLEL 2820
ANRIQSVLCV LIAGYYRSFG GEGTEKQVKA SLNRDDNKII EDPMIQLIPE KLRRELERLG 2880
VSRMEVDELM PSISPDDTLA QLVAKKLISL NVSTEEYSAE VSRLKQTLTA RNVLHGLAGG 2940
IKELSLPIYT IFMKSYFFKD NVFLSLTDRW STKHSTNYRD SCGKQLTGRI ITKYTHWLDT 3000
FLGCSVSINR HTTVKEPSLF NPNIRCVNLI TFEDGLRELS VIQSHLKVFE NEFTNLNLQF 3060
SDPNRQKLRI VESRPAESEL EANRAVIVKT KLFSATEQVR LSNNPAVVMG YLLDESAISE 3120
VKPTKVDFSN LLKDRFKIMQ FFPSVFTLIK MLTDESSDSE RNGLSPDLQQ VARYSNHLTL 3180
LSRMIQQAKP TVTVFYMLKG NLMNTEPTVA ELVSYGIKEG RFYRLSDTGI DASTYSVKYW 3240
KILHCISAIG CLPLSQADKS SLLMSFLNWR VNMDIRTSDC PLSSHEASIL SEFDGQVIAN 3300
ILASELSSVK RDSEREGLTD LLDYLNSPTE LLKKKPYLGT TCKFNTWGDS NRSGKFTYSS 3360
RSGESIGIFI AGKLHIHLSS ESIALLCETE RQVLSWMSKR RTEVMTKEQH QLFLSLLPQS 3420
HECLQKHKDG SALSVIPDSS NPRLLKFVPL KKGLAVVKIK KQILTVKKQV VFDAESEPRL 3480
QWGHGCLSIV YDETDTQTTY HENLLKVKQL VDCSTDRKKL LPRSVFSDSK VVLSRIKFKT 3540
ELLLNSLTLL HCFLKHAPSD AIMEVESKSS LLHKYLKSGG VRQRNTEVLF REKLNKVVIK 3600
DNLEQGVEEE IEFCNNLTKT VSENPLPLSC WSEVQNYIED IGFNNVLVNI DRNTVKSELL 3660
WKFTLDTNVS TTSTIKDMRT LVSYVSTETI PKFLLAFLLY EEVLMNLVNQ CKAVKELINS 3720
TGLSDLELES LLTFCTFYFQ NECSRRDGPR CSFAALLSLV HEDWQKIGRN ILVRANNELG 3780
DVSLKVNIVL VPLKDMSKPK PERVVIARRS LNHALSLMFL DEMSLPELKS LSVNCKMGNF 3840
EGQECFEFTI LKDNSTRLDY NKLIDHCVDM EKKREAVRAV EDLILMLTGK AVKPSTVTQI 3900
EHKDEQCQEQ ISLDDLMASD TAIDLPDREA EALKTGNLGF NWDSD* 3945
<---
Изобретение относится к биотехнологии. Описан ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 длиной 11838 п.н. Также описана рекомбинантная плазмида pSB3delta-RdRp, предназначенная для интеграции и экспрессии гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ, имеет размер 18270 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой целевой ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 длиной 3945 а.к.о., и состоит из следующих элементов: ген β-лактамазы (координаты с 17218 по 18078 п.н.) под контролем промотора (координаты с 18079 по 18183 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli; точка начала репликации ori плазмидного вектора pUC (координаты с 16459 по 17047 п.н.); 5'-ITR и 3'-ITR инвертированные повторы, имеющие координаты с 17 по 288 п.н. и с 15990 по 16214 п.н. соответственно, обеспечивают интеграцию участка плазмиды, заключенного между ними, в геном клеток млекопитающих при помощи транспозазы Sleeping Beauty (SB); промотор и энхансер CMV - обеспечивает экспрессию гена по п. 1 в клетках млекопитающих (координаты с 855 по 1438 п.н.); chimeric intron - химерный интрон, обеспечивающий эффективную транскрипцию, стабильность и транспорт транскрипта из ядра клетки (координаты с 1574 по 1706 п.н.); Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции (координаты с 1751 по 1769 п.н.); L protein (RdRp) - открытая рамка считывания гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ по п. 1 (координаты с 1783 по 13620 п.н.); IRES2 - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к пуромицину (координаты с 13854 по 14240 п.н.); PuroR - ген устойчивости к пуромицину, кодирующий N-ацетил трансферазу (координаты с 14241 по 14843 п.н.); bGH poly(A) signal - сигнал полиаденелирования (координаты с 14874 по 15098 п.н.). Изобретение расширяет арсенал средств для борьбы с ККГЛ. 2 н.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 3 пр.
1. Ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 длиной 11838 п.н.
2. Рекомбинантная плазмида pSB3delta-RdRp, предназначенная для интеграции и экспрессии гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ, имеет размер 18270 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 4, целевой ген по п. 1, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса ККГЛ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 длиной 3945 а.к.о., и состоит из следующих элементов:
• ген β-лактамазы (координаты с 17218 по 18078 п.н.) под контролем промотора (координаты с 18079 по 18183 п.н.), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к ампициллину клеток бактерии E.coli;
• точка начала репликации ori плазмидного вектора pUC (координаты с 16459 по 17047 п.н.);
• 5'-ITR и 3'-ITR инвертированные повторы, имеющие координаты с 17 по 288 п.н. и с 15990 по 16214 п.н. соответственно, обеспечивают интеграцию участка плазмиды, заключенного между ними, в геном клеток млекопитающих при помощи транспозазы Sleeping Beauty (SB);
• промотор и энхансер CMV - обеспечивает экспрессию гена по п. 1 в клетках млекопитающих (координаты с 855 по 1438 п.н.);
• chimeric intron - химерный интрон, обеспечивающий эффективную транскрипцию, стабильность и транспорт транскрипта из ядра клетки (координаты с 1574 по 1706 п.н.);
• Т7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага Т7, необходимая для in vitro транскрипции (координаты с 1751 по 1769 п.н.);
• L protein (RdRp) - открытая рамка считывания гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса ККГЛ по п. 1 (координаты с 1783 по 13620 п.н.);
• IRES2 - внутренний сайт посадки рибосом вируса энцефаломиелита, обеспечивающий экспрессию гена устойчивости к пуромицину (координаты с 13854 по 14240 п.н.);
• PuroR - ген устойчивости к пуромицину, кодирующий N-ацетил трансферазу (координаты с 14241 по 14843 п.н.);
• bGH poly(A) signal - сигнал полиаденелирования (координаты с 14874 по 15098 п.н.).
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS MUSCULUS L. CCHFV VD-1-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА 4G/B К ВИРУСУ КРЫМ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ | 2013 |
|
RU2535982C1 |
RU 2018142031 A, 10.06.2020 | |||
CN 103172708 A, 26.06.2013. |
Авторы
Даты
2021-07-05—Публикация
2020-11-10—Подача