СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ ТОКСИНОВ ПОСРЕДСТВОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР С ПОСЛЕДУЮЩИМ СЕКВЕНИРОВАНИЕМ Российский патент 2021 года по МПК G01N33/53 C12N15/00 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение, относится к медицине, а именно к области микробиологии, молекулярной генетике и позволяет выявлять гены токсинов бактериального происхождения в образцах окружающей среды, продуктах питания, клинических образцах. Изобретение может быть использовано в научно-исследовательских лабораториях, клинической лабораторной диагностике, референс-лабораториях.

Уровень техники.

Из уровня техники из патента RU 2532225 С1 27.10.2014 известен способы для идентификации генов идентификации кластера генов, кодирующих стафилококковые белки, получившие название суперантигено-подобные экзотоксины, характеризующийся тем, что проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию в одной или нескольких реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров к генам, кодирующим такие белки стафилококков, как термонуклеаза, бета-глюкозидаза у видов S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. saprophytics, в первой реакционной смеси и к генам set1, set2, set3, set4, set5, кодирующим белки экзотоксины, во второй реакционной смеси, с температурой отжига праймеров 58°С в течение 30 с при числе циклов амплификации, равном 25, для первой реакционной смеси, и температурой отжига праймеров 59°С в течение 10 с при числе циклов амплификации, равном 25, для второй реакционной смеси, с последующим анализом путем сравнения амплифицированных фрагментов генов, полученных в двух аликвотах образца, с положительным контрольным образцом в соответствии с идентификационной таблицей 2; для экзотоксигенных штаммов стафилококков характерно наличие ампликонов генов set1, set2, set3, set4, set5, идентичных контрольному положительному образцу.

Осуществление изобретения.

Использование мультиплексной панели специфических олигонуклеотидов для проведения ПЦР будет однозначно более чувствительным подходом, позволяющим детектировать единичные копии генов токсинов. При этом мультиплексная панель детектирует Дифтерийный токсин (Diphtheria toxin), стрептококковый токсин группы A (Exotoxin type А speA), холерный токсин (Cholera enterotoxin subunit А и Cholera enterotoxin subunit В), ботулинический токсин типов A-G (Botulinum neurotoxin types A-G), столбнячный токсин (Tetanus toxin), стрептококковый токсин группы А, продуцентами которого могут быть Corynebactehum diphtheriae и Streptococcus pyrogenes которые, являются возбудителями респираторных заболеваний человека.

Для выявления и идентификации нуклеиновых кислот генов бактериальных токсинов был проведен анализ общедоступных баз данных Database of Bacterial Exotoxins for Human (DBETH) и GenBank NCBI. В результате нуклеотидного выравнивания последовательностей генов токсинов были выявлены регионы, пригодные для последующего выбора олигонуклеотидов для амплификации с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выбор олигонуклеотидов осуществлялся с использованием программ BioEdit version 7.0.5.3 и UGENE version 1.32.0. Основными критерием подбора олигонуклеотидов для таргетной амплификации являются:

- длина олигонуклеотидов должна быть не менее 17 нуклеотидов.

- размер амплифицируемых фрагментов: от 200 до 600 нуклеотидов.

- праймеры не должны образовывать димеры и вторичные структуры.

- праймеры на разные мишени не должны образовывать димеров и вторичных структур и должны быть собраны в мультиплексную панель.

Задачей настоящего изобретения является возможность определять присутствие патогенных микроорганизмов в образце (клинический материал, образцы, выделенные из окружающей среды) с применением секвенирования следующего поколения, идентифицировать их в сложных смесях, а также выявлять присущие им гены токсинов, а также разработка метода обладающего высокой чувствительностью к выявлению генов токсинов, позволяющего детектировать единичные копии генов токсинов.

Технический результат заключается в возможности определять присутствие патогенных микроорганизмов в образце (клинический материал, образцы, выделенные из окружающей среды) с применением секвенирования следующего поколения, идентифицировать их в сложных смесях, а также выявлять присущие им гены токсинов, в повышении чувствительности выявления генов токсинов, и в возможности детекции единичных копий генов токсинов.

Осуществление изобретения.

Для осуществления метода предварительно создают мультиплексную панель олигонуклеотидов для амплификации генов различных токсинов.

При этом осуществляют выбор олигонуклеотидов для таргетной амплификации на основании следующих критериев:

- длина олигонуклеотидов должна быть не менее 17 нуклеотидов.

- размер амплифицируемых фрагментов: от 200 до 600 нуклеотидов.

- праймеры не должны образовывать димеры и вторичные структуры.

- праймеры на разные мишени не должны образовывать димеров и вторичных структур и должны быть собраны в мультиплексную панель.

Затем выполняют разработку на основании вышеуказанных критериев мультиплексной панели олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена дифтерийного токсина (Diphtheria toxin)

В состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена дифтерийного токсина (Diphtheria toxin) из баз данных было получено 106 последовательностей, из которых 37 последовательностей были получены из генома Corynebactehum diphtheriae, 10 последовательностей из Corynebactehum pseudotuberculosis, 21 последовательность из Corynebactehum ulcerans, 3 последовательности из Corynebactehum phage. Стоит отметить, что в общедоступных баз данных встречаются последовательности дифтерийного токсина с различными модификациями в синтетических конструкциях и векторах для трансформации 24 последовательности.

После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур. Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагмент размером 309 пар оснований.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена стрептококкового токсина группы A (Exotoxin type A speA)

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена стрептококкового токсина группы A (Exotoxin type A speA) из баз данных было получено 58 последовательностей, из которых 54 последовательности были получены из генома Streptococcus pyogenes, 1 последовательность из Streptococcus pyrogenes, 1 последовательность из Streptococcus dysgafactiae, 2 последовательности из фагов. Стоит отметить, что в общедоступных баз данных встретилась 1 последовательность стрептококкового токсина группы А.

После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена холерного токсина субъединицы A (Cholera enterotoxin subunit А)

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена холерного токсина субъединицы A (Cholera enterotoxin subunit А) из баз данных было получено 213 последовательностей, из которых 152 последовательности были получены из генома Vibrio cholera, 57 последовательностей Vibrio phage.

После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур. Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагмент размером 408 пар оснований.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена холерного токсина субъединицы В (Cholera enterotoxin subunit В)

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена холерного токсина субъединицы В (Cholera enterotoxin subunit В) из баз данных было получено 447 последовательностей, из которых 250 последовательности были получены из генома Vibrio cholera, 104 последовательностей Vibrio phage. Стоит отметить, что в общедоступных баз данных встречаются последовательности холерного токсина субъединицы В с различными модификациями в синтетических конструкциях и векторах для трансформации (37 последовательностей).

После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур. Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагмент размером 347 пар оснований.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа A (Botulinum neurotoxin type А).

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа A (Botulinum neurotoxin type А) из баз данных было получено 111 последовательностей, из которых 103 последовательностей были получены из генома Clostridium botulinum, 8 последовательностей с различными модификациями в синтетических конструкциях.

После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур. Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагмент размером 425 пар оснований.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа В (Botulinum neurotoxin type В)

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа В (Botulinum neurotoxin type В) из баз данных было получено 111 последовательностей, из которых 103 последовательностей были получены из генома Clostridium botulinum, 8 последовательностей с различными модификациями в синтетических конструкциях.

После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур. Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагмент размером 507 пар оснований.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа С1 (Botulinum neurotoxin type CD

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа С1 (Botulinum neurotoxin type С1) из баз данных было получено 37 последовательностей, из которых 29 последовательностей были получены из генома Clostridium botulinum, 8 последовательностей из геномов фагов.

После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур. Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагмент размером 369 пар оснований.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа D (Botulinum neurotoxin type D)

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа D (Botulinum neurotoxin type D) из баз данных было получено 42 последовательности, из которых 31 последовательностей были получены из генома Clostridium botulinum, 11 последовательностей из геномов фагов.

После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур. Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагмент размером 468 пар оснований.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа Е (Botulinum neurotoxin type Е)

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа Е (Botulinum neurotoxin type Е) из баз данных было получено 68 последовательностей, из которых 57 последовательностей были получены из генома Clostridium botulinum, 5 последовательностей из Clostridium butyricum, 3 последовательности с различными модификациями в синтетических конструкциях. После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур. Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагменты размером 497 и 339 пар оснований.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа F (Botulinum neurotoxin type F)

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа F (Botulinum neurotoxin type F) из баз данных было получено 102 последовательности, из которых 88 последовательностей были получены из генома Clostridium botulinum, 5 последовательностей из Clostridium butyricum, 7 последовательностей из Clostridium baratii, 1 последовательность с различными модификациями в синтетической конструкции. После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур.

Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагмент размером 326 пар оснований.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа G (Botulinum neurotoxin type G)

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа G (Botulinum neurotoxin type G) из баз данных было получено 292 последовательности, из которых 261 последовательности были получены из генома Clostridium botulinum, 9 последовательностей из фагов, 9 последовательностей из Clostridium baratii 6 последовательностей с различными модификациями в синтетических конструкциях.

После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур. Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагменты размером 469 и 339 пар оснований.

Разработка олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена столбнячного токсина (Tetanus toxin (ТхТ))

Для дизайна праймеров в состав мультиплексной ПЦР в общей сложности для разработки олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена столбнячного токсина (Tetanus toxin (ТхТ) из баз данных было получено 488 последовательностей. Стоит отметить, что только 6 последовательностей полноразмерного гена столбнячного токсина (Tetanus toxin (ТхТ) получены из генома Clostridium tetani.

После выбора региона и подбора олигонуклеотидов, был проведен in silico анализ выбранных праймеров на наличие димеров и вторичных структур. Разработанные олигонуклеотиды позволяют амплифицировать фрагмент размером 325 пар оснований.

Таким образом, для целевого обогащения последовательностей генов токсинов методом ПЦР разработана панель олигонуклеотидов для амплификации 12 фрагментов генов токсинов согласно таблице 1.

Таким образом, заявленный способ позволяет определять присутствие бактериальных токсинов из перечня СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней в образце с применением секвенирования следующего поколения (клинический материал, образцы, выделенные из окружающей среды): Diphtheria toxin (Corynebactehum diphtheriae), Exotoxin type A speA (Streptococcus pyogenes), Cholera enterotoxin subunit A (Vibrio cholerae), Cholera enterotoxin subunit В (Vibrio cholerae), Botulinum neurotoxin type A (Clostridium botulinum), Botulinum neurotoxin type В (Clostridium botulinum), Botulinum neurotoxin type C1 (Clostridium botulinum), Botulinum neurotoxin type D (Clostridium botulinum), Botulinum neurotoxin type E (Clostridium botulinum), Botulinum neurotoxin type F (Clostridium botulinum), Botulinum neurotoxin type G (Clostridium botulinum) и Tetanus toxin (txt) (Clostridium tetani).

Изобретение поясняется следующей фигурой:

Фиг 1. Тестирование мультиплексной панели. Электрофореграмма продуктов амплификации. Дорожки botF- Botulinum neurotoxin type F; botD - Botulinum neurotoxin typeD; botC - Botulinum neurotoxin type C; cholB - Cholera enterotoxin subunit B; dift - Diphtheria toxin; speA - Streptococcus pyogenes Exotoxin type A; botA - Botulinum neurotoxin type A; tet - Tetanus toxin; botG - Botulinum neurotoxin type G; cholA - Cholera enterotoxin subunit A; botE - Botulinum neurotoxin type E; botB - Botulinum neurotoxin type В; M - маркер длин ДНК (1 kb DNA Ladder, Евроген); tox12 - Эквимолярная смесь 12 ПКО.

Промышленная применимость.

Заявленный способ может быть осуществлен специалистом на практике и при осуществлении обеспечивает реализацию заявленного назначения. Возможность осуществления на практике следует из того, что для каждого признака, включенного в формулу изобретения на основании описания, известен материальный эквивалент, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость» для изобретения и критерию «полнота раскрытия» для изобретения.

Изобретение относится к медицине, а именно к области микробиологии, молекулярной генетике, и позволяет выявлять гены токсинов бактериального происхождения в образцах окружающей среды, продуктах питания, клинических образцах. Создают мультиплексную панель олигонуклеотидов для амплификации генов токсинов. Для этого осуществляют выбор олигонуклеотидов для таргетной амплификации на основании следующих критериев: длина олигонуклеотидов должна быть не менее 17 нуклеотидов; размер амплифицируемых фрагментов: от 200 до 600 нуклеотидов; праймеры не должны образовывать димеры и вторичные структуры; праймеры на разные мишени не должны образовывать димеры и вторичные структуры и должны быть собраны в мультиплексную панель; затем выполняют разработку на основании вышеуказанных критериев мультиплексной панели олигонуклеотидов для амплификации фрагмента гена дифтерийного токсина, гена стрептококкового токсина группы А, гена холерного токсина субъединицы А, гена холерного токсина субъединицы В, гена ботулинического токсина типа А, гена ботулинического токсина типа В, гена ботулинического токсина типа С1, гена ботулинического токсина типа D, гена ботулинического токсина типа Е, гена ботулинического токсина типа F, гена ботулинического токсина типа G, гена столбнячного токсина, получены их праймеры. Затем с помощью выбранных олигонуклеотидов были амплифицированы соответствующие участки генома микроорганизмов - Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pyogenes, Vibrio cholerae, Clostridium botulinum и Clostridium tetani. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Мультиплексная панель для выявления генов токсинов микроорганизмов:

Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pyogenes, Vibrio cholerae, Clostridium botulinum и Clostridium tetani методом NGS, включающая

для амплификации фрагмента гена дифтерийного токсина Diphtheria toxin, праймеры DiphtoxF1 TGGTGCTCTTTCGATACTTCC и DiphtoxR1 CGAATCTTCAACAGTGTTCC,

для амплификации фрагмента гена стрептококкового токсина группы A Exotoxin type A speA, праймеры SpeAF TACGGAGGGGTAACAAATCAT и SpeAR GTTGTTAGGTAGACTTCAATTTG,

для амплификации фрагмента гена холерного токсина субъединицы A Cholera enterotoxin subunit А, праймеры CtxA-F GACCTCCTGATGAAATAAAGCA и CtxA-R TCTCTGTAGCCCCTATTACGAT,

для амплификации фрагмента гена холерного токсина субъединицы В Cholera enterotoxin subunit В, праймеры CtxB-F CAGTTTTACTATCTTCAGCATATG и CtxB-R TTAATTTGCCATACTAATTGCGG,

для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа A Botulinum neurotoxin type А, праймеры BotntA-F TATCAACTTCAAGTGACTCCT и BotntA-R CACCAGAAGCAAAACAAGTTC,

для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа В Botulinum neurotoxin type В, праймеры BotntB-F AAGAGGGAATGTATAAGGCT и BotntB-R ACCTTTGCCCCATATCCTGA,

для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа С Botulinum neurotoxin type С, праймеры BotntC-F1 AATCTCGGAAGCAATGAATAATA и BotntC-R1 CTCACTTCTGCGTTATATCCTGAT,

для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа D Botulinum neurotoxin type D, праймеры BotntD-F CTTAGTTCAGAAAGTGTAGTAGAT и BotntD-R TGCTATAACCTAATGCTTCTTCA,

для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа Е Botulinum neurotoxin type Е, праймеры BotntE-F TATAATGGGAGCAGAGCCTG и BotntE-R CCGCTAGCATCTTTATCTAATCCAT,

для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа F Botulinum neurotoxin type F, праймеры BotntF-F TATAATGGGAGCAGAGCCTG и BotntF-R TTTTCGGCTATCATAAGAGGT,

для амплификации фрагмента гена ботулинического токсина типа G Botulinum neurotoxin type G, праймеры BotntG-F1 GACCAGGACCAGTTCTAAGT и BotntG-R GTACAGGATCGCTATGTTGC,

для амплификации фрагмента гена столбнячного токсина Tetanus toxin (ТхТ), получены праймеры Cltxt-FTTATTTGTCTAACTTCTCCCGC и Cltxt-R GTAATAACATATCCAGATGCTCA.

2. Способ выявления генов токсинов микроорганизмов на основании мультиплексной панели по п. 1, содержащий следующие этапы, на которых:

- осуществляют одновременную амплификацию фрагментов гена дифтерийного токсина Diphtheria toxin с длиной фрагмента 309 н.п., гена стрептококкового токсина группы А с длиной фрагмента 361 н.п., гена холерного токсина субъединицы A Exotoxin type A speA с длиной фрагмента 408 н.п., гена холерного токсина субъединицы В с длиной фрагмента 347 н.п., гена ботулинического токсина типа А с длиной фрагмента 425 н.п., гена ботулинического токсина типа В с длиной фрагмента 507 н.п., гена ботулинического токсина типа С с длиной фрагмента 369 н.п., гена ботулинического токсина типа D с длиной фрагмента 468 н.п., гена ботулинического токсина типа Е с длиной фрагмента 497 н.п., гена ботулинического токсина типа F с длиной фрагмента 326 н.п., гена ботулинического токсина типа G с длиной фрагмента 339 н.п. и гена столбнячного токсина с длиной фрагмента 325 н.п.,

- далее полученные фрагменты используют для создания плазмид, которые используют как положительные контрольные образцы для определения генов токсинов в исследуемых образцах,

- затем получают электрофореграммы продуктов амплификации, на основании чего определяют наличие амплифицированных генов токсинов микроорганизмов в исследуемом образце.