Пентавалентная субъединичная вакцина против респираторных инфекций и способ ее получения Российский патент 2023 года по МПК A61K39/12 C12N1/00 

Область техники, к которой относится изобретение.

Настоящее изобретение относится к иммунологии, медицинской биотехнологии и биоинженерии, в частности к способу получения вакцины против респираторных инфекций.

Уровень техники. Вакцинопрофилактика рассматривается в современных условиях как одно из ведущих массовых эффективных средств борьбы с инфекциями.

Введение. Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) остаются актуальной проблемой современного здравоохранения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) ежегодно ОРВИ заболевает до 40% взрослого населения планеты. Из них гриппом заболевают до 10% взрослых и 30% детей. Инфекция ОРВИ, особенно в группах риска, может протекать в тяжелой форме, требовать госпитализации, приводить к летальному исходу. При этом, например, вирусы гриппа сохраняют высокий пандемический потенциал, в частности, вирусы гриппа птиц, а также свиней и свиного происхождения.

Если обратиться к пандемии коронавирусов, в частности SARS-CoV-2, которые также вызывают острые респираторные инфекции с тяжелыми последствиями, то ими переболело к февралю 2022 года около 400 млн человек, из них летальный исход наблюдался в 6 млн случаях. В настоящее время только эффективная вакцинация способна предотвратить пандемии ОРВИ, что является основным подходом в элиминации коронавирусных и гриппозных инфекций.

В то же время используемые, как правило, инактивированные вакцины не всегда эффективны для ряда популяционных групп: маленьких детей, беременных, пожилых людей, лиц с различными хроническими заболеваниями, которых относят к группам риска по ОРВИ, а также в отношении штаммов гриппа (дрейфовых и гетерологичных), не содержащихся в вакцине (имеющих другой антигенный состав, прежде всего-гемагглютинин). При использовании адъювантов появляется возможность повысить иммуногенность вакцин против гриппа в отношении набора различных штаммов, а также для иммунизации различных популяционных групп, в том числе групп риска. Кроме того, при значительном повышении иммуногенности за счет добавления адъюванта к вакцине появляется возможность перехода на простые (однократные) схемы иммунизации, а также снижения дозы антигена, что улучшает экономику их производства. Это особенно важно для вакцин в условиях пандемии, поскольку при той же мощности производства будет получено больше доз вакцины, и, как следствие, иммунизировано больше людей.

В настоящее время для повышения эффективности вакцин в экспериментальных и клинических исследованиях применяют адъюванты различного происхождения: минеральные (гидроксид или фосфат алюминия и др.); растительные (сапонины - QuilA, QS21); микробные (убитые бактерии, липополисахарид и его производные, CpG-мотивы ДНК) и др. Вследствие токсичности или недостаточной эффективности большинства адъювантов для широкого клинического использования разрешены только соли алюминия и водно-масляная эмульсия MF-59, а в некоторых странах вирусоподобные частицы (VLP - virus-like particles) и иммуностимулирующий комплекс (ISCOM - immunostimulating complex). Зарубежные коммерческие гриппозные вакцины выпускаются лишь с одним адъювантом MF-59, и такие вакцины оказались более иммуногенными при вакцинации пожилых лиц, однако, обладали повышенной реактогенностью.

Разработка новых классов адъювантов является перспективным направлением современной иммунобиологии. За последние десятилетия произошли значительные изменения в технологии производства вакцинных препаратов. Вакцины, которые проходят в настоящее время клинические испытания, значительно отличаются от традиционных вакцин. Прежде всего, это рекомбинантные вакцины на основе очищенных белков. Создание новых вакцин является в свою очередь причиной поиска новых адъювантов. Использование адъювантов позволяет уменьшить дозу антигена в вакцине, увеличить иммуногенность «слабых» антигенов, предотвращать конкуренцию антигенов в комбинированных вакцинах, увеличивать скорость развития и продолжительность иммунного ответа у привитых, индуцировать защитные свойства слизистых оболочек, а также увеличивать силу иммунного ответа у детей и лиц пожилого возраста.

Гриппозные вакцины с адъювантами. В настоящее время на российском рынке представлены две вакцины против гриппа с адъювантами - это вакцина гриппозная инактивированная субъединичная Совигрипп® и четырехвалентная полимерсу бъединичная вакцина Гриппол®.

Вакцина «Совигрипп» (RU 2446824) содержит в качестве адъюванта и носителя сополимер 2-метил-5-винилпиридина и N-винил-пирролидона. Способ ее получения предусматривает культивирование вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости, концентрирование, очистку, инактивацию и расщепление вируса. Концентрирование и очистку осуществляют сорбцией вируса на куриных эритроцитах с последующим ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Инактивацию и расщепление вируса проводят любыми разрешенными к применению средствами. Расщепленный концентрат вируса центрифугируют и подвергают ультрафильтрации. Полученный концентрат очищенных антигенов каждого штамма вируса гриппа рассматривается как моновакцина. После сведения моновакцин в поливакцину добавляют адъювант - сополимер 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона. Полученная полимерная трехвалентная вакцина содержит штаммы вируса гриппа типа А, В при массовом соотношении антиген-адъювант от 1:5 до 1:30. Недостатком данной вакцины является ограниченность применения трехвалентных инактивированных вакцин против гриппа, для ряда популяционных групп: маленьких детей, беременных, пожилых людей, лиц с различными хроническими заболеваниями, которых относят к группам риска по гриппу, а также в отношении антигенно отличных штаммов (дрейфовых и гетерологичных), не содержащихся в вакцине. Для повышения эффективности инактивированных вакцин против гриппа используют штаммы двух линий гриппа В (ямагатской и викторианской), вместо одной, а также добавляют иммуноадъюванты.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому изобретению является технология получения тетравалентной вакцины Гриппол®, которая содержит антигены вируса гриппа подтипов A (H1N1), A (H3N2), B/Yamagata lineage, B/Victoria lineage, в качестве адъюванта и носителя - производное поли-1,4-этиленпиперазина - Полиоксидоний, а в качестве вспомогательных веществ фосфатно-солевой буферный раствор, тиомерсал, манитол, повидон, тритон Х-100. Способ получения вакцин Гриппол® предусматривает культивирование вируса гриппа в развивающихся куриных эмбрионах, получение вирусного концентрата, очистка вирусного концентрата методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы, инактивация вирусного материала, расщепление вирусного концентрата детергентом, выделение антигенов вируса гриппа, сведение моновалентов в поливалентную вакцину с последующим добавлением адъюванта поли-1,4-этиленпиперазина «Полиоксидоний». Данная вакцина является недостаточно эффективной, что обусловлено применяемым полимерным адъювантом, который не способен формировать глобулярные структуры (корпускулы), усиливая этим клеточное звено иммунного ответа.

Перспективные разработки адъювантов. В настоящее время в мировой и отечественной практике рассматриваются адъюванты в виде различных форм: липосомы, виросомы, иммуностимулирующие комплексы, наноэмульсии (MF59, SAF, Montanide), полимерные наносферы, вирусоподобные частицы и др. Самые перспективные адъюванты, по мнению исследователей, - это наночастицы (НЧ). Одной из причин использования НЧ в качестве адъювантов является тот известный факт, что они эффективно поглощаются антигенпрезентирующими клетками. Таким образом, если с НЧ связать антиген, то он будет направленно поглощаться макрофагами, что приведет к усилению иммунного ответа.

Среди наночастиц наибольший интерес представляют адъюванты на основе тритерпеноидов бересты, в частности, наночастицы на основе природного пентациклического тритерпенового вещества - бетулина (бетуленол, бетулинол, лупендиол). Его применение (RU 232209), в отличие от известных адъювантов, обеспечивает наряду с адъювантными свойствами широкий спектр биологической активности, в частности противобактериальное, противогрибковое, противовирусное действия, гепатопротективное, противовоспалительное, противораковое, противоаллергическое, мембранстабилизирующее, иммуномодулирующее, антиоксидантное действие. При создании таких адъювантов, имеются трудности, связанные с крайне низкой растворимостью в воде тритерпеноидов. Так, растворимость бетулина, как было определено, составляет менее 1 мкг/мл. Поэтому создание водорастворимой формы весьма актуально, так как должно привести к увеличению концентрации частиц и повышению эффективности адъюванта. Поиск таких форм привел к созданию сферических аморфных наночастиц на основе бересты.

Патент - бетулин. Задача, решаемая изобретением RU 2545714 С, заключается в повышении качества бетулина-адъюванта, позволяющая получать его в соответствии с требованиями, предъявляемыми к препаратам, вводимым парентерально: стерильность, апирогенность, атоксичность, а также легкости масштабирования и стабильности при хранении.

Технический результат достигнут тем, что в способе получения адъюванта включающем растворение смеси тритерпеноидов бересты в тетрагидрофуране, добавление криопротектора и лиофилизацию, согласно изобретению получают смесь в тритерпеноидов бересты в тетрагидрофуране с концентрацией 5-10 г/л, с последующим растворением олеиновой кислоты в количестве 5-10% от массы тритерпеноидов бересты, проводят стерилизующую фильтрацию смеси, добавляют 25 кратный избыток 0,01 М трис буфера рН=9,0±0,2 для формирования сферических аморфных наночастиц и перемешивают, проводят ультразвуковую обработку в течение 5-10 минут, удаляют органический растворитель с помощью ультрафильтрации при скорости 1,0-1,2 л/минуту, при давлении 0,6-0,8 атм и предпочтительно на мембранах с порогом исключения 300 КДА, замораживают полученную концентрированную смесь с содержанием смеси терпеноидов 1 мг/мл при добавлении криопротектора ниже температуры (-350)°С, выдерживают при этой температуре 4-6 часов и лиофилизируют. В качестве криопротектора могут быть использованы: сахароза, маннит, мальтоза, трегалоза, манноза, сорбит и т.п. Предпочтительно в способе при лиофилизации используют сахарозу как наиболее дешевый углевод.

Одно из преимуществ данного адъюванта заключается в наличии в его составе олеиновой кислоты в количестве 5-10% от массы тритерпеноидов бересты, которая обеспечивает стабильность при хранении. Введение стадии стерилизующей фильтрации обеспечило получение адъюванта стерильным и апирогенным, а использование ультрафильтрационной очистки способствовало исключению токсичности и удаление тетрагидрофурана. Включение стадии обработки ультразвуком позволило в большей степени стабилизировать адъювант. Совокупность отличительных признаков обеспечивает легкость масштабирования технологического процесса от лабораторного до промышленного.

В настоящее время бетулин в виде сферических аморфных наночастиц предложено применять в составе моновакцин против гепатита В, дифтерии, вируса болезни Ньюкасла, а также в качестве адъюванта для четырехвалентных гриппозных вакцин (RU 2355423, RU 2546861, RU 2545714, RU 2740751). Применение его для поливакцин в доступной литературе не описано. Сферический наноадъювант на основе бетулина применяется и в настоящее время в рекомбинантной вакцине против коронавируса «Бетувакс КоВ-2» (RU 2749193 С1, RU 2021139955 А). Данная вакцина была разработана в условиях пандемии коронавируса SARS-CoV-2 и зарекомендовала себя как эффективная вакцина с пониженным содержанием рекомбинантного антигена, представляющего собой RBD участок S-белка вируса SARS-Cov-2.

Список рисунков:

Фиг 1. Схема S-белка SARS-CoV-2 и рекомбинантного белка на основе RBD-SD1-Fc. а) схема S-белка на поверхности SARS-CoV-2, б) схема структуры рекомбинантного RBD-SD1-Fc антигена, в) схема S-белка SARS-CoV-2, с указанной RBD-SD1 частью, взятой за основу рекомбинантных белков.

Фиг. 2. Карта плазмиды P-Pharma-RBD-Fc.

Задачей настоящего изобретения является расширение номенклатуры используемых вакцин против респираторных инфекций, с помощью объединенной вакцины, содержащей антигены и вирусов гриппа и вируса SARS-CoV-2 и новый корпускулярный адъювант на основе тритерпеноидов бересты. Такая комбинированная вакцина представляется стратегически важным аспектом защиты населения Российской Федерации от тяжелых социальных и экономических последствий пандемии, которые возможно эффективно контролировать лишь с помощью вакцинопрофилактики. Технический результат достигается за счет способа получения вариантов антигенов вируса гриппа подтипов A (H1N1), A (H3N2), B/Yamagata lineage, B/Victoria lineage и вариантов антигенов-рекомбинантных белков на основе участка S-белка SARS-CoV-2, включающего RBD и SD1, слитого с Fc фрагментом IgG, с последующим добавлением адъюванта в форме сферических аморфных наночастиц к каждому антигену и их объединением в пентавалентную вакцину.

Раскрытие сущности изобретения

Технология получения вакцины включает раздельное культивирование вирусов гриппа подтипов A (H1N1), A (H3N2), B/Yamagata lineage, B/Victoria lineage в развивающихся куриных эмбрионах с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости, концентрирование, очистку, инактивацию и расщепление вируса, его последующее центрифугирование, ультрафильтрацию и получение моновалентов для каждого штамма, а также культивирование линии клеток, продуцирующих RBD-Fc рекомбинантного белка вируса SARS-CoV-2 (антигена) с отбором и осветлением культуральной жидкости, содержащей антиген, последующей хроматографической очисткой антигена и получением моновалента. Добавление адъюванта к каждому типу вируса осуществляют раздельно - в каждый из монопрепаратов вводят в качестве адъюванта бетулин при соотношении антиген-адъювант от 1:1,25 до 1:12,5, после чего осуществляют сведение моновакцин в комбинированную вакцину при тщательном перемешивании.

Введение бетулина в концентрации менее 1:1,25 не позволяет добиться необходимого уровня иммунного ответа, а его использование в концентрации более 1:12,5 не приводит к повышению иммуногенности вакцины и ведет к снижению концентрации активного начала, что экономически нецелесообразно.

Описание изобретения. Для получения пентавалентной субъединичной вакцины против респираторных инфекций, содержащей корпускулярный адъювант на основе природного бетулина, использовались антигены два штамма вируса SARS-CoV-2 и штаммы вируса гриппа типа A (H1N1), А (Н3Н2), В1 и В2.

Получение адъюванта на основе сферических аморфных наночастиц. Адъювант получали по технологии, представленной в патентах RU 2545714 С1 и RU 2749193 С1. Коротко, в емкость со стерильным буферным раствором подавали стерильный раствор бетулина в тетрагидрофуране с включенным ультразвуком при 35 КГц в течение 10 минут. После подачи и перемешивания раствора бетулина, полученную суспензию подвергали ультрафильтрации для удаления тетрагидрофурана, а по завершению ультрафильтрации суспензию обрабатывали ультразвуком при 35 кГц в течение 3 минут.

Способ получения антигенов вируса гриппа. Куриные эмбрионы 10-12-суточного возраста заражали вирусом гриппа в аллантоисную полость. Зараженные эмбрионы помещали в термальную комнату при температуре 32-35°С и влажности (60±10) %. Для штаммов гриппа типа А продолжительность инкубации составляла 48 ч, для штаммов вируса типа В - 72 ч. По окончании инкубации эмбрионы проверяли с помощью овоскопа. Жизнеспособные эмбрионы помещали в холодильную камеру при температуре (4±2)°С на (18±2) ч для охлаждения. Сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) осуществляли методом слива в бутыль. В бутыли, содержащие 5-6 л вируссодержащей аллантоисной жидкости, добавляли равное количество фосфатного буферного раствора, перемешивали в течение 10 мин на шейкере и проводили микрофильтрацию через каскад фильтрующих элементов с размерами пор соответственно: 2,3-2,6-1,2-0,8-0,44 мкм. В содержимое бутыли (фильтрат) добавляли раствор бета-пропиолактона до конечной концентрации 0,1%, тщательно перемешивали и оставляли в холодильной камере на шейкере на 17-18 часов.

Далее проводили концентрирование и частичную очистку инактивированной ВАЖ: ультрафильтрацию проводили на установке для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с 4 кассетными модулями с номинальной отсекающей молекулярной массой 300 кДа. Полученный концентрат ВАЖ промывали 3-4 объемами фосфатного буферного раствора и дополнительно очищали ультрацентрифугированием в градиенте плотности при помощи двух растворов сахарозы 50% и 20% при скорости вращения ротора 30000 об/мин. Содержимое ротора раскапывали по фракциям объемом 20 мл после чего титровали в РГА для определения пика вируса и собирали в единый объем с максимальным содержанием гемагглютинина. Для очистки ультрацентифугата концентрата использовали гель-хроматографию на полимерном носителе. Объем носителя для хроматографии определяли из расчета 5 объемов носителя к одному объему пробы. Колонку уравновешивали трис-буфером, наносили концентрат с сахарозой на колонку через насос, затем элюировали трис-буфером. Сбор целевого элюата осуществляли по оптической плотности при длине волны 280 нм.

Для инактивации вируса использовали установку, содержащую источник ультрафиолетовых лучей с силой потока ультрафиолетового облучения не менее 90 люменов. Для разрушения инактивированного вирусного концентрата использовали октилглюкозид (Octil-D-Glucopyranoside) в массовом соотношении детергента к суммарному белку 10:1 Инкубацию проводили в течение 1 часа в холодильной камере при температуре от 5±3°С. Далее проводили концентрирование расщепленного вирусного препарата на установке ультрафильтрации с 2 кассетными модулями с диаметром пор 10 кДа.

Сконцентрированный расщепленный препарат далее очищали от детергента методом гельфильтрации на хроматографическом носителе на основе агарозы с пределом эксклюзии 150 кД. Собирали элюат в стерильную емкость. Для отделения липопротеинов использовали ультрацентрифугирование при ускорении 90000 g в течение 2 часов при температуре от 2 до 8°С. Центрифугат передавали на стерилизующую фильтрацию через набор фильтров с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм.

Антигены вируса гриппа и адъювант. Полученные полуфабрикаты (моновалентные субстанции) контролировали по следующим показателям: стерильность, остаточное содержание детергента, специфическая активность по ОРИД (содержание гемагглютинина), гемагглютинирующая активность, специфическая безопасность, подлинность, белок по методу Лоури с осаждением. После проведения контроля, в бутыль-приемник добавляли предварительно приготовленный корпускулярный адъювант на основе природного бетулина в массовом соотношении гемагглютинина моновалента и адъюванта 1:5 в фосфатном буферном растворе рН 7,5. Бутыль тщательно перемешивали и помещали в шейкере в холодильник на 3 часа. Затем бутыли с моновалентной субстанцией и адъювантом хранили в холодильной камере при температуре 4±2°С. Конечная концентрация НА составила 25 мкг/мл, а концентрации адъюванта 400 мкг/мл в фосфатном буферном растворе рН 7,5.

Способ получения рекомбинантных белков-антигенов на основе S-белка SARS-CoV-2. Согласно заявке RU 2021139955 А, на первом этапе работы был разработан дизайн рекомбинантного гена RBD-Fc для экспрессии и получения антигена-рекомбинантного белка вируса SARS-CoV-2. Был выбран участок S-белка штамма Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2 (далее по тексту: Wuhan), включающий RBD и SD1, слитый с Fc фрагментом IgG человека (фиг. 1). Участок S-белка (аминокислоты 302-638), включающий RBD и SD1 представлен на фиг. 1 как «RBD-SD1 антиген».

Разработанная генная конструкция, содержащая последовательность RBD-Fc, была синтезирована в ЗАО «Евроген». Таким образом, была получена конструкция pAL-TA-RBD-Fc. Далее рекомбинантный ген RBD-Fc был амплифицирован в реакции ПЦР с использованием фланкирующих праймеров, фосфорилирован и клонирован в плазмидный вектор P-Pharma для экспрессии в клеточных линиях млекопитающих. Полученная плазмида была названа P-Pharma-RBD-Fc.

Генная конструкция P-Pharma-RBD-Fc получена на основе вектора pCBG99 (GenBank, AY258596). Вектора pCBG99 модифицировали следующим образом: промотор SV-40 заменяли гибридной промоторной конструкцией, содержащей энхансер hCMV MIE (pcDNA3.1-GFP, GenBank, МН325108) и промотор hEF-1 (pEXPR5, GenBank, M34017), сигнал полиаденилирования SV-40 был заменен сигналом bGH Poly(A) (pcDNA3.1-GFP, GenBank, МН325108). Кроме того, были добавлены область прикрепления матрикса (MAR) локуса гена бета-интерферона человека и домены белка терминального повтора вируса Эпштейна-Барр (EBVTR). Были добавлены промоторы эукариотических маркеров селекции - hPGK (GenBank, М34017) для устойчивости к зеоцину и mPGK (pHPmF1, GenBank, JN195815) для экспрессии мышиного DHFR (GenBank, ВС005796).

Плазмиду расщепляли смесью рестрикционных ферментов HindIIIl/XbaI в буфере CutSmart (NEB), полученный продукт дефосфорилировали и затупляли с помощью CIP (NEB) и ДНК-полимеразы Phusion (NEB), соответственно. Последовательность RBD-Fc амплифицировали с фланкирующими праймерами, содержащими последовательность Козака и сигнал терминации транскрипции. Полученный продукт фосфорилировали PNK Т4 (NEB), лигировали в вектор и трансформировали в Е. coli 10 бета (NEB) и выделили при помощи коммерческого набора Plasmid Midiprep 2.0 (Евроген). Схема конструкции представлена на фиг. 2.

Для продукции RBD-Fc рекомбинантного белка были использованы клетки яичников китайского хомячка СНО-НР (ООО «Фармапарк», Россия). Способ получения RBD-Fc рекомбинантного белка включает следующие этапы:

1) культивирование штамма, продуцирующего рекомбинантный белок,

2) отбор и осветляющая фильтрация культуральной жидкости,

3) хроматографическая очистка рекомбинантного белка,

4) подтверждение подлинности полученного рекомбинантного белка.

RBD-Fc рекомбинантный белок получали по технологии согласно заявке RU 2021139955 А. Коротко, клетки CHO-S культивировали в шейкер-инкубаторе при 5% содержания CO2, 80%-ной влажности и скорости качания 120 об/мин в питательной среде HyClone HyCell TransFx-C transfection media (GE Healthcare, США) с добавлением 8 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), до достижения плотности 2*106 кл/мл 1 литр суспензии. Полученную суспензию трансфицировали плазмидными векторами при помощи 1 мг/мл реагента Polyethylenimine (Polyscience, США), согласно инструкции производителя.

В клетках СНО в режиме транзиентной экспрессии осуществлен биосинтез RBD-Fc рекомбинантного белка. Затем в течение 2 недель проводили селекцию трансфицированных клеток на антибиотике гигромицин Б. Данный антибиотик был выбран, поскольку плазмидные векторы содержат ген устойчивости к антибиотику Hygromycin В. Продукция указанного белка составляла от 5 мг/л до 10 мг/л.

Выделение RBD-Fc рекомбинантного белка осуществляли из культуральной жидкости, по окончанию культивирования клеток СНО. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, супернатант переносили в чистые пробирки и осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 4000 об/мин. Супернатант снова переносили в чистые пробирки, добавляли 1/10 объема 10-кратного буфера Трис-HCl (20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl рН 7,2 1× буфер) и наносили на предварительно уравновешенную 1 мл колонку с носителем HiTrap MabSelect SuRe (Cytiva, США). Выделение белковых препаратов осуществляли на хроматографе Acta Pure (GE Healthcare, США) при скорости потока жидкости 2-4 мл/мин и давлении не более 0,5 Мпа. После нанесения колонку промывали 10 объемами колонки буфера Трис-HCl. Рекомбинантный белок элюировали цитратным буфером (20 мМ лимонная кислота-NaOH, 200 мМ NaCl, рН 3,0), детекцию белков осуществляли в режиме реального времени по оптическому поглощению при 280 нм. Фракцию, содержащую искомый продукт, нейтрализовали добавлением 1/10 от объема фракции буфера для нейтрализации (1M Tris-HCl рН 8,0). Элюат диализовали против двух смен фосфатного буфера (10 mM NaH2PO4, 1.7 mM K2HPO4, 137 mM NaCl, KCl 2.7 mM рН=7,4), проводили стерилизующую фильтрацию и помещали на хранение при +4°С.

Полученный в соответствии с перечисленными этапами стерильный рекомбинантный белок RBD-Fc, растворенный в Трис-HCl буферном растворе, далее добавляли в емкость с предварительно приготовленным стерильным адъювантом в 0,05М буферном растворе Трис-HCl с добавлением 0,15М NaCl (рН 7,5) тщательно перемешивали в течение двух часов при +4°С. Полуфабрикат RBD-Fc, прошедший все контроли, доводят до концентрации белка 100 мкг/мл и концентрации адъюванта 400 мкг/мл в фосфатном буферном растворе рН 7,5. Емкость помещали в шейкере в холодильник на 3 часа. Затем бутыли с рекомбинантным белком и адъювантом хранили в холодильной камере при температуре от 2 до 8°С Полученный вакцинный балк после проведения контролей разливали во флаконы по 0,5 мл и применяли в качестве кандидатной вакцины для проведения доклинических и клинических исследований.

Объединение. После перемешивания на шейкере в течение 0,5 часа в холодильной камере при +4°С моновалентные полуфабрикаты объединяют в стерильной бутыли добавляя равные части полуфабрикатов (1:1:1:1:1). Полученный объединенный балк помещают в холодильную камеру на +4°С и перемешивают на шейкере 2 часа. Затем хранят при той же температуре. Полученный полуфабрикат вакцины с адъювантом контролируют по следующим показателям: стерильность, содержание адъюванта, специфическая безопасность, подлинность, белок по методу Лоури (Лоури-М) с осаждением. В сведенном препарате содержание каждого из антигенов должно быть следующим: H1N1: 5±1,4 мкг/мл, H3N2: 5±1,4 мкг/мл, В1: 5±1,4 мкг/мл, В2: 5±1,4 мкг/мл, RBD-Fc: 18±2 мкг/мл. По мере надобности подсоединяют к разливочной машине и, с помощью дозирующего устройства проводят розлив во флаконы, шприцы или ампулы.

Таким образом, разработка отечественного безопасного и эффективного препарата - вакцины против коронавирусной инфекции, содержащей корпускулярный адъювант, была осуществлена с применением адъюванта на основе бетулина. Также, каждая из созданных вакцин позволяла контролировать раздельно профилактику гриппа или новой коронавирусной инфекции.

Сущность изобретения иллюстрируются следующими примерами:

Пример 1. Вакцину получали по вышеописанной технологии при массовом соотношении антигенов (RBD-Fc рекомбинантного белка и гемагглютининов) и адъюванта 1:1,25.

Пример 2. Вакцину получали по вышеописанной технологии при массовом соотношении антигенов (RBD-Fc рекомбинантного белка и гемагглютининов) и адъюванта 1:12,5.

Пример 3. Вакцину получали по вышеописанной технологии при массовом соотношении антигенов (RBD-Fc рекомбинантного белка и гемагглютининов) и адъюванта 1:5, причем адъювант вводили после смешения моновалентов.

Исследование иммуногенности. В исследовании иммуногенности вакцинных препаратов были использованы беспородные мыши, самки («Рапполово», Ленинградская область). Животных содержали в стандартных условиях (18-22°С. относительная влажность воздуха 50-70%, 12 ч темноты/12 ч света), в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях и в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29 августа 2014 г. №51). Использовали гранулированный полнорационный экструдированный корм для мышей, крыс, хомяков (ООО «Лабораторкорм», Москва) ad libitum. Все препараты (таблица 1) до использования хранились в холодильной камере (5±3°С), в темноте.

Иммунизацию животных осуществляли внутрибрюшинно в объеме 125-250 мкл/животное. Забор сывороток проводили в сроки, указанные в дизайне исследования (таблица 2). Кровь получали из нижнечелюстной вены, после чего образцы крови отстаивали при комнатной температуре в течение 2-х часов, после чего центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин и отбирали образовавшуюся цельную сыворотку. До момента использования сыворотки хранили при температуре - 20°С.

Для постановки реакции торможения гемаггютинации (РТГА) сыворотки мышей были обработаны RDE согласно инструкции производителя (RDE, Receptor destroying enzyme, Denka Seiken, Japan). Для удаления неспецифических агглютининов сыворотки были дополнительно обработаны равным объемом 10% куриных эритроцитов. Затем были приготовлены серии двукратных разведений в 96-луночньгх панелях для серологических реакций («Медполимер») в 25 мкл раствора NaCl 0,9%. Затем к разведениям сывороток было добавлено 25 мкл антигена, содержащего 4 ГАЕ (гемагглютинирующие единицы). В качестве антигенов были использованы диагностикумы гриппозные для постановки реакции торможения гемагглютинации (ООО «ППДП», Санкт-Петербург), содержащие штаммы вируса гриппа: A/Victoria/2570/19 (H1N1pdm09), A/Cambodia/e0826360/20 (H3N2), В/Вашингтон/02/19 (линия B/Victoria/2/87), В/Пхукет/3073/2013 (линия B/Yamagata/16/88). Сыворотки с антигеном были проинкубированы в течение часа при комнатной температуре, после чего во все лунки было добавлено 50 мкл 0.5% куриных эритроцитов, растворенных в NaCl 0,9%. Максимальное разведение сыворотки, которое полностью ингибировало гемагглютинацию куриных эритроцитов, принималось за титр сыворотки. РТГА титром являлось значение обратное разведению сыворотки в последней лунки с отсутствием гемагглютинации.

Двукратная иммунизация беспородных мышей привела к достоверному увеличению титров специфических антител ко всем четырем гриппозным монокомпонентам вакцинных препаратов. Для гриппозных монокомпонентов H1N1pdm09 и H3N2 в случае использования пентавалентной вакцины наблюдалось достоверно более высокое значение среднегеометрических титров по сравнению с использованием тетравалентной вакцины ТетраФлюБет (р<0,05). Двукратная иммунизация вакцинными препаратами в использованной дозировке приводила к выраженному формированию вируснейтрализующих антител.

Реакция микронейтрализации. Для обнаружения нейтрализующих антител использовали реакцию микронейтрализации на основе TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose). Сыворотки мышей прогревали 60 мин при 56°С, чтобы избежать связанного с комплементом снижения вирусной активности. Затем готовили серию двукратных разведений сыворотки на среде МЕМ+2% HI-FBS в объеме 60 мкл, начиная с 1:10 (в пересчете на цельную сыворотку). Каждое разведение сыворотки смешивали в равном объеме с живым вирусом SARS-CoV-2 (hCoV-19/St_Petersburg-3524V/2020 virus, GISAID EPI_ISL_415710, 60 мкл, содержащим 25 TCID50 / 50 мкл) и инкубировали 1 час при 37°С. Затем 100 мкл разведений переносили в 96- луночные планшеты с монослоем клеток Vero (АТСС CCL-81). Планшеты инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2, в течение 4 суток, после чего проверяли на наличие ЦПД (цитопатического действия вируса). Нейтрализацию регистрировали, если 100% клеток в лунке сохранялись (без видимых бляшек или цитопатического эффекта). Нейтрализующий титр сыворотки выражали как значение, обратное самому высокому разведению сыворотки, в котором была показана нейтрализующая активность (Barchuk А, 2021). Все эксперименты проводились в лаборатории BSL3.

Статистический анализ первичных данных проводили в GraphPad Prism v9. Для представления данных использовали следующие статистические показатели: среднее геометрическое, стандартное отклонение. Для определения значимости различий между групповыми средними использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA для группового сравнения, затем критерий Даннета для апостериорных попарных сравнений групп. Групповой уровень значимости принимали равным α=0,05. Различия считали достоверными при р<α.

Результаты реакции нейтрализации против коронавируса SARS-CoV-2 в сыворотках крови мышей после двукратной иммунизации показали, что в экспериментальных группах, привитых пентавалентной вакциной наблюдалась нейтрализация вируса, достоверно отличающаяся от группы, привитой тетравалентной гриппозной вакциной ТетраФлюБет и от контроля (плацебо). Результаты представлены в таблицах 3-7.

Изобретение относится к иммунологии, медицинской биотехнологии и биоинженерии. Описан способ получения вакцины против респираторных инфекций. Раздельно культивируют вирусы гриппа подтипов A (H1N1), A (H3N2), B/Yamagata lineage, B/Victoria lineage в развивающихся куриных эмбрионах с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости, её концентрацией и очищением. Осуществляют инактивацию и расщепление вируса, его последующее центрифугирование, ультрафильтрацию и получение моновалентов для каждого штамма, а также культивирование линии клеток, продуцирующей рекомбинантный белок вируса SARS-CoV-2 - RBD-Fc с отбором и осветлением культуральной жидкости, содержащей RBD-Fc. Проводят хроматографическую очистку с получением моновалента. При этом добавляют адъювант к каждому моноваленту раздельно. В качестве адъюванта используют бетулин при соотношении антиген:адъювант от 1:1,25 до 1:12,5. После чего осуществляют сведение моновакцин в комбинированную вакцину. Изобретение расширяет арсенал средств для профилактики респираторных инфекций, в частности гриппа и SARS-CoV-2. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 табл., 3 пр.

1. Способ получения пентавалентной субъединичной вакцины против гриппа и SARS-CoV-2, относящихся к ОРВИ, включающий раздельное культивирование вирусов гриппа подтипов A (H1N1), A (H3N2), B/Yamagata lineage, B/Victoria lineage в развивающихся куриных эмбрионах с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости, концентрирование, очистку, инактивацию и расщепление вируса, его последующее центрифугирование, ультрафильтрацию и получение моновалентов для каждого штамма, а также культивирование линии клеток, продуцирующей рекомбинантный белок вируса SARS-CoV-2 - RBD-Fc с отбором и осветлением культуральной жидкости, содержащей RBD-Fc, последующей хроматографической очисткой и получением моновалента, добавление адъюванта к каждому моноваленту осуществляют раздельно, в качестве адъюванта используют бетулин при соотношении антиген:адъювант от 1:1,25 до 1:12,5, после чего осуществляют сведение моновакцин в комбинированную вакцину.

2. Способ получения пентавалентной субъединичной вакцины против гриппа и SARS-CoV-2, относящихся к ОРВИ, по п. 1, отличающийся тем, что рекомбинантный RBD-Fc получают экспрессией в клетках СНО с помощью транзиентной трансфекции.