Способ определения иммунологической толерантности у животных Российский патент 2021 года по МПК G01N33/53 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в клинической практике для диагностики иммунологической толерантности у животных, в частности к способу оценки иммунологической ареактивности в биологической системе «мать-плацента-потомство» и использовать иммунологические методы диагностики для выявления различных заболеваний у сельскохозяйственных животных на крупных и мелких животноводческих фермах.

Уровень техники

При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов определения иммунологической толерантности у животных путем оценки иммунологической реактивности организма.

Известно множество способов оценки иммунологической реактивности, направленных на изучение различных звеньев иммунной системы, осуществляемых как in vitro, так и in vivo и основанных на выявлении и определении функциональной активности клеток, участвующих в формировании клеточного и гуморального иммунитета, определении иммуноглобулинов и циркулирующих иммунных комплексов, антителозависимой клеточной цитотоксичности, оценке реакций гиперчувствительности замедленного типа, немедленного типа, в частности реакции дегрануляции тучных клеток и базофилов крови.

Однако известные и широко используемые способы оценки иммунологической реактивности макроорганизма не дают полной гарантии и точной оценки индуцированного состояния иммунологической ареактивности к специфическому антигену.

Известен способ определения иммунологической реактивности организма путем воздействия на организм лекарственным веществом (вводят пирогенал в дозе 0,15-0,18 мкг на 1 кг веса) и при повышении температуры до 37,0-37,5°С определяют иммунологическую реактивность в пределах нормы, при 36,6-36,9°С определяют недостаточность иммунологической реактивности (См. Авт. св. СССР №1689857, М.Кл.² G01N 33/53, 1989 г.). Данный способ имеет ряд недостатков, снижающих его информативность. Так, определяемый показатель температуры тела претерпевает существенные изменения, обусловленные не только физиологическими процессами (испарение влаги с поверхности кожи, вентиляция легких и т.д.), но и неконтролируемыми технологическими параметрами (температура и влажность внешнего воздуха, теплопроводность поверхностей). Высокая вариабельность полученных результатов, также снижает информативность таких параметров для суждения о недостаточности иммунологической реактивности.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы (См. Авт. св. СССР №1686364, М.Кл.² G01N 33/53, 1991 г.). Однако для реализации способа требуется дорогостоящее оборудование и биопрепараты. Кроме того, способ недостаточно информативен, а также сложен.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение концентрации иммуноглобулинов и специфических антител в плазме, отличающийся тем, что, дополнительно определяют концентрацию иммуноглобулинов A, G, М и специфических сывороточных антител, сорбированных на форменных элементах крови и по соотношению концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови судят о иммунологической реактивности организма (См. Патент РФ №2126154, M.Кл.² G01N 33/53, 1999 г.).

Недостаток данного способа в том, что он применим только в специальных лабораторных условиях с применением методов иммунохимии, что сужает диапазон его полезного использования в полевых условиях. Кроме того, определение концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови достаточно сложно технически и требует значительных временных затрат, специального оборудования и реактивов.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение иммунологических показателей клеток крови, по которым судят о состоянии организма (См. Патент РФ №1813213, М.Кл.² G01N 33/53, 1993 г.).

Однако недостатком данного способа является повышенная травматичность, т.к. отбор крови производится из локтевой вены, что особенно сложно для тяжелобольных и в педиатрической практике. Из-за невозможности проведения анализа после длительного хранения проб исключается проведение скрининговых исследований. Способ недостаточно информативен, т.к. позволяет определить предрасположенность к небольшому количеству заболеваний, характеризуется низкой пропускной способностью из-за длительности процесса.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип является способ тестирования иммунологической толерантности у животных, включающий искусственное индуцирование ареактивности к антигену, последующее введение в организм разрешающей дозы антигена и исследование базофилов крови, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, исследуют динамику количественных сдвигов циркулирующих в крови базофилов в течение семи суток после однократного внутрибрюшного введения специфического антигена в разведении 1:50-1:100 в количестве 5 мл на 1 кг массы тела и при содержании количественных параметров на уровне до введения антигена тестируют иммунологическую толерантность (См. Патент РФ №2014606, M.Кл.² G01N 33/53, 1994 г.).

Несмотря на положительные результаты прототипа, его недостатками является диагностика иммунологической толерантности без выявления и определения значений титра антител и не позволяет достоверно установить наличие и степень тяжести толерантного эффекта в функциональной системе «мать-плацента-потомство». А по одному виду пула клеток-базофилов не представляется возможным оценить степень резвившейся иммунологической ареактивности к специфическому антигену. Наш способ будет выявлять уже доступные изменения иммунологической реактивности с первых часов жизни у полученного потомства.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа оценки иммунологической толерантности у животных, направленного на более релевантную оценку ареактивности потомства в раннем возрасте.

Техническим результатом изобретения является повышение, достоверности лабораторного исследования (неинвазивного пренатального скрининга изоиммунизационных эффектов у потомства) за счет выявления состояния реакции агглютинации между полученной иммунной сывороткой крови потомства и семенем биологического самца производителя. Предлагаемый способ позволяет сформировать группу животных с признаками иммунологической толерантности.

Технический результат достигается при помощи способа определения иммунологической толерантности у животных, при этом с целью оценки иммунологической ареактивности в раннем постнатальном периоде, производят смешивание сыворотки крови новорожденного животного в пропорции 1:1 с нативной спермой самца-производителя, подвижность спермиев которой предварительно оценена по 10 бальной шкале, а по снижению активности спермиев на один балл относительно контроля новорожденные животные соответствуют первой степени ареактивности, на 2 балла - второй степени, на три бала третьей степени и так далее по 5 степеням (5-я степень ареактивности у потомства - очень тяжелая с вероятным летальным исходом).

Краткое описание чертежей и иных материалов На фиг. приведена схема оценки иммунологической толерантности у особей опытной и контрольной групп.

Осуществление изобретения Примеры конкретного выполнения способа определения иммунологической толерантности у животных. Опыт 1.

У самца-производителя (хряка) получили сперму общепринятым искусственным способом на чучело т.е. при помощи специального спермиоприемника, подвижность спермиев которой предварительно оценивают по 10 бальной шкале (для проведения опыта подвижность спермиев не должна быть менее 7 баллов). В нашем опыте подвижность спермиев составила 9 баллов. После чего от трех новорожденных животных, полученных о данного самца-производителя, проводят отбор крови с получением сыворотку крови. Полученную сыворотку смешивают, с целью оценки иммунологической ареактивности в раннем постнатальном периоде, в пропорции 1:1 с исследуемой спермой самца-производителя. Через 5 минут после смешивания определяют повторно подвижность спермиев. Контроль проводят по сыворотке, смешанной 1:1 с физиологическим раствором. При снижении активности спермиев на один балл относительно контроля соответствует первой степени ареактивности, на 2 балла - второй степени, на три бала 3 степени и так далее по 5 степеням. 5-я степень ареактивности у потомства - очень тяжелая с вероятным летальным исходом. В нашем опыте реакция спермиев с сывороткой поросенка №1, №2 соответствовала первой степени ареактивности. Реакция спермиев с сывороткой поросенка №3 соответствовала четвертой степени (данные представлены на фиг.).

Опыт 2.

Опыт проводился по аналогии опыта 1, только вместо спермы хряка использовали спермы самца-производителя (быка). При этом подвижность спермиев составила 9 баллов. Реакция спермиев с сывороткой теленка №1 соответствовала пятой степени ареактивности, Реакция спермиев с сывороткой теленка №2 и №3 соответствовала третьей степени ареактивности. Теленок №1 после интегральной оценки имел признаки пониженной жизнеспособности и в течении первой декады постнатального периода погиб (данные представлены на фиг.).

Опыт 3.

Опыт проводился по аналогии опыта 1, только вместо спермы хряка использовали спермы самца-производителя (барана). При этом подвижность спермиев составила 9 баллов. Реакция спермиев с сывороткой ягненка №1 соответствовала первой степени ареактивности. Реакция спермиев с сывороткой ягнят №2 и №3 соответствовала пятой степени ареактивности. Ягнята №2 и №3 после интегральной оценки имел признаки пониженной жизнеспособности и в течении первой декады постнатального периода погибли (данные представлены на фиг.).

Опыт 4.

Опыт проводился по аналогии опыта 1, только вместо спермы хряка использовали спермы самца-производителя (козла). При этом подвижность спермиев составила 8 баллов. Реакция спермиев с сывороткой козлят №1 и №3 соответствовала четвертой степени ареактивности. Реакция спермиев с сывороткой козленка №2 соответствовала пятой степени ареактивности. Козленок №2 после интегральной оценки имел признаки пониженной жизнеспособности и в течении первой декады постнатального периода погиб (данные представлены на фиг.).

Опыт 5.

Опыт проводился по аналогии опыта 1, только вместо спермы хряка использовали спермы самца-производителя (жеребца). При этом подвижность спермиев составила 9 баллов. Реакция спермиев с сывороткой жеребят №1 и №2 соответствовала второй степени ареактивности. Реакция спермиев с сывороткой жеребенка №3 соответствовала пятой степени ареактивности. Жеребенок №3 после интегральной оценки имел признаки пониженной жизнеспособности и в течении второй декады постнатального периода погиб (данные представлены на фиг. ).

Опыт 6.

Опыт проводился по аналогии опыта 1, только вместо спермы хряка использовали спермы самца-производителя (кобеля). При этом подвижность спермиев составила 8 баллов. Реакция спермиев с сывороткой щенков №1 и №2 соответствовала четвертой степени ареактивности. Реакция спермиев с сывороткой щенка №3 соответствовала третьей степени ареактивности (данные представлены на фиг.).

Опыт 7.

Опыт проводился по аналогии опыта 1, только вместо спермы хряка использовали спермы самца-производителя (кота). При этом подвижность спермиев составила 8 баллов. Реакция спермиев с сывороткой котенка №1 соответствовала второй степени ареактивности. Реакция спермиев с сывороткой котенка №3 соответствовала третьей степени ареактивности. Реакция спермиев с сывороткой котенка №2 соответствовала пятой степени ареактивности. Котенок №2 после интегральной оценки имел признаки пониженной жизнеспособности и в течении первой декады постнатального периода погиб (данные представлены на фиг.).

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

1. Предлагаемый способ предназначен для определения иммунологической толерантности (ареактивности) организма животных.

2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.

3. Практически не требует затрат: для исследования необходимо небольшое количество крови и семени самца-производителя. Кроме того, для проведения анализа не используется специальное оборудование.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии и иммунологии, и касается определения иммунологической толерантности у животных. Для этого в раннем постнатальном периоде производят смешивание сыворотки крови новорожденного животного в пропорции 1:1 с исследуемой спермой самца-производителя, подвижность спермиев которой предварительно оценена по 10-балльной шкале. При снижении активности спермиев на 1 балл относительно контроля новорожденные животные соответствуют первой степени ареактивности, на 2 балла - второй степени, на 3 балла - третьей степени и так далее по 5 степеням. 5-я степень ареактивности у потомства - очень тяжелая с вероятным летальным исходом. Способ обеспечивает возможность оценки степени ареактивности у новорожденных животных с дальнейшим выявлением у них различных заболеваний. 7 пр., 1 ил.

Способ определения иммунологической толерантности у животных, отличающийся, тем, что с целью оценки иммунологической толерантности в раннем постнатальном периоде производят смешивание сыворотки крови новорожденного животного в пропорции 1:1 с исследуемой спермой самца-производителя в виде антигенспецифической реакции агглютинации на отцовские антигены, подвижность спермиев которой предварительно оценена по 10-балльной шкале, а при снижении активности спермиев на 1 балл относительно контроля новорожденные животные соответствуют первой степени ареактивности, на 2 балла - второй степени, на 3 балла - третьей степени и так далее по 5 степеням, при этом контролем является активность сперматозоидов в сперме с сывороткой крови животного, смешанной в равных частях с физиологическим раствором.