Рекомбинантная плазмидная ДНК pMBP-PUUV_N, обеспечивающая синтез и секрецию слитого белка MBP-PUUV_N в клетках E. coli, штамм Escherichia coli KRX/pMBP-PUUV_N, продуцирующий указанный белок, используемый для получения рекомбинантного белка PUUV_N, применяемого для диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом Российский патент 2025 года по МПК C12N15/70 C12N15/40 C07K14/08 C07K19/00 

Изобретение относится к рекомбинантной плазмидной ДНК рМВР- PUUV_N, обеспечивающей синтез и секрецию слитого белка MBP-PUUV_N в клетках Е. Coli, штамму Escherichia coli KRX/pMBP-PUUV_N, продуцирующему указанный белок и рекомбинантному белку PUUV_N, продуцируемому указанным штаммом и может быть использовано в биотехнологии, в частности в генной и белковой инженерии.

Вирус Пуумала (PUUV) относится к роду Orthohantavirus семейства Hantaviridae порядка Bunyavirales. Является возбудителем геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). ГЛПС - острая вирусная зооантропонозная инфекция, вызываемая представителями рода Orthohantavirus, широко представленными по всему миру. Заболевание характеризуется лихорадкой и гриппоподобными симптомами, острой почечной недостаточностью и геморрагической гемостазиопатией в тяжелых случаях. На территории Российской Федерации (РФ) ежегодно регистрируется 7-9 тысяч случаев ГЛПС, возбудителем более 95% из них является PUUV. PUUV представляет собой оболочечный вирус с сегментированным одноцепочечным РНК-геномом с отрицательным смыслом. Люди инфицируются в большинстве случаев после прямого контакта с инфицированными грызунами или их экскрементами, зачастую при вдыхании аэрозоля, содержащего вирус. Геном вируса имеет три сегмента. Большой L-сегмент кодирует вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), средний М-сегмент кодирует два поверхностных гликопротеина (Gn) и (Gc), и малый S-сегмент кодирует белок нуклеокапсида (N).

На сегодняшний день в мире существует ряд вакцинных препаратов, направленных на специфическую профилактику ГЛПС. Все эти препараты относятся к классу инактивированных вакцин, их использование одобрено в Китае, Южной и Северной Корее. Препараты, производимые в этих странах разработаны на основе вирусов Хантаан и Сеул, и не способствуют формированию протективного иммунного ответа против PUUV. Работа с представителями рода Orthohantavirus и производство хантавирусных инактивированных вакцин сопряжено с созданием лабораторий и производств высокого уровня биобезопасности BSL-3, что значительно снижает, исследовательские возможности и возможности технологического масштабирования производства вакцинных препаратов.

На данный момент актуальной остаётся задача создания вакцинных препаратов против возбудителей ГЛПС распространённых на территории РФ. Для изготовления и контроля вакцинных препаратов против PUUV необходимо решить проблему разработки эффективных серологических методов на основе гликопротеинов Gn, Gc и нуклеопротеина N, участвующих в иммунореакции. Однако, до настоящего времени задача получения полноразмерных коммерческих препаратов белков Gn, Gc хантавирусов не решена, что обусловлено их токсичностью по отношению к бактериальным клеткам. В то же время, установлено, что нуклеопротеин N является иммунодоминантным антигеном.

Известно решение по патенту (RU2221869C2, МПК C12N 15/63, опубл. 20.10.2004) [1], где был предложен вариант рекомбинантной плазмиды с промотором SP-6, обеспечивающий синтез РНК-копии S-сегмента вируса Хантаан для положительного контроля для диагностики возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Получение вирусной РНК достигалось трансформацией Е. Coli штамма XL-2Blue плазмидой pSP64-S, содержащей кДНК-копию S-сегмента вируса Хантаан.

Известно решение по патенту (RU2495938C2, МПК С07К14/175, опубл. 10.07.2013) [2], где был предложен способ получения рекомбинантного антигена G2 хантавируса Добрава в клетках Е. coli.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является изобретение (WO1998014585A1, МПК С07К14/175, опубл. 09.04.1998 г.) [3], которое относится к гену нуклеокапсида штамма R22 SEOUL_N (нуклеопротеина N) вируса Сеул, рекомбинантному вектору экспрессии указанного гена, трансформированному микроорганизму E.coli указанной рекомбинантной плазмидой и белку нуклеокапсида, экспрессируемому указанным трансформантом, а также к новой фармацевтической композиции для диагностики или профилактикЬ геморрагической лихорадки с почечным синдромом, вызванной вирусами рода Hantavirus, содержащими указанный белок нуклеокапсида. Белок SEOUL_N нарабатывали в тельцах включения для получения растворимого белка. При очистке проводили денатурацию и последующую ренатурацию указанного белка.

Однако белки, приведенные в аналогах и прототипе не способствуют формированию протективного иммунного ответа против PUUV.

Таким образом, из анализа уровня техники видно, что существует потребность в разработке технологии и средств для получения рекомбинантного белка PUUV_N.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом изобретения является синтез белка МВР- PUUV_N, из которого получают очищенный рекомбинантный белок PUUV_N с чистотой препарата не менее 95% для диагностики ГЛПС.

Указанный технический результат достигается тем, что получена рекомбинантная плазмидная ДНК pMBP-PUUV_N, обеспечивающая синтез и секрецию слитого рекомбинантного белка MBP-PUUV_N в клетках Е. coli, имеющая размер 7916 п.н. и содержащая следующие элементы генетической конструкции в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1:

- ген, кодирующий сигнальную аминокислотную последовательность мальтоза-связывающего белка (МВР), имеющий координаты с 92 по 1192 п.н.;

- в открытой рамке считывания с МВР ген рекомбинантного нуклеопротеина вируса Пуумала (PUUV_N), с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, имеющий координаты с 1319 по 2614 п.н.;

- нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена МВР, кодирующую аминокислотные остатки 6-ти гистидинов (б-His), имеющий координаты с 1265 по 1282 п.н.;

- нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена МВР сайта узнавания и разрезания TEV-протеазой с 1295 по 1315 п.н.;

- промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, имеющие координаты с 4 по 22 п.н. и с 2727 по 2774 соответственно;

- ген Р-лактамазы (AmpR), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к пенициллиновым антибиотикам клеток бактерии Е. Coli, имеющий координаты с 3398 по 3466 п.н.;

- уникальные сайты рестрикции Xbal, Ndel, Hindlll, Xhol, имеющие координаты 50, 90, 2622, 2637, соответственно;

- lacl, имеющий координаты с 6447 по 7529 п.н.;

- lacl промотор, имеющий координаты с 7530 по 7607 п.н.;

- ori, имеющий координаты с 4429 по 5017 п.н.;

- fl ori, имеющий координаты с 2811 по 3266 п.н.;

- сайт рестрикции Eagl-Notl, имеющий координаты 2629 п.н.;

- ac оператор, имеющий координаты с 23 по 47 п.н.;

- AmpR промотор, имеющий координаты с 3293 по 3397 п.н.

Указанный технический результат также достигается созданием рекомбинантного штамма Escherichia coli KRX/pMBP-PUUV_N, полученного путем трансформации клеток штамма Escherichia coli KRX рекомбинантной плазмидной ДНК pMBP-PUUV_N по п. 1., продуцирующий гибридный полипептид MBP-PUUV_N, используемый для получения рекомбинантного белка PUUV_N, применяемого для диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

Существенными отличиями заявляемого изобретения от прототипа, обеспечивающими достижение технического результата, являются:

1. Использование нуклеопротеина вируса Пуумала вместо вируса Сеул.

2. Использование в качестве белка слияния пептида МВР, обеспечивающего биосинтез PUUV_N в растворимой форме, что позволяет избежать этапа денатурации и последующей ренатурации рекомбинантного белка.

Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами. На фиг. 1 изображена физическая и генетическая карта рекомбинантной плазмиды pMBP-PUUV_N. На фиг. 2 представлен рестрикционный анализ экспрессионной конструкции pMBP-PUUV_N эндонуклеазами рестрикции ВатШ и Xhol. Слева предполагаемая электрофореграмма. На фиг. 3 изображена электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента Е. coli KRX/pMBP-PUUV_N. 1 - лизат клеток штамма-продуцента Е. coli KRX/pMBP-PUUV_N, 2 - лизат клеток Е. coli KRX.

На фиг. 4 приведена электрофореграмма препарата рекомбинантного белка PUUV_N. На фиг. 5 представлен Вестерн-блот рекомбинантного белка PUUV_N с использованием моноклональных антител 5F147 (MyBioSource, США) в разведении 1:500. На фиг. 6 представлены: SEQ ID N0:1 - нуклеотидная последовательность гена рекомбинантного нуклеопротеина вируса Пуумала (PUUV_N), кодирующая полипептид MBP-PUUV_N и SEQ ID NO: 2 - аминокислотная последовательность рекомбинантного белка PUUV N.

Осуществление изобретения.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pMBP-PUUV_N, предназначенной для экспрессии слитого рекомбинантного белка MBP-PUUV_N.

Фрагмент ДНК, кодирующий белок нуклеопротеина PUUV_N, получили амплификацией с генетической конструкции, содержащей полноразмерную кДНК копию S-сегмента. Использовали праймеры, фланкирующие открытую рамку считывания белка PUUV_N и вносящие на 5’-конец последовательности сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции BamHI и сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции XhoI на 3’-конец фрагмента. ДНК фрагмент, кодирующий белок PUUV_N, лигировали с плазмидой pMBP предварительно обработанной эндонуклеазами рестрикции BamHI и XhoI. Генетические конструкции трансформировали в химически компетентные клетки E. Coli NEB Stable (NEB, США). Спустя 16 часов культивирования на агаризированой среде LB (100 мкг/мл ампициллина) при температуре 30°C, отбирали единичные колонии и культивировали 12 часов в жидкой питательной среде LB с селективным антибиотиком (100 мкг/мл ампициллина) при температуре 30°C. Плазмидную ДНК экстрагировали с использованием набора QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Германия). Корректность генетических конструкций подтверждали рестрикционным анализом по сайтам узнавания эндонуклеазами рестрикции BamHI и XhoI фиг. 2 и секвенированием по методу Сенгера.

Пример 2. Получение штамм-продуцента путем трансформации плазмидной ДНК pMBP-PUUV_N клеток Escherichia coli KRX.

Штамм-продуцент рекомбинантного белка MBP-PUUV_N получали электропорацией компетентных клеток Escherichia coli KRX (Promega, США). Трансформанты культивировали на агаризированой среде SOB, содержащей 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Полученную культуру засевали в жидкую среду SOB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина, культивировали 6-8 ч при 37°С в термостатируемом орбитальном шейкере при 220 об/мин до достижения OD₆₀₀ ~ 1.

Пример 3. Биосинтез рекомбинантного слитого белка MBP-PUUV_N путём индуцированного культивирования штамм-продуцента Escherichia coli KRX/ pMBP-PUUV_N.

Продукцию рекомбинантного белка индуцировали добавление L-рамнозы до концентрации 0,1% и добавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до концентрации 1 мМ, индукцию экспрессии проводили в течение 20-24 ч при 18°С при 220 об/мин.

Пример 4. Выделение, отщепление белка слияния и очистка рекомбинантного белка PUUV_N из клеток Escherichia coli KRX/ pMBP-PUUV_N.

Бактериальную биомассу осаждали посредством центрифугирования при 4500 g в течение 15 мин при 4°С, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере А (20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 25 мМ имидазол, pH 8.0) 15 мл буфера на 1 грамм клеточного осадка. Лизис клеток осуществляли гомогенизацией под давлением в гомогенизаторе EmulsiFlex-C3 (Avestin, Канада) (фиг. 3). Лизат центрифугировали при 13000 g в течение 30 мин при 4°С. Выделение рекомбинантных белков из супернатанта осуществляли методом металл-хелатной аффинной хроматографии. Супернатант наносили на сорбент Sepharose Ni-NTA (GE Healthcare, Великобритания). После колонку промывали фосфатным буфером А (20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 25 мМ имидазол pH 8.0) со ступенчатым повышением концентрации имидазола: 50, 100 и 150 мМ. Целевые белки элюировали фосфатным буфером Б (20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, pH 8.0). Полученный хроматографически очищенный белок диализовали против буфера А (20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 25 мМ имидазол, pH 8.0,) и обрабатывали протеазой TEV (Invitrogen, США) в массовом соотношении протеазы к белку 1:1000, при температуре 4°С в течение 16 ч для отщепления последовательности пептида MBP от целевого белка. Продукты расщепления разделяли с использованием металл-хелатной аффинной проточной хроматографии. Белковую фракцию наносили на колонку, содержащую Sepharose Ni-NTA, пептид MBP, TEV протеаза и балластные белки связывались с сорбентом, целевой белок оставался несвязанным (фиг. 4). Белковые фракции, собранные в процессе очистки, разделяли в 10% ПААГ в денатурирующих условиях по методике Лэммли. Таким образом, получена система для наработки рекомбинантного PUUV_N. Проведение двух последовательных раундов метал-хелатной аффинной хроматографии позволяет получить высокоочищенные препарат рекомбинантных вирусных белков.

Пример 5. Определение антигенной активности рекомбинантного белка PUUV_N в Вестерн-блотинге.

Выявление антигенной активности препарата рекомбинантного белка PUUV_N проводили с использованием метода Вестерн-блот анализа. Пробы из фракций, собранных в процессе очистки, разделяли в 10% ПААГ в денатурирующих условиях по методике Лэммли. Из геля белок переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Затем мембрану помещали в блокирующий буфер (10 mM Трис-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Твин-20, 3% рыбий желатин, pH 7.5) на 1 ч при 37°С. Далее мембрану инкубировали с использованием моноклонального антитела 5F147 (MyBioSource, США) в разведении 1:500, в течение 1 ч при 37°С. После 3-кратной отмывки в буфере ФБРТ (10 mM Трис-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Твин-20, pH 7.5) мембрану инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в разведении 1:10000 с пероксидазным конъюгатом антител кролика к IgG мыши. После 3-кратной отмывки проводили визуализацию образовавшихся иммунных комплексов добавлением 0,3% раствора диаминобензидина в 0,1% перекиси водорода (фиг. 5).

Пример 6. Сравнение антигенной активности рекомбинантного белка PUUV_N c нативным антигеном в иммуноферментном анализе.

Препарат нативного антигена получен в результате инфицирования чувствительной клеточной культуры (Vero) вирусом Пуумала. Через 5 суток выявлена 100 % деградация монослоя клеток в результате цитопатического действия. Детрит отделили от культуральной жидкости центрифугированием. Культуральную жидкость дезинфицировали добавлением 0,1% пропиолактона. Проверили отсутствие остаточной инфекционности тремя пассажами аликвоты на чувствительной культуре клеток. Использовали в качестве антигена для иммуносорбента в ИФА. Антигены рекомбинантного белка N и нативный развели 1:100 в растворе 0,1М натрия углекислого и внесли по 100 мкл в лунки планшета для иммунологических реакций. Инкубировали 18 часов при температуре 21°С, аспирировали жидкость, блокировали сайты связывания полистирола раствором 0,1% казеина по 200 мкл в лунку в течении 2 часов при температуре 21°С. Жидкость аспирировали, планшет высушивали 18 часов при температуре 21°С. Сравнительный анализ проведен с использованием коллекции из 35 образцов сыворотки крови пациентов медицинских учреждений с диагнозом хантавирусная инфекция в результате инфицирования вирусом Пуумала. Их специфическая активность была определена при заборе крови в титрах реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Образцы разводили от 1:100 до 1:102400 серией последовательных двукратных разведений в растворе 0,1% бычьего сывороточного альбумина и вносили по 100 мкл разведений в дубле в лунки обоих планшетов с рекомбинантным и нативным антигеном. В качестве отрицательного контроля исследовали 4 образа от условно здоровых доноров методом скрининга в разведении 1:100. Инкубировали 60 мин при температуре 37°С. Содержимое лунок аспирировали и пятикратно отмывали не связавшиеся в иммунные комплексы реагенты фосфатно-солевым раствором с добавление 0,2% Твин-20 (ФСБ-Т). Вносили в лунки по 100 мкл раствора пероксидазного конъюгата МАТ мыши к IgG человека 1:100 в 0,1% казеине, инкубировали 30 мин при температуре 37°С, аспирировали из лунок жидкость и пятикратно отмывали ФСБ-Т. Вносили по 100 мкл хромогена тетраметилбензидина (ТМБ) с визуализацией образовавшихся иммунных комплексов 15 мин при 37°С. Останавливали реакцию внесением 1М раствора серной кислоты, результаты учитывали на планшетном ридере при длине волны 450 нм. Титром образца считали максимальное разведение (в повторе), показавшее значение оптической плотности в четыре раза превышающее среднеарифметическое значение заведомо отрицательных образцов. В результате выявления титров специфических антител к антигенам рекомбинантного белка N и нативного вируса Пуумала в обоих случаях 35 клинических образцов показали положительный результат более 1:100 (табл. 1). В таблице 1 дан сравнительный анализ титров специфических к вирусу Пуумала антител в образцах сыворотки крови пациентов. Ложно положительных результатов при исследовании образцов от условно здоровых доноров не выявлено. Ранговый коэффициент корреляции Спирмена в парах данных «РНИФ-ИФА N» составил 0,37. Аналогичная величина в парах «ИФА N - ИФА нат» равна 0,91. Специфические IgG в крови инфицированных пациентов выявлены титрах от 1:200 до 1:102400. Ранговый коэффициент корреляции Спирмена в парах данных «РНИФ-ИФА N» свидетельствует о слабо положительной корреляции, тогда как аналогичная величина в парах «ИФА N-ИФА нат» говорит о высокой корреляции результатов. Таким образом, каждый из антигенов продемонстрировал способность выявлять специфические IgG в крови инфицированных пациентов в сравнимых титрах ИФА при отсутствии ложно положительных результатов.

Таблица 1. Сравнительный анализ титров специфических к вирусу Пуумала антител в образцах сыворотки крови пациентов

№ обр РНИФ ИФА N ИФА нат 872 512 800 400 874 4096 1600 1600 1059 4096 3200 25600 1060 4096 6400 25600 1115 4096 1600 800 1116 4096 102400 51200 1117 4096 1600 800 1118 4096 1600 3200 1192 1024 3200 25600 1201 1024 400 400 1206 4096 12800 25600 1207 16384 102400 25600 1208 1024 800 3200 1209 16384 1600 6400 1210 1026 800 1600 1211 65536 3200 12800 1306 1024 1600 3200 1335 1024 400 400 1338 256 800 3200 1339 1024 6400 25600 1340 1024 12800 12800 1341 4096 12800 25600 1342 1024 400 480 1343 4096 12800 51200 1344 256 200 400 1345 1024 51200 102400 1372 64 800 800 1373 1024 800 3200 1374 4096 1600 1600 1375 256 3200 6400 1376 1024 6400 25600 1377 256 1600 3200 1378 16384 3200 25600 1379 256 1600 6400 1380 256 25600 102400 K1 0,0099 0,0069 0,0064 K2 0,0128 0,0101 0,0115 K3 0,0063 0,0064 0,0062 K4 0,0081 0,0074 0,0074

По результатам исследования 35 образцов с IgG к Пуумала и 4 образца без специфических антител, применение в ИФА рекомбинантного белка N как антигена может обеспечить выявление специфических IgG к вирусу Пуумала на уровне требований к диагностическим характеристикам (чувствительность, специфичность) современных медицинских изделий.

Таким образом, получена система для наработки и очистки рекомбинантного белка PUUV_N. Результаты иммунологических исследований продемонстрировали возможность использования данных препаратов для серологических исследований.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Перечень последовательностей, представленная в соответствии со стандартом ST26 ВОИС

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="Приложение_Рекомбинантный белок PUUV_N.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-10-27">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>123456</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-19</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>12345</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1234567</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-06</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Роспотребнадзора)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe byudzhetnoe uchrezhdenie nauki

&quot;Gosudarstvennyj nauchnyj tsentr virusologii i biotekhnologii

&quot;Vektor&quot; Federalnoj sluzhby po nadzoru v sfere zashchity

prav potrebitelej i blagopoluchiya cheloveka (FBUN GNTS VB

&quot;Vektor&quot; Rospotrebnadzora) (RU)</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантная плазмидная ДНК

pMBP-PUUV_N, обеспечивающая синтез и секрецию слитого белка

MBP-PUUV_N в клетках E. Coli, штамм Escherichia coli

KRX/pMBP-PUUV_N, продуцирующий указанный белок и рекомбинантный

белок PUUV_N, продуцируемый указанным штаммом и используемый для

диагностики геморрагической лихорадки с почечным

синдромом</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1299</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1299</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tccgacttgacagacatccaagaggagataacccgccatgagcaacaac

ttgttgttgccagacaaaaactcaaggatgcagagagagcagtggaagtggacccggatgacgttaacaa

aaacacactacaagcgaggcaacaaacagtgtcagcattggaggataaactcgcagactacaagagaaga

atggcagatgctgtgtcccggaagaaaatggatactaaacctactgacccgactgggattgaacctgatg

atcatctcaaggagagatcaagccttagatatggaaatgtccttgatgtaaatgccattgacattgaaga

accaagtggtcagacagcagattggtatactattggagtctatgtaataggttttacaattcccatcatt

ttaaaggctctatacatgttgtcaacacgtggaagacagaccgtgaaagagaacaagggaacacggatca

ggttcaaggatgacacatcatttgaggatattaatggcattaggagaccaaaacatctatatgtgtccat

gcctactgcccagtccaccatgaaagctgaagaacttacacccggacggtttcgtacaattgtatgtggc

ttattccctacacagatacaagtgcgtaatatcatgagtccagtgatgggagtgattggtttttcttttt

ttgtcaaagactggccagagaggattagggaatttatggaaaaagaatgccctttcataaaaccagaagt

taagcccgggacaccagcacaggagatagaatttttgaaaaggaatagggtttatttcatgacccgccaa

gatgttcttgacaaaaatcatgtggctgacattgataagttaattgactatgctgcctctggtgacccta

catcacctgatgacatcgaatcgcctaatgcaccatgggtatttgcttgtgcaccagaccggtgtccccc

tacatgcatttatgttgctgggatggctgaattaggcgcattcttttcaatcctacaggatatgaggaac

actattatggcatctaaaactgtaggtacagcagaagagaaattaaaaaagaagtcctccttctatcaat

catatttacgccggacacaatcaatggggattcaacttgatcagaggataatcctactgtacatgttgga

gtggggaaaagaaatggtggatcatttccatcttggtgatgatatggatcctgagctcaggggccttgct

cagtcactcatagatcagaaagtaaaagaaatatcaaatcaggagcccttaaagatatga</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>432</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..432</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>SDLTDIQEEITRHEQQLVVARQKLKDAERAVEVDPDDVNKNTLQARQQT

VSALEDKLADYKRRMADAVSRKKMDTKPTDPTGIEPDDHLKERSSLRYGNVLDVNAIDIEEPSGQTADWY

TIGVYVIGFTIPIILKALYMLSTRGRQTVKENKGTRIRFKDDTSFEDINGIRRPKHLYVSMPTAQSTMKA

EELTPGRFRTIVCGLFPTQIQVRNIMSPVMGVIGFSFFVKDWPERIREFMEKECPFIKPEVKPGTPAQEI

EFLKRNRVYFMTRQDVLDKNHVADIDKLIDYAASGDPTSPDDIESPNAPWVFACAPDRCPPTCIYVAGMA

ELGAFFSILQDMRNTIMASKTVGTAEEKLKKKSSFYQSYLRRTQSMGIQLDQRIILLYMLEWGKEMVDHF

HLGDDMDPELRGLAQSLIDQKVKEISNQEPLKI</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pMBP-PUUV_N, обеспечивающая синтез и секрецию слитого рекомбинантного белка МВР-PUUV_N в клетках Е. coli. Также предложен рекомбинантный штамм Escherichia coli KRX/pMBP-PUUV_N, полученный путем трансформации клеток штамма Escherichia coli KRX указанной плазмидной ДНК pMBP-PUUV_N и продуцирующий гибридный полипептид MBP-PUUV_N, используемый для получения рекомбинантного белка PUUV_N, применяемого для диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Изобретение обеспечивает синтез рекомбинантного белка МВР-PUUV_N, из которого получают рекомбинантный белок PUUV_N с чистотой препарата не менее 95% для диагностики ГЛПС. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 6 пр.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pMBP-PUUV_N, обеспечивающая синтез и секрецию слитого рекомбинантного белка МВР-PUUV_N в клетках Е. coli, имеющая размер 7916 п.н. и содержащая следующие элементы генетической конструкции в соответствии с физической и генетической картой:

- ген, кодирующий сигнальную аминокислотную последовательность мальтоза-связывающего белка (МВР), имеющий координаты с 92 по 1192 п.н.;

- в открытой рамке считывания с МВР ген рекомбинантного нуклеопротеина вируса Пуумала (PUUV_N), с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, имеющий координаты с 1319 по 2614 п.н.;

- нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена МВР, кодирующую аминокислотные остатки 6 гистидинов (6-His), имеющую координаты с 1265 по 1282 п.н.;

- нуклеотидную последовательность в рамке считывания гена МВР сайта узнавания и разрезания TEV-протеазой с 1295 по 1315 п.н.;

- промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, имеющие координаты с 4 по 22 п.н. и с 2727 по 2774 соответственно;

- ген β-лактамазы (AmpR), в качестве генетического маркера, определяющего устойчивость к пенициллиновым антибиотикам клеток бактерии Е. сoli, имеющий координаты с 3398 по 3466 п.н.;

- уникальные сайты рестрикции XbaI, NdeI, HindIII, XhoI, имеющие координаты 50, 90, 2622, 2637, соответственно;

- lacI, имеющий координаты с 6447 по 7529 п.н.;

- lacI промотор, имеющий координаты с 7530 по 7607 п.н.;

- ori, имеющий координаты с 4429 по 5017 п.н.;

- fl ori, имеющий координаты с 2811 по 3266 п.н.;

- сайт рестрикции EagI-NotI, имеющий координаты 2629 п.н.;

- lac оператор, имеющий координаты с 23 по 47 п.н.;

- AmpR промотор, имеющий координаты с 3293 по 3397 п.н.

2. Рекомбинантный штамм Escherichia coli KRX/pMBP-PUUV_N, полученный путем трансформации клеток штамма Escherichia coli KRX рекомбинантной плазмидной ДНК pMBP-PUUV_N по п. 1, продуцирующий гибридный полипептид MBP-PUUV_N, используемый для получения рекомбинантного белка PUUV_N, применяемого для диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом.