Способ долгосрочного культивирования и экспансии NK-клеток с высокой жизнеспособностью и функциональной активностью Российский патент 2023 года по МПК C12N5/783 

Область техники

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к клеточной биотехнологии и может применяться для увеличения количества (экспансии) естественных киллеров (далее NK-клеток), полученных из периферической крови донора или онкологического больного.

За последние десятилетия появилось множество исследований, направленных на изучение и использование NK-клеток в адоптивной клеточной иммунотерапии против многих типов рака. В литературе сообщается о многочисленных способах культивирования и активации NK-клеток человека с использованием цитокинов и фидерных клеток, однако многие из этих подходов имеют ограничения, связанные с незначительным увеличением количества клеток при культивировании, необходимостью в добавлении больших количеств цитокинов или фидерных клеток для активации, регуляции пролиферации и апоптоза клеточной культуры, а также процессов активации и ингибирования основных NK-клеточных рецепторов [1].

NK-клетки являются компонентом врожденной иммунной системы, характеризуемые CD45⁺CD3^-CD56⁺ фенотипом, которые действуют как ключевые регуляторы и проявляют сильную противоопухолевую цитолитическую активность. Для оценки терапевтической эффективности адоптивной NK-клеточной иммунотерапии на доклинических этапах с возможностью клинического применения существует потребность в разработке надежных протоколов для экспансии NK-клеток ex vivo.

Среди описанных методов представлены способы культивирования NK-клеток на основе аутологичных и аллогенных NK-клеток, NK-клеточных линий, генетически модифицированных NK-клеток, включая несущие химерные рецепторы антигена CAR-NK. Способы экспансии NK-клеток in vitro отличаются также по длительности культивирования, составу питательных сред и режиму замены среды во время культивирования, составу активационных смесей из цитокинов, типу фидерных клеток и способу их обработки, включая замораживание и облучение.

При описании заявляемого способа и аналогов используются термины, имеющее следующее значение:

Термин «долгосрочное культивирование» относится к способу культивирования клеток, при котором клетки добавляют к питательной среде, составленной из всех необходимых компонентов, и культивируют не менее 14 дней. Культивирование прекращают на 21 сутки, а клетки и/или компоненты в среде собирают и по желанию очищают.

Термин «экспансия» используется для описания процесса быстрого увеличения количества клеток, в данном описании является синонимом к термину «генерация клеток».

Термин «ко-культивирование» относится к способу одновременного культивирования двух и более типов клеток/клеточных линий.

Термин «жизнеспособность клеток» относится к способности клеток выживать в культуре при заданной совокупности условий культивирования или экспериментальных отклонениях. Данный термин включает также отношение той части клеток, которая в определенное время является живой, к суммарному количеству живых и мертвых клеток в культуре в указанное время.

Термин «функциональная активность клеток» относится к характеристикам клеток, включающим описание иммунофенотипов клеток и их цитолитической функции за счет продукции цитокинов.

Термин «клеточная линия» относится к популяциям опухолевых клеток, используемых в качестве фидерных клеток для ко-культивирования с NK-клетками. Многочисленные клеточные линии поставляются коммерческими организациями, в частности Американской коллекцией типовых культур (АТСС).

Уровень техники

Известен способ «Methods For Expansion Of Natural Killer (NK) Cell Subset And Related Compositions And Methods» по заявке WO2020107002. В известном способе по культивированию и экспансии NK-клеток с иммунофенотипами CD3^-CD45⁺CD56⁺, CD3^-CD56⁺CD45⁺FcRγ^-, с облученными фидерными клетками 221.АЕН в соотношениях от 1:10 до 10:1. Выделение субпопуляций с иммунофенотипами CD3^-CD57⁺, CD3^-CD56⁺, CD3^-CD16⁺, CD3^-CD56⁺NKG2A^-CD161^- проводили из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных с помощью афереза или лейкофереза. В питательную среду добавляли 100 IU/мл рекомбинантного IL-2 и 50 нг/мл моноклонального антитела анти-CD3. Замену питательной среды осуществляли на 5-7 день и далее каждые 2-3 дня. Количество NK-клеток увеличилось в 100-2500 раз. К недостаткам известного способа можно отнести то, что для культивирования NK-клеток используют только один цитокин - интерлейкин-2 (IL-2), а не комбинацию цитокинов, что не позволяет достигнуть высокого уровня пролиферации (увеличения количества) NK-клеток. В качестве фидерных клеток используется клеточная линия 221.АЕН, которая не является классической мишенью для NK-клеток. Это также не позволяет достигнуть высокого уровня пролиферации NK-клеток, которое можно достичь при ко-культивировании с фидерными клетками, предложенными в заявляемом способе.

Известен способ «Method For Culturing Natural Killer Cells Using T Cells» по заявке WO2016085248. В известном способе NK-клетки выделяют из РВМС периферической крови человека. NK-клетки получают из клеток РВМС путем CD3⁺-сепарации. Для экспансии NK-клеток использовали Т-клетки в качестве фидерных клеток, в особенности использовали CD4⁺ Т-клетки, культивируемые ex vivo. При этом использовали инактивированные или не облученные выделенные из РВМС CD4⁺ Т-клетки или Т-клеточные линии, такие как Н9 или HuT78. Питательная среда содержит: основную среду (AIM-V medium, RIMI-1640, CellGro SCGM, X-VIVO20, IMDM или DMEM); дополнительные компоненты (любую сыворотку, например, аутологичную); моноклональное антитело anti-CD3 в концентрации 0,1-100 нг/мл (например, 10 нг/мл OKT-3); интерлейкин из группы IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 и IL-21 в концентрации 10-2000 Ед/мл (например, 500 Ед/мл IL-2). Фидерные клетки и NK-клетки вносят в питательную среду одновременно в соотношении по меньшей мере 1:1, более точно 2:1-20:1, наиболее точно 5:1. NK-клетки культивируют в течение по меньшей мере 5 дней, точнее 5-60 дней, более точно 14-21 день, но не ограничиваются этим. Стимуляция начинается на 0 день культивирования и может повторяться с интервалами 5-12 дней, конкретно 7 дней, но не ограничивается этим. Клетки можно собирать через 5 дней или более, конкретно через 14 дней после последней стимуляции. Дополнительно в способе рассматривается рестимуляция антителами и интерлейкинами с интервалами 5-12 сутки, конкретно на 7 сутки. Дополнительно рассматривалась рестимуляция фидерными клетками. Данный способ приводит к активации NK-клеток за счет увеличения экспрессии NKp44 и NKp46 рецепторов. К достоинствам известного способа можно отнести задекларированную жизнеспособность NK-клеток в 80% или выше. К недостаткам известного способа можно отнести активацию только двух рецепторов NKp44 и NKp46. Так же применение Т-клеток может усложнять процесс введения клеток пациентам для их лечения (этот недостаток указывается и в описании самого известного способа).

В качестве прототипа принят известный способ «Method for natural killer cell expansion» по заявке US2018245044. Известный способ культивирования in vitro и размножения NK-клеток в питательной среде включает следующие этапы:

а) добавление IL-21 в начале процесса культивирования в питательную среду;

б) многократное добавление в питательную среду IL-2 и/или IL-15;

с) многократное добавление фидерных клеток или их мембранных частиц к питательной среде, где фидерные клетки являются производными В-клеток, иммортализованные EBV;

При этом IL-21 и фидерные клетки добавляются в питательную среду с 0 дня. Установлено, что добавление указанного IL-21 в начале процесса культивирования и использование фидерных клеток, полученных из В-клеток, EBV, таких как SMI-EBV-LCL, приводят к очень высоким скоростям экспансии. Эффективная концентрация IL-21 в питательной среде может составлять от 0,1 до 1000 нг/мл. Эффективная концентрация IL-15 в указанной среде для культивирования клеток может составлять от 0,1 до 1000 нг/мл. IL-2 и IL-15 могут быть добавлены вместе. Многократное добавление фидерных клеток к питательной среде может быть выполнено между 5-м и 16-м днем. Соотношение NK-клеток к фидерным клеткам составляет от 1:100 до 1:1. Начальная концентрация NK-клеток в питательной среде содержит популяцию 2,5×10⁴ NK-клеток в 1 мл питательной среды или 5,25×10⁵ на 1 мл питательной среды (включая фидерные клетки). Питательная среда включает среду TexMACS (Miltenyi Biotec GmbH) с добавлением 5% сыворотки крови человека. В другом варианте осуществления среда для культивирования NK-клеток включает среду для роста стволовых клеток SCGM (Cell Genix) с добавлением 5% человеческой сыворотки типа АВ и 500 Ед/мл IL-2. Могут быть использованы среды X-Vivo 10, Х-Vivo 15, BINKIT NK Cell Initial Medium (Cosmo Bio USA), AIM-V (Invitrogen), DMEM / F12. К недостаткам прототипа можно отнести то, что в качестве фидерных клеток предложено использовать трансформированную вирусом Эпштейн-Барр лимфобластную клеточную линию, трансфекция и поддержание активной трансформированной клеточной линии, которой является сложным многостадийным процессом.

В заявляемом способе предложено использование типов фидерных клеток, полученных из опухолевых клеток, например, K-562. Это позволяет получить NK-клетки с одинаковым уровнем пролиферации и экспансии и позволяет упростить процесс получения фидерных клеток.

В прототипе для экспансии NK-клеток предложено использовать IL-21 с последующим добавлением IL-2 и/или IL-15. Перечисленные интерлейкины являются основными, используемыми в протоколах активации NK-клеток, которые улучшают противоопухолевую функцию NK-клеток и усиливают их пролиферацию in vitro и in vivo. Однако различные их комбинации могут приводить к активации разных рецепторов NK-клеток, что может приводить к различным результатам по их цитотоксичности. В прототипе не приводится информация об активационных маркерах полученных NK-клеток, что не позволяет сделать вывод об уровне их активации и их функциональной активности.

Использование в известном способе аутологичной сыворотки человека для культивирования NK-клеток может приводить к ингибированию активации NK-клеток за счет блокировки рецепторов.

Задачей изобретения является расширение арсенала технических средств культивирования NK-клеток и устранения отмеченных недостатков, присущих известным техническим решениям. Был осуществлен подбор состава питательной среды и комбинаций активирующих субстанций, включая цитокины, фидерные клетки и/или моноклональные антитела.

Было осуществлено определение условий и длительности культивирования NK-клеток. Комбинация подобранных составов и условий привела к многократной экспансии и активации полученных NK-клеток.

Технический результат состоит в том, что заявленный способ долгосрочного культивирования и экспансии NK-клеток с использованием цитокинов и фидерных клеток позволяет in vitro получать клеточные препараты с большим содержанием NK-клеток, а именно до 50×10⁷ клеток. Заявленный способ позволяет повышать функциональную активность NK-клеток. Так определение функциональной активности NK-клеток в конце процесса культивирования показывает, что по меньшей мере 80% клеток РВМС имеют фенотип NK-клеток и по меньшей мере 70% NK-клеток имеют активированный фенотип, включая экспрессию рецепторов CD38, CD69, HLA-DR, CD95, NKR.

Технический результат достигается тем, что способ культивирования NK-клеток в питательной среде, содержащей комбинацию по меньшей мере двух цитокинов, включает этапы:

(a) добавление в питательную среду NK-клеток, выделенных из мононуклеарных клеток (РВМС) периферической крови человека в концентрации (1-10)×10⁵ на 1 мл питательной среды;

(b) добавление в питательную среду фидерных клеток.

При этом добавление одних из следующих фидерных клеток: K-562, Jurkat, РВМС, генетически модифицированной линии K562-mbl5-41BBL или K562-mb21-41BBL в питательную среду на этапе (b) начинают на 5-8 сутки, весь процесс культивирования NK-клеток составляет 14-21 суток, в течение которого периодически меняют часть питательной среды на свежую питательную среду.

При этом могут использовать питательную среду, которая помимо комбинации по меньшей мере двух цитокинов содержит основную среду и дополнительный компонент.

В качестве основной среды могут использовать одну из следующих сред: RPMI-1640, TexMacs, Х-VIVO 10, Х-VIVO 20, AIM V.

В качестве дополнительного компонента могут использовать одну из следующих составляющих: эмбриональную бычью сыворотку (FBS), альбумин человека, заменитель сыворотки NU-SERUM или их аналоги в концентрации 5-10%.

В качестве цитокинов могут использовать комбинацию из по меньшей мере двух следующих интерлейкинов: интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин -15 (IL-15), интерлейкин-18 (IL-18), интерлейкин-21 (IL-21), в концентрации 0,1-500 нг на 1 мл питательной среды.

Для питательной среды могут дополнительно использовать моноклональные антитела anti-CD3 и/или anti-CD16 в концентрации 0,1-50 нг/мл.

NK-клетки по отношению к фидерным клеткам могут вносить в соотношениях от 1:1 до 1:10.

Замену питательной среды для культивирования NK-клеток могут проводить каждые 2-5 суток от начала культивирования.

Определение жизнеспособности, количества и функциональной активности NK-клеток в составе РВМС могут проводить при каждой замене питательной среды.

Сущность изобретения

Изобретение поясняется подробным описанием, примерами выполнения и фигурами, на которых изображено:

На фиг. 1 отображена морфология популяции активированных NK-клеток, полученных при культивировании в соответствии со способом культивирования, описанном в данном изобретении на 1-ые (слева) и на 10-ые (справа) сутки культивирования. Микрофотографии получены на инвертированном микроскопе (Leica Microsystems, Германия), без окрашивания, увеличение в 400 раз.

На фиг. 2 отображены два графика динамики пролиферации NK-клеток при культивировании в среде, не содержащей цитокины (незакрашенные ромбы) и содержащей цитокины IL-2, IL-15 и IL-21 (закрашенные треугольники) в течении 48 часов.

На фиг. 3 представлен фенотипический профиль маркеров РВМС, включая NK-клетки, полученный с помощью метода проточной цитометрии. Анализ проводили на 0, 7 и 14 сутки культивирования. Для анализа были выбраны следующие активационные маркеры: CD38, CD69, CD314, HLA-DR. Обозначения: сплошной линией обозначены «0 сутки», пунктирной - обозначены «7 сутки», точечной - обозначены «14 сутки».

На фиг. 4 представлено сравнение пролиферативной активности (конфлюентности) NK-клеток в различные сроки после активации комбинацией цитокинов.

Обозначения: закрашенные треугольники - NK-клетки на 0 сутки культивирования; закрашенные квадраты - NK-клетки на 3 сутки культивирования; не закрашенные треугольники - NK-клетки на 5 сутки культивирования; кресты - NK-клетки на 7 сутки культивирования.

На фиг. 5 представлены динамики уменьшения количества живых клеток-мишеней (флуоресценция САМ) в цитотоксическом тесте, в каждой лунке 24-луночного планшета, в среде с комбинацией цитокинов, записанные на протяжении 2-х часов, где:

- на 0 день сразу после начала активации NK-клеток (1-3 клетки по горизонтали);

- на 3 день после активации (4-6 клетки по горизонтали).

(А, В, С, D - клетки по вертикали, где А, В - здоровый донор; С, D - онкобольной).

A, С - соотношение мишень: эффектор 1:20;

B, D - соотношение мишень: эффектор 1:10.

На фиг. 6 представлены динамики изменения концентраций цитокинов в супернатантах на 1, 3 и 5 сутки культивирования NK-клеток в питательной среде. Обозначения: точечная линия - IL-2, закрашенная сплошная линия - IFN-γ, пунктирная линия - IL-6, не закрашенная сплошная - TNF-α.

Описание изобретения

Процесс культивирования NK-клеток начинается с выделения мононуклеарных клеток (РВМС) из периферической крови человека по стандартной методике градиентного центрифугирования. Для этого гепаринизированную венозную кровь предварительно разводят фосфатно-солевым буфером (PBS) и наслаивают на градиент фиколла (плотностью 1,077 г/см³), после чего отобранные РВМС двукратно отмывают PBS центрифугированием. В одном варианте выделение РВМС проводят путем лейкафереза в постоянном потоке крови на автоматических сепараторах крови, что обеспечивает более высокую чистоту и концентрацию РВМС в продукте. Клетки получают, накапливают и подвергают лабораторным воздействиям в асептических условиях, способных обеспечить минимальное загрязнение и минимум примесей. Клетки могут быть получены от здоровых доноров и от онкобольных пациентов.

Затем, для культивирования NK-клеток в питательной среде, лимфоциты, выделенные на градиенте плотности или путем лейкофереза из периферической крови больного (аутологичные) или здорового донора (аллогенные), активируют in vitro в питательной среде, состоящей из основной среды, дополнительного компонента и комбинации по меньшей мере двух рекомбинантных цитокинов человека. В качестве основной среды используют одну из следующих сред: RPMI-1640, TexMaCS, Х-VIVO 10, Х-VIVO 20, AIM-V. В качестве дополнительного компонента используют одну из следующих составляющих: эмбриональную бычью сыворотку (FBS), альбумин человека, заменитель сыворотки NU-SERUM или их аналоги в концентрации 5-10%. В качестве цитокинов используют рекомбинантные цитокины человека (IL-2, IL-15, IL-18, IL-21) в концентрации 0,1-500 нг на 1 мл питательной среды.

Для питательной среды дополнительно могут использовать моноклональные антитела anti-CD3 и/или anti-CD16 в концентрации 0,1-50 нг/мл. Для культивирования используют 6-ти или 24-луночный планшет. При увеличении количества клеток в одной лунке планшета более 2-6*106 клеток/мл осуществляют пересев клеток на 2-4 новые лунки.

NK-клетки на этапе (а) вносят в концентрации 1*10⁵-1*10⁶ клеток/мл в необходимом объеме питательной среды на лунку. Культивирование проводят при 37°С в CO₂-инкубаторе с концентрацией CO₂ 5% на протяжении 14-21 суток. В одном варианте осуществления культивирование проводят в мультигазовом инкубаторе в атмосфере 5% CO₂ и 5-10% O₂.

На 0 сутки культивирования в среду вносят цитокины в комбинациях или по отдельности, а также могут вносить моноклональные антитела. Первые 2 суток культивирование проводят без замены питательной среды. Затем каждые 2-5 суток проводят замену части (например, половины) питательной среды на свежую питательную среду. При этом свежая питательная среда может не содержать цитокинов.

Затем на этапе (b) производят ко-культивирование NK-клеток с фидерными клетками, для чего в питательную среду добавляют фидерные клетки. В качестве фидерных клеток используют следующие клеточные линии: K-562, Jurkat cells или РВМС, а также генетически модифицированные линии, включая K562-mbl5-41BBL или K562-mb21-41BBL. Фидерные клетки предварительно облучают или обрабатывают митамицином С для устранения пролиферативной активности. NK-клетки по отношению к фидерным клеткам вносят в соотношениях от 1:1 до 1:10, например - 1:1, 1:3, 1:5, 1:10. Здесь термин "соотношение" относится к соотношению, основанному на количестве клеток.

В одном варианте осуществления фидерные клетки ко-культивируют без последующей замены питательной среды с добавлением комплекса цитокинов.

Каждый день проводится микроскопическая визуализация клеточной суспензии. На 0, 7, 14 и 21 сутки культивирования проводят оценку жизнеспособности, пролиферативной активности NK-клеток и фенотипирование на проточном цитометре субпопуляций CD3/CD16/CD56 лимфоцитов и экспрессию рецепторов активации NK-клеток. Цитотоксическую активность активированных NK-клеток оценивают на 7 и 14 сутки культивирования. На 21 сутки культивирования определяют концентрации факторов роста, хемокинов и цитокинов в среде культивирования.

Одним из общепринятых методов увеличения активности цитотоксических лимфоцитов (в частности NK-клеток) остается культивирование in vitro периферических мононуклеаров в сочетании с цитокинами, антителами, ростовыми факторами или фидерными клетками. В данном изобретении был предложен способ долгосрочного культивирования и экспансии NK-клеток с добавлением комбинации цитокинов IL-2, IL-15, IL-18 и моноклональных anti-CD3 и anti-CD16 антител, чтобы получить большое количество NK-клеток с высокой цитотоксической активностью без уменьшения их жизнеспособности. Настоящее изобретение может быть использовано в клинике для клеточной терапии иммунопатологий, включая использования NK-клеток в адоптивной иммунотерапии рака, а также в исследованиях, направленных на использование активированных клеток для лечения аллергий и иммуносупрессивных состояний, например, при COVID-19.

Пример 1 Долгосрочное культивирование NK-клеток с высокой жизнеспособностью и функциональной активностью.

Для получения NK-клеток с целью долгосрочного культивирования, их экспансии и повышения функциональной активности у здорового донора собирали венозную кровь в пробирки с гепарином. Далее проводили выделение РВМС согласно стандартной методике на градиенте плотности Hystopague-1077 (Sigma Aldrich, США).

Культивирование проводили в питательной среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS) с добавлением моноклональных антител anti-CD3 в концентрации 30 нг/мл, цитокинов IL-2 в концентрации 250 МЕ/мл и IL-15 и IL-21 по 20 нг/мл соответственно. Культивирование проводили в CO₂-инкубаторе во влажной атмосфере при 37°С.

После активации в присутствии цитокинов NK-клетки начинают пролиферировать с первых часов культивирования и их количество увеличивается до 9 раз уже через 15 часов после начала активации (Фиг. 1). По сравнению с неактивированными клетками данный показатель был выше в 2,5 раза (р<0,05) (Фиг. 2).

Доля NK-клеток в смеси культивированных РВМС к 14 дню у большинства доноров возросла почти в 2 раза от исходного количества и составила в среднем 70±8% от РВМС. В результате сепарации получили очищенную субпопуляцию активированных NK-клеток, среди которых 98% клеток имели фенотип CD3^-CD16⁺CD56⁺ NK-клеток, экспрессирующих маркеры ранней (CD38, CD69) и поздней активации (NKG2D, HLA-DR). Данные клетки могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии онкобольных, а также для изучения цитотоксической активности NK-клеток.

Пример 2 Фенотипический анализ активированных после экспансии NK-клеток.

В процессе культивирования РВМС, выделенных у онкобольных пациентов, был проведен анализ субпопуляционного состава и маркеров активации лимфоцитов с помощью проточной цитометрии и определения наличия поверхностных маркеров CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD38, CD56, CD69, CD314 и HLA-DR на 0, 7 и 14 стуки культивирования. Анализ флуоресценции и подсчет клеток (не менее 10000 событий в экспериментах по анализу экспрессии поверхностных маркеров в гейте (области)) проводили на проточном цитофлуориметре с визуализацией Amnis Mark II (Luminex, США) с лазерами на 405, 488 и 642 нм. Результаты подвергали математической обработке с использованием программы IDEAS (Luminex, США) или с помощью программы Kaluza Analysis (Beckman Coulter, США).

Культивирование проводили с изменениями по процедуре, описанной в примере 1. Так, после выделения РВМС сразу культивировали NK-клетки без проведения негативной селекции. При культивировании клеток в среде с IL-2 и IL-15 было выявлено, что в процессе активации происходит незначительное перераспределение клеточных субпопуляций (Фиг. 3). Так процент В- и Т-лимфоцитов незначительно уменьшался к 14 суткам культивирования, доля NKT-клеток начинала увеличиваться с 7 суток. Количество NK-клеток к 14 суткам возрастает в 1,4 раза. Экспрессия рецептора NKG2D на всех лимфоцитах незначительно увеличилась на 14 сутки культивирования. Процент клеток, несущих рецептор к IL-2(CD25) максимально возрастал в 1,7 раз только к 14 суткам. Экспрессия активационных маркеров увеличилась к 14 дню в 2,3 раза для CD38, в 2,5 раза для HLA-DR и в 3 раза для CD69. Учитывая их функциональные особенности, эти эффекторные клетки могут быть использованы для целей адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований.

Пример 3 Оценка жизнеспособности и пролиферативной активности активированных после экспансии NK-клеток.

Для определения функциональной активности активированных NK-клеток проводили оценку пролиферативной, цитотоксической активностей и жизнеспособности клеток. Количество клеток в суспензии определяли с использованием автоматического анализатора жизнеспособности клеток ТС20 (BioRad, Сингапур). Как правило, одновременно определяли жизнеспособность клеток методом исключения красителя (трипановый синий) (Trypan Blue Dye 0,1%, Bio-Rad, Великобритания). Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии (~10 мкл) смешивают с равным количеством 0,4% (w/v) раствора красителя в PBS. Пролиферативную активность и жизнеспособность культивируемых клеток оценивали каждые 72 ч в течение всего времени культивирования. Результат получали как процент живых и мертвых клеток. Количество клеток в 1 мл суспензии пересчитывали на общий объем культуральной среды.

Оценку кинетики роста клеточной популяции и функциональной активности клеток, культивируемых в 24-луночных планшетах, проводили в режиме реального времени IncuCyte Zoom (Essen Bioscience, США) в течении 65 ч в условиях CO₂-инкубатора. Каждый час автоматически получали изображение областей наблюдения и количественные характеристики заданных параметров клеточной популяции. Полученные данные обрабатывали с помощью программы IncuCyte Software и получали графики зависимости конфлюентности (т.е. пролиферативную активность, количество живых или мертвых клеток по включению флуорисцентных красителей в зависимости от времени культивирования) NK-клеток от времени наблюдения. По сравнению с неактивированными NK-клетками этот показатель был выше в 2,5 раза (Фиг. 4).

Пример 4 Оценка цитотоксической активности активированных после экспансии NK-клеток

Для постановки цитотоксического теста были использованы стандартные для NK-клеток клетки-мишени линии К-562. Цитолитическую активность NK-клеток оценивали цитофлуориметрически, используя специальный набор, содержащий два вида красителей для живых и мертвых клеток-мишеней (L-3224) "Live/Dead" (Molecular Probes, США). Кальцеин AM (САМ) окрашивает живые клетки, этидий гомодимер-1 (Ethd-1) проникая в ядро, окрашивает мертвые клетки. Литическую активность NK-клеток против клеток-мишеней оценивали в различных соотношениях. Исходя из количества мишеней (К-562) - 15 тыс. клеток на образец с NK-клетками в соотношении 1:2 и 1:4.

Показано, что при культивировании в среде с комбинацией цитокинов IL-2, IL-15, IL-18, IL-21 цитотоксическая активность NK-клеток проявляется с первых часов культивирования, т.к. уменьшается количество живых клеток, окрашенных САМ (Фиг. 5), и постепенно возрастает, достигая максимума через 60 часов культивирования. Показано, что цитотоксическая активность выше у активированных NK-клеток (Фиг. 5, 4, 6) при соотношении мишеней и эффекторов 1:20. Если сравнивать показатели у здорового донора и онкологического больного, то можно заметить, что у больного (Фиг. 5 - С, D) цитотоксическая активность меньше, чем у здорового добровольца (Фиг. 5 - А, В), особенно при низком соотношении мишеней и эффекторов.

Пример 5 Оценка секреторной функции NK-клеток после активации in vitro в присутствии комбинации цитокинов

Для изучения функциональной активности активированных NK-клеток проводили оценку концентраций цитокинов (включая IL-2, IFN-γ, IL-6, TNF-α) в бесклеточном продукте (супернатанте) на 1, 3 и 5 сутки культивирования с помощью мультипараметрического анализа по протоколу набора MILLIPLEX^® MAP Human Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A 48 Plex Premixed Magnetic Bead Panel (Millipore, Merck, США) на приборе Luminex 200 (Merck, США). По стандартным образцам строили калибровочные кривые, по которым вычисляли концентрацию белков в супернатантах. На Фиг. 6 представлены результаты анализа изменения концентраций IL-2, IFN-γ, IL-6, TNF-α в динамике у здоровых доноров. Было показано, что концентрация большинства цитокинов в разной степени повышается в динамике наблюдения, что свидетельствует об увеличении цитокинпродуцирующей секреторной функции NK-клеток в процессе их активации.

Литература:

[1] Abakushina Е.V. et al., The Advantages and Challenges of Anticancer Dendritic Cell Vaccines and NK Cells in Adoptive Cell Immunotherapy // Vaccines. - 2021. - Т. 9. - №.11. - C. 1363.

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии, биотехнологии и медицины, а именно к способу культивирования in vitro естественных киллеров (NK-клеток) в питательной среде с комбинацией по меньшей мере двух цитокинов: IL-2, IL-15, IL-18, IL-21 и фидерными клетками K562-mb15-41BBL или K562-mb21-41BBL. Для осуществления указанного способа сначала добавляют в питательную среду NK-клетки, выделенные из мононуклеарных клеток (РВМС) периферической крови человека в концентрации от 1×10⁵ до 1×10⁶ на 1 мл питательной среды. После чего в питательную среду добавляют интерлейкины. Затем в среду добавляют фидерные клетки в соотношениях от 1:1 до 1:10. При этом весь процесс культивирования NK-клеток составляет 14-21 суток, в течение которого замену питательной среды проводят каждые 2-5 суток от начала культивирования. В качестве питательной среды используют RPMI-1640, на этапе (b) интерлейкины добавляют в питательную среду, начиная с 0 суток, на этапе (с) начинают на 5-8 сутки. Культивирование проводят в мультигазовом инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% CO₂ или 5% CO₂ и 5-10% О₂. Заявленный способ позволяет получать клеточные препараты с большим содержанием NK-клеток, а именно до 50×10⁷ клеток, и позволяет повышать функциональную активность NK-клеток. 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.

1. Способ культивирования in vitro естественных киллеров (NK-клеток) в питательной среде с комбинацией по меньшей мере двух цитокинов: интерлейкином-2 (IL-2), интерлейкином-15 (IL-15), интерлейкином-18 (IL-18), интерлейкином-21 (IL-21) и фидерными клетками, включающий этапы:

(a) добавление в питательную среду NK-клеток, выделенных из мононуклеарных клеток (РВМС) периферической крови человека в концентрации от 1×10⁵ до 1×10⁶ на 1 мл питательной среды;

(b) добавление интерлейкинов в питательную среду;

(с) добавление в среду фидерных клеток в соотношениях от 1:1 до 1:10;

при этом весь процесс культивирования NK-клеток составляет 14-21 суток, в течение которого замену питательной среды проводят каждые 2-5 суток от начала культивирования, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют RPMI-1640, на этапе (b) интерлейкины добавляют в питательную среду, начиная с 0 суток, на этапе (с) начинают на 5-8 сутки, а в качестве фидерных клеток используют одну из генетически модифицированных линий K562-mb15-41BBL или K562-mb21-41BBL, культивирование проводят в мультигазовом инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% CO₂ или 5% CO₂ и 5-10% О₂.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для питательной среды дополнительно используют одну из следующих составляющих: эмбриональную бычью сыворотку (FBS), альбумин человека, заменитель сыворотки NU-SERUM или их аналоги в концентрации 5-10%.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что интерлейкины (IL-2, IL-15, IL-18, IL-21) используют в концентрации 0,1-500 нг на 1 мл питательной среды.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для питательной среды дополнительно используют моноклональные антитела anti-CD3 и/или anti-CD16 в концентрации 0,1-50 нг/мл.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят определение жизнеспособности, количества и функциональной активности NK-клеток в составе PBMC при каждой замене питательной среды.