Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 Российский патент 2020 года по МПК A61K39/215 C12N15/86 C12N7/00 

Изобретение относится к искусственному гену, кодирующему эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей экспрессию указанного искусственного гена и рекомбинантному штамму вируса везикулярного стоматита, экспрессирующему антигены коронавируса SARS-CoV-2, индуцирующему специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2 и используемому для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и может быть использовано в биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине.

Известно решение по патенту (US, 20190062785A1, МПК A61K 39/215, А61K39/205; C12N15/86, опубл. 28.02.2019 г.), где описана вакцина на основе рекомбинантного вируса бешенства, которая обеспечивает защиту против бешенства и тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV). Транскрипционная кассета локализована в межгенном регионе N и P, что гарантирует высокий уровень экспрессии трансгена за счет особенностей организации генома рабдовирусов. В патенте раскрыты основные существующие подходы дизайна целевых коронавирусных иммуногенов/антигенов, такие как полноразмерный гликопротеин S, вариант с усеченным цитоплазматическим доменом (Δ19), а также рецептор-связывающий домен RBD с трансмембранным регионом и цитоплазматическим доменом вируса бешенства.

Однако использование данного вектора осложнено остаточной нейровирулентностью и возможными побочными эффектами. В тоже время использование функционального гликопротеина S коронавирусов в качестве иммуногена может привести к созданию рекомбинантного вируса бешенства, обладающего двойной тропностью за счет экспонированных вирусных гликопротеинов. Недостатком данного решения также является использование антигенов вируса SARS-CoV, что, вероятно, не позволит сформировать противовирусный иммунитет против нового коронавируса SARS-CoV-2.

Известно иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (RU, 2720614, МПК A61K 39/215; A61P 31/12, опубл. 12.05.2020 г.), или последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1, или их комбинации.

Однако показано, что использование векторов на основе циркулирующих в человеческой популяции агентов (аденовирусы, герпесвирусы, респираторно-синцитиальный вирус и т.д.) может быть осложнено наличием специфического иммунитета против вируса «дикого типа», в результате чего не будет происходить достаточного продуктивного инфицирования клеток рекомбинантным вирусом, и как следствие, не будет эффективно обеспечена экспрессия целевого трансгена.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является решение по патенту (CN, 111088283A, МПК A61K 39/215; A61P 31/14; C12N 15/86; опубл. 01.05.2020 г.), где предложены вирусные векторы на основе аттенуированного вируса везикулярного стоматита, в котором химерный ген гетерологичного антигена локализован между генами G и L. В патенте также раскрываются классические подходы дизайна целевых коронавирусных иммуногенов/антигенов (кодон-оптимизация, полноразмерный S (Spike), RBD). В патенте раскрывается подход получения химерных поверхностных гликопротеинов вируса везикулярного стоматита, с целью индукции иммунитета на коронавирусный компонент.

Недостатком данного решения является дизайн иммуногенов в виде N- и C-концевых слитых белков, что может сказаться на фолдинге коронавирусных антигенных компонентов и инфекционном титре рекомбинантного вируса. Предлагаемая строгая локализация трансгена в геноме вируса (между генами G и L, фактически 5-ая транскрипционная кассета, начиная с 3’-конца генома), не позволяет в полной мере контролировать транскрипционный уровень трансгена. Также важным недостатком является использование небольшого фрагмента (RBD) гликопротеина S для индукции противовирусного иммунитета, в то время как размер полноразмерного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 ~1200 а.о., на поверхности вирионов который организован в виде гомотримеров.

Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке новых рекомбинантных вакцин от коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2).

Раскрытие изобретения

Целью заявленного изобретения является создание рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, обеспечивающего экспрессию антигенов коронавируса SARS-CoV-2, и индуцирующего специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2.

Техническим результатом является повышение уровня экспрессии трансгена, улучшение фолдинга и обеспечение синтеза полноразмерного эктодомена гликопротеина S SARS-CoV-2 заявляемым рекомбинантным вирусом.

Указанный технический результат достигается созданием искусственного гена, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, кодирующего искусственный белок-иммуноген, представляющий собой эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом, представленная в SEQ ID NO:1 длиной 3723 п.н.

Указанный технический результат достигается также созданием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-EctoS_SC2, используемой для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, имеющей молекулярную массу 1,07⋅10⁷ дальтон, размер 17369 п.н. и содержащей в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2 целевой ген по п. 1, кодирующий искусственный белок-иммуноген EctoS_SC2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 длиной 1240 а.к.о. и находящийся под контролем вирусного промотора в новой транскрипционной кассете в 3’-конце генома, обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих, состоящая из следующих фрагментов:

- ORI - (ORI, origin of replication) точка начала репликации плазмидного вектора pUC (координаты 16543-17131 п.н.);

- AmpR - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику ампициллину (координаты 15512-16372 п.н.);

- T7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага T7, необходимая для транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 166-183 п.н.);

- T7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага T7, необходимая для терминации транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 15284-15390 п.н.);

- HDV-Rbz - нуклеотидная последовательность рибозима HDV, которая после транскрибирования отщепляется с формированием аутентичной 3’-концевой некодирующей последовательности (координаты 15197-15279 п.н.);

- N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты 4012-5280 п.н.);

- P - открытая рамка считывания гена P (фосфопротеин) (координаты 5344-6141 п.н.);

- L - открытая рамка считывания гена L (РНК-зависимая РНК-полимераза) (координаты 8768-15097 п.н.);

- VSV-G - открытая рамка считывания гликопротеина G (координаты 7134-8669 п.н.);

- T4 fibritin foldon (Fd) trimerization domains - бета-пропеллерный тримеризующий домен фибритина бактериофага T4, обеспечивающий формирование гомотримеров эктодомена S SARS-CoV-2 (координаты 3878-3976 п.н.);

- Spike protein - эктодомен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 254-3868 п.н.);

- Receptor-binding domain (RBD) - рецептор-связывающий домен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 1208-1876 п.н.).

Указанный технический результат достигается также созданием штамма rVSV-EctoS_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, полученный с использованием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-EctoS_SC2 по п. 2, обеспечивающего синтез коронавирусного антигена (тримеризованный эктодомен гликопротеина S SARS-CoV-2), используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и депонированного в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под № V-982.

Существенными отличиями от прототипа, обеспечивающими достижение технического результата, являются:

1. Оптимизация искусственного гена посредством нормализации кодонного состава и исключение из последовательности элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии и стабильности мРНК;

2. Локализация трансгена в новой транскрипционной кассете в 3’-конце генома вируса везикулярного стоматита, что обеспечивает наибольший уровень экспрессии в рабдовирусного генома;

3. Использование бета-пропеллерного тримеризующего домена фибритина бактериофага T4, обеспечивающего формирование гомотримеров эктодомена S SARS-CoV-2 с нативной конформацией;

4. Использование полноразмерного эктодомена S SARS-CoV-2, что позволяет индуцировать полноценный иммунный ответ на вневирионные антигенные компоненты вирусного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2.

Осуществление изобретения

Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами. На фиг. 1 приведена схема клонирования нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих конструкционные варианты эктодомена гликопротеина S в плазмидном векторе для обратной генетики вируса везикулярного стоматита pStem-rVSV_ng. На фиг. 2 изображена схема конструкции рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-EctoS_SC2, используемой для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2. На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) искусственного гена, кодирующего эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом.

На фиг. 4 приведена аминокислотная последовательность секретируемого эктодомена гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом (SEQ ID NO:2).

Дизайн искусственного гена и получение рекомбинантной плазмиды. Первым этапом создания рекомбинантного вируса везикулярного стоматита для создания вакцины стал дизайн целевого антигена/иммуногена. Согласно литературным данным, наиболее перспективными вирусными компонентами, для индукции протективного иммунитета, являются поверхностный трансмембранный гликопротеин S (Spike), а также нуклеопротеин N.

В ходе проведенного биоинформатического анализа опубликованных полногеномных нуклеотидных последовательностей вируса SARS-CoV-2 (референс последовательность GenBank: NC_045512.2), а также фрагментарных нуклеотидных последовательностей, кодирующих гликопротеин S, подтверждена относительная стабильность аминокислотных последовательностей целевых антигенов.

Важно отметить, что нативный вирусный гликопротеин S представлен трансмембранным триммером, с сигналами удержания в ER/Гольджи в C-концевом фрагменте белка. С использованием онлайн инструментов SignalIP-5.0 и TMHMM был локализован эктодомен гликопротеина S, по гомологии с гликопротеином S SARS-CoV выделен рецептор-связывающий домен (RBD), с фланкирующими регионами, необходимыми для корректного фолдинга домена. Согласно литературным данным, иммунизация животных рекомбинантным гликопротеином S родственных коронавирусов (SARS-CoV, MERS-CoV и др.), или конструкциями, обеспечивающими его экспрессию, приводит к индукции специфических вируснейтрализующих антител (Kun Li et al., 2020).

Следовательно, экспрессия эктодомена гликопротеина S посредством рекомбинантного вируса в составе вакцины будет индуцировать синтез вирусспецифических антител к SARS-CoV-2. В изобретении предложена оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая эктодомен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2. Оптимизация синтетических конструкций, кодирующих полноразмерный гликопротеин S SARS-CoV была проведена посредством нормализации кодонного состава и исключения из последовательностей элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии или стабильность мРНК. Нуклеотидные последовательности искусственных генов были химически синтезированы и использованы для получения рекомбинантных конструкций для обратной генетики репликационно-компетентного вируса везикулярного стоматита.

Вирус везикулярного стоматита использован в качестве вектора в силу безопасности, широкого клеточного тропизма, а также из-за отсутствия предсуществующего иммунитета у большинства людей, что является необходимым требованием для проведения эффективной иммунизации. Показано, что использование векторов на основе других циркулирующих в человеческой популяции агентов (аденовирусы, герпесвирусы, респираторно-синцитиальный вирус и т.д.) может быть осложнено наличием специфического иммунитета против вируса «дикого типа», в результате чего не будет происходить продуктивного инфицирования клеток рекомбинантным вирусом и, как следствие, не будет обеспечена экспрессия целевого трансгена. Важным свойством, позволяющим рекомендовать рабдовирусы в качестве вакцинных вирусных векторов, является высокий титр накопления в перевиваемых культурах клеток (до 10¹⁰ ТЦД₅₀/мл), а также относительно низкие иммунизирующие дозы (10⁵ - 10⁷ ТЦД₅₀). Показано также, что рекомбинантные вирусы везикулярного стоматита, экспрессирующие гликопротеины гетерологичных вирусов (Эбола, Марбург, Ласса и т.д.) обеспечивают формирование протективного иммунитета в отношении широкого круга инфекционных заболеваний.

Изобретение также представляет собой штамм рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащий оптимизированную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:1) искусственного гена, кодирующего искусственный белок-иммуноген, представляющий собой тримеризованный эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2.

Способ индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2, предусматривает:

1) 1-, 2- или 3-кратное введение в организм человека или животного одного, двух или более иммуногенных композиций на основе заявляемого штамма рекомбинантного вируса везикулярного стоматита.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Получение конструкционного варианта эктодомена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2.

Прототипом для дизайна синтетической конструкции вариантов гликопротеина S, выступала аминокислотная последовательность, кодируемая геном S (Spike), представленным в депонированной полногеномной последовательности вируса SARS-CoV-2 (GenBank: NC_045512). Химерный синтетический иммуноген представляет собой секретируемый эктодомен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом (SEQ ID NO:2). При экспрессии данного варианта в эукариотических клетках происходит синтез и необходимые посттрансляционные модификации эктодомена гликопротеина S. За счет тримеризующего домена эктодомен EctoS_SC2 организуется в гомотример, формируя тем самым нативную конформационную структуру антигена. Тримеризованный коронавирусный антиген транспортируется в межклеточное пространство, где происходит захват антигенпрезентирующими клетками (АПК), что приводит к индукции иммунного ответа, в том числе, на конформационные антигенные детерминанты. Благодаря локализации искусственного гена EctoS_SC2 в 3’-конце генома обеспечивается наибольший уровень экспрессии трансгена с рабдовирусного генома.

Пример 2. Получение генетической конструкции.

Для получения генетической конструкции эктодомена гликопротеина S был рассчитан оптимизированный искусственный ген с нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO:1, фиг. 3). Оптимизация гена была направлена на нормализацию кодонного состава искусственного гена и исключения из последовательностей элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии или стабильность мРНК.

Нуклеотидные последовательности генов были получены методом химического синтеза ЗАО «Биокад» и ЗАО «Евроген».

Для получения рекомбинантного вируса везикулярного стоматита ген EctoS_SC2, кодирующий конструкционный вариант эктодомена гликопротеина S, был клонирован в плазмидном векторе для обратной генетики вируса везикулярного стоматита pStem-rVSV_ng. Схема клонирования приведена на фиг. 1. Направленное клонирование проведено по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикций EagI и MluI, располагающихся в полилинкере новой транскрипционной кассеты в 3’-конце геномной кДНК последовательности. Для этого 1,5 мкг плазмидной ДНК pStem-rVSV_ng гидролизовали эндонуклеазами рестрикции EagI и MluI (NEB) в буфере CutSmart при 37 °C 1 час, после чего вносили 2 е.а. рекомбинантной щелочной фосфатазы креветок (rSAP) (NEB), необходимой для предотвращения «самолигирования» вектора, с инкубацией при 37 °C 1 час. Продукты гидролиза разделяли методом электрофореза, фрагменты ДНК, соответствующие гидролизованному вектору (~13650 п.н.), выделяли из агарозного геля с использованием коммерческого набора QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Нуклеотидную вставку, кодирующую целевой трансген EctoS_SC2, возможно подготовить посредством постановки гидролиза клонировочной плазмиды, амплификацией нуклеотидных последовательностей в LAMP или ПЦР, либо любым другим методом, доступным исследователю. Клонирование может быть проведено любым из существующих методов (лигирование, метод Гибсона, гомологической рекомбинации и др.), при этом в целевом трансгене должен присутствовать старт-кодон (ATG) в оптимальном фланкирующем контексте (консенсусная последовательность Козак; GCCACC). На фиг. 1 представлена схема направленного клонирования трансгена, с формированием транскрипционной кассеты. Для этого 1 мкг гидролизованного вектора pStem-rVSV_ng/EagI-MluI смешивали с гидролизованным по EagI и MluI фрагментом ДНК трансгена EctoS_SC2 в эквимолярном соотношении, добавляли реакционный буфер и T4 ДНК лигазу. После инкубации при 20 °C 1 час, лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E.coli. Скрининг клонов-трансформантов проводили с использованием методов ПЦР и рестрикционного анализа рекомбинантных плазмид.

Корректность нуклеотидных последовательностей плазмидных конструкций подтверждена секвенированием по Сэнгеру. Получена генетическая конструкция, кодирующая нуклеотидную последовательность конструкционного варианта антигена SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1, фиг. 3).

Рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2 имеет молекулярную массу 1,07⋅10⁷ дальтон, размер 17369 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2 целевой искусственный ген по п. 1, кодирующий искусственный белок-иммуноген EctoS_SC2 - эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 (фиг. 4) длиной 1240 а.к.о. и находящийся под контролем вирусного промотора в новой транскрипционной кассете в 3’-конце генома, обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих и состоящая из следующих фрагментов:

- ORI - (ORI, origin of replication) точка начала репликации плазмидного вектора pUC (координаты 16543-17131 п.н.);

- AmpR - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику ампициллину (координаты 15512-16372 п.н.);

- T7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага T7, необходимая для транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 166-183 п.н.);

- T7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага T7, необходимая для терминации транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 15284-15390 п.н.);

- HDV-Rbz - нуклеотидная последовательность рибозима HDV, которая после транскрибирования отщепляется с формированием аутентичной 3’-концевой некодирующей последовательности (координаты 15197-15279 п.н.);

- N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты 4012-5280 п.н.);

- P - открытая рамка считывания гена P (фосфопротеин) (координаты 5344-6141 п.н.);

- L - открытая рамка считывания гена L (РНК-зависимая РНК-полимераза) (координаты 8768-15097 п.н.);

- VSV-G - открытая рамка считывания гликопротеина G (координаты 7134-8669 п.н.);

- T4 fibritin foldon (Fd) trimerization domains - бета-пропеллерный тримеризующий домен фибритина бактериофага T4, обеспечивающий формирование гомотримеров эктодомена S SARS-CoV-2 (координаты 3878-3976 п.н.);

- Spike protein - эктодомен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 254-3868 п.н.);

- Receptor-binding domain (RBD) - рецептор-связывающий домен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 1208-1876 п.н.).

Пример 3. Получение репликационно-компетентного штамма rVSV-EctoS_SC2 вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антиген SARS-CoV-2.

Выделение плазмидной ДНК генетической конструкции для обратной генетики вируса везикулярного стоматита, кодирующего антигены SARS-CoV-2, выполнено с использованием коммерческого набора QIAGEN Plasmid Maxi Kit, согласно инструкции производителя.

Получение репликационно-компетентного вируса везикулярного стоматита проведено с использованием методов обратной генетики в перевиваемой линии клеток Vero и/или 4647 (коллекция культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора). Для этого монослой клеточной культуры (конфлюентность 90%) трансфецировали с использованием липофектамина 3000 (Thermo Scientific, США) полученной генетической плазмидной конструкцией pStem-rVSV-EctoS_SC2 совместно с хелперными плазмидами pStem-vN, pStem-vP, pStem-vL обеспечивающими экспрессию белковой репликативной машинерии вируса везикулярного стоматита (N, P и L), а также ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7. Количество каждой из плазмидных конструкций составило: pStem-N - 0,25 мкг; pStem-P - 0,25 мкг; pStem-L - 1,0 мкг; pStem-T7 - 1,5 мкг; pStem-rVSV-EctoS_SC2 (конструкционный вариант) - 2 мкг. Через сутки производили смену питательной среды на поддерживающую с 2% фетальной сыворотки крови, с последующим культивированием 48-72 часа в CO₂-инкубаторе (5% CO₂; 37 °C; влажная атмосфера). При оптической микроскопии по истечению срока культивирования отмечали полную деструкцию монослоя клеток. Вируссодержащую культуральную жидкость рекомбинантного вируса собирали, осветляли посредством центрифугирования (10 мин при 10 тыс об/мин), аликвотировали и хранили до использования при минус 80 °C.

Штамм идентифицирован в ФБУН ГНЦ ВБ Вектор» Роспотребнадзора в апреле 2020 г. и депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-982.

Инфекционную активность рекомбинантного вируса везикулярного стоматита оценивали при постановках классических вирусологических методов титрования в чувствительную культурах клеток Vero и/или 4647, с выражением в 50 % тканевых цитопатических дозах (ТЦД₅₀), либо в бляшкообразующих единицах (БОЕ). При изучении культуральных свойств установлено, что полученный рекомбинантный вирус сохранил основные свойства исходного штамма вируса везикулярного стоматита (клеточная чувствительность, характер цитопатического действия, оптимальные параметры культивирования и др.).

Титр накопления в культуре клеток Vero рекомбинантного штамма вируса везикулярного стоматита, кодирующий нуклеотидную последовательность антигена SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:2) составил - 3,67 ± 0,12 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 4. Подтверждение наличия гена EctoS_SC2, кодирующего антиген SARS-CoV-2, в составе генома заявляемого штамма rVSV-EctoS_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита.

Подтверждение наличия и экспрессии искусственного гена EctoS_SC2, кодирующего антиген (тримеризованный эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2), проводили в полимеразной цепной реакции совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Выделение РНК из образцов культуральных сред, полученных после инфицирования монослоя клеток Vero рекомбинантным вирусом везикулярного стоматита, проводили с использованием набора реагентов «Рибо-преп» (Интерлабсервис, Россия) согласно инструкции производителя. Для оценки экспрессии и наличия трансгенов использовали специфические олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие открытую рамку считывания трансгена:

F-NCR (5’-ACGAAGACAAACAAACCATTATTATCATTAAAAGGC-3’) и R-VSV_1_seq (5’-TTGTGTTCTGCCCACTCTGT-3’).

Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием набора реагентов «обратная транскриптаза RNAscribe RT» (Биолабмикс, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Амплификацию фрагментов кДНК вируса везикулярного стоматита проводили с Phusion-полимеразы (NEB, США) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты амплификации анализировали посредством электрофоретического разделения в агарозном геле и последующего окрашивания гелей рабочим раствором этидия бромида (0,5 мкг/мл). Корректность открытых рамок считывания трансгена EctoS_SC2 подтверждали секвенированием по Сэнгеру элюированных из агарозного геля целевых ампликонов.

Наличие и функциональная активность гена G, кодирующего поверхностный гликопротеин вируса везикулярного стоматита подтверждается секвенированием ампликонов трансгена по Сэнгеру, а также репродукцией рекомбинантного вируса в пермиссивных клеточных линиях (Vero, 4647, BHK-21/13 и т.д.) с культуральными свойствами, аналогичными «дикому типу» ВВС.

Дизайн и экспериментальные исследования штамма rVSV-EctoS_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антиген коронавируса SARS-CoV-2, и индуцирующего специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2, а также иммуногенной композиции на его основе показывают возможность их использования в качестве кандидатного вакцинного препарата против коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2). Вакцинные композиции могут включать приемлемые адъюванты, стабилизаторы, наполнители и заявляемый штамм рекомбинантного везикулярного стоматита, экспрессирующего антигены коронавируса SARS-CoV-2.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

<120> Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2

<160> SEQ ID NO 2

<210> SEQ ID NO:1

<211> 3723

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность искусственного гена, кодирующая искусственный белок-иммуноген, представляющий собой эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом.

<400> 1

ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTGTGAACCTGA 55

CCACAAGAACCCAGCTGCCTCCAGCCTACACCAACAGCTTTACCAGAGGCGTGTA 110

CTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCCAGCGTGCTGCACTCTACCCAGGACCTGTTC 165

CTGCCTTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCA 220

ATGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGGGTGTACTT 275

TGCCAGCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACACTG 330

GACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTCATCA 385

AAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTCTACTATCACAA 440

GAACAACAAGAGCTGGATGGAAAGCGAGTTCCGGGTGTACAGCAGCGCCAACAAC 495

TGCACCTTCGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAGCAGG 550

GCAACTTCAAGAACCTGCGCGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAA 605

GATCTACAGCAAGCACACCCCTATCAACCTCGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTC 660

TCTGCTCTGGAACCCCTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTC 715

AGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGATAGCAGCAGCGG 770

ATGGACAGCTGGTGCCGCCGCTTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTC 825

CTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGATTGTGCTCTGG 880

ATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTGGAAAAGGGCAT 935

CTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCC 990

AATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCT 1045

CTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGT 1100

GCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACC 1155

AAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGG 1210

GAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAA 1265

CTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAAC 1320

CTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGT 1375

CCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAG 1430

CACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTAC 1485

GGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGA 1540

GCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAA 1595

TCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGC 1650

GTGCTGACAGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAGCAGTTTGGCCGGGATA 1705

TCGCCGATACCACAGACGCCGTTAGAGATCCCCAGACACTGGAAATCCTGGACAT 1760

CACCCCTTGCAGCTTCGGCGGAGTGTCTGTGATCACCCCTGGCACCAACACCAGC 1815

AATCAGGTGGCAGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGTACCGAAGTGCCCGTGGCCA 1870

TTCACGCCGATCAGCTGACACCTACATGGCGGGTGTACTCCACCGGCAGCAATGT 1925

GTTTCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGAGCCGAGCACGTGAACAATAGCTAC 1980

GAGTGCGACATCCCCATCGGCGCTGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACACAGACAA 2035

ACAGCCCCAGACGGGCCAGATCTGTGGCCAGCCAGAGCATCATTGCCTACACAAT 2090

GTCTCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACTCCAACAACTCTATCGCTATCCCC 2145

ACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGTCCATGACCAAGA 2200

CCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGATTCCACCGAGTGCTCCAACCT 2255

GCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGGATC 2310

GCCGTGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCT 2365

ACAAGACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAATTTCAGCCAGATTCTGCC 2420

CGATCCTAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAA 2475

GTGACACTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGATTGTCTGGGCGACA 2530

TTGCCGCCAGGGATCTGATTTGCGCCCAGAAGTTTAACGGACTGACAGTGCTGCC 2585

ACCACTGCTGACCGATGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCCGGC 2640

ACAATCACAAGCGGCTGGACATTTGGAGCTGGCGCCGCTCTGCAGATCCCCTTTG 2695

CTATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGAGTGACCCAGAATGTGCTGTA 2750

CGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAG 2805

GACAGCCTGAGCAGCACAGCAAGCGCCCTGGGAAAGCTGCAGGACGTGGTCAACC 2860

AGAATGCCCAGGCACTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTGTCCTCCAACTTCGGCGC 2915

CATCAGCTCTGTGCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACAAGGTGGAAGCCGAG 2970

GTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGGCTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTTA 3025

CCCAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGATTAGAGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCAC 3080

CAAGATGTCTGAGTGTGTGCTGGGCCAGAGCAAGAGAGTGGACTTTTGCGGCAAG 3135

GGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCCCCTCACGGCGTGGTGTTTCTGC 3190

ACGTGACATACGTGCCCGCTCAAGAGAAGAATTTCACCACCGCTCCAGCCATCTG 3245

CCACGACGGCAAAGCCCACTTTCCTAGAGAAGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACC 3300

CATTGGTTCGTGACCCAGCGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCGACA 3355

ACACCTTCGTGTCTGGCAACTGCGACGTCGTGATCGGCATTGTGAACAATACCGT 3410

GTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTAC 3465

TTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGATATCAGCGGAATCAATG 3520

CCAGCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAA 3575

TCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGGAAGGGCAGCGGCTCTGGC 3630

GGAGGCTACATTCCCGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCTTACGTTAGAAAGGACG 3685

GCGAATGGGTGCTGCTGAGCACATTTCTCGGAGGCTGA 3723

<210> SEQ ID NO:2

<211> 1240

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Аминокислотная последовательность секретируемого эктодомена гликопротеина S (Spike) коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом, обеспечивающим независимый синтез коронавирусного антигена.

<400> 2

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLF 55

LPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTL 110

DSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANN 165

CTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGF 220

SALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTF 275

LLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFP 330

NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPT 385

KLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNN 440

LDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSY 495

GFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTG 550

VLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTS 605

NQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSY 660

ECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIP 715

TNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGI 770

AVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNK 825

VTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAG 880

TITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQ 935

DSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAE 990

VQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGK 1045

GYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGT 1100

HWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKY 1155

FKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKGSGSG 1210

GGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGG* 1240

<---

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине. Описан искусственной ген, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом, имеющий SEQ ID NO:1 длиной 3723 п.н. Также представлена рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию указанного искусственного гена, представленная на физической и генетической карте на Фиг. 2, а также рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_EctoS_SC2 для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, экспрессирующий антигены коронавируса SARS-CoV-2, индуцирующий специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2, депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-982. Техническим результатом является повышение уровня экспрессии трансгена, улучшение фолдинга и обеспечение синтеза полноразмерного эктодомена гликопротеина S SARS-CoV-2. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

1. Искусственный ген, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген, представляющий собой эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом, представленный в SEQ ID NO:1 длиной 3723 п.н.

2. Рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, используемая для получения рекомбинантного вируса везикулярного стоматита и вакцины на его основе против коронавируса SARS-CoV-2, имеющая молекулярную массу 1,07⋅10⁷ дальтон, размер 17369 п.н. и содержащая в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2, целевой ген по п. 1, кодирующий искусственный белок-иммуноген EctoS_SC2 - тримеризованный эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 длиной 1240 а.к.о. и находящийся под контролем вирусного промотора в новой транскрипционной кассете в 3’-конце генома, обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих, и состоящая из следующих фрагментов:

- ORI - (ORI, origin of replication) точка начала репликации плазмидного вектора pUC (координаты 16543-17131 п.н.);

- AmpR - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику ампициллину (координаты 15512-16372 п.н.);

- T7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага T7, необходимая для транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 166-183 п.н.);

- T7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага T7, необходимая для терминации транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 15284-15390 п.н.);

- HDV-Rbz - нуклеотидная последовательность рибозима HDV, которая после транскрибирования отщепляется с формированием аутентичной 3’-концевой некодирующей последовательности (координаты 15197-15279 п.н.);

- N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты 4012-5280 п.н.);

- P - открытая рамка считывания гена P (фосфопротеин) (координаты 5344-6141 п.н.);

- L - открытая рамка считывания гена L (РНК-зависимая РНК-полимераза) (координаты 8768-15097 п.н.);

- VSV-G - открытая рамка считывания гликопротеина G (координаты 7134-8669 п.н.);

- T4 fibritin foldon (Fd) trimerization domains - бета-пропеллерный тримеризующий домен фибритина бактериофага T4, обеспечивающий формирование гомотримеров эктодомена S SARS-CoV-2 (координаты 3878-3976 п.н.);

- Spike protein - эктодомен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 254-3868 п.н.);

- Receptor-binding domain (RBD) - рецепторсвязывающий домен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 1208-1876 п.н.).

3. Рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, кодируемый рекомбинантной плазмидой pStem-rVSV-EctoS_SC2 по п. 2, обеспечивающий синтез эктодомена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c C-концевым тримеризующим доменом, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-982.