Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который представлен в электронном виде в формате ASCII и тем самым полностью включен в качестве ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 11 ноября 2015 г., обозначена как 32401_SL.txt и имеет размер 527137 байтов.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение к комбинированным терапиям на основе активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы и антагониста, связывающегося с осью PD-1, и необязательно антагониста TIM3 и к применению указанных комбинированных терапий для лечения рака.

Предпосылки создания изобретения

Моноклональные антитела являются сильными терапевтическими агентами для лечения рака благодаря их избирательному направленному воздействию на антигены, которые характеризуются специфической схемой экспрессии на раковых клетках.

В последние годы повысился интерес к биспецифическим антителам, созданным таким образом, чтобы они связывались с помощью одного антигенсвязывающего фрагмента с поверхностным антигеном на клетках-мишенях и с помощью второго антигенсвязывающего фрагмента с активирующим инвариантным компонентом комплекса Т-клеточного рецептора (TCR). Одновременное связывание такого антитела с обеими его мишенями должно приводить к временному взаимодействию между клеткой-мишенью и Т-клеткой, вызывая активацию любой цитотоксической Т-клетки и последующий лизис клетки-мишени. Таким образом, иммунный ответ переориентируется на клетки-мишени и не зависит от презентации пептидного антигена клеткой-мишенью или специфичности Т-клетки, что имеет место при нормальной ограниченной ГКГС активации CTL. В этом контексте решающее значение имеет то, что CTL активируются только тогда, когда клетка-мишень презентует им биспецифическое антитело, т.е. имеет место имитация иммунологического синапса. Наиболее предпочтительными являются биспецифические антитела, для которых не требуется предварительное кондиционирование или костимуляция лимфоцитов для того, чтобы вызывать эффективный лизис клеток-мишеней. Пока не установлено, каким образом ТСВ (активирующие Т-клетки биспецифические молекулы) влияют на сами Т-клетки помимо активации определенной эффекторной функции.

Для активации покоящихся Т-лимфоцитов или Т-клеток антигенпрезентирующими клетками (АРС), по-видимому, требуется два входных сигнала (Lafferty и др., Aust. J. Exp. Biol. Med. ScL 53, 1975, cc. 27-42). Первичный сигнал или антигенспецифический сигнал трансдуцируется через Т-клеточный рецептор (TCR) после распознавания «чужого» антигенного пептида, презентируемого в контексте главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). Второй или костимуляторный сигнал доставляется к Т-клеткам костимуляторными молекулами, которые экспрессируются на антигенпрезентующих клетках (АРС) и индуцируют усиление клональной экспансии, секреции цитокинов и эффекторной функции Т-клеток (Lenschow и др., Ann. Rev. Immunol. 14, 1996, с. 233). В отсутствии костимуляции Т-клетки могут становиться устойчивыми к антигенной стимуляции, не могут обеспечивать эффективный иммунный ответ, и это также может приводить к (иммунному) истощению или толерантности к «чужим» антигенам.

Т-клетки могут получать как положительные, так и отрицательные вторичные костимуляторные сигналы. Баланс положительных и отрицательных сигналов является важным для создания эффективных иммунных ответов, поддерживая при этом иммунологическую толерантность и предупреждая аутоиммунитет. Отрицательные вторичные сигналы, по-видимому, необходимы для индукции Т-клеточной толерантности, а положительные сигналы ускоряют Т-клеточную активацию.

В последние годы установлено, что Т-клеточная дисфункция или анергия существует одновременно с индуцированной и сохраняющейся экспрессией ингибирующего рецептора, полипептида запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1). Один из его лигандов, PD-L1, сверхэкспрессируется при многих видах рака и часто ассоциирован с плохим прогнозом (Okazaki Т. и др., Intern. Immun. 19(7), 2007, с. 813; Thompson R.H. и др., Cancer Res 66(7), 2006, c. 3381). Важно отметить, что большинство инфильтрующих опухоль Т-лимфоцитов главным образом экспрессируют PD-1 в отличие от Т-лимфоцитов в здоровых тканях и Т-лимфоцитов периферической крови, это свидетельствует о том, что повышающая регуляция PD-1 на опухольреактивных Т-клетках может принимать участие в нарушенных противоопухолевых иммунных ответах (Blood, 114(8), 2009, с. 1537).

Для иммунной регуляции важной является молекула, содержащая Т-клеточный иммуноглобулин и домен 3 муцина (TIM3). Этот присутствующий на клеточной поверхности белок экспрессируется главным образом Т-клетками-хелперами типа 1 и участвует в регуляции активации макрофагов, воспалительных состояний и рака (Majeti R. и др., PNAS, 106, 2009, сс. 3396-3401 и WO 2009/091547). Связывание молекулы TIM3 с одним из ее лигандов (например, с галектином-9) может подавлять Th1-ответ путем индукции запрограммированной гибели клеток, поддерживая тем самым периферическую толерантность. Обработка siPHK TIM3 или антагонистическим антителом к TIM3 повышает секрецию интерферона альфа CD4-позитивными Т клетками, что подтверждает ингибирующую роль TIM3 в человеческих Т-клетках. Примеры моноклональные антител к TIM3 включают антитела, описанные в WO 2013/06490 и US 2012/189617 (Ngiow и др., Cancer Res 7, 2011, с. 6567).

FOLR1 экспрессируется на опухолевых клетках различного происхождения, например, клетках рака яичника и рака легкого. Описано несколько подходов для нацеливания на FOLR1 терапевтических антител, таких как фарлетузумаб, конъюгатов антитело-лекарственное средство, или для визуализации опухолей при адоптивной Т-клеточной терапии (Kandalaft и др., J Transl Med.; 10, 3 августа 2012 г., с. 157. doi: 10.1186/1479-5876-10-157; van Dam и др., Nat Med.; 17(10), 18 сентября 2011 г., сс. 1315-1319. doi: 10.1038/нМ.2472; Clifton и др., Hum Vaccin.; 7(2), февраль 2011 г., Epub 1 февраля 2011 г.; Kelemen и др., Int J Cancer.; 119(2), 15 июля 2006 г., сс. 243-150; Vaitilingam и др., J Nucl Med.; 53(7), июль 2012 г.; Teng и др., 9(8), август 2012 г., сс. 901-908. doi: 10.1517/17425247.2012.694863, Epub 5 июля 2012 г.). Было предпринято несколько попыток направленного воздействия на позитивные по фолатному рецептору опухоли с помощью конструкций, мишенью которых являются фолатный рецептор и CD3 (Kranz и др., Proc Natl Acad Sci USA.; 92(20), сентябрь 1995 г., сс. 9057-9061; Roy и др., Adv Drug Deliv Rev.; 56(8), 29 апреля 2004 г., сс. 1219-1231; Huiting Cui и др Biol Chem.; 287(34), 17 августа 2012 г., сс. 28206-28214; Lamers и др., Int. J. Cancer. 60(4), 1995, с. 450; Thompson и др., MAbs.; 1(4), июль-август 2009 г., сс. 348-356, Epub 19 июля 2009 г.; Mezzanzanca и др., Int. J. Cancer, 41, 1988, сс. 609-615).

При этом сохраняется потребность в указанной оптимальной терапии для лечения, стабилизации, предупреждения и/или замедления развития различных видов рака.

Краткое изложение сущности изобретения

В широком смысле настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, в которых объединен нацеленный на фолатный рецептор 1 (FolR1) антигенсвязывающий сайт со вторым антигенсвязывающим сайтом, нацеленным на CD3, и к их применению в комбинации с антагонистом, связывающимся с осью PD-1, например, для лечения рака. В одном из вариантов осуществления изобретения комбинация содержит также антагонист TIM3. Способы и комбинации, предлагаемые в настоящем изобретении, могут усиливать иммунотерапию. Преимуществом по сравнению с общепринятым лечением является специфическая индукция Т-клеточной активации только в области, в которой происходит экспрессия FolR1, а также снижение и/или реверсия низкой обусловленной Т-клетками активности, называемой также Т-клеточным истощением, в результате объединения с антагонистом, связывающимся с осью PD-1, и необязательно с антагонистом TIM3.

Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является способ лечения или замедление развития рака у индивидуума, включающий введение индивидууму в эффективном количестве активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы и антагониста, связывающегося с осью PD-1. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, и второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1). В одном из вариантов осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере одного гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере одного CDR легкой цепи, выбранную из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. В одном из вариантов осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит также третий антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FolR1. В одном из вариантов осуществления изобретения второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат идентичные последовательности гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи и CDR легкой цепи. В одном из вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен второму антигенсвязывающему фрагменту. В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере один из первого, второго и третьего антигенсвязывающего фрагмента представляет собой молекулу Fab.

В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1) содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере одного гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, и по меньшей мере одного CDR легкой цепи, выбранную из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере одного гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57, и по меньшей мере одного CDR легкой цепи, выбранную из группы SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере одного гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 50, и по меньшей мере одного CDR легкой цепи, выбранную из группы SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FolR1, содержит:

(а) аминокислотную последовательность гипервариабельного участка 1 тяжелой цепи (CDR-H1) SEQ ID NO: 8;

(б) аминокислотную последовательность CDR-H2 SEQ ID NO: 9;

(в) аминокислотную последовательность CDR-H3 SEQ ID NO: 50;

(г) аминокислотную последовательность гипервариабельного участка легкой цепи 1 (CDR-L1) SEQ ID NO: 52;

(д) аминокислотную последовательность CDR-L2 SEQ ID NO: 53 и

(е) аминокислотную последовательность CDR-L3 SEQ ID NO: 54.

В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FolR1, содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с человеческим FolR1, FolR1 обезьян циномолгус и мышиным FolR1.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула индуцирует пролиферацию человеческой CD3-позитивной Т-клетки in vitro.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула индуцирует опосредуемый мононуклеарной клеткой периферической крови человека цитолиз экспрессирующей FolR1 человеческой опухолевой клетки in vitro.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула индуцирует опосредуемый Т-клеткой цитолиз экспрессирующей FolR1 человеческой опухолевой клетки in vitro. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула индуцирует опосредуемый Т-клеткой цитолиз экспрессирующей FolR1 человеческой опухолевой клетки in vitro, характеризующийся величиной ЕС₅₀, составляющей от примерно 36 до примерно 39573пМ через 24 ч. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула индуцирует повышающую регуляцию экспрессии на клеточной поверхности Т-клетки по меньшей мере одного из CD25 и CD69 по данным измерений методом проточной цитометрии. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с человеческим FolR1 с кажущейся величиной K_D, составляющей от примерно 5,36пМ до примерно 4нМ. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с FolR1 человека и обезьян циномолгус с кажущейся величиной K_D, составляющей примерно 4нМ. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с мышиным FolR1 с кажущейся величиной K_D, составляющей примерно 1,5нМ. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с человеческим FolR1 с величиной K_D, характеризующей одновалентное связывание, которая составляет примерно 1000 нМ.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с FolR1, экспрессируемым на человеческой опухолевой клетке. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с конформационным эпитопом на человеческом FolR1. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула не связывается с человеческим фолатным рецептором 2 (FolR2) или человеческим фолатным рецептором 3 (FolR3). В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент связывается с полипептидом FolR1, содержащим аминокислоты с 25 по 234 человеческого FolR1 (SEQ ID NO: 227). В одном из вариантов осуществления изобретения связывающий антиген FolR1 фрагмент связывается с полипептидом FolR1, содержащим аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 227, 230 и 231, и при этом связывающий антиген FolR1 фрагмент не связывается с полипептидом FolR, содержащим аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 228 и 229. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит а) первый антигенсвязывающий сайт, который конкурирует за связывание с человеческим FolR1 с референс-антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH), который имеет SEQ ID NO: 49, и вариабельный домен легкой цепи, который имеет SEQ ID NO: 51; и б) второй антигенсвязывающий сайт, который конкурирует за связывание с человеческим CD3 с референс-антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH), который имеет SEQ ID NO: 36, и вариабельный домен легкой цепи, который имеет SEQ ID NO: 31, где конкуренцию за связывание оценивают методом поверхностного плазмонного резонанса.

Одним из объектов изобретения является активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, где антигенсвязывающая молекула содержит первую, вторую, третью, четвертую и пятую полипептидные цепи, которые образуют первый, второй и третий антигенсвязывающий фрагменты, где первый антигенсвязывающий фрагмент обладает способностью связываться с CD3, а второй и третий антигенсвязывающий фрагмент каждый обладает способностью связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), где а) первая и вторая полипептидные цепи содержат в направлении от амино (N)-конца к карбоксильному (С)-концу VLD1 и CLD1; б) третья полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к С-концу VLD2 и CH1D2; в) четвертая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к С-концу VHD1, CH1D1, CH2D1 и CH3D1; г) пятая полипептидная цепь содержит VHD1, CH1D1, VHD2, CLD2, CH2D2 и CH3D2; где VLD1 представляет собой вариабельный домен первой легкой цепи, VLD2 представляет собой вариабельный домен второй легкой цепи, CLD1 представляет собой константный домен первой легкой цепи, CLD2 представляет собой константный домен второй легкой цепи, VHD1 представляет собой вариабельный домен первой тяжелой цепи, VHD2 представляет собой вариабельный домен второй тяжелой цепи, CH1D1 представляет собой константный домен 1 первой тяжелой цепи, CH1D2 представляет собой константный домен 1 второй тяжелой цепи, CH2D1 представляет собой константный домен 2 первой тяжелой цепи, CH2D2 представляет собой константный домен 2 второй тяжелой цепи, CH3D1 представляет собой константный домен 3 первой тяжелой цепи, и CH3D2 представляет собой константный домен 3 второй тяжелой цепи.

В одном из указанных вариантов осуществления изобретении

а. третья полипептидная цепь и VHD2 и CLD2 пятой полипептидной цепи образуют первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью связываться с CD3;

б. первая полипептидная цепь и VHD1 и CH1D1 четвертой полипептидной цепи образуют второй связывающий фрагмент, обладающий способностью связываться с FolR1; и

в. вторая полипептидная цепь и VHD1 и CH1D1 пятой полипептидной цепи образуют третий антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью связываться с FolR1.

В одном из указанных вариантов осуществления изобретения первая и вторая полипептидные цепи содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 399. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 394. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения пятая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 397. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения

а. первая и вторая полипептидные цепи содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 399;

б. третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86;

в. четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 394; и

г. пятая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 397.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело является двухвалентным касательно FolR1 и CD3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело содержит один или несколько Fab-фрагмент(ов), содержащий(их) антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении CD3, в котором(ых) вариабельные домены или константные домены тяжелой и легкой цепи обменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело содержит Fc-домен, по меньшей мере один Fab-фрагмент, который содержит антигенсвязывающий сайт, специфический для FolR1, и по меньшей мере один Fab-фрагмент, который содержит антигенсвязывающий сайт, специфический для CD3, в котором либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи по меньшей мере одного Fab-фрагмента обменены.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело содержит:

а) Fc-домен,

б) первый и второй Fab-фрагменты, каждый из которых содержит антигенсвязывающий сайт, специфический для FolR1,

в) третий Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий сайт, специфический для CD3, в котором третий Fab-фрагмент соединен на С-конце вариабельной тяжелой цепи (VH) со второй субъединицей Fc-домена и в котором третий Fab-фрагмент соединен на N-конце вариабельной тяжелой цепи с С-концом второго Fab-фрагмента.

В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере один из указанных Fab-фрагментов соединен с Fc-доменом через пептидный линкер.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное биспецифическое антитело содержит Fc-домен, содержащий одну или несколько аминокислотную(ых) замену(н), которая(ые) снижает(ют) связывание с Fc-рецепторами и/или эффекторную функцию. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная(ые) одна или несколько аминокислотная(ых) замена(н) находится в одном или нескольких положениях, выбранных из группы L234, L235 и Р329. В одном из вариантов осуществления изобретения каждая субъединица Fc-домена содержит три аминокислотные замены, которые аннулируют связывание с активирующим или ингибирующим Fc-рецептором и/или эффекторную функцию, где указанные аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и P329G.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, выбирают из группы, состоящей из антагониста, связывающегося с PD-1, антагониста, связывающегося с PD-L1, и антагониста, связывающегося с PD-L2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, представляет собой антагонист, связывающийся с PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с его партнером по связыванию, таким как лиганд. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 и с PD-L1, и с PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-1 представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-1 представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab-, Fab'-SH-, Fv-, scFv- и (Fab')₂-фрагментов. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой ниволумаб, пембролизумаб, СТ-011 или АМР-224.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, представляет собой антагонист, связывающийся с PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с В7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PDL1, ингибирует связывание и с PD-1, и с В7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L1, представляет собой антитело к PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab-, Fab'-SH-, Fv-, scFv- и (Fab')2-фрагментов. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 представляет собой гуманизированное антитело или человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L1, выбирают из группы, состоящей из: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 и MEDI4736.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 содержит тяжелую цепь, которая содержит последовательность HVR-H1 SEQ ID NO: 289, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO: 290 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO: 291; и легкую цепь, которая содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO: 292, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO: 293 и последовательность HVR-L3 SEQ ID NO: 294. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PDL1 содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 280 или SEQ ID NO: 281, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 383. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 содержит тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278 и/или легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 279.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, представляет собой антагонист, ввязывающийся с PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L2, представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L2 представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L2 представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab-, Fab'-SH-, Fv-, scFv- и (Fab')₂-фрагментов. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L2, представляет собой иммуноадгезин.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ по любому из указанных выше вариантов осуществления изобретения дополнительно включает введение индивидууму антагониста Т-клеточного иммуноглобулина-муцина 3 (TIM3). В одном из вариантов осуществления изобретении антагонист TIM3 представляет собой антитело к TIM3. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 индуцирует интернализацию TIM3 экспрессирующей TIM3 клеткой, составляющую по меньшей мере 45% через 120 мин при 37°С, когда интернализацию определяют с помощью FACS-анализа. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 обладает одним или несколькими из следующих свойств:

а) конкурирует за связывание с TIM3 с антителом к TIM3, содержащим VH, которая имеет SEQ ID NO: 7, и VL, которая имеет SEQ ID NO: 8,

б) связывается с TIM3 человека и обезьян циномолгус,

в) обладает в виде иммуноконъюгата цитотоксической активностью в отношении экспрессирующих TIM3 клеток,

г) индуцирует высвобождение интерферона-гамма.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 обладает одним или несколькими из следующих свойств:

а. конкурирует за связывание с TIM3 с антителом к TIM3, содержащим VH, которая имеет SEQ ID NO: 7, и VL, которая имеет SEQ ID NO: 8,

б. связывается с TIM3 человека и обезьян циномолгус,

в. обладает в виде иммуноконъюгата цитотоксической активностью в отношении экспрессирующих TIM3 клеток,

г. индуцирует высвобождение интерферона-гамма.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 представляет собой моноклональное антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 представляет собой фрагмент антитела, который связывается с TIM3. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 представляет собой Fab-фрагмент. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит:

А) (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309; или

Б) (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 306; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 314; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309; или

В) (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 306; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 315; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309; или

Г) (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 316, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 317, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 318; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 319; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 320, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 321; или

Д) (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 324, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 325, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 326; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 327; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 328, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329; или

Е) (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 332, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 334; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 335; (И) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 336, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 337; или

Ж) (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 340, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 341, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 342; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 343; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 344, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 345; или

З) (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 348, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 349, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 350; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 351; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353; или

И) (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 356, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 358; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 359; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 360, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 361; или

К) (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 364, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 365, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 366; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 367; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 368, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 369.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 представляет собой полноразмерное антитело IgGl-изотипа с мутациями S228P, L235E и P329G, где нумерация соответствует EU-индексу Кэбота. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 представляет собой любое из антител, описанных в WO 2011/155607, WO 2013/006490, WO 03/063792, WO 2009/097394 и WO 2011/159877. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 представляет собой F38-2E2.

В одном из вариантов осуществления изобретения рак содержит ген KRAS дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения рак содержит активирующую мутацию в гене KRAS.

В одном из вариантов осуществления изобретения лечение приводит к продолжительному ответу у индивидуума после прекращения лечения. В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одну активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу и антагонист, связывающийся с осью PD-1, вводят непрерывно. В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одну активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу и антагонист, связывающийся с осью PD-1, вводят с перерывами. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, вводят перед FolR1-ТСВ (ТСВ, мишенью которой является FolR1). В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, вводят одновременно с FolR1-ТСВ. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, вводят после FolR1-ТСВ. В одном из вариантов осуществления изобретения рак выбирают из группы, состоящей из рака яичника, рака легкого, рака молочной железы, рака почки, колоректального рака, рака эндометрия. В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одну активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу и антагонист, связывающийся с осью PD-1, вводят внутривенно, внутримышечно, подкожно, местно, орально, чрескожно, внутрибрюшинно, внутриглазнично, путем имплантации, путем ингаляции, внутритрахеально, внутрь желудочков или внутриназально.

В одном из вариантов осуществления изобретения Т-клетки у индивидуума обладают повышенной активацией, пролиферацией и/или эффекторной функцией по сравнению с клеткой до введения комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения Т-клетки у индивидуума обладают повышенной активацией, пролиферацией и/или эффекторной функцией по сравнению с клеткой до введения только активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы. В одном из вариантов осуществления изобретения Т-клеточная эффекторная функция представляет собой секрецию по меньшей мере одного из IL-2, IFN-γ и TNF-α. В одном из вариантов осуществления изобретения индивидуум содержит менее чем примерно 15% экспрессирующих PD-1^hi инфильтрующих опухоль Т-клеток.

Одним из объектов изобретения является способ усиления иммунной функции у индивидуума с FolR1-позитивным раком, включающий введение индивидууму в эффективном количестве комбинации активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, специфической в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1) и CD3, и антагониста, связывающегося с осью PD-1. В одном из вариантов осуществления изобретения Т-клетки у индивидуума обладают повышенной активацией, пролиферацией и/или эффекторной функцией по сравнению с клеткой до введения комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения Т-клетки у индивидуума обладают повышенной активацией, пролиферацией и/или эффекторной функцией по сравнению с клеткой до введения только активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы. В одном из вариантов осуществления изобретения Т-клеточная эффекторная функция представляет собой секрецию по меньшей мере одного из IL-2, IFN-γ и TNF-α.

В одном из вариантов осуществления изобретения индивидуум содержит менее чем примерно 15% экспрессирующих PD-1^hi инфильтрующих опухоль Т-клеток.

Другим объектом изобретения является способ отбора пациента для лечения комбинацией активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, специфической в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1) и CD3, и антагониста, связывающегося с осью PD-1, включающий измерение уровня экспрессии PD-1, и отбор пациента для лечения комбинацией, который имеет менее чем примерно 15% экспрессирующих PD-1^hi Т-клеток.

Другим объектом изобретения является набор, который содержит активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, специфическую в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1) и CD3, и листовку-вкладыш в упаковку с инструкциями по применению активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы в сочетании с антагонистом, связывающимся с осью PD-1, для лечения или замедления развития рака у индивидуума. В одном из вариантов осуществления изобретения набор дополнительно содержит инструкции по применения активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы в сочетании с антагонистом TIM3.

Другим объектом изобретения является набор, который содержит активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, специфическую в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1) и CD3, антагонист, связывающийся с осью PD-1, и листовку-вкладыш в упаковку с инструкциями по применению активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы в сочетании с антагонистом, связывающимся с осью PD-1, для лечения или замедления развития рака у индивидуума. В одном из вариантов осуществления изобретения набор дополнительно содержит антагонист TIM3. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, представляет собой антитело к PD-1 или антитело к PD-L1. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, представляет собой антитело к PD-1 иммуноадгезин.

Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, специфическую в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1) и CD3, антагонист, связывающийся с осью PD-1, и фармацевтический приемлемый носитель. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит антагонист TIM3.

Следующим объектом изобретения является применение комбинации активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, специфической в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1) и CD3, антагониста, связывающегося с осью PD-1, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака. В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения рака яичника, рака легкого, рака молочной железы, рака почки, колоректального рака, рака эндометрия.

В некоторых вариантах осуществления всех объектов настоящего изобретения предпочтительно указанная активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула и/или антагонист, связывающийся с осью PD-1, являются человеческими или гуманизированными.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело содержит Fc-домен, по меньшей мере один Fab-фрагмент, который содержит антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении FolR1, и по меньшей мере один Fab-фрагмент, который содержит антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении CD3.

Одним из объектов изобретения является способ лечения или замедления развития рака у индивидуума, включающий введение индивидууму в эффективном количестве активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы и антагониста TIM3. В некоторых из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит Fc-домен, два Fab-фрагмента, каждый из которых содержит антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении FolR1, и один Fab-фрагмент, который содержит антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении CD3.

Следующим объектом настоящего изобретения является применение комбинации активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, которая связывается с FolR1 и CD3, и антагониста, связывающегося с осью PD-1, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.

Следующим объектом настоящего изобретения является применение комбинации активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, которая связывается с FolR1 и CD3, антагониста, связывающегося с осью PD-1, и антагониста TIM3 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.

Варианты осуществления настоящего изобретения будут ниже описаны с целью примера, которые не ограничивают объем изобретения, и со ссылкой на прилагаемые чертежи. Однако различные другие объекты и варианты осуществления настоящего изобретения должны стать очевидными специалистам в данной области в свете настоящего описания.

В контексте настоящего описания «и/или» рассматривается как специфическое описание каждой из двух специфических особенностей или компонентов вместе или отдельно друг от друга. Например, «А и/или Б» следует рассматривать как специфическое описание каждого из следующих вариантов (I) А, (II) Б и (III) А и Б, так, как если бы каждый из них упоминался индивидуально.

Если из контекста не следует иное, то описания и определения описанных выше особенностей не ограничены каким-либо конкретным объектом или вариантом осуществления изобретения и равным образом относятся ко всем описанным объектам и вариантам осуществления изобретения.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1А-И - проиллюстрированы примеры конфигураций активирующих Т-клетку биспецифических антигенсвязывающих молекул (ТСВ), предлагаемых в изобретении. Все конструкции за исключением каппа-лямбда-формата (представленного на фиг. 1И) имеют мутации P329G LALA и содержат «knob-into-hole»-Fc-фрагменты с модификациями типа «knob-into-hole». На фиг. 1А проиллюстрирована конструкция «FolR1-ТСВ 2+1 инвертированная (общая легкая цепь)». FolR1-связывающий агент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, содержащей модификацию, приводящую к образованию «выступа». Эти конструкции не являются «скрещенными» и имеют встречающуюся три раза одну и ту же легкую цепь (содержат три одинаковые) VLCL. На фиг. 1Б проиллюстрирована конструкция «FolR1-ТСВ 1+1 «голова-к хвосту» (общая легкая цепь)». Эти конструкции не являются «скрещенными» и имеют встречающуюся два раза одну и ту же легкую цепь VLCL. На фиг. 1В проиллюстрирована конструкция «FolR1-ТСВ 1+1 классическая (общая легкая цепь)». Эти конструкции не являются «скрещенными» и имеют встречающуюся два раза одну и ту же легкую цепь VLCL. На фиг. 1Г проиллюстрирована конструкция «FolR1-ТСВ 2+1 классическая (общая легкая цепь)». CD3-связывающий агент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, содержащей модификацию, приводящую к образованию «выступа». Эти конструкции не являются «скрещенными» и имеют встречающуюся три раза одну и ту же легкую цепь VLCL. На фиг. 1Д проиллюстрирована конструкция «FolR1 ТСВ 2+1 crossfab классическая». Эти конструкции содержат цепь Ck-VH для CD3-связывающего агента вместо канонической цепи CH1-VH. CD3-связывающий агент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, содержащей модификацию, приводящую к образованию «выступа». На фиг. 1Е проиллюстрирована конструкция «FolR1-ТСВ 2+1 crossfab инвертированная». Эти конструкции содержат цепь Ck-VH для CD3-связывающего агента вместо канонической цепи CH1-VH. FolR1-связывающий агент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, содержащей модификацию, приводящую к образованию «выступа». На фиг. 1Ж проиллюстрирована конструкция «FolR1-ТСВ 1+1 crossfab «голова-к хвосту»». Эти конструкции содержат цепь Ck-VH для CD3-связывающего агента вместо канонической цепи CH1-VH. На фиг. 1З проиллюстрирована конструкция «FolR1-ТСВ 1+1 crossfab классическая». Эти конструкции содержат цепь Ck-VH для CD3-связывающего агента вместо канонической цепи CH1-VH. На фиг. 1И проиллюстрирован каппа-лямбда-формат антитела к CD3/FolR1. Эти конструкции содержат «скрещенную» общую легкую цепь VLCH1 и одну «скрещенную» цепь VHCL, специфическую в отношении CD3, и одну «скрещенную» цепь VHCL, специфическую в отношении FolR1;

на фиг. 2А-В - графики, на которых обобщены данные о связывании FolR1-связывающих агентов в виде IgG с клетками HeLa. Связывание новых созданных FolR1-связывающих агентов с FolR1, экспрессируемым на клетках HeLa, оценивали с помощью проточной цитометрии. Связанные антитела обнаруживали с использованием флуоресцентно меченного вторичного античеловеческого антитела;

на фиг. 3А-Б - графики, на которых обобщены данные о специфичности FolR1-связывающих агентов в отношении FolR1. Связывание IgG к FolR1 с клетками НЕК, кратковременно трансфектированными либо FolR1, либо FolR2, анализировали с помощью проточной цитометрии для идентификации клонов, которые специфически связывались с FolR1 и не связывались с FolR2. Антитела обнаруживали с использованием флуоресцентно меченного вторичного античеловеческого антитела;

на фиг. 4А-Б - графики, на которых обобщены данные о кросс-реактивности FolR1-связывающих агентов с cyFoLR1. Кросс-реактивность антител к FolR1 с cynoFolR1 анализировали на клетках НЕК, кратковременно трансфектированных cyFolR1, с помощью проточной цитометрии. Антитела обнаруживали с использованием флуоресцентно меченного вторичного античеловеческого антитела;

на фиг. 5 - график, иллюстрирующий интернализацию ТСВ к FolR1 (FolR1-ТСВ) после связывания. Интернализацию четырех FolR1-ТСВ после связывания с FolR1 тестировали на клетках HeLa. Оставшиеся на поверхности FolR1-ТСВ обнаруживали с использованием флуоресцентно меченного вторичного античеловеческого антитела в указанные моменты времени после инкубации при 37°С. Рассчитывали процент интернализации;

на фиг. 6А-Д - графики, на которых обобщены данные о связывании антител к FolR1 в виде IgG с клетками, характеризующимися различными уровнями экспрессии FolR1. Связывание IgG 9D11, 16D5 и Mov19 с опухолевыми клетками, характеризующимися различными уровнями экспрессии FolR1, анализировали с помощью проточной цитометрии. IgG DP47 включали в качестве контроля изотипа, a MKN-45 включали в качестве FolR1-негативной клеточной линии. Антитела обнаруживали с использованием флуоресцентно меченного вторичного античеловеческого антитела;

на фиг. 7А-М - графики, на которых обобщены данные об опосредуемом Т-клетками цитолизе клеток НТ-29 и SKOV3. FolR1-ТСВ применяли для тестирования опосредуемого Т-клетками цитолиза опухолевых клеток НТ-29 и SKOV3 и повышающей регуляции маркера активации на Т-клетках после цитолиза. На фиг. 7А-Г представлены данные об опосредуемом Т-клетками цитолизе клеток НТ-29 и SKOV3 в присутствии FolR1-TCB 19D11 и FolR1-TCB 16D5, который оценивали по высвобождению ЛДГ через 24 и 48 ч. ТСВ DP47 включали в качестве отрицательного контроля. После инкубации в течение 48 ч оценивали повышающую регуляцию маркеров активации CD25 и CD69 на CD8-Т-клетках и CD4-Т-клетках после цитолиза опухолевых клеток SKOV3 (фиг. 7Е-З) или НТ-29 (фиг. 7И-М) с помощью проточной цитометрии;

на фиг. 8 - график, демонстрирующий отсутствие связывания антител к FolR1 (анти-FolR1) с эритроцитами. Эритроциты выявляли с помощью дискриминационного окна как CD235a-позитивную популяцию и связывание IgG 9D11, IgG 16D5, IgG Mov19 и IgG DP47 с указанной популяцией обнаруживали с помощью проточной цитометрии. Антитела обнаруживали с использованием флуоресцентно меченного вторичного античеловеческого антитела;

на фиг. 9А-Г - графики, на которых представлено обобщение данных о повышающей регуляции маркера активации в цельной крови. Повышающую регуляцию маркеров активации CD25 и CD69 на СВ4-Т-клетках и CD8-T-клетках через 24 ч после добавления FolR1-ТСВ 9D11, FolR1-ТСВ 16D5, FolR1-ТСВ Mov19 и ТСВ DP47 анализировали с помощью проточной цитометрии;

на фиг. 10А-В - данные о цитолизе человеческих опухолевых клеток Hela (высокий уровень FolR1) (фиг. 24А), SKov-3 (средний уровень FolR1) (фиг. 24Б) и НТ-29 (низкий уровень FolR1) (фиг. 24В) Т-клетками, индуцируемом ТСВ 36F2, ТСВ 16D5, 16D5 в формате «ТСВ классическая», 16D5 в формате «ТСВ 1+1» и 16D5 в формате «ТСВ НТ (голова-к хвосту)» (Е:Т = 10:1, эффекторные клетки представляли собой человеческие РВМС, время инкубации 24 ч). ТСВ DP47 включали в качестве несвязывающегося контроля;

на фиг. 11А-Б - данные об экспрессии ингибирующих рецепторов на инфильтрующих опухоль Т-клетках. CD8⁺- и CD4⁺-Т-клетки в образцах опухоли характеризовали в отношении экспрессии ингибирующих рецепторов с помощью проточной цитометрии;

на фиг. 12А-П - данные об активации CD8⁺-Т-клеток в ферментативно расщепленных образцах опухолей и злокачественных выпотах после экспозиции FolR1-ТСВ. Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или в отсутствии FolR1-ТСВ или ТСВ DP47 в качестве контроля. Экспрессию маркеров активации или маркеров Т-клеточной функции на CD8⁺-Т-клетках определяли с помощью проточной цитометрии (фиг. 12А-Н). На фиг. 12К-Л показаны репрезентативные FACS-графики, демонстрирующие индуцированную FolR1-ТСВ Т-клеточную активацию у «высокореагирующих» (с высоким ответом) пациентов (BS-269) или «низкореагирующих» пациентов (BS-212). На фиг. 12М показаны FACS-графики, демонстрирующие индуцированную FolR1-ТСВ экспрессию маркеров активации в Т-клетках репрезентативного пациента. На графиках, представленных на фиг. 12Н, проиллюстрировано повышение уровня экспрессии маркера после обработки FolR1-ТСВ в виде среднего значения и стандартных отклонений. Для сравнения РВМС из здоровых доноров совместно культивировали с опухолевыми клетками линии Skov3 и стимулировали FolR1-TCB. На фиг. 12O представлены уровни IFN-γ, IL-2, TNF и перфорина в супернатантах клеточных культур по данным, полученным с помощью анализа методом Cytometric Bead Array (цитометрический анализ на гранулах множества агентов) или ELISA, и стандартизованных относительно количества 1×10⁵ CD3⁺-Т-клеток (IFN-γ, TNF, IL-2) или CD3⁺ CD8⁺ -Т-клеток (перфорин) в культуре. На фиг. 12П продемонстрировано, что индуцированный FolR1-ТСВ цитолиз опухолевых клеток значительно варьируется в ферментативно расщепленных образцах опухолей и злокачественных выпотах. FolR1-позитивные и FolR1-негативные ферментативно расщепленные образцы опухолей, злокачественные выпоты или РВМС из здоровых доноров совместно культивировали с экзогенно добавленными флуоресцентно меченными FolR1⁺-Skov3-клетками при соотношении Е:Т 1:1 в течение 24 ч в присутствии или в отсутствии FolR1-ТСВ. Индуцированный FolR1-ТСВ специфический цитолиз клеток Skov3 определяли с помощью проточной цитометрии путем измерения активированной каспазы 3 и маркера живых/мертвых клеток LIVE/DEAD^®-near-IR (LIVE/DEAD^® для ближней инфракрасной области). Опосредуемый FolR1-ТСВ цитолиз рассчитывали следующим образом: % специфического цитолиза = 100-[(% живых Skov3-клеток в обработанном FolR1-ТСВ образце / % живых Skov3-клеток в необработанном образце)×100]. На FACS-графиках продемонстрирован индуцированный FolR1-ТСВ цитолиз у репрезентативного пациента, р-значения рассчитывали с помощью непарного критерия Манна-Уитни;

на фиг. 13А-В - данные, демонстрирующие, что индуцированная FolR1-ТСВ Т-клеточная активация не коррелирует с соотношением Е:Т (фиг. 13А) или количеством опухолевых FolR1⁺-клеток (фиг. 13Б). Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или отсутствии FolR1-ТСВ. Индуцированная FolR1-ТСВ экспрессия CD25 коррелировала с соотношением Е:Т или количеством клеток-мишеней. MFI: среднее значение интенсивности флуоресценции;

на фиг. 14А-М - данные, демонстрирующие, что индуцированная FolR1-ТСВ Т-клеточная активация обратно коррелирует с уровнем экспрессии PD-1 и TIM3. Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или отсутствии FolR1-ТСВ. Экспрессию маркеров активации или маркеров Т-клеточной функции на CD8⁺-Т-клетках определяли с помощью проточной цитометрии. Индуцированная FolR1-ТСВ экспрессия CD25 (фиг. 14А-В), CD137 (фиг. 14Г-Е), ICOS (фиг. 14Ж-И) и гранзима В (фиг. 14К-М) коррелировали с исходным уровнем индивидуально или совместно экспрессируемых ингибирующих рецепторов PD-1 и TIM3;

на фиг. 15А-В - данные, демонстрирующие что индуцированная FolR1-ТСВ секреция IL-2 обратно коррелирует с совместной экспрессией PD-1 и TIM3. Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или отсутствии FolR1-ТСВ. IL-2 в супернатантах клеточных культур определяли с помощью ELISA и стандартизовали относительно количества Т-клеток. Индуцированная FolR1-ТСВ секреция IL-2 коррелировала с исходным уровнем индивидуально или совместно экспрессируемых ингибирующих рецепторов PD-1 и TIM3;

на фиг. 16А-Е - данные, демонстрирующие, что индуцированный FolR1-ТСВ цитолиз опухолевых клеток обратно коррелирует с совместной экспрессией PD-1 и TIM3. Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты совместно культивировали с экзогенно добавленными флуоресцентно меченными Skov3-клетками при соотношении Т-клеток и клеток-мишеней 1:1 в течение 24 ч в присутствии или отсутствии FolR1-ТСВ. FolR1-ТСВ-специфический цитолиз Skov3-клеток определяли с помощью проточной цитометрии путем измерения активированной каспазы 3 и маркера живых/мертвых клеток Live/Dead-near-IR. Специфический цитолиз коррелировал с исходным уровнем индивидуально или совместно экспрессируемых ингибирующих рецепторов PD-1, TIM3 и CTLA-4;

на фиг. 17А-З - данные об активации инфильтрующих опухоль CD8⁺-Т-клеток после экспозиции катумаксомаба. Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или в отсутствии катумаксомаба. На фиг. 17А-Г - данные об экспрессии маркеров активации или маркеров Т-клеточной функции на CD8⁺-T-клетках, которые определяли с помощью проточной цитометрии. На фиг. 17Д-З - графики, демонстрирующие исходную экспрессию ингибирующих рецепторов;

на фиг. 18А-Т - данные, демонстрирующие, что индуцированная катумаксомабом Т-клеточная активация обратно коррелирует с совместной экспрессией ингибирующих рецепторов. Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или в отсутствии катумаксомаба. Т-клеточная активация и эффекторные функции коррелировали с экспрессией PD-1 (фиг. 18А-Е), TIM3 (фиг. 18Ж-М) или комбинацией PD-1 и TIM3 (фиг. 18Н-Т):

на фиг. 19А-З - экспрессия ингибирующих рецепторов на инфильтрующих опухоли Т-клетках у пациентов с немелкоклеточным раком легких. CD8⁺- и CD4⁺-Т-клетки в образцах опухоли характеризовали с помощью проточной цитометрии в отношении экспрессии в них ингибирующих рецепторов (фиг. 19А-Е). На фиг. 19Ж продемонстрирована стратегия установки дискриминационных окон для одного репрезентативного донора. На фиг. 19З - результаты анализа и мозаичная теплокарта указанных субпопуляций клеток на основе процента экспрессии, полученная с помощью программы условного форматирования Excel;

на фиг. 20А-Д - данные о Т-клеточной активации и эффекторных функциях после поликлональной стимуляции с помощью антител к CD3/CD28. Экспрессию CD25 и гранзима В (фиг. 20А-Б), а также IL-2, IFN-γ и TNF-α (фиг. 20В-Д) в качестве маркеров Т-клеточной активации и эффекторной функции соответственно анализировали в Т-клетках из ферментативно расщепленных образцов опухолей после стимуляции ферментативно расщепленной всей опухоли с помощью антител к CD3 и CD28;

на фиг. 21A-O - данные об экспрессии ингибирующих рецепторов и дисфункции Т-клеток. Экспрессия CD25 и гранзима В (фиг. 21А-Б), а также IL-2, IFN-γ и TNF-α (фиг. 21В-Д) после поликлональной стимуляции антителами к CD3/к CD28 коррелировала с кумулятивной экспрессией ингибирующих рецепторов, по данным, полученным на основе iR-балла. На фиг. 21Е - пример расчета iR-баллов. Процент экспрессии PD-1, TIM3, CTLA-4, LAG-3 и BTLA анализировали во всех образцах NSCLC и определяли медианные значения, а также межквартильные размахи. Для расчета iR-балла каждому пациенту начисляли «очки» в зависимости от уровня экспрессии каждого из анализируемых ингибирующих рецепторов, которые определяли на основе квартиля, в который попадал уровень экспрессии. Максимально достижимое количество составляло 15 «очков»; рассчитанный балл для каждого образца стандартизовали относительно максимального количества «очков». На фиг. 21Ж-Л продемонстрировано, что экспрессия ингибирующих рецепторов повышалась в зависимости от стадии опухоли. Экспрессия ингибирующих рецепторов на инфильтрующих опухоли СВ8⁺-Т-клетках коррелировала со TNM-стадией (международная классификация злокачественных опухолей) опухоли. На фиг. 21М-О представлены данные о кумулятивной экспрессии ингибирующих рецепторов по мере развития опухоли. Кумулятивная экспрессия ингибирующих рецепторов PD-1, TIM3, CTLA-4, LAG-3 и BTLA, выраженная в виде iR-балла, коррелировала с нодальным статусом и TNM-стадией;

на фиг. 22А-И - данные, демонстрирующие, что экспрессия PD-1 и TIM3 коррелировала с дисфункцией Т-клеток. Экспрессия CD25 и гранзима В (фиг. 22А-В), а также IL-2, IFN-γ и TNF-α (фиг. 22Г-Е) после поликлональной стимуляции CD3/CD28 коррелировала с экспрессией PD-1 (фиг. 22А-В), TIM3 (фиг. 22Г-Е) или PD-1/TIM3 (фиг. 22Ж-И) на инфильтрующих опухоль Т-клетках;

на фиг. 23А-Д - данные, демонстрирующие, что воздействие блокады PD-1 или комбинированный блокады PD-1/TIM3 варьируется межу пациентами. Ферментативно расщепленные образцы стимулировали агонистическими антителами к CD3/к CD28 в дополнение к блокирующим антителам к PD-1 индивидуально или в комбинации с TIM3. Секрецию IFN-γ, TNF-α и IL-2 определяли с помощью ELISA и стандартизовали относительно 1×10⁶ Т-клеток. На фиг. 23А-В представлены данные для Т-клеток из пациента, у которого функции Т-клеток можно восстанавливать («спасать») путем добавления блокирующих Ат (BS-268), и Т-клеток из пациента, не отвечающего на блокаду PD-1 или PD-1/TIM3. Представлены данные в виде различия в экспрессии ([% экспрессии при обработке Ат]-[% экспрессии без обработки]). На фиг. 23Г представлены соответствующие полученные с помощью проточной цитометрии графики для субпопуляций PD-1^hi и PD-1^int. На фиг. 23Д обобщены данные о секреции IL-2, TNF-α и IFN-γ Т-клетками из шести пациентов, полученные с помощью ELISA и стандартизованные относительно 1×10⁶ CD3⁺-Т-клеток;

на фиг. 24А-Е - данные, демонстрирующие, что воздействие блокады PD-1 или комбинированной блокады PD-1/TIM3 различается у субпопуляций PD-1^hi и PD-1^int. Корреляцию повышения производства цитокинов при блокаде PD-1 или комбинированной блокаде PD-1/TIM3 с субпопуляциями PD-1^hi и PD-1^int определяли с использованием соотношения PD-1^hi/PD-1^int;

на фиг. 25А-И - данные, демонстрирующие активацию CD4⁺-Т-клеток в ферментативно расщепленных образцах опухолей и злокачественных выпотах после экспозиции FolR1-ТСВ. Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или отсутствии FolR1-ТСВ или применяемой в качестве контроля ТСВ DP47. Экспрессию маркеров активации или маркеров Т-клеточной функции определяли на CD8⁺-Т-клетках с помощью проточной цитометрии;

на фиг. 26А-В - данные, демонстрирующие, что индуцированная FolR1-ТСВ Т-клеточная активация не зависит от экспрессии CTLA-4, Lag-3 и BTLA. Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или отсутствии FolR1-ТСВ. Экспрессию CD25 на CD8⁺-Т-клетках определяли с помощью проточной цитометрии. Индуцированная FolR1-ТСВ экспрессия CD25 коррелировала с исходным уровнем экспрессии CTLA-4, Lag-3 и BTLA;

на фиг. 27А-В - данные, демонстрирующие, что FolR1-ТСВ индуцирует секрецию цитокинов только у пациентов с низким процентом экспресирующих PD-1^hi CD8⁺-Т-клеток. Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или отсутствии FolR1-ТСВ. IFN-γ, TNF и IL-2 в супернатантах клеточных культур определяли и стандартизовали относительно количества 1×10⁵ Т-клеток в культуре. Индуцированная FolR1-ТСВ секреция цитокинов коррелировала с исходным уровнем экспрессии PD-1^hi;

на фиг. 28А-Е - данные, демонстрирующие, что обработка блокирующим антителом к PD-1 не индуцирует секрецию цитокинов в ферментативно расщепленных образцах опухолей или злокачественных выпотах пациентов с раком легкого и яичника, имеющих низкий процент экспрессирующих PD-1^hi клеток. Ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч с FolR1-ТСВ в присутствии или отсутствии блокирующего PD-1 антитела (фиг. 28А-В) или комбинации блокирующих PD-1 и TIM3 антител (фиг. 28Г-Е). Определяли IFN-γ, TNF и IL-2 в супернатантах клеточных культур и стандартизовали относительно количества 1×10⁵ Т-клеток в культуре. Секреция цитокинов, индуцированная блокирующими антителами, по сравнению с обработкой только FolR1-ТСВ коррелировала с исходным уровнем экспрессии PD-1^hi;

на фиг. 29А-Б - результаты анализа интернализации на основе FACS. Данные демонстрируют, что Fab-фрагмент (<TIM3> Fab) антитела к TIM3 Tim3_0022 (сокращенно <TIM3> Ab(022)) интернализировался в rec (рекомбинантные) CHOK1-клетки, экспрессирующие huTIM3, после инкубации при 37°С, при этом кинетика была сходной с кинетикой антитела в полноразмерном IgG-формате;

на фиг. 30А-Б - данные, демонстрирующие связывание антител к TIM3 с клетками RPMI-8226 (антитело, обозначенное как клон 0016, относится к антителу Tim3_0016, клон 0016, которое обозначает вариант антитела Tim3_0016 (антитело Tim3_0018), клон 0022 относится к антителу Tim3_00122 и т.д.). На фиг. 30Б - данные, демонстрирующие связывание антител к TIM3 с клетками Пфайффера (антитело, обозначенное как клон 0016, относится к антителу Tim3_0016, клон 0016 относится к варианту антитела Tim3_0016 (антитело Tim3_0018), клон 0022 относится к антителу Tim3_00122 и т.д.);

на фиг. 31 - данные, демонстрирующие уровень экспрессии TIM3 на различных образцах клеток пациента с AML, определенный с помощью FACS с использованием МАт к TIM3;

на фиг 32 - мозаичная теплокарта экспрессии ингибирующих рецепторов на ассоциированных с NSCLC TIL (опухоль-инфильтрующие лимфоциты).

Совместная экспрессия ингибирующих рецепторов на инфильтрующих опухоль CD8⁺-Т-клетках, позитивных по указанным иммунными контрольным точкам (чекпойнты), приведена в виде мозаичной теплокарты, на которой представлен процент экспрессии дополнительных рецепторов;

на фиг. 33 - радарный график экспрессии ингибирующих рецепторов на ассоциированных с NSCLC TIL. Совместная экспрессия ингибирующих рецепторов на инфильтрующих опухоль CD8⁺-Т-клетках, позитивных по указанным иммунными контрольным точкам, представлена в виде радарного графика, на котором показаны среднее значение экспрессии и стандартное отклонение для четырех других рецепторов;

на фиг. 34А-Г - процент PD-1^hi или PD-1^int CD8⁺-Т-клеток, экспрессирующих дополнительные иммунные контрольные точки. На графиках каждая точка обозначает образцы из одного пациента. Величины р рассчитывали, используя критерий суммы рангов Вилкоксона;

на фиг. 35А-Е - данные об экспрессии ингибирующих Т-клеточных рецепторах и Т-клеточной функции внутри опухоли. На фиг. 35А продемонстрирована стратегия установки дискриминационных окон для идентификации PD-1^hi, PD-1^int и PD-1^neg субпопуляций CD8⁺-Т-клеток из двух репрезентативных пациентов. На фиг. 35Б продемонстрировано распределение указанных Т-клеточных субпопуляций в проанализированных образцах опухолей. На фиг. 35В продемонстрировано, что Т-клеточные функции, индуцированные стимуляцией антител к CD3/к CD28, зависят от уровня экспрессии PD-1 на CD8⁺-Т-клетках. Ферментативно расщепленные образцы опухолей и злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или в отсутствии агонистических антител к CD3/к CD28. Повышение уровня экспрессии CD25 на CD8⁺-Т-клетках (фиг. 35В) и повышение уровня эффекторных цитокинов IFN-γ, IL-2 и TNF (фиг. 35Г) определяли в опухолях с низким и высоким уровнем PD-1^hi. p-значения рассчитывали с помощью непарного критерия Манна-Уитни. Образцы опухолей разделяли на основе процента экспрессирующих PD-1^hi CD8⁺-клеток на две группы с низким и высоким уровнем экспрессии PD-1^hi соответственно (фиг. 35Д). Уровень экспрессии ингибирующих рецепторов PD-1, TIM3, CTLA-4, Lag-3 и BTLA определяли с помощью проточной цитометрии на CD8⁺-Т-клетках из ферментативно расщепленных образцов опухолей и злокачественных выпотов (фиг. 35Е);

на фиг. 36А-Д - схемы экспрессии ингибирующих рецепторов и процент CD8⁺-Т-клеток с низким и высоким уровнем экспрессии. На фиг. 36А-Г представлены данные о совместной экспрессии TIM3, CTLA-4, Lag-3 и BTLA на PD-1^hi, PD-1^int и PD-1^neg CD8⁺-Т-клетках. p-значения рассчитывали с помощью одностороннего дисперсионного анализа с использованием апостериорного критерия Бонферрони. Образцы FolR1⁺-опухолей разделяли на основе экспрессирующих PD-1^hi CD8⁺-клеток на две группы с низким и высоким уровнем экспрессии PD-1^hi соответственно (фиг. 36Д);

на фиг. 37А-З - данные, демонстрирующие, что индуцированные FolR1-ТСВ Т-клеточные функции зависят от уровня экспрессии PD-1 на CD8⁺-T-клетках. Ферментативно расщепленные образцы FolR1⁺-опухолей и злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч в присутствии или в отсутствии FolR1-ТСВ. Повышение уровня экспрессии маркеров активации на СВ8⁺-Т-клетках (фиг. 37А-В) и повышение производства эффекторных цитокинов IFN-γ, IL-2, TNF и перфорина (фиг. 37Г-Ж) определяли в опухолях с низким и высоким уровнем экспрессии PD-1^hi. На фиг. 37З представлены данные о цитолизе клеток-мишеней. Уровень клеток в образцах и FolR1-позитивных, и негативных опухолей регулировали, добавляя клеточную линию FolR1⁺ Skov3 до достижения соотношения Е:Т=1:1, и сравнивали цитолиз в опухолях с высоким и низким уровнем PD-1^hi. р-значения рассчитывали с помощью непарного критерия Манна-Уитни;

на фиг. 38А-Д - данные, демонстрирующие, что блокада PD-1 повышает производство цитокинов, но не их цитолитическую функцию только в Т-клетках из опухолей с низким уровнем PD-1^hi. На фиг. 38А-Г: ферментативно расщепленные образцы FolR1⁺-опухолей или злокачественные выпоты культивировали в течение 24 ч с FolR1-ТСВ в присутствии или в отсутствии блокирующего антитела к PD-1. Содержание IFN-γ, IL-2, TNF и перфорина в супернатантах клеточных культур определяли с помощью анализа Cytometric Bead Array или ELISA и стандартизовали относительно количества 1×10⁵ CD3⁺-Т-клеток (IFN-γ, IL-2, TNF, фиг. 38А-В) или CD3⁺ CD8⁺-Т-клеток (перфорин, фиг. 38Г). Повышение секреции цитокинов после комбинированной обработки FolR1-ТСВ и антителом к PD-1 по сравнению с обработкой только FolR1-ТСВ определяли в опухолях с низким и высоким уровнем PD-1^hi. На фиг. 38Д: ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты совместно культивировали с экзогенно добавленными флуоресцентно меченными клетками Skov3 при соотношении Е:Т 1:1 в течение 24 ч в присутствии или в отсутствии блокирующего PD-1 антитела и FolR1-ТСВ. Повышение специфического цитолиза при применении антитела к PD-1 сравнивали в опухолях с низким и высоким уровнем PD-1^hi. p-значения рассчитывали с помощью непарного критерия Манна-Уитни;

на фиг. 39 - подробные характеристики пациентов;

на фиг. 40А-В - данные об активации CD8⁺-Т-клеток после экспозиции повышенными концентрациями FolR1-ТСВ. РВМС совместно культивировали с Skov3-клетками в течение 24 ч в присутствии или отсутствии FolR1-ТСВ или применяемой в качестве неспецифического контроля ТСВ DP47. На фиг. 40А продемонстрированы данные об экспрессии FolR1 на Skov3. Закрашенная гистограмма: контроль изотипа; незакрашенная гистограмма: антитело к FolR1. На фиг. 40Б - данные об экспрессии маркеров активации CD25, CD137 и ICOS на CD8⁺-Т-клетках, которые определяли с помощью проточной цитометрии. На фиг. 40В - данные об уровне IFN-γ, IL-2 и TNF в супернатантах клеточных культур, которые определяли с помощью ELISA и стандартизовали относительно количества 1×10⁵ CD3⁺-Т-клеток.

Подробное описание вариантов осуществления изобретения

I. Определения

В контексте настоящего описания «акцепторный человеческий каркасный участок» означает каркасный участок, содержащий аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасного участка вариабельного домена тяжелой цепи (VH), имеющий происхождение из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или консенсусного человеческого каркасного участка, указанного ниже.

Акцепторный человеческий каркасный участок «имеющий происхождение из» каркасного участка человеческого иммуноглобулина или консенсусного человеческого каркасного участка, может содержать такую же аминокислотную последовательность или может содержать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность акцепторного человеческого каркасного участка VL идентична последовательности каркасного участка VL человеческого иммуноглобулина или последовательности консенсусного человеческого каркасного участка.

Понятие «аффинность» относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). В контексте настоящего описания, если не указано иное, «аффинность связывания» относится к присущей молекуле аффинности связывания, отражающей взаимодействие по типу 1:1 между компонентами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно характеризовать с помощью константы диссоциации (Kd). Аффинность можно оценивать с помощью общепринятых методов, известных в данной области, включая те, которые представлены в настоящем описании. Ниже в качестве иллюстрации представлены конкретные варианты измерения аффинности связывания.

Антитело «с созревшей аффинностью» означает антитело с одним или несколькими изменениями в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVR) по сравнению с родительским антителом, которое не содержит указанных изменений, указанные изменения приводят к повышению аффинности антитела к антигену.

Понятия «биспецифическое антитело, которое специфически связывается с фолатным рецептором 1 (FolR1) и CD3», «активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, специфическая в отношении FolR1 и CD3» и «FolR1-ТСВ» в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо, и они относятся к биспецифическому антителу, которое обладает способностью связывать FolR1 и CD3 с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента для таргетинга CD3⁺-Т-клеток к FolR1⁺-клеткам-мишеням.

Понятия «анти-TIM3 антитело» и «антитело к TIM3» в контексте настоящего описания используют в качестве синонимов для обозначения антитела, которое специфически связывается с TIM3. Антитело к TIM3, указанное в настоящем описании, относится к антителу, которое обладает способностью связывать TIM3, прежде всего полипептид TIM3, экспрессируемый на клеточной поверхности, с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента. В одном из вариантов осуществления изобретения уровень связывания антитела, которое специфически связывается с TIM3, с неродственным белком, который не представляет собой TIM3, составляет менее чем примерно 10% от связывания антитела с TIM3 по данным измерений, полученным, например, с помощью радиоиммуноанализа (РИА) или проточной цитометрии (FACS). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, которое специфически связывается с TIM3, характеризуется величиной константы диссоциации (K_D), составляющей ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, которое специфически связывается с TIM3, связывается с эпитопом TIM3, который является консервативным среди DR5 различных видов. Предпочтительно указанное антитело связывается с TIM3 человека и обезьян циномолгус. Под понятие «антитело, которое специфически связывается с TIM3» подпадают также биспецифические антитела, которые обладают способностью связываться с TIM3 и вторым антигеном.

В контексте настоящего описания понятие «антитело» используется в его наиболее широком смысле и относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.

В контексте настоящего описания «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; димерные антитела (диабоди), cross-Fab-фрагменты; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Антитела в виде scFv описаны, например, у Houston J.S. Methods in Enzymol. 203, 1991, сс. 46-96). Кроме того, фрагменты антител содержат одноцепочечные полипептиды, имеющие характеристики VH-домена, т.е. обладающие способностью к сборке с VL-доменом, или VL-домена, т.е. обладающие способностью к сборке с VH-доменом, с образованием антигенсвязывающего сайта и поэтому обладают антигенсвязывающей особенностью полноразмерных антител.

В контексте настоящего описания «Fab-фрагмент» относится фрагменту антитела, содержащему фрагмент легкой цепи, который содержит VL-домен и константный домен легкой цепи (CL), и VH-домен и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, содержат по меньшей мере один Fab-фрагмент, в котором либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепей обменены. В результате обмена либо вариабельных областей, либо константных областей указанный Fab фрагмент обозначают также как «cross-Fab-фрагмент» или «xFab-фрагмент» или «Кроссовер-Fab-фрагмент». Возможны две различные композиции цепи кроссовер-молекулы Fab, и они могут входить в биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении: с одной стороны, имеет место обмен вариабельными областями тяжелой и легкой цепи Fab, т.е. кроссовер-молекула Fab содержит пептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области тяжелой цепи (СН1), и пептидную цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL). Указанную кроссовер-молекулу Fab обозначают также как CrossFab_(VLVH). С другой стороны, когда друг на друга обменены константные области тяжелой и легкой цепи Fab, то кроссовер-молекула Fab содержит пептидную цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL), и пептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области тяжелой цепи (СН1). Указанную кроссовер-молекулу Fab обозначают также как CrossFab_(CLCH1). Форматы биспецифических антител, содержащих кроссовер-Fab-фрагменты, описаны, например, в WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080251, WO 2009/080254, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2013/026831.

«Одноцепочечный Fab-фрагмент» или «scFab» представляет собой полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела, константного домена 1 (СН1) антитела, вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела, константного домена легкой цепи (CL) антитела и линкера, в котором указанные домены антитела и указанный линкер имеют один из следующих порядков расположения в направлении от N-конца к С-концу:

а) VH-СН1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-СН1, в) VH-CL-линкер-VL-CH1 или г) VL-CH1-линкер-VH-CL; и в котором указанный линкер представляет собой полипептид, состоящий по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно примерно от 32 до 50 аминокислот. Указанные одноцепочечные Fab-фрагменты a) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-CH1, в) VH-CL-линкер-VL-СН1 и г) VL-CH1-линкер-VH-CL стабилизируют с помощью встречающейся в естественных условиях дисульфидной связи между CL-доменом и СН1-доменом. Кроме того, указанные одноцепочечные молекулы Fab можно дополнительно стабилизировать посредством создания межцепочечных дисульфидных связей путем встраивания остатков цистеина (например, в положение 44 в вариабельной тяжелой цепи и в положение 100 в вариабельной легкой цепи согласно нумерации Кэбота).

Понятие «N-конец» означает последнюю аминокислоту N-конца. Понятие «С-конец» означает последнюю аминокислоту С-конца.

Под понятием «слитый» или «связанный» подразумевают, что компоненты (например, молекула Fab и субъединица Fc-домена) соединены пептидными связями либо непосредственно, либо через один или несколько пептидных линкеров.

Понятие «линкер» в контексте настоящего описания означает пептидный линкер и предпочтительно пептид с аминокислотной последовательностью, состоящей по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно из 5-100, более предпочтительно 10-50 аминокислот. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный пептидный линкер представляет собой (G_xS)_n (SEQ ID NO: 384 и 385) или (G_xS)_nG_m (SEQ ID NO: 429 и 430), где G обозначает глицин, S обозначает серин и (х=3, n=3, 4, 5 или 6 и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4 и n=2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный пептидный линкер представляет собой (G₄S)₂ (SEQ ID NO: 386).

Понятие «молекула иммуноглобулина» относится к белку, имеющему структуру встречающегося в естественных условиях антитела. Например, иммуноглобулины класса IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. В направлении от N-конца к С-концу каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой расположены три константных домена (CH1, СН2 и СН3), которые называют также константной областью тяжелой цепи. Аналогично этому, в направлении от N- конца к С-концу каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой расположен константный домен легкой цепи (CL), который называют также константной областью легкой цепи. Тяжелая цепь иммуноглобулина может относиться к одному из пяти типов, обозначенных как α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) или μ (IgM), некоторые из которых дополнительно подразделяют на подтипы, например, γ₁ (IgG₁), γ₂ (IgG₂), γ₃ (IgG₃), γ₄ (IgG₄), α₁ (IgA₁) и α₂ (IgA₂). Легкая цепь иммуноглобулина может относиться к одному из двух типов, обозначенных как каппа (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности ее константного домена. Иммуноглобулин, как правило, состоит из двух молекул Fab и Fc-домена, которые соединены через шарнирную область иммуноглобулина.

«Антитело, которое связывается с тем же эпитопом», что и референс-антитело, означает антитело, которое блокирует связывание референс-антитела с его антигеном при оценке в анализе в условиях конкуренции на 50% или более, и наоборот, референс-антитело блокирует связывание антитела с его антигеном при оценке в анализе в условиях конкуренции на 50% или более. Пример анализа в условиях конкуренции представлен в настоящем описании.

Понятие «антигенсвязывающий домен» относится к части антигенсвязывающей молекулы, которая содержит область, специфически связывающуюся и являющуюся комплементарной части антигена или полному антигену. Если антиген является крупным, то антигенсвязывающая молекула может связываться только с конкретной частью антигена, которую называют эпитопом. Антигенсвязывающий домен может представлять собой, например, один или несколько вариабельных доменов антитела (которые называют также вариабельными областями). Предпочтительно антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH).

Понятие «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из конкретного источника или конкретных видов, а остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или других видов, которое, как правило, получают методами рекомбинантной ДНК. Химерные антитела, содержащие кроличью вариабельную область и человеческую константную область, являются предпочтительными. Другие предпочтительные формы «химерных антител», подпадающие по объем настоящего изобретения, представляют собой антитела, в которых константная область модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом для получения свойств, указанных в настоящем изобретении, прежде всего касающихся связывания с C1q и/или связывания с Fc-рецептором (FcR). Указанные химерные антитела обозначают также как «антитела переключенного класса». Химерные антитела являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих ДНК-сегменты, которые кодируют вариабельные области иммуноглобулина, и ДНК-сегменты, которые кодируют константные области иммуноглобулина. Методы получения химерных антител включают общепринятый метод рекомбинантной ДНК и методы трансфекции генов, хорошо известные в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 6851-6855; US №№5202238 и 5204244).

В контексте настоящего описания понятие «цитотоксический агент» относится к субстанции, которая ингибирует или препятствует клеточной функции и/или вызывает гибель или деструкцию клетки. Цитотоксические агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); ингибирующие рост агенты; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или обладающие ферментативной активностью токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты; и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже.

Понятие «эффекторные функции» относится к тем видам биологической активности, которые связаны с Fc-областью антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: способность связываться с C1q и комплементзависимая цитотоксичность (CDC), способность связываться с Fc-рецептором, антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), антитело-обусловленный клеточнозависимый фагоцитоз (ADCP), секреция цитокинов, опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); и активация В-клеток.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятия «конструирование, сконструированный, инженерия» включают любую манипуляцию с пептидным каркасом или пост-трансляционные модификации встречающегося в естественных условиях или рекомбинантного полипептида или его фрагмента. Инженерия включает модификации аминокислотной последовательности, схемы гликозилирования или группы боковых цепей индивидуальных аминокислот, а также комбинации указанных подходов.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «аминокислотная мутация» относится к аминокислотным заменам, делециям, инсерциям и модификациям. Можно применять любую комбинацию замены, делеции, инсерции и модификации для создания конечной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, пониженной способностью связываться с Fc-рецептором или повышенной ассоциацией с другим пептидом. Аминокислотная последовательность с делециями и инсерциями включает амино- и/или карбоксиконцевые делеции и инсерции аминокислот. Конкретными аминокислотными мутациями являются аминокислотные замены. Для изменения, например, характеристик связывания Fc-области, наиболее предпочтительными являются неконсервативные аминокислотные замены, т.е. замена одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую другие структурные и/или химические свойства. Аминокислотные замены включают замену на не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты или на производные встречающихся в естественных условиях двадцати стандартных аминокислот (например, на 4-гидроксипролин, 3-метилгистидин, орнитин, гомосерин, 5-гидроксилизин). Аминокислотные мутации можно создавать с помощью генетических или химических методов, хорошо известных в данной области. Генетические методы могут включать сайтнаправленный мутагенез, ПЦР, синтез генов и т.п. Подразумевается, что можно применять также методы изменения боковой группы аминокислоты, отличные от методов генетической инженерии, такие как химическая модификация. Для обозначения одной и той же аминокислотной мутации можно использовать различные обозначения. Например, замену пролина в положении 329 Fc-домена на глицин можно обозначать как 329G, G329, G₃₂₉, P329G или Pro329Gly.

Понятие «эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, означает количество, эффективное в дозах и в течение периода времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.

Понятие «Fc-домен» или «Fc-область» в контексте настоящего описания относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие включает нативную последовательность Fc-областей и вариант Fc-областей. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может либо присутствовать, либо отсутствовать. Если специально не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константном участке соответствует системе EU-нумерации, которую называют также EU-индексом, описанной у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-oe изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Понятие «субъединица» Fc-домена в контексте настоящего описания относится к одному из двух полипептидов, образующих димерный Fc-домен, т.е. к полипептиду, который содержит С-концевые константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, обладающие способностью к стабильной самоассоциации. Например, субъединица Fc-домена IgG содержит константный домен СН2 IgG и СН3 IgG.

«Модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена» представляет собой манипуляцию с пептидным каркасом или пост-трансляционные модификации субъединицы Fc-домена, которые уменьшают или препятствуют ассоциации полипептида, содержащего субъединицу Fc-домена, с идентичным полипептидом с образованием гомодимера. В контексте настоящего описания модификация, способствующая ассоциации, включает, прежде всего, различные модификации, осуществляемые с каждой из двух субъединиц Fc-домена, предназначенных для ассоциации (например, первой и второй субъединиц Fc-домена), при этом, модификации дополняют друг друга таким образом, чтобы способствовать ассоциации двух субъединиц Fc-домена. Например, модификация, способствующая ассоциации, может изменять структуру или заряд одной или обеих субъединиц Fc-домена таким образом, чтобы улучшать их ассоциацию стерически или электростатически соответственно. Так, (гетеро)димеризация имеет место между полипептидом, который содержит первую субъединицу Fc-домена, и полипептидом, который содержит вторую субъединицу Fc-домена, которые могут быть неидентичными, поскольку дополнительные компоненты, слитые с каждой из субъединиц (например, антигенсвязывающие фрагменты), не являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления изобретения модификация, способствующая ассоциации, представляет собой аминокислотную мутацию в Fc-домене, в частности, аминокислотную замену. В конкретном варианте осуществления изобретения модификация, способствующая ассоциации, представляет собой индивидуальную аминокислотную мутацию, в частности, аминокислотную замену, в каждой из двух субъединиц Fc-домена.

«Каркасные участки» или «FR»-участки представляют собой участки вариабельных доменов, отличные от остатков гипервариабельных участков (HVR). FR вариабельного домена, как правило, представлены четырьмя FR-доменами: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, расположены в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Понятия «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную с нативной структурой антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат представленную в настоящем описании Fc-область.

Понятия «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используют взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированную клетку и полученное из нее потомство безотносительно к количеству пересевов. Потомство может не быть полностью идентичным по составу нуклеиновых кислот родительской клетке, но может содержать мутации. Под объем изобретения подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, которая обнаружена в результате скрининга или отобрана у исходной трансформированной клетки.

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком или человеческой клеткой, или полученную из источника, отличного от человека, с использованием спектра человеческих антител или других кодирующих человеческое антитело последовательностей. Из указанного определения человеческого антитела специально исключено гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки. Следует отметить, что как уже было отмечено для химерных и гуманизированных антител, предлагаемых в изобретении, понятие «человеческое антитело» включает также такие антитела, константная область которых модифицирована с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания FcR, например, путем «переключения класса», т.е. замены или мутации Fc-областей (например, IgG1 на IgG4 и/или IgG1/IgG4-мутация).

Понятие «рекомбинантное человеческое антитело» в контексте настоящего описания относится ко всем человеческим антителам, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью методов рекомбинации, например, к антителам, выделенным из клетки-хозяина, такой как NS0- или СНО-клетка, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным из-за присутствия человеческих генов иммуноглобулинов или антител, экспрессируемых с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектирована клетка-хозяин. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, которые находятся в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, подвергают соматической гипермутации in vivo. Таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и родственных им линий, могут не существовать в естественных условиях в спектре зародышевой линии человеческих антител in vivo.

«Человеческий консенсусный каркасный участок» представляет собой каркасный участок, в который входят наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в выбранных последовательностях каркасных участков VL или VH человеческого иммуноглобулина. Как правило, выбор последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина осуществляют из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, описанную у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., публикация NIH 91-3242, Bethesda MD, т.т. 1-3, 1991. В одном из вариантов осуществления изобретения касательно VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I согласно Kabat и др., выше. В одном из вариантов осуществления изобретения касательно VH подгруппа представляет собой подгруппу III согласно Kabat и др., выше.

Понятие «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. Понятие «гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергали гуманизации. Другие формы «гуманизированных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, представляют собой формы, константная область которых дополнительно модифицирована или изменена относительно исходного антитела с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания с Fc-рецептором (FcR).

Понятие «гипервариабельный участок» или «HVR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательности которых являются гипервариабельными («определяющие комплементарность участки» или «CDR») и/или формируют петли определенной структуры («гипервариабельные петли»), и/или содержат контактирующие с антигеном остатки («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR, как правило, содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из «определяющих комплементарность участков» (CDR), последние отличаются наиболее выраженной вариабельностью последовательности и/или участвуют в распознавании антигенов. Приведенные в качестве примера гипервариабельные петли включают аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2), и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917). Приведенные в качестве примера CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) включают аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35В (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) (Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Гипервариабельные участки (HVR) часто обозначают как «определяющие комплементарность участки» (CDR), и эти понятия в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо, и они относятся к участкам вариабельной области, которые образуют антигенсвязывающие области. Эта конкретная область описана у Kabat и др., U.S. Dept. of Health and Human Services, «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1983 и у Chothia и др., J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917, причем эти определения относятся к перекрывающимся аминокислотным остаткам или поднаборам аминокислотных остатков при их сравнении друг с другом. Однако в контексте настоящего описания подразумевается возможность применения любого определения CDR антитела или его вариантов. Соответствующие аминокислотные остатки, из которых состоят CDR, как они определены в каждой из процитированных выше ссылок, представлены в сравнении ниже в таблице А. Точные номера остатков, которые образуют конкретный CDR, должны варьироваться в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области на основе данных об аминокислотной последовательности вариабельной области антитела легко могут определять, какие остатки входят в конкретный CDR.

¹ Нумерация всех входящих в CDR остатков в таблице А дана в соответствии с номенклатурой, предложенной Кэботом с соавторами (см. ниже).

² Обозначение «AbM» с прописной буквой «b», использованное в таблице А, относится к CDR, как они определены программой для моделирования антител «AbM» компании Oxford Molecular Group.

Кэбот с соавторами предложили также систему нумерации (номенклатуру) последовательностей вариабельных областей, которую можно применять для любого антитела. Обычный специалист в данной области может однозначно применять эту систему «нумерации по Кэботу» к любой последовательности вариабельной области, не имея никаких экспериментальных данных, кроме сведений о самой последовательности. В контексте настоящего описания понятие «нумерация по Кэботу» относится к системе нумерации, описанной у Kabat и др., «Sequence of Proteins of Immunological Interest», изд-во U.S. Dept. of Health and Human Services, 1983. Если не указано иное, то ссылки на нумерацию положений конкретных аминокислотных остатков в вариабельной области антитела даны в соответствии с системой нумерации по Кэботу.

За исключением CDR1 в VH, CDR, как правило, содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. CDR содержат также «определяющие специфичность остатки» или «SDR», которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR, содержащиеся в областях CDR, обозначают как укороченные -CDR или a-CDR. Приведенные в качестве примера a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) содержат аминокислотные остатки 31-34 (L1), 50-55 (L2), 89-96 (L3), 31-35B (H1), 50-58 (H2) и 95-102 (Н3) (см. Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, cc. 1619-1633). Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) в настоящем описании нумеруют согласно Kabat и др., выше.

«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичной(ыми) молекулой(ами), включая (но, не ограничиваясь только им) цитотоксический агент.

«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) одомашненных животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, люди и приматы кроме человека, такие как мартышки), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум или субъект представляет собой человека.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое отделено от компонента его естественного окружения. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело очищают до чистоты, превышающей 95% или 99% по данным, например, электрофоретических анализов (таких, например, как ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографических анализов (таких, например, как ионообменная хроматография или ЖХВР с обращенной фазой). Обзор методов оценки чистоты антител см., например, у Flatman S. и др., J. Chrom. В 848, 2007, сс. 79-87.

«Выделенная» нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена от компонента ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетке, которая в норме включает молекулу нуклеиновой кислоты, но в которой молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в которой ее локализация на хромосоме отличается от ее встречающейся в естественных условиях локализации на хромосоме.

Понятие «выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело, которое специфически связывается с DR5 и FAP» относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или его фрагменты), включая указанную(ые) молекулу(ы) нуклеиновой(ых) кислоты(т), которая(ые) находится(ятся) в одном векторе или в разных векторах, и указанная(ые) молекула(ы) нуклеиновой(ых) кислоты(т) присутствует(ют) в одной или нескольких областях в клетке-хозяине.

Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих встречающиеся в естественных условиях мутации или возникающих в процессе производства препарата моноклонального антитела, указанные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты антигена. Таким образом, прилагательное «моноклональный» определяет особенность антитела, характеризуя его как полученное из практически гомогенной популяции антител, а не сконструированное в соответствии с требованиями к получению антитела с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно создавать с помощью различных технологий, включая (но, не ограничиваясь только ими) метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы на основе трансгенных животных, которые содержат все или часть локусов иммуноглобулина, указанные методы и другие приведенные в качестве примера методы получения моноклональных антител представлены в настоящем описании.

Понятие «голое» антитело» относится к антителу, не конъюгированному с гетерологичным фрагментом (например, цитотоксическим фрагментом) или радиоактивной меткой. «Голое» антитело может присутствовать в фармацевтической композиции.

Понятие «нативные антитела» относятся к встречающимся в естественных условиях молекулам иммуноглобулинов с различными структурами. Например, нативные антитела в виде IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь в направлении от N- к С-концу содержит вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой расположены три константных домена (CH1, СН2 и СН3), которые называют также константной областью тяжелой цепи. Аналогично этому каждая легкая цепь в направлении от N- к С-концу содержит вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой расположен константный легкий (CL) домен, который называют также константной областью легкой цепи. Легкая цепь может относиться к одному из двух типов, обозначенных как каппа (κ) или лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности ее константного домена.

«Блокирующее» антитело или «антагонистическое» антитело представляет собой антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность антигена, с которым оно связывается. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующие антитела или антагонистические антитела практически полностью ингибируют биологическую активность антигена. Например, антитела к PD-L1, предлагаемые в изобретении, блокируют передачу сигнала через PD-1 так, чтобы восстанавливать функциональный ответ Т-клеток (например, пролиферацию, производство цитокинов, цитолиз клеток-мишеней) из состояния с нарушенной функцией в ответ на стимуляцию антигеном.

«Агонистическое» или активирующее антитело представляет собой антитело, которое повышает или инициирует передачу сигнала антигеном, с которым оно связывается. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистические антитела вызывают или активируют передачу сигнала без присутствия встречающегося в естественных условиях лиганда.

Понятие «листовка-вкладыш в упаковку» в контексте настоящего описания относится к инструкциям, которые обычно помещают в поступающие в продажу упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или мерах предосторожности при применении указанных терапевтических продуктов.

Понятие «не обладает значительной перекрестной реактивностью» означает, что молекула (например, антитело) не распознает или не связывается специфически с антигеном, отличным от фактического антигена-мишени молекулы (например, антигеном, близкородственным антигену-мишени), прежде всего по сравнению с антигеном-мишенью. Например, уровень связывания антитела с антигеном, отличным от фактического антигена-мишени, может составлять от менее чем примерно 10% до менее чем примерно 5%, или уровень связывания с указанным антигеном, отличным от фактического антигена-мишени, может составлять менее чем примерно 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% или 0,1%, предпочтительно менее чем примерно 2%, 1% или 0,5% и наиболее предпочтительно уровень связывания с антигеном, отличным от фактического антигена-мишени, может составлять менее чем примерно 0,2% или 0,1%.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно полипептидной референс-последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в полипептидной референс-последовательности, после выравнивания последовательностей и интродукции при необходимости брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и при этом какие-либо консервативные замены не учитываются при оценке идентичности последовательностей. Сравнительный анализ для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, которые находятся в компетенции специалиста в данной области, например, с использованием публично доступных компьютерных программ, таких как программа BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения величину % идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием предназначенной для сравнения последовательностей компьютерной программы ALIGN-2. Предназначенная для сравнения последовательностей компьютерная программа ALIGN-2 разработана фирмой Genentech, Inc., и исходный код помещен на хранение вместе с документацией для пользователя в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под регистрационным номером U.S. Copyright Registration, №TXU510087. Программа ALIGN-2 представляет собой публично доступную программу фирмы Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, шт. Калифорния, или ее можно компилировать из исходного кода. Программу ALIGN-2 можно компилировать для применения в операционной системе UNIX, включая цифровую версию UNIX V4.0D. В программе ALIGN-2 все параметры для сравнения последовательностей являются заданными и не должны изменяться. В ситуациях, когда ALIGN-2 применяют для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотных последовательностей данной аминокислотной последовательности А относительно или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью Б (которую другими словами можно обозначать как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или отличается определенным % идентичности аминокислотной последовательности относительно или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью Б), рассчитывают следующим образом:

100 × частное X/Y,

где X обозначает количество аминокислотных остатков, оцененных программой сравнительного анализа последовательностей ALIGN-2 как идентичные совпадения при сравнительном анализе последовательностей А и Б с помощью указанной программы, и где Y обозначает общее количество аминокислотных остатков в Б. Должно быть очевидно, что, когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, то % идентичности аминокислотной последовательности А относительно аминокислотной последовательности Б не должен быть равен % идентичности аминокислотной последовательности Б относительно аминокислотной последовательности А. Если специально не указано иное, то в контексте настоящего описания все величины % идентичности аминокислотных последовательностей получают согласно процедуре, описанной в последнем из предшествующих параграфов, с помощью компьютерной программы ALIGN-2.

Понятие «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, что он обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и который не содержит дополнительных компонентов, которые обладают неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому следует вводить композицию.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемые носители включают (но, не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

Понятие «антагонист, связывающийся с осью PD-1» относится к молекуле, которая ингибирует взаимодействие связывающегося с осью PD-1 партнера с одним или несколькими его партнерами по связыванию, таким образом, чтобы устранять Т-клеточную дисфункцию, являющуюся результатом передачи сигналов по оси передачи сигналов PD-1, что приводит к восстановлению или повышению Т-клеточной функции (например, пролиферация, производство цитокинов, цитолиз клеток-мишеней). В контексте настоящего описания антагонист, связывающийся с осью PD-1, включает связывающийся с PD-1 антагонист, связывающийся с PD-L1 антагонист и связывающийся с PD-L2 антагонист.

Понятие «антагонисты, связывающееся с PD-1» относится к молекуле, которая снижает, блокирует, ингибирует, аннулирует или препятствует трансдукции сигнала, образовавшегося в результате взаимодействия PD-1 с одним или несколькими его партнерами по связыванию, такими как PD-L1, PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по связыванию. В конкретном объекте изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, ингибирует связывание PD-1 с PD-L1 и/или PD-L2. Например, антагонисты, связывающиеся с PD-1, включают антитела к PD-1, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, слитые белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, аннулируют или препятствуют трансдукции сигнала, образовавшегося в результате взаимодействия PD-1 с PD-L1 и/или PD-L2. В одном из вариантов осуществления изобретения, антагонист, связывающийся с PD-1, уменьшает отрицательный костимуляторный сигнал, опосредуемый или проходящий через белки клеточной поверхности, которые экспрессируются на Т-лимфоцитах, опосредуемый передачей сигнала через PD-1, что снижает дисфункцию Т-клеток с нарушенной функцией (например, повышает эффекторные ответы на распознаваемый антиген). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой антитело к PD-1. В конкретном объекте изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой MDX-1106, указанный в настоящем описании. В другом конкретном объекте изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой Merck 3745, указанный в настоящем описании. В другом конкретном объекте изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой СТ-01 1, указанный в настоящем описании.

Понятие «антагонисты, связывающиеся с PD-L1» относится к молекуле, которая снижает, блокирует, ингибирует, аннулирует или препятствует трансдукции сигнала, образовавшегося в результате взаимодействия PD-L1 с одним или несколькими его партнерами по связыванию, такими как PD-1, В7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L1, представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по связыванию. В конкретном объекте изобретения антагонист, связывающийся с PD-L1, ингибирует связывание PD-L1 с PD-1 и/или В7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонисты, связывающиеся с PD-L1, включают антитела к PD-L1, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, слитые белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, аннулируют или препятствуют трансдукции сигнала, образовавшегося в результате взаимодействия PD-L1 с одним или несколькими его партерами по связыванию, такими как PD-1, В7-1. В одном из вариантов осуществления изобретения, антагонист, связывающийся с PD-L1, уменьшает отрицательный костимуляторный сигнал, опосредуемый или проходящий через белки клеточной поверхности, которые экспрессируются на Т-лимфоцитах, опосредуемый передачей сигнала через PD-L1, что снижает дисфункцию Т-клеток с нарушенной функцией (например, повышает эффекторные ответы на распознаваемый антиген). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L1, представляет собой антитело к PD-L1. В конкретном объекте изобретения антитело к PD-L1 представляет собой YW243.55.S70, указанное в настоящем описании. В другом конкретном объекте изобретения антитело к PD-L1 представляет собой MDX-1105, указанное в настоящем описании. В следующем конкретном объекте изобретения антитело к PD-L1 представляет собой MPDL3280A, указанное в настоящем описании.

Понятие «антагонисты, связывающиеся с PD-L2» относится к молекуле, которая снижает, блокирует, ингибирует, аннулирует или препятствуют трансдукции сигнала, образовавшегося в результате взаимодействия PD-L2 с его партнерами по связыванию, такими как PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L2, представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L2 с его партнерами по связыванию. В конкретном объекте изобретения антагонист, связывающийся с PD-L2, ингибирует связывание PD-L2 с PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонисты, связывающиеся с PD-L2, включают антитела к PD-L2, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, слитые белки, олигопептиды и другие молекулы, которые снижают, блокируют, ингибируют, аннулируют или препятствуют трансдукции сигнала, образовавшегося в результате взаимодействия PD-L2 с одним или несколькими его партерами по связыванию, такими как PD-1. В одном из вариантов осуществления изобретения, антагонист, связывающийся с PD-L2, уменьшает отрицательный костимуляторный сигнал, опосредуемый или проходящий через белки клеточной поверхности, которые экспрессируются на Т-лимфоцитах, опосредуемый передачей сигнала через PD-L2, что снижает дисфункцию Т-клеток с нарушенной функцией (например, повышает эффекторные ответы на распознаваемый антиген). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L2, представляет собой иммуноадгезин.

«Олигопептид PD-1», «олигопептид PD-L1» или «олигопептид PD-L2» представляет собой олигопептид, который связывается, предпочтительно специфически, с вызывающим отрицательную костимуляцию полипептидом PD-1, PD-L1 или PD-L2 соответственно, включая рецептор, лиганд или компонент пути передачи сигнала, которые указаны в настоящем описании. Такие олигопептиды можно синтезировать химически с использованием известной методологии синтеза олигопептидов или можно получать и очищать с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Указанные олигопептиды, как правило, состоят по меньшей мере примерно из 5 аминокислот, альтернативно этому, по меньшей мере примерно из 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислот или более. Указанные олигопептиды можно идентифицировать с использованием методик, хорошо известных в данной области. В этой связи следует упомянуть, что методики скрининга библиотек олигопептидов в отношении олигопептидов, которые обладают способностью специфически связываться с полипептидом-мишенью, хорошо известны в данной области (см., например, US №№5556762, 5750373, 4708871, 4833092, 5223409, 5403484, 5571689, 5663143; публикации РСТ WO 84/03506 и WO 84/03564; Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 1984, сс. 3998-4002; Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 1985, сс. 178-182; Geysen и др. в: Synthetic Peptides as Antigens, 1986, cc. 130-149; Geysen и др., J. Immunol. Metk, 102, 1987, cc. 259-274); Schoofs и др., J. Immunol., 140, 1988, cc. 611-616; Cwirla S.E. и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1990, c. 6378; Lowman H.B. и др., Biochemistry, 30, 1991, с. 10832; Clackson Т. и др., Nature, 352, 1991, с. 624; Marks J.D. и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, c. 581; Kang A.S. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991, c. 8363 и Smith G.P., Current Opin. Biotechnol, 2, 1991, c. 668).

Понятие «анергия» означает состояние нечувствительности к стимуляции антигеном, обусловленное неполным или недостаточным уровнем сигналов, проходящих через Т-клеточный рецептор (например, повышение внутриклеточного Са⁺² в отсутствии ras-активации). Т-клеточная анергия может являться также результатом стимуляции антигеном в отсутствии костимуляции, это приводит к тому, что клетки становятся устойчивыми к последующей активации антигеном даже в контексте костимуляции. Состояние нечувствительности часто может аннулироваться в результате присутствия интерлейкина -2. Анергическим Т-клеткам не присуща клональная экспансия и/или приобретение эффекторных функций.

Понятие «истощение Т-клеток» относится к Т-клеточному истощению в качестве состояния Т-клеточной дисфункции, возникающей в результате постоянной передачи сигналов TCR, что имеет место при многих хронических инфекциях и раке. Оно отличается от анергии тем, что возникает не в результате неполного уровня передачи сигналов или их дефицита, а в результате постоянной передачи сигналов. Это проявляется в низкой эффекторной функции, постоянной экспрессии ингибирующих рецепторов и особенностях транскрипции, которые отличаются от присущих функциональным эффекторным Т-клеткам или Т-клеткам памяти. Истощение препятствует оптимальному контролю инфекции и опухолей. Истощение может обусловливаться как внешними отрицательными регуляторным путями (например, иммунорегуляторные цитокины), так и присущими клетке отрицательными регуляторным (костимуляторными) путями (PD-1, В7-Н3, В7-Н4 и т.д.).

«Повышение Т-клеточной функции» означает индукцию, мотивацию или стимуляцию Т-клетки для придания ей длительной или усиленной биологической функции или возобновление или реактивацию функции у истощенных или неактивных Т-клеток. Примеры повышенной Т-клеточной функции включают: повышенную секрецию γ-интерферона из СБ8⁺-Т-клеток, повышенную пролиферацию, повышенную чувствительность к антигенам (например, вирус, патоген или клиренс опухоли) относительно уровней перед вмешательством. В одном из вариантов осуществления изобретения степень повышения составляет по меньшей мере 50%, альтернативно этому, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Пути измерения указанного повышения известны специалисту в данной области.

«Иммунитет опухоли» означает процесс, с помощью которого опухоли уклоняются от иммунного распознавания и клиренса. Таким образом, в качестве терапевтической концепции иммунитет опухоли «излечивается», когда указанное уклонение снижается, и опухоли распознаются и атакуются иммунной системой. Примеры распознавания опухоли включают связывание с опухолью, сокращение опухоли и клиренс опухоли.

«Иммуногенность» относится к способности конкретной субстанции провоцировать иммунный ответ. Опухоли являются иммуногенными, и повышенная иммуногенность опухоли способствует клиренсу опухолевых клеток под воздействием иммунного ответа. Примеры повышения иммуногенности опухолей включают обработку антителом к PDL и ингибитором ME.

«Постоянный (длительный) ответ» означает постоянное воздействие, приводящее к уменьшению роста опухоли после прекращения лечения. Например, размер опухоли может оставаться таким же или снижаться по сравнению с размером в начале фазы лечения. В некоторых вариантах осуществления изобретения постоянный ответ имеет продолжительность, которая по меньшей мере совпадает с продолжительностью лечения, по меньшей мере в 1,5, 2, 2,5 или 3 раза превышает продолжительность лечения.

В контексте настоящего описания понятие «фибробласт-активирующий белок (FAP)» относится любому нативному FAP из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая, если не указано иное, млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы). Под понятие подпадает «полноразмерный» непроцессированний FAP, а также любая форма FAP, полученная в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты FAP, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. Предпочтительно антитело к FAP, предлагаемое в изобретении, связывается с внеклеточным доменом FAP. Аминокислотные последовательности приведенных в качестве примеров полипептидов FAP, включая последовательность человеческого FAP, описаны в WO 2012/020006.

В контексте настоящего описания понятие «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «процесс лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики, либо в процессе развития клинической патологии. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезни и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, применяют для задержки развития болезни или замедления прогрессирования болезни.

В контексте настоящего описания понятие «рак» относится к пролиферативным заболеваниям, таким, например, как колоректальный рак, саркома, рак головы и шеи, плоскоклеточная карцинома, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, немелкоклеточная карцинома легкого, мелкоклеточный рак легкого и мезотелиома, включая рефракторные варианты любого из указанных выше видов рака и комбинации одного или нескольких видов рака. В одном из вариантов осуществления изобретения рак представляет собой колоректальный рак и необязательно применяемое для его лечения химиотерапевтическое средство представляет собой иринотекан. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых рак представляет собой саркому, саркома необязательно представляет собой хондросаркому, лейомиосаркому, опухоли стромы желудочно-кишечного тракта, фибросаркому, остеосаркому, липосаркому или злокачественную фиброзную гистиоцитому.

Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH- или VL-домен из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов соответственно (см., например, Portolano и др., J. Immunol. 150, 1993, сс. 880-887; Clarkson и др., Nature 352, 1991, cc. 624-628).

В контексте настоящего описания понятие «антигенсвязывающая молекула» в наиболее широком смысле относится к молекуле, которая специфически связывается с антигенной детерминантой. Примерами антигенсвязывающих молекул являются иммуноглобулины и их производные, например, фрагменты.

В контексте настоящего описания понятие «антигенсвязывающий сайт антитела» относится к аминокислотным остаткам, которые ответственны за связывание антигена. Антигенсвязывающий участок антитела содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность участков» «CDR». «Каркасные участки» или «FR»-участки представляют собой участки вариабельных областей, отличные от остатков гипервариабельных участков, указанных в настоящем описании. Таким образом, вариабельные домены тяжелых и легких цепей антитела содержат в направлении от N-конца к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В частности, CDR3 тяжелой цепи представляет собой область, которая вносит основной вклад в связывание антигена и определяет свойства антитела. CDR- и FR-участки определяют согласно стандартному описанию, предложенному Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991), и/или они представляют собой остатки из «гипервариабельной петли».

Специфичность антитела относится к избирательному распознаванию антителом конкретного эпитопа антигена. Встречающиеся в естественных условиях антитела являются, например, моноспецифическими. «Биспецифические антитела», предлагаемые в настоящем изобретении, представляют собой антитела, которые имеют две различные антигенсвязывающие специфичности. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают специфичностью в отношении двух различных антигенов, т.е. в отношении DR5 в качестве первого антигена и FAP в качестве второго антигена.

В контексте настоящего описания понятие «моноспецифическое» антитело означает антитело, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.

Понятие «биспецифическая» означает, что антигенсвязывающая молекула обладает способностью специфически связываться по меньшей мере с двумя различными антигенными детерминантами. Как правило, биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит по меньшей мере два антигенсвязывающих сайта, каждый из которых обладает специфичностью в отношении различных антигенных детерминант. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула обладает способностью одновременно связываться с двумя антигенными детерминантами, прежде всего двумя антигенными детерминантами, которые экспрессируются на двух различных клетках.

Антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют связывающие специфичности по меньшей мере для двух различных сайтов. В изобретении предложено биспецифическое антитело, имеющее связывающие специфичности для FAP и DR5. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами DR5. Биспецифические антитела можно применять также для локализации цитотоксических агентов в клетках, которые экспрессируют DR5. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

Методы создания мультиспецифических антител включают (но, не ограничиваясь только ими) рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, которые обладают различными специфичностями (см. Milstein и Cuello, Nature 305, 1983, с. 537, WO 93/08829 и Traunecker и др., ЕМВО J. 10, 1991, с. 3655), и конструирование на основе технологии «knob-in-hole» (см., например, US №5731168). Мультиспецифические антитела можно получать также путем создания обусловленных электростатическим действием эффектов для создания молекул антител с гетеродимерной Fc-областью (WO 2009/089004 A1); путем поперечного сшивания двух или большего количества антител или их фрагментов (см., US №4676980 и Brennan и др., Science 229, 1985, с. 81); с использованием «лейциновых молний» для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny и др., J. Immunol. 148(5), 1992, сс. 1547-1553); с использованием технологии «диабоди» (димерных антител) для создания фрагментов биспецифических антител (см., например, Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, cc. 6444-6448); и с использованием димеров одноцепочечных Fv (scFv) (см., например, Gruber и др., J. Immunol., 152, 1994, с. 5368); путем получения триспецифических антител согласно методу, описанному, например, у Tutt и др., J. Immunol. 147, 1991, с. 60.

Под объем настоящего изобретения подпадают также сконструированные антитела с тремя или большим количеством функциональных антигенсвязывающих сайтов, включая «антитела-осьминоги» (см., например, US 2006/0025576 A1).

Согласно настоящему описанию антитело или его фрагмент может включать также «Fab двойного действия» или «DAF», которые содержат по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, который связывается с FAP или DR5, а также с другим, отличным от него антигеном (см. например, US 2008/0069820).

В контексте настоящего описания понятие «валентность» означает присутствие определенного количества связывающих сайтов в молекуле антитела. Так, понятие «двухвалентная», «четырехвалентная» и «шестивалентная» означает присутствие двух связывающих сайтов, четырех связывающих сайтов и шести связывающих сайтов соответственно в молекуле антитела. Биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, являются по меньшей мере «двухвалентными», и они могут быть «трехвалентными» и «многовалентными» (например, «четырехвалентными» или «шестивалентными»).

Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют два или большее количество связывающих сайтов и являются биспецифическими. Это означает, что антитела могут быть биспецифическими даже в случаях, когда имеют более двух связывающих сайтов (т.е. антитело является трехвалентным или многовалентным). Биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, включают, например, многовалентные одноцепочечные антитела, димерные антитела и тримерные антитела, а также антитела, которые имеют структуру константного домена полноразмерных антител, с которым связаны дополнительные антигенсвязывающие сайты (например, одноцепочечный Fv, VH-домен и/или VL-домен, Fab или (Fab)₂) через один или несколько пептидных линкеров. Антитела могут представлять собой полноразмерные антитела, полученные из одного вида, или могут быть химерными или гуманизированными.

В контексте настоящего описания понятие «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая обладает способностью амплифицировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связна. Понятие относится к вектору как самореплицирующейся содержащей нуклеиновую кислоту структуре, а также к вектору, встроенному в геном клетки-хозяина, в которую интродуцирован вектор. Некоторые векторы обладают способностью контролировать экспрессию нуклеиновых кислот, с которым они функционально связаны. Такие векторы в контексте настоящего описания обозначают как «экспрессионные векторы».

В контексте настоящего описания понятие «аминокислота» обозначает группу встречающихся в естественных условиях карбокси-α-аминокислот, включающую аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, E), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серин (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

В контексте настоящего описания понятия «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и они все включают потомство. Так, понятия «трансфектанты» и «трансфектированные клетки» включают первичную рассматриваемую клетку и выведенные из нее культуры безотносительно к количеству пересевов. Следует понимать также, что потомство может не быть полностью идентичным по составу ДНК из-за произвольных или преднамеренных мутаций. Под объем изобретения подпадает вариант потомства, который обладает такой же функцией или биологической активностью, которая обнаружена в результате скрининга или отобрана у исходной трансформированной клетки.

Понятие «аффинность» относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между индивидуальным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, то в контексте настоящего описания понятие «аффинность связывания» относится к присущей компонентам связывающейся пары (например, антителу и антигену) аффинности связывания, отражающей взаимодействие по типу 1:1. Аффинность молекулы Х к ее партнеру Y можно, как правило, характеризовать с помощью константы диссоциации (K_D). Аффинность можно оценивать общепринятыми методами, известными в данной области, включая представленные в настоящем описании методы. Ниже описаны конкретные служащие в качестве иллюстрации и примера варианты подходов к оценке аффинности связывания.

В контексте настоящего описания понятие «связывание» или «специфическое связывание» относится к связыванию антитела с эпитопом антигена в анализе in vitro, предпочтительно в анализе методом поверхностного плазменного резонанса (SPR, BIAcore, фирма GE-Healthcare, Уппсала, Швеция). Аффинность связывания определяют в понятиях k_a (константа скорости реакции ассоциации антитела при образовании комплекса антитело/антиген), k_d (константа скорости реакции диссоциации) и K_D (k_d/k_a). Связывание или специфическое связывание означает, что аффинность связывания (K_D) составляет 10^-8 моля/л или менее, предпочтительно от 10^-9 М до 10^-13 моля/л.

Связывание антитела с рецептором смерти можно оценивать с помощью BIAcore-анализа (фирма GE-Healthcare, Упсала, Швеция). Аффинность связывания определяют в понятиях k_a (константа скорости реакции ассоциации антитела при образовании комплекса антитело/антиген), k_d (константа скорости реакции диссоциации) и k_d (k_d/k_a).

Понятие «пониженное связывание (пониженная способность к связыванию)», например, пониженная способность к связыванию с Fc-рецептором, относится к снижению аффинности касательно соответствующего взаимодействия, измеренной, например, с помощью SPR. Для ясности следует отметить, что понятие включает также снижение аффинности до нуля (или ниже предела обнаружения аналитического метода), т.е. полную элиминацию взаимодействия. И, наоборот, «повышенное связывание (повышенная способность к связыванию)» относится к повышению аффинности связывания касательно соответствующего взаимодействия.

Понятие «Т-клеточная активация (активация Т-клеток)» в контексте настоящего описания относится к одному или нескольким клеточным ответам Т-лимфоцита, в частности, цитотоксического Т-лимфоцита, выбранным из: пролиферации, дифференцировки, секреции цитокинов, высвобождения цитотоксических эффекторных молекул, цитотоксической активности и экспрессии маркеров активации. Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, обладают способностью индуцировать Т-клеточную активацию. Приемлемые анализы оценки Т-клеточной активации, известные в данной области, представлены в настоящем описании.

Понятие «антиген клетки-мишени» в контексте настоящего описания относится к антигенной детерминанте, которая присутствует на поверхности клетки-мишени, например, клетки в опухоли, такой как раковая клетка или клетка стромы опухоли. В частности, понятие «антиген клетки-мишени» относится к фолатному рецептору 1.

В контексте настоящего описания понятия «первый» и «второй» касательно антигенсвязывающих фрагментов и т.д. применяют с целью удобства различения, когда присутствует более одного типа каждого из фрагментов. Применение этих понятий не подразумевает их конкретный порядок или ориентацию в активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекуле, если специально не указано иное.

Понятие «эпитоп» относится к любой полипептидной детерминанте, обладающей способностью специфически связываться с антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитопная детерминанта включает химические активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорил или сульфонил, и в некоторых вариантах осуществления изобретения может иметь специфические характеристики трехмерной структуры или специфические характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, с которой связывается антитело.

В контексте настоящего описания понятие «антигенная детерминанта» является синонимом понятий «антиген» и «эпитоп» и относится к сайту (например, участку, состоящему из смежных аминокислот, или конформационной конфигурации, состоящей из различных областей несмежных аминокислот) на полипептидной макромолекуле, с которой связывается антигенсвязывающий фрагмент с образованием комплекса антигенсвязывающий фрагмент-антиген. Пригодные антигенные детерминанты могут присутствовать, например, на поверхности опухолевых клеток, на поверхности инфицированных вирусом клеток, на поверхности других больных клеток, на поверхности иммунных клеток, клеток, находящихся в свободном состоянии в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (ЕСМ). В контексте настоящего описания белки, относящиеся к антигенам, например, FolR1 и CD3, если не указано иное, могут представлять собой любые нативные формы белков из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы). В конкретном варианте осуществления изобретения антиген представляет собой человеческий белок. В контексте настоящего описания при ссылке на конкретный белок подразумевается «полноразмерный», непроцессированный белок, а также любая форма белка, полученная в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты белка, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. Примерами человеческих белков, пригодных в качестве антигенов, являются (но, не ограничиваясь только ими): FolR1 (фолатный рецептор альфа (FRA); фолатсвязывающий белок (FBP); человеческий FolR1, UniProt № Р15328; мышиный FolR1, UniProt № Р35846; FolR1 обезьян циномолгус, UniProt № G7PR14) и CD3, прежде всего эпсилон-субъединица CD3 (см. UniProt № Р07766 (версия 130), NCBI RefSeq № NP_000724.1, SEQ ID NO: 150, человеческая последовательность; или UniProt № Q95LI5 (версия 49), NCBI GenBank, № BAB71849.1, последовательность обезьян циномолгус [Macaca fascicularis]). Активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, связывается с эпитопом CD3 или антигеном клетки-мишени, который является консервативным для CD3 или антигена-мишени из различных видов. В некоторых вариантах осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, связывается с CD3 и FolR1, но не связывается с FolR2 (фолатный рецептор бета; FRB; человеческий FolR2, UniProt № Р14207) или FolR3 (фолатный рецептор гамма; человеческий FolR3, UniProt № Р41439).

В контексте настоящего описания понятие «инженерия» (создание), «созданный с помощью инженерии», «процесс создания с помощью инженерии», прежде всего с приставкой «глико», а также понятие «инженерия гликозилирования» (гликоинженерия, конструирование схемы гликозилирования), относятся к любой манипуляции, которой подвергают схему гликозилирования встречающегося в естественных условиях или рекомбинантного полипептида или его фрагмента. Конструирование схемы гликозилирования включает метаболическое конструирование механизма гликозилирования клетки, в том числе генетические манипуляции, касающиеся путей олигосахаридного синтеза, с целью получения измененного гликозилирования гликопротеинов, экспрессируемых в клетках. Кроме того, инженерия гликозилирования включает воздействия мутаций и клеточного окружения на гликозилирование. В одном из вариантов осуществления изобретения инженерию гликозилирования осуществляют с целью изменения гликозилтрансферазной активности. В конкретном варианте осуществления изобретения инженерия позволяет изменять активность глюкозаминилтрансферазы и/или активность фукозилтрансферазы.

II Композиции и способы

Одним из объектов изобретения является применение терапевтической комбинации активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, например, активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, которая содержит первый антигенсвязывающий сайт, специфический для фолатного рецептора 1 (FolR1), и второй антигенсвязывающий сайт, специфический для CD3, и антагонист, связывающийся с осью PD-1, например, для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтическая комбинация дополнительно включает антагонист TIM3.

А. Комбинированные терапии на основе активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы и антагониста, связывающегося с осью PD-1

В широком смысле настоящее изобретение относится к активирующим Т-клетки биспецифическим антигенсвязывающим молекулам и их применению в комбинации с антагонистами, связывающимися с осью PD-1. Преимущество комбинации относительно монотерапии состоит в том, активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, применяемые согласно настоящему изобретению, могут обеспечивать переориентацию к клеткам-мишеням и активацию Т-клеток, а антагонист, связывающийся с осью PD-1, усиливает Т-клеточную функцию путем уменьшения истощения Т-клеток.

Одним из объектов изобретения является способ лечения или замедление развития рака у индивидуума, включающий введение индивидууму в эффективном количестве активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, например, FolR1-TCB, и антагониста, связывающегося с осью PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение приводит к длительному ответу индивидуума после прекращения лечения. Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут найти применение для лечения состояний, при которых требуется повышенная иммуногенность, например, повышенная иммуногенность опухоли, для лечения рака. Можно лечить или замедлять развитие широкого разнообразия видов рака, включая (но, не ограничиваясь только ими) рак, который может содержать мутацию BRAF V600E, рак, который может содержать BRAF дикого типа, рак, который может содержать KRAS дикого типа, или рак, который может содержать активирующую KRAS мутацию.

В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум имеет рак эндометрия. Рак эндометрия может находиться на ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум имеет меланому. Меланома может находиться на ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум имеет колоректальный рак. Колоректальный рак может находиться на ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум имеет рак легкого, например, немелкоклеточный рак легкого. Немелкоклеточный рак легкого может находиться на ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум имеет рак поджелудочной железы. Рак поджелудочной железы может находиться на ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум имеет гематологическое злокачественное заболевание. Гематологическое злокачественное заболевание может находиться на ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум имеет рак яичника. Рак яичника может находиться на ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум имеет рак молочной железы. Рак молочной железы может находиться на ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум имеет почечно-клеточную карциному. Почечно-клеточная карцинома может находиться на ранней стадии или поздней стадии.

В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум представляет собой млекопитающее, такое как одомашненные животные (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматы (например, люди и приматы кроме человека, такие как мартышки), кролики и грызуны (например, мыши и крысы). В некоторых вариантах осуществления изобретения подлежащий лечению индивидуум представляет собой человека.

Другим объектом изобретения является способ повышения иммунной функции у индивидуума, который имеет рак, включающий введение в эффективном количестве активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, в частности, FolR1-TCB, и антагониста, связывающегося с осью PD-1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Т-клетки у индивидуума обладают повышенными примированием, активацией, пролиферации и/или эффекторной функцией относительно состояния до введения активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул и антагониста, связывающегося с осью PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения Т-клеточная эффекторная функция представляет собой секрецию по меньшей мере одного из IL-2, IFN-γ и TNF-α. В одном из вариантов осуществления изобретения введение FolR1-TCB и антитела к PDL-1 приводит к повышенной Т-клеточной секреции IL-2, ifn-γ и TNF-α. В некоторых вариантах осуществления изобретения Т-клетка представляет собой CD8⁺-Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения Т-клеточное примирование характеризуется повышенным уровнем экспрессии CD44 и/или повышенной цитолитической активностью CD8-Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения активация CD8-T-клеток характеризуется повышенной частотой встречаемости γ-IFT^T CD8-Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD8-T-клетка представляет собой антигенспецифическую Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибируется ускользание от иммунологического надзора путем передачи сигналов через экспрессируемый на поверхности PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак характеризуется повышенными уровнями Т-клеточной инфильтрации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения комбинированная терапия, предлагаемая в изобретении, предусматривает введение FolR1-TCB и антагониста, связывающегося с осью PD-1. FolR1-TCB и антагонист, связывающий с осью PD-1, можно вводить любым приемлемым путем, известным в данной области. Например, FolR1-TCB и антагонист, связывающийся с осью PD-1, можно вводить последовательно (в различные моменты времени) или параллельно (одновременно). В некоторых вариантах осуществления изобретения FolR1-TCB вводят постоянно. В некоторых вариантах осуществления изобретения FolR1-TCB вводят прерывисто (периодически). В некоторых вариантах осуществления изобретения FolR1-TCB вводят перед введением антагониста, связывающего с осью PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения FolR1-TCB вводят одновременно с введением антагониста, связывающегося с осью PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения FolR1-TCB вводят после введения антагониста, связывающегося с осью PD-1.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу лечения или замедления развития рака у индивидуума, включающий введенное индивидууму в эффективном количестве активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, например, FolR1-TCB, и антагониста, связывающегося с осью PD-1, предусматривающий также применении дополнительной терапии. Согласно конкретному указанному варианту осуществления изобретения дополнительная терапия включает антагонист TIM3. Таким образом, одним из объектов изобретения является способ лечения или замедления развития рака у индивидуума, включающий введение индивидууму в эффективном количестве активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, например, FolR1-TCB, антагониста, связывающегося с осью PD-1, и антагониста TIM3. Можно применять любой антагонист TIM3, например, указанный в настоящем описании. Дополнительная терапия может представлять собой также лучевую терапию, хирургию (например, лампэктомию и мастэктомию), химиотерапию, генную терапию, ДНК-терапию, вирусную терапию, RA-терапию, иммунотерапию, трансплантацию костного мозга, нанотерапию, терапию моноклональным антителом или комбинацию вышеуказанных путей. Дополнительная терапия может иметь форму адъювантной или неоадъювантной терапии. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительная терапия предусматривает введение низкомолекулярного ингибитора ферментов или антиметастатического агента. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительная терапия предусматривает введение агентов, ограничивающих побочные действия (например, агентов, предназначенных для снижения возникновения и/или серьезности побочных действий лечения, таких как противотошнотные средства и т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительная терапия представляет собой лучевую терапию. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительная терапия представляет собой хирургию. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительная терапия представляет собой комбинацию лучевой терапии и хирургии. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительная терапия представляет собой гамма-облучение. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительная терапия представляет собой терапию, мишенью которой является путь P13K/А T/mTOR, ингибитор HSP90, ингибитор тубулина, ингибитор апоптоза и/или химиопревентивное средство. Дополнительная терапия может включать одно или несколько описанных выше химиотерапевтических средств.

Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, например, FolR1-TCB, и антагонист, связывающийся с осью PD-1, можно вводить с использованием одинакового пути введения или различных путей введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, например, FolR1-TCB, вводят внутривенно, внутримышечно, подкожно, местно, орально, чрескожно, внутрибрюшинно, внутриглазнично, путем имплантации, путем ингаляции, внутритрахеально, внутрь желудочков или внутриназально. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, вводят внутривенно, внутримышечно, подкожно, местно, орально, чрескожно, внутрибрюшинно, внутриглазнично, путем имплантации, путем ингаляции, внутритрахеально, внутрь желудочков или внутриназально. Для предупреждения или лечения заболевания активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы и антагонист, связывающийся с осью PD-1, можно вводить в эффективном количестве. Требуемую дозу активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул и/или антагониста, связывающегося с осью PD-1, можно определять с учетом типа заболевания, подлежащего лечению, типа активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул и антагониста, связывающегося с осью PD-1, серьезности и течения заболевания, клинического состояния индивидуума, истории болезни индивидуума и ответа на лечение и предписания лечащего врача.

В способах можно применять любые активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, антагонисты, связывающиеся с осью PD-1, и антагонисты TIM3, известные в данной области или описанные ниже.

Следующим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, указанные в настоящем описании, антагонисты, связывающиеся с осью PD-1, указанные в настоящем описании, и фамацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит антагонист TIM3.

Следующим объектом изобретения является набор, который содержит активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, специфическую в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1) и CD3, и листовку-вкладыш в упаковку, которая содержит инструкции по применению активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы в сочетании с антагонистом, связывающимся с осью PD-1, для лечения или замедления развития рака у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор дополнительно содержит инструкции по применению активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы в сочетании с антагонистом TIM3.

Следующим объектом изобретения является набор, который содержит активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, специфическую в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1) и CD3, и антагонист, связывающийся с осью PD-1, и листовку-вкладыш в упаковку, которая содержит инструкции по применению активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы и антагониста, связывающегося с осью PD-1, для лечения или замедления развития рака у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор дополнительно содержит инструкции по применению активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы в сочетании с антагонистом TIM3. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, представляет собой антитело к PD-1 или антитело к PD-L1. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, представляет собой антитело к PD-1, такое как иммуноадгезин.

Следующим объектом изобретения является набор, содержащий:

(I) первый контейнер, который содержит композицию, содержащую активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, специфическую в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1) и CD3, указанную в настоящем описании; и

(II) второй контейнер, который содержит композицию, содержащую антагонист, связывающийся с осью PD-1.

Следующим объектом изобретения является набор, содержащий:

(I) первый контейнер, который содержит композицию, содержащую активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, специфическую в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1) и CD3, указанную в настоящем описании; и

(II) второй контейнер, который содержит композицию, содержащую антагонист, связывающийся с осью PD-1 и

(III) третий контейнер, который содержит композицию, содержащую антагонист TIM3.

Б. Примеры активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, предназначенной для применения согласно изобретению

Активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, является биспецифической, т.е. она содержит по меньшей мере два антигенсвязывающих фрагмента, обладающих способностью специфически связываться с двумя различными антигенными детерминантами, а именно, с CD3 и с FolR1. Согласно изобретению антигенсвязывающие фрагменты представляют собой молекулы Fab (т.е. антигенсвязывающие домены, состоящие из тяжелой и легкой цепи, каждая из которых содержит вариабельную и константную области). В одном из вариантов осуществления изобретения указанные молекулы Fab являются человеческими. В другом варианте осуществления изобретения указанные молекулы Fab являются гуманизированными. Еще в одном варианте осуществления изобретения указанные молекулы Fab содержат человеческие константные области тяжелой и легкой цепи.

Активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, обладает способностью одновременно связываться с антигеном клетки-мишени FolR1 и CD3. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула обладает способностью к перекрестному связыванию с Т-клеткой и экспрессирующей FolR1 клеткой-мишенью посредством одновременного связывания с антигеном клетки-мишени FolR1 и CD3. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения такое одновременное связывание приводит к лизису экспрессирующей FolR1 клетки-мишени, прежде всего экспрессирующей FolR1 опухолевой клетки. В одном из вариантов осуществления изобретения такое одновременное связывание приводит к активации Т-клетки. В других вариантах осуществления изобретения такое одновременное связывание приводит к клеточному ответу Т-лимфоцита, прежде всего цитотоксического Т-лимфоцита, выбранному из следующей группы: пролиферация, дифференцировка, секреция цитокинов, высвобождение цитотоксической эффекторной молекулы, цитотоксическая активность и экспрессия маркеров активации. В одном из вариантов осуществления изобретения связывание активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы с CD3 без одновременного связывания с антигеном клетки-мишени FolR1 не приводит к активации Т-клетки.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула обладает способностью перенаправлять цитотоксическую активность Т-клетки на экспрессирующую FolR1 клетку-мишень. В конкретном варианте осуществления изобретения указанное перенаправление не зависит от опосредуемой ГКГС презентации пептидного антигена клеткой-мишенью и/или от специфичности Т-клетки.

В частности, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения Т-клетка представляет собой цитотоксическую Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения Т-клетка представляет собой CD4⁺- или CD8⁺-Т-клетку, прежде всего CD8⁺-Т-клетку.

Активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент, обдающий способностью связываться с CD3 (в настоящем описании его обозначают также как «связывающий антиген CD3 фрагмент» или «первый антигенсвязывающий фрагмент»). В конкретном варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит не более одного антигенсвязывающего фрагмента, обладающего способностью специфически связываться с CD3. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула характеризуется одновалентным связыванием с CD3. В конкретном варианте осуществления изобретения CD3 представляет собой CD3 человека или CD3 обезьян циномолгус, более конкретно, человеческий CD3. В конкретном варианте осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент обладает перекрестной реактивностью с (т.е. специфически связывается с) человеческим CD3 и CD3 обезьян циномолгус. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент обладает способностью специфически связываться с эпсилон-субъединицей CD3 (см. UniProt № Р07766 (версия 130), NCBI RefSeq № NP_000724.1, SEQ ID NO: 150, человеческая последовательность; UniProt № Q95LI5 (версия 49), NCBI GenBank № BAB71849.1, последовательность обезьян циномолгус [Macaca fascicularis]).

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

В одном из вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34.

В одном из вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

В одном из вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 36, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 31.

Активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью связываться с антигеном клетки-мишени FolR1 (в настоящее описании его обозначают также как «связывающий FolR1 фрагмент» или «второй» или «третий» антигенсвязывающий фрагмент). В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью связываться с антигеном клетки-мишени FolR1, не связывается с FolR2 или FolR3. В конкретном варианте осуществления изобретения связывающий антиген FolR1 фрагмент обладает перекрестной реактивностью с (т.е. специфически связывается с) FolR1 человека и FolR1 обезьян циномолгус. В конкретных вариантах осуществления изобретения, активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит два антигенсвязывающих фрагмента, обладающих способностью связываться с антигеном клетки-мишени FolR1. В одном из таких конкретных вариантов осуществления изобретения каждый из указанных антигенсвязывающих фрагментов специфически связывается с одной и той же антигенной детерминантой. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения все указанные антигенсвязывающие фрагменты являются идентичными. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит не более двух антигенсвязывающих фрагментов, обладающих способностью связываться с FolR1.

FolR1-связывающий фрагмент, как правило, представляет собой молекулу Fab, которая специфически связывается с FolR1 и обладает способностью направлять активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, с которой она соединена, к сайту-мишени, например, к специфическому типу опухолевой клетки, которая экспрессирует FolR1.

Одним из объектов настоящего изобретения является активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34; и

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1).

В одном из вариантов осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с FolR1.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат идентичные последовательности гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи и CDR легкой цепи. В одном из таких вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен второму антигенсвязывающему фрагменту.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, дополнительно содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации.

В одном из вариантов осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент и второй антигенсвязывающий фрагмент каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена.

В одном из вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, необязательно через пептидный линкер.

В следующем конкретном варианте осуществления изобретения в активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекуле присутствует не более одного антигенсвязывающего фрагмента, обладающего способностью специфически связываться с CD3, (т.е. активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула характеризуется одновалентным связыванием с CD3).

Активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула с общей легкой цепью

При создании настоящего изобретения было разработано биспецифическое антитело, в котором связывающие фрагменты обладают общей легкой цепью, которое сохраняет специфичность и эффективность родительского моноспецифического антитела к CD3 и может связываться со вторым антигеном (например, FolR1) с помощью такой же легкой цепи. Создание биспецифической молекулы с общей легкой цепью, которая сохраняет характеристики связывания, присущие родительскому антителу, не является очевидным, поскольку общие CDR гибридной легкой цепи должны обеспечивать специфичность связывания с обеими мишенями. Одним из объектов настоящего изобретения является активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая первый и второй антигенсвязывающие фрагменты, один из которых представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, а другой из которых представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с FolR1, в которой первая и вторая молекулы Fab имеют идентичные легкие цепи VLCL. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная идентичная легкая цепь (VLCL) содержит CDR легкой цепи, имеющие SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная идентичная легкая цепь (VLCL) содержит SEQ ID NO: 35.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и связывающий антиген FolR1 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 16, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 17, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 18, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, и который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит вариабельную тяжелую цепь содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

В следующем варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающий фрагмент, который обладает специфичностью в отношении FolR1, содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 15, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 31, или их варианты, которые сохраняют функциональность.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 36, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 15, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 31.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент (который представляет собой молекулу Fab), обладающий способностью специфически связываться с FolR1.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат идентичные последовательности гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи и CDR легкой цепи. В одном из таких вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен второму антигенсвязывающему фрагменту.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, связывающий антиген FolR1 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 16, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 17, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 18, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, и который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит вариабельную тяжелую цеп, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 402 и SEQ ID NO: 400, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и связывающий антиген FolR1 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 16, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 402, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 400, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, и который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 401, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

В следующем варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающий фрагмент, который обладает специфичностью в отношении FolR1, содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 401, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 31, или их варианты, которые сохраняют функциональность.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 36, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 401, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 31.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент (который представляет собой молекулу Fab), обладающий способностью специфически связываться с FolR1.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат идентичные последовательности гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи и последовательности CDR легкой цепи. В одном из таких вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен второму антигенсвязывающему фрагменту.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 402 и SEQ ID NO: 400, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 402 и SEQ ID NO: 400, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и связывающий антиген FolR1 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 16, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 402, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 400, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, и который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 401, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31;

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), и который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 401, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

Так, один из вариантов осуществления изобретения относится к биспецифическим молекулам, в которых по меньшей мере два связывающих фрагмента имеют идентичные легкие цепи и соответствующие реконструированные тяжелые цепи, которые обеспечивают специфическое связывание с активирующим Т-клетку антигеном CD3 и антигеном клетки-мишени FolR1 соответственно. Применение так называемого принципа «общей легкой цепи», т.е. объединения двух связывающих агентов, которые обладают одной легкой цепью, но имеют различные специфичности, предупреждает ошибочной спаривание легких цепей. Таким образом, в процессе производства образуется меньшее количество побочных продуктов, что облегчает получение гомогенных активирующих Т-клетку биспецифических антигенсвязывающих молекул.

Компоненты активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы можно сливать друг с другом в различных конфигурациях. Примеры конфигураций представлены на фиг. 1А-И и более подробно описаны ниже.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанная активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации. В представленных ниже в качестве примера вариантах осуществления изобретения описана активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая Fc-домен.

Активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая кроссовер-Fab-фрагмент

При создании настоящего изобретения был создан второй формат биспецифического антитела, в котором один из связывающих фрагментов представляет собой кроссовер-Fab-фрагмент. Одним из объектов изобретения является одновалентное биспецифическое антитело, в котором один из Fab-фрагментов молекулы IgG заменен на кроссовер-Fab-фрагмент. Кроссовер-Fab-фрагменты представляют собой Fab-фрагменты, в которых обменены либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепей. Форматы биспецифического антитела, содержащего кроссовер-Fab-фрагменты, описаны, например, в WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080251, WO 2009/080254, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2013/026831. В конкретном варианте осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссовер-молекулу Fab, в которой обменены либо вариабельные области, либо константные области легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab. Такая модификация предупреждает ошибочное спаривание тяжелых и легких цепей из различных молекул Fab, что повышает выход и чистоту активирующей Т-клетку антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, при ее получении методами рекомбинации. В конкретной кроссовер-молекуле Fab, которую можно использовать в активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекуле, предлагаемой в изобретении, обменены вариабельные области легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab. В другой кроссовер-молекуле Fab, которую можно использовать в активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекуле, предлагаемой в изобретении, обменены константные области легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой кроссовер-молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и связывающий антиген FolR1 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 56, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 59, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 60, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 65.

В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой каноническую молекулу Fab.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой кроссовер-молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой каноническую молекулу Fab.

В следующем варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, обладающий специфичностью в отношении FolR1, содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 55, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 64, или их варианты, которые сохраняют функциональность.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 36, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 31, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 55, и полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FolR1.

В одном из вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент представляет собой каноническую молекулу Fab. В одном из вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссовер-молекулу Fab.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат идентичные последовательности гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи и CDR легкой цепи. В одном из таких вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен второму антигенсвязывающему фрагменту.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой кроссовер-молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65;

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и связывающий антиген FolR1 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 56, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 59, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 60, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 65.

В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент и третий антигенсвязывающие фрагменты оба представляют собой каноническую молекулу Fab.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой кроссовер-молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31,

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64,

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент и третий антигенсвязывающий фрагмент оба представляют собой каноническую молекулу Fab.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой кроссовер-молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 50, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и связывающий антиген FolR1 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 9, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 54.

В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой каноническую молекулу Fab. В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссовер-молекулу Fab.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой кроссовер-молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51.

В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой каноническую молекулу Fab. В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссовер-молекулу Fab.

В следующем варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, который обладает специфичностью в отношении FolR1, содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 49, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 51, или их варианты, которые сохраняют функциональность.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 36, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 31, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 49, полипептидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 51.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FolR1.

В одном из вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент представляет собой каноническую молекулу Fab. В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссовер-молекулу Fab.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат идентичные последовательности гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи и CDR легкой цепи. В одном из таких вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен второму антигенсвязывающему фрагменту.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой кроссовер-молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 49, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54;

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 50, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54.

В одном из таких вариантов осуществления изобретения связывающий антиген CD3 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и связывающий антиген FolR1 фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 9, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 54.

В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент и третий антигенсвязывающий фрагмент оба представляют собой каноническую молекулу Fab.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит

(I) первый антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой кроссовер-молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с CD3, который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31,

(II) второй антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51,

(III) третий антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), который содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51.

В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент и третий антигенсвязывающий фрагмент оба представляют собой каноническую молекулу Fab.

Так, один из вариантов осуществления изобретения относится к биспецифическим молекулам, в которых два связывающих фрагмента обеспечивают специфическое связыванием с FolR1 и один связывающий фрагмент обеспечивает специфичность в отношении активирующего Т-клетку антигена CD3. Одну из тяжелых цепей модифицируют для обеспечения правильного спаривания тяжелой и легкой цепей, исключая тем самым необходимость применения подхода, основанного на использовании общей легкой цепи. Наличие двух сайтов связывания FolR1 позволяет осуществлять требуемое взаимодействие с антигеном-мишенью FolR1 и активацию Т-клеток.

Компоненты активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы можно сливать друг с другом в различных конфигурациях. Примеры конфигураций представлены на фиг. 1А-И и более подробно описаны ниже.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанная активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц, обладающих способностью к стабильной ассоциации. Ниже описаны примеры вариантов активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-домен.

Форматы активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы

Как указано выше и проиллюстрировано на фиг. 1А-И, в одном из вариантов осуществления изобретения активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы содержат по меньшей мере два Fab-фрагмента, имеющие идентичные легкие цепи (VLCL) и различные тяжелые цепи (VHCL), которые обеспечивают специфичности в отношении двух различных антигенов, а именно, один Fab-фрагмент обладает способностью специфически связываться с активирующим Т-клетку антигеном CD3, а другой Fab-фрагмент обладает способностью специфически связываться с антигеном клетки-мишени FolR1.

В другом варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит по меньшей мере два антигенсвязывающих фрагмента (молекул Fab), один из которых представляет собой кроссовер-молекулу Fab, а другой представляет собой каноническую молекулу Fab. В одном из таких вариантов осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, представляет собой кроссовер-молекулу Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FolR, представляет собой каноническую молекулу Fab.

Указанные компоненты активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы можно сливать друг с другом в различных конфигурациях. Примеры конфигураций представлены на фиг. 1А-И.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. В одном конкретном таком варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула практически состоит из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и необязательно одного или нескольких пептидных линкеров, где первый и второй антигенсвязывающий фрагмент каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. В одном из таких вариантов осуществления изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты оба представляют собой Fab-фрагменты и имеют идентичные легкие цепи (VLCL). В другом таком варианте осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, представляет собой кроссовер-молекулу Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FolR, представляет собой каноническую молекулу Fab.

В одном из вариантов осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента. В конкретном указанном варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула практически состоит из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и необязательно одного или нескольких пептидных линкеров, где первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента, а второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. В одном из таких вариантов осуществления изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты оба представляют собой Fab-фрагменты и имеют идентичные легкие цепи (VLCL). В другом таком варианте осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, представляет собой кроссовер-молекулу Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FolR, представляет собой каноническую молекулу Fab. Необязательно легкая цепь Fab первого антигенсвязывающего фрагмента и легкая цепь Fab второго антигенсвязывающего фрагмента могут быть дополнительно слиты друг с другом.

В других вариантах осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. В конкретном указанном варианте осуществления изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента. В конкретном указанном варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула практически состоит из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и необязательно одного или нескольких пептидных линкеров, где второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. В одном из таких вариантов осуществления изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты оба представляют собой Fab-фрагменты и имеют идентичные легкие цепи (VLCL). В другом таком варианте осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, представляет собой кроссовер-молекулу Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с FolR, представляет собой каноническую молекулу Fab. Необязательно легкая цепь Fab первого антигенсвязывающего фрагмента и легкая цепь Fab второго антигенсвязывающего фрагмента могут быть дополнительно слиты друг с другом.

Антигенсвязывающие фрагменты могут быть слиты с Fc-доменом или друг с другом непосредственно или через пептидный линкер, содержащий одну или несколько аминокислот, как правило, примерно 2-20 аминокислот. Пептидные линкеры известны в данной области, и они представлены в настоящем описании. Пригодные неиммуногенные пептидные линкеры включают, например, пептидные линкеры (G₄S)_n (SEQ ID NO: 387), (SG₄)_n (SEQ ID NO: 388), (G₄S)_n (SEQ ID NO: 387) или G₄(SG₄)_n (SEQ ID NO: 389). Как правило, «n» обозначает число от 1 до 10, как правило, от 2 до 4. Наиболее пригодным пептидным линкером для слияния легких цепей Fab первого и второго антигенсвязывающих фрагментов друг с другом является (G₄S)₂ (SEQ ID NO: 386). Примером пептидного линкера, пригодного для соединения тяжелых цепей Fab первого и второго антигенсвязывающих фрагментов является EPKSC(D)-(G₄S)₂ (SEQ ID NO: 390 и 391). Линкеры могут дополнительно содержать шарнирную область иммуноглобулина (ее часть). В частности, когда антигенсвязывающий фрагмент слит на N-конце субъединицы Fc-домена, то он может быть слит посредством шарнирной области иммуноглобулина или ее части с использованием или без использования дополнительного пептидного линкера.

При создании настоящего изобретения было установлено, что активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая два связывающих фрагмента, специфических в отношении антигена клетки-мишени FolR, обладает более предпочтительными характеристиками по сравнению с активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулой, содержащей только один связывающий фрагмент, специфический в отношении антигена клетки-мишени FolR.

В соответствии с этим в конкретных вариантах осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержит также третий антигенсвязывающий фрагмент, который представляет собой молекулу Fab, обладающую способностью специфически связываться с FolR. В одном из таких вариантов осуществления изобретения второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат идентичные последовательности гипервариабельного участка (CDR) тяжелой цепи и CDR легкой цепи, т.е. последовательности CDR тяжелой цепи второго антигенсвязывающего фрагмента являются такими же, что и последовательности CDR тяжелой цепи третьего антигенсвязывающего фрагмента, а последовательности CDR легкой цепи второго антигенсвязывающего фрагмента являются такими же, что и последовательности CDR легкой цепи третьего антигенсвязывающего фрагмента. В одном из таких вариантов осуществления изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен второму антигенсвязывающему фрагменту (т.е. они содержат одинаковые аминокислотные последовательности).

В одном из вариантов осуществления изобретения первый и второй антигенсвязывающий фрагмент каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена, а третий антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента. В конкретном таком варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула практически состоит из первого, второго и третьего антигенсвязывающих фрагментов, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и необязательно одного или нескольких пептидных линкеров, где первый и второй антигенсвязывающий фрагмент каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, а третий антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента. В одном из таких вариантов осуществления изобретения первый, второй и третий антигенсвязывающие фрагменты представляют собой канонические Fab-фрагменты и имеют идентичные легкие цепи (VLCL). В другом таком варианте осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, представляет собой кроссовер-молекулу Fab, а второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR, представляют собой каноническую молекулу Fab. Необязательно легкая цепь Fab первого антигенсвязывающего фрагмента и легкая цепь Fab третьего антигенсвязывающего фрагмента дополнительно могут быть слиты друг с другом.

Другим объектом изобретения является биспецифическое антитело, содержащее а) первый антигенсвязывающий сайт, который конкурирует за связывание с человеческим FolR1 с референс-антителом, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 49, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 51; и б) второй антигенсвязывающий сайт, который конкурирует за связывание с человеческим CD3 с референс-антителом, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 36, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 31, где конкуренцию за связывание измеряют методом поверхностного плазменного резонанса.

Другим объектом изобретения является активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, и второй антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1), где активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с тем же эпитопом на человеческом FolR1, что и первое референс-антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 49, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 51; и где активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с тем же эпитопом на человеческом CD3, что и второе референс-антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 36, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 31.

Другим объектом изобретения является активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, которая содержит первую, вторую, третью, четвертую и пятую полипептидную цепь, которые образуют первый, второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, где первый антигенсвязывающий фрагмент обладает способностью связываться с CD3, а второй и третий антигенсвязывающий фрагмент каждый обладает способностью связываться с фолатным рецептором 1 (FolR1). Первая и вторая полипептидные цепи содержат в направлении от амино-(N)-конца к карбоксильному (С)-концу вариабельный домен первой легкой цепи (VLD1) и константный домен первой легкой цепи (CLD1). Третья полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к С-концу вариабельный домен второй легкой цепи (VLD2) и константный домен 1 второй тяжелой цепи (CH1D2). Четвертая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к С-концу вариабельный домен первой тяжелой цепи (VHD1), константный домен 1 первой тяжелой цепи (CH1D1), константный домен 2 первой тяжелой цепи (CH2D1) и константный домен 3 первой тяжелой цепи (CH3D1). Пятая полипептидная цепь содержит VHD1, CH1D1, вариабельный домен второй тяжелой цепи (VHD2), константный домен второй легкой цепи (CLD2), константный домен 2 второй тяжелой цепи (CH2D2) и константный домен 3 второй тяжелой цепи (CH3D2). Третья полипептидная цепь и VHD2 и CLD2 пятой полипептидной цепи образуют первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью связываться с CD3. Вторая полипептидная цепь и VHD1 и CH1D1 пятой полипептидной цепи образуют третий связывающий фрагмент, обладающий способностью связываться с FolR1. Первая полипептидная цепь и VHD1 и CH1D1 четвертой полипептидной цепи образуют второй связывающий фрагмент, обладающий способностью связываться с FolR1.

В другом варианте осуществления изобретения второй и третий антигенсвязывающий фрагмент каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента. В конкретном таком варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула практически состоит из первого, второго и третьего антигенсвязывающих фрагментов, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и необязательно одного или нескольких пептидных линкеров, где второй и третий антигенсвязывающий фрагмент каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab третьего антигенсвязывающего фрагмента. В одном из таких вариантов осуществления изобретения первый, второй и третий антигенсвязывающие фрагменты представляют собой канонические Fab-фрагменты, и они имеют идентичные легкие цепи (VLCL). В другом таком варианте осуществления изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, представляет собой кроссовер-молекулу Fab, а второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR, представляют собой каноническую молекулу Fab. Необязательно легкая цепь Fab первого антигенсвязывающего фрагмента и легкая цепь Fab второго антигенсвязывающего фрагмента могут быть дополнительно слиты друг с другом.

Антигенсвязывающие фрагменты могут быть слиты с Fc-доменом непосредственно или через пептидный линкер. В конкретном варианте осуществления изобретения каждый из антигенсвязывающих фрагментов слит с Fc-доменом через шарнирную область иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления изобретения шарнирная область иммуноглобулина представляет собой шарнирную область человеческого IgG₁.

В одном из вариантов осуществления изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты и Fc-домен являются частью молекулы иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления изобретения молекула иммуноглобулина представляет собой иммуноглобулин IgG-класса. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин IgG₁-подкласса. В другом варианте осуществления изобретения иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин IgG₄-подкласса. В другом варианте осуществления изобретения иммуноглобулин представляет собой человеческий иммуноглобулин. В других вариантах осуществления изобретения иммуноглобулин представляет собой химерный иммуноглобулин или гуманизированный иммуноглобулин.

В конкретном варианте указанной активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы первый и второй антигенсвязывающие фрагменты и Fc-домен являются частью молекулы иммуноглобулина, а третий антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, где первый, второй и третий антигенсвязывающие фрагменты представляют собой канонические Fab-фрагменты и имеют идентичные легкие цепи (VLCL), где первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34; и второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34.

В конкретном варианте указанной активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы первый и второй антигенсвязывающие фрагменты и Fc-домен являются частью молекулы иммуноглобулина, а третий антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, где первый, второй и третий антигенсвязывающие фрагменты представляют собой канонические Fab-фрагменты и имеют идентичные легкие цепи (VLCL), где первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 36, вариабельную легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 31; а второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат вариабельную тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15, вариабельную легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 31.

В конкретном варианте указанной активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы первый и второй антигенсвязывающие фрагменты и Fc-домен представляют собой часть молекулы иммуноглобулина, а третий антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, а первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, представляет собой кроссовер-молекулу Fab, в которой либо вариабельные, либо константные области легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab обменены, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34; и второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57, и по меньшей мере один CDR легкой цепи, выбранный из группы SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 65.

В конкретном варианте указанной активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы первый и второй антигенсвязывающие фрагменты и Fc-домен являются частью молекулы иммуноглобулина, а третий антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, и первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, представляет собой кроссовер-молекулу Fab, в которой либо вариабельные, либо константные области легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab обменены, где первый антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью специфически связываться с CD3, содержит вариабельную тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 36, вариабельную легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 31; а второй и третий антигенсвязывающие фрагменты, обладающие способностью специфически связываться с FolR1, содержат вариабельную тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 55, вариабельную легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 65.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула является одновалентной в отношении каждого антигена. В конкретном варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула может связываться с человеческим CD3 и человеческим фолатным рецептором альфа (FolR1), и она сконструирована без применения подхода на основе гетеродимеризации, такого, например, как технология «knob-into-hole». Например, молекулу можно получать с использованием библиотеки общих легких цепей и технологии CrossMab. В конкретном варианте осуществления изобретения вариабельную область CD3-связывающего агента сливают с СН1-доменом стандартного человеческого антитела в виде IgG1 с образованием VLVH-«скрещенной» молекулы (слитой с Fc), которая является общей для обеих специфичностей. Для создания скрещенных «копий» (VHCL) специфический в отношении CD3 вариабельный домен тяжелой цепи сливают с человеческой константной легкой λ-цепью, в то время как вариабельный домен тяжелой цепи, специфический в отношении человеческого FolR1 (например, выделенный из библиотеки общих легких цепей) сливают с человеческой константной легкой κ-цепью. Полученная в результате этого требуемая молекула с правильно спаренными цепями содержит легкие и каппа-, и лямбда-цепи или их фрагменты. Затем эти требуемые виды биспецифической молекулы можно очищать от неправильно спаренных или гомодимерных видов, осуществляя последовательно стадии очистки для легкой каппа- и лямбда-цепи в любом порядке. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения очистку требуемого биспецифического антитела проводят с помощью последовательных стадий очистки на колонках с KappaSelect и LambdaFabSelect (фирма GE Healthcare) для удаления нежелательных гомодимерных антител.

Fc-домен

Fc-домен активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы состоит из пары полипептидных цепей, содержащих домены тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина. Например, Fc-домен молекулы иммуноглобулина G (IgG) представляет собой димер, каждая субъединица которого содержит константные домены СН2 и СН3 тяжелой цепи IgG. Две субъединицы Fc-домена обладают способностью к стабильной ассоциации друг с другом. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в изобретении, содержит не более одного Fc-домена.

В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы представляет собой Fc-домен IgG. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁. В другом варианте осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₄. В более конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₄, содержащий аминокислотную замену в положении S228 (нумерация по Кэботу), прежде всего аминокислотную замену S228P. Указанная аминокислотная замена снижает in vivo обмен в Fab-плече антител в виде IgG₄ (см. Stubenrauch и др., Drug Metabolism and Disposition 38, 2010, cc. 84-91). В другом конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен является человеческим.

Модификации Fc-домена, способствующие гетеродимеризации

Активирующие Т-клетку биспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, содержат различные антигенсвязывающие фрагменты, слитые с одной или другой из двух субъединиц Fc-домена, при этом две субъединицы Fc-домена, как правило, содержатся в двух неидентичных полипептидных цепях. Рекомбинантная совместная экспрессия этих полипептидов и последующая димеризация приводит к нескольким возможным комбинациям двух полипептидов. Для повышения выхода и чистоты активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул при их получении методами рекомбинации целесообразно интродуцировать в Fc-домен активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы модификацию, которая способствует ассоциации требуемых полипептидов.

Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения Fc-домен активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, содержит модификацию, которая способствует ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена. Сайт наиболее сильного белок-белкового взаимодействия двух субъединиц Fc-домена человеческого IgG находится в СН3-домене Fc-домена. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения указанная модификация находится в СН3-домене Fc-домена.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанная модификация представляет собой так называемую модификацию типа «knob-in-hole» (типа «выступ-впадина»), которая включает модификацию, приводящую к образованию «выступа» на одной из двух субъединиц Fc-домена и модификацию, приводящую к образованию «впадины» в другой одной из двух субъединиц Fc-домена.

Технология «knob-into-hole» описана, например, в US №5731168; US №7695936; у Ridgway и др., Prot Eng 9, 1996, cc. 617-621 и Carter, J Immunol Meth 248, 2001, cc. 7-15. В целом, метод включает интродукцию выпуклости («выступ») на поверхности раздела первого полипептида и соответствующей полости («впадина») в поверхности раздела второго полипептида, в результате выпуклость может помещаться в полость, способствуя тем самым образованию гетеродимера и препятствуя образованию гомодимера. Выпуклости конструируют путем замены аминокислот с небольшими боковыми цепями на поверхности раздела первого полипептида на аминокислоты с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан). Компенсирующие полости идентичного или сходного с выпуклостями размера создают в поверхности раздела второго полипептида путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с менее крупными боковыми цепями (например, аланин или треонин).

Таким образом, в конкретном варианте осуществления изобретения в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет больший объем боковой цепи, что приводит к образованию выпуклости на СН3-домене первой субъединицы, которая может помещаться в полость в СН3-домене второй субъединицы, и в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет меньший объем боковой цепи, что приводит к образованию полости в СН3-домене второй субъединицы, в которую может помещаться выпуклость на СН3-домене первой субъединицы.

Выпуклость и полость можно создавать путем изменения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза или путем пептидного синтеза.

В конкретном варианте осуществления изобретения в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена остаток треонина в положении 366 заменен остатком триптофана (T366W), а в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена остаток тирозина в положении 407 заменен на остаток валина (Y407V). В одном из вариантов осуществления изобретения во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток треонина в положении 366 заменен на остаток серина (T366S) и остаток лейцина в положении 368 заменен на остаток аланина (L368A).

В следующем варианте осуществления изобретения в первой субъединице Fc-домена дополнительно остаток серина в положении 354 заменен на остаток цистеина (S354C), а во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток тирозина в положении 349 заменен на остаток цистеина (Y349C). Интродукция указанных двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя субъединицами Fc-домена, тем самым дополнительно стабилизируя димер (Carter, J Immunol Methods 248, 2001, cc. 7-15).

В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью связываться с CD3, слит (необязательно через антигенсвязывающий фрагмент, обладающий способностью связываться с антигеном FolR1 на клетки-мишени) с первой субъединицей Fc-домена (которая содержит модификацию, приводящую к образованию «выступа»).

Не вдаваясь в какую-либо теорию, можно считать, что слияние антигенсвязывающего фрагмента, обладающего способностью связываться с CDS, с содержащей «выступ» субъединицей Fc-домена должно (дополнительно) минимизировать образование антигенсвязывающих молекул, содержащих два антигенсвязывающих фрагмента, обладающих способностью связываться с CD3 (стерическое «столкновение» двух содержащих «выступ» полипептидов).

В альтернативном варианте осуществления изобретения модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена, представляет собой модификацию, опосредующую определяемые электростатическим действием воздействия, например, описанные в публикации РСТ WO 2009/089004. В целом, указанный метод включает замену одного или нескольких аминокислотных остатков на поверхности раздела двух субъединиц Fc-домена на заряженные аминокислотные остатки, в результате чего образование гомодимера становится электростатически невыгодным, а гетеродимеризация становится электростатически выгодной.

Модификации Fc-домена, приводящие к аннулированию связывания с Fc-рецептором и/или эффекторной функции

Fc-домен придает активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекуле предпочтительные фармакокинетические свойства, включая продолжительное время полужизни в сыворотке, что обеспечивает хорошее накопление в ткани-мишени и предпочтительное соотношение распределения в ткани-крови. Однако в то же время он может приводить к нежелательной направленности активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы к клеткам, которые экспрессируют Fc-рецепторы, а не к предпочтительным несущим антиген клеткам. Кроме того, совместная активация путей передачи сигналов Fc-рецептора может приводить к высвобождению цитокинов, что в сочетании с обусловливающими активацию Т-клетки свойствами и продолжительным временем полужизни антигенсвязывающей молекулы, приводит к избыточной активации цитокиновых рецепторов и серьезным побочным действиям при системном введении. Активация (несущих Fc-рецептор) иммунных клеток, отличных от Т-клеток, может даже снижать эффективность активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы из-за возможной деструкции Т-клеток, например, NK-клетками.

Таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления изобретения Fc-домен активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в изобретении, обладает пониженной аффинностью связывания с Fc-рецептором и/или пониженной эффекторной функцией по сравнению с нативным Fc-доменом IgG₁. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения Fc-домен (или активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный Fc-домен) характеризуется аффинностью связывания, составляющей менее чем 50%, предпочтительно менее чем 20%, более предпочтительно менее чем 10% и наиболее предпочтительно менее чем 5% от аффинности связывания с Fc-рецептором нативного Fc-домена IgG₁ (или активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей указанный нативный Fc-домен IgG₁), и/или эффекторной функцией, составляющей менее чем 50%, предпочтительно менее чем 20%, более предпочтительно менее чем 10% и наиболее предпочтительно менее чем 5% от эффекторной функции нативного Fc-домена IgG₁ (или активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей указанный нативный Fc-домен IgG₁). В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен (или активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный Fc-домен) практически не связывается с Fc-рецептором и/или не индуцирует эффекторную функцию. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой Fcγ-рецептор. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой человеческий Fc-рецептор. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой активирующий Fc-рецептор. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой активирующий человеческий Fcγ-рецептор, более конкретно человеческий FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa, наиболее предпочтительно человеческий FcγRIIIa. В одном из вариантов осуществления изобретения эффекторная функция представляет собой одну или несколько функций, выбранных из группы, включающей CDC, ADCC, ADCP и секрецию цитокинов. В конкретном варианте осуществления изобретения эффекторная функция представляет собой ADCC. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен характеризуется практической такой же аффинностью связывания с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), что и нативный Fc-домен IgG₁. Практически такое же связывание с FcRn достигается, когда Fc-домен (или активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный Fc-домен), характеризуется аффинностью связывания, составляющей более чем примерно 70%, предпочтительно более чем примерно 80%, более предпочтительно более чем примерно 90%, от аффинности связывания нативного Fc-домена IgG₁ (или активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащий нативный Fc домен IgG₁) с FcRn.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения Fc-домен конструируют так, чтобы он обладал пониженной аффинностью связывания с Fc-рецептором и/или пониженной эффекторной функцией по сравнению с не подвергнутым инженерии Fc-доменом. В конкретных вариантах осуществления изобретения Fc-домен активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы содержит одну или несколько аминокислотных мутаций, которые снижают аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором и/или эффекторную функцию. Как правило, в каждой из двух субъединиц Fc-домена присутствует(ют) одна или несколько одинаковых аминокислотных мутаций. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация снижает аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация снижает аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз. Согласно вариантам осуществления изобретения, в которых имеет место более одной аминокислотной мутации, которые снижают аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором, комбинация указанных аминокислотных мутаций может снижать аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз или по меньшей мере в 50 раз. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая сконструированный Fc-домен, характеризуется аффинностью связывания, составляющей менее чем 20%, в частности, менее чем 10%, более предпочтительно менее чем 5% от аффинности связывания с Fc-рецептором, характерной для активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей не подвергнутый инженерии Fc-домен. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой Fcγ-рецептор. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой человеческий Fc-рецептор. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой активирующий Fc-рецептор. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой активирующий человеческий Fc-рецептор, более конкретно человеческий FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa, наиболее предпочтительно человеческий FcγRIIIa. Предпочтительно уменьшается связывание с каждым из этих рецепторов. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения снижается также аффинность связывания с компонентом системы комплемента, в частности, аффинность связывания с C1q. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения не снижается аффинность связывания с неонатальным Fc-рецептором (FcRn). Практически такое же связывание с FcRn, т.е. сохранение аффинности связывания Fc-домена с указанным рецептором, достигается, когда Fc-домен (или активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный Fc-домен) характеризуется аффинностью связывания с FcRn, составляющей более чем примерно 70% от аффинности связывания с FcRn не подвергнутой инженерии формы Fc-домена (или активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей указанную не подвергнутую инженерии форму Fc-домена). Fc-домен или активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, содержащие указанный Fc-домен, могут характеризоваться аффинностью, составляющей более чем примерно 80% и даже более чем примерно 90% от указанной выше аффинности. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-домен активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы создают так, чтобы он обладал пониженной эффекторной функцией по сравнению с не подвергнутым инженерии Fc-доменом Пониженная эффекторная функция может представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) пониженную(ые) одну или несколько из следующих функций: пониженная комплементзависимая цитотоксичность (CDC), пониженная антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), пониженный антитело-обусловленный клеточнозависимый фагоцитоз (ADCP), пониженная секреция цитокинов, пониженное опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, пониженное связывание с NK-клетками, пониженное связывание с макрофагами, пониженное связывание с моноцитами, пониженное связывание с полиморфоядерными клетками, пониженная непосредственная передача сигнала, индуцирующего апоптоз, пониженное перекрестное сшивание связанных с мишенью антител, пониженное созревание дендритных клеток или пониженное Т-клеточное примирование. В одном из вариантов осуществления изобретения пониженная эффекторная функция представляет собой одну или несколько функций, выбранных из группы, включающей пониженную CDC, пониженную ADCC, пониженный ADCP и пониженную секрецию цитокинов. В конкретном варианте осуществления изобретения пониженная эффекторная функция представляет собой пониженную ADCC. В одном из вариантов осуществления изобретения пониженная ADCC составляет меньше 20% от ADCC, индуцируемой не подвергнутым инженерии Fc-доменом (или активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулой, содержащей не подвергнутый инженерии Fc-домен).

В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация, которая снижает аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором и/или эффекторную функцию, представляет собой аминокислотную замену. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из Е233, L234, L235, N297, Р331 и Р329. В более конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из L234, L235 и Р329. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотные замены L234A и L235A. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁, в частности, Fc-домен человеческого IgG₁. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотную замену в положении Р329. В более конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотная замена представляет собой Р329А или P329G, прежде всего P329G. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотную замену в положении Р329 и, кроме того, аминокислотную замену в положении, выбранном из Е233, L234, L235, N297 и Р331. В более конкретном варианте осуществления изобретения дополнительная аминокислотная замена представляет собой Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотные замены в положениях Р329, L234 и L235. В более конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотные мутации L234A, L235A и P329G («P329G LALA»). В одном из указанных вариантов осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁, прежде всего Fc-домен человеческого IgG₁. Комбинация аминокислотных замен «P329G LALA» практически полностью элиминирует связывание с Fcγ-рецептором Fc-домена человеческого IgG₁, что описано в публикации РСТ WO 2012/130831, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. В WO 2012/130831 описаны также методы получения указанных мутантных Fc-доменов, методы изучения их свойств, таких как связывание с Fc-рецептором или эффекторные функции.

Антитела подкласса IgG₄ обладают пониженной аффинностью к связыванию с Fc-рецепторами и пониженными эффекторными функциями по сравнению с антителами подкласса IgG₁. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-домен активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в изобретении, представляет собой Fc-домен IgG₄, в частности Fc-домен человеческого IgG₄. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен IgG₄ содержит аминокислотные замены в положении S228, конкретно аминокислотную замену S228P. Для дополнительного снижения аффинности связывания с Fc-рецептором и/или его эффекторной функции в одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен IgG₄ содержит аминокислотную замену в положении L235, в частности, аминокислотную замену L235E. В другом варианте осуществления изобретения Fc-домен IgG₄ содержит аминокислотную замену в положении Р329, в частности, аминокислотную замену P329G. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен IgG₄ содержит аминокислотные замены в положениях S228, L235 и Р329, в частности, аминокислотные замены S228P, L235E и P329G. Указанные мутанты Fc-домена IgG₄ и их особенности связывания с Fcγ-рецептором описаны в публикации РСТ WO 2012/130831, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен, характеризующийся пониженной аффинностью связывания с Fc-рецептором и/или пониженной эффекторной функцией по сравнению с нативным Fc-доменом IgG₁, представляет собой Fc-домен человеческого IgG₁, содержащий аминокислотные замены L234A, L235A и необязательно P329G, или Fc-домен человеческого IgG₄, содержащий аминокислотные замены S228P, L235E и необязательно P329G.

В некоторых вариантах осуществления изобретения элиминировали N-гликозилирование Fc-домена. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотную мутацию в положении N297, в частности, аминокислотную замену аспарагина на аланин (N297A) или аспарагиновую кислоту (N297D).

Помимо Fc-доменов, описанных выше и в публикации РСТ WO 2012/130831, Fc-домены с пониженной способностью связываться с Fc-рецептором и/или эффекторной функцией включают также Fc-домены с заменой одного или нескольких остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (US №637056). К указанным мутантам Fc относятся мутанты Fc с заменами в двух или большем количестве из аминокислотных положений 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант Fc-домена «DANA» с заменой остатков 265 и 297 на аланин (US №7332581).

Мутантные Fc-домены можно получать путем аминокислотной делеции, замены, инсерции или модификации с использованием генетических или химических методов, хорошо известных в данной области. Генетические методы могут включать сайтнаправленный мутагенез кодирующей ДНК последовательности, ПЦР, синтез генов и т.п. Правильность нуклеотидных замен можно подтверждать, например, секвенированием.

Связывание с Fc-рецепторами можно легко определять, например, с помощью ELISA или поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием стандартного оборудования, такого как устройство BIAcore (фирма GE Healthcare), и с применением таких Fc-рецепторов, которые можно получать методом рекомбинантной экспрессии. Приемлемый указанный анализ связывания представлен в настоящем описании. Альтернативно этому, аффинность связывания Fc-доменов или активирующих клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, содержащих Fc-домен, с Fc-рецепторами можно оценивать с использованием клеточных линий, для которых известно, что они экспрессируют конкретные Fc-рецепторы, такие как человеческие NK-клетки, экспрессирующие FcγIIIa-рецептор.

Эффекторную функцию Fc-домена или активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-домен, можно оценивать методами, известными в данной области. Приемлемый анализ для оценки ADCC представлен в настоящем описании. Другие примеры анализов in vitro, предназначенных для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы, описаны в US №5500362; у Hellstrom и др., Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, cc. 7059-7063 и Hellstrom и др., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1985, cc. 1499-1502; US №5821337; у Bruggemann и др., J Exp Med 166, 1987, cc. 1351-1361. Альтернативно этому, можно применять методы, основанные на нерадиоактивном анализе (см., например, ACTI™ - нерадиоактивный анализ цитотоксичности с помощью проточной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); и CytoTox 96^® - нерадиоактивный анализ цитотоксичности (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин)). Приемлемыми эффекторными клетками для таких анализов являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, с использованием созданных на животных моделей, описанных у Clynes и др., Proc Natl Acad Sci USA 95, 1998, cc. 652-656.

В некоторых вариантах осуществления изобретения снижают связывание Fc-домена с компонентом системы комплемента, в частности с C1q. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых Fc-домен конструируют так, чтобы он обладал пониженной эффекторной функцией, указанная пониженная эффекторная функция включает пониженную CDC. Можно осуществлять анализы связывания C1q для решения вопроса о том, может ли активирующая Т-клетки биспецифическая антигенсвязывающая молекула связываться с C1q и, как следствие, обладает ли она CDC-активностью (см., например, анализы связывания с C1q и С3 с с помощью ELISA, описанные в WO 2006/029879 и WO 2005/100402). Для оценки активации комплемента можно осуществлять анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro и др., J Immunol Methods 202, 1996, с. 163; Cragg и др., Blood 101, 2003, сс. 1045-1052 и Cragg и Glennie, Blood 103, 2004, сс. 2738-2743).

Модификации Fc-домена, способствующие гетеродимеризации

Активирующие Т-клетку биспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, содержат различные антигенсвязывающие фрагменты, слитые с одной или другой из двух субъединиц Fc-домена, при этом две субъединицы Fc-домена, как правило, содержатся в двух неидентичных полипептидных цепях. Рекомбинантная совместная экспрессия этих полипептидов и последующая димеризация приводит к нескольким возможным комбинациям двух полипептидов. Для повышения выхода и чистоты биспецифических антител, предлагаемых в изобретении, при их получении методами рекомбинации целесообразно интродуцировать в Fc-домен биспецифических антител, предлагаемых в изобретении, модификацию, которая способствует ассоциации требуемых полипептидов.

Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения Fc-домен биспецифических антител, предлагаемых в изобретении, содержит модификацию, которая способствует ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена. Сайт наиболее сильного белок-белкового взаимодействия двух субъединиц Fc-домена человеческого IgG находится в СН3-домене Fc-домена.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанная модификация представляет собой, так называемую модификацию типа «knob-in-hole» (типа «выступ-впадина»), которая включает модификацию, приводящую к образованию «выступа» на одной из двух субъединиц Fc-домена и модификацию, приводящую к образованию «впадины» в другой одной из двух субъединиц Fc-домена. Технология «knob-into-hole» описана, например, в US №5731168; US №7695936; у Ridgway и др., Prot Eng 9, 1996, сс. 617-621 и Carter, J Immunol Meth 248, 2001, сс. 7-15.

В целом, метод включает интродукцию выпуклости («выступ») на поверхности раздела первого полипептида и соответствующей полости («впадина») в поверхности раздела второго полипептида, в результате выпуклость может помещаться в полость, способствуя тем самым образованию гетеродимера и препятствуя образованию гомодимера. Выпуклости конструируют путем замены аминокислот с небольшими боковыми цепями на поверхности раздела первого полипептида на аминокислоты с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан). Компенсирующие полости идентичного или сходного с выпуклостями размера создают в поверхности раздела второго полипептида путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с менее крупными боковыми цепями (например, аланин или треонин).

Таким образом, в конкретном варианте осуществления изобретения в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена биспецифических антител, предлагаемых в изобретении, аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет больший объем боковой цепи, что приводит к образованию выпуклости в СН3-домене первой субъединицы, которая может помещаться в полость в СН3-домене второй субъединицы, и в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет меньший объем боковой цепи, что приводит к образованию полости в СН3-домене второй субъединицы, в которую может помещаться выпуклость в СН3-домене первой субъединицы.

Выпуклость и полость можно создавать путем изменения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза или путем пептидного синтеза.

В конкретном варианте осуществления изобретения в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена остаток треонина в положении 366 заменен остатком триптофана (T366W), и в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена остаток тирозина в положении 407 заменен остатком валина (Y407V). В одном из вариантов осуществления изобретения во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток треонина в положении 366 заменен остатком серина (T366S) и остаток лейцина в положении 368 заменен остатком аланина (L368A).

В следующем варианте осуществления изобретения в первой субъединице Fc-домена дополнительно остаток серина в положении 354 заменен остатком цистеина (S354C) и во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток тирозина в положении 349 заменен остатком цистеина (Y349C). Интродукция этих двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя субъединицами Fc-домена, дополнительно стабилизирующего димер (Carter, J Immunol Methods 248, 2001, cc. 7-15).

В альтернативном варианте осуществления изобретения модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена, представляет собой модификацию, которая опосредует определяемые электростатическим действием воздействия, например, описанные в WO 2009/089004. В целом, указанный метод включает замену одного или нескольких аминокислотных остатков на поверхности раздела двух субъединиц Fc-домена на заряженные аминокислотные остатки, в результате чего образование гомодимера становится электростатически невыгодным, а гетеродимеризация становится электростатически выгодной.

В одном из указанных выше вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, которая связывается с FolR1 и CD3, содержит молекулу иммуноглобулина G (IgG) с двумя сайтами связывания, специфическими в отношении FolR1, в которой Fc-область первой тяжелой цепи содержит первой модуль димеризации, а Fc-область второй тяжелой цепи содержит второй модуль димеризации, что обеспечивает гетердимеризацию двух тяжелых цепей молекулы IgG.

В другом предпочтительном варианте первой модуль димеризации содержит «выступы», а второй модуль димеризации содержит «впадины» в соответствии со стратегией «knobs -in-holes» (см. Carter P., Ridgway J.В.В, Presta L.G: Immunotechnology, т. 2, №1, февраль 1996 г., cc. 73-73(1)).

Биологические свойства и функциональные характеристики активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул

Специалисту в данной области должно быть очевидно, что молекула, обладающая способностью избирательно различать раковые и нераковые здоровые клетки, обладает преимуществом с точки зрения эффективности. Одним из путей достижения указанной цели является соответствующая направленная селекция. Маркеры, которые экспрессируются исключительно на опухолевых клетках, можно применять для избирательного нацеливания эффекторных молекул или клеток на опухолевые клетки, не затрагивая здоровые клетки, которые не экспрессируют такой маркер. Однако, в некоторых случаях так называемые маркеры опухолевых клеток экспрессируются также и в здоровой ткани, хотя и с более низкими уровнями. Такая экспрессия в здоровой ткани может вызывать токсичность. Таким образом, в данной области существует необходимость в молекулах, которые могут более избирательно нацеливаться на опухолевые клетки. В изобретении, представленном в настоящем описании, предложены активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые избирательно нацеливаются на FolR1-позитивные опухолевые клетки, а не на здоровые нераковые клетки, которые характеризуются низкими уровнями экспрессии FolR1 или полным отсутствием его экспрессии. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит по меньшей мере два, предпочтительно два, FolR1-связывающих фрагмента, обладающих относительно низкой аффинностью, что обеспечивает эффект авидности, который позволяет различать клетки с высоким и низким уровнем экспрессии FolR1. Поскольку опухолевые клетки характеризуются высоким или промежуточным уровнем экспрессии FolR1, то молекула, предлагаемая в этом варианте осуществления изобретения, избирательно связывается с опухолевыми клетками и/или индуцирует цитолиз опухолевых клеток, но не здоровых нераковых клеток, характеризующихся низкими уровнями экспрессии FolR1 или полным ее отсутствием. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула имеет формат «2+1 инвертированная». В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула индуцирует опосредуемый Т-клеткой цитолиз FolR1-позитивных опухолевых клеток, но не неопухолевых клеток, и содержит связывающий антиген CD3 фрагмент, который содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и два связывающих антиген FolR1 фрагмента, каждый из которых содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 9, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 54.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула не индуцирует цитолиз здоровых клеток, на поверхности которых присутствует менее чем примерно 1000 копий FolR1.

Помимо указанных выше предпочтительных характеристик в одном из вариантов осуществления изобретения для получения молекулы не требуется осуществлять химическим путем перекрестное сшивание или применять подход на основе гибридов. В соответствии с этим в одном из вариантов осуществления изобретения предложена активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, которая может продуцироваться в клетках СНО. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит гуманизированные и человеческие полипептиды. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула не приводит к перекрестному связыванию с FcgR. В одном из таких вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула может продуцироваться в клетках СНО и содержит связывающий антиген CD3 фрагмент, который содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и два связывающих антиген FolR1 фрагмента, каждый из которых содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 9, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 54.

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления изобретения, представленных в настоящем описании, предложены активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, имеющие два связывающих фрагмента, которые обеспечивают специфическое связывание с FolR1, и один связывающий фрагмент, который обеспечивает специфичность в отношении активирующего Т-клетку антигена CD3, где каждый индивидуальный связывающий FolR1 фрагмент характеризуется низкой аффинностью к антигену. Но, тем не менее, поскольку молекула содержит два антигенсвязывающих фрагмента, которые обеспечивают связывание с FolR1, то общая авидность молекулы обеспечивает эффективное связывание с экспрессирующими FolR1 клетками-мишенями и активацию Т-клеток для индукции Т-клеточной эффекторной функции. Учитывая, что хотя FolR1 экспрессируется в различных уровнях на опухолевых клетках, он экспрессируется также в очень малых уровнях (например, в количестве менее чем 1000 копий/поверхность клетки) в определенных здоровых клетках, специалист в данной области легко может понять, что такая молекула обладает преимуществом с точки зрения эффективности при применении в качестве терапевтического агента. Такая молекула избирательно нацеливается на опухолевые клетки по сравнению со здоровыми клетками. Таким образом, указанную молекулу можно вводить индивидууму, нуждающемуся в этом, с меньшим опасением касательно токсичности в отношении FolR1-позитивных здоровых клеток по сравнению с молекулами, которые связываются с FolR1 с высокой аффинностью, индуцируя эффекторную функцию.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с человеческим FolR1 с кажущейся величиной K_D, составляющей от примерно 5,36 пМ до примерно 4 нМ. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с человеческим FolR1 и FolR1 обезьян циномолгус с кажущейся величиной K_D, составляющей примерно 4 нМ. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с мышиным FolR1 с кажущейся величиной K_D, составляющей примерно 1,5 нМ. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с человеческим FolR1 с величиной K_D, характеризующей одновалентное связывание, составляющей по меньшей мере примерно 1000 нМ. В конкретном варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с человеческим FolR1 и FolR1 обезьян циномолгус с кажущейся величиной K_D, составляющей примерно 4 нМ, связывается с мышиным FolR1 с кажущейся величиной K_D, составляющей примерно 1,5 нМ, и содержит связывающий антиген CD3 фрагмент, который содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и два связывающих антиген FolR1 фрагмента, каждый из которых содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 9, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 54. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула связывается с FolR1 с величиной K_D, характеризующей одновалентное связывание, составляющей по меньшей мере примерно 1000 нМ, и содержит связывающий антиген CD3 фрагмент, который содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и два связывающих антиген FolR1 фрагмента, каждый из которых содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 9, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 54.

Как указано выше, активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, представленные в настоящем описании, могут индуцировать Т-клеточную эффекторную функцию, например, экспрессию маркера клеточной поверхности, производство цитокинов, опосредуемый Т-клеткой цитолиз. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула индуцирует опосредуемый Т-клеткой цитолиз экспрессирующей FolR1 клетки-мишени, такой как человеческая опухолевая клетка, in vitro. В одном из вариантов осуществления изобретения Т-клетка представляет собой CD8-позитивную Т-клетку. Примеры экспрессирующих FolR1 человеческих опухолевых клеток включают (но, не ограничиваясь только ими) клетки Hela, Skov-3, НТ-29 и HRCEpiC. Специалисту в данной области легко доступны и другие FolR1-позитивные человеческие раковые клетки, которые можно применять для тестирования in vitro. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула индуцирует опосредуемый Т-клеткой цитолиз экспрессирующих FolR1 человеческих опухолевых клеток in vitro с величиной ЕС₅₀, составляющей от примерно 36 пМ до примерно 39573 пМ, через 24 ч. Конкретно предложены активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые индуцируют опосредуемый Т-клеткой цитолиз экспрессирующей FolR1 опухолевой клетки in vitro с величиной ЕС₅₀, составляющей примерно 36 пМ, через 24 ч. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула индуцирует опосредуемый Т-клеткой цитолиз экспрессирующей FolR1 опухолевой клетки in vitro с величиной ЕС₅₀, составляющей примерно 178,4 пМ, через 24 ч. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула опосредуемый Т-клеткой цитолиз экспрессирующей FolR1 опухолевой клетки in vitro с величиной ЕС₅₀, составляющей примерно 134,5 пМ или более, через 48 ч. Величину ЕС₅₀ можно измерять методами, известными в данной области, например, методами, которые представлены в настоящем описании в разделе «Примеры».

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в любом из представленных выше вариантах осуществления изобретения, индуцирует повышающую регуляцию экспрессии на поверхности Т-клетки по меньшей мере одного из CD25 и CD69 по данным измерений с помощью проточной цитометрии. В одном из вариантов осуществления изобретения Т-клетка представляет собой CD4-позитивную Т-клетку или CD8-позитивную Т-клетку.

В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, связывается с FolR1, экспрессируемым на человеческой опухолевой клетке. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, связывается с конформационным эпитопом на человеческом FolR1. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула, предлагаемая в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, не связывается с человеческим фолатным рецептором 2 (FolR2) или с человеческим фолатным рецептором 3 (FolR3). В одном из вариантов активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, антигенсвязывающий фрагмент связывается с полипептидом FolR1, содержащим аминокислоты с 25 по 234 человеческого FolR1 (SEQ ID NO: 227). В одном из вариантов активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, связывающий антиген FolR1 фрагмент связывается с полипептидом FolR1, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 227, 230 и 231, связывающий антиген FolR1 фрагмент не связывается с полипептидом FolR, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 228 и 229. В одном конкретном варианте осуществления изобретения активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит связывающий антиген FolR1 фрагмент, который связывается с полипептидом FolR1, содержащим аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 227, 230 и 231, и при этом связывающий антиген FolR1 фрагмент не связывается с полипептидом FolR, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 228 и 229, и содержит связывающий антиген CD3 фрагмент, который содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, и два связывающих антиген FolR1 фрагмента, каждый из которых содержит CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 9, CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 54.

В отношении FolR1 активирующие Т-клетку биспецифические антигенсвязывающие молекулы, представленные в настоящем описании, могут обладать агонистическим, антагонистическим или нейтральным действием. Примеры агонистического действия включают индукцию или усиление передачи сигнала через FolR1 после контакта связывающего FolR1 фрагмента с рецептором FolR1 на клетке-мишени. Примеры антагонистической активности включают аннулирование или снижение передачи сигнала через FolR1 после контакта связывающего FolR1 фрагмента с рецептором FolR1 на клетке-мишени. Это может, например, иметь место в результате блокады или ослабления взаимодействия фолата с FolR1.

Примеры связывающихся с осью PD-1 антагонистов, предназначенных для применения согласно изобретению

В изобретении предложены способы лечения или замедления развития рака у индивидуума, включающий введение индивидууму в эффективном количестве активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы и антагониста, связывающегося с осью PD-1. К антагонистам, связывающимся с осью PD-1, относятся, например, антагонист, связывающийся с PD-1, антагонист, связывающийся с PD-L1, и антагонист, связывающийся с PD-L2.

Альтернативные обозначения «PD-1» включают CD279 и SLEB2.

Альтернативные обозначения «PD-L1» включают В7-Н1, В7-4, CD274 и В7-Н.

Альтернативные обозначения «PD-L2» включают B7-DC, Btdc и CD273. В некоторых вариантах осуществления изобретения PD-1, PD-L1 и PD-L2 представляют собой человеческие PD-1, PD-L1 и PD-L2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-1 с его партнерами по связыванию, такими как лиганды. В конкретном объекте изобретения лиганды для PD-1, представляющие собой партнеров по связыванию, представляют собой PD-L1 и/или PD-L2. В другом вариант осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L1, представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по связыванию. В конкретном объекте изобретения партнерами по связыванию PDL1 являются PD-1 и/или В7-1. В другом варианте осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PDL2, представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L2 с его партнерами по связыванию. В конкретном объекте изобретения партнером по связыванию PD-L2 является PD-1. Антагонист может представлять собой антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, слитый белок или олигопептид.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой антитело к PD-1 (например, человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-1 выбирают из группы, включающей ниволумаб, пембролизумаб и СТ-011. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой иммуноадгезин (например, иммуноадгезин, который содержит внеклеточную или связывающую PD-L1 или PD-L2 область PD-1, слитую с константной областью (например, Fc-область последовательности иммуноглобулина). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой АМР-224. Ниволумаб, который известен также как MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, и OPDIVO®, представляет собой антитело к PD-1, описанное в WO 2006/121168. Пембролизумаб, который известен также как МК-3475, Merck 3475, ламбролизумаб, KEYTRUDA® и SCH-900475, представляет собой антитело к PD-1, описанное в WO 2009/114335. СТ-011, который известен также как hBAT или hBAT-1, представляет собой антитело к PD-1, описанное в WO 2009/101611. АМР-224, который известен также как B7-DCIg, представляет собой слитый растворимый рецептор PD-L2-Fc, описанный в WO 2010/027827 и WO 2011/066342.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-1 представляет собой ниволумаб (регистрационный номер CAS: 946414-94-4). Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное антитело к PD-1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 274, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 275. Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное антитело к PD-1, содержащее последовательность тяжелой цепи и/или легкой цепи, в котором:

(а) последовательность тяжелой цепи по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности тяжелой цепи:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 274), или

(б) последовательность легкой цепи по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности легкой цепи:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 275).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-1 представляет собой пембролизумаб (регистрационный номер CAS: 1374853-91-4). Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное антитело к PD-1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 276 и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 277. Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное антитело к PD-1, содержащее последовательность тяжелой цепи и/или легкой цепи, в котором:

(а) последовательность тяжелой цепи по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности тяжелой цепи:

QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK (SEQ ID NO: 276), или

(б) последовательность легкой цепи по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности легкой цепи: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 277).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L1, представляет собой антитело к PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-L1, выбирают из группы, включающей YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 и MEDI4736. MDX-1105, известный также как BMS-936559, представляет собой антитело к PD-L1, описанное в WO 2007/005874. Антитело YW243.55.S70 (последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи представлены в SEQ ID NO: 20 и 21 соответственно) представляет собой антитело к PD-L1, описанное в WO 2010/077634 A1. MEDI4736 представляет собой антитело к PD-L1, описанное в WO 2011/066389 и US 2013/034559, каждый документ полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Примеры антител к PD-L1, которые можно применять в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, и методы их получения описаны в публикации РСТ WO 2010/077634 А1 и US №8217149, каждый документ полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с осью PD-1, представляет собой антитело к PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 может ингибировать связывание между PD-L1 и PD-1 и/или между PD-L1 и В7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab-, Fab'-SH-, Fv-, scFv- и (Fab')₂-фрагментов. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 представляет собой человеческое антитело.

Антитела к PD-L1, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включая композиции, содержащие указанные антитела, такие как описанные в WO 2010/077634 А1, можно применять в комбинации с активирующей Т-клетку антигенсвязывающей молекулой и необязательно антагонистическим антителом к TIM3 для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 382, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 383.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к PD-L1 содержит полипептид вариабельной области тяжелой цепи, который содержит последовательности HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где:

(а) последовательность HVR-H1 представляет собой GFTFSX1SWIH (SEQ ID NO: 283);

(б) последовательность HVR-H2 представляет собой AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (SEQ ID NO: 284);

(в) последовательность HVR-H3 представляет собой RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 285);

в которых также: X1 обозначает D или G; Х2 обозначает S или L; Х3 обозначает Т или S.

В одном из конкретных объектов изобретения X1 обозначает D; Х2 обозначает S и Х3 обозначает Т. В другом объекте изобретения полипептид дополнительно содержит последовательности каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи, расположенные между HVR согласно формуле: (НС-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVRH3)-(HC-FR4). Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков получают из последовательностей человеческих консенсусных каркасных участков. В другом объекте изобретения последовательности каркасных участков относятся к подгруппе III VH консенсусного каркасного участка. Еще в одном объекте изобретения по меньшей мере одна из последовательностей каркасного участка представляет собой:

HC-FR1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 295),

HC-FR2: WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 296),

HC-FR3: RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 297),

HC-FR4: WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 298).

Согласно следующему объекту изобретения полипептид тяжелой цепи объединен также с вариабельной областью легкой цепи, содержащей HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, где:

(а) последовательность HVR-L1 представляет собой RASQX4X5X6TX7X8A (SEQ ID NO: 286);

(б) последовательность HVR-L2 представляет собой SASX9LX10S (SEQ ID NO: 287);

(в) последовательность HVR-L3 представляет собой QQX11X12X13X14PX15T (SEQ ID NO: 288),

в которых также: Х4 обозначает D или V; Х5 обозначает V или I; Х6 обозначает S или N; Х7 обозначает А или F; Х8 обозначает V или L; Х9 обозначает F или Т; X10 обозначает Y или А; X11 обозначает Y, G, F или S; Х12 обозначает L, Y, F или W; X13 обозначает Y, N, А, Т, G, F или I; X14 обозначает Н, V, Р, Т или I; X15 обозначает A, W, R, Р или Т.

В следующем объекте изобретения Х4 обозначает D; Х5 обозначает V; Х6 обозначает S; Х7 обозначает А; Х8 обозначает V; Х9 обозначает F; X10 обозначает Y; X11 обозначает Y; X12 обозначает L; X13 обозначает Y; X14 обозначает Н; X15 обозначает А. В другом объекте изобретения легкая цепь дополнительно содержит последовательности каркасных участков вариабельной области легкой цепи, расположенные между HVR согласно формуле: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LCFR4).

Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков получают из последовательностей человеческих консенсусных каркасных участков. Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков относятся к консенсусному каркасному участку VL каппа I. Еще в одном объекте изобретения по меньшей мере одна из последовательностей каркасного участка представляет собой:

LC-FR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 300),

LC-FR2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 301),

LC-FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 302),

LC-FR4: FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 303).

Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное антитело к PDL1 или антигенсвязывающий фрагмент, которое/который содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, где:

(а) тяжелая цепь содержит HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3 и при этом:

(I) последовательность HVR-H1 представляет собой GFTFSX1SWIH (SEQ ID NO: 283),

(II) последовательность HVR-H2 представляет собой AWIX2PYGGSX3YYADSVKG (SEQ ID NO: 284),

(III) последовательность HVR-H3 представляет собой RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 285),

(б) легкая цепь содержит HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3 и при этом:

(I) последовательность HVR-L1 представляет собой RASQX4X5X6TX7X8A (SEQ ID NO: 286),

(II) последовательность HVR-L2 представляет собой SASX9LX10S (SEQ ID NO: 287),

(III) последовательность HVR-L3 представляет собой QQX11X12X13X14PX15T (SEQ ID NO: 288),

в которых также: X1 обозначает D или G; Х2 обозначает S или L; Х3 обозначает Т или S; Х4 обозначает D или V; Х5 обозначает V или I; Х6 обозначает S или N; Х7 обозначает А или F; Х8 обозначает V или L; Х9 обозначает F или Т; X10 обозначает Y или А; X11 обозначает Y, G, F или S; X12 обозначает L, Y, F или W; X13 обозначает Y, N, А, Т, G, F или I; X14 обозначает Н, V, Р, Т или I; X15 обозначает A, W, R, Р или Т.

Согласно конкретному объекту изобретения X1 обозначает D; Х2 обозначает S и Х3 обозначает Т. В другом объекте изобретения Х4 обозначает D; Х5 обозначает V; Х6 обозначает S; Х7 обозначает А; Х8 обозначает V; Х9 обозначает F; Х10 обозначает Y; X11 обозначает Y; Х12 обозначает L; Х13 обозначает Y; X14 обозначает Н; X15 обозначает А. В следующем объекте изобретения X1 обозначает D; Х2 обозначает S и Х3 обозначает Т, Х4 обозначает D; Х5 обозначает V; Х6 обозначает S; Х7 обозначает А; Х8 обозначает V; Х9 обозначает F; Х10 обозначает Y; X11 обозначает Y; Х12 обозначает L; X13 обозначает Y; Х14 обозначает Н и X15 обозначает А.

Согласно следующему объекту изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или несколько последовательностей каркасных участков, расположенных между HVR следующим образом: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), и вариабельная область легкой цепи содержит одну или несколько последовательностей каркасных участков, расположенных между HVR следующим образом: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков получают из последовательностей человеческих консенсусных каркасных участков. В другом объекте изобретения последовательности каркасных участков тяжелой цепи относятся к подгруппе I, II или III согласно Кэботу. В другом объекте изобретения последовательности каркасных участков тяжелой цепи относятся к подгруппе III VH консенсусного каркасного участка. Еще в одном объекте изобретения по меньшей мере одна из последовательностей каркасного участка тяжелой цепи представляет собой:

HC-FR1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 295),

HC-FR2: WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 296),

HC-FR3: RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 297),

HC-FR4: WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 298).

Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков легкой цепи получают из последовательности подгруппы каппа I, II, II или IV по Кэботу. В следующем объекте изобретения последовательности каркасного участка легкой цепи относятся к консенсусному каркасному участку VL каппа I. Еще в одном объекте изобретения по меньшей мере одна из последовательностей каркасного участка легкой цепи представляет собой:

LC-FR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 300),

LC-FR2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 301),

LC-FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 302),

LC-FR4: FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 303).

кусок

В следующем объекте изобретения антитело содержит также человеческую или мышиную константную область. Еще в одном объекте изобретения человеческую константную область выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. В следующем конкретном объекте изобретения человеческая константная область соответствует константной области IgG1. Еще в одном объекте изобретения мышиную константную область выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В следующем объекте изобретения мышиная константная область соответствует константной области IgG2A. Еще в одном конкретном объекте изобретения антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В другом конкретном объекте изобретения минимальная эффекторная функция является результатом мутации Fc, приводящей к снижению эффекторной функции («effectorless»-мутация Fc), или агликозилирования. В следующем варианте осуществления изобретения «effectorless»-мутация Fc представляет собой замену N297A или D265A/N297A в константной области.

Другим вариантом осуществления изобретения является антитело к PDL1, которое содержит последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, в котором:

(а) тяжелая цепь содержит также последовательности HVR-H1, HVR-H2 и HVRH3, последовательности которых идентичны по меньшей мере на 85% последовательностям GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 289), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 290) и RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 291) соответственно, или

(б) легкая цепь содержит также последовательности HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, последовательности которых идентичны по меньшей мере на 85% последовательностям RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 292), SASFLYS (SEQ ID NO: 293) и QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 294) соответственно.

В конкретном объекте изобретения идентичность последовательности составляет 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Согласно следующему объекту изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или несколько последовательностей каркасных участков, расположенных между HVR следующим образом: (НС-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), и вариабельная область легкой цепи содержит одну или несколько последовательностей каркасных участков, расположенных между HVR следующим образом: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков получают из последовательностей человеческих консенсусных каркасных участков. В другом объекте изобретения последовательности каркасных участков тяжелой цепи получают из последовательности подгруппы I, II или III согласно Кэботу. В другом объекте изобретения последовательность каркасного участка тяжелой цепи относится к подгруппе III VH консенсусного каркасного участка. Еще в одном объекте изобретения одна или несколько последовательностей каркасного участка тяжелой цепи представляет собой:

HC-FR1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 295),

HC-FR2: WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 296),

HC-FR3: RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 297),

HC-FR4: WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 298).

Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков легкой цепи получают из последовательности подгруппы каппа I, II, II или IV по Кэботу. В следующем объекте изобретения последовательности каркасного участка легкой цепи относятся к консенсусному каркасному участку VL каппа I. Еще в одном объекте изобретения по меньшей мере одна из последовательностей каркасного участка легкой цепи представляет собой:

LC-FR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 300),

LC-FR2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 301),

LC-FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 302),

LC-FR4: FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 303).

В следующих конкретных объектах изобретения антитело содержит также человеческую или мышиную константную область. В следующем объекте изобретения человеческую константную область выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Еще в одном конкретном объекте изобретения человеческая константная область соответствует константной области IgG1. Еще в одном объекте изобретения мышиную константную область выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В следующем объекте изобретения мышиная константная область соответствует константной области IgG2A. Еще в одном конкретном объекте изобретения антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В другом конкретном объекте изобретения минимальная эффекторная функция является результатом мутации Fc, приводящей к снижению эффекторной функции («effectorless»-мутация Fc) или агликозилирования. В следующем варианте осуществления изобретения «effectorless»-мутация Fc представляет собой замену N297A или D265A/N297A в константной области.

Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное антитело к PD-L1, которое содержит последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, в котором:

(а) тяжелая цепь содержит последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности тяжелой цепи:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 382), или

(б) легкая цепь содержит последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности легкой цепи:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 383).

В конкретном объекте изобретения идентичность последовательности составляет 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Согласно следующему объекту изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или несколько последовательностей каркасных участков, расположенных между HVR следующим образом: (НС-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), и вариабельная область легкой цепи содержит одну или несколько последовательностей каркасных участков, расположенных между HVR следующим образом: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков получают из последовательностей человеческих консенсусных каркасных участков. В другом объекте изобретения последовательности каркасных участков тяжелой цепи получают из последовательности подгруппы I, II или III согласно Кэботу. В другом объекте изобретения последовательность каркасного участка тяжелой цепи относится к подгруппе III VH консенсусного каркасного участка. Еще в одном объекте изобретения одна или несколько последовательностей каркасного участка тяжелой цепи представляет собой:

HC-FR1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 295),

HC-FR2: WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 296),

HC-FR3: RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 297),

HC-FR4: WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 298).

Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков легкой цепи получают из последовательности подгруппы каппа I, II, II или IV по Кэботу. В следующем объекте изобретения последовательности каркасного участка легкой цепи относятся к консенсусному каркасному участку VL каппа I. Еще в одном объекте изобретения по меньшей мере одна из последовательностей каркасного участка легкой цепи представляет собой:

LC-FR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 300),

LC-FR2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 301),

LC-FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 302),

LC-FR4: FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 303).

В следующих конкретных объектах изобретения антитело содержит также человеческую или мышиную константную область. В следующем объекте изобретения человеческую константную область выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Еще в одном конкретном объекте изобретения человеческая константная область соответствует константной области IgG1. Еще в одном объекте изобретения мышиную константную область выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В следующем объекте изобретения мышиная константная область соответствует константной области IgG2A. Еще в одном конкретном объекте изобретения антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В следующем объекте изобретения минимальная эффекторная функция является результатом получения в прокариотических клетках. В другом конкретном объекте изобретения минимальная эффекторная функция является результатом мутации Fc, приводящей к снижению эффекторной функции («effectorless»-мутация Fc), или агликозилирования. В следующем варианте осуществления изобретения «effectorless»-мутация Fc представляет собой замену N297A или D265A/N297A в константной области.

Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное антитело к PDL1, которое содержит последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, в котором:

(а) тяжелая цепь содержит последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности тяжелой цепи:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 280), или

(б) легкая цепь содержит последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности легкой цепи:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 383).

Еще одним вариантом осуществления изобретения является выделенное антитело к PDL1, которое содержит последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, в котором:

(а) тяжелая цепь содержит последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности тяжелой цепи:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK (SEQ ID NO: 281), или

(б) легкая цепь содержит последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности легкой цепи:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 282).

В конкретном объекте изобретения идентичность последовательности составляет 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Согласно следующему объекту изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или несколько последовательностей каркасных участков, расположенных между HVR следующим образом: (НС-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), и вариабельная область легкой цепи содержит одну или несколько последовательностей каркасных участков, расположенных между HVR следующим образом: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков получают из последовательностей человеческих консенсусных каркасных участков. В другом объекте изобретения последовательности каркасных участков тяжелой цепи получают из последовательности подгруппы I, II или III согласно Кэботу. В другом объекте изобретения последовательность каркасного участка тяжелой цепи относится к подгруппе III VH консенсусного каркасного участка. Еще в одном объекте изобретения одна или несколько последовательностей каркасного участка тяжелой цепи представляет собой:

HC-FR1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 295),

HC-FR2: WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 296),

HC-FR3: RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 297),

HC-FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 299).

Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков легкой цепи получают из последовательности подгруппы каппа I, II, II или IV по Кэботу. В следующем объекте изобретения последовательности каркасного участка легкой цепи относятся к консенсусному каркасному участку VL каппа I. Еще в одном объекте изобретения по меньшей мере одна из последовательностей каркасного участка легкой цепи представляет собой:

LC-FR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 300),

LC-FR2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 301),

LC-FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 302),

LC-FR4: FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 303).

В следующих конкретных объектах изобретения антитело содержит также человеческую или мышиную константную область. В следующем объекте изобретения человеческую константную область выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Еще в одном конкретном объекте изобретения человеческая константная область соответствует константной области IgG1. Еще в одном объекте изобретения мышиную константную область выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В следующем объекте изобретения мышиная константная область соответствует константной области IgG2A. Еще в одном конкретном объекте изобретения антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В следующем объекте изобретения минимальная эффекторная функция является результатом получения в прокариотических клетках. В другом конкретном объекте изобретения минимальная эффекторная функция является результатом мутации Fc, приводящей к снижению эффекторной функции («effectorless»-мутация Fc) или агликозилирования. В следующем варианте осуществления изобретения «effectorless»-мутация Fc представляет собой замену N297A или D265A/N297A в константной области.

В другом варианте осуществления изобретения антитело к PD-L1 представляет собой MPDL3280A (регистрационный номер CAS: 1422185-06-5). Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное антитело к PD-L1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 28, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21. Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное антитело к PD-L1, содержащее последовательность тяжелой цепи и/или легкой цепи, в котором:

(а) последовательность тяжелой цепи по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности тяжелой цепи: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 278), или

(б) последовательность легкой цепи по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности легкой цепи: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 279).

Следующим вариантом осуществления изобретения являются композиции, содержащее любое из описанных выше антител к PDL1 в сочетании по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем.

Другим вариантом осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует последовательность вариабельной области легкой цепи или тяжелой цепи антитела к PDL1 в котором:

(а) тяжелая цепь содержит также последовательности HVR-H1, HVR-H2 и HVRH3, идентичные по меньшей мере на 85% последовательности GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 289), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 290) и RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 291) соответственно, и

(б) легкая цепь содержит также последовательности HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, идентичные по меньшей мере на 85% последовательности RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 292), SASFLYS (SEQ ID NO: 293) и QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 294) соответственно.

В конкретном объекте изобретения идентичность последовательности составляет 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Согласно следующему объекту изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или несколько последовательностей каркасных участков, расположенных между HVR следующим образом: (НС-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), и вариабельная область легкой цепи содержит одну или несколько последовательностей каркасных участков, расположенных между HVR, следующим образом: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков получают из последовательностей человеческих консенсусных каркасных участков. В другом объекте изобретения последовательности каркасных участков тяжелой цепи получают из последовательности подгруппы I, II или III согласно Кэботу. В другом объекте изобретения последовательность каркасного участка тяжелой цепи относится к подгруппе III VH консенсусного каркасного участка. Еще в одном объекте изобретения одна или несколько последовательностей каркасного участка тяжелой цепи представляет собой:

HC-FR1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 295),

HC-FR2: WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 296),

HC-FR3: RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 297),

HC-FR4: WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 298).

Еще в одном объекте изобретения последовательности каркасных участков легкой цепи получают из последовательности подгруппы каппа I, II, II или IV по Кэботу. В следующем объекте изобретения последовательность каркасного участка легкой цепи относится к консенсусному каркасному участку VL каппа I. Еще в одном объекте изобретения по меньшей мере одна из последовательностей каркасного участка легкой цепи представляет собой:

LC-FR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 300),

LC-FR2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 301),

LC-FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 302),

LC-FR4: FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 303).

В следующих конкретных объектах изобретения антитело, указанное в настоящем описании (такое как антитело к PD-1, антитело к PDL1 или антитело к PDL2), содержит также человеческую или мышиную константную область. В следующем объекте изобретения человеческую константную область выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Еще в одном конкретном объекте изобретения человеческая константная область соответствует константной области IgG1. Еще в одном объекте изобретения мышиную константную область выбирают из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. В следующем объекте изобретения мышиная константная область соответствует константной области IgG2A. Еще в одном конкретном объекте изобретения антитело обладает пониженной или минимальной эффекторной функцией. В следующем объекте изобретения минимальная эффекторная функция является результатом получения в прокариотических клетках. В другом конкретном объекте изобретения минимальная эффекторная функция является результатом мутации Fc, приводящей к снижению эффекторной функции («effectorless»-мутация Fc) или агликозилирования. В следующем варианте осуществления изобретения «effectorless»-мутация Fc представляет собой замену N297A или D265A/N297A в константной области.

Другим объектом изобретения являются нуклеиновые кислоты, которые кодируют любое из антител, указанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота содержится также в векторе, пригодном для экспрессии нуклеиновой кислоты, которая кодирует описанные выше антитела к PDL1, к PD-1 или к PDL2. В еще одном конкретном объекте изобретения вектор содержится также в клетке-хозяине, пригодной для экспрессии нуклеиновой кислоты. В другом конкретном объекте изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку или прокариотическую клетку. В следующем конкретном объекте изобретения эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского хомячка (СНО).

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно получать методами, известными в данной области, например, с помощью процесса, включающего культивирование клетки-хозяина, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из указанных выше антител к PDL1, к PD-1 или к PDL2, или их антигенсвязывающий фрагмент, в форме, пригодной для экспрессии, в условиях, в которых можно получать указанное антитело или фрагмент, и выделение антитела или фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное антитело к PDL1 является агликозилированным.

Гликозилирование антител, как правило, бывает либо N-связанным, либо О-связанным. N-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, в которых X обозначает любую аминокислоту кроме пролина, представляют собой распознаваемые последовательности для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из указанных трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров, таких как N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза, к гидроксиаминокислоте, наиболее часто к серину или треонину, хотя можно использовать также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Удаление сайтов гликозилирования из антитела, как правило, сопровождается изменением аминокислотной последовательности, таким как удаление одной из вышеуказанных трипептидных последовательностей (в случае N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение можно осуществлять путем замены остатка аспарагина, серина или треонина в сайте гликозилирования на другой аминокислотный остаток (например, глицин, аланин или консервативная замена).

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения выделенное антитело к PD-L1 может связываться с человеческим PD-L1, например, человеческим PD-L1, который имеет код доступа UniProtKB/Swiss-Prot. №Q9NZQ7.1, или его вариантом.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является композиция, которая содержит указанное в настоящем описании антитело к PD-L1, к PD-1 или к PD-L2 или его антигенсвязывающий фрагмент, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1, к PD-1 или к PD-L2 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые вводят индивидууму, находятся в составе композиции, которая содержит один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

Можно применять любые фармацевтически приемлемые носители, указанные в настоящем описании или известные в данной области.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1, указанное в настоящем описании, находится в препаративной форме, которая содержит антитело в количестве примерно 60 мг/мл, ацетат гистидина в концентрации примерно 20 мМ, сахарозу в концентрации примерно 120 мМ и полисорбат (например, полисорбат 20) в концентрации 0,04% (мас./об.), и препаративная форма имеет рН примерно 5,8. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1, указанное в настоящем описании, находится в препаративной форме, которая содержит антитело в количестве примерно 125 мг/мл, ацетат гистидина в концентрации примерно 20 мМ, сахарозу в концентрации примерно 240 мМ и полисорбат (например, полисорбат 20) в концентрации 0,02% (мас./об.), и препаративная форма имеет рН примерно 5,5.

Примеры антагонистов к TIM3, которые можно применять согласно изобретению

В настоящем описании предложны способы лечения или замедления развития рака у индивидуума, включающие введение индивидууму в эффективном количестве активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, антагониста, связывающегося с осью PD-1, и антагониста TIM3. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист TIM3 представляет собой антитело к TIM3. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к TIM3 индуцирует интернализацию TIM3, экспрессируемого на клетках, по меньшей мере на уровне 45% через 120 мин при 37°С по данным, полученным с помощью FACS-анализа. Клетка представляет собой, например, RPMI8226-клетки (АТСС® CCL-155™). В одном из вариантов осуществления изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 на экспрессирующих TIM3 RPMI8226-клетках (АТСС® CCL-155™) по меньшей мере на уровне 55% через 120 мин при 37°С по данным, полученным с помощью FACS-анализа. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 на экспрессирующих TIM3 RPMI8226-клетках (АТСС® CCL-155™) по меньшей мере на уровне 60% через 240 мин при 37°С по данным, полученным с помощью FACS-анализа. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 на экспрессирующих TIM3 RPMI8226-клетках (АТСС® CCL-155™) по меньшей мере на уровне 65% через 240 мин при 37°С по данным, полученным с помощью FACS-анализа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к TIM3 конкурирует за связывание с TIM3 с антителом к Tim3, которое содержит VH и VL антитела Tim3_0016. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к TIM3 связывается с TIM3 человека и обезьян циномолгус.В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к TIM3 проявляет в виде иммуноконъюгата цитотоксическую активность на экспрессирующих TIM3 клетках. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат имеет относительную величину IC₅₀, характеризующую цитотоксическую активность в виде конъюгата с экзотоксином A Pseudomonas в отношении RPMI-8226-клеток, составляющую 0,1 или менее. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 индуцирует высвобождение интерферона-гамма по данным MLR-анализа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к TIM3 связывается с TIM3 человека и обезьян циномолгус и индуцирует высвобождение интерферона-гамма по данным MLR-анализа.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307; или HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 314; HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 315; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307; или HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 314; или HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 315; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 314; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 315; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307; или HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 314; или HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 315; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308, и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 306; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307; или HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 314; или HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 315; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 306; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 306; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 314; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 306; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 315; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 308, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 309.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное антитело к TIM3 содержит:

I) VH-последовательность SEQ ID NO: 310 и VL-последовательность SEQ ID NO: 311;

II) VH-последовательность SEQ ID NO: 312 и VL-последовательность SEQ ID NO: 313;

III) или гуманизированный вариант VH и VL антитела, указанного в подпункте I) или II).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 316; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 317; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 318; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 319; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 320; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 321.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 316; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 317; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 318; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 319; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 320; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 321.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 316, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 317, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 318; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 319; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 320, и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 321.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 316, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 317, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 318; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 319; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 320, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 321.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное антитело к TIM3 содержит:

I) VH-последовательность SEQ ID NO: 322 и VL-последовательность SEQ ID NO: 323;

II) или гуманизированный вариант VH и VL антитела, указанного в подпункте I).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 324; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 325; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 326; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 327; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 328; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 324; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 325; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 326; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 327; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 328; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 324, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 325, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 326; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 327; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 328, и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 324, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 325, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 326; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 327; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 328, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 329.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное антитело к TIM3 содержит:

I) VH-последовательность SEQ ID NO: 330 и VL-последовательность SEQ ID NO: 331;

II) или гуманизированный вариант VH и VL антитела, указанного в подпункте I).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 332; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 335; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 336; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 337.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 332; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 335; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 336; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 337.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 332, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 335; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 336, и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 337.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 332, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 334; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 335; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 336, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 337.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное антитело к TIM3 содержит:

I) VH-последовательность SEQ ID NO: 338 и VL-последовательность SEQ ID NO: 339;

II) или гуманизированный вариант VH и VL антитела, указанного в подпункте I).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 340; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 341; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 343; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 344; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 345.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 340; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 341; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 343; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 344; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 345.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 340, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 341, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 343; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 344, и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 345.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 340, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 341, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 342; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 343; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 344, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 345.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное антитело к TIM3 содержит:

I) VH-последовательность SEQ ID NO: 346 и VL-последовательность SEQ ID NO: 347;

II) или гуманизированный вариант VH и VL антитела, указанного в подпункте I).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 348; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 349; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 350; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 351; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 352; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 348; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 349; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 350; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 351; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 352; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 348, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 349, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 350; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 351; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 352, и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 348, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 349, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 350; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 351; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 352, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное антитело к TIM3 содержит:

I) VH-последовательность SEQ ID NO: 354 и VL-последовательность SEQ ID NO: 355;

II) или гуманизированный вариант VH и VL антитела, указанного в подпункте I).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 356; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 359; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 360; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 361.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 356; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 359; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 360; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 361.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 356, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 358; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 359; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 360, и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 361.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 356, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 358; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 359; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 360, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 361.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное антитело к TIM3 содержит:

I) VH-последовательность SEQ ID NO: 362 и VL-последовательность SEQ ID NO: 363;

II) или гуманизированный вариант VH и VL антитела, указанного в подпункте I).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 364; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 365; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 366; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 367; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 368; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 369.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 364; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 365; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 366; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 367; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 368; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 369.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 364, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 365, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 366; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 367; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 368, и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 369.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит (а) VH-домен, содержащий (I) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 364, (II) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 365, и (III) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 366; и (б) VL-домен, содержащий (I) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 367; (II) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 368, и (III) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 369.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанное антитело к TIM3 содержит:

I) VH-последовательность SEQ ID NO: 370 и VL-последовательность SEQ ID NO: 371;

II) или гуманизированный вариант VH и VL антитела, указанного в подпункте I).

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 является гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит HVR, указанные в любом из приведенных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержит акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок. В другом варианте осуществления изобретения антитело к TIM3 содержит HVR, указанные в любом из приведенных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержит VH и VL, содержащие указанные HVR. В другом объекте изобретения антитело к TIM3 связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, представленное в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к TIM3 связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, содержащее VH- последовательность SEQ ID NO: 310 и VL-последовательность SEQ ID NO: 311, или антитело к TIM3 связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 312 и VL-последовательность SEQ ID NO: 313, или предложено антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 322 и VL-последовательность SEQ ID NO: 323, или предложено антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 330 и VL-последовательность SEQ ID NO: 331, или предложено антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 338 и VL-последовательность SEQ ID NO: 339, или предложено антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 346 и VL-последовательность SEQ ID NO: 347, или предложено антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 354 и VL-последовательность SEQ ID NO: 355, или предложено антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 362 и VL-последовательность SEQ ID NO: 363, или предложено антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 370 и VL-последовательность SEQ ID NO: 371. Одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения является антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело к TIM3, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 310 и VL-последовательность SEQ ID NO: 311.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 конкурирует за связывание с человеческим TIM3 с антителом к TIM3, которое содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 310 и VL-последовательность SEQ ID NO: 311, по данным анализа в условиях конкуренции с использованием экспрессирующих TIM3 RPMI-8226-клеток (АТСС® CCL-155™).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3, указанное в любом из приведенных выше вариантов осуществления изобретения, представляет собой моноклональное антитело, включая химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 представляет собой фрагмент антитела, такой, например, как Fv-, Fab-, Fab'-, scFv-фрагмент, димерное антитело или F(ab')₂-фрагмент.В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело изотипа IgG1 или IgG4 или антитело другого класса или изотипа, указанного в настоящем описании.

В другом объекте изобретения антитело к TIM3, указанное в любом из приведенных выше вариантов осуществления изобретения, может обладать любой особенностью, индивидуально или в сочетании, указанной в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 представляет собой любое из антител, указанных в WO 2011/155607, WO 2013/006490, WO 03/063792, WO 2009/097394 или WO 2011/159877. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к TIM3 представляет собой F38-2E2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к TIM3 представляют собой антитела из гибридом 8 В.2С12 и 25F.1D6 и их получают согласно методам, описанным в заявках на патент США №№2004/0005322 и 2005/0191721, у Sabatos С.А. и др., Nature Immunol. 4, 2003, сс. 1102-1110 и Sanchez-Fueyo А. и др., Nature Immunol. 4, 2003, сс. 1093-1101, которые все полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. Под объем изобретения подпадают другие специфические в отношении TIM3 антитела и антитела, которые можно получать, например, методами, указанными в настоящем описании. Нуклеотидные и белковые последовательности человеческого TIM3 можно получать из Genbank, код доступа AF251707.1 и Uniprot, код доступа Q8TDQ0. Приведенная в качестве примера аминокислотная последовательность человеческого TIM3 представлена в SEQ ID NO: 380; приведенная в качестве примера аминокислотная последовательность внеклеточного домена человеческого TIM3 представлена в SEQ ID NO: 381.

Получение антител

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист, связывающийся с PD-1, представляет собой антитело (например, антитело к PD-1, антитело к PD-L1 или антитело к PD-L2). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист TIM3 представляет собой антитело (например, антагонистическое антитело к TIM3). Антитела, указанные в настоящем описании, можно получать с использованием методик, известных в данной области для создания антител, например, методов, которые описаны более подробно в приведенных ниже разделах.

Антитело направлено против представляющего интерес антигена. Например, антитело может быть направлено против PD-1 (такого как человеческий PD-1), PD-L1 (такого как человеческий PD-L1), PD-L2 (такого как человеческий PD-L2), TIM3 (такого как человеческий TIM3). Предпочтительно антиген представляет собой биологически важный полипептид, и введение антитела млекопитающему, которое страдает нарушением, может приводить к терапевтической пользе для указанного млекопитающего.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в настоящем описании, имеет константу диссоциации (Kd), составляющую 1 мкМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ или 0,001 нМ ((например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М).

В одном из вариантов осуществления изобретения Kd измеряют путем анализа связывания радиоактивномеченного антигена (РИА), используя версию Fab представляющего интерес антитела и его антиген, согласно следующему анализу. Аффинность связывания в растворе Fab к антигену измеряют путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией (¹²⁵I)-меченного антигена в присутствии полученных титрованием серий немеченого антигена, затем «захватывают» связанный антиген с использованием сенсибилизированного антителом к Fab планшета (см., например, Chen и др., J. Mol. Biol. 293, 1999, cc. 865-881). Для создания условий для анализа многолуночные планшеты MICROTITER^® (фирма Thermo Scientific) сенсибилизируют в течение ночи 5 мкг/мл «захватывающего» антитела к Fab (фирма Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6) и затем блокируют 2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в ЗФР в течение 2-5 ч при комнатной температуре (примерно 23°С). В неадсорбирующем планшете (фирма Nunc, №269620) смешивают [¹²⁵I]-антиген (100 пМ или 26 пМ) с серийными разведениями представляющего интерес Fab. Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи; однако инкубацию можно осуществлять и в течение более длительного периода (например, примерно 65 ч) для гарантии достижения равновесия. Затем смеси переносят в иммобилизующий («захватывающий») планшет для инкубации при комнатной температуре (например, в течение 1 ч). Затем раствор удаляют и планшет промывают 8 раз 0,1% полисорбатом 20 (TWEEN-20^®) в ЗФР. Затем планшеты сушат, добавляют 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости (MICROSCINT-20™; фирма Packard) и осуществляют подсчет содержимого планшетов с помощью счетчика гамма-лучей TOPCOUNT™ (фирма Packard) в течение 10 мин. Концентрации каждого Fab, при которых связывание ниже или равно 20% от максимального связывания, выбирают для применения в анализах связывания в условиях конкуренции.

Согласно другому варианту осуществления изобретения Kd измеряют с помощью анализов методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием устройства BIACORE®-2000 или BIACORE®-3000 (фирма BIAcore, Inc., Пискатавей, шт. Нью-Джерси) при 25°С с использованием антигена, иммобилизованного на СМ5-чипах с уровнем иммобилизации, соответствующим ~ 10 единицам ответа (RU). В целом, метод состоит в следующем: биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма BIACORE, Inc.) активируют с помощью гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8 до концентрации 5 мкг/мл (~ 0,2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин для достижения уровня иммобилизации, соответствующего примерно 10 единицам ответа (RU) связанного белка. После инъекции антигена инъецируют 1М этаноламин для блокады непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецируют двукратные серийные разведения (Fab) (от 0,78 до 500 нМ) в ЗФР, дополненном 0,05% полисорбата 20 (TWEEN-20™) в качестве сурфактанта (ЗФРТ), при 25°С со скоростью потока примерно 25 мкл/мин. Скорость реакции ассоциации (k_on) и реакции диссоциации (k_off) рассчитывают с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программное обеспечение BIACORE® Evaluation, версия 3.2) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации.

Константу равновесия реакции диссоциации (Kd) рассчитывают как соотношение k_off/k_on (см., например, Chen и др., J Mol Biol 293, 1999, cc. 865-881). Если скорость реакции ассоциации превышает 10⁶ М^-1 с^-1 при оценке с помощью описанного выше метода поверхностного плазмонного резонанса, то скорость реакции ассоциации можно определять с помощью метода гашения флуоресценции, который позволяет измерять повышение или снижение интенсивности излучения флуоресценции (длина волны возбуждения = 295 нм; длина волны испускания = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С применяемого в концентрации 20 нМ антитела к антигену (Fab-формат) в ЗФР, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, осуществляя измерения с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр, снабженный блоком для остановки потока (фирма Aviv Instruments), или спектрофотометр SLM-AMINCO™ серии 8000 (фирма ThermoSpectronic), при перемешивании содержимого кюветы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело TIM3, представленное в настоящем описании, характеризуется аффинностью связывания, составляющей по меньшей мере 100 пМ или менее в отношении человеческого TIM3, аффинностью связывания, составляющей по меньшей мере 300 пМ или менее в отношении человеческого TIM3, аффинностью связывания, составляющей по меньшей мере 400 пМ или менее в отношении человеческого TIM3, нейтрализующей способностью, составляющей по меньшей мере 40 нМ или менее в отношении человеческого TIM3, нейтрализующей способностью, составляющей по меньшей мере 120 нМ или менее в отношении человеческого TIM3, и нейтрализующей способностью, составляющей по меньшей мере 31 нМ или менее в отношении человеческого TIM3. В этих вариантах осуществления изобретения аффинность связывания можно измерять с помощью поверхностного плазмонного резонанса, описанного в US №8771697.

Фрагменты антител

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антитела представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) Fab-, Fab'-, Fab'-SH-, F(ab')₂-, Fv- и scFv-фрагменты и другие фрагменты, описанные ниже. Обзор конкретных фрагментов антител см. у Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, сс 129-134. Обзор scFv-фрагментов см, например, у в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, под ред. Rosenburg и Moore (изд-во Springer-Verlag, New York), т. 113, 1994, сс. 269-315; см. также WO 93/16185 и US №№5571894 и 5587458. Обсуждение Fab- и F(ab')₂-фрагментов, содержащих остатки эпитопа, связывающегося с рецептором «спасения», и обладающих удлиненным временем полужизни in vivo, см. в US №5869046.

Димерные антитела (диабоди) представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими центрами, которые могут быть двухвалентными или юниспецифическими (см., например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134 и Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 6444-6448). Тримерные антитело (триабоди) и тетрамерные антитела (тетрабоди) описаны также у Hudson и др. Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134. Одноцепочечные антитела представляют собой фрагменты антител, которые содержат весь вариабельный домен тяжелой цепи или его часть или вес вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечное антитело представляет собой человеческое одноцепочечное антитело (фирма Domantis, Inc., Валтам, шт.Массачусетс, см., например, US №6248516 В1).

Фрагменты антител можно получать различными методами, включая (но, не ограничиваясь только ими) протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получать с использованием рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е. coli или фага), как указано в настоящем описании.

Химерные и гуманизированные антитела

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в US №4816567 и у Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, сс. 6851-6855. В одном из примеров химерное антитело содержит нечеловеческую вариабельную область (например, вариабельную область из антитела мышей, крыс, хомяков, кроликов или приматов кроме человека, таких как обезьяны) и человеческую константную область. В другом примере химерное антитело представляет собой антитело «переключенного класса», класс или подкласс которого изменен по сравнению с родительским антителом. К химерным антителам относятся также их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления изобретения химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, нечеловеческое антитело гуманизируют для уменьшения иммуногенности для людей с сохранением специфичности и аффинности родительского нечеловеческого антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в котором(ых) HVR, например, CDR (или их фрагменты) выводят из нечеловеческого антитела, a FR (или их фрагменты) выводят из последовательностей человеческих антител. Гуманизированное антитело необязательно может содержать также по меньшей мере часть человеческой константной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменяют на соответствующие остатки из нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого выведены остатки HVR), например, для сохранения или повышения специфичности или аффинности антитела.

Сведения о гуманизированных антителах и методах их получения обобщены, например, у Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, сс. 1619-1633, и они описаны также, например, у Riechmann и др., Nature 332, 1988, сс. 323-329; Queen и др., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 10029-10033; US №№. 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Jones и др., Nature 321, 1986, сс. 522-525; Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1984, сс. 6851-6855; Morrison и Oi, Adv. Immunol. 44, 1988, сс. 65-92; Verhoeyen и др., Science 239, 1988, сс. 1534-1536; Padlan, Molec. Immun. 31(3), 1994, cc. 169-217; Kashmiri и др., Methods 36, 2005, cc. 25-34 (описание трансплантации SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28, 1991, cc. 489-498 (описание «нанесения нового покрытия»); и др., Methods 36, 2005, cc. 43-60 (описание «перестановки FR»); и Osbourn и др., Methods 36, 2005, cc. 61-68 и у Klimka и др., Br. J. Cancer 83, 2000, cc. 252-260 (описание подхода на основе «целенаправленной селекции» для перестановки FR).

Человеческие каркасные участки, которые можно применять для гуманизации, включают (но, не ограничиваясь только ими): каркасные участки, выбранные на основе метода «наилучшего подбора» (см., например, Sims и др., J. Immunol. 151, 1993, с. 2296); каркасные участки, выведенные из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей легких или тяжелых цепей (см., например, Carter и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1992, с. 4285; и Presta и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2623); человеческие зрелые (подвергнутые соматической мутации) каркасные участки или каркасные участки человеческой зародышевой линии (см., например, Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, cc. 1619-1633); и каркасные участки, полученные в результате скрининга FR-библиотек (см., например, Васа и др., J. Biol. Chem. 272, 1997, cc. 10678-10684) и Rosok и др., J. Biol. Chem. 271, 1996, cc. 22611-22618).

Человеческие антитела

В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получать различными методами, известными в данной области. Человечески антитела описаны в целом у van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, cc. 368-374 и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 2008, cc. 450-459.

Человеческие антитела можно получать путем введения иммуногена трансгенному животному, которое модифицировано таким образом, что продуцирует интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на контрольное заражение антигеном. Указанные животные, как правило, содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, которыми заменены эндогенные локусы иммуноглобулина, или которые присутствуют вне хромосом или интегрированы произвольно в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные локусы иммуноглобулина, как правило, инактивированы. Обзор методов получения человеческих антител в трансгенных животных см. у Lonberg, Nat. Biotech. 23, 2005, cc. 1117-1125. Они описаны также, например, в US №№6075181 и 6150584 в которых описана технология XENOMOUSE™; US №5770429, в котором описана технология HuMab®; US 7041870, в котором описана технология K-М MOUSE® и в публикации заявки на патент США №2007/0061900, в котором описана технология VelociMouse®. Человеческие вариабельные области интактных антител, полученные в таких животных, можно дополнительно модифицировать, например, объединяя с человеческой константной областью из другого антитела.

Человеческие антитела можно получать также с помощью методов, основанных на применении гибридом. Описаны клеточные линии человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы, предназначенные для получения человеческих моноклональных антител (см., например, Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, с. 3001; Brodeur и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 1987, cc. 51-63 (изд-во Marcel Dekker, Inc., New York); и Boerner и др., J. Immunol., 147, 1991, c. 86). Человеческие антитела, созданные с помощью технологии, основанной на применении человеческих В-клеточных гибридом, описаны также у Li и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 2006, cc. 3557-3562. Дополнительные методы представляют методы, описанные, например, в US №7189826 (описание получения моноклональных человеческих антител типа IgM из клеточных линий гибридом) и у Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4), 2006, cc. 265-268 (описание человеческих-человеческих гибридом). Технология, основанная на применении человеческих гибридом (Trioma-технология), описана также у Vollmers и Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3), 2005, cc. 927-937 и Vollmers и Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3), 2005, cc. 185-191.

Человеческие антитела можно создавать также путем выделения последовательностей вариабельных доменов Fv-клона, выбранных из фаговых дисплейных библиотек, для создания которых использовали человеческие антитела. Указанные последовательности вариабельных доменов затем можно объединять с требуемым человеческим константным доменом. Методики отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.

Полученные из библиотек антитела

Антитела, предлагаемые в изобретении, можно выделять путем скрининга комбинаторных библиотек антител с требуемой активностью или видами активности. Например, в данной области известны разнообразные методы для создания фаговых дисплейных библиотек и скрининга указанных библиотек в отношении антител, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Указанные методы обобщены, например, у Hoogenboom и др., в: Methods in Molecular Biology, под ред. и др., изд-во, Human Press, Totowa, NJ, 178, 2001, сс.1-37 и описаны также, например, у McCafferty и др., Nature 348, сс.552-554; Clackson и др., Nature 352, 1991, сс. 624-628; Marks и др., J. Mol. Biol. 222, 1992, сс. 581-597); Marks и Bradbury, в: Methods in Molecular Biology, под ред. Lo и др., изд-во, Human Press, Totowa, NJ, 248, 2003, сс. 161-175; Sidhu и др., J. Mol. Biol. 338(2), 2004, сс. 299-310; Lee и др., J. Mol. Biol. 340(5), 2004, cc. 1073-1093; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34), 2004, cc. 12467-12472; и Lee и др., J. Immunol. Methods 284(1-2), 2004, cc. 119-132.

При осуществлении некоторых методов фагового дисплея популяции VH- и VL-генов клонируют по отдельности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинируют произвольно в фаговых библиотеках, которые затем подвергают скринингу в отношении антигенсвязывающего фага согласно методу, описанному у Winter и др., Ann. Rev. Immunol., 12, 1994, сс. 433-455. Фаг, как правило, экспонирует фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv), либо в виде Fab-фрагментов. Библиотеки, полученные из иммунизированных источников, включают антитела, обладающие высокой аффинностью к иммуногену, при этом отсутствует необходимость в создании гибридом. В альтернативном варианте можно клонировать необработанную («наивную») популяцию (например, из организма человека), получая один источник антител к широкому спектру чужих, а также своих антигенов без какой-либо иммунизации, что описано у Griffiths и др., EMBO J, 12, 1993, сс.725-734. И, наконец, «наивные» библиотеки можно получать также методами синтеза путем клонирования неперегруппированных сегментов V-гена из стволовых клеток и с помощью ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, для кодирования гипервариабельных CDR3-участков и для осуществления перегруппировки in vitro согласно методу, описанному у Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227, 1992, сс. 381-388. Фаговые библиотеки человеческих антител описаны, например, в следующих патентных публикациях: US №5750373 и публикации заявок на патент США №№2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.

Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, рассматриваются как человеческие антитела или фрагменты человеческих антител.

Мультиспецифические антитела

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности, связывающиеся по меньшей мере с двумя различными сайтами. Их примерами являются активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, специфические в отношении FolR1 и CD3, указанные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист компонента оси PD1 является мультиспецифическим. Одна из специфичностей связывается с компонентом оси PD-1 (например, PD-1, PD-L1 или PD-L2), а другая с любым другим антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из специфичностей связывается с IL-17 или IL-17R, а другая с любым другим антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антитела могут связываться с различными эпитопами компонента оси PD-1 (например, PD-1, PD-L1 или PD-L2), IL-17 или IL-17R. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из специфичностей связывается с компонентом оси PD-1 (например, PD-1, PD-L1 или PD-L2), а другая с IL-17 или IL-17R. В настоящем описании предложены способы лечения или замедления развития рака у индивидуума, включающие введение индивидууму в эффективном количестве мультиспецифического антитела, где мультиспецифическое антитело содержит первую специфичность, связывающуюся с компонентом оси PD-1 (например, PD-1, PDL1 или PDL2), и вторую специфичность, связывающуюся с IL-17 или IL-17R. В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антитела можно получать с помощью любых методов, указанных выше и ниже в настоящем описании.

Методы создания мультиспецифических антител включают (но, не ограничиваясь только ими) рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина, которые обладают различными специфичностями (см. Milstein и Cuello, Nature 305, 1983, с. 537, WO 93/08829 и Traunecker и др., EMBO J. 10, 1991, с. 3655), и конструирование на основе технологии «knob-in-hole» (взаимодействие по типу выступ - во впадину) (см., например, US №5731168). Мультиспецифические антитела можно получать также путем создания обусловленных электростатическим действием эффектов для создания молекул антител с гетеродимерной Fc-областью (WO 2009/089004 А1); путем поперечного сшивания двух или большего количеств антител или их фрагментов (см., US №4676980 и Brennan и др., Science 229, 1985, с. 81); с использованием «лейциновых молний» для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny и др., J. Immunol. 148(5), 1992, сс. 1547-1553); с использованием технологии «диабоди» для создания фрагментов биспецифических антител (см., например, Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, сс. 6444-6448); и с использованием димеров одноцепочечных Fv (scFv) (см., например, Gruber и др., J. Immunol., 152, 1994, с. 5368); и путем получения триспецифических антител согласно методу, описанному, например, у Tutt и др., J. Immunol. 147, 1991, с. 60.

Под объем настоящего изобретения подпадают также сконструированные антитела с тремя или большим количеством антигенсвязывающих сайтов, включая «антитела-осьминоги» (см., например, US 2006/0025576 А1).

Согласно настоящему описанию антитело или его фрагмент может включать также « Fab двойного действия» или «DAF», которые содержат антигенсвязывающий сайт, который связывается с компонентом оси PD-1 (например, PD-1, PD-L1 или PD-L2), IL-17 или IL-17R, а также с другим, отличным от него антигеном (см. например, US 2008/0069820).

В. Нуклеотидные последовательности, векторы и методы их получения Полинуклеотиды, кодирующие активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, например, активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, которая содержит первый антигенсвязывающий сайт, специфический для фолатного рецептора 1 (FolR1), и второй антигенсвязывающий сайт, специфический для CD3, и антитела можно применять для получения активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы и антител, указанных в настоящем описании. Активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу и антитела, предлагаемые в изобретении, можно экспрессировать в виде индивидуального полинуклеотида, который кодирует полную биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, или в виде нескольких (например, двух или большего количества) совместно экспрессируемых полинуклеотидов. Полипептиды, кодируемые совместно экспрессируемыми полинуклеотидами, можно соединять, например, через дисульфидные связи или другими путями с образованием функциональной активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы и антитела. Например, часть Fab-фрагмента, представляющая собой легкую цепь, может кодироваться полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, кодирующего часть биспецифического антитела или антитела, связывающегося с FolR1, которая содержит часть Fab-фрагмента, представляющую собой тяжелую цепь, субъединицу Fc-домена и необязательно (часть) другого Fab-фрагмента. При совместной экспрессии полипептиды тяжелой цепи должны связываться с полипептидами легкой цепи с образованием Fab-фрагмента. В другом примере часть активирующей Т-клетку биспецифической антиген связывающей молекулы или ее связывающая антиген FolR1 часть, указанная в настоящем описании, содержащая одну из двух субъединиц Fc-домена и необязательно один или несколько (часть одного или нескольких) Fab-фрагментов, может кодироваться полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, кодирующего часть биспецифического антитела или антитела, связывающуюся с FolR1, представленную в настоящем описании, содержащую вторую из двух субъединиц Fc-домена и необязательно (часть) Fab-фрагмента. При совместной экспрессии субъединицы Fc-домена должны связываться с образованием Fc-домена.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В других вариантах осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК). РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть одноцепочечной или двухцепочечной.

Г. Варианты антител

В некоторых вариантах осуществления изобретения помимо описанных выше в настоящем изобретении предложены варианты аминокислотных последовательностей активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, специфической в отношении FolR1 и CD3, и антител. Например, может требоваться повышение аффинности связывания и/или других биологических свойств активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы. Аминокислотные последовательности вариантов активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы и антитела можно получать путем интродукции соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу или антитело, или путем пептидного синтеза. Указанные модификации включают, например, делеции и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечной конструкции можно использовать любую комбинацию делеций, инсерций и замен, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, способностью связываться с антигеном.

1. Варианты, полученные путем замены, инсерции и делеции

Конкретными вариантами осуществления изобретения являются варианты, которые имеют одну или несколько аминокислотных замен. Представляющими интерес сайтами для замещающего мутагенеза являются HVR и FR.

Консервативные замены представлены в таблице Б под заголовком «консервативные замены». Более общие замены представлены в таблице Б под заголовком «приведенные в качестве примера замены», и они дополнительно описаны ниже, со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно интродуцировать в представляющее интерес антитело и продукты подвергать скринингу в отношении требуемой активности, например, в отношении сохранения/повышения способности к связыванию антигена, пониженной иммуногенности или улучшенной ADCC или CDC.

Аминокислоты можно группировать на основе общих свойств боковых цепей следующим образом:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Под неконсервативными заменами подразумевают замену представителя одного из указанных классов на представителя из другого класса.

Один тип полученного в результате замены варианта включает замену одного или нескольких остатков в гипервариабельном участке родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, образовавшийся(еся) вариант(ы), выбранный(ые) для дальнейшего изучения, должен(ны) иметь модификации (например, улучшения) определенных биологических свойств (например, повышенная аффинность, пониженная иммуногенность) относительно родительского антитела и/или должен(ны) практически сохранять определенные биологические свойства родительского антитела. Примером полученного в результате замены варианта является антитело с созревшей аффинностью, которое можно легко получать, например, с помощью методов созревания аффинности на основе фагового дисплея, которые указаны в настоящем описании. В целом, метод состоит в следующем: один или несколько остатков HVR подвергают мутации и представляющие собой варианты антитела экспонируют на фаге и подвергают скринингу в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).

Изменения (например, замены) можно осуществлять в HVR, например, для повышения аффинности антитела. Указанные изменения можно делать в «горячих (активных) точках» в HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации в процессе соматического мутагенеза (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207, 2008, cc. 179-196), и/или SDR (a-CDR), осуществляя оценку полученного варианта VH или VL в отношении аффинности связывания. Созревание аффинности путем создания и повторной селекции вторичных библиотек описано, например, у Hoogenboom и др., в: Methods in Molecular Biology, под ред. и др., изд-во, Human Press, Totowa, NJ, 178, 2001, cc. 1-37. Согласно некоторым вариантам созревания аффинности вносят разнообразие в гены вариабельных областей, выбранные для созревания, с помощью любого из многочисленных методов (таких, например, как ПЦР пониженной точности, перестановка цепи или сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов). Затем создают вторичную библиотеку. Затем библиотеку подвергают скринингу для идентификации любых вариантов антител с требуемой аффинностью. Другой метод внесения разнообразия включает подходы, связанные с HVR, при осуществлении которых рандомизируют несколько остатков в HVR (например, 4-6 остатков одновременно). Конкретные остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно специфически идентифицировать, например, с помощью аланин-сканирующего мутагенеза, или посредством моделирования. В частности, мишенями часто являются CDR-H3 и CDR-L3.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения замены, инсерции или делеции могут иметь место в одном или нескольких HVR, если указанные изменения не существенно снижают способность антитела связываться с антигеном. Например, в HVR можно осуществлять консервативные изменения (например, указанные в настоящем описании консервативные замены), которые не приводят к существенному снижению аффинности связывания. Указанные изменения могут находиться вне «горячих (активных) точек» HVR или SDR. В некоторых из описанных выше вариантов последовательностей VH и VL каждый HVR либо является неизмененным, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

Ценным методом для идентификации остатков или участков антитела, которые можно подвергать мутагенезу, является метод, получивший называние «аланин-сканирующий мутагенез», он описан у Cunningham и Wells, Science, 244, 1989, сс. 1081-1085. При осуществлении этого метода идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для определения того, оказывает ли такая замена влияние на взаимодействие антитела с антигеном. В аминокислотные положения, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к начальным заменам, можно интродуцировать дополнительные замены. В альтернативном или дополнительном варианте может оказаться ценным анализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Указанные участвующие в контакте остатки и соседние остатки можно рассматривать в качестве мишеней или исключать из рассмотрения в качестве кандидатов для замены. Варианты можно подвергать скринингу для определения, обладают ли они требуемыми свойствами.

Инсерции аминокислотных последовательностей включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или большее количество остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примером результата осуществления терминальных инсерций является антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние N- или С-конца антитела с ферментом (как, например, в случае ADEPT (антитело-направленный фермент пролекарственной терапии) или с полипептидом, который удлиняет время полужизни антитела в сыворотке.

2. Варианты гликозилирования

В некоторых вариантах осуществления изобретения активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу или антитело, представленные в настоящем описании, изменяют с целью повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Добавление или делецию сайтов гликозилирования в антителе можно легко осуществлять путем такого изменения аминокислотной последовательности, которое позволяет создавать или удалять один или несколько сайтов гликозилирования.

Если активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула или антитело содержит Fc-область, то можно изменять присоединенный к ней углевод. Нативные антитела, которые продуцируются клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный биантенный олигосахарид, присоединенный с помощью N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-области (см., например, Wright и др., TIBTECH 15, 1997, сс. 26-32). Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стебле» биантенной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления изобретения модификации олигосахарида в биспецифическом антителе или антителе, связывающемся с DR5, представленном в настоящем описании, можно осуществлять для создания вариантов с определенными улучшенными свойствами.

Одним из вариантов осуществления изобретения являются варианты биспецифического антитела или варианты антител, имеющие углеводную структуру, в которой снижено содержание фукозы, присоединенной (прямо или косвенно) к Fc-области. Например, содержание фукозы в указанном антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Содержание фукозы определяют путем расчета среднего содержания фукозы в сахарной цепи на Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексные, гибридные структуры и структуры с высоким содержанием маннозы), которое измеряют с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии согласно методу, описанному, например, в WO 2008/077546. Asn297 обозначает остаток аспарагина, присутствующий примерно в положении 297 в Fc-области (EU-нумерация остатков Fc-области); однако вследствие минорных вариаций последовательности антитела Asn297 может располагаться также примерно на ±3 аминокислоты в прямом или обратном направлении относительно положения 297, т.е. между положениями 294 и 300. Указанные фукозилированные варианты могут обладать улучшенной ADCC-функцией (см., например, US 2003/0157108 (Presta L.); US 2004/0093621 (фирма Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примерами публикаций, касающихся «дефукозилированных» вариантов антител или вариантов антител «с дефицитом фукозы» являются: US №2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US №2003/0115614; US №2002/0164328; US №2004/0093621; US №2004/0132140; US №2004/0110704; US №2004/0110282; US №2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki и др., J. Mol. Biol. 336, 2004, cc. 1239-1249; Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, cc. 614-622). Примерами клеточных линий, которые обладают способностью продуцировать дефукозилированные антитела, являются Lec13 СНО-клетки с дефицитом белкового фукозилирования (Ripka и др., Arch. Biochem. Biophys. 249, 1986, сс. 533-545; заявка на патент США 2003/0157108 А1 (Presta L.) и WO 2004/056312 (Adams и др.) см., прежде всего, пример 11), и клеточные линии с «выключенным» геном, например, СНО-клетки с «выключенным» геном альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, с. 614-622); Kanda Y. и др., Biotechnol. Bioeng., 94(4), 2006, сс. 680-688; и WO 2003/085107).

Предложены также варианты активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул и варианты антител с бисекционными олигосахаридами, например, в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к Fc-области активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, связывающейся с FolR1, бисекционируется с помощью GlcNAc. Указанные варианты активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы могут отличаться пониженным фукозилированием и/или повышенной ADCC-функцией. Примеры указанных вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet и др.); US №6602684 (Umana и др.); и US 2005/0123546 (Umana и др.). Предложены также варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Указанные варианты антител могут обладать повышенной CDC-функцией. Указанные варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel и др.); WO 1998/58964 (Raju S.) и WO 1999/22764 (Raju S.).

3. Варианты антител, сконструированные с использованием цистеина

В конкретных вариантах осуществления изобретения может оказаться желательным конструировать активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы и антитела, с использованием цистеина, например, «тиоМАт»», в которых один или несколько остатков в активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекуле заменены на остатки цистеина. В конкретных вариантах осуществления изобретения замененные остатки присутствуют в доступных сайтах активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы. Путем замены указанных остатков на цистеин реактивные тиольные группы вносятся в доступные сайты антитела и могут использоваться для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты лекарственных средств или фрагменты линкера - лекарственного средства, для создания иммуноконъюгата. В конкретных вариантах осуществления изобретения любой один или несколько следующих остатков можно заменять на цистеин: V205 (нумерации по Кэботу) легкой цепи; А118 (EU-нумерация) тяжелой цепи и S400 (EU-нумерация) Fc-области тяжелой цепи. Сконструированные с помощью цистеина антитела можно создавать, например, согласно методу, описанному в US №7521541.

Д. Методы рекомбинации и композиции

Активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу и антитела, предлагаемые в изобретении, можно получать, например, путем твердофазного пептидного синтеза (например, твердофазного синтеза Меррифилда) или методами рекомбинации. Для рекомбинантного получения один или несколько полинуклеотидов, кодирующих активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу или антитела (или фрагменты), например, описанные выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанный полинуклеотид легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур. Одним из вариантов осуществления изобретения является вектор, предпочтительно экспрессионный вектор, содержащий один или несколько полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении. Методы, хорошо известные специалистам в данной области, можно применять для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующую последовательность активирующей Т-клетку биспецифической молекулы или антитела наряду с приемлемыми контролирующими транскрипцию/трансляцию сигналами. Эти методы включают технологии рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и in vivo рекомбинации/генетической рекомбинации (см., например, методы, описанные у Maniatis и др., Maniatis и др., Molecular Cloning A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989; и Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology, изд-во Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989). Экспрессионный вектор может представлять собой часть плазмиды, вируса или может представлять собой фрагмент нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор включает кассету экспрессии, в которой полинуклеотид, кодирующий активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (фрагмент) или антитело (фрагмент) (т.е. кодирующую область), клонируют с обеспечением функциональной связи с промотором и/или другими элементами, контролирующими транскрипцию или трансляцию. В контексте настоящего описания «кодирующая область» представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя «стоп-кодон» (TAG, TGA или ТАА) не транслируется в аминокислоту, он, в случае его присутствия, может рассматриваться как часть кодирующей области, однако любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны, 5'- и 3'- нетранслируемые области и т.п., не являются частью кодирующей области. Две или большее количество кодирующих областей может присутствовать в индивидуальной полинуклеотидной конструкции, например, индивидуальном векторе, или в различных полинуклеотидных конструкциях, например, в различных (отдельных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или большее количество кодирующих областей, например, вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, может кодировать один или несколько полипептидов, которые пост- или котранляционно разделяются на конечные белки посредством протеолитического расщепления. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота, предлагаемый/предлагаемая в изобретении, может кодировать гетерологичные кодирующие области, либо слитые, либо не слитые с полинуклеотидом, который кодирует активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (фрагмент) или антитело, или их вариант, или производное. Гетерологичные кодирующие области включают (но, не ограничиваясь только ими) специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. Функциональная связь имеет место, когда кодирующая область генного продукта, например полипептида, ассоциирована с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта находилась под воздействием или контролем регуляторной(ых) последовательности(ей). Два ДНК-фрагмента (таких как кодирующая область полипептида и ассоциированный с ней промотор) являются «функционально связанными», если индукция промоторной функции приводит к транскрипции мРНК, кодирующей требуемый генный продукт, и если природа связи между двумя ДНК-фрагментами не оказывает воздействия на способность регулирующих экспрессию последовательностей направлять экспрессию генного продукта, или не оказывает воздействия на способность ДНК-матрицы к транскрипции. Таким образом, промоторная область должна быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор обладает способностью осуществлять транскрипцию указанной нуклеиновой кислоты. Промотор может представлять собой специфический для клетки промотор, который обеспечивает значительную транскрипцию ДНК только в предварительно отобранных клетках.

Другие контролирующие транскрипцию элементы, помимо промотора, например, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, можно функционально связывать с полинуклеотидом для обеспечения специфической для клетки транскрипции. Приемлемые промоторы и другие контролирующие транскрипцию области представлены в настоящем описании. Специалистам в данной области известно широкое разнообразие контролирующих транскрипцию областей. Они включают (но, не ограничиваясь только ими) контролирующие транскрипцию области, которые функционируют в клетках позвоночных животных, такие как (но, не ограничиваясь только ими) сегменты промоторов и энхансеров из цитомегаловирусов (например, немедленно-ранний промотор в сочетании с интроном-А), обезьяньего вируса 40 (например, ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие контролирующие транскрипцию области включают области, выведенные из генов позвоночных животных, таких как ген актина, белка теплового шока, бычьего гормона роста и кроличьего β-глобина, а также другие последовательности, которые могут контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные приемлемые контролирующие транскрипцию области включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцибельные промоторы (например, промоторы, индуцируемые тетрациклином). Аналогично этому, обычным специалистам в данной области известно широкое разнообразие контролирующих трансляцию элементов. Они включают (но, не ограничиваясь только ими) сайты связывания рибосом, кодоны инициации трансляции и терминирующие кодоны и элементы, выведенные из вирусных систем (в частности, внутренний сайт связывания (посадки) рибосом или IRES, который обозначают также как CITE-последовательность). Кассета экспрессии может включать также другие характерные структуры, такие как сайт инициации репликации и/или интегрированные в хромосому элементы, такие как длинные концевые повторы (LTR) ретровирусов, или инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV).

Кодирующие области полинуклеотида и нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть ассоциированы с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, которые направляют секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом, предлагаемым в настоящем изобретении. Например, если требуется секреция активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы или антитела, то ДНК, кодирующую сигнальную последовательность, можно помещать против хода транскрипции относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, или антитело, связывающееся с DR5, предлагаемое в изобретении, или его фрагмент. Согласно гипотезе, касающейся сигналов, белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, который/которая отщепляется от зрелого белка после инициации экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Обычным специалистам в данной области должно быть очевидно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных животных, как правило, имеют сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от транслируемого полипептида с образованием секретируемой или «зрелой» формы полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения используют нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина или функциональное производное указанной последовательности, которое сохраняет способность обеспечивать секрецию полипептида, функционально связанного с ним. Альтернативно этому, можно применять гетерологичный сигнальный пептид млекопитающих или его функциональное производное. Например, лидерную последовательность дикого типа можно заменять на лидерную последовательность человеческого тканевого активатора плазминогена (TPA) или мышиной β-глюкуронидазы.

ДНК, кодирующую короткую белковую последовательность, которую можно применять для облегчения дальнейшей очистки (например, гистидиновую метку), или предназначенную для мечения активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы можно включать внутрь или на концы полинуклеотида, кодирующего активирующую Т-клетку биспецифическцю антигенсвязывающую молекулу (фрагмент) или антитело (фрагмент).

Другим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая один или несколько полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении. Некоторыми вариантами осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая один или несколько векторов, предлагаемых в изобретении.

Полинуклеотиды и векторы могут обладать любыми особенностями, индивидуально или в сочетании, указанными в настоящем описании касательно полинуклеотидов и векторов соответственно. В одном из таких вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин содержит вектор (например, трансформирована или трансфектирована им), содержащий полинуклеотид, который кодирует активирующую Т-клетку биспецифическую антигенсвязывающую молекулу или антитело, предлагаемую/предлагаемое в изобретении, или их фрагмент. В контексте настоящего описания понятие «клетка-хозяин» относится к любому типу клеточной системы, которую можно конструировать для получения активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, например, анти-FolR1 активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, указанных в настоящем описании, или антител, например, антител к PD-1, антител к-PD-L1 и антител к TIM3, предлагаемых в изобретении, или их фрагментов. Клетки-хозяева, пригодные для репликации и для поддержания экспрессии активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы и антител, предлагаемых в изобретении, хорошо известны в данной области. Такие клетки можно трансфектировать или трансдуцировать соответствующим образом конкретным экспрессионным вектором и можно выращивать большее количество содержащих вектор клеток с целью внесения в ферментеры для крупномасштабных процессов получения активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул и антител, в достаточных для клинических применений количествах. Приемлемыми клетками-хозяевами являются прокариотические микроорганизмы, такие как Е. coli, или различные эукариотические клетки, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки насекомых или т.п. Например, полипептиды можно получать в бактериях, прежде всего в тех случаях, когда отсутствует потребность в гликозилировании. После экспрессии полипептид можно выделять из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции и можно дополнительно очищать. Помимо прокариот в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, которые кодируют полипептид, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что позволяет получать полипептид с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross, Nat. Biotech. 22, 2004, сс. 1409-1414 и Li и др., Nat. Biotech. 24, 2006, сс. 210-215). Клетки-хозяева, которые можно использовать для экспрессии (гликозилированных) полипептидов, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные бакуловирусные штаммы и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, прежде всего для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, US №№5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях). В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных животных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью SV40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (293 или клетки линии 293, субклонированные с целью выращивания в суспензионной культуре, Graham и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, с. 59); клетки почки детеныша хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (ТМ4-клетки, описанные, например, у Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, сс. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76,); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, сс. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая dhfr-CHO-клетки (Urlaub и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с. 4216); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0, Р3Х63 и Sp2/0 Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства белка, см., например, у Yazaki и Wu, в: Methods in Molecular Biology под ред. В.K.С. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, cc. 255-268. Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, клетки дрожжей, клетки насекомых, клетки бактерий и клетки растений (но не ограничиваясь только ими), а также клетки, находящиеся в организме трансгенного животного, трансгенного растения или культивируемой растительной или животной ткани. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, предпочтительно клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского хомячка (СНО), клетку почки человеческого эмбриона (HEK) или лимфоидную клетку (например, клетку Y0, NS0, Sp20).

В данной области известны стандартные технологии для экспрессии чужеродных генов в этих системах. Клетки, экспрессирующие полипептид, содержащий либо тяжелую, либо легкую цепью антигенсвязывающего домена такой, как антитело, можно конструировать таким образом, чтобы в них происходила экспрессия также других цепей антитела, так, чтобы экспрессируемый продукт, представляя собой антитело, которое содержит как тяжелую, так и легкую цепь.

Любые виды антител, фрагментов антител, антигенсвязывающих доменов или вариабельных областей животного происхождения можно применять в активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекулах, предлагаемых в изобретении. Примерами антител, фрагментов антител, антигенсвязывающих доменов или вариабельных областей, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются (но, не ограничиваясь только ими) конструкции, полученные из организма мышей, приматов или человека. Если активирующая Т-клетку биспецифическая антигенсвязывающая молекула предназначена для применения на человеке, то можно применять химерную форму антитела, в которой константные области антитела получают из человеческого антитела. Гуманизированную или полностью человеческую форму антитела можно получать также с помощью методов, хорошо известных в данной области (см., например, US №5565332 на имя Winter). Для осуществления гуманизации можно применять различные методы, такие как (но, не ограничиваясь только ими) (а) трансплантация нечеловеческих (например, из антитела-донора) CDR в человеческий (например, антитело-реципиент) каркасный участок и константные области, сохраняющие или не сохраняющие имеющие решающее значение остатки каркасного участка (например, остатки, важные для сохранения хорошей антигенсвязывающей аффинности или функций антитела), (б) трансплантация только нечеловеческих определяющих специфичность участков (SDR или a-CDR; остатки имеют решающее значение для взаимодействия антитело-антиген) в человеческий каркасный участок и константные области, или (в) трансплантация полных нечеловеческих вариабельных доменов, но их «маскировка» напоминающим человеческий сегментом путем замены поверхностных остатков. Обзор гуманизированных антител и методов их получения см., например, у Almagro и Fransson, Front Biosci 13, 12008, сс. 1619-1633, и они описаны также, например, у Riechmann и др., Nature 332, 1988, сс. 323-329; Queen и др., Proc Natl Acad Sci USA 86, 1989, cc. 10029-10033; U.S. №№5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Jones и др., Nature 321, 1986, cc. 522-525; Morrison и др., Proc Natl Acad Sci 81, 1984, cc. 6851-6855; Morrison и Oi, Adv Immunol 44, 1988, cc. 65-92; Verhoeyen и др., Science 239, 1988, cc. 1534-1536; Padlan, Molec Immun 31(3), 1994, cc. 169-217; Kashmiri и др., Methods 36, 2005, cc. 25-34) (описание трансплантации SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 1991, cc. 489-498 (описание метода «перекладки»); и др., Methods 36, 2005, сс. 43-60 (описание метода «перестановки FR») и Osbourn и др., Methods 36, 2005, сс. 61-68, и Klimka и др., Br J Cancer 83, 2000, сс. 252-260 (описание подхода на основе «целенаправленной селекции» для перестановки FR). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно получать с помощью различных методик, известных в данной области. Человеческие антитела описаны в целом у van Dijk и van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 2001, cc. 368-374 и Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 2008, cc. 450-459. Человеческие вариабельные области могут образовывать часть человеческих моноклональных антител или могут быть получены из них с помощью метода гибридом (см., например, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, изд-во Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, cc. 51-63). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно получать также путем введения иммуногена трансгенному животному, которое модифицировано таким образом, что может продуцировать интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на контрольное заражение антигеном (см., например, Lonberg, Nat Biotech 23, 2005, cc. 1117-1125). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области можно создавать также путем выделения последовательностей вариабельных областей Fv-клона, отобранных из человеческих фаговых дисплейных библиотек (см., например, Hoogenboom и др. в: Methods in Molecular Biology, под ред. и др., изд-во Human Press, Totowa, NJ, 178, 2001, cc. 1-37); и McCafferty и др., Nature 348, 552-554; Clackson и др., Nature 352, 1991, cc. 624-628). Фаг, как правило, экспонирует фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv- (scFv)-фрагментов, либо в виде Fab-фрагментов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты, предлагаемые в настоящем изобретении, создают так, чтобы они обладали повышенной аффинностью связывания, например, с помощью методов, описанных в публикации заявки на патент США №2004/0132066, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. Способность активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, предлагаемой в изобретении, связываться со специфической антигенной детерминантой, можно оценивать количественно либо с помощью твердофазного ферментного анализа (ELISA), либо другими методиками, известными специалисту в данной области, например, с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (осуществляя анализ с использованием системы BIACORE Т100) (Liljeblad и др., Glyco J 17, 2000, cc. 323-329), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 2002, cc. 217-229). Анализы в условиях конкуренции (конкурентные анализы) можно применять для идентификации антитела, фрагмента антитела, антигенсвязывающего домена или вариабельного домена, конкурирующего с референс-антителом за связывание с конкретным антигеном, например, антитела, которое конкурирует с антителом V9 за связывание с CD3. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается референс-антитело. Подробные приведенные в качестве примеров методы картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлены у Morris, «Epitope Mapping Protocols», в: Methods in Molecular Biology, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 66, 1996. При осуществлении приведенного в качестве примера анализа в условиях конкуренции иммобилизованный антиген (например, CD3) инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с антигеном (например, антитело V9), и вторым немеченым антителом, которое подлежит тестированию в отношении его способности конкурировать с первым антителом за связывание с антигеном. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный антиген инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержащем второе немеченое антитело. После инкубации в условиях, обеспечивающих связывание первого антитела с антигеном, избыток несвязанного антитела удаляют и оценивают количество метки, ассоциированной с иммобилизованным антигеном. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным антигеном, существенно снижено в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это свидетельствует о том, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с антигеном (см. Harlow и Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, гл. 14, 1988).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты, предлагаемые в настоящем изобретении, создают так, чтобы они обладали повышенной аффинностью связывания, например, с помощью методов, описанных в публикации заявки на патент США №2004/0132066, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. Способность активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы или антитела, предлагаемой/предлагаемого в изобретении, связываться со специфической антигенной детерминантой, можно оценивать количественно либо с помощью твердофазного ферментного анализа (ELISA), либо другими методиками, известными специалисту в данной области, например, с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (осуществляя анализ с использованием системы BIACORE Т100) (Liljeblad и др., Glyco J 17, 2000, cc. 323-329), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 2002, cc. 217-229). Анализы в условиях конкуренции можно применять для идентификации антитела, фрагмента антитела, антигенсвязывающего домена или вариабельного домена, конкурирующего с референс-антителом за связывание с конкретным антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается референс-антитело. Подробные приведенные в качестве примеров методы картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлены у Morris, ((Epitope Mapping Protocols)), BiMethods in Molecular Biology, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 66, 1996. При осуществлении приведенного в качестве примера анализа в условиях конкуренции иммобилизованный антиген инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с антигеном, и второе немеченое антитело, которое подлежит тестированию в отношении его способности конкурировать с первым антителом за связывание с антигеном. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный антиген инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержащем второе немеченое антитело.

После инкубации в условиях, обеспечивающих связывание первого антитела с антигеном, избыток несвязанного антитела удаляют и оценивают количество метки, ассоциированной с иммобилизованным антигеном. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным антигеном, существенно снижено в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это свидетельствует о том, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с антигеном (см. Harlow и Lane. Antibodies: А Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, гл. 14, 1988).

Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы и антитела, полученные с помощью представленных в настоящем описании методов, можно очищать с использованием известных в данной области методик, таких как жидкостная хроматография высокого разрешения, ионообменная хроматография, гель-электрофорез, аффинная хроматография, гель-фильтрация и т.п. Фактические условия, применяемые для очистки конкретного белка, зависят, в частности, от таких факторов, как чистый заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.д., и они должны быть очевидны специалисту в данной области. Для очистки антитела с помощью аффинной хроматографии можно использовать лиганд, рецептор или антиген, с которым связывается биспецифическое антитело или антитело, связывающееся с DR5. Например, для очистки с помощью аффинной хроматографии биспецифических антител, предлагаемых в изобретении, можно использовать матрикс с белком А или белком G. Например, последовательное применение аффинной хроматографии на белке А или G и гель-фильтрации можно использовать для выделения биспецифического антитела, практически согласно методу, описанному в разделе «Примеры». Чистоту биспецифического антитела или антитела, связывающегося с DR5, можно определять с помощью любого из широкого разнообразия хорошо известных аналитических методов, включая гель-электрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и т.п.

Е. Анализы

Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, например, активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые содержат первый антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1), и второй антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении CD3, и антитела, например, антагонистические антитела, связывающиеся с осью PD-1, и антагонистические антитела к TIM3, представленные в настоящем описании, можно идентифицировать, подвергать скринингу или характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области.

1. Анализы аффинности

Аффинность активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, например, активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, которые содержат первый антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1), и второй антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении CD3, и антител, например, антагонистических антител, которые связываются с осью PD-1, и антагонистических антител к TIM3, представленных в настоящем описании, с соответствующим антигеном, например, FolR1, PD-1, PD-L1, TIM3, можно определять с помощью методов, изложенных в разделе «Примеры», с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR), используя стандартную инструментальную базу, например, устройство BIAcore (фирма GE Healthcare), и рецепторы или белки-мишени, которые можно получать с помощью рекомбинантной экспрессии. Альтернативно этому, связывание активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул и антител, представленных в настоящем описании, с соответствующим антигеном можно оценивать с использованием клеточных линий, экспрессирующих конкретный рецептор или антиген-мишень, например, с помощью проточной цитометрии (FACS).

Величину K_Dможно измерять методом поверхностного плазмонного резонанса с помощью устройства BIACORE® Т100 (фирма GE Healthcare) при 25°С. Для анализа взаимодействия между Fc-областью и Fc-рецепторами меченный с помощью His рекомбинантный Fc-рецептор «захватывают» с использованием антитела к пента-His (фирма Qiagen) («пента-His» представлена в виде SEQ ID NO: 392), иммобилизованного на СМ5-чипах, и биспецифические конструкции применяют в качестве аналитов. В целом, метод состоит в следующем: биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма GE Healthcare) активируют с помощью гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антитело к пента-His (последовательность «пента-His» представлена в SEQ ID NO: 392) разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 5,0 до концентрации 40 мкг/мл перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин для достижения уровня иммобилизации, соответствующего примерно 6500 единиц ответа (RU) связанного белка. После инъекции лиганда инъецируют 1М этаноламин для блокады непрореагировавших групп. Затем осуществляют «захват» Fc-рецептора в течение 60 с в концентрации 4 или 10 нМ. Для кинетических измерений инъецируют четырехкратные серийные разведения биспецифической конструкции (диапазон от 500 до 4000 нМ) в буфере HBS-EP + (фирма GE Healthcare, 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% сурфактанта Р20, рН 7,4) при 25°С со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 120 с.

Для определения аффинности к антигену-мишени биспецифические конструкции «захватывают» с помощью специфического в отношении человеческого Fab антитела (фирма GE Healthcare), которое иммобилизуют на поверхности активированного сенсорного СМ5-чипа согласно методу, описанному для антитела к пента-His («пента-His» представлена в виде SEQ ID NO: 392). Конечное количество сшитого белка соответствовало примерно 12000 RU. Осуществляют «захват» биспецифических конструкций в течение 90 с в концентрации 300 нМ. Антигены-мишени пропускают через проточные ячейки в течение 180 с в диапазоне концентраций от 250 до 1000 нМ со скоростью потока 30 мкл/мин. Мониторинг диссоциации осуществляют в течение 180 с. Различия всех показателей преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного в проточной референс-ячейке. Ответ на стационарной стадии используют для определения константы диссоциации (K_D) с помощью аппроксимации нелинейной кривой изотермы связывания Ленгмюра. Скорость реакции ассоциации (k_on) и реакции диссоциации (k_off) рассчитывают с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программное обеспечение BIACORE ® Т100 Evaluation, версия 1.1.1) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (K_D) рассчитывали как соотношение k_off/k_on (см., например, Chen и др., J Mol Biol 293, 1999, cc. 865-881).

2. Анализы связывания и другие анализы

Согласно одному из объектов изобретения активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, например, активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые содержат первый антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1), и второй антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении CD3, и антитела, например, антагонистические антитела, которые связываются с осью PD-1, и антагонистические антитела к TIM3, предлагаемые в изобретении, тестируют в отношении их антигенсвязывающей активности, например, с помощью известных методов, таких как ELISA, Вестерн-блоттинг и т.д.

Согласно другому объекту изобретения можно использовать анализы в условиях конкуренции для идентификации антитела или фрагмента, которое/который конкурирует со специфическим референс-антителом за связывание с соответствующими антигенами. В конкретных вариантах осуществления изобретения, такое конкурирующие антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается специфическое референс-антитело. Подробное описание примеров методов картирования эпитопов, с которыми связывается антитело, представлено у Morris, «Epitope Mapping Protocols)), в: Methods in Molecular Biology, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 66, 1996. Другие методы описаны в разделе «Примеры».

3. Анализы активности

Одним из объектов изобретения являются анализы, предназначенные для идентификации активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, например, активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, которые содержат первый антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1), и второй антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении CD3, и антител, например, антагонистических антител, которые связываются с осью PD-1, и антагонистических антител к TIM3, представленных в настоящем описании, в отношении наличия биологической активности. Биологическая активность может включать, например, индукцию ДНК-фрагментации, индукцию апоптоза и лизис клеток-мишеней. Предложены также антитела, обладающие указанной биологической активностью in vivo и/или in vitro.

В некоторых вариантах осуществления изобретения активирующую Т-клетку антигенсвязывающую молекулу и антитело, предлагаемую/предлагаемое в изобретении, тестировали в отношении указанной биологической активности. Анализы, предназначенные для оценки лизиса клеток (например, на основе оценки высвобождения ЛДГ) или апоптоза (например, с помощью TUNEL-анализа) хорошо известны в данной области. Анализы оценки ADCC или CDC описаны в WO 2004/065540 (см. пример 1 в указанной заявке), полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Ж. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, например, активирующей Т-клетку биспецифической антигенсвязывающей молекулы, которая содержит первый антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении фолатного рецептора 1 (FolR1), и второй антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении CD3, и антител, например, антагонистических антител, которые связываются с осью PD-1, и антагонистических антител к TIM3, представленных в настоящем описании, получают путем смешения указанных активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул или антител, имеющих необходимую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями ( Pharmaceutical Sciences, под ред. A. Osol, 1980) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, они включают (но, не ограничиваясь только ими) буферы, такие как фосфатный, цитратный, ацетатный буферы, а также буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и мета-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (содержащие менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; содержащие металл комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В контексте настоящего описания фармацевтически приемлемые носители включают также диспергирующие агенты интерстициальных лекарственных средств, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидаз (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, фирма Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и методы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в публикациях патентов США №№2005/0260186 и 2006/0104968. Согласно одному из объектов изобретения sHASEGP объединяют с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в US №6267958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в US №6171586 и WO 2006/044908, последние композиции включают гистидин-ацетатный буфер.

Композиция, предлагаемая в изобретении, может содержать также более одного действующего вещества, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно вещества с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Такие действующие вещества должны присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для решения поставленной задачи.

Действующие вещества можно включать также в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например в гидроксипропилметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Pharmaceutical Sciences, под ред. A. Osol, 1980.

Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие антитело, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы.

Композиции, предназначенные для применения in vivo, как правило, должны быть стерильными. Это легко можно осуществлять путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

3. Терапевтические способы и композиции

Представленные в настоящем описании терапевтические комбинации, которые содержат одну или несколько активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул и антагонистическое антитело, связывающееся с осью PD-1, и необязательно, антагонист TIM3, можно применять в терапевтических способах.

Одним из объектов изобретения являются активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с фолатным рецептором 1 (FolR1) и CD3, предназначенные для применения в качестве лекарственного средства, в комбинации с антагонистическим антителом, связывающимся с осью PD-1. Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с FolR1 и CD3, предназначенные для применения в комбинации с антагонистическим антителом, связывающимся с осью PD-1, для применения в способе лечения. В некоторых вариантах осуществления изобретения комбинация содержит также антагонист TIM3, например, антагонистическое антитело к TIM3. Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с FolR1 и CD3, и антагонистические антитела, которые связываются с осью PD-1, для применения в способе лечения индивидуума, который имеет рак, включающий введение индивидууму в эффективном количестве активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, которые связываются с FolR1 и CD3, и антагонистического антитела, которое связывается с осью PD-1. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения способ включает также введение индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одного антагониста TIM3, например, описанного ниже. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения предпочтительно представляет собой человека. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанный рак представляет собой рак поджелудочной железы, саркому или колоректальную карциному. В других вариантах осуществления изобретения рак представляет собой колоректальный рак, саркому, рак головы и шеи, плоскоклеточые карциномы, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, немелкоклеточную карциному легкого, мелкоклеточный рак легкого или мезотелиому. В вариантах осуществления изобретения, в которых рак представляет собой рак молочной железы, рак молочной железы может представлять собой трижды негативный рак молочной железы.

Следующим объектом изобретения является применение терапевтической комбинации, содержащей активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с FolR1 и CD3, и антагонистическое антитело, которое связывается с осью PD-1, для производства или приготовления лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления изобретения комбинация содержит также антагонист TIM3. В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения рака. В другом варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения рака, включающем введение индивидууму, который имеет рак, в эффективном количестве лекарственного средства. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения способ включает также введение индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, указанного ниже. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может представлять собой человека.

Следующим объектом изобретения является способ лечения рака. В одном из вариантов осуществления изобретения способ включает введение индивидууму, который имеет рак, в эффективном количестве терапевтической комбинации, содержащей активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с FolR1 и CD3, и антагонистическое антитело, которое связывается с осью PD-1. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения способ включает также введение индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, указанного ниже. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство представляет собой антагонистическое антитело к TIM3. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может представлять собой человека. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанный рак представляет собой рак поджелудочной железы, саркому или колоректальную карциному. В других вариантах осуществления изобретения рак представляет собой колоректальный рак, саркому, виды рака головы и шеи, плоскоклеточые карциномы, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, немелкоклеточную карциному легкого, мелкоклеточный рак легкого или мезотелиому.

Следующим объектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие любую из представленных в настоящем описании активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, которые связываются с FolR1 и CD3, например, для применения в любом из указанных выше терапевтических способов, и антагонистическое антитело, которое связывается с осью PD-1. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любую из представленных в настоящем описании активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, которые связываются с FolR1, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любую из активирующих Т-клетки биспецифических антигенсвязывающих молекул, которые связываются с FolR1 и CD3, и представленное в настоящем описании антагонистическое антитело, которое связывается с осью PD-1, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, указанное ниже.

Биспецифическое антитело можно вводить любыми приемлемыми путями, включая парентеральный, внутрилегочный и интраназальный, и при необходимости применять для местной обработки, осуществлять введение в повреждение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование можно осуществлять любым приемлемым путем, например, путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости, в том числе, от того, является ли лечение кратковременным или хроническим. Можно применять различные схемы дозирования, включая (но, не ограничиваясь только ими) однократное введение или несколько введений в различные моменты времени, болюсное введение и пульсирующую инфузию.

Биспецифические антитела можно включать в состав композиций, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой.

Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину заболевания, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам. Биспецифическое антитело можно, но это не является обязательным, включать в композицию в сочетании с одним или несколькими другими агентами, которые в настоящее время применяют для предупреждения рассматриваемого заболевания. Эффективное количество указанных других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, типа нарушения или лечения и других указанных выше факторов. Их, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием таких же путей введения, которые указаны в настоящем описании, или в количестве, составляющем от 1 до 99% от дозы, указанной в настоящем описании, или в любой дозе и с помощью любого пути, который по данным эмпирической/клинической оценки является пригодным.

Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая доза биспецифического антитела должна зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, серьезности и течения болезни, применяют ли биспецифическое антитело, для профилактических или терапевтических целей, предшествующей терапии, истории болезни пациента и ответа на биспецифическое антитело, а также предписания лечащего врача. Биспецифическое антитело можно вводить пациенту однократно или в виде серий обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-10 мг/кг) биспецифического антитела или нового антитела, которое связывается с DR5, может представлять собой начальную возможную дозу для введения пациенту, например, с помощью одной или нескольких отдельных обработок или с помощью непрерывной инфузии. Одним из примеров типичных суточных доз может являться доза, составляющая от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. При использовании повторных введений в течение нескольких дней или более длительного периода времени, в зависимости от состояния, лечение, как правило, следует продолжать до достижения подавления симптомов заболевания. Одним из примеров доз биспецифического антитела является доза, составляющая от примерно 0,05 до примерно 10 мг/кг. Так, пациенту можно вводить одну или несколько следующих доз: примерно 0,5, 2,0, 4,0 или 10 мг/кг. Указанные дозы можно вводить дробно, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати, например, примерно шесть доз биспецифического антитела). Можно применять начальную повышенную ударную дозу с последующим введением одной или нескольких более низких доз. Однако можно применять другие схемы введения доз. С помощью общепринятых методов и анализов можно легко осуществлять мониторинг действия указанной терапии.

Очевидно, что любые из вышеуказанных композиций или терапевтических способов можно применять с использованием иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, вместо или в дополнение к активирующим Т-клетки биспецифическим антигенсвязывающим молекулам, которые связываются с FolR1 и CD3, и антагонистическому антителу, которое связывается с осью PD-1, и необязательно антагонистическому антителу к TIM3.

II. Изделия

Другим объектом изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения, предупреждения и/или диагностирования указанных выше нарушений. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковку, которые размещены на контейнере или вложены в него. Приемлемыми контейнерами являются, например банки, пузырьки, шприцы, пакеты для внутривенного раствора и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для IV-раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой биспецифическое антитело, а дополнительное действующее вещество представляет собой дополнительное химиотерапевтическое средство, указанное в настоящем описании. На этикетке или листовке-вкладыше в упаковку указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит биспецифическое антитело; и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Согласно этому варианту осуществления изобретения изделие может содержать листовку-вкладыш в упаковку, которая содержит информацию о том, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно включать второй (или третий) контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Как должно быть очевидно, любое из указанных выше изделий может включать иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, вместо или в дополнение к активирующим Т-клетки биспецифическим антигенсвязывающим молекулам, которые связываются с FolR1 и CD3, и антагонистическому антителу, которое связывается с осью PD-1, и необязательно антагонистическому антителу к TIM3.

III. Примеры

Ниже представлены примеры способов и композиций, предлагаемых в изобретении. Как должно быть очевидно, в целом можно воплощать на практике различные другие варианты осуществления изобретения с учетом представленного выше описания изобретения.

Общие методы

Методы рекомбинантной ДНК

Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии применяли согласно инструкциям производителей. Общую информацию, касающуюся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческих иммуноглобулинов, см. у: Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во NIH, публикация N 91-3242, 1991.

Секвенирование ДНК

Последовательности ДНК определяли путем стандартного секвенирования двух цепей.

Синтез генов

Требуемые сегменты генов либо создавали с помощью ПЦР с использованием соответствующих матриц, либо синтезировали на фирме Geneart AG (Регенсбург, Германия) из синтетических олигонуклеотидов и ПЦР-продуктов посредством автоматического синтеза генов. В тех случаях, когда точная генная последовательность не была доступна, создавали олигонуклеотидные праймеры на основе последовательностей ближайших гомологов и гены выделяли с помощью ОТ-ПЦР из РНК, полученной из соответствующей ткани. Сегменты генов, фланкированные единичными сайтами, распознаваемыми рестрикционными эндонуклеазами, клонировали в стандартных клонирующих/секвенирующих векторах. Плазмидную ДНК очищали из трансформированных бактерий и определяли концентрацию с помощью УФ-спектроскопии. Последовательность ДНК субклонированных фрагментов генов подтверждали ДНК-секвенированием. Создавали сегменты генов с требуемыми сайтами рестрикции, позволяющими субклонировать их в соответствующих экспрессионных векторах. Все конструкции создавали с 5'-концевой последовательностью ДНК, кодирующей лидерный пептид, который направляет секрецию белков в эукариотических клетках.

Выделение первичных человеческих пан-Т-клеток из РВМС

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали путем центрифугирования в градиенте плотности Histopaque из обогащенных лимфоцитами препаратов (лейкоцитарные пленки), полученных из местных банков крови или из свежей крови здоровых доноров. В целом, метод состоял в следующем: кровь разводили стерильным ЗФР и осторожно наслаивали на градиент Histopaque (фирма Sigma, Н8889). После центрифугирования в течение 30 мин при 450×g при комнатной температуре (отключенное тормозное устройство), часть плазмы, находящуюся над содержащей РВМС интерфазой, отбрасывали. РВМС переносили в новые 50-миллилитровые фальконовские пробирки и пробирки заполняли ЗФР до полного объема 50 мл. Смесь центрифугировали при комнатной температуре в течение 10 мин при 400×g (включенное тормозное устройство). Супернатант отбрасывали и дебрис РВМС отмывали дважды стерильным ЗФР (стадии центрифугирования при 4°С в течение 10 мин при 350×g). Осуществляли автоматический подсчет полученной популяции РВМС (устройство ViCell) и хранили в среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS и 1% L-аланил-L-глутамина (фирма Biochrom, K0302) при 37°С, 5% СО₂ в инкубаторе вплоть до начала анализа.

Для получения фракции, обогащенной Т-клетками, из РВМС, использовали набор для выделения пан-Т-клеток (Pan Т Cell Isolation Kit II) (фирма Miltenyi Biotec, №130-091-156) согласно инструкциям производителя. В целом, метод состоял в следующем: клеточный дебрис разводили, используя 40 мкл холодного буфера на 10 миллионов клеток (ЗФР с 0,5% БСА, 2 мМ ЭДТА, простерилизованный фильтрацией), и инкубировали, используя 10 мкл коктейля биотин-антитело на 10 миллионов клеток, в течение 10 мин при 4°С. Добавляли 30 мкл холодного буфера и 20 мкл магнитных гранул с антителом к биотину на 10 миллионов клеток и смесь инкубировали в течение еще 15 мин при 4°С. Клетки промывали, добавляя буфер в объеме, превышающем в 10-20 раз имевшийся объем, и затем осуществляли стадию центрифугирования при 300×g в течение 10 мин. Вплоть до 100 миллионов клеток ресуспендировали в 500 мкл буфера. Магнитную сепарацию немеченых человеческих пан-Т-клеток осуществляли с помощью LS-колонок (фирма Miltenyi Biotec, №130-042-401) согласно инструкциям производителя. Осуществляли автоматический подсчет полученной популяции Т-клеток (устройство ViCell) и хранили их в среде AIM-V при 37°С, 5% СО₂ в инкубаторе вплоть до начала анализа (не более 24 ч).

Выделение первичных человеческих наивных Т-клеток из РВМС

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности Histopaque из обогащенных лимфоцитами препаратов (лейкоцитарные пленки), полученных из местных банков крови или из свежей крови здоровых доноров. Для получения фракции, обогащенной Т-клетками из РВМС, использовали набор для выделения наивных CD8⁺-Т-клеток (Naive CD8⁺Т cell isolation Kit) фирмы Miltenyi Biotec (№130-093-244), согласно инструкциям производителя, но, пропуская последнюю стадию выделения CD8⁺-Т-клеток (см. также описание выделения первичных человеческих пан-Т-клеток).

Выделение мышиных пан-Т-клеток из спленоцитов

Изымали селезенки из мышей линии C57BL/6, переносили их в С-пробирку GentleMACS (фирма Miltenyi Biotech, №130-093-237), содержащую MACS-буфер (ЗФР + 0,5% БСА + 2 мМ ЭДТА), и расщепляли с помощью устройства для диссоциации тканей GentleMACS с получением суспензии единичных клеток согласно инструкциям производителя. Клеточную суспензию пропускали через фильтр предварительной очистки для удаления недиссоциированных частиц ткани. После центрифугирования при 400×g в течение 4 мин при 4°С добавляли буфер для лизиса ACK для лизирования эритроцитов (инкубация в течение 5 мин при комнатной температуре). Оставшиеся клетки дважды промывали MACS-буфером, подсчитывали и применяли для выделения мышиных пан-Т-клеток. Негативную (магнитную) селекцию осуществляли, используя набор для выделения пан-Т-клеток фирмы Miltenyi Biotec (№130-090-861) согласно инструкциям производителя. Осуществляли автоматический подсчет полученной популяции Т-клеток (устройство ViCell) и сразу применяли для дополнительных анализов.

Выделение первичных РВМС обезьян циномолгус из гепаризированной крови

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали путем центрифугирования в градиенте плотности из свежей крови здоровых обезьян циномолгус следующим образом: гепаринизированную кровь разводили в соотношении 1:3 стерильным ЗФР и среду Lymphoprep (фирма Axon Lab, №1114545) разводили до 90% стерильным ЗФР. Два объема разведенной крови наслаивали на один объем разведенного градиента плотности и фракцию РВМС разделяли путем центрифугирования в течение 30 мин при 520×g без торможения при комнатной температуре. Полосу, соответствующую РВМС, переносили в свежую 50-миллилитровую фальконовскую пробирку, и промывали стерильным ЗФР путем центрифугирования в течение 10 мин при 400×g при 4°С. Осуществляли одну стадию низкоскоростного центрифугирования для удаления тромбоцитов (15 мин при 150×g, 4°С) и осуществляли автоматический подсчет полученной популяции РВМС (устройство ViCell) и сразу применяли для дополнительных анализов.

Пример 1

Очистка слияний биотинилированный фолатный рецептор-Fc

Для создания новых антител к человеческому FolR1 конструировали указанные ниже антигены и «инструменты» для скрининга в виде одновалентных слитых белков, содержащих Fc (внеклеточный домен антигена, сцепленный с шарнирной областью Fc с «выступом», который совместно экспрессировали с молекулой, содержащей Fc с «впадиной»). Гены антигена синтезировали (фирма Geneart, Регенсбург, Германия) на основе последовательностей, полученных из GenBank или SwissProt, и встраивали в экспрессионные векторы для создания слитых белков, содержащих Fc с «выступом», с С-концевой Avi-меткой для биотинилирования in vivo или in vitro. Биотинилирование in vivo осуществляли путем совместной экспрессии бактериального гена birA, кодирующего бактериальную биотинлигазу, в процессе получения. Экспрессию всех генов осуществляли под контролем химерного промотора MPSV на плазмиде, содержащей элемент oriP для поддержания стабильности плазмид в содержащих EBNA клеточных линиях.

Для получения биотинилированных мономерных слитых молекул антиген/Fc, клетки HEK293 EBNA, растущие в суспензии на экспоненциальной фазе роста, совместно трансфектировали тремя векторами, кодирующими два компонента слитого белка (цепи с «выступом» и с «впадиной»), а также BirA, фермент, необходимый для реакции биотинилирования. Соответствующие векторы применяли в соотношении 9,5:9,5:1 («антиген ECD-Fc с «выступом»-avi-метка»:«Fc с «впадиной»:«BirA»).

Для получения белка во встряхиваемых колбах вместимостью 500 мл высевали 400 млн клеток HEK293 EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 5 мин при 210 g и супернатант заменяли предварительно нагретой средой CD СНО. Экспрессионный векторы ресуспендировали в 20 мл среды CD СНО, содержащей 200 мкг векторной ДНК. После добавления 540 мкл полиэтиленимина (ПЭИ) раствор перемешивали в течение 15 с и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/ПЭИ, переносили в 500-миллилитровую встряхиваемую колбу и инкубировали в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% СО₂. После инкубации добавляли 160 мл среды F17 и клетки культивировали в течение 24 ч. Через один день после трансфекции к культуре добавляли 1 мМ вальпроевую кислоту и 7% Feed 1 (фирма Lonza). Среду для производства дополняли также 100 мкМ биотином. После культивирования в течение 7 дней супернатант собирали путем осаждения центрифугированием в течение 15 мин при 210×g. Раствор стерилизовали фильтрацией (фильтр с размером пор 0,22 мкм), дополняли азидом натрия до конечной концентрации 0,01% (мас./об.), выдерживали при 4°С.

Секретированные белки очищали из супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии на белке А с последующей гель-фильтрацией. Для осуществления аффинной хроматографии супернатант вносили на колонку HiTrap ProteinA HP (CV = 5 мл, фирма GE Healthcare), уравновешенную 40 мл буфера, содержащего 20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, рН 7,5. Несвязанный белок удаляли промывкой, используя равный по меньшей мере 10 объемам колонки объем буфера, содержащего 20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, рН 7,5. Связанный белок элюировали, применяя линейный рН-градиент, который создавали, используя равный 20 объемам колонки объем буфера, содержащего 20 мМ цитрат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин, рН 3,0. Затем колонку промывали, используя равный 10 объемам колонки объем буфера, содержащего 20 мМ цитрат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин, рН 3,0.

Величину рН собранных фракций регулировали, добавляя 1/10 (об./об.) 0,5 М фосфат кальция, рН 8,0. Белок концентрировали и фильтровали перед внесением на колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ гистидин, 140 мМ хлорид натрия, рН 6,0.

Концентрацию белка определяли путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, использую коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу FolR1-Fc-слияния анализировали с помощью капиллярного электрофореза в присутствии ДСН (КЭ-ДСН) с восстановителем и без него (система Caliper LabChip GXII, фирма Perkin Elmer) согласно инструкциям производителя.

Содержание агрегатов в образцах белков анализировали с помощью аналитической колонки для гель-фильтрации TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh), уравновешенной в подвижном буфере, содержащем 25 мМ K₂HPO₄, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлорид L-аргинина, 0,02% (мас./об.) NaN₃, рН 6,7, при 25°С.

Очищенные слитые белки антиген-Fc анализировали с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса с использованием поступающих в продажу антител для подтверждения правильной и встречающейся в естественных условиях конформации антигенов (данные не представлены).

Пример 2

Создание общей легкой цепи, обладающей специфичностью в отношении CD3ε

Активирующие Т-клетку биспецифические молекулы, представленные в настоящем описании, содержат по меньшей мере один связывающий CD3 фрагмент. Этот фрагмент можно создавать путем иммунизации лабораторных животных, скрининга фаговой библиотеки или с использованием известных антител к CD3. Общую легкую цепь, обладающую специфичностью в отношении CD3ε, создавали путем гуманизации легкой цепи родительского мышиного антитела к CD3ε (СН2527). Для гуманизации антитела из организма кроме человека CDR-остатки из нечеловеческого антитела (донора) необходимо трансплантировать в каркасный участок человеческого (акцепторного) антитела. Как правило, последовательности акцепторного каркасного участка отбирают путем выравнивания последовательности донора с коллекцией потенциальных акцепторных последовательностей и выбора одной, которая либо обладает достаточной гомологией с донором, либо характеризуется наличием сходных аминокислот в некоторых положениях, имеющих решающее значение с точки зрения структуры и активности. В данном случае поиск акцепторного каркасного участка антитела осуществляли путем выравнивания последовательности мышиного VL-домена родительского антитела с коллекцией последовательностей человеческой зародышевой линии и отбора человеческой последовательности, характеризующейся высокой степенью идентичности последовательности. Неожиданно было установлено, что хорошее соответствие с точки зрения гомологии последовательности каркасного участка имеет место в случае довольно редко встречающейся человеческой легкой цепи, относящейся к семейству 7 V-доменов лямбда-типа, более точно hVL_7_46 (номенклатура IMGT, GenBank, код доступа Z73674). Вследствие этого указанная редко встречающаяся человеческая легкая цепь была выбрана в качестве акцепторного каркасного участка для гуманизации легкой цепи СН2527. Три гипервариабельных участка (CDR) вариабельного домена мышиной легкой цепи были трансплантированы в указанный акцепторный каркасный участок. Поскольку область каркасного участка 4 не является частью вариабельной области V-гена зародышевой линии, то выравнивание в этой области (J-элемент) осуществляли индивидуально. Таким образом, последовательность IGLJ3-02 была выбрана для гуманизации указанной легкой цепи.

Было создано тринадцать гуманизированных вариантов (CH2527-VL7_46-1-VL7_46-10, VL7_46-12 - VL7_46-14). Они различались остатками каркасного участка (и их комбинациями), которые были подвергнуты обратной мутации в направлении последовательности мышиного V-домена, или CDR-остатками (определение по Кэботу), которые могли сохраниться идентичными остаткам в последовательности человеческой зародышевой линии. Ниже представлены остатки каркасного участка, находящиеся вне CDR, которые посредством обратной мутации были превращены в мышиные остатки в конечном варианте гуманизированного VL-домена варианта VL7_46-13 (перечислены мышиные остатки): V36, Е38, F44, G46, G49 и G57, соответственно. Человеческий J-элемент IGLJ3-02 был на 100% идентичен J-элементу мышиного родительского антитела.

Пример 3

Оценка методом SPR гуманизированных вариантов, обладающих специфичностью в отношении CD3ε

Оценивали гуманизированные варианты VL в виде химеры в формате «2+1 классическая», т.е. когда гуманизированные V-домены легкой цепи спарены с мышиными V-доменами тяжелой цепи. Оценку методом SPR проводили с использованием устройства ProteOn XPR36 (фирма Bio-Rad). Более точно процедура заключалась в следующем: варианты иммобилизовали непосредственно из супернатанта культуры на дериватизированном антителом к Fab сенсорном чипе GLM (козий античеловеческий IgG, F(ab')2-фрагментспецифический, фирма Jackson ImmunoResearch) в вертикальной ориентации. Для оценки связывания с CD3ε человека и обезьян циномолгус последовательно инъецировали в горизонтальной ориентации в одной концентрации, перечисленные ниже аналиты: hu CD3ε(-1-26)-Fc(«выступ»)-avi (ID807), 3 мкМ, и су CD3ε-(-1-26)-Fc(«выступ»)-Avi-Рс(«впадина») (ID873), 2,5 мкМ, соответственно. Ответы, характеризующие связывание, качественно сравнивали со связыванием мышиной контрольной конструкции и ранжировали следующим образом: + (выявлен сопоставимый уровень связывания), ± (выявлен пониженный уровень связывания) и - (не выявлено связывания). «Захватывающее» антитело регенерировали после каждого цикла иммобилизации лиганда и связывания аналита, и после окончания исследования повторно инъецировали мышиную конструкцию для подтверждения активности «захватывающей» поверхности. Результаты обобщены в таблице 3.

Таблица 3. Качественная оценка методом SPR связывания конструкций, содержащих гуманизированные варианты легкой цепи, объединенные с мышиной тяжелой цепью СН2527. В конечном итоге был выбран только гуманизированный вариант легкой цепи CH2527-VL7_46-13, выделенный жирным шрифтом, который характеризовался сопоставимым связыванием с CD3ε человека и обезьян циномолгус.

Пример 4

Свойства гуманизированной общей легкой цепи, обладающей специфичностью в отношении CD3ε

Вариант V-домена легкой цепи, который был выбран для гуманизированной лидерной молекулы, представлял собой VL7_46-13. Определяли степень гуманизации, т.е. гомологию последовательности гуманизированного V-домена с последовательностью V-домена человеческой зародышевой линии. Для VL7_46-13 общая степень идентичности последовательности с наиболее близким гомологом человеческой зародышевой линии составляла 65% до гуманизации и 80% после гуманизации. Если исключить CDR-участки, то степень идентичности последовательности с наиболее близким гомологом человеческой зародышевой линии составляла 92%. Как продемонстрировано в таблице 3, VL7_46-13 является единственным гуманизированным вариантом VL из панели, включающей 13 вариантов, который характеризовался уровнем связывания, сопоставимым с уровнем связывания родительского мышиного антитела, и сохранял также перекрестную реактивность с CD3ε обезьян циномолгус. Этот результат свидетельствует о том, что гуманизация мышиного VL-домена без потери аффинности связывания с CD3ε, является нетривиальной задачей, которая требует осуществления нескольких обратных мутаций для восстановления остатков мышиного каркасного участка (в частности G46), сохраняя при этом G24 в CDR1. Кроме того, этот результат демонстрирует, что VL-домен играет решающую роль в распознавании мишени. Важным является то, что гуманизированный VL-домен VL7_46-13 на основе редко встречающейся человеческой зародышевой линии, относящийся к семейству 7 V-доменов лямбда-типа и сохраняющий аффинность и специфичность в отношении CD3ε, пригоден также для применения в качестве общей легкой цепи в фаговых дисплейных библиотеках антител Fab-формата и позволяет осуществлять успешную селекцию новых специфичностей, что значительно облегчает создание и производство биспецифических молекул, связывающихся с CD3ε и, например, с мишенью на опухоли, и обладающих одной и той же «общей» легкой цепью.

Пример 5

Создание фаговой дисплейной библиотеки антител с использованием общей легкой цепи на основе человеческой зародышевой линии, происходящей из HVK1-39

В нескольких подходах к созданию биспецифических антител, напоминающих полноразмерный человеческий IgG, применяли модификации Fc-области, которые индуцировали гетеродимеризацию двух различных тяжелых цепей. Соответствующие примеры включают технологии «knobs-into-holes» (Merchant и др., Nat Biotechnol.; 16(7), июль 1998 г., сс. 677-681), технологию SEED (Davis и др., Protein Eng Des Sel.; 23(4), апрель 2010 г., cc. 195-202) и технологии на основе электростатического взаимодействия (Gunasekaran и др., J Biol Chem.; 285(25), июнь 2010 г., сс. 19637-19646). Хотя эти подходы позволяют осуществлять эффективную гетеродимеризацию двух различных тяжелых цепей, правильное спаривание когнатных легких и тяжелых цепей остается проблемой. Применение общей легкой цепи (LC) может позволить решить эту проблему (Merchant и др., Nat Biotech 16, 1998, сс. 677-681).

В настоящем изобретении описано создание библиотеки антител для дисплея на фаге М13. Важным является то, что согласно изобретению создают многокаркасную библиотеку для тяжелой цепи с одной постоянной (или «общей) легкой цепью. Указанная библиотека предназначена для создания мультиспецифических антител без необходимости применения сложных технологий для того, чтобы избежать ошибочного спаривания легких цепей.

Благодаря применению общей легкой цепи получение указанных молекул может быть облегчено, поскольку в этом случае более не происходит ошибочного спаривания и облегчается выделение высокоочищенного биспецифического антитела. По сравнению с другими форматами применение Fab-фрагментов в качестве конструктивных элементов в отличие, например, от применения scFv-фрагментов, приводит к более высокой термостабильности и отсутствию агрегирования scFv и образования межмолекулярных scFv.

Создание библиотеки

Ниже описано создание библиотеки антител для дисплея на фаге М13. Важным является то, что согласно изобретению создают многокаркасную библиотеку для тяжелой цепи с одной постоянной (или «общей) легкой цепью.

Согласно изобретению в библиотеке используют следующие тяжелые цепи (коды доступа в GenBank указаны в скобках):

IGHV1-46*01 (Х92343) (SEQ ID NO: 104),

IGHVl-69*06 (L22583), (SEQ ID NO: 105),

IGHV3-15*01 (X92216), (SEQ ID NO: 106),

IGHV3-23*01 (M99660), (SEQ ID NO: 107),

IGHV4-59*01 (AB019438), (SEQ ID NO: 108),

IGHV5-51*01 (M99686), (SEQ ID NO: 109).

Во всех тяжелых цепях применяли IGHJ2 в качестве J-элемента, за исключением IGHV 1-69*06, в которой применяли последовательность IGHJ6. Осуществляли рандомизацию CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3. Для CDR-H1 и CDR-Н2 была выбрана стратегия «мягкой» рандомизации, и рандомизацию олигонуклеотидов осуществляли таким образом, чтобы кодон, кодирующий аминокислоту последовательности зародышевой линии, присутствовал в 50% случаев. На долю всех остальных аминокислот, за исключением цистеина, в сумме приходились оставшиеся 50%. В CDR-H3, в котором отсутствовала аминокислота зародышевой линии вследствие присутствия генетического D-элемента, создавали такие олигонуклеотиды, которые допускали применение рандомизированных вставок между V-элементом и J-элементом длиной от 4 до 9 аминокислот. Олигонуклеотиды, содержавшиеся в этих рандомизированных участках, включали, например, следующие аминокислоты. Три аминокислоты G/Y/S присутствовали в количестве 15% каждая, аминокислоты A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E присутствовали в количестве 4,6% каждая.

Примеры методов создания библиотек антител описаны у Hoogenboom и др., Nucleic Acids Res., 19, 1991, сс. 4133-413; Lee и др., J. Mol. Biol., 340, 2004, cc. 1073-1093.

Легкую цепь получали на основе человеческой последовательности hVK1-39 и применяли в немодифицированной и нерандомизированной форме. Это должно гарантировать, что можно использовать одну и ту же легкую цепь для других проектов без дополнительных модификаций.

Пример селекции с использованием библиотеки:

Селекцию с использованием библиотек с созревшей аффинностью осуществляли в растворе согласно представленной ниже процедуре с использованием мономерного и биотинилированного внеклеточного домена антигена-мишени X.

1. 10¹² фагмидных частиц каждой библиотеки связывали с 100 нМ биотинилированным растворимым антигеном в течение 0,5 ч в общем объеме 1 мл. 2. Биотинилированный антиген «захватывали» и выделяли специфически связанные фаговые частицы путем добавления ~5×10⁷ покрытых стрептавидином магнитных гранул в течение 10 мин. 3. Гранулы промывали с использованием 5-10×1 мл ЗФР/Твин 20 и 5-10×1 мл ЗФР. 4. Элюцию фаговых частиц осуществляли в течение 10 мин путем добавления 1 мл 100 мМ ТЭА (триэтиламин) и нейтрализации путем добавления 500 мкл 1М Трис/HCl, рН 7,4, и 5. На последующих раундах селекции осуществляли повторное заражение бактерии штамма TG1 Е. coli на экспоненциальной фазе роста, заражение хелперным фагом VCSM13 и последующее осаждение фагмидных частиц с помощью ПЭГ/NaCl. Селекции проводили, осуществляя 3-5 раундов с использованием постоянных или снижающихся (от 10^-7 М до 2×10^-9 М) концентраций антигена. При осуществлении раунда 2 проводили «захват» комплексов антиген/фаг с использованием нейтравидиновых планшетов вместо стрептавидиновых гранул. Все реакционные смеси для связывания дополняли либо 100 нМ бычьим сывороточным альбумином, либо порошкообразным обезжиренным молоком для конкуренции с нежелательными клонам, возникающими вследствие простого липкого связывания антител с пластиковой подложкой.

Селекции проводили, осуществляя три или четыре раунда с использованием снижающихся концентраций антигена, начиная с 100 нМ и снижая их до 5 нМ в конечном раунде селекции. Специфические связывающие агенты определяли по сигналам, превышающим примерно в 5 раз фоновый уровень, и идентифицировали с помощью ELISA. Специфические связывающие агенты идентифицировали с помощью ELISA следующим образом: по 100 мкл 10 нМ биотинилированного антигена на лунку иммобилизовали на сенсибилизированные нейтравидином планшеты. Добавляли содержащие Fab бактериальные супернатанты и проводили обнаружение связанных Fab по их Flag-меткам с использованием вторичного антитела анти-Flag/HRP. Позитивные по данным ELISA клоны экспрессировали в бактериях в виде растворимых Fab-фрагментов в 96-луночном формате и проводили эксперимент по скринингу супернатантов в отношении кинетических характеристик с помощью SPR-анализа с использованием ProteOn XPR36 (фирма BioRad). Идентифицировали экспрессирующие Fab клоны с наиболее высокими константами аффинности и секвенировали соответствующие фагмиды. Для дополнительной характеризации последовательности Fab амплифицировали с помощью ПЦР из фагмид и клонировали с использованием соответствующих сайтов рестрикции в экспрессионных векторах для человеческого IgG1 с целью получения в клетках млекопитающих.

Создание библиотеки антител для фагового дисплея с использованием гуманизированной CD3ε-специфической общей легкой цепи

В данном разделе описано создание библиотеки антител для дисплея на фаге М13. Важным является то, что согласно изобретению создавали многокаркасную библиотеку для тяжелой цепи с одной постоянной (или «общей) легкой цепью. Эту библиотеку создавали для конструирования содержащих Fc, но не обладающих активностью в отношении связывания с FcgR, активирующих Т-клетки биспецифических антител изотипа IgG1 P329G LALA или IgG4 SPLE PG, в которых один или два Fab распознают опухолевый поверхностный антиген, экспрессируемый на опухолевой клетке, в то время как оставшееся Fab-плечо антитела распознает CD3ε на Т-клетке.

Создание библиотеки

Ниже описано создание библиотеки антител для дисплея на фаге М13. Важным является то, что согласно изобретению создавали многокаркасную библиотеку для тяжелой цепи с одной постоянной (или «общей) легкой цепью. Эту библиотеку создавали исключительно для конструирования содержащих Fc, но не обладающих активностью в отношении связывания с FcgR на Т-клетках, биспецифических антител изотипа IgG1 P329G LALA или IgG4 SPLE PG.

Разнообразие вносили посредством рандомизации олигонуклеотидов только в CDR3 различных тяжелых цепей. Методы создания библиотек антител хорошо известны в данной области и описаны у Hoogenboom и др., Nucleic Acids Res., 19, 1991, сс. 4133-4413; или у Lee и др., J. Mol. Biol., 340, 2004, сс. 1073-1093.

При создании библиотеки применяли следующие тяжелые цепи:

IGHV1-46*01 (Х92343), (SEQ ID NO: 104),

IGHV1-69*06 (L22583), (SEQ ID NO: 105),

IGHV3-15*01 (X92216), (SEQ ID NO: 106),

IGHV3-23*01 (M99660), (SEQ ID NO: 107),

IGHV4-59*01 (AB019438), (SEQ ID NO: 108),

IGHV5-51*01 (M99686), (SEQ ID NO: 109).

В библиотеке применяли легкую цепь, полученную на основе специфического в отношении CD3ε человека и обезьян циномолгус гуманизированного антитела СН2527: (VL7_46-13; SEQ ID NO: 112). Эту легкую цепь не рандомизировали и применяли без дополнительных модификаций для того, чтобы гарантировать совместимость с другими биспецифическими связывающими агентами.

Во всех тяжелых цепях применяли IGHJ2 в качестве J-элемента, за исключением IGHV 1-69*06, в которой применяли последовательность IGHJ6. Стратегия рандомизации была сфокусирована только на CDR-H3, и создавали ПЦР-олигонуклеотиды, которые позволяли применять рандомизированные вставки между V-элементом и J-элементом длиной от 4 до 9 аминокислот.

Пример 6

Отбор фрагментов антител к FolR1 из библиотек общих легких цепей (CLCL) (содержащих легкую цепь со специфичностью в отношении CD3ε)

Антитела 16А3, 15А1, 18D3, 19Е5, 19А4, 15Н7, 15В6, 16D5, 15Е12, 21D1, 16F12, 21А5, 21G8, 19Н3, 20G6 и 20Н7, содержащие общую легкую цепь VL7_46-13 со специфичностью к CD3ε, получали посредством селекции методом фагового дисплея в отношении различных видов (человеческого, обезьяньего (циномолгус) и мышиного) FolR1. Клоны 16А3, 15А1, 18D3, 19Е5, 19А4, 15Н7, 15В6, 21D1, 16F12, 19Н3, 20G6 и 20Н7 отбирали из подбиблиотеки, в которой общая легкая цепь была спарена со спектром тяжелых цепей на основе человеческой зародышевой линии VH1_46. В этой подбиблиотеке CDR3 VH1_46 был рандомизирован с использованием 6 различных по длине CDR3. Клоны 16D5, 15Е12, 21А5 и 21G8 отбирали из подбиблиотеки, в которой общая легкая цепь была спарена со спектром тяжелых цепей на основе человеческой зародышевой линии VH3_15. В этой подбиблиотеке CDR3 VH3_15 был рандомизирован с использованием 6 различных по длине CDR3. Для получения обладающих видовой кросс-реактивностью (или реактивностью к мышиному FolR1) антител, при осуществлении 3 раундов биопэннинга чередовали различным образом различные виды FolR1 (или сохраняли постоянными): 16A3 и 15А1 (FolR1 человека - обезьян циномолгус - человека); 18D3 (FolR1 обезьян циномолгус - человека - мышей); 19Е5 и 19А4 (3 раунда селекции против FolR1 мышей); 15Н7, 15 В6, 16D5, 15Е12, 21D1, 16F12, 21А5, 21G8 (FolR1 человека-обезьян циномолгус - человека); 19Н3, 20G6 и 20Н7 (3 раунда селекции против FolR1 мышей).

FolR1 человека, мышей и обезьян циномолгус в качестве антигенов для селекции методом фагового дисплея, а также для скринингов на основе ELISA и SPR, кратковременно экспрессировали в виде N-концевого мономерного Fc-слияния в клетках HEK EBNA и in vivo сайт-специфически биотинилировали посредством совместной экспрессии биотинлигазы BirA на распознаваемой avi-меткой последовательности, расположенной на С-конце несущей Fc-фрагмент рецепторной цепи (Fc-цепь с «выступом»). Для оценки специфичности в отношении FolR1 создавали таким же образом два родственных рецептора, а именно человеческие FolR2 и FolR3.

Раунды селекции (биопэннинг) осуществляли в растворе согласно следующей схеме:

1. Преклиринг ~10¹² фагмидных частиц на планшетах Maxisorp, сенсибилизированных 10 мкг/мл неродственного человеческого IgG, для истощения библиотек антител, распознающих Fc-область, слитую с антигеном.

2. Инкубация не связывающихся с Fc фагмидных частиц с 100 нМ биотинилированным человеческим, обезьяньим (циномолгус) или мышиным FolR1 в течение 0,5 ч в присутствии 100 нМ неродственной небиотинилированной Fc-конструкции, созданной с помощью технологии «knob-into-hole», для дополнительного истощения связывающих Fc агентов в общем объеме 1 мл.

3. «Захват» биотинилированного FolR1 и присоединенного специфически связывающегося фага путем переноса в 4 лунки предварительно покрытого нейтравидином титрационного микропланшета в течение 10 мин (в раундах 1 и 3).

4. Промывка соответствующих лунок с использованием 5×ЗФР/Твин20 и 5×ЗФР.

5. Элюция фаговых частиц путем добавления по 250 мкл 100 мМ ТЭА (триэтиламин) на лунку в течение 10 мин и нейтрализация путем добавления 500 мкл 1М Трис/HCl, рН 7,4 к объединенным элюатам, полученным в 4 лунках.

6. Последующая очистка нейтрализованных элюатов путем инкубации на предварительно покрытом нейтравидином титрационном микропланшете с использованием 100 нМ связанного с биотином FolR2 или FolR3 для окончательного удаления связывающихся с Fc и неспецифических агентов.

7. Повторное заражение находящихся на логарифмической стадии клеток Е. coli TG1 супернатантом элюированных фаговых частиц, заражение хелперным фагом VCSM13, инкубация на шейкере при 30°С в течение ночи и последующее осаждение фагмидных частиц с помощью ПЭГ/NaCl для использования на следующем раунде селекции.

Селекции проводили, осуществляя 3 раунда с использованием постоянных концентраций антигена, составлявших 100 нМ. В раунде 2 во избежание обогащения агентами, связывающимися с нейтравидином, осуществляли «захват» комплексов антигенгфаг путем добавления 5,4×10⁷ покрытых стрептавидином магнитных гранул. Специфические связывающиеся агенты идентифицировали с помощью ELISA следующим образом: 100 мкл 25 нМ биотинилированного человеческого, обезьяньего (циномолгус) или мышиного FolR1 и 10 мкг/мл человеческого IgG наносили на нейтравидиновый планшет и планшет Maxisorp соответственно. Добавляли содержащие Fab бактериальные супернатанты и связывание Fab обнаруживали по их Flag-меткам с использованием вторичного антитела анти-Flag/HRP. Составляли шорт-лист клонов, дающих сигналы на человеческом FolR1 и дающих негативный ответ на человеческом IgG, для дальнейшего анализа и проводили их тестирование аналогичным образом в отношении оставшихся двух видов FolR1. Их экспрессировали в бактериях в объеме культуры, составлявшем 0,5 л, осуществляли аффинную очистку и проводили дополнительную характеризацию с помощью SPR-анализа с использованием биосенсора ProteOn XPR36 фирмы BioRad.

Аффинности (K_D) отобранных клонов измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с помощью устройства ProteOn XPR36 (фирма Biorad) при 25°С с использованием биотинилированного FolR1 человека, обезьян циномолгус или мышей, а также FolR2 и FolR3 человека (отрицательные контроли), иммобилизованных на чипах NLC посредством «захвата» нейтравидином. Иммобилизация антигенов (лиганд): рекомбинантные антигены разводили с помощью ЗФРТ (10 мМ фосфат, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,4, 0,005% Твин 20) до 10 мкг/мл, затем инъецировали со скоростью 30 мкл/мин в вертикальной ориентации. Инъекция аналитов: Для измерений кинетических характеристик за один прогон («one-shot»-кинетика) направление инъекции изменяли на горизонтальную ориентацию, инъецировали двукратные серийные разведения очищенного Fab (варьируя диапазоны концентраций) одновременно вдоль отдельных каналов 1-5, продолжительность ассоциации составляла 200 с, а продолжительность диссоциации составляла 600 с. Вдоль шестого канала инъецировали буфер (ЗФРТ), создавая «параллельный» («in-line») пустой контроль для сопоставления. Константы скорости диссоциации (k_off) рассчитывали с использованием простой модели связывания 1:1 Ленгмюра с помощью программного обеспечения ProteOn Manager v 3.1 путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия диссоциации (K_D) рассчитывали в виде отношения k_off/k_on. В таблице 4 перечислены константы равновесия диссоциации (K_D) отобранных клонов, обладающих специфичностью в отношении FolR1.

Пример 7

Отбор фрагментов антител к FolR1 из генерических (родовых) мультикаркасных библиотек

Антитела 11F8, 36F2, 9D11, 5D9, 6В6 и 14Е4 получали путем селекции методом фагового дисплея с использованием родовых мультикаркасных подбиблиотек против FolR1 различных видов (человека, обезьян циномолгус или мышей). В этих мультикаркасных подбиблиотеках различные VL-домены с рандомизированными CDR3 (3 различные длины) спаривали с различными VH-доменами с рандомизированными CDR3 (6 различных длин). Отобранные клоны имели следующие спаренные VL/VH: 11F8 (Vk_1_5/VH_1_69), 36F2 (Vk_3_20/VH_1_46), 9D11 (Vk2D_28/VH1_46), 5D9 (Vk3_20/VH1_46), 6B6 (Vk3_20/VH1_46) и 14E4 (Vk3_20/VH3_23). Для получения обладающих видовой кросс-реактивностью (или реактивностью к мышиному FolR1) антител, при осуществлении 3 или 4 раундов биопэннинга чередовали различным образом FolR1 различных видов (или сохраняли их постоянными): 11F8 (FolR1 обезьян циномолгус - мышей - человека); 36F2 (FolR1 человека - мышей - обезьян циномолгус - мышей); 9D11 (FolR1 обезьян циномолгус - человека - обезьян циномолгус); 5D9 (FolR1 человека - обезьян циномолгус - человека); 6В6 (FolR1 человека - обезьян циномолгус - человека) и 14Е4 (3 раунда против FolR1 мышей).

FolR1 человека, мышей и обезьян циномолгус, применяемые в качестве антигенов для селекции методом фагового дисплея, а также скринингов на основе ELISA и SPR, кратковременно экспрессировали в виде N-концевого мономерного Fc-слияния в клетках HEK EBNA и сайт-специфически биотинилировали in vivo посредством совместной экспрессии биотинлигазы BirA на распознаваемой avi-меткой последовательности, расположенной на С-конце несущей Fc-область рецепторной цепи (Fc-цепь с «выступом»). Для оценки специфичности в отношении FolR1 создавали таким же образом два родственных рецептора, а именно человеческие FolR2 и FolR3.

Раунды селекции (биопэннинг) осуществляли в растворе согласно следующей схеме:

1. Преклиринг ~10¹² фагмидных частиц на планшетах maxisorp сенсибилизированных 10 мкг/мл неродственного человеческого IgG для истощения библиотек антител, распознающих Fc-область, слитую с антигеном.

2. Инкубация не связывающихся с Fc фагмидных частиц с 100 нМ биотинилированным FolR1 человека, обезьян циномолгус или мышей в течение 0,5 ч в присутствии 100 нМ неродственной небиотинилированной Реконструкции, созданной с помощью технологии «knob-into-hole», для дополнительного истощения связывающих Fc агентов в общем объеме 1 мл.

3. «Захват» биотинилированного FolR1 и присоединенного специфически связывающегося фага путем переноса в 4 лунки предварительно покрытого нейтравидином титрационного микропланшета в течение 10 мин (в раундах 1 и 3).

4. Промывка соответствующих лунок с использованием 5×ЗФР/Твин20 и 5×ЗФР.

5. Элюция фаговых частиц путем добавления по 250 мкл 100 мМ ТЭА (триэтиламин) на лунку в течение 10 мин и нейтрализация путем добавления 500 мкл 1М Трис/HCl, рН 7.4 к объединенным элюатам, полученным в 4 лунках.

6. Последующая очистка нейтрализованных элюатов путем инкубации на предварительно покрытом нейтравидином титрационном микропланшете с использованием 100 нМ связанного с биотином FolR2 или FolR3 для окончательного удаления связывающихся с Fc и неспецифических агентов.

7. Повторное заражение находящихся на логарифмической стадии клеток Е. coli TG1 супернатантом элюированных фаговых частиц, заражение хелперным фагом VCSM13, инкубация на шейкере при 30°С в течение ночи и последующее осаждение фагмидных частиц с помощью ПЭГ/NaCl для использования на следующем раунде селекции.

Селекции проводили, осуществляя 3 раунда с использованием постоянных концентраций антигена, составлявших 100 нМ. В раундах 2 и 4 во избежание обогащения агентами, связывающимися с нейтравидином, осуществляли «захват» комплексов антигенгфаг путем добавления 5,4×10⁷ покрытых стрептавидином магнитных гранул. Специфические связывающие агенты идентифицировали с помощью ELISA следующим образом: 100 мкл 25 нМ биотинилированного FolR1 человека, обезьян циномолгус или мышей и 10 мкг/мл человеческого IgG наносили на нейтравидиновые планшеты и планшеты Maxisorp соответственно. Добавляли содержащие Fab бактериальные супернатанты и связывание Fab обнаруживали по их Flag-меткам с использованием вторичного антитела анти-Flag/HRP. Составляли шорт-лист клонов, дающих сигналы на человеческом FolR1 и дающих негативный ответ на человеческом IgG, для дальнейшего анализа и проводили их тестирование аналогичным образом в отношении FolR1 оставшихся двух видов. Их экспрессировали в бактериях в объеме культуры, составлявшем 0,5 л, осуществляли аффинную очистку и проводили дополнительную характеризацию с помощью SPR-анализа с использованием биосенсора ProteOn XPR36 фирмы BioRad. Аффинности (K_D) отобранных клонов измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с помощью устройства ProteOn XPR36 (фирма Biorad) при 25°С с использованием биотинилированного FolR1 человека, обезьян циномолгус или мышей, а также FolR2 и FolR3 человека (отрицательные контроли), иммобилизованных на чипах NLC посредством «захвата» нейтравидином. Иммобилизация антигенов (лиганд): рекомбинантные антигены разводили с помощью ЗФРТ (10 мМ фосфат, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,4, 0,005% Твин 20) до 10 мкг/мл, затем инъецировали со скоростью 30 мкл/мин в вертикальной ориентации. Инъекция аналитов: Для измерений кинетических характеристик за один прогон («one-shot»-кинетика) направление инъекции изменяли на горизонтальную ориентацию, инъецировали двукратные серийные разведения очищенного Fab (варьируя диапазоны концентраций) одновременно вдоль отдельных каналов 1-5, продолжительность ассоциации составляла 200 с, а продолжительность диссоциации составляла 600 с. Вдоль шестого канала инъецировали буфер (ЗФРТ), создавая «параллельный» («in-line») пустой контроль для сопоставления. Константы скорости диссоциации (k_off) рассчитывали с использованием простой модели связывания 1:1 Ленгмюра с помощью программного обеспечения ProteOn Manager v 3.1 путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия диссоциации (K_D) рассчитывали в виде отношения k_off/k_on. - В таблице 5 перечислены константы равновесия диссоциации (K_D) отобранных клонов, обладающих специфичностью в отношении FolR1.

Пример 8

Получение и очистка новых FolR1-связывающих агентов в формате IgG и форматах активирующих Т-клетку биспецифических молекул

Для идентификации FolR1-связывающих агентов, которые обладают способностью индуцировать зависящий от Т-клеток цитолиз выбранных клеток-мишеней, антитела, выделенные из библиотеки общих легких цепей или Fab-фрагментов, превращали в соответствующий формат человеческого IgG1. В целом метод заключался в следующем. Вариабельные тяжелые и вариабельные легкие цепи уникальных FolR1-связывающих агентов, полученных с помощью фагового дисплея, амплифицировали, осуществляя стандартные ПЦР-реакции с использованием клонов Fab в качестве матрицы. ПЦР-продукты очищали и встраивали (либо посредством клонирования, основанного на применении рестрикционной эндонуклеазы и лигазы, либо посредством «рекомбинации» с использованием набора InFusion фирмы Invitrogen) в пригодные экспрессионные векторы, в которых их сливали с соответствующей человеческой константной тяжелой или человеческой константной легкой цепью. Кассеты экспрессии в этих векторах включали химерный промотор MPSV и синтетический сайт полиаденилирования. Кроме того, плазмиды содержали область oriP из вируса Эпштейна-Барра для поддержания плазмид в стабильном состоянии в клетках HEK293, несущих ядерный антиген EBV (EBNA). После опосредованной ПЭИ трансфекции антитела кратковременно продуцировали в клетках HEK293 EBNA и очищали с помощью стандартной аффинной хроматографии с использованием белка А и последующей гель-фильтрации согласно описанному методу:

Кратковременная трансфекция и получение

Все используемые согласно настоящему изобретению (биспецифические) антитела (если их не приобретали у коммерческих поставщиков) кратковременно получали в клетках HEK293 EBNA с применением описанной ниже процедуры опосредуемой ПЭИ трансфекции с использованием соответствующих векторов. Клетки HEK293 EBNA культивировали в бессывороточной суспензии в среде CD СНО. Для получения во встряхиваемую колбу вместимостью 500 мл высевали за 24 ч до трансфекции 400 млн клеток HEK293 EBNA (для других масштабов производства все количества регулировали соответствующим образом). Для осуществления трансфекции клетки центрифугировали в течение 5 мин при 210×g, супернатант заменяли на 20 мл предварительно нагретой среды CD СНО. Экспрессионные векторы смешивали в 20 мл среды CD СНО до получения конечного количества 200 мкг ДНК. После добавления 540 мкл ПЭИ раствор интенсивно перемешивали в течение 15 с и затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/ПЭИ, переносили в 500-миллилитровую встряхиваемую колбу и инкубировали в течение 3 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО₂. После инкубации добавляли 160 мл среды F17 и клетки культивировали в течение 24 ч. Через 1 день после трансфекции добавляли 1 мМ вальпроевую кислоту и 7% Feed 1. После культивирования в течение 7 дней супернатант собирали для очистки путем центрифугирования в течение 15 мин при 210×g, раствор стерилизовали фильтрацией (фильтр с размером пор 0,22 мкм), добавляли азид натрия в конечной концентрации 0,01% (мас./об.) и выдерживали при 4°С. После завершения производства супернатанты собирали, фильтровали содержащие антитело супернатанты через стерильные фильтры с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°С до очистки.

Очистка антител

Все молекулы подвергали двухстадийной очистке с применением стандартных процедур, таких как аффинная очистка с использованием белка А (фирма Explorer) и гель-фильтрация. Значение рН супернатанта, полученного посредством кратковременного производства, доводили до рН 8,0 (используя 2М Трис, рН 8,0) и вносили в колонку HiTrap PA FF (фирма GE Healthcare, объем колонки (cv) = 5 мл), уравновешенную взятым в объеме, равном 8 объемам колонки (cv), буфером А (20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, рН 7,5). После промывки с использованием 10 cv буфера А белок элюировали, применяя градиент рН до буфера Б (20 мМ цитрат натрия, рН 3, 100 мМ NaCl, 100 мМ глицин) с использованием объема, равного 12 cv. Объединяли фракции, содержащие представляющий интерес белок и значение рН раствора осторожно доводили до рН 6,0 (используя 0,5М Na₂HPO₄, рН 8,0). Образцы концентрировали до 2 мл с использованием ультра-концентраторов (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, фирма Sartorius) и затем вносили в колонку для препаративной хроматографии HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ гистидин, рН 6,0, 140 мМ NaCl, 0,01% Твин-20. Содержание агрегатов в элюированных фракциях анализировали с помощью аналитической гель-фильтрации. Для этого по 30 мкл каждой фракции вносили в колонку для аналитической гель-фильтрации TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh), уравновешенную подвижным буфером, содержащим 25 мМ K₂HPO₄, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлорид L-аргинина, 0,02% (мас./об.) NaN₃, рН 6,7 при 25°С. Фракции, содержащие менее 2% олигомеров, объединяли и концентрировали до конечной концентрации 1-1,5 мг/мл с использованием ультра-концентраторов (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, фирма Sartorius). Концентрацию белка определяли путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярную массу конструкций анализировали с помощью капиллярного электрофореза в присутствии ДСН с восстанавливающим агентом и без него согласно инструкциям производителя (устройство Caliper LabChipGX, фирма Perkin Elmer). Очищенные белки замораживали в жидком N₂ и хранили при -80°С.

На основе результатов характеризации in vitro отобранные связывающие агенты конвертировали в формат активирующей Т-клетку биспецифической молекулы. В этих молекулах связывающие FolR1:CD3 фрагменты расположены в соответствии со схемой 2:1, при этом связывающие FolR1 Fab-фрагменты локализованы на N-конце. Для клонов, выделенных из стандартной библиотеки Fab, CD3-связывающий фрагмент создавали в виде CrossFab (скрещивание СН1Сκ), в то время как для клонов, полученных с использованием библиотеки общих легких цепей, скрещивание не требовалось осуществлять. Указанные биспецифические молекулы получали и очищали аналогично процедуре, которую применяли для IgG.

CLC: общая легкая цепь

Пример 9

Форматы «2+1» и «1+1» активирующих Т-клетку биспецифических молекул

Получали четыре различных формата активирующих Т-клетку биспецифических молекул для имеющего одну общую легкую цепь связывающего агента (16D5) и три формата для одного связывающего агента из библиотеки Fab (9D11) для сравнения их способности к цитолизу in vitro.

Стандартным форматом является уже описанный формат «2+1 инвертированная» (FolR1:CD3-связывающие фрагменты, расположенные в соответствии со схемой 2:1, где FolR1-связывающие Fab находятся на N-конце). В классическом формате 2+1 FolR1:CD3-связывающие фрагменты расположены в соответствии со схемой 2:1, где CD3-связывающий Fab находится на N-конце. Получали также два одновалентных формата. В формате «1+1 «голова-к хвосту»» FolR1:CD3-связывающие фрагменты расположены в соответствии со схемой 1:1 на одном и том же плече молекулы, при этом FolR1-связывающий Fab находится на N-конце. В классическом формате «1+1» присутствует по любому из FolR1:CD3-связывающих фрагментов, каждый из которых находится на одном плече молекулы. Для клона 9D11, выделенного из стандартной библиотеки Fab, CD3-связывающий фрагмент создавали в виде CrossFab (скрещивание СН1Сκ), в то время как для 16D5, полученного с использованием библиотеки общих легких цепей, скрещивание не требовалось. Указанные биспецифические молекулы получали и очищали аналогично процедуре, которую применяли для стандартного инвертированного формата активирующей Т-клетку биспецифической молекулы.

Пример 10

Определение биохимических характеристик FolR1-связывающих агентов с помощью поверхностного плазмонного резонанса

Связывание FolR1-связывающих агентов в виде IgG или в формате активирующей Т-клетку биспецифической молекулы с различными рекомбинантными фолатными рецепторами (человеческие FolR1, 2 и 3, мышиный FolR1 и FolR1 обезьян циномолгус; все в виде слияний с Fc) оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Все эксперименты с применением SPR осуществляли на устройстве Biacore T200 при 25°С с использованием HBS-EP в качестве подвижного буфера (0,01М HEPES, рН 7,4, 0.15М NaCl, 3мМ ЭДТА, 0,005% сурфактант Р20, фирма Biacore, Фрейбург, Германия).

Однократные инъекции

Сначала анализировали анти-FolR1 IgG, осуществляя однократные инъекции (таблица 1), для характеризации их кросс-реактивности (к FolR1 человека, мышей и обезьян циномолгус) и специфичности (в отношении человеческого FolR1, человеческого FolR2, человеческого FolR3). Осуществляли непосредственное сочетание слияний рекомбинантного биотинилированного мономерного Fc с фолатным рецептором 1 человека, обезьян циномолгус и мышей (FolR1-Fc) или человеческим фолатным рецептором 2 и 3 (FolR2-Fc, FolR3-Fc) с SA-чипом согласно инструкции по осуществлению стандартного сочетания (фирма Biacore, Фрейбург, Германия). Уровень иммобилизации составлял примерно 300-400 RU. IgG инъецировали в течение 60 с в концентрации 500нМ. Антитела в виде IgG, связывающиеся с huFolR2 и huFolR3, отбраковывали вследствие отсутствия специфичности. Большинство связывающих агентов обладали кросс-реактивностью только к человеческому и cynoFolR1, дополнительная кросс-реактивность к мышиному FolR1 в большинстве случаев сопровождалась потерей специфичности.

Авидность к фолатному рецептору 1

Авидность взаимодействия между анти-FolR1 IgG или активирующими Т-клетку биспецифическими молекулами и рекомбинантными фолатными рецепторами определяли согласно описанному ниже методу (таблица 9).

Осуществляли непосредственное сочетание слияний рекомбинантного биотинилированного мономерного Fc с фолатным рецептором 1 человека, обезьян циномолгус и мышей (FolR1-Fc) с SA-чипом согласно инструкции по осуществлению стандартного сочетания (фирма Biacore, Фрейбург, Германия). Уровень иммобилизации составлял примерно 300-400 RU. Анти-FolR1 IgG или активирующие Т-клетку биспецифические молекулы в диапазоне концентраций от 2,1 до 500нМ пропускали со скоростью 30 мкл/мин через проточные ячейки в течение 180 с. Мониторинг диссоциации осуществляли в течение 600 с. Все различия в коэффициенте преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в проточной референс-ячейке с иммобилизованным слиянием рекомбинантный биотинилированный рецептор IL2-Fc. Для анализа взаимодействия между 19Н3 IgG и мышиным фолатным рецептором 1, добавляли фолат (фирма Sigma, каталожный номер F7876) в проточном буфере HBS-EP в концентрации 2,3мкМ. Кривые связывания, полученные в результате двухвалентного связывания IgG или активирующих Т-клетку биспецифических молекул, аппроксимировали на основе модели связывания по типу 1:1 Ленгмюра и подгоняли к этой модели (что не является корректным, но позволяет судить об авидности). Кажущиеся константы авидности, характеризующие взаимодействия, получали на основе констант скорости, определенных в результате подгонки с использованием программного обеспечения Bia Evaluation (фирма GE Healthcare).

Аффинность к фолатному рецептору 1

Аффинность взаимодействия между анти-FolR1 IgG или активирующими Т-клетку биспецифическими молекулами и рекомбинантными фолатными рецепторами определяли согласно описанному ниже методу (таблица 10).

Для измерения аффинности осуществляли непосредственное сочетание античеловеческого Fab-специфического антитела (набор для «захвата» Fab, фирма GE Healthcare) до достижения уровня, соответствующего примерно 6000-7000 резонансных единиц (RU), на СМ5-чипе при рН 5,0 с использованием набора для осуществления стандартного аминного сочетания (фирма GE Healthcare). Анти-FolR1 IgG или активирующие Т-клетки биспецифические молекулы в концентрации 20нМ «захватывали» при скорости потока 10 мкл/мин в течение 20 или 40 с, в проточной референс-ячейке «захват» не осуществляли. Через все проточные ячейки пропускали серийные разведения (от 6,17 до 500нМ или от 12,35 до 3000нМ) слияний человеческий или обезьяний (циномолгус) фолатный рецептор 1-Fc при скорости потока 30 мкл/мин в течение 120 или 240 с для регистрации фазы ассоциации. Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение 240 с и для запуска заменяли раствор для образца на HBS-EP. Поверхность чипа регенерировали после каждого цикла, используя две инъекции по 60 с с использованием 10мМ глицина-HCl, рН 2,1. Различия всех показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в проточной референс-ячейке 1. Константы аффинности, характеризующие взаимодействия, определяли на основе констант скорости путем подгонки к модели связывания 1:1 Ленгмюра, используя программное обеспечение Bia Evaluation (фирма GE Healthcare).

Аффинность к CD3

Аффинность взаимодействия между анти-FolR1 активирующими Т-клетку биспецифическими молекулами и слиянием рекомбинантный человеческий CD3εδ-Fc определяли согласно описанному ниже методу (таблица 11).

Для измерения аффинности осуществляли непосредственное сочетание античеловеческого Fab-специфического антитела (набор для «захвата» Fab, фирма GE Healthcare) до достижения уровня, соответствующего примерно 9000 резонансных единиц (RU), с СМ5-чипом при рН 5,0 с использованием набора для осуществления стандартного аминного сочетания (фирма GE Healthcare). Анти-FolR1 активирующие Т-клетки биспецифические молекулы в концентрации 20 нМ «захватывали» при скорости потока 10 мкл/мин в течение 40 с, в проточной референс-ячейке «захват» не осуществляли. Через все проточные ячейки пропускали серийные разведения (от 6,17 до 500нМ) слияния человеческий CD3εδ-Fc при скорости потока 30 мкл/мин в течение 240 с для регистрации фазы ассоциации. Мониторинг фазы диссоциации осуществляли в течение 240 с и для запуска заменяли раствор образца на HBS-EP. Поверхность чипа регенерировали после каждого цикла с помощью двух инъекций глицина-HCl в концентрации 10мМ, рН 2,1, в течение 60 с каждая. Различия всех показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в проточной референс-ячейке 1. Константы аффинности, характеризующие взаимодействия, определяли на основе констант скорости путем подгонки к модели связывания 1:1 Ленгмюра, используя программное обеспечение Bia Evaluation (фирма GE Healthcare).

CD3-связывающий фрагмент был одинаковым для всех конструкций и аффинность оказалась сходной для проанализированных активирующих Т-клетки биспецифических молекул (величины KD находились в диапазоне от 60 до 90нМ).

Пример 11

Одновременное связывание активирующих Т-клетки биспецифических молекул с фолатным рецептором 1 и CD3

Одновременное связывание анти-FolR1 активирующих Т-клетки биспецифических молекул с рекомбинантным фолатным рецептором 1 и слиянием рекомбинантный человеческий CD3εδ-Fc определяли с помощью поверхностного плазменного резонанса согласно описанному ниже методу. Осуществляли непосредственное сочетание слияний рекомбинантного биотинилированного мономерного Fc с рецептором 1 человека, обезьян циномолгус и мышей (FolR1-Fc) с SA-чипом согласно стандартным инструкциям по осуществлению сочетаний (фирма Biacore, Фрейбург, Германия). Уровень иммобилизации составлял примерно 300-400 RU. Анти-FolR1 активирующие Т-клетки биспецифические молекулы в концентрации 500нМ инъецировали в течение 60 с при скорости потока 30 мкл/мин через проточные ячейки, после чего осуществляли инъекцию hu CD3εδ-Fc в концентрации 500нМ в течение 60 с. Различия всех показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в проточной референс-ячейке с иммобилизованным слиянием рекомбинантный биотинилированный рецептор IL2-Fc. Четыре протестированные активирующие Т-клетки биспецифические молекулы (16D5 ТСВ, 21А5 ТСВ, 51С7 ТСВ и 45D2 ТСВ), как и ожидалось, обладали способностью к одновременному связыванию с фолатным рецептором 1 и человеческим CD3.

Пример 12

Группировка в зависимости от эпитопа

Для группировки в зависимости от эпитопа осуществляли непосредственную иммобилизацию анти-FolR1 IgG или активирующих Т-клетки биспецифических молекул на СМ5-чипе при рН 5,0 с использованием набора для стандартного аминного сочетания (фирма GE Healthcare) до достижения конечного ответа, соответствующего примерно 700 RU. После этого осуществляли «захват» 500нМ huFolR1-Fc в течение 60 с, а затем различных связывающих агентов в концентрации 500нМ в течение 30 с. Поверхность регенерировали, осуществляя две инъекции с использованием 10мМ глицина, рН 2, в течение 30 с каждая. Оценивали, могут ли различные связывающие агенты связываться с huFolR1, «захваченном» иммобилизованными связывающими агентами (таблица 12).

На основе этих результатов и дополнительных данных об одновременном связывании на иммобилизованном huFolR1 связывающие агенты были разделены на три группы. Осталось невыясненным, имеет ли 9D11 отдельный эпитоп, поскольку его вытесняли все другие связывающие агенты. 16D5 и 21А5, по-видимому, входят в одну группу, a Mov19, фарлетузумаб (Coney и др.. Cancer Res., 51(22), 15 ноября 1991 г., сс. 6125-6132; Kalli и др., Curr Opin Investig Drugs., 8(12), декабрь 2007 г., сс. 1067-1073) и 36F2 входят в другую группу (таблица 13). Однако 36F2 связывался с эпитопом, отличным от того, с которым связывались Mov 19 и фарлетузумаб, поскольку он связывался с FolR1 человека, обезьян циномолгус и мышей.

Пример 13

Отбор связывающих агентов

Осуществляли скрининг FolR1-связывающих агентов в формате IgG с помощью поверхностного плазменного резонанса (SPR) и анализа in vitro на клетках для отбора наиболее перспективных кандидатов.

Анти-FolR1 IgG анализировали с помощью SPR для характеризации их кросс-реактивности (к FolR1 человека, мышей и обезьян циномолгус) и специфичности (в отношении человеческого FolR1, человеческого FolR2, человеческого FolR3). Неспецифическое связывание с человеческим FolR2 и 3 рассматривали как критерий исключения. Данные о связывании и специфичности в отношении человеческого FolR1 подтверждали на клетках.

Некоторые связывающие агенты не связывались на клетках, экспрессирующих FolR1, даже несмотря на то, что они распознавали рекомбинантный человеческий FolR1 по данным анализа методом SPR. Определяли температуру агрегации, но ее не рассматривали в качестве критерия исключения, поскольку все отобранные связывающие агенты были стабильными. Отобранные связывающие агенты тестировали с помощью ELISA для определения полиреактивности с целью проверки наличия неспецифического связывания, что привело к исключению четырех связывающих агентов. В результате этого процесса сначала были отобраны три связывающих агента: 36F2 (библиотека Fab), 9D11 (библиотека Fab) и 16D5 (общая легкая цепь). Диссоциация 36F2 из комплекса с huFolR1 происходила слишком быстро, и, следовательно, сразу было очевидно, что он не обладал преимуществом.

Пример 14

Специфическое связывание новых сконструированных FolR1-связывающих агентов с позитивными по человеческому FolR1 опухолевыми клетками

Новые FolR1-связывающие агенты конструировали с помощью метода фагового дисплея с использованием либо библиотеки Fab, либо библиотеки общих легких цепей, созданных с использованием легкой цепи CD3. Идентифицированные связывающие агенты конвертировали в формат человеческого IgG1 и анализировали связывание с характеризующимися высоким уровнем экспрессии FolR1 клетками HeLa. В качестве референс-молекулы применяли связывающий человеческий FolR1 клон Mov19. Большинство из протестированных в этом опыте связывающих агентов характеризовались уровнем связывания с FolR1 от промежуточного до высокого, при этом некоторые клоны обладали такой же способностью к связыванию, что и Mov19 (см. фиг. 2). Клоны 16А3, 18D3, 15Н7, 15В6, 21D1, 14Е4 и 16F12 были исключены, поскольку их связывание с FolR1 на клетках не удалось подтвердить с помощью проточной цитометрии. На следующей стадии отобранные клоны тестировали в отношении специфичности к человеческому FolR1, исключая клоны, которые связывались с близко родственным человеческим FolR2. Для анализа специфичности клетки НЕК кратковременно трансфектировали либо человеческим FolR1, либо человеческим FolR2. Клоны 36F2 и 9D11, полученные из библиотеки Fab, и клоны 16D5 и 21А5, полученные из библиотеки CLC, специфически связывались с человеческим FolR1 и не связывались с человеческим FolR2 (см. фиг. 3А-Б). Все другие протестированные клоны обладали по меньшей мере небольшой способностью связываться с человечески FolR2 (см. фиг. 3А-Б). Вследствие этого указанные клоны были исключены при проведении дальнейшей характеризации. Параллельно анализировали кросс-реактивность связывающих FolR1 клонов с cynoFolR1, изучая способность к связыванию с клетками НЕК, кратковременно трансфектированными cynoFolR1. Все протестированные клоны обладали способностью к связыванию с cynoFolR1, а четыре отобранных специфических в отношении человеческого FoLR1 клона 36F2, 9D11, 16D5 и 21А5 обладали сопоставимой высокой способностью к связыванию с человеческим FoLR1 и cynoFoLR1 (фиг. 4). Затем три специфических в отношении человеческого FolR1 связывающих агента, обладающих кросс-реактивностью с cynoFolR1, конвертировали в формат ТСВ и тестировали в отношении индукции опосредованного Т-клеткой цитолиза и активации Т-клеток. Указанные клоны представляли собой клон 9D11, полученный из библиотеки Fab и клоны 16D5 и 21А5 из библиотеки CLC. В качестве референс-молекулы во всех исследованиях применяли FolR1-ТСВ Mov19. Затем указанные FolR1-TCB применяли для сравнения индукции интернализации после связывания с FolR1 на клетках HeLa. Все три протестированных клона характеризовались интернализацией после связывания с FolR1, сопоставимой с интернализацией после связывания FoLR1-ТСВ Mov19 (фиг. 5). Изучение FolR1-TCB 21А5 прекратили вследствие обнаружения признаков полиреактивности.

Пример 15

Опосредуемый Т-клеткой цитолиз экспрессирующих FolR1 опухолевых клеток-мишеней, индуцируемый антителами FolR1-TCB

FolR1-TCB применяли для оценки опосредуемого Т-клеткой цитолиза опухолевых клеток, экспрессирующих FoLR1. Для определения сайтов связывания FoLR1 с помощью анализа с использованием набора Qifikit применяли панель линий потенциальных клеток-мишеней.

Применяемая панель опухолевых клеток включала опухолевые клетки с высоким, промежуточным и низким уровнем экспрессии FolR1 и FolR1-негативную линию клеток.

Оценивали связывание трех различных FoLR1-TCB (включая связывающие агенты 9D11, 16D5 и Mov19) с указанной панелью линий опухолевых клеток и было продемонстрировано, что FoLR1-TCB специфически связывались с экспрессирующими FolR1 опухолевыми клетками и не связывались с FoLR1-негативной линией опухолевых клеток. Количество связанных конструкций пропорционально уровню экспрессии FolR1 и при этом оказалось возможным обнаружить все еще достаточно высокий уровень связывания с линией клеток НТ-29, характеризующейся низким уровнем экспрессии FolR1. Кроме того, не было выявлено связывания служащей в качестве отрицательного контроля ТСВ DP47 ни с одной из применявшихся клеточных линий (фиг. 6А-Д).

Затем клеточную линию SKOV3, характеризующуюся промежуточным уровнем экспрессии, и клеточную линию НТ-29, характеризующуюся низким уровнем экспрессии, использовали для тестирования опосредуемого Т-клетками цитолиза и активации Т-клеток с использованием ТСВ 16D5 и ТСВ 9D11; ТСВ DP47 включали в качестве отрицательного контроля. Обе клеточные линии погибали уже в присутствии низких уровней ТСВ 16D5 и ТСВ 9D11, и при этом не было обнаружено различия в активности между обеими ТСВ даже несмотря на то, что ТСВ 9D11 обладала более сильной способностью к связыванию с FolR1, чем ТСВ 16D5. Общий уровень цитолиза клеток SKOV3 был выше по сравнению с НТ-29, что отражает более высокие уровни экспрессии FolR1 на клетках SKOV3 (фиг. 7А-Г). С этим согласуется и то, что была выявлена сильная повышающая регуляция маркера активации CD25 и CD69 на CD4⁺-Т-клетках и CD8⁺-Т-клетках. Активация Т-клеток оказалась очень сходной в присутствии как клеток SKOV3, так и клеток НТ-29. Применяемая в качестве отрицательного контроля ТСВ DP47 не индуцировала цитолиз в применявшихся концентрациях, и не было выявлено значимой повышающей регуляции CD25 и CD69 на Т-клетках.

Пример 16

Связывание с эритроцитами и активация Т-клеток в цельной крови

Для доказательства того, что спонтанная активация не имеет места в отсутствии экспрессирующих FoLR1 опухолевых клеток, при создании изобретения было проведено исследование вопроса о том, происходит ли связывание FolR1-связывающих клонов с эритроцитами, которые потенциально могут экспрессировать FolR1. Не было выявлено никакого специфического связывания IgG 9D11, IgG 16D5 и IgG Mov19 с эритроцитами, при этом в качестве отрицательного контроля применяли IgG DP47 (фиг. 8).

Для того чтобы исключить любое другое неспецифическое связывание с клетками крови или неспецифическую активацию через FoLR1-TCB, в цельную кровь добавляли ТСВ 9D11, ТСВ 16D5 и ТСВ Mov19 и анализировали повышающую регуляцию CD25 и CD69 на CD4⁺-Т-клетках CD8⁺-Т-клетках с помощью проточной цитометрии. ТСВ DP47 включали в качестве отрицательного контроля. При анализе повышающей регуляции CD25 и CD69 на CD4⁺-Т-клетках CD8⁺-Т-клетках не было обнаружено активации Т-клеток любой из протестированных конструкций (фиг. 9).

Пример 17

Опосредуемый Т-клетками цитолиз, индуцированный ТСВ 36F2 и ТСВ 16D5 в различных одновалентных и двухвалентных форматах активирующих Т-клетки биспецифических молекул

Оценивали опосредуемый Т-клетками цитолиз человеческих опухолевых клеток Hela, Skov-3 (средний уровень FolR1, примерно 70000-90000 копий) и НТ-29 (низкий уровень FolR1, примерно 10000 копий), индуцированный антителами ТСВ 36F2, ТСВ 16D5, ТСВ 16D5 в формате «ТСВ классическая», ТСВ 16D5 в формате «ТСВ 1+1» и ТСВ 16D5 в формате «ТСВ НТ». Антитело, представляющее собой ТСВ DP47, включали в качестве отрицательного контроля. Человеческие РВМС применяли в качестве эффекторных клеток, и цитолиз оценивали после инкубации в течение 24 ч с биспецифическим антителом. В целом метод состоял в следующем: клетки-мишени собирали с использованием трипсина/ЭДТА, промывали и высевали с плотностью 25000 клеток/лунку в плоскодонные 96-луночные планшеты. Клеткам давали прикрепиться в течение ночи. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали путем центрифугирования в градиенте плотности Histopaque из обогащенных лимфоцитами препаратов (лейкоцитарные пленки), полученных из крови здоровых доноров. Свежую кровь разводили стерильным ЗФР и наслаивали на градиент Histopaque (фирма Sigma, H8889). После центрифугирования (450 × g, 30 мин, комнатная температура) часть плазмы, находящуюся над содержащей РВМС интерфазой, отбрасывали и РВМС переносили в новую фальконовскую пробирку, которую затем заполняли 50 мл ЗФР. Смесь центрифугировали (400 × g, 10 мин, комнатная температура), супернатант отбрасывали и дебрис РВМС промывали дважды стерильным ЗФР (стадии центрифугирования при 350 × g, 10 мин). Осуществляли автоматический подсчет полученной популяции РВМС (устройство ViCell) и хранили в среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS и 1% L-аланил-L-глутамина (фирма Biochrom, K0302) при 37°С, 5% СО₂ в инкубаторе для клеток до дальнейшего использования (не более 24 ч). Для анализа цитолиза антитело добавляли в указанных концентрациях (в диапазоне от 0,01 пМ до 100 нМ в трех повторностях). Добавляли РВМС к клеткам-мишеням в конечном соотношении Е:Т = 10:1. Цитолиз клеток-мишеней оценивали после инкубации в течение 24 ч при 37°С, 5% СО₂ путем количественной оценки высвобождения ЛДГ в клеточные супернатанты апоптозными/некротическими клетками (набор для обнаружения ЛДГ, фирма Roche Applied Science, каталожный номер 11644793001). Максимальный лизис клеток-мишеней (=100%) достигался при инкубации клеток-мишеней в присутствии 1% Тритона Х-100. Минимальный лизис (=0%) соответствовал лизису при совместной инкубации клеток-мишеней с эффекторными клетками без биспецифических конструкций.

Результаты продемонстрировали мишень-специфический цитолиз всех трех линий FolR1⁺ - клеток-мишеней, индуцированный ТСВ 36F2 и ТСВ 16D5 (фиг. 10).

Пример 18

Создание антител к TIM3

Иммунизация мышей Мышей линии NMRI иммунизировали генетически, используя плазмидный экспрессионный вектор, кодирующий полноразмерный человеческий TIM3, путем внутрикожного введения 100 мкг векторной ДНК (плазмида 15304_hTIM3-f1) с последующей электропорацией (2 квадратных импульса по 1000 В/см, продолжительность 0,1 мс, интервал 0,125 с; затем 4 квадратных импульса по 287,5 В/см, продолжительность 10 мс, интервал 0,125 с. Мышей подвергали любым 6 последовательным иммунизациям в дни 0, 14, 28, 42, 56, 70 и 84. Образцы крови брали в дни 36, 78 и 92 и получали сыворотку, которую использовали для определения титра с помощью ELISA (см. ниже).

Животных с наиболее высокими титрами отбирали для бустерной иммунизации в день 96 путем внутривенной инъекции 50 мкг химеры рекомбинантный человеческий TIM3-человеческий Fc и моноклональные антитела выделяли, используя технологию гибридом, путем слияния спленоцитов с клеточной линией миеломы через 3 дня после бустерной иммунизации.

Определение титров в сыворотке (ELISA) Химеру человеческий рекомбинантный TIM3-человеческий Fc иммобилизовали на 96-луночном планшете Maxisorp (фирма NUNC) в концентрации 0,3 мкг/мл, 100 мкл/лунку в ЗФР, после чего: блокировали планшет с помощью 2% Crotein С в ЗФР, 200 мкл/лунку; вносили серийные разведения антисыворотки в двух повторностях в 0,5% Crotein С в ЗФР, 100 мкл/лунку; осуществляли обнаружения с помощью конъюгированного с HRP козьего антимышиного антитела (фирма Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16 000). При осуществлении всех стадий планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Между всеми стадиями планшеты промывали 3 раза 0,05% Твин 20 в ЗФР. Сигнал выявляли путем добавления растворимого субстрата ВМ Blue POD (фирма Roche), 100 мкл/лунку; и реакцию прекращали путем добавления 1М HCl, 100 мкл/лунку. Абсорбцию определяли при 450 нм, используя волну длиной 690 нм в качестве референс-волны. Титр определяли как разведение антисыворотки, обеспечивающее сигнал, составляющий половину от максимального.

Пример 19

Характеризация антител к Tim3

ELISA для Tim3. Сенсибилизированные стрептавидином планшеты Nunc-Maxi Sorp (фирма MicroCoat, №1974998/МС1099) покрывали, применяя из расчета 25 мкл/лунку Tim3-ECD-His-биотин (биотинилированный с помощью лигазы BirA) и инкубировали при КТ в течение 1 ч при встряхивании при скорости вращения 400 об/мин. После промывки (3×90 мкл/лунку ЗФРТ-буфера) добавляли 25 мкл образцов антител к Tim3 или разведенное (серийные разведения 1:2) референс-антитело к Tim3 F38-2E2 (фирма Biolegend) и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После промывки (3×90 мкл/лунку ЗФРТ-буфера) добавляли 25 мкл/лунку овечьего антимышиного антитела-POD (фирма GE, NA9310V) в разведении 1:9000 и инкубировали при КТ в течение 1 ч при встряхивании при скорости вращения 400 об/мин. После промывки (4×90 мкл/лунку ЗФРТ-буфера) добавляли 25 мкл/лунку ТМВ-субстрата (фирма Calbiochem, №CL07) и инкубировали до достижения ОП 1,5-2,5. Затем реакцию прекращали путем добавления 25 мкл/лунку 1н. раствора HCl. Измерения проводили при 370/492 нм. Результаты ELISA, выраженные в виде величин ЕС₅₀ [нг/мл], обобщены ниже в таблице 17.

Клеточный ELISA для Tim3. Прикрепленные клетки линии СНО-K1, стабильно трансфектированные плазмидой 15312_hTIM3-f1_pUC_Neo, кодирующей полноразмерный человеческий Tim3 и маркер селекции G418 (маркер устойчивости к неомицину на плазмиде), высевали в концентрации 1,2×10Е6 клеток/мл в 384-луночные плоскодонные планшеты и выращивали в течение ночи.

На следующий день добавляли по 25 мкл/лунку образца Tim3 или референс-антитела к Tim3 F38-2E2, свободного от азида (фирма Biolegend, 354004), и инкубировали в течение 2 ч при 4°С (во избежание интернализиации). После промывки (3×90 мкл/лунку ЗФРТ (фирма BIOTEK Washer: Prog. 29, 1×90) клетки фиксировали путем быстрого удаления остаточного буфера и добавления 50 мкл/лунку 0,05% глутарового альдегида: разведение 1:500 25%-ного глутарового альдегида (фирма Sigma, каталожный №G5882) в 1×ЗФР-буфере и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После промывка (3×90 мкл/лунку ЗФРТ (фирма BIOTEK Washer: Prog. 21, 3×90 GreinLysin) добавляли из расчета по 25 мкл/лунку вторичное идентифицирующее антитело (овечье антимышиное-POD; связанное с пероксидазой из хрена (POD), F(ab')₂-фрагмент; (фирма GE, NA9310) с последующей инкубацией в течение 2 ч при КТ при встряхивании при 400 об/мин. После промывки (3×90 мкл/лунку ЗФРТ (фирма BIOTEK Washer: Prog. 21, 3×90 GreinLysin) добавляли 25 мкл/лунку раствора ТМВ-субстрата (фирма Roche, 11835033001) и инкубировали вплоть до достижения ОП 1,5-2,5. Затем реакцию прекращали путем добавления 25 мкл/лунку 1н. раствора HCl. Измерения проводили при 370/492 нм. Результаты ELISA, выраженные в виде величин «ЕС₅₀ CHO-Tim3» [нг/мл], обобщены ниже в таблице 17.

Biacore-характеризация Ат к Tim3 Анализ на основе поверхностного плазменного резонанса (SPR) применяли для определения кинетических параметров связывания для нескольких связывающих мышиный Tim3 агентов, а также поступающих в продажу связывающихся с человеческими Tim3 референс-антител. Для этой цели антимышиный IgG иммобилизовали с помощью аминного сочетания на поверхности сенсорного СМ5-чипа (фирма Biacore). Затем «захватывали» образцы и связывали с ними hu/cy Tim3-ECD. Поверхность сенсорного чипа регенерировали после каждого цикла анализа. И, наконец, определяли константу равновесия K_D путем аппроксимации данных к модели взаимодействия по типу 1:1 Ленгмюра. Сшивали с каждым из пятен 1, 2, 4 и 5 проточных ячеек 1-4 сенсорного СМ5-чипа (пятна 1,5 представляли собой активные пятна, а пятна 2,4 - референс-пятна) антимышиный IgG (фирма GE Healthcare, №BR-1008-38) в концентрации 30 мкг/мл, уровень иммобилизации соответствовал примерно 12000 единицам ответа, в устройстве Biacore B4000 при рН 5,0 с помощью набора для аминного сочетания, поставляемого фирмой GE Healthcare.

Буфер для образов и подвижный буфер представлял собой HBS-EP+(0,01М HEPES, 0.15M NaCl, 3мМ ЭДТА, 0,05 об.% сурфактанта Р20, рН 7,4). Температуру проточной ячейки устанавливали на 25°С, а температуру компартмента для образца на 12°С. Систему примировали с помощью подвижного буфера. Образцы инъецировали в течение 30 с в концентрации 200 мкг/мл и связывали с пятнами 1 и 5 каждой проточной ячейки, что позволяло оценивать 8 образцов параллельно. Затем инъецировали полный набор образцов (мономерный cyno, мономерный человеческий и слитый с huFc димерный человеческий Tim3-ECD) в различных концентрациях (см. таблицу X) по поверхности каждого образца в течение 240 с, после чего давали пройти диссоциации в течение 30/1800 с (см. таблицу 1). После каждого цикла анализа («захват» образца, пятна 1 и 5 - инъекция Tim3-ECD) осуществляли регенерацию с использованием инъекции продолжительностью 30 с глицина -HCl, рН 1,7. Во время всего погона скорость потока составляла 30 мкл/мин. И, наконец, полученные с использованием двойного стандарта данные аппроксимировали на основе модели взаимодействия по типу 1:1 Ленгмюра с помощью программного обеспечения Biacore B4000 Evaluation. Полученные величины K_D представлены в таблицах 17 и 18.

Пример 20

Создание производных антител к Tim3

Производные в виде химерных антител. Химерные антитела к Tim3 создавали путем амплификации вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиных антител к TIM3 Tim3-0016, вариант Tim3-0016 (0018), Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028, Tim3-0030 и Tim3-0033, Tim3-0038 путем ПЦР и их клонирования в экспрессионных векторах для тяжелых цепей в виде слитых белков с человеческими IgGI-каркасами/человеческими CH1-шарнир-СН2-СН3 с мутациями LALA и PG (замена лейцина 234 на аланин, лейцина 235 на аланин, пролина 329 на глицин), которые элиминируют эффекторные функции, и в экспрессионных векторах для легких цепей в виде слитых белков с человеческой С-каппа. Затем LC- и НС-плазмидами совместно трансфектировали HEK293 и антитела очищали через 7 дней из супернатантов с помощью стандартных методов очистки антител.

Удаление сайта гликозилирования NYT: Модификация 1 положения в HVR-L1 антител Tim3-0016, вариант Tim3_0016 (обозначенный как 0018 или Tim3 0018) путем замены N на О или S. Мутации в вариабельной области легкой цепи Tim3_0016 и варианта Tim3_0016 (0018) создавали путем мутагенеза in vitro, используя набор фирмы Agilent «Quick Change Lightning Site-directed Mutagenesis» согласно инструкциям производителя. С помощью этого метода аспарагин (N) в мотиве NYT сайта гликозилирования в HVR-L1 легкой цепи (SEQ ID NO: 4) заменяли на глутамин (Q) (получая SEQ ID NO: 11, которая соответствует Tim3_0016_HVR-L1 вариант 1_NQ) или альтернативно этому, аспарагин (N) заменяли на серин (S) (получая SEQ ID NO: 12, которая соответствует Tim3_0016_HVR-L1 вариант 2_NS). В обоих случаях это приводило к успешной модификации мотива NYT сайта гликозилирования. Затем LC- и НС-плазмидами, кодирующими эти варианты, совместно трансфектировали HEK293 и антитела очищали через 7 дней из супернатантов с помощью стандартных методов очистки антител. Созданные мутанты тестировали с помощью ELISA с использованием человеческого Tim3, ELISA с использованием Tim3 обезьян циномолгус и клеточного ELISA, который осуществляли на прикрепленных СНО-K1-клетках, экспрессирующих полноразмерный человеческий Tim3. Установлено, что все созданные мутанты отличались еще более выраженным функциональным связыванием с человеческим TIM3 (человеческий), cynoT1M3 (супо) или человеческим TIMR на СНО-клетках по сравнению с родительскими антителами Tim3_0016 или вариантом антитела Tim3_0016 т.е. Tim3_0018 соответственно.

Пример 21

Флуоресцентное мечение очищенного моноклонального антитела

Флуоресцентное мечение полученного из гибридомы моноклонального антитела осуществляли, используя набор для мечения моноклональных антител Alexa Fluor 488 (производство фирмы Invitrogen), согласно инструкциям производителя. После мечения подтверждали, что каждое антитело является позитивно меченным с помощью Alexa Fluor 488 (далее в контексте настоящего описания обозначено как «Alexa-488»), используя устройство FACSCalibur (производство фирмы BD Biosciences) для анализа экспрессирующих TIM3 клеток RPMI-8226 и клеток Пфайффера.

Пример 22

Классификация в зависимости от связывания с группами эпитопов с использованием конкурентного анализа на основе FACS

Анализировали соответствие эпитопов между созданными антителами к TIM3 и 6 референс-антителами к TIM3 с помощью конкурентного анализа связывания на основе FACS. Использовали следующие референс-антитела к TIM3: антитела 4177 и 8213, описанные в US 2012/189617, антитела 1.7Е10 и 27.12Е12, описанные в WO 2013/06490; антитело 344823 (клон 344823, производство фирмы R&D Systems) и антитело F38-2E2 (клон F38-2E2, производство фирм BioLegend и R&D Systems). В целом, метод состоял в следующем: тестируемому антителу давали взаимодействовать и связываться с экспрессирующими TIM3 клетками RPMI-8226 (АТСС® CCL-155™) и затем оценивали с помощью метода проточной цитометрии, может ли другое антитело к TIM3 также связываться с экспрессирующими TIM3 клетками.

В целом метод состоял в следующем: экспрессирующие человеческий TIM3 клетки RPMI-8226 инкубировали с реагентом фирмы BD, блокирующим человеческий Fc, в течение 10 мин при КТ и окрашивали с использованием двух различных экспериментальных схем для исключения влияния различий в аффинности тестируемых антител на связывание:

1) с использованием описанных очищенных антител к TIM3 (10 мкг/мл в буфере для окрашивания фирмы BD (BD SB) в течение 0,5 ч при 4°С), которые конъюгировали с Alexa*488 согласно инструкциям производителя (фирма Molecular Probes, A-20181) из расчета в среднем 2,7 флуорофоров на антитело. Затем а) добавляли немеченые (1-4) рекомбинантные референс-антитела к TIM3 или контроль изотипа 10 мкг/мл) в течение 0,5 ч при 4°С в BD SB и после промывки с помощью BD SB окрашивали меченными РЕ Ат к huFcγ (фирма JIR, 109-116-098, 1:200, 0,5 ч при 4°С в BD SB), или б) добавляли меченные РЕ (5-6) доступные референс-антитела к TIM3 или соответствующие контроли изотипа (10 мкг/мл) в течение 0,5 ч при 4°С в BD SB. После промывки и центрифугирования анализировали MFI-сигналы окрашенных RPMI-8226-клеток с помощью проточного цитометра фирмы BD Biosciences FACSCanto.

Результаты основанного на FACS картирования в зависимости от групп эпитопов продемонстрировали, что Tim3_0016 и вариант Tim3_0016, т.е. Tim3_0018, не конкурировали за связывание с протестированными референс-антителами к TIM3, и это позволяет предположить, что указанные Ат распознают новый эпитоп, отличный от эпитопов, которые распознаются описанными ранее референс-антителами к TIM3, в то время как Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028 и Tim3_0038 конкурировали в разной степени за связывание с TIM3, экспрессируемым на поверхности клеток JRPMI-8226, с различными конкурентами.

Пример 23

Воздействие антител к человеческому TIM3 на производство цитокинов при изучении с использованием реакции лимфоцитов в смешанной культуре (MLR)

Реакцию лимфоцитов в смешанной культуре применяли для демонстрации явления блокирования пути TIM3 у эффекторных форм лимфоцитов. В этом анализе тестировали активацию Т-клеток и секрецию ими IFN-гамма в присутствии или отсутствии МАт к TIM3.

Человеческие лимфоциты выделяли из периферической крови здорового донора путем центрифугирования в градиенте плотности, используя устройство Leukosep (фирма Greiner Bio One, 227 288). В целом, метод состоял в следующем: гепаринизированную кровь разводили трехкратным объемом ЗФР и аликвоты по 25 мл разбавленной крови наслаивали в 50-миллилитровых Leukosep-пробирках. После центрифугирования при 800 × g в течение 15 мин при комнатной температуре (без перерыва) содержащие лимфоциты фракции собирали, промывали в ЗФР и непосредственно применяли для функционального анализа или ресуспендировали в среде для замораживания (10% ДМСО, 90% FCS) из расчета 1,0Е+07 клеток/мл и хранили в жидком азоте. Применяли соотношение 1:1 клеток-мишеней/респондеров в MLR-анализе (т.е. каждая MLR-культуру содержала - 2,0Е+05 РВМС из каждого донора в общем объеме 200 мкл). Добавляли моноклональные антитела к TIM3, т.е. Tim3_0016, вариант Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028, Tim3_0030, Tim3_0033, Tim3_0038 и F38-2E2 (фирма BioLegend) в каждую культуру, применяя антитела в различных концентрациях. В качестве отрицательного контроля применяли либо реакцию без антитела, либо с антителом, применяемым в качестве контроля изотипа, и rec hu IL-2 (20 EU/мл) применяли в качестве положительного контроля. Клетки культивировали в течение 6 дней при 37°С. Через 6 дней по 100 мкл среды отбирали из каждой культуры для измерения уровня цитокинов. Для определения уровней IFN-гамма применяли набор OptEIA ELISA (фирма BD Biosciences).

Результаты представлены в таблице 21 (секреция/высвобождение IFN-g). Моноклональные антитела к TIM3 повышали Т-клеточную активацию и секрецию IFN-гамма в зависимости от концентрации. Антитела к TIM3 Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0028 и Tim3_0038 снижали высвобождение провоспалительного цитокина IFN-гамма в большей степени, чем антитело F38-2Е2. Для Tim3_0016, варианта Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0033 и Tim3_0038 обнаружено, что высвобождение было сходным с высвобождением при применении антитела F38-2E2. В противоположность этому, в культурах, содержащих антитело, применяемое в качестве контроля изотипа, не обнаружено повышение секреции IFN-гамма.

Пример 24

Интернализация антител к TIM3 экспрессирующими TIM3 клетками

TIM3-специфические антитела, указанные в настоящем описании, могут интернализироваться экспрессирующими TIM3 клетками, включая экспрессирующие TIM3 клетки лимфомы, множественной миеломы и AML. Например, установлено, что TIM3-специфические антитела и их фрагменты могут интернализироваться recTIM3-СНО-клетками, которые стабильно экспрессируют человеческий TIM3, по данным, полученным с помощью клеточного ELISA, проточной цитометрии (FACS) и конфокальной микроскопии.

Стабильно трансфектированные Tim3 клетки СНО-K1 (клон 8) (4×10⁴ клеток/лунку/100 мкл) высевали в 98-луночный титрационный микропланшет (МТР), применяя свежую культуральную среду. После прикрепления клеток в течение ночи среду для культуры клеток удаляли, тестируемые антитела добавляли к клеткам (10 мкг/мл в среде для культуры клеток) и инкубировали в течение 0,5 ч при 4°С. В качестве референс-эталона применяли поступающее в продажу мышиное античеловеческое антитело (TIM3 МАВ 11Е365 (фирма US Biological, T5469-92P). После промывки (2× с помощью среды для культуры клеток) и центрифугирования клетки инкубировали в течение 3 ч при а) 4°С или б) 37°С в 200 мкл среды для культуры клеток. Интернализация, как правило, происходит при 37°С, но не происходит при 4°С, что является дополнительным контролем реакции. Затем клетки фиксировали, используя 100 мкл/лунку 0,05%-ного глутарового альдегида (фирма Sigma, каталожный № G5882) в 1×ЗФР в течение 10 мин при комнатной температуре (КТ). После чего осуществляли три стадии промывки с помощью 200 мкл ЗФР-Т и добавляли в качестве вторичного антитела овечье антимышиное антитело-POD (связанное с POD из хрена, F(ab')₂-фрагмент); GE NA9310)) в течение 1 ч при КТ. После конечных стадий промывки (3×ЗФР-Т) добавляли ТМВ-субстрат (фирма Roche, № заказа 11835033001) в течение 15 мин и цветную реакцию прекращали с помощью 1н. HCl. Конечные ОП определяли, осуществляя измерения при 450/620 нм, в ридере для ELISA. Указанную процедуру клеточного ELISA применяли для определения при средней пропускной способности интернализирующей способности тестируемых антител, которые очищали из супернатантов гибридомы.

Процент интернализации рассчитывали следующим образом:

интернализация [%]=(1 - ОП_{образца_}37°C/ОП_{образца_}4°C)×100

Результаты представлены на фиг. 29А и Б (интернализация). Практически все протестированные моноклональные антитела к TIM3 одинаково хорошо интернализировались стабильно трансфектированными Tim3 CHO-K1-клетками после инкубации в течение 3 ч при 37°С (представлены не все данные).

Для отобранных кандидатов осуществляли с помощью FACS определение величин ЕС₅₀, характеризующих уровни интернализации (в зависимости от времени), а также сравнение кинетики интернализации в зависимости от одновалентного относительно двухвалентного связывания.

В целом, метод состоял в следующем: стабильно экспрессирующие человеческий TIM3 CHO-K1-клетки высевали (4×10⁵ клеток/лунку/50 мкл) в 98-луночный с v-образным дном МТР, используя свежую культуральную среду, и инкубировали с жидким Redimune® NF в течение 10 мин при КТ для блокады неспецифического связывания. Затем добавляли из расчета 50 мкл/лунку отобранные очищенные антитела к TIM3 (10 мкг/мл в среде для культуры клеток) и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. После промывки (средой для культуры клеток) и центрифугирования клетки инкубировали в течение 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 и 24 ч при а) 4°С или б) 37°С в 200 мкл среды для культуры клеток. Затем клетки промывали ЗФР/1% БСА и добавляли в качестве вторичного антитела меченный Alexa Fluor 488 козий антимышиный IgG, F(ab)₂ в течение 1 ч при 4°С. После промывки и центрифугирования добавляли 125 мкл CellFix (фирма BD Bioscience, 1:1000) и анализировали MFI-сигналы окрашенных клеток с помощью проточного цитометра фирмы BD Biosciences FACSCanto.

Процент интернализации рассчитывали следующим образом:

интернализация [%]=(1-MFI_{образца_}37°C/MFI_{образца_}4°C)×100.

Пример оценки в зависимости от времени интернализации антител к TIM3, таких как Tim3 0016. вариант Tim3 0016 (Tim3 0018). Tim3 0021. Tim3 0028, Tim3 0030. Tim3 0033. Tim3 0038 на RPMI-8226-клетках (АТСС® CCL-155™):

Указанные в настоящем описании антитела к TIM3 отличались быстрой интернализацией экспресирующими TIM3 RPMI-8226-клетками (АТСС® CCL-155™) и достигали высокого уровня в клетках. Эксперименты проводили согласно описанному выше методу с использованием экспрессирующих TIM3 RPMI-8226-клеток (АТСС® CCL-155™) вместо rec CHOK1-клеток, экспрессирующих huTIM3. Результаты представлены в таблице 22. Следующие антитела применяли в качестве анти-TIM3 референс-антител: антитело 8213, описанное в US2012/189617, антитело 27.12Е12, описанное в WO 2013/06490. Tim3_0016, вариант Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0038 применяли в качестве химерных версий человеческих IgG1.

Результаты продемонстрировали, что протестированные антитела быстро и с высоким по сравнению с референс-антителами процентом интернализовались RPMI-8226-клетками (АТСС® CCL-155™).

Пример 25

Связывание антител к TIM3 с выделенными человеческими моноцитами, экспрессирующими TIM3

CD14⁺-моноциты выделяли из обработанной антикоагулянтом периферической крови здоровых доноров путем центрифугирования в градиенте плотности, с использованием фиколл-пака (фирма GE Healthcare) (см. общие протоколы в руководствах для пользователей или на сайте www.miltenyibiotec.com/protocols) и затем подвергали позитивной селекции с использованием CD14-микрогранул (MicroBeads). Сначала CD14⁺-клетки метили магнитными частицами с использованием CD14-микрогранул. Затем суспензию клеток вносили на колонку MACS®, которую помещали в магнитное поле MACS-сепаратора. Меченные магнитными частицами CD14⁺-клетки задерживались на колонке. Немеченые клетки проходили через колонку, эта клеточная фракция была истощена по CD14⁺-клеткам. После удаления колонки из магнитного поля сохранившие магнитные свойства CD14⁺-клетки можно элюировать в качестве клеточной фракции, прошедшей позитивную селекцию. После центрифугирования при 200 × g в течение 10 мин при комнатной температуре моноциты собирали и применяли непосредственно для анализа связывания или ресуспендировали в среде для замораживания (10% ДМСО, 90% FCS) из расчета 1,0Е+07 клеток/мл и хранили в жидком азоте.

Как известно из литературы, моноциты экспрессируют конститутаивно TIM3 на их поверхности. 1×10 выделенных человеческих CD14⁺-моноцитов (50 мкл/лунку) вносили в 98-луночный с v-образным дном МТР в свежей культуральной среде и инкубировали с жидким Redimune® NF в течение 15 мин при КТ для блокады неспецифического связывания. Затем добавляли из расчета 50 мкл/лунку описанные МАт к TIM3 или референс-МАт к TIM3 344823 (фирма R&D) и F38-2E2 (фирма BioLegend) (10 мкг/мл в среде для культивирования клеток) и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. Затем клетки промывали ЗФР/1% БСА и добавляли в качестве вторичного антитела меченный РЕ козий антимышиный F(ab')₂ (фирма Jackson Lab, 115-006-072) в течение 1 ч при 4°С. После промывки и центрифугирования MFI-сигналы окрашенных клеток анализировали с помощью проточного цитометра фирмы BD Biosciences FACSCanto.

Специфическое связывание рассчитывали следующим образом:

специфическое связывание [MFI]=среднее геометрическое МFI_{образца}- среднее геометрическое MFI_{контроля изотипа}.

Результаты представлены в таблице 23: (Связывание с человеческими моноцитами). Клоны антител к TIM3, такие как Tim3_0016, Tim3_0018, Tim3_0020, Tim3_0028 и Tim3_0038 связывались с человеческими моноцитами различных доноров даже лучше, чем референс-Ат к TIM3.

Пример 26

Связывание антител к TIM3 с выделенными моноцитами обезьян циномолгус (cyno), экспрессирующими TIM3

CD14⁺-моноциты выделяли из обработанной антикоагулянтом периферической крови обезьян циномолгус путем центрифугирования в градиенте плотности, с использованием фиколл-пака (фирма GE Healthcare) (см. общие протоколы в руководствах для пользователей или на сайте www.miltenyibiotec.com/protocols) и затем подвергали позитивной селекции с использованием NHP CD14-микрогранул. Сначала CD14⁺-клетки метили магничными частицами с использованием CD14-микрогранул. Затем суспензию клеток вносили на колонку MACS®, которую помещали в магнитное поле MACS-сепаратора. Меченные магнитными частицами CD14⁺-клетки задерживались на колонке. Немеченые клетки проходили через колонку, эта клеточная фракция была истощена по CD14⁺-клеткам. После удаления колонки из магнитного поля сохранившие магнитные свойства CD14⁺-клетки можно элюировать в качестве клеточной фракции, прошедшей позитивную селекцию. После центрифугирования при 200 × g в течение 10 мин при комнатной температуре моноциты собирали и применяли непосредственно для анализа связывания или ресуспендировали в среде для замораживания (10% ДМСО, 90% FCS) из расчета 1,0Е+07 клеток/мл и хранили в жидком азоте.

Как известно из литературы, моноциты экспрессируют конститутаивно TIM3 на их поверхности. 1×10⁵ выделенных обезьяньих (cyno) CD14⁺-моноцитов (50 мкл/лунку) вносили в 98-луночный с v-образным дном МТР в свежей культуральной среде и инкубировали с жидким Redimune® NF в течение 15 мин при КТ для блокады неспецифического связывания. Затем добавляли из расчета 50 мкл/лунку меченные Alexa488 антитела к TIM3 (10 мкг/мл в среде для культивирования клеток) и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. После промывки и центрифугирования MFI-сигналы окрашенных клеток анализировали с помощью проточного цитометра фирмы BD Biosciences FACSCanto.

Специфическое связывание рассчитывали следующим образом:

специфическое связывание [MFI]=среднее геометрическое МFI_{образца} - среднее геометрическое MFI_{контроля изотипа}.

Результаты представлены в таблице 24 (Связывание с моноцитами обезьян циномолгус). Клоны антител к TIM3, такие как Tim3_0016, Tim3_0018, Tim3_0026, Tim3_0028 и Tim3_0030 связывались с моноцитами cyno из различных обезьян-доноров.

Пример 27

Связывание антител к TIM3 с клеточными линиями NHL (неходжскинская лимфома) и ММ (множественная миелома), экспресирующими TIM3

Способность к связыванию описанных антител к TIM3 и двух клонов референс-антител к TIM3 (1) 4177 и (2) 8213 (фирма Kyowa) анализировали с помощью FACS. В целом, метод состоял в следующем: экспрессирующие человеческий TIM3 клетки В-клеточной лимфомы (примером которых являются клетки Пфайффера) и клетки множественной миеломы (примером которых являются RPMI-8226-клетки) инкубировали с реагентом фирмы BD, блокирующим человеческий Fc, в течение 10 мин при КТ для блокады неспецифического связывания. Затем 2×10⁵ клеток (50 мкл/лунку) вносили в 98-луночный с v-образным дном МТР и добавляли из расчета 50 мкл/лунку меченные Alexa488 антитела к TIM3 (10 мкг/мл в буфере для окрашивания фирмы BD) и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. После промывки и центрифугирования MFI-сигналы окрашенных клеток анализировали с помощью проточного цитометра фирмы BD Biosciences FACSCanto.

Специфическое связывание рассчитывали следующим образом:

специфическое связывание [MFI]=среднее геометрическое MFI_{образца} - среднее геометрическое MFI_{контроля изотипа}.

Результаты представлены на фиг. 2А и 2Б (Связывание с клетками RPMI-8226 и клетками Пфайффера).

Цитотоксическая активность антител к TIM3 на экспрессирующих TIM3 клетках NHL и ММ

TIM3-специфические антитела, конъюгированные с экзотоксином Pseudomonas (РЕ 24), эффективно уничтожали экпрессирующие TIM3 клетки. Цитотоксическую активность описанных антител к TIM3 и одного поступающего в продажу референс-антитела к TIM3 клона 11Е365 (доступно от фирмы US Biological) анализировали с использованием люминисцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы Promega (CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay). В целом, метод состоял в следующем: к 5×10³ (50 мкл/лунку в 98-луночном МТР, в трех повторностях) рекомбинантных СНО K1-клеток, стабильно экспрессирующих человеческий TIM3, или 2×10⁴ клеток (50 мкл/лунку в 98-луночном МТР, в трех повторностях) экспрессирующих человеческий TIM3 клеток В-клеточной лимфомы (например, клетки Пфайффера) или клеток множественной миеломы (например, RPMI-8226-клетки) добавляли из расчета 25 мкл/лунку серийное разведение 1:5 описанных антител к TIM3 в наиболее высокой из изученных концентраций 10 мкг/мл или добавляли соответствующие среды к необработанным клеткам, или контроль изотипа к обработанным клеткам, которые не являются мишенями. Для обработок применяли антитела в диапазоне от 10 мкг/мл до 1 нг/мл в трех повторностях. Все антитела применяли в виде полноразмерных мышиных Fcγ-версий. Для конъюгации с экзотоксином Pseudomonas добавляли специфические в отношении мышиного Fcγ-фрагмента Fab, конъюгированные с РЕ 24 (10 мкг/мл), и инкубировали в течение 3 дней при 37°С. В качестве положительного контроля применяли циклогексимид, известный ингибитор синтеза белков у эукариот. Жизнеспособность обработанных клеток измеряли с помощью люминисцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы Promega.

Цитотоксическую активность рассчитывали следующим образом:

относительное ингибирование [%]=(1-(Е_{образца} - Е_{отрицательного контроля})/(Е_{положительного контроля} - E_{отрицательного контроля}))×100

Результаты представлены в таблице 25.

Все протестированные клоны антител к TIM3 обладали высокой эффективностью (диапазон IC₅₀ 0,01-0,2нМ) в отношении рекомбинантных клеток СНО K1, стабильно экспрессирующих человеческий TIM3, и клеток Пфайффера, экспрессирующих высокие и средние уровни TIM3, и являлись даже более эффективными касательно их цитотоксической активности, чем сильно интернализирующееся референс-Ат к TIM-3 клона 11Е365 (фирма US Biological). Клоны анти-Т1М3 0016, 0018, 0021, 0022, 0033 и 0038 обладали также эффективностью в отношении RPMI-8226-клеток, которые экспресировали в 5 раз более низкие уровни TIM3 по сравнению с рекомбинантными клетками СНО TIM3.

Пример 28: Сравнение цитотоксической активности описанных антител к TIM3 и двух референс-антител к TIM3 1.7.Е10 и 27-12Е12 (описанных в WO 2013/06490)

Цитотоксическую активность описанных антител к TIM3 и двух референс-антител к TIM3 1.7.Е10 и 27-12Е12, которые описаны в WO 2013/06490, анализировали с помощью описанного выше люминисцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы Promega. Все антитела применяли в формате полноразмерного человеческого IgG1, включающего Fсгамма-область. В этом эксперименте конъюгацию экзотоксина Pseudomonas осуществляли через специфические в отношении человеческого Fcγ-фрагмента Fab, конъюгированные с РЕ 24 (10 мкг/мл), которые добавляли и инкубировали в течение 5 дней при 37°С.

Результаты представлены в таблице 26.

Все описанные клоны антител к TIM3 обладали высокой активностью (диапазон IC₅₀ 0,02-0,08нМ) в отношении клеток Пфайффера и RPMI-8226, экспрессирующих TIM3, и являлись даже более эффективными касательно их цитотоксической активности, чем сильно интернализирующееся референс-Ат к TIM-3 клона 27-12Е12. Все антитела сравнивали в виде конъюгатов с экзотоксином Pseudomonas (PE24) с использованием одного и того же экзотоксина Pseudomonas в одинаковых условиях.

Пример 28

Цитотоксическая активность Fab-РЕ24-конструкций описанных антител к TIM3 в отношении клеточных линий MM, NHL и AML (которые экспрессируют TIM3. но не PSMA)

Цитотоксическую активность анализировали с помощью описанного выше люминисцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы Promega. Серийные разведения 1:5 Fab-фрагментов описанных антител к TIM3, непосредственно конъюгированных с PE24, в наиболее высокой из изученных концентраций 50 мкг/мл или соответствующие среды в случае необработанных клеток, или несвязывающися контрольные анти-PSMA Fab-PE24 в случае обработанных клеток, которые не являются мишенями, инкубировали с 7,5×10³ клеток Пфайффера или 2×10³ RPMI-8226-клеток (50 мкл/лунку в 98-луночном МТР) в течение 4 дней при 37°С. Для обработок применяли антитела в диапазоне от 50 мкг/мл до 8 нг/мл в трех повторностях. Циклогексимид применяли в качестве положительного контроля. Результаты представлены в таблице 27.

Все протестированные Fab-РЕ24-конструкции описанных антител к TIM3 обладали высокой эффективностью (диапазон IC₅₀ 1-10нМ) в отношении клеток MM (RPMI-8226) и NHL (Karpas-299), экспрессирующих средние уровни TIM3, и обладали выраженной цитотоксической активностью в отношении линий клеток AML (CMK, TF-1, MOLM-13), экспрессирующих очень низкие уровни TIM3.

Пример 29

Цитотоксическая активность иммуноконъюгатов (конъюгаты с экзотоксином A Pseudomonas (Fab-РЕ24-конструкции) описанных антител к TIM3 в отношении первичных лейкозных стволовых клеток/клеток-предшественников AML из пациентов с рецидивирующими/рефрактерными формами заболевания

CD34⁺-клетки из периферической крови пациентов с рецидивирующими/рефрактерными формами получали от фирмы AllCells, LLC, Аламеда, шт. Калифорния. После подтверждения чистоты и жизнеспособности всех образцов (диапазон чистоты 84-94% и диапазон жизнеспособности 95-99%) оценивали уровень экспрессии TIM3 согласно методу, описанному в примере 7, используя МАт к TIM3 344823 (фирма R&D) (см. фиг. 31). Для всех протестированных (4/4) образцов (CD34⁺) AML из крови пациентов с рецидивирующими/рефрактерными формами продемонстрировано наличие гомогенной экспрессии различных уровней TIM3.

Для оценки цитотоксической активности Fab-РЕ24-конструкций описанных клонов антител к TIM3 0016 и 0022 в отношении первичных CD34⁺-клеток AML 1×10⁴ клеток (50 мкл/лунку в 98-луночном МТР, в трех повтороностях) инкубировали с серийными разведениями 1:5 Fab-фрагментов в наиболее высокой из изученных концентраций 50 мкг/мл или с соответствующими средами в случае необработанных клеток или с несвязывающимся контрольным анти-PSMA Fab-PE24 в случае обработанных клеток, которые не являются мишенями, в течение 3 дней при 37°С. Циклогексимид применяли в качестве положительного контроля. Цитотоксическую активность анализировали с помощью описанного выше люминисцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы Promega согласно методу, описанному в выше примере 28.

Результаты представлены в таблице 28. (Цитотоксическая активность Fab-РЕ24-конструкций описанных антител к TIM3 в отношении первичных CD34⁺-клеток AML).

Fab-РЕ24-конструкции антител к TIM3 Tim3_0016 и Tim3_0022 обладали высокой эффективностью в отношении (2/4) образцов первичных AML-клеток (РВ0142 и РВ0135) (диапазон IC₅₀ 30-116нМ) и обладали существенной цитотоксической активностью в отношении всех (4/4) первичных лейкозных стволовых клеток/клеток-предшественников (CD34+) AML-клеток, экспрессирующих различные уровни TIM3.

Пример 30

Сравнение эффективности Fab-РЕ24-конструкций отобранных антител к TIM3 в отношении линий клеток NHL и ММ

Цитотоксическую активность сшитых с сортазой Fab-РЕ24-конструкций отобранных антител к TIM3 анализировали с помощью люминисцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы Promega, описанного выше в примере 28.

Результаты представлены в таблице 29.

Продемонстрирована высокая цитотоксическая эффективность для Fab-РЕ24-конструкций всех отобранных описанных антител к TIM3 (диапазон IC₅₀ 0,3-5нМ) в отношении клеток NHL (клетки Пфайффера) и ММ (клетки RPMI-8226), которые экспрессировали средний уровень TIM3.

Наиболее высокая цитотоксическая активность обнаружена при применении Fab-РЕ24-конструкций описанных антител к TIM-3 Tim3_ 0016 и Tim3 0038.

Пример 31

Сравнение цитотоксической активности Fab-РЕ24-конструкции и конъюгата полный IgG-аматоксин одного и того же клона описанного антитела к TIM3 в отношении клеток Пфайффера

Оценку цитотоксической активности конъюгированной с Fab-PE24 конструкции описанного антитела к TIM3 клона 0016 в сравнении с полным IgG этого же клона, конъюгированного с аматоксином (полученным согласно процедуре, описанной в WO 2012/041504 (конъюгация через 6' С-атом аминокислоты 4 аматоксина, прежде всего через атом кислорода, связанный с 6' С-атомом аминокислоты аматоксина, и с которым антитело к TIM3 связано с помощью линкера через остаток мочевины), осуществляли с помощью люминисцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo фирмы Promega, описанного выше в примере 12.

Результаты представлены в таблице 30.

Цитотоксическая активность конъюгированного с аманитином (аматотоксин) антитела к TIM3 клона 0016 (IC₅₀ 0,8нМ) оказалась сопоставимой с цитотоксической активностью Fab-РЕ24-конструкции этого же клона (IC₅₀ 0,3нМ) в отношении клеток NHL (клетки Пфайффера), которые экспрессируют средний уровень TIM3.

Пример 32

Обработка пациентов и образцов опухолей

Свежевырезанные пораженные солидными опухолями образцы, и злокачественные выпоты собирали у 34 пациентов с немелкоклеточным раком легкого, 7 пациентов с раком яичника и 1 пациента с почечно-клеточной карциномой (RCC). Образцы пораженных солидными опухолями тканей механически измельчали и расщепляли аккутазой (фирма РАА), коллагеназой IV (фирма Worthington), гиалуронидазой (фирма Sigma) и ДНКазой типа IV (фирма Sigma) непосредственно после иссечения. Получали суспензии единичных клеток. Клеточную фракцию злокачественных выпотов выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности, используя Histopaque-1119 (фирма Sigma). Все образцы хранили в жидком азоте до дальнейшего использования. Исследование одобрено местным наблюдательным советом по этике (Ethikkommission Nordwestschweiz, Комиссия по этике Северо-Западной Швейцарии).

Пример 33

Характеризация образцов опухолей

Все образцы опухолей всесторонне характеризовали с помощью многоцветной проточной цитометрии. Для анализа методом проточной цитометрии использовали следующие антитела: α(анти)-CD4-РЕ, α-CD8-PE-Cy7, α-CD11b-PerCP-eFluor710, α-CD45-PE-Cy7, α-CD45-PerCP-Cy5.5, α-CD137-ФИТЦ, α-BTLA-биотин, α-CTLA-4-PE, α-ICOS-ФИТЦ, α-IFN-γ-ФИТЦ, α-Lag-3-APC (все фирмы eBioscience), α-CD3-PECF594, α-CD25-BV605, α-CD69-ФИТЦ, α-ЕрСАМ-ФИТЦ, α-гранзим В-РЕ, α-активная каспаза 3-РЕ, α-PD-1-BV605, стрептавидин-BV711 (все фирмы BD Bioscience), α-CD45RA-BV421, α-CCR7-AlexaFluor647, α-FoxP3-AlexaFluor647, α-TIM3-BV421, α-TIM3-BV605 (все фирмы Biolegend). Мертвые клетки окрашивали с помощью набора для фиксации и окрашивания мертвых клеток в ближней инфракрасной области LIVE/DEAD® (LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain) или с помощью набора для фиксации и окрашивания синим цветом мертвых клеток LIVE/DEAD® (LIVE/DEAD® Fixable Blue Dead Cell Stain) (фирма Invitrogen). Для внутриклеточного окрашивания применяли буферы для фиксации и пермеабилизации фирмы eBioscience. Данные для образцов получали с помощью проточной цитометрии с использованием устройства фирмы BD LSR Fortessa. Все наборы для ELISA, предназначенные для оценки человеческих IL-2, IFN-γ и TNF, получали от фирмы BD Bioscience.

CD8⁺- и CD4⁺-Т-клетки (CD45⁺CD3⁺) характеризовали в отношении экспрессии поверхностных маркеров PD-1, TIM3, CTLA-4, Lag-3, BTLA, CD25, CD69, CD137, ICOS, CD45RA и CCR7. Опухолевые клетки (CD45^-EpCAM⁺) характеризовали в отношении экспрессии FolR1 в сравнении со связыванием FolR1-специфического антитела с его контролем соответствующего изотипа. Только образцы, позитивные по экспрессии FolR1 применяли для обработки FolR1-TCB, а образцы, экспрессирующие ЕрСАМ, для обработки катумаксомабом соответственно.

Пример 34

Обработка ex vivo образцов опухолей с помощью FolR1-TCB

FolR1-позитивные ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты подвергали оттаиванию, промывали и высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты для культуры клеток (фирма BD Falcon) с плотностью 3×10⁵ клеток/200 мкл/лунку в полную среду (DMEM+пируват натрия (1 мМ)+заменимые аминокислоты MEM (1x)+L-глутамин (2 мМ)+пенициллин/стрептомицин (100 нг/мл)+2-меркаптоэтанол (50нМ)+ципроксин (1 мг/мл)+10% человеческой сыворотки). Образцы культивировали в присутствии или в отсутствии FolR1-TCB или DP47 ТСВ в концентрации 2нМ в течение 24 ч. Активацию CD8⁺- и CD4⁺-Т-клеток (CD45⁺CD3⁺) после обработки FolR1-ТСВ определяли с помощью многоцветной проточной цитометрии, измеряя уровень экспрессии маркеров клеточной поверхности CD25, CD69, CD137, ICOS, PD-1 и TIM3. Кроме того, определяли уровень экспрессии гранзима В и IFN-γ с помощью внутриклеточного окрашивания. Концентрацию IL-2 в супернатантах клеточных культур измеряли с помощью ELISA (набор ELISA для человеческого IL-2, фирма BD OptEIA) согласно инструкциям производителя.

Пример 35

Обработка ех vivo образцов опухолей катумаксомабом

Трехфункциональную ТСВ-молекулу катумаксомаб (Removab®) получали от фирмы Fresenius. Применяли экспериментальные условия, сходные с описанными выше для FolR1-ТСВ. В целом, метод состоял в следующем:

ЕрСАМ-позитивные ферментативно расщепленные образцы опухолей или злокачественные выпоты культивировали в присутствии или в отсутствии катумаксомаба в концентрации 10 нг/мл в течение 24 ч. Анализ CD8⁺- и CD4⁺-позитивных Т-клеток (CD45⁺CD3⁺) осуществляли согласно описанному выше методу.

Пример 36

Анализ цитолиза

Для определения индуцированного FolR1-TCB цитолиза опухолевых клеток 3×10⁴ меченных CFSE Skov3-клеток совместно культивировали с образцами опухолей в присутствии или отсутствии FolR1-TCB в концентрации 2нМ в течение 24 ч в 96-луночных плоскодонных планшетах для культуры клеток. Соотношение Е:Т (Е: эффекторные CD45⁺CD3⁺-Т-клетки; Т: FolR1⁺-клетки-мишени из опухоли и добавленные Skov3-клетки) доводили до 1:1 в каждой лунке и количество клеток в добавленных образцах опухолей рассчитывали для каждого образца с помощью предварительной характеризации с использованием проточной цитометрии. Клеточную гибель Skov3-клеток определяли с помощью проточной цитометрии, измеряя уровень активированной касапазы 3 и маркера живых/мертвых клеток с помощью анализа Live/Dead® в ближней инфракрасной области. Анализ проводили в трех повторностях. Опосредуемый FolR1-TCB цитолиз рассчитывали согласно следующему уравнению: % специфического цитолиза = 100 - [(% живых клеток Skov3 в обработанном FolR1-TCB образце/% живых клеток Skov3 в необработанном образце) × 100].

Для сравнения индуцированной FolR1-TCB цитолитической способности Т-клеток между образцами опухолей и для исключения дополнительных факторов, подавляющих функциональность Т-клеток, таких как экспрессия PD-L1 на опухолевых клетках, при создании изобретения экзогенно добавляли меченные CFSE FolR1⁺-клетки линии Skov3 к ферментативно расщепленным образцам опухолей и доводили соотношение Е:Т до 1:1, в целом, согласно описанному выше методу. Затем измеряли индуцированный FolRl-TCB цитолиз меченных CFSE Skov3-клеток, что позволяло включать в анализ также FolR1^--образцы опухолей. Поскольку некоторые опухоли из первоначальной группы нельзя было использовать для характеризации опосредуемого ТСВ цитолиза опухолевых клеток из-за очень низкого количества эффекторных клеток, анализировали другую группу, состоящую из 12 ферментативно расщепленных образцов опухолей и 5 злокачественных выпотов из 15 пациентов с немелколклеточным раком легкого (NSCLC) и двух пациентов с эпителиальной карциномой яичника (ЕОС). Все образцы анализировали в отношении содержания в них CD3⁺- эффекторных клеток и FolR1⁺-клеток-мишеней (фиг. 39). Вызывающие цитолиз клеток опухолей CD3⁺-Т-клетки из пациентов сравнивали с полученными из РВМС здоровых доноров Т-клетками. Обнаружена значительная гетерогенность в цитолизе опухолевых клеток между отдельными пациентами (26±11,8%) через 24 ч (фиг. 12П). Следует отметить, что CD3⁺-Т-клетки из здоровых доноров индуцировали существенно более высокий цитолиз, чем TIL (опухольинфильтрующий лимфоцит) (42,8±9,7%, p=0,013). Экспозиция контрольной ТСВ, которая не связывалась с опухолевым антигеном (ТСВ DP47), не индуцировала никакого цитолиза опухолевых клеток.

Пример 37

Поликлональная стимуляция антителами к CD3/CD28

96-луночный плоскодонный планшет предварительно сенсибилизировали 0,5 мкг/мл антитела к CD3ε (клон ОКТ3, фирма Biolegend) в течение 2 ч при 37°С. Затем раствор антитела удаляли и планшет интенсивно промывали. Суспензии замороженных опухолей подвергали оттаиванию, промывали и культивировали из расчета 3×10⁵ клеток/200 мкл/лунку в полной среде с 2 мкг/мл антитела к CD28 (клон 28.2, фирма eBioscience) в течение 24 ч. После инкубации в течение 24 ч клетки собирали, промывали и анализировали с помощью проточной цитометрии в отношении экспрессии маркеров активации, например, CD25, и маркеров эффекторных функций Т-клеток, например, гранзима В и IFN-γ на CD8⁺-Т-клетках. Супернатанты собирали для осуществления ELISA-анализа в отношении IL-2, IFN-γ и TNF-α, который осуществляли согласно инструкциям производителя.

Пример 38

Восстановление Т-клеточной функции путем блокады PD-1

Ферментативно расщепленные образцы опухолей стимулировали агонистическими антителами к CD3 и к CD28, описанными выше, в присутствии 10 мкг/мл/лунку антитела к PD-1 (MDX5C4) или без антитела и инкубировали в течение 24 ч. Через 24 ч клетки собирали, промывали и анализировали с помощью проточной цитометрии. Супернатанты собирали для осуществления ELISA-анализа в отношении IL-2, IFN-γ и TNF-α, который осуществляли согласно инструкциям производителя.

Пример 39

Активация Т-клеток в ферментативно расщепленных образцах опухолей и злокачественных выпотах с помощью FolR1-TCB

Активирующие Т-клетки биспецифические антитела, связывающиеся с CD3 и фолатным рецептором 1 (Mov19 на основе FolR1-TCB), и контрольное антитело ТСВ DP47 получали от фирмы Roche Glycart. Антитело к PD-15C4 описано в US №800,449. В качестве антитела к TIM3 применяли антитело F38-2EL. Для характеризации с помощью проточной цитометрии экспрессии FolR1 применяли антитело к FolR1-APC (ак 25-233) фирма LifeSpanBiosciences и контрольное антитело соответствующего изотипа (фирма Biolegend). В образцах пораженных опухолями тканей из 15 пациентов с FolR1⁺-опухолями характеризовали активацию Т-клеток, индуцированную FolR1-TCB. Образцы включали 9 суспензий единичных клеток и 6 злокачественных выпотов пациентов с NSCLC (n=7), раком яичника (n=7) и почечно-клеточным раком (n=1). Количество CD3⁺-Т-клеток и опухолевых FolR1⁺-клеток сильно варьировало между пациентами (CD3⁺: среднее 33,9%±стандартное отклонение 16,6%, FolR1⁺: 17,1%±16,8%). Характеризация экспрессии ингибирующих рецепторов PD-1, TIM3, CTLA-4, Lag-3 и BTLA на Т-клетках подтвердило высокую гетерогенность между пациентами (фиг. 11А-Б). В то время как для инфильтрующих опухоли CD8⁺-Т-клеток характерны высокие уровни PD-1, TIM3 и CTLA-4 (31,6%±25%; 22,2%±20,8% и 18,7%±14,4% соответственно), Lag-3 и BTLA экспрессировались только в очень небольшом количестве клеток у всех пациентов этой группы (3,5%±4,9% и 2,3%±1,7% соответственно). Ингибирующие рецепторы на CD4⁺-Т-клетках распределялись аналогичным образом с некоторым преобладанием экспрессии CTLA-4.

Для определения индуцированной FolR1-TCB активации Т-клеток образцы опухолей культивировали в присутствии или отсутствии FolR1-TCB или контрольной молекулы ТСВ DP47. Затем Т-клетки характеризовали с помощью многоцветной проточной цитометрии в отношении экспрессии маркеров активации и Т-клеточных эффекторных функций согласно описанному выше методу. На фиг. 12А-П продемонстрировано наличие высокой гетерогенности индуцированной FolR1-TCB активации Т-клеток между пациентами. В частности, у основного большинства пациентов обнаружена экспрессия CD69 уже на исходном уровне, установлена повышающая регуляция CD25, CD137 и ICOS, варьирующая на уровне 9-80%, 2,5-50% и 3,5-71% соответственно. Обнаружено приобретение эффекторных функций, таких как секреция IFN-γ, дегрануляция CD107 и экспрессия гранзима В, варьирующая от 3,7 до 59%, кратность изменения от 1 до 7 или от 1,3 до 64 соответственно (фиг. 12А-И). После обработки FolR1-TCB обнаружена также повышающая регуляция, вне зависимости от исходного уровня экспрессии, ингибирующих рецепторов PD-1 и TIM3, являющихся маркером активации. Экспозиция ТСВ DP47 не индуцировала никакой Т-клеточной активации. Повышающая регуляция CD25 и ICOS, индуцированная стимуляцией FolR1-TCB, оказалась существенно более сильной в периферических CD8⁺-Т-клетках из здоровых доноров, чем в полученных из опухолей CD8⁺-клетках (p=0,002 и p<0,001 соответственно; фиг. 12К, фиг. 12М, фиг. 12Н). Секреция эффекторными Т-клетками цитокинов IFN-γ, IL-2 и TNF после стимуляции FolR1-TCB значительно снижалось среди TIL в большинстве опухолей по сравнению с РВМС из здоровых доноров (p=0,0047, p<0,001 и p=0,006 соответственно; фиг. 12O). Индуцированная FolR1-TCB секреция перфорина сильно варьировала в TIL и серьезно нарушалась в субпопуляции пациентов (фиг.12O).

Аналогично этому, несмотря на более низкую повышающую регуляцию гранзима В, FolR1-TCB индуцировали активацию и приобретение эффекторных функций CD4⁺-Т-клетками (фиг. 25А-И). Для решения вопроса о том, влияет ли избыток Т-клеток внутри опухолей или экспрессия FolR1 на активацию Т-клеток после экспозиции ТСВ, оценивали корреляцию повышающей регуляции маркеров активации с соотношением Е:Т (Е: эффекторные CD45⁺CD3⁺-Т-клетки; Т: FolR1⁺-клетки) и с процентом и уровнем экспрессии опухолевого антигена FolR1⁺-клетками (фиг. 13А-В). Последний показатель определяли на основе среднего значения интенсивности флуоресцении FolR1 на опухолевых клетках (CD45^-EpCAM⁺) с помощью проточной цитометрии (фиг. 13В). Однако ни один из указанных параметров не влиял на активацию Т-клеток, т.е. для эффективной повышающей регуляции маркеров активации и функции оказалось достаточно даже небольшого количества FolR1⁺-клеток, высоких соотношений Е:Т или слабой Т-клеточной инфильтрации. Кроме того, присутствие потенциально иммуносупрессорных клеточных популяций, таких как регуляторные Т-клетки или незрелые миелоидные клетки, не оказывало влияния на Т-клеточную активацию или Т-клеточную функцию.

Пример 40

Индуцированная FolR1-TCB активация Т-клеток обратно коррелирует с экспрессии PD-1 и TIM3

Высокий уровень экспрессии ингибирующих рецепторов описан в качестве отличительного признака истощенных Т-клеток. Такие образом дисфункциональное состояние инфильтрующих опухоли Т-клеток может влиять на эффективность FolR1-TCB и может отвечать, по меньше мере частично, за гетерогенность Т-клеточной активации после экспозиции ТСВ. Поэтому совместная экспрессия ингибирующих рецепторов, измеренная при определении исходного уровня, коррелировала с индуцированной FolR1-TCB повышающей регуляцией маркеров активации и Т-клеточными эффекторными функциями. Поэтому экспрессия и PD-1 и TIM3 на CD8⁺-Т-клетках отрицательно коррелировала с активацией Т-клеток, определенной по экспрессии CD25, CD137 и ICOS. Для CD8⁺-Т-клеток с высоким уровнем экспрессии PD-1 или TIM3 характерен маргинальный эффект после обработки FolR1-TCB, в то время как Т-клетки с низким уровнем экспрессии этих ингибирующих рецепторов могли сильно активироваться обработкой FolR1-TCB (фиг. 14А-И). Измерение индуцированной FolR1-TCB секреции IL-2, стандартизованной относительно содержания Т-клеток в образцах, позволило установить такие же зависимости от уровня экспрессии PD-1 и TIM3 (фиг. 15А-В), хотя индуцированная FolR1-TCB повышающая регуляция гранзима В в меньшей степени зависела от предшествующей экспрессии указанных ингибирующих рецепторов (фиг. 14К-М). Важно отметить, что исходный уровень экспрессии CTLA-4, Lag-3 и BTLA на CD8⁺-Т-клетках не коррелировал с индуцированной FolR1-TCB Т-клеточной активацией (фиг. 26А-В). Экспрессия ингибирующих рецепторов на CD4⁺-Т-клетках была существенно в меньшей степени прогностической для индуцированной FolR1-TCB активации CD4⁺-Т-клеток по сравнению с экспрессией этих же рецепторов на CD8⁺-Т-клетках.

Пример 41

Индуцированный FolR1-TCB цитолиз опухолевых клеток обратно коррелирует с экспрессией PD-1 и TIM3

Для изучения индуцированного FolR1-TCB цитолиза опухолевых клеток при отрегулированном соотношении Е:Т 1:1 экзогенно добавляли меченные CFSE Skov3-клетки к ферментативно расщепленным образцам опухолей, которые содержали предварительно определенное количество CD3⁺-Т-клеток с использованием многоцветной проточной цитометрии. Индуцированный FolR1-TCB цитолиз Skov3-клеток определяли путем измерения активированной каспазы 3 и маркера живых/мертвых клеток. Аналогично с индуцированной FolR1-TCB Т-клеточной активацией, которую измеряли по повышающей регуляции CD25, специфический цитолиз после экспозиции FolR1-TCB отрицательно коррелировал с индивидуальной или совместной экспрессией PD-1 и TIM3 на CD8⁺-Т-клетках. Кроме того, на индуцированный FolR1-TCB цитолиз влиял также исходный уровень экспрессии CTLA-4 и совместной экспрессии PD-1 и CTLA-4. Однако влияние экспрессии CTLA-4 на индуцированный FolR1-TCB цитолиз опухолевых клеток было менее выраженным по сравнению с экспрессией PD-1 и TIM3.

Пример 42

Обработка свежих образцов пораженных опухолями тканей катумаксомабом - активация инфильтрующих опухоли Т-клеток при использовании катумаксомаба и корреляция с экспрессией ингибирующих рецепторов

Для определения степени, в которой катумаксомаб индуцирует активацию Т-клеток, и для подтверждения описанных выше данных, полученных с использованием второй независимой от Т-клеток биспецифической молекулы, 4 ферментативно расщепленных образца опухолей из пациентов с NSCLC обрабатывали катумаксомабом, трехфункциональным биспецифическим антителом, которое распознает CD3 на Т-клетках и ЕрСАМ на опухолевых клетках. Затем Т-клетки характеризовали с помощью проточной цитометрии в отношении экспрессии маркеров активации и Т-клеточных эффекторных функций (фиг. 17А-Г). При валидации полученных при создании изобретения описанных выше данных для FolR1-TCB, установлена значительная гетерогенность индуцированной катумаксомабом активации Т-клеток. Поэтому исходный уровень экспрессии ингибирующих рецепторов различался между пациентами (фиг. 17Д-З).

Анализ Т-клеточной активации и эффекторной функции после обработки катумаксомабом выявил две группы пациентов на основе экспрессии PD-1 и/или TIM3 на CD8⁺-Т-клетках, подтверждающий полученные при создании изобретения данные для FolR1-TCB (фиг. 18А-Т). Клетки, экспрессирующиее PD-1^low, TIM3^low и, в более выраженном случае PD-1^low /TIM3^low не могли активироваться катумаксомабом, в то время как в PD-1^high, TIM3^high и PD-1^high /TIM3^high Т-клетках имела место выраженная повышающая регуляция CD25, CD69, CD137, ICOS, гранзима В и IFN-γ.

Пример 43

Поликлональная стимуляция инфильтрующих опухоль Т-клеток с помощью CD3/CD28 - иммунное фенотипирование инфильтрующих опухоли субпопуляций Т-клеток в образцах немелкоклеточного рака легкого

При создании изобретения исследовали экспрессию коингибирующих Т-клеточных рецепторов и дифференцированных маркеров на инфильтрующих опухоли субпопуляциях CD3⁺CD8⁺- и CD3⁺CD4⁺-Т-клеток из 34 пациентов с NSCLC с помощью многоцветной проточной цитометрии. В большинстве опухолей обнаружен высокий уровень экспрессии ингибирующего рецептора PD-1 (фиг. 19А-Б), основного регулятора Т-клеточного истощения. Следует отметить, что экспрессия других ингибиторов контрольных точек (чекпойнтов), таких как TIM3, CTLA-4, LAG-3 или BTLA, характеризовалась значительной вариацией между Т-клетками, полученными из различных опухолей (фиг.19А-Б).

Пример 44

Кумулятивная экспрессия ингибирующих рецепторов определяет Т-клеточную дисфункцию

В этом примере поликлональную стимуляцию применяли в субоптимальной дозе для оценки воздействия ингибирующих рецепторов на Т-клеточную функцию. Воздействие стимуляции агонистическими антителами к CD3 и к CD28 на активацию Т-клеток, например, на экспрессию CD25, и на эффекторную функцию Т-клеток, которую оценивали на основе производства IFN-γ, TNF-α и IL-2, а также экспрессии гранзима В, значительно варьировалось между пациентами при определении с помощью проточной цитометрии (фиг. 20А-Б) и ELISA (фиг. 20В-Д). Следует отметить, что при создании изобретения обнаружены различные уровни Т-клеточной функции, варьирующие от популяций Т-клеток, которые имели в значительной степени сохраненную Т-клеточную функцию (т.е. характеризовались стабильной экспрессией CD25 и экспрессией гранзима В, а также стабильным производством IL-2, IFN-γ и TNF-α), до популяций Т-клеток с нарушенной Т-клеточной функцией (характеризовавшихся снижением экспрессии CD25 и гранзима В и производства цитокинов).

Для анализа воздействия нескольких ингибирующих рецепторов на функциональность Т-клеток при создании изобретения определяли балл ингибирующих рецепторов (iR) в качестве маркера кумулятивной экспрессии ингибирующих рецепторов на Т-клетках. Для этой цели процент экспрессии PD-1, TIM3, CTLA-4, Lag-3 и BTLA анализировали во всех NSCLC-образцах и определяли балл на основе медианы и межквартильных размахов каждого из экспрессируемых рецепторов и рассчитывали для каждого образца (например, фиг. 21Е). Для инфильтрующих опухоли CD8⁺-Т-клеток, экспрессия которых соответствовала высокому iR-баллу, свидетельствующему об экспрессии нескольких ингибирующих рецепторов, характерен маргинальный эффект после поликлональной стимуляции, коррелирующий с их высоким статусом дисфункции, в то время как Т-клетки с низким iR-баллом могли сильно активироваться в результате поликлональной стимуляции (фиг. 21А-Д). Повышающая регуляция Т-клеточных эффекторных функций, характеризующаяся производством IL-2, IFN-γ и TNF-α, не только коррелировала с кумулятивной экспрессией ингибирующих рецепторов, но также и с экспрессией PD-1 и TIM3, а также и с совместной экспрессией обоих рецепторов (фиг. 22А-И), что свидетельствует о существенном вкладе PD-1 и TIM3 в дисфункцию Т-клеток.

Пример 45

Экспрессия ингибирующих рецепторов

Индивидуальная и кумулятивная экспрессия ингибирующих рецепторов возрастала по мере развития опухолей. Экспрессия ингибирующих рецепторов коррелировала со стадией опухоли и развитием опухоли. Количество позитивных по PD-1, TIM3 и LAG-3 клеток четко возрастало по мере по мере повышения стадий опухоли (фиг. 21Ж-Л). Не обнаружено четкой корреляции с экспрессией CTLA-4, что может свидетельствовать о том, что этот рецептор действует посредством другого механизма ингибирования. Для BTLA, как правило, характерен низкий уровень экспрессии и лишь небольшое увеличение обнаружено на поздних стадиях развития опухолей (фиг. 21Л). Существенное повышение кумулятивной экспрессии ингибирующих рецепторов, выраженной в виде iR-балла, обнаружено у пациентов с нодальным позитивным раком и на поздних стадиях опухолей, в то время как размер первичных опухолей не коррелировал значимо с iR-баллом (фиг. 21М-Н). Эти данные позволяют предположить наличие постепенной и постоянной повышающей регуляции ингибирующих рецепторов в процессе развития опухолей, что наиболее вероятно влияет на Т-клеточное истощение при NSCLC.

Ингибирующие рецепторы постепенно экспрессируются на инфильтрующих опухоли Т-клетках. Для объяснения роли одновременной экспрессии различных ингибирующих рецепторов на единичных Т-клетках анализировали совместную экспрессию этих рецепторов в CD8⁺-Т-клетках (фиг. 32, 33) относительно экспрессии любого из пяти проанализированных рецепторов. Экспрессия выражена в виде мозаичной теплокарты, на которой представлен процент экспрессии для индивидуальных пациентов (фиг. 32), или в виде радарного графика, на котором экспрессия четырех соответствующих рецепторов на CD8⁺-Т-клетках выражена в виде среднего значения и стандартного отклонения, относительно пятого рецептора, обозначающего иммунную контрольную точку (фиг. 33). Для CD8⁺PD-1⁺-Т-клеток установлен наиболее низкий процент среднего уровня экспрессии относительно других ингибирующих рецепторов, в то время как на CD8⁺BTLA⁺-Т-клетках экспрессировались с высоким уровнем все из четырех остальных ингибирующих рецепторов, что свидетельствует о том, что BTLA является маркером наиболее истощенной субпопуляции Т-клеток (фиг. 32, 33). Обнаружено повышение количества совместно экспрессируемых ингибирующих рецепторов от CD8⁺TIM3⁺-Т-клеток к CD8⁺CTLA-4⁺-Т-клеткам и к CD8⁺LAG-3⁺-T-клеткам (фиг. 32, 33). Эти результаты позволяют предположить постепенное вовлечение ингибирующих рецепторов, при этом широко экспрессируемый PD-1 является ранним маркером, а повышающая регуляция BTLA скорее имеет место позднее в процессе истощения Т-клеток.

Пример 46

Блокада PD-1 позволяет частично восстанавливать Т-клеточную функцию Восстановление Т-клеточной функции путем блокады антителами к PD-1 зависит от уровня экспрессии PD-1. При создании изобретения выявлена четкая корреляция между уровнем экспрессии ингибирующих рецепторов, прежде всего PD-1 и TIM3, и активацией Т-клеток после поликлональной стимуляции, блокада путей PD-1 или PD-1/TIM3 может восстанавливать Т-клеточную функцию. Однако добавление блокирующего антитела к PD-1 (5С4) или совместная блокада PD-1 и TIM3 после стимуляции агонистическими антителами к CD3 и к CD28 восстанавливали эффекторную функцию Т-клеток, такую как производство и секреция IL-2, IFN-γ и TNF-α, только у некоторых пациентов, в то время как воздействие на других пациентов оказалось лишь маргинальным (фиг. 23А-Г). В соответствии с указанным для мышиной модели хронической LCMV (вирус лимфоцитарного хориоменингита)-инфекции (Blackburn и др., PNAS 105(39), 2008, с. 15016), при создании изобретения идентифицировали субпопуляции PD-1^hi и PD-1^int инфильтрующих опухоли CD8⁺-Т-клеток из пациентов с NSCLC. В целом метод состоял в следующем: субпопуляции PD-1^hi, PD-1^int и PD-1^neg можно идентифицировать на основе измеренных уровней интенсивности флуоресценции. Клетки из 33 пациентов анализировали в отношении экспрессии PD-1 для определения единых параметров для воспроизводимого распознавания трех субпопуляций. Анализ перекрывал полный спектр уровней экспрессии PD-1 и включал образцы опухолей с четко разделенными популяциями PD-1^neg или PD-1^hi. Это позволяло устанавливать дискриминационные окна при осуществлении этого анализа, которые затем применяли для всех образцов.

Установлено, что только субпопуляции экспрессирующих PD-1^int-Т-клеток могли восстанавливать активацию после блокады PD-1 или комбинированной блокады PD-1/TIM3, в то время как никакого воздействия на активацию Т-клеток не обнаружено при блокаде PD-1^hi-клеток (фиг. 24). Последнее может свидетельствовать об «истощенном» в большей степени фенотипе, который может обладать устойчивостью к блокаде только PD-1.

При создании изобретения этот результат был подтвержден на Т-клетках, активированных FolR1-TCB. Т-клетки стимулировали FolR1 согласно описанному выше методу. Блокада PD-1 еще более усиливала индуцированную FolR1-TCB Т-клеточную активацию Т-клеток из субпопуляции пациентов.

Измерение индуцированной FolR1-TCB секреции IFN-γ, TNF и IL-2, стандартизованной относительно содержания Т-клеток в образцах, подтвердило, что полученные из пациентов популяции клеток со значительным количеством экспрессирующих PD-1^hi (примерно>15%) клеток, не могли секретировать указанные цитокины. В противоположность этому, секрецию цитокинов удалось индуцировать в большинстве полученных из пациентов популяциях клеток с более низким количеством экспрессирующих PD-1^hi (примерно <15%) клеток (фиг. 27А-В). В последней группе добавление блокирующего антитела к PD-1 или комбинированной блокады PD-1 и TIM3 после стимуляции с помощью FolR1-TCB стимулировало повышенное производство IL-2, IFN-γ и TNF-α (фиг. 28А-Е). Таким образом, субпопуляция, экспрессирующая PD-1^hi, может иметь в большей степени «истощенный» фенотип, который может обладать устойчивостью к блокаде только PD-1.

Таким образом, эффекторные функции Т-клеток, такие как производство IL-2, ifn-γ и TNF-α, можно восстанавливать в TIL из некоторых пациентов с NSCLC, в то время как у других пациентов можно достигать лишь маргинальное восстановление функций Т-клеток. Повышение производства цитокинов в ответ на стимуляцию антителами к CD3/CD28 в комбинации с обработкой блокирующим антителом к PD-1 сравнивали с процентом PD-1^hi CD8⁺-Т-клеток на пациента из PD-1-позитивной популяции. Повышение экспрессии цитокинов после блокады PD-1 обратно коррелировало с процентом PD-1^hi Т-клеток, что свидетельствует о том, что пациенты, у которых имеет место экспрессия PD-1^hi- Т-клеток в большем количестве, слабо реагируют на блокаду только PD-1 (фиг. 24А-В). Поскольку дисфункция Т-клеток коррелирует с экспрессией нескольких ингибирующих рецепторов (т.е. пациенты с высоким iR-баллом), и ответ на направленную на PD-1 терапию коррелирует с уровнями экспрессии PD-1 на CD8⁺-Т-клетках, при создании изобретения анализировали также экспрессию TIM3, CTLA-4, LAG-3 и BTLA в PD-1^hi и PD-1^int CD8-Т-клетках. Важно отметить, что PD-1^hi Т-клетки экспрессировали значительно более высокие уровни дополнительных рецепторов по сравнению с PD-1^int субпопуляциями (фиг. 34). Таким образом, по уровню PD-1^hi и PD-1^int можно идентифицировать две различные популяции Т-клеток, при этом PD-1^hi Т-клетки могут иметь в большей степени «истощенный» фенотип, который не может восстанавливаться при блокаде только PD-1.

В настоящем изобретении представлены полученные впервые результаты всестороннего фенотипического и функционального анализа инфильтрующих опухоли CD8⁺-Т-клеток из пациентов с NSCLC. Данные свидетельствуют о том, что эти клетки главным образом имеют эффекторный фенотип, характерный для клеток памяти (CCR7-CD45RAlow), и обладают значительной гетерогенностью касательно экспрессии ингибирующих рецепторов, таких как PD-1, TIM3, CTLA-4, LAG-3 и BTLA. Однако обнаружено четкое увеличение количества рецепторов, экспрессируемых на инфильтрующих опухоли лимфоцитах (TIL) из опухолей на более поздних стадиях, что отражает прогрессивное развитие дисфункции Т-клеток в процессе развития опухолей. Представленные в настоящем описании данные свидетельствуют о том, что эффекторные функции TIL могут нарушаться у огромного большинства пациентов, и это нарушение коррелирует с экспрессией ингибирующих рецепторов. Для восстановления Т-клеточной функции с помощью приемлемого для клинического применения процесса при создании настоящего изобретения объединяли поликлональную стимуляцию Т-клеток с опосредуемым антителом ингибированием PD-1. Воздействие блокады PD-1 на функциональность Т-клеток варьировало между TIL из различных пациентов, но его можно прогнозировать путем оценки процента CD8⁺-Т-клеток, экспрессирующих высокие уровни PD-1.

Таким образом, при создании изобретения удалось продемонстрировать, что функциональность TIL может коррелировать и на нее может оказывать значительное воздействие количество и уровень экспрессии ингибирующих рецепторов. Следует отметить, что даже Т-клетки, экспрессирующие низкие уровни ингибирующих рецепторов, имели в некоторой степени нарушенную функциональность, так секреция IL-2 оказалась нарушенной у огромного большинства пациентов. В целом, активация и эффекторная функция CD8⁺-Т-клеток обратно коррелировали с кумулятивной экспрессией ингибирующих рецепторов, что свидетельствует о непосредственном вкладе различных ингибирующих путей в дисфункцию Т-клеток при NSCLC.

Проведенный при создания изобретения анализ пяти ингибирующих рецепторов на инфильтрующих опухоли CD8⁺-Т-клетках продемонстрировал четкое повышение индивидуальной и кумулятивной экспрессии этих ингибирующих рецепторов в тканях опухолей из пациентов с NSCLC, которые имеют пораженные опухолью лимфатические узлы и поздней стадии развития опухолей. Экспрессия CTLA-4 отличалась от экспрессии других четырех рецепторов наиболее высоким процентом позитивных клеток на ранних стадиях, что может свидетельствовать об отличной от других рецепторов роли CTLA-4 в регуляции Т-клеточного иммунитета (Topalian и др., Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 антитело in cancer. N. Engl. J. Med. 366, 28 июня 2012, с. 2443). Анализ совместной экспрессии дополнительных ингибирующих рецепторов на единичных клетках относительно экспрессии одного из указанных рецепторов продемонстрировал постепенное увеличение от ранней к более поздней стадии повышающей регуляции PD-1 и BTLA соответственно. Это может отражать динамический процесс Т-клеточного истощения.

Результаты, представленные в настоящем описании, свидетельствуют о клинической значимости экспрессии ингибирующих рецепторов при развитии NSCLC, что ассоциировано с прогрессирующим недостатком иммунного контроля при росте опухолей. При создании изобретения задокументированы две популяции инфильтрующих опухоли CD8⁺-Т-клеток, характеризующиеся различными уровнями экспрессии PD-1 (субпопуляции PD-1^hi и PD-1^int). Частота встречаемости PD-1^hi-Т-клеток не коррелировала с процентом экспрессии PD-1.

Важно отметить, что при создании изобретения было обнаружено, что воздействие блокады PD-1 коррелировало с уровнями экспрессии PD-1, что характеризовалось минимальным воздействиями на чувствительность TIL с наиболее высоким относительным содержанием субпопуляцией PD-1^hi. Эти результаты согласуются с данными экспериментов, проведенных на мышиной модели с хронической LCMV-инфекцией, согласно которым субпопуляция PD-1^int DbGP33-специфических CD8⁺-Т-клеток могла восстанавливаться после блокады PD-1. В противоположность этому, субпопуляция PD-1^hi по-видимому была более «истощенной», т.е. имела признаки функционального истощения и слабо реагировала на блокаду PD-1. Таким образом, уровень экспрессии PD-1 может являться новым маркером, который позволяет различать субпопуляции Т-клеток при некоторых видах человеческого рака и может служить прогностическим фактором ответов на лечение антителами, блокирующими PD-1.

Пример 47

Активация Т-клеток из здоровых доноров и страдающих раком пациентов с помощью FolR1-TCB

Для оценки воздействия FolR1-TCB на активацию Т-клеток мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) здоровых доноров совместно культивировали с линией FolR1⁺-клеток рака яичника Skov3 (фиг. 40А). После воздействия возрастающих концентраций FolR1-TCB от 0,6пМ до 2нМ в течение 24 ч обнаружена сильная активация CD8⁺-Т-клеток с повышающей регуляцией CD25, CD137 и ICOS. Кроме того, Т-клетки секретировали IL-2, IFN-γ и TNF. Экспозиция ТСВ DP47, т.е. ТСВ, направленной против нерелевантного антигена, не индуцировала какую-либо активацию Т-клеток (фиг. 40Б и В).

Пример 48

Экспрессия ингибирующих рецепторов сильно различается в инфильтрующих опухоли CD8⁺-Т-клетках

Поскольку присутствующие в опухолях Т-клетки часто отличаются фенотипом с высокой степенью дисфункциональности, обнаруженная гетерогенность касательно активации Т-клеток среди различных пациентов после стимуляции FolR1-TCB, может являться следствием нарушенной функциональности TIL. Отличительным признаком дисфункциональности Т-клеток как при хронических вирусных инфекциях, так и в опухолях является сверхэкпрессия ингибирующих рецепторов. По этой причине при создании изобретения определяли экспрессию иммунных контрольных точек PD-1, TIM3, CTLA-4, Lag-3 и BTLA на инфильтрующих опухоли CD8⁺-Т-клетках во всех образцах опухолей. При создании изобретения обнаружено высокое разнообразие в частоте и объединенной экспрессии этих рецепторов для различных опухолей; было установлено, что PD-1 является наиболее часто встречающимся ингибирующим рецептором с наиболее высоким процентом экспрессии (60,2±30%), далее в порядке убывания за ним следовали TIM3 (29,5±24,4%), CTLA-4 (24,6±17,6%), Lag-3 (7,0±5,9%) и BTLA (3,9±2,6%) (фиг. 35Е). Как описано выше для мышиной модели хронической вирусной инфекции (Blackburn и др., Proc Nati Acad Sci USA 105(39), 2008, ее. 15016-15021) и как продемонстрировано в настоящем описании, в человеческих опухолях PD-1⁺-популяцию можно разделять на экспрессирующие PD-1^hi и PD-1^int субпопуляции (фиг. 35А). Анализ дополнительных ингибирующих рецепторов, экспрессируемых в указанных конкретных субпопуляциях, продемонстрировал существенно более высокий уровень экспрессии всех других ингибирующих рецепторов, включая TIM3, CTLA-4, Lag-3 и BTLA, в PD-1^hi-субпопуляции по сравнению с экспрессией этих рецепторов в PD-1^int - и PD-1^neg - субпопуляциях (фиг. 36А-Г). По этой причине при создании изобретения применяли процент PD-1^hi Т-клеток в CD8⁺-субпопуляции в качестве суррогатного маркера кумулятивной экспрессии ингибирующих рецепторов. Образцы опухолей разделяли в зависимости от частоты встречаемости PD-1^hi-клеток на две группы с высокой («богатые» PD-1^hi опухоли) и низкой частотой встречаемости экспрессирующих PD-1^hi-Т-клеток («бедные» PD-1^hi опухоли) соответственно. В качестве отсекающего значения экспрессии PD-1^hi для разделения двух групп выбран уровень, равный 30%. Процент PD-1^hi-клеток составлял 39,1-60,5% в «богатой» PD-1^hi (49,5±7,9%) и 2,65-19,5% в «бедной» PD-1^hi группе (8,4±5,7%; фиг. 36Д). Отсекающее значение подтверждали во второй группе пациентов, включающей 14 пациентов с NSCLC и 2 с раком яичника, со сходным распределением частоты встречаемости PD-1^hi-клеток, в которой были получены сопоставимые результаты после поликлональной стимуляции с использованием антител к CD3/к CD28 (фиг. 39).

Пример 49

Индуцированная FolR1-TCB активация Т-клеток сильно зависит от уровня экспрессии PD-1 на CD8⁺-Т-клетках

При создании изобретения анализировали, может ли экспрессия ингибирующих рецепторов коррелировать со сниженной функциональностью Т-клеток после обработки FolR1-TCB. В соответствии с результатами, описанными выше в примере 41, индуцированная FolR1-TCB активация Т-клеток, изученная на примере экспрессии CD25, CD 137 и ICOS (p=0,028; p<0,001 и p=0,008 соответственно), и эффекторные функции Т-клеток, оцененные по секреции IFN-γ, IL-2, TNF, а также перфорина, существенно нарушались в «богатых» PD-1^hi опухолях по сравнению с «бедными» PD-1^hi опухолями (p=0,019; p=0,007; p=0,028 и p=0,029 соответственно; фиг. 37А-Ж). Аналогично этому, в «богатых» PD-1^hi опухолях имела место существенно пониженная цитотоксичность после стимуляции FolR1-TCB, в то время как сильный цитолиз опухолевых клеток удалось обнаружить в большинстве «бедных» PD-1^hi опухолях (p=0,021; фиг. 373).

Пример 50

Блокада PD-1 восстанавливает индуцированную FolR1-TCB Т-клеточную функцию только в «бедных» PD-1^hi опухолях

Поскольку уровень экспрессии PD-1 на TIL коррелирует с эффективностью FolR1-TCB, при создании изобретения анализировали, может ли блокада оси PD-1/PD-L1 в комбинации с обработкой FolR1-TCB восстанавливать Т-клеточную функцию. Было установлено, что после совместной обработки FolR1-TCB и блокирующим PD-1 антителом ниволумабом (MDX5C4) секреция эффекторных цитокинов ifn-γ, TNF и IL-2, а также перфорина может повышаться только в некоторых «бедных» PD-1^hi опухолях. В противоположность этому, в «богатых» PD-1^hi опухолях блокада PD-1 не приводила к какому-либо ответу (фиг. 38А-Г). Следует отметить, что дополнительная блокада PD-1 не приводила к повышению цитотоксического лизиса опухолевых клеток в Т-клетках ни в «бедных» PD-1, ни в «богатых» PD-1^hi опухолях (фиг. 38Д).

В приведенных выше примерах продемонстрирована иммуномодулирующая способность CD3 × FolR1-специфических ТСВ в пораженных первичными опухолями образцах из пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC), эпителиальной карциномой яичника (ЕОС) и почечно-клеточной карциномой (RCC). По сравнению с полностью функциональными периферическими Т-клетками из здоровых доноров обнаружена выраженная гетерогенность в отношении индуцированного FolR1-ТСВ цитолиза опухолевых клеток и Т-клеточной активации между различными образцами человеческих опухолей, что приводило к частичному или полному нарушению Т-клеточной функции у большинства пациентов. Всесторонний анализ экспрессии ингибирующих рецепторов на клеточной поверхности находящихся внутри опухолей Т-клеток продемонстрировал, что эффективность активации Т-клеток FolR1-TCB обратно коррелировала с уровнями экспрессии PD-1. Пациенты с опухолями, «богатыми» PD-1^hi, характеризовались нарушенной активацией Т-клеток и нарушенной эффекторной функцией после обработки FolR1-TCB. Кроме того, указанные пациенты не реагировали на блокаду PD-1 в отличие от соответствующих пациентов с низким уровнем экспрессии PD-1^hi. Таким образом, биологическая активность биспецифических антител значительно затруднялась вследствие дисфункции Т-клеток, что являлось результатом, по меньшей мере частично, постоянной и отличающейся высоким разнообразием экспрессией ингибирующих рецепторов.

При создании изобретения обнаружили сильную повышающую регуляцию маркеров активации Т-клеток, секреции эффекторных цитокинов и цитолиза опухолевых клеток после стимуляции FolR1-TCB в РВМС из здоровых доноров (фиг. 40). Однако в полной противоположности этому, эффекторные функции Т-клеток варьировались в большей степени и, как правило, снижались в находящихся внутри опухолей Т-клетках. В частности, цитолитическая активность и производство эффекторных цитокинов оказались существенно более низкими в TIL с полной утратой производства IL-2 и серьезным нарушением секреции TNF и IFN-γ в большинстве опухолей.

При создании изобретения задокументирована экспрессия ингибирующих рецепторов PD-1, TIM3, CTLA-4, Lag-3 и BTLA на находящихся внутри опухолей CD8⁺-Т-клетках. Для PD-1 характерен наиболее широкий диапазон экспрессии всех проанализированных ингибирующих рецепторов. Данные, полученные при исследовании на мышиной модели хронических LCMV-инфекций, проведенном Blackburn, позволяют предположить присутствие функционально различных PD-1-позитивных субпопуляций Т-клеток, которые можно разделять на основе уровней MFI с помощью проточной цитометрии (Blackburn и др., PNAS 105(39), 2008, с. 15016). Следует отметить, что субпопуляции PD-1^hi-Т-клеток отличались высоким уровнем совместной экспрессии TIM3 и CTLA-4 и меньшим уровнем Lag-3 и BTLA, в то время субпопуляции PD-1^int экспрессировали лишь невысокие уровни других ингибирующих рецепторов, сопоставимые с PD-1^neg-Т-клетками. Частота встречаемости PD-1^hi CD8⁺-Т-клеток сильно различалась между пациентами и позволила авторам настоящего изобретения выявлять различие между «богатыми» и «бедными» PD-1^hi опухолями. В отличие от пациентов с «бедным» PD-1^hi фенотипом опосредованная FolR1-TCB активация Т-клеток и цитолиз опухолевых клеток существенно нарушался в опухолях с «богатым» PD-1^hi фенотипом. Эти данные расширяют и подтверждают сделанные ранее наблюдения о том, что активация и эффекторная функция CD8⁺-Т-клеток коррелирует с совместной экспрессией множества иммунных контрольных точек (Sakuishi и др., J Exp Med 207(10), 2010, cc. 2187-2194; Fourcade и др., J Exp Med 207(10), 2010, cc. 2175-2186; Grosso и др., J Immunol 182(11), 2009, cc. 6659-6669; Matsuzaki и др., Proc Nati Acad Sci USA 107(17), 2010, cc. 7875-7880; Fourcade и др., Cancer Res 72(4), 2012, cc. 887-896). Таким образом, частоту встречаемости PD-1^hi Т-клеток можно применять в качестве суррогатного маркера функциональности TIL после активации с помощью ТСВ, а также она может служить в качестве прогностического маркера терапевтических ответов на обработку ТСВ. Указанный иммунный профиль может способствовать отбору пациентов, которые, вероятно, будут отвечать на иммунотерапию, например, на основе ТСВ. Эту корреляцию с клинической пользой следует определить в перспективных клинических исследованиях.

Перспективным путем повышения терапевтической эффективности ТСВ является блокада ингибирующих сигналов на Т-клетках. Поскольку PD-1 оказался наиболее заметным экспрессируемым ингибирующим рецептором во всех проанализированных опухолях, при создании изобретения оценивали, может ли блокада PD-1 повышать эффекторные функции Т-клеток после активации с помощью ТСВ. Была выявлена повышенная секреция эффекторных цитокинов после объединенной обработки FolR1-TCB и антителом к PD-1, однако только в «бедных» PD-1^hi опухолях. Таким образом, существует необходимость в новых терапевтических стратегиях, позволяющих трансформировать PD-1^hi в PD-1^int Т-клетки, для повышения чувствительности к блокаде PD-1/PD-L1.

Важно отметить, что при создании изобретения не обнаружено повышения цитолиза опухолевых клеток после одновременной блокады PD-1 во всех образцах опухолей. Таким образом, блокады единичной иммунной контрольной точки может оказаться недостаточно для восстановления способности к цитолизу у TIL. Однако на мышиной модели опухоли установлено, что блокада оси PD-1/PD-L1 повышает Т-клеточную инфильтрацию опухоли (Curran и др., Proc Nati Acad Sci USA 107(9), 2010, cc. 4275-4280), что является особенностью указанной обработки, отличной от подхода in vitro, который применен в настоящем описании. Так, терапевтическое действие блокады PD-1 in vivo может являться результатом не только повышения Т-клеточной цитотоксичности находящихся внутри опухолей Т-клеток, но и устойчивой функциональности вновь инфильтрующих Т-клеток. Установлено, что индуцированная ТСВ активация Т-клеток приводит к повышающей регуляции экспрессии PD-1, что может приводить к вторичной устойчивости в присутствии PD-L1, который экспрессируется и на опухолевых клетках, и на инфильтрующих иммунных клетках, что в последнее время продемонстрировано как для Her2-специфических ТСВ, так и для специфических для карциноэмбрионального антигена (СЕА) ТСВ (Junttila и др., Cancer Res 74(19), 2014, cc. 5561-5571; Osada и др.. Cancer Immunol Immunother 2015). Важно отметить, что блокада оси PD-1/PD-L1 может полностью восстанавливать индуцированную ТСВ Т-клеточную функцию как in vitro, так и на мышиной модели опухоли. Эти результаты свидетельствуют о том, что совместное введение ингибиторов контрольных точек позволяет предупреждать вторичную устойчивость, что может увеличивать дисфункциональный статус TIL и ограничивать терапевтическую эффективность ТСВ. Существует выраженная необходимость в дальнейшем исследовании для определения оптимальных комбинированных режимов ингибиторов контрольных точек и ТСВ. Также решающее значение имеет идентификация ингибирующих и активирующих Т-клеточных рецепторов, не обладающих избыточной функцией, в качестве потенциальных терапевтических мишеней.

Полученные при создании изобретения данные четко свидетельствуют о том, что биспецифические антитела, такие как FolR1-TCB, обладают способностью принуждать Т-клетки осуществлять повышающую регуляцию костимуляторных молекул, продуцировать провоспалительные цитокины и приобретать цитолитическую функцию. Были обнаружены различные статусы Т-клеточной дисфункции, обусловленные, по меньшей мере частично, экспрессией ингибирующих рецепторов, и в некоторых случаях они снижают эффективность ТСВ. Поскольку индуцированные FolR1-TCB эффекторные функции могут лишь частично восстанавливаться блокадой PD-1, результаты, полученные при создании изобретения, позволяют скорее предположить наличие комплексной иммунной регуляции, в которой используется несколько и, в конечном счете, не дублирующих путей, для поддержания Т-клеточной дисфункция в окружении опухолей.

Аминокислотные последовательности для представленных в качестве примера вариантов осуществления изобретения

1) FolR-связывающие агенты, пригодные для применения в формате с общей легкой цепью, вариабельная тяжелая цепь

2) CD3-связывающий агент, общая легкая цепь (CLC)

3) CD3-связывающий агент, тяжелая цепь

4) FolR-связывающие агенты, которые можно применять для Crossfab-формата

5) CD3-связывающие агенты, которые можно применять для Crossfab-формата

6) Примеры аминокислотных последовательностей биспецифических антител к CD3-FolR в формате «2+1 инвертированная, Crossmab»

7) Примеры аминокислотных последовательностей биспецифических антител к CD3-FolR с общей легкой цепью

8) Примеры вариантов 16D5 с пониженной аффинностью

а. Примеры вариантов легкой цепи с пониженной аффинностью

б. Примеры вариантов тяжелой цепи с пониженной аффинностью

9) Дополнительные примеры вариантов осуществления изобретения, созданных с использованием фаговой дисплейной библиотеки (CDR подчеркнуты)

10) Гликозилированные варианты 9D11: вариабельная легкая цепь представленных в качестве примеров вариантов осуществления изобретения (CDR подчеркнуты)

11) Варианты с удаленными сайтами деамидирования

12) Представленные в качестве примеров варианты ТСВ на основе Mov19 (CDR подчеркнуты)

13) Дополнительные FolR1-TCB с промежуточной аффинностью (CDR, определенные согласно Кэботу, подчеркнуты):

14) Последовательности антигенов

15) Нуклеотидные последовательности для представленных в качестве примеров вариантов осуществления изобретения

Примеры последовательностей антагонистов PD1

Приведенные в качестве примера последовательности антител к TIM3

Ниже в перечне последовательностей представлены приведенные в качестве примера аминокислотные последовательности антител к TIM3 и приведенные в качестве примера последовательности TIM3:

SEQ ID NO: 304 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0016

SEQ ID NO: 305 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0016

SEQ ID NO: 306 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0016

SEQ ID NO: 307 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0016

SEQ ID NO: 308 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0016

SEQ ID NO: 309 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0016

SEQ ID NO: 310 вариабельный домен тяжелой цепи VH, Tim3_0016

SEQ ID NO: 311 вариабельный домен легкой цепи VL, Tim3_0016

SEQ ID NO: 312 вариабельный домен тяжелой цепи VH, Tim3_0016, вариант (0018)

SEQ ID NO: 313 вариабельный домен легкой цепи VL, Tim3_0016, вариант (0018)

SEQ ID NO: 314 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0016_HVR-L1 вариант 1_NQ (удален сайт гликозилирования в результате мутации N на Q)

SEQ ID NO: 315 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0016_HVR-L1 вариант 2_NS (удален сайт гликозилирования в результате мутации N на S)

SEQ ID NO: 316 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0021

SEQ ID NO: 317 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0021

SEQ ID NO: 318 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0021

SEQ ID NO: 319 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0021

SEQ ID NO: 320 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0021

SEQ ID NO: 321 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0021

SEQ ID NO: 322 вариабельный домен тяжелой цепи VH, Tim3_0021

SEQ ID NO: 323 вариабельный домен легкой цепи VL, Tim3_0021

SEQ ID NO: 324 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0022

SEQ ID NO: 325 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0022

SEQ ID NO: 326 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0022

SEQ ID NO: 327 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0022

SEQ ID NO: 328 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0022

SEQ ID NO: 329 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0022

SEQ ID NO: 330 вариабельный домен тяжелой цепи VH, Tim3_0022

SEQ ID NO: 331 вариабельный домен легкой цепи VL, Tim3_0022

SEQ ID NO: 332 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0026

SEQ ID NO: 333 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0026

SEQ ID NO: 334 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0026

SEQ ID NO: 335 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0026

SEQ ID NO: 336 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0026

SEQ ID NO: 337 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0026

SEQ ID NO: 338 вариабельный домен тяжелой цепи VH, Tim3_0026

SEQ ID NO: 339 вариабельный домен легкой цепи VL, Tim3_0026

SEQ ID NO: 340 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0028

SEQ ID NO: 341 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0028

SEQ ID NO: 342 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0028

SEQ ID NO: 343 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0028

SEQ ID NO: 344 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0028

SEQ ID NO: 345 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0028

SEQ ID NO: 346 вариабельный домен тяжелой цепи VH, Tim3_0028

SEQ ID NO: 347 вариабельный домен легкой цепи VL, Tim3_0028

SEQ ID NO: 348 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0030

SEQ ID NO: 349 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0030

SEQ ID NO: 350 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0030

SEQ ID NO: 351 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0030

SEQ ID NO: 352 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0030

SEQ ID NO: 353 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0030

SEQ ID NO: 354 вариабельный домен тяжелой цепи VH, Tim3_0030

SEQ ID NO: 355 вариабельный домен легкой цепи VL, Tim3_0030

SEQ ID NO: 356 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0033

SEQ ID NO: 357 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0033

SEQ ID NO: 358 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0033

SEQ ID NO: 359 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0033

SEQ ID NO: 360 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0033

SEQ ID NO: 361 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0033

SEQ ID NO: 362 вариабельный домен тяжелой цепи VH, Tim3_0033

SEQ ID NO: 363 вариабельный домен легкой цепи VL, Tim3_0033

SEQ ID NO: 364 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0038

SEQ ID NO: 365 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0038

SEQ ID NO: 366 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0038

SEQ ID NO: 367 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0038

SEQ ID NO: 368 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0038

SEQ ID NO: 369 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0038

SEQ ID NO: 370 вариабельный домен тяжелой цепи VH, Tim3_0038

SEQ ID NO: 371 вариабельный домен легкой цепи VL, Tim3_0038

SEQ ID NO: 372 пример варианта 1 экзотоксина A Pseudomonas (пример деиммунизированного PE24)

SEQ ID NO: 373 пример варианта 2 экзотоксина A Pseudomonas (пример деиммунизированного PE24)

SEQ ID NO: 374 константная область человеческой легкой каппа-цепи

SEQ ID NO: 375 константная область человеческой легкой лямбда-цепи

SEQ ID NO: 376 константная область человеческой тяжелой цепи, полученной из IgG1

SEQ ID NO: 377 константная область человеческой тяжелой цепи, полученной из IgG1 с мутациями L234A и L235A

SEQ ID NO: 378 константная область человеческой тяжелой цепи, полученной из IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G

SEQ ID NO: 379 константная область человеческой тяжелой цепи, полученной из IgG4

SEQ ID NO: 380 пример последовательностей человеческого TIM3

SEQ ID NO: 381 внеклеточный домен (ECD) человеческого TIM3

Хотя представленное выше изобретение подробно описано для целей лучшего понимания с помощью иллюстраций и примеров, описание и примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Содержание всех процитированных патентов и научной литературы полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ф.Хоффманн-Ля Рош АГ

<120> Комбинированная терапия на основе активирующих T-клетки

биспецифических антигенсвязывающих молекул против CD3 и

фолатного рецептора 1 (FOLR1) и антагонистов, связывающихся

с осью PD-1

<130> 32401

<140>

<141>

<150> EP 15167173.2

<151> 2015-05-11

<150> EP 15152141.6

<151> 2015-01-22

<150> EP 14194136.9

<151> 2014-11-20

<160> 430

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Tyr Ala Gly Val Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Tyr Thr Gly Gly Ser Ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Tyr Ile Gly Ile Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Tyr Val Gly Val Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Phe Thr Val Leu Arg Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Tyr Ile Gly Val Val Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 8

Ser Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 9

Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 10

Asn Tyr Tyr Ile Gly Val Val Thr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Glu Trp Arg Arg Tyr Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 12

Gly Glu Trp Arg Arg Tyr Thr Ser Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Trp Ile Arg Trp Glu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 14

Gly Gly Trp Ile Arg Trp Glu His Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 16

Asn Ala Trp Met Ser

1 5

<210> 17

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 17

Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 18

Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr

1 5

<210> 19

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 20

Pro Trp Glu Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 21

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ala Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 22

Pro Trp Glu Trp Ala Trp Phe Asp Tyr

1 5

<210> 23

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 24

Pro Trp Glu Trp Ala Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 25

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Trp Ser Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 26

Thr Gly Trp Ser Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 27

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Glu Trp Ile Arg Tyr Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 28

Gly Glu Trp Ile Arg Tyr Tyr His Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Trp Tyr Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 30

Val Gly Trp Tyr Arg Trp Gly Tyr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 109

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 31

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 32

<211> 14

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 32

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 33

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 34

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 35

<211> 215

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 35

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 36

<211> 125

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 36

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 37

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 38

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 38

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 39

<211> 14

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 39

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 40

<211> 228

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 40

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

210 215 220

Pro Lys Ser Cys

225

<210> 41

<211> 121

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Val Phe Tyr Arg Ala Trp Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 42

Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 43

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 44

Ala Val Phe Tyr Arg Ala Trp Tyr Ser Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 45

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Ser Pro Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 46

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 47

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 48

Gln Gln Tyr Thr Ser Pro Pro Pro Thr

1 5

<210> 49

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr His Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Phe Phe Thr Gly Phe His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 50

Ser Phe Phe Thr Gly Phe His Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 51

<211> 109

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 51

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Asn Glu His

85 90 95

Tyr Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 52

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 52

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 53

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 54

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 54

Gln Gln Tyr Thr Asn Glu His Tyr Tyr Thr

1 5 10

<210> 55

<211> 117

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 56

Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 57

Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr

1 5

<210> 58

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 58

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Ser Ile Met Asn Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 59

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 59

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 60

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 60

Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 61

Met Gln Ala Ser Ile Met Asn Arg Thr

1 5

<210> 62

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 62

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Ser Ile Met Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 63

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 63

Met Gln Ala Ser Ile Met Ser Arg Thr

1 5

<210> 64

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 64

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Ser Ile Met Gln Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 65

Met Gln Ala Ser Ile Met Gln Arg Thr

1 5

<210> 66

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 66

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Ser Ile Met Asn Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 67

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 67

Met Gln Ala Ser Ile Met Asn Arg Ala

1 5

<210> 68

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 68

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Ser Ile Met Asn Arg Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 69

Met Gln Ala Ser Ile Met Asn Arg Asn

1 5

<210> 70

<211> 116

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 70

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Ile Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 71

Ser Tyr Ile Asp Met Asp Tyr

1 5

<210> 72

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 72

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Trp Ser Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 73

Gln Gln Asp Asn Trp Ser Pro Thr

1 5

<210> 74

<211> 116

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 74

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Val Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 75

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 75

Ser Tyr Val Asp Met Asp Tyr

1 5

<210> 76

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 76

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ile Trp Ser Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 77

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 77

Gln Gln Asp Ile Trp Ser Pro Thr

1 5

<210> 78

<211> 121

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 78

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ser Ser Tyr Val Glu Trp Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 79

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 79

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 80

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 80

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 81

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 81

Asp Ser Ser Tyr Val Glu Trp Tyr Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 82

<211> 108

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 82

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Thr Ser Ser Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 83

Gln Gln Pro Thr Ser Ser Pro Ile Thr

1 5

<210> 84

<211> 103

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 84

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 85

<211> 103

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 85

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 86

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 86

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala

100 105 110

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

145 150 155 160

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

180 185 190

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

195 200 205

Val Glu Pro Lys Ser Cys

210

<210> 87

<211> 232

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 87

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 88

<211> 105

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 88

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

20 25 30

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

65 70 75 80

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

85 90 95

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 89

<211> 689

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 89

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

245 250 255

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg

260 265 270

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys

275 280 285

Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

290 295 300

Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

305 310 315 320

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly

325 330 335

Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

340 345 350

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

355 360 365

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

370 375 380

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

385 390 395 400

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

405 410 415

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

420 425 430

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

435 440 445

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

450 455 460

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

465 470 475 480

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

485 490 495

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

500 505 510

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

515 520 525

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

530 535 540

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

545 550 555 560

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

565 570 575

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

580 585 590

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

595 600 605

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

610 615 620

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

625 630 635 640

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

645 650 655

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

660 665 670

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

675 680 685

Lys

<210> 90

<211> 450

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 90

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 91

<211> 689

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 91

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

210 215 220

Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

225 230 235 240

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser

245 250 255

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp

260 265 270

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

275 280 285

Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro

290 295 300

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu

305 310 315 320

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

325 330 335

Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

340 345 350

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

355 360 365

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

370 375 380

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

385 390 395 400

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

405 410 415

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

420 425 430

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

435 440 445

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

450 455 460

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

465 470 475 480

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

485 490 495

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

500 505 510

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

515 520 525

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

530 535 540

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

545 550 555 560

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

565 570 575

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

580 585 590

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

595 600 605

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

610 615 620

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

625 630 635 640

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

645 650 655

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

660 665 670

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

675 680 685

Lys

<210> 92

<211> 455

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 92

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

210 215 220

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

325 330 335

Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 93

<211> 227

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 93

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 94

<211> 690

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 94

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly

225 230 235 240

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

245 250 255

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro

260 265 270

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn

275 280 285

Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

290 295 300

Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

305 310 315 320

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly

325 330 335

Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

340 345 350

Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

355 360 365

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

370 375 380

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

385 390 395 400

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

405 410 415

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

420 425 430

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

435 440 445

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp

450 455 460

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

465 470 475 480

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

485 490 495

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

500 505 510

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

515 520 525

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

530 535 540

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

545 550 555 560

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

565 570 575

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

580 585 590

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

595 600 605

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

610 615 620

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

625 630 635 640

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

645 650 655

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

660 665 670

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

675 680 685

Gly Lys

690

<210> 95

<211> 447

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 95

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Phe Ala Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 96

<211> 219

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 96

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Ser Ile Met Asn Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 97

<211> 648

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (603)..(603)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 97

gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatacca acgaacatta ttatacgttc 300

ggccagggga ccaaagtgga aatcaaacgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 360

ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420

ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480

tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540

ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600

canggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 648

<210> 98

<211> 459

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 98

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

225 230 235 240

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

245 250 255

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

275 280 285

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

290 295 300

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

305 310 315 320

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

325 330 335

Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

340 345 350

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp

355 360 365

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe

370 375 380

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

385 390 395 400

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

405 410 415

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

420 425 430

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

435 440 445

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 99

<211> 689

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 99

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

245 250 255

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg

260 265 270

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys

275 280 285

Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

290 295 300

Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

305 310 315 320

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly

325 330 335

Asn Phe Gly Ala Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

340 345 350

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

355 360 365

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

370 375 380

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

385 390 395 400

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

405 410 415

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

420 425 430

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

435 440 445

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

450 455 460

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

465 470 475 480

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

485 490 495

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

500 505 510

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

515 520 525

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

530 535 540

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

545 550 555 560

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

565 570 575

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

580 585 590

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

595 600 605

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

610 615 620

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

625 630 635 640

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

645 650 655

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

660 665 670

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

675 680 685

Lys

<210> 100

<211> 689

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 100

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

245 250 255

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg

260 265 270

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys

275 280 285

Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

290 295 300

Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

305 310 315 320

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly

325 330 335

Asn Phe Gly Asn Ala Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

340 345 350

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

355 360 365

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

370 375 380

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

385 390 395 400

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

405 410 415

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

420 425 430

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

435 440 445

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

450 455 460

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

465 470 475 480

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

485 490 495

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

500 505 510

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

515 520 525

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

530 535 540

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

545 550 555 560

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

565 570 575

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

580 585 590

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

595 600 605

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

610 615 620

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

625 630 635 640

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

645 650 655

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

660 665 670

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

675 680 685

Lys

<210> 101

<211> 441

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 101

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala

100 105 110

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

145 150 155 160

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

180 185 190

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

195 200 205

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

245 250 255

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

260 265 270

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

275 280 285

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

290 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

305 310 315 320

Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

325 330 335

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

340 345 350

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

355 360 365

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

370 375 380

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

405 410 415

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

420 425 430

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 102

<211> 227

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 102

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val

115 120 125

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

130 135 140

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

145 150 155 160

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

165 170 175

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

180 185 190

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

195 200 205

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

210 215 220

Gly Glu Cys

225

<210> 103

<211> 231

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 103

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro

115 120 125

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

130 135 140

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

165 170 175

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

180 185 190

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

195 200 205

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

210 215 220

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

225 230

<210> 104

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 104

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 105

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 105

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 106

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 106

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 107

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 107

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 108

<211> 117

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 108

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 109

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 109

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 110

<211> 109

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 110

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 111

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 111

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 112

<211> 109

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 112

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 113

<211> 109

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 113

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Ala Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 114

<211> 109

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 114

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ala Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 115

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 115

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 116

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 116

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 117

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 117

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ser Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 118

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 118

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Tyr Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 119

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 119

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Tyr Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 120

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 120

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Thr Ile Val Val Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 121

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 121

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Phe Ile Gly Ser Val Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 122

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 122

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Thr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115

<210> 123

<211> 114

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 123

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Ile Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr

<210> 124

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 124

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Ala Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser

115

<210> 125

<211> 109

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 125

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Gly Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 126

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 126

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Phe Ser Ala Gly Arg Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 127

<211> 115

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 127

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr

115

<210> 128

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 128

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115

<210> 129

<211> 113

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 129

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Trp His Ser Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr

<210> 130

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 130

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Thr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115

<210> 131

<211> 114

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 131

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr

<210> 132

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 132

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Ser Ile Met Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 133

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 133

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Ser Ile Met Gln Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 134

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 134

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Ser Ile Met Asn Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 135

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 135

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Ser Ile Met Asn Arg Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 136

<211> 448

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 136

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

355 360 365

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 137

<211> 691

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 137

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly

210 215 220

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala

245 250 255

Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala

260 265 270

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn

275 280 285

Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile

290 295 300

Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu

305 310 315 320

Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe

325 330 335

Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

340 345 350

Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

355 360 365

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

370 375 380

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

385 390 395 400

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

405 410 415

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

420 425 430

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

435 440 445

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

450 455 460

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

465 470 475 480

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

485 490 495

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

500 505 510

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

515 520 525

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

530 535 540

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

545 550 555 560

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

565 570 575

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

580 585 590

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

595 600 605

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

610 615 620

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

625 630 635 640

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

645 650 655

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

660 665 670

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Lys

690

<210> 138

<211> 218

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 138

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Thr

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 139

<211> 257

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 139

Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val

1 5 10 15

Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu

20 25 30

Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly

35 40 45

Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala

50 55 60

Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys

85 90 95

Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn

100 105 110

Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg

115 120 125

Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu

130 135 140

Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp

145 150 155 160

Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln

165 170 175

Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile

180 185 190

Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg

195 200 205

Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu

210 215 220

Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala

225 230 235 240

Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu

245 250 255

Ser

<210> 140

<211> 468

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 140

Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala

1 5 10 15

Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln

20 25 30

Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln

35 40 45

Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His

50 55 60

Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr

65 70 75 80

Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val

85 90 95

Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys

100 105 110

Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys

115 120 125

Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys

130 135 140

Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr

145 150 155 160

Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser

165 170 175

Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro

180 185 190

Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala

195 200 205

Met Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile

450 455 460

Glu Trp His Glu

465

<210> 141

<211> 227

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 141

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 142

<211> 255

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 142

Met Ala His Leu Met Thr Val Gln Leu Leu Leu Leu Val Met Trp Met

1 5 10 15

Ala Glu Cys Ala Gln Ser Arg Ala Thr Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu

20 25 30

Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu

35 40 45

Asp Asn Leu His Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Thr Asn Ser Cys Cys

50 55 60

Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Ile Ser Tyr Leu Tyr

65 70 75 80

Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Thr Met Thr Ser Glu Cys Lys Arg

85 90 95

His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly

100 105 110

Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu

115 120 125

Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Gln Gln Trp Trp Glu Asp Cys

130 135 140

Gln Ser Ser Phe Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp

145 150 155 160

Ser Ser Gly His Asn Glu Cys Pro Val Gly Ala Ser Cys His Pro Phe

165 170 175

Thr Phe Tyr Phe Pro Thr Ser Ala Ala Leu Cys Glu Glu Ile Trp Ser

180 185 190

His Ser Tyr Lys Leu Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile

195 200 205

Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala

210 215 220

Arg Phe Tyr Ala Glu Ala Met Ser Gly Ala Gly Leu His Gly Thr Trp

225 230 235 240

Pro Leu Leu Cys Ser Leu Ser Leu Val Leu Leu Trp Val Ile Ser

245 250 255

<210> 143

<211> 466

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 143

Thr Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His

1 5 10 15

His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Asn Leu His Asp Gln Cys Ser

20 25 30

Pro Trp Lys Thr Asn Ser Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala

35 40 45

His Lys Asp Ile Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly

50 55 60

Thr Met Thr Ser Glu Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu

65 70 75 80

Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln

85 90 95

Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp

100 105 110

Cys Gln Gln Trp Trp Glu Asp Cys Gln Ser Ser Phe Thr Cys Lys Ser

115 120 125

Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Ser Ser Gly His Asn Glu Cys Pro

130 135 140

Val Gly Ala Ser Cys His Pro Phe Thr Phe Tyr Phe Pro Thr Ser Ala

145 150 155 160

Ala Leu Cys Glu Glu Ile Trp Ser His Ser Tyr Lys Leu Ser Asn Tyr

165 170 175

Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln

180 185 190

Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Glu Ala Met Val

195 200 205

Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp

450 455 460

His Glu

465

<210> 144

<211> 257

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 144

Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val

1 5 10 15

Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Thr Ala Arg Ala Arg Thr Glu

20 25 30

Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly

35 40 45

Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Lys Lys Asn Ala

50 55 60

Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys

85 90 95

Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn

100 105 110

Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg

115 120 125

Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu

130 135 140

Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp

145 150 155 160

Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Pro Val Gly Ala Ala Cys Gln

165 170 175

Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile

180 185 190

Trp Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg

195 200 205

Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu

210 215 220

Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala

225 230 235 240

Ala Trp Pro Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Thr Leu Leu Trp Leu Leu

245 250 255

Ser

<210> 145

<211> 468

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 145

Arg Thr Ala Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala

1 5 10 15

Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln

20 25 30

Cys Arg Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln

35 40 45

Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His

50 55 60

Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr

65 70 75 80

Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val

85 90 95

Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys

100 105 110

Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys

115 120 125

Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys

130 135 140

Cys Pro Val Gly Ala Ala Cys Gln Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr

145 150 155 160

Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile Trp Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Ser

165 170 175

Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro

180 185 190

Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala

195 200 205

Met Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile

450 455 460

Glu Trp His Glu

465

<210> 146

<211> 255

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 146

Met Val Trp Lys Trp Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Val Cys Val Ala

1 5 10 15

Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met

20 25 30

Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His

35 40 45

Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr

50 55 60

Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp

65 70 75 80

Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln

85 90 95

Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln

100 105 110

Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu

115 120 125

Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His

130 135 140

Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val

145 150 155 160

Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe

165 170 175

Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys

180 185 190

Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe

195 200 205

Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala

210 215 220

Ala Ala Met His Val Asn Ala Gly Glu Met Leu His Gly Thr Gly Gly

225 230 235 240

Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Gln Leu Trp Leu Leu Gly

245 250 255

<210> 147

<211> 472

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 147

Thr Met Cys Ser Ala Gln Asp Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met

1 5 10 15

Asp Ala Lys His His Lys Thr Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His

20 25 30

Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr

35 40 45

Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp

50 55 60

Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln

65 70 75 80

Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Gln

85 90 95

Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asp Val Pro Leu

100 105 110

Cys Lys Glu Asp Cys Gln Arg Trp Trp Glu Asp Cys His Thr Ser His

115 120 125

Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Val

130 135 140

Asn Lys Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Arg Thr Phe Glu Ser Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys

165 170 175

Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe

180 185 190

Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala

195 200 205

Ala Ala Met His Val Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser

210 215 220

Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

325 330 335

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu

450 455 460

Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

465 470

<210> 148

<211> 243

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 148

Met Ala Trp Gln Met Met Gln Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gly Ser Ala Gln Pro Arg Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp Leu Leu

20 25 30

Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Thr Gln Pro Ser Pro Glu

35 40 45

Asp Glu Leu Tyr Gly Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys

50 55 60

Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr

65 70 75 80

Asn Phe Asn Trp Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys Lys Arg

85 90 95

His Phe Ile Gln Asp Ser Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly

100 105 110

Pro Trp Ile Arg Gln Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu

115 120 125

Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys

130 135 140

Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp

145 150 155 160

Thr Ser Gly Ile Asn Glu Cys Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser Thr Phe

165 170 175

Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser

180 185 190

His Ser Phe Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile

195 200 205

Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala

210 215 220

Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg Gly Ile

225 230 235 240

Ile Asp Ser

<210> 149

<211> 479

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 149

Ser Ala Arg Ala Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys

1 5 10 15

His His Lys Thr Gln Pro Ser Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Gly Gln Cys

20 25 30

Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Thr Ala Ser Thr Ser Gln Glu

35 40 45

Leu His Lys Asp Thr Ser Arg Leu Tyr Asn Phe Asn Trp Asp His Cys

50 55 60

Gly Lys Met Glu Pro Thr Cys Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Ser Cys

65 70 75 80

Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Arg Gln Val Asn

85 90 95

Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu

100 105 110

Asp Cys Glu Arg Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys

115 120 125

Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp Thr Ser Gly Ile Asn Glu Cys

130 135 140

Pro Ala Gly Ala Leu Cys Ser Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Pro Thr Pro

145 150 155 160

Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Phe Lys Val Ser Asn

165 170 175

Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Ser Ala

180 185 190

Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Met

195 200 205

Asn Ala Gly Ala Pro Ser Arg Gly Ile Ile Asp Ser Val Asp Glu Gln

210 215 220

Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly

450 455 460

Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

465 470 475

<210> 150

<211> 207

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 150

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

145 150 155 160

Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg

180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 151

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 151

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300

tacgctggtg ttactccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 152

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 152

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300

tacatcggtg ttgttacttt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 153

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 153

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300

tacactggtg gttcttctgc tttcgactat tggggtcaag gcaccctcgt aacggtttct 360

tct 363

<210> 154

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (47)..(47)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 154

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgnttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgaa 300

tggcgtcgtt acacttcttt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 155

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 155

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtggt 300

tggatccgtt gggaacattt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 156

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 156

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300

tacctgttct ctacttcttt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 157

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 157

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgag gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300

tacatcggta tcgttccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 158

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 158

gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120

ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180

gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240

ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300

ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360

<210> 159

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (53)..(53)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 159

gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc ccngcgtctg 60

agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120

ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180

gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240

ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaacc gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300

ccgtgggaat ggtcttactt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360

<210> 160

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 160

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaactac 300

tacgttggtg tttctccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 161

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (47)..(47)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<220>

<221> модифицированное_основание

<222> (177)..(177)

<223> a, c, t, g, неизвестное или другое

<400> 161

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgnttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcntac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcaacttc 300

actgttctgc gtgttccgtt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 162

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 162

gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120

ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180

gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240

ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300

ccgtgggaat gggcttggtt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360

<210> 163

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 163

gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120

ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180

gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240

ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaacc gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300

ccttgggaat gggcttactt cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360

<210> 164

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 164

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcactggt 300

tggtctcgtt ggggttacat ggactattgg ggccaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 165

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 165

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgaa 300

tggatccgtt actaccattt cgactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 166

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 166

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcgttggt 300

tggtaccgtt ggggttacat ggactattgg ggtcaaggca ccctcgtaac ggtttcttct 360

<210> 167

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 167

caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag ggtaaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagagctgtt 300

ttctaccgtg cttggtactc tttcgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360

tca 363

<210> 168

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 168

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataccagcc caccaccaac gtttggccag 300

ggcaccaaag tcgagatcaa g 321

<210> 169

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 169

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccatgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctctttc 300

ttcactggtt tccatctgga ctattggggt caaggcaccc tcgtaacggt ttcttct 357

<210> 170

<211> 327

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 170

gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatacca acgaacatta ttatacgttc 300

ggccagggga ccaaagtgga aatcaaa 327

<210> 171

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 171

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggccc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgcggtgac 300

ttcgcttggc tggactattg gggtcaaggc accctcgtaa cggtttcttc t 351

<210> 172

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 172

gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60

atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120

tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180

tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240

agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300

cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336

<210> 173

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 173

gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60

atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120

tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180

tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240

agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgagc 300

cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336

<210> 174

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 174

gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60

atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120

tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180

tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240

agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgcag 300

cggacttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336

<210> 175

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 175

gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60

atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120

tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180

tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240

agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300

cgggcttttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336

<210> 176

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 176

gatattgtta tgactcaatc tccactgtct ctgccggtga ctccaggcga accggcgagc 60

atttcttgcc gttccagcca gtctctgctg cactccaacg gctacaacta tctcgattgg 120

tacctgcaaa aaccgggtca gagccctcag ctgctgatct acctgggctc taaccgcgct 180

tccggtgtac cggaccgttt cagcggctct ggatccggca ccgatttcac gttgaaaatc 240

agccgtgttg aagcagaaga cgtgggcgtt tattactgta tgcaggcaag cattatgaac 300

cggaattttg gtcaaggcac caaggtcgaa attaaa 336

<210> 177

<211> 348

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 177

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctcttac 300

atcgacatgg actattgggg tcaaggcacc ctcgtaacgg tttcttct 348

<210> 178

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 178

gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggataact ggagcccaac gttcggccag 300

gggaccaaag tggaaatcaa a 321

<210> 179

<211> 348

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 179

caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60

agctgcaaag catccggata caccttcact tcctattaca tgcactgggt tcgtcaagcc 120

ccgggccagg gtctggaatg gatgggcatc attaacccaa gcggtggctc tacctcctac 180

gcgcagaaat tccagggtcg cgtcacgatg acccgtgaca ctagcacctc taccgtttat 240

atggagctgt ccagcctgcg ttctgaagat actgcagtgt actactgtgc acgctcttac 300

gttgacatgg actattgggg tcaaggcacc ctcgtaacgg tttcttct 348

<210> 180

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 180

gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctacc tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag caggatattt ggagcccaac gttcggccag 300

gggaccaaag tggaaatcaa a 321

<210> 181

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 181

gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagactct 300

tcttacgttg aatggtacgc tttcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 182

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 182

gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gactccactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagccaacca gcagcccaat tacgttcggc 300

caggggacca aagtggaaat caaa 324

<210> 183

<211> 684

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 183

gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120

cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180

tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240

ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300

cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360

gtgaccgtgt caagcgctag taccaagggc cccagcgtgt tccccctggc acccagcagc 420

aagagcacat ctggcggaac agccgctctg ggctgtctgg tgaaagacta cttccccgag 480

cccgtgaccg tgtcttggaa ctctggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac ctttccagcc 540

gtgctgcaga gcagcggcct gtactccctg tcctccgtgg tcaccgtgcc ctctagctcc 600

ctgggaacac agacatatat ctgtaatgtc aatcacaagc cttccaacac caaagtcgat 660

aagaaagtcg agcccaagag ctgc 684

<210> 184

<211> 696

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 184

gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120

cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180

tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240

ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300

cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360

gtgaccgtgt caagcgctag tgtggccgct ccctccgtgt ttatctttcc cccatccgat 420

gaacagctga aaagcggcac cgcctccgtc gtgtgtctgc tgaacaattt ttaccctagg 480

gaagctaaag tgcagtggaa agtggataac gcactgcagt ccggcaactc ccaggaatct 540

gtgacagaac aggactccaa ggacagcacc tactccctgt cctccaccct gacactgtct 600

aaggctgatt atgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660

tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgt 696

<210> 185

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

праймер"

<400> 185

gcaggcaagc attatgcagc ggacttttgg tcaagg 36

<210> 186

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

праймер"

<400> 186

caggcaagca ttatgagccg gacttttggt caagg 35

<210> 187

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

праймер"

<400> 187

cattatgaac cgggcttttg gtcaaggcac caaggtc 37

<210> 188

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

праймер"

<400> 188

cattatgaac cggaattttg gtcaaggcac caaggtc 37

<210> 189

<211> 2067

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 189

gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120

ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180

gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240

ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300

ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360

gctagcacaa agggccctag cgtgttccct ctggccccca gcagcaagag cacaagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgtct 480

tggaacagcg gagccctgac aagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtact ccctgagcag cgtggtcacc gtgcctagca gcagcctggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa ggtggagccc 660

aagagctgtg atggcggagg agggtccgga ggcggaggat ccgaggtgca gctgctggaa 720

tctggcggcg gactggtgca gcctggcgga tctctgagac tgagctgtgc cgccagcggc 780

ttcaccttca gcacctacgc catgaactgg gtgcgccagg cccctggcaa aggcctggaa 840

tgggtgtccc ggatcagaag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900

aagggccggt tcaccatcag ccgggacgac agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 960

agcctgcggg ccgaggacac cgccgtgtac tattgtgtgc ggcacggcaa cttcggcaac 1020

agctatgtgt cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcaagcgct 1080

agtaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcacccagca gcaagagcac atctggcgga 1140

acagccgctc tgggctgtct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 1200

aactctggcg ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 1260

ctgtactccc tgtcctccgt ggtcaccgtg ccctctagct ccctgggaac acagacatat 1320

atctgtaatg tcaatcacaa gccttccaac accaaagtcg ataagaaagt cgagcccaag 1380

agctgcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1440

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1500

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1560

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1620

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1680

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1740

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 1800

accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1860

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1920

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1980

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2040

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2067

<210> 190

<211> 1350

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 190

gaggtgcaat tggttgaatc tggtggtggt ctggtaaaac cgggcggttc cctgcgtctg 60

agctgcgcgg cttccggatt caccttctcc aacgcgtgga tgagctgggt tcgccaggcc 120

ccgggcaaag gcctcgagtg ggttggtcgt atcaagtcta aaactgacgg tggcaccacg 180

gattacgcgg ctccagttaa aggtcgtttt accatttccc gcgacgatag caaaaacact 240

ctgtatctgc agatgaactc tctgaaaact gaagacaccg cagtctacta ctgtactacc 300

ccgtgggaat ggtcttggta cgattattgg ggccagggca cgctggttac ggtgtcttcc 360

gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 540

ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660

aagagctgcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350

<210> 191

<211> 645

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 191

caggccgtcg tgacccagga acccagcctg acagtgtctc ctggcggcac cgtgaccctg 60

acatgtggca gttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120

aagcccggcc aggccttcag aggactgatc ggcggcacca acaagagagc ccctggcacc 180

cctgccagat tcagcggatc tctgctggga ggaaaggccg ccctgacact gtctggcgcc 240

cagccagaag atgaggccga gtactactgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300

ggcggaggca ccaagctgac agtcctaggt caacccaagg ctgcccccag cgtgaccctg 360

ttccccccca gcagcgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatcagc 420

gacttctacc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggccg acagcagccc cgtgaaggcc 480

ggcgtggaga ccaccacccc cagcaagcag agcaacaaca agtacgccgc cagcagctac 540

ctgagcctga cccccgagca gtggaagagc cacaggtcct acagctgcca ggtgacccac 600

gagggcagca ccgtggagaa aaccgtggcc cccaccgagt gcagc 645

<210> 192

<211> 2067

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 192

gaggtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120

cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcccgg atcagaagca agtacaacaa ctacgccacc 180

tactacgccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240

ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgtgcgg 300

cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360

gtgaccgtgt catctgctag cacaaagggc cctagcgtgt tccctctggc ccccagcagc 420

aagagcacaa gcggcggaac agccgccctg ggctgcctcg tgaaggacta cttccccgag 480

cccgtgacag tgtcttggaa cagcggagcc ctgacaagcg gcgtgcacac cttccctgcc 540

gtgctgcaga gcagcggcct gtactccctg agcagcgtgg tcaccgtgcc tagcagcagc 600

ctgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aaccacaagc ccagcaacac caaagtggac 660

aagaaggtgg agcccaagag ctgtgatggc ggaggagggt ccggaggcgg aggatccgag 720

gtgcaattgg ttgaatctgg tggtggtctg gtaaaaccgg gcggttccct gcgtctgagc 780

tgcgcggctt ccggattcac cttctccaac gcgtggatga gctgggttcg ccaggccccg 840

ggcaaaggcc tcgagtgggt tggtcgtatc aagtctaaaa ctgacggtgg caccacggat 900

tacgcggctc cagttaaagg tcgttttacc atttcccgcg acgatagcaa aaacactctg 960

tatctgcaga tgaactctct gaaaactgaa gacaccgcag tctactactg tactaccccg 1020

tgggaatggt cttggtacga ttattggggc cagggcacgc tggttacggt gtctagcgct 1080