Способ повышения устойчивости лактобактерий для пробиотической добавки Российский патент 2021 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 A23K10/18 

Изобретение относится к микробиологии и сельскому хозяйству, а конкретно к способу повышения устойчивости микроорганизмов на основе молочнокислых бактерий для получения пробиотической добавки с целью повышения мясной продуктивности птицы.

Современное птицеводство многими путями решает проблему максимальной реализации биоресурсного потенциала птицы и сохранения при этом ее продуктивного здоровья. Ускорение динамики роста и повышение суточных приростов живой массы птицы при снижении экономических затрат на 1 кг прироста живой массы тела является одной из основных задач птицеводства.

Немаловажным показателем пробиотических свойств молочнокислой флоры является их способность колонизировать желудочно-кишечный тракт, а также их резистентность к биологическим жидкостям организма-хозяина (Выделение и отбор бактерий рода Lactobacillus - основы пробиотических препаратов / И.А. Буряко [и др.] // Пробиотики, пребиотики и синбиотики и функциональные продукты питания: мат. Междунар. конф. - М., 2004. - С. 19; Андрейчин, М.А. Антимикробные свойства желчи и желчных кислот / М.А. Андрейчин // Антибиотики. - 1980. - №25 (12). - С. 936-939; Петров, Л.Н. Основы конструирования пробиотиков повышенной терапевтической активности / Л.Н. Петров // Пробиот. микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования: тез. докл. Междунар. науч.-практ. конф. - М., 2002. - С. 12). Последний показатель возможно визуализировать in vitro путем использования экспериментальных агрессивных сред (Кощаев, А.Г. Биотехнология производства и применение функциональных кормовых добавок для птицы: дис…. докт. биол. наук: 16.00.04 / Кощаев Андрей Георгиевич. - 2008. - 425 с.).

Известен способ, предусматривающий внесение в питательную среду пектина из расчета 5-6 г/л (0,5-0,6%), обеспечивающего накопление биомассы микроорганизмов и придачу кисломолочному продукту пре-биотических свойств (Патент РФ №2023396, МПК А23С 9/12, А23С 9/127, 02.03.1993 г.).

Недостатком способа является отсутствие информации о виде пектина, его консистенции, при какой температуре он добавляется, что в целом не может гарантировать положительный результат.

Известен способ предусматривающий применение в составе рациона перепелов пробиотической добавки, состоящей из мелассы кормовой, К₂НРО₄, дрожжевого экстракта и воды (Интенсификация процесса культивирования физиологически-адаптированных штаммов лактобацилл как основа создания биопрепаратов микробного происхождения для птицеводства / А.Г. Кощаев, Ю.А. Лысенко, Мищенко В.А. [и др.] // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2017. - №04 (128). - С. 1102-1115).

Наиболее близким является техническое решение, в котором используют питательную среду для культивирования Lactobacillus agilis, состоящей из мелассы кормовой, К₂НРО₄ и дрожжевого экстракта (Патент РФ №2686326, МПК C12N 1/20, А61К 35/74, А61Р 43/00, 25.04.2019 г.).

Недостатком данного способа является то, что при использовании данной пробиотической добавки в рационе птицы будет происходить гибель живой культуры микроорганизма из-за агрессивной среды желудочно-кишечного тракта.

Техническим результатом является повышение устойчивости молочнокислых культур, за счет использования в питательной среде порошкообразного яблочного пектина.

Технический результат достигается тем, что в способе повышения устойчивости лактобактерий, в питательную среду для культивирования Lactobacillus agilis, состоящей из мелассы кормовой, К₂НРО₄, дрожжевого экстракта и воды, согласно изобретению при температуре 30-40°С питательной среды добавляют порошкообразный яблочный пектин из расчета 2,0-4,0 г на 1 литр воды.

Новизна заявляемого технического решения обусловлена тем, что используется мелассная среда, отличающаяся включением в ее состав порошкообразного яблочного пектина из расчета 2,0-4,0 г на 1 литр воды при температуре 30-40°С для равномерного распределения и полного растворения.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «новизна».

Соответствие заявляемого решения критерию патентоспособности «промышленная применимость» обусловлено тем, что предлагаемое техническое решение работоспособно и возможно его использование в качестве пробиотической добавки для сельскохозяйственной птицы.

Способ повышения устойчивости лактобактерий воспроизводится следующим образом.

Культивирование микроорганизмов Lactobacillus agilis осуществляют в среде, состоящей из мелассы кормовой - 45,0 г, К₂НРО₄ - 2,0 г, дрожжевого экстракта - 0,02 г и порошкообразного яблочного пектина, взятого в количестве 3,0 г в расчете на 1 литр воды и внесенного в питательную среду при температуре 30-40°С для равномерного его распределения и полного растворения. Затем в полученную смесь добавляют микроорганизмы Lactobacillus agilis с титром не менее 1,0×10⁵КОЕ/мл в количестве 100,0 г/л и культивируют при температуре 37°С, в течение 24 ч.

При использовании порошкообразного яблочного пектина в количестве менее 3,0 г/л, не будет обеспечиваться максимальной жизнеспособности культур в пробиотической добавке.

При использовании порошкообразного яблочного пектина в количестве более 3,0 г/л, достигается та же жизнеспособность культур в пробиотической добавке, поэтому не имеет смысла брать большее количество.

При внесении порошкообразного яблочного в питательную среду при температуре ниже 30°С не происходит его полного растворения и равномерного распределения, что соответственно не приводит к желаемому эффекту для микроорганизмов.

При внесении порошкообразного яблочного пектина в питательную среду при температуре выше 40°С происходит частичное разрушение пектина, что соответственно не приводит к желаемому эффекту для микроорганизмов.

Первый этап исследований включает изучение выращивания бактерий на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов без применения пектина. Устойчивость лактобактерий визуализировали по наличию или отсутствию роста изучаемой микрофлоры в жидкой питательной среде (мелассной), содержащей натуральный желудочный сок лошади (препарат «Эквин», 90%), желчь крупного рогатого скота медицинская консервированная (20%, 30%, 40%), фенол (0,4%) и NaCl (2%, 4%). Время выращивания культуры составляло 48 ч, температурный оптимум 37°С.

Результаты по влиянию агрессивных сред на выживаемость лактобактерий без применения полисахаридного компонента (пектина) представлены в таблице 1.

Результаты исследований показали, что культуры изучаемых лактобактерий проявили хороший рост только на среде с содержанием 2,0 и 4,0% хлорида натрия, а также при наличии в среде желчи в концентрации 20%. Незначительный рост дала культура на питательной среде, содержащей 30% желчи. В остальных случаях рост исследуемой культуры не проявился.

Следующим этапом исследований является обоснование использования порошкообразного яблочного и цитрусового пектинов для выращивания Lactobacillus agilis на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов. Выбор пектинов обусловлен тем, что на данные пектины существует стандарт, позволяющий их применять для пищевых целей («ГОСТ 29186-91. Пектин. Технические условия»).

Для проведения эксперимента микроорганизмы Lactobacillus agilis выращивали на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов с применением различных доз порошкообразного яблочного пектина:

1. Состав среды №1: 45 г/л мелассы кормовой, K₂HPO₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 1,0 г/л.

2. Состав среды №2: 45 г/л мелассы кормовой, К₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 2,0 г/л.

3. Состав среды №3: 45 г/л мелассы кормовой, К₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 3,0 г/л.

4. Состав среды №4: 45 г/л мелассы кормовой, К₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 4,0 г/л.

5. Состав среды №5: 45 г/л мелассы кормовой, К₂HPO₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 5,0 г/л.

Результаты влияния различных доз полисахарида растительного происхождения (яблочного пектина) на устойчивость лактобактерий Lactobacillus agilis к агрессивным средам представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что наилучшие результаты исследований проявились с применением в составе питательной среды, на которой выращивали изучаемые лактобактерий, яблочного пектина в дозе - 3,0; 4,0 и 5,0 г/л. В дозе 2,0 г/л яблочного пектина в составе мелассной среды выявлена устойчивость ко всем растворам NaCl и желчи, также незначительный рост в среде, содержащей 0,4% фенола, однако наблюдалось отсутствие роста в желудочном соке. При дозе 1,0 г/л яблочного пектина в составе питательной среды выявлена жизнеспособность как без отсутствия пектина.

Третьим этапом исследований является изучение выращивания Lactobacillus agilis на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов с применением различных доз порошкообразного цитрусового пектина:

1. Состав среды №1: 45 г/л мелассы кормовой, К₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 1,0 г/л.

2. Состав среды №2: 45 г/л мелассы кормовой, К₂HPO₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 2,0 г/л.

3. Состав среды №3: 45 г/л мелассы кормовой, К₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 3,0 г/л.

4. Состав среды №4: 45 г/л мелассы кормовой, К₂HPO₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 4,0 г/л.

5. Состав среды №5: 45 г/л мелассы кормовой, К₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 5,0 г/л.

Результаты влияния различных доз полисахарида растительного происхождения (цитрусового пектина) на устойчивость лактобактерий Lactobacillus agilis к агрессивным средам представлены в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что наилучшие результаты исследований проявились с применением в составе питательной среды, на которой выращивали изучаемые лактобактерий, цитрусового пектина в дозе - 5,0 г/л.

Результаты проведенных исследований показали, что наиболее эффективной и оптимальной питательной средой является мелассная среда следующего состава: 45 г/л мелассы кормовой, К₂НРО₄ - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, порошкообразного яблочного пектина - 3,0 г/л и остальное вода. Разработанная пробиотическая добавка может быть использована в производственных условиях при кормлении сельскохозяйственной птицы, в частности для перепелов.

Для доказательства эффективности полученной пробиотической добавки на основе микроорганизмов Lactobacillus agilis, выращенных на мелассной среде с добавлением порошкообразного яблочного пектина были проведены научные исследования на перепелах породы Фараон.

Методом групп аналогов было сформировано пять групп перепелов по 90 голов в каждой: контрольная группа - в рационе присутствовал только основной полноценный комбикорм и питьевая вода; 1-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали разработанную пробиотическую добавку в дозе 0,25 мл/гол; 2-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,5 мл/гол; 3-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,75 мл/гол; 4-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 1,0 мл/гол. Применение пробиотической добавки в опытных группах осуществлялось ежедневно (таблица 4).

Перепела выращивались в полупромышленных многоярусных металлических клетках.

Результаты хозяйственных показателей при выращивании перепелов представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5, статистически достоверное повышение по живой массе перепелов в сравнении с группой контроля, было выявлено на 21-е сутки в 1-й, 2-й, 3-й и 4-й опытных группах, соответственно, на 5,83; 7,76; 7,80 и 7,16% (Р<0,05). На 28-сутки в 1-й опытной группе живая масса перепелов была больше, чем в контроле на 13,07%, во 2-й на 9,05%, в 3-й - 13,46% при достоверной разнице (Р<0,05). На 35-й день выращивания птицы достоверное повышение живой массы наблюдалось в 1-й, 3-й и 4-й опытных группах на 10,23; 10,60 и 10,83% (Р<0,05). Аналогичная тенденция в 1-й, 3-й и 4-й опытных группах по изучаемому показателю наблюдалась на 42-е сутки, в которых по сравнению с контрольной группой живая масса была достоверно больше на 8,11; 9,12 и 9,75% (Р<0,05).

Сохранность перепелов во всех опытных группах была выше, чем в контрольной на 6,66; 13,33; 5,55 и 14,44%.

Прирост живой массы перепелов за весь период выращивания в 1-4-й опытных группах также был больше, чем в контрольной на 2,21; 9,45; 2,91 и 10,10%.

Как видно из таблицы 5, с ростом живой массы опытных птиц повышается и потребление ими комбикормов. При этом затраты кормов на 1 кг прироста живой массы в опытных группах оставались ниже, чем в контрольной на 1,26; 7,79; 2,01 и 7,54%.

Таким образом, результаты испытаний показали, что выращивание перепелов с использованием разработанной пробиотической добавки на основе культуры Lactobacillus agilis, а также выращенная на мелассной среде с добавлением порошкообразного яблочного пектина, в испытуемых дозах обеспечивает повышение продуктивности перепелов, за счет повышения устойчивости микроорганизмов Lactobacillus agilis к агрессивным средам ЖКТ птицы.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ устойчивости лактобактерий для пробиотической добавки предусматривает культивирование бактерий вида Lactobacillus agilis на питательной среде, содержащей мелассу кормовую, К₂НРО₄, дрожжевой экстракт, порошкообразный яблочный пектин и воду в заданных количествах при температуре 30-40°С в течение 24 ч. При этом пектин вносится в питательную среду при температуре питательной среды 30-40°С. Изобретение позволяет повысить устойчивость биомассы лактобактерий при попадании их в желудочно-кишечный тракт птицы и к агрессивным условиям окружающей среды. 5 табл.

Способ повышения устойчивости лактобактерий для пробиотической добавки, включающий использование питательной среды для культивирования микроорганизмов Lactobacillus agilis, состоящей из мелассы кормовой, К₂НРО₄, дрожжевого экстракта и воды, отличающийся тем, что в питательную среду при температуре 30-40°С добавляют порошкообразный яблочный пектин из расчета 2,0-4,0 г на 1 литр воды.