ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США № 62/200428, поданной 3 августа 2015 г., описание которой включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, который содержится в файле с названием MONS383WO_ST25.txt, размер которого 69.4 Кбайт (измерено в MS-Windows), и который создан 27 июля 2016 г., зарегистрирован вместе с данным документом посредством электронной подачи и включен в данный документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Конкретнее, изобретение относится к рекомбинантным молекулам ДНК, кодирующим ферменты, которые обеспечивают устойчивость к гербицидам, ингибирующим протопорфириногеноксидазу.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

При выращивании сельскохозяйственных культур часто используют трансгенные свойства, полученные с использованием методов биотехнологии. Для получения трансгенного свойства в растение можно вводить гетерологичный ген, также известный как трансген. Экспрессия трансгена в растении придает растению какое-либо свойство, такое как устойчивость к гербициду. Примеры трансгенных свойств устойчивости к гербицидам включают устойчивость к глифосату, устойчивость к глюфосинату и устойчивость к дикамбе. С увеличением количества видов сорных растений, устойчивых к широко используемым гербицидам, в данной области необходимы новые свойства устойчивости к гербицидам. Гербициды, представляющие особый интерес, включают в себя гербициды, которые ингибируют протопорфириногеноксидазу (PPO), называемые PPO гербицидами. PPO гербициды обеспечивают контроль над рядом гербицидостойких сорных растений, таким образом делая свойство придания устойчивости к этим гербицидам особенно полезным для систем земледелия в сочетании с одним или большим количеством других свойств устойчивости к гербицидам.

Протопорфириногеноксидаза выполняет функции в пути биосинтеза как хлорофилла, так и гема, где она превращает протопорфириноген IX в протопорфирин IX. После выработки протопорфирина IX пути биосинтеза хлорофилла и гема расходятся, при этом присоединяются различные ионы металлов (железо для гема и магний для хлорофилла). Сегменты этого пути сохраняются для прокариотов и эукариотов, и многие из ферментов PPO, обнаруживаемые у прокариотов и эукариотов, в общем и целом подобны. Некоторые прокариоты (например, цианобактерии) используют этот путь для выработки хлорофилла и гема, тогда как другие прокариоты (например, Escherichia coli) используют этот путь для выработки гема.

Нечувствительные к гербицидам протопорфириногеноксидазы («iPPO») выделены из ряда прокариот и эукариот. С точки зрения структуры считают, что существует по меньшей мере три различных подкласса ферментов PPO: HemY (Hansson and Hederstedt, ʺCloning and characterization of the Bacillus subtilis hemEHY gene cluster, which encodes protoheme IX biosynthetic enzymesʺ Journal of Bacteriology 174(24):8081-8093 (1992)), HemG (Sasarman, et al.,, ʺMapping of a new hem gene in Escherichia coli K12ʺ Microbiology 113:297-303 (1979)) и HemJ (Boynton, et al.,, ʺDiscovery of a gene involved in a third bacterial protoporphyrinogen oxidase activity through comparative genomic analysis and functional complementationʺ Applied and Environmental Microbiology 77(14):4795-4801 (2011)). Согласно настоящему изобретению предложены рекомбинантные iPPO, которые являются членами семейства HemG. Несмотря на двадцать лет исследований и количество iPPO, идентифицированных на данный момент, трансгенная сельскохозяйственная культура, содержащая рекомбинантную iPPO, еще не запущена в коммерческое производство. Мощный контроль над сорными растениями частично зависит от непрерывного развития наборов свойств устойчивости к гербицидам. Выявление и использование iPPO для придания трансгенных свойств сельскохозяйственным культурам, следовательно олицетворяет прогресс в области сельского хозяйства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте изобретения предложена рекомбинантная молекула ДНК, содержащая гетерологичный промотор, функционально присоединенный к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности полипептида, выбранной из SEQ ID № 1-20, причем полипептид обладает активностью нечувствительной к гербицидам протопорфириногеноксидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность полипептида идентична по меньшей мере на около 85%, идентична по меньшей мере на около 90%, идентична по меньшей мере на 95%, идентична по меньшей мере на 96%, идентична по меньшей мере на 97%, идентична по меньшей мере на 98% или идентична по меньшей мере на 99% последовательности полипептида, выбранной из SEQ ID № 1-20, и полипептид обладает активностью нечувствительной к гербицидам протопорфириногеноксидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложена рекомбинантная молекула ДНК, причем последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из SEQ ID № 22-63. В конкретных вариантах осуществления изобретения рекомбинантная молекула ДНК кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1-20. Следовательно, согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична полной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID № 1-20, причем полипептид обладает активностью нечувствительной к гербицидам протопорфириногеноксидазы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен гетерологичный промотор, например промотор, функционирующий в клетках растений, функционально присоединенный к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипетид, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности полипептида по данному изобретению, например последовательности полипептида, выбранной из SEQ ID № 1-20, причем полипептид обладает активностью нечувствительной к гербицидам протопорфириногеноксидазы. Полученная таким образом молекула ДНК может дополнительно содержать нацеливающую последовательность, функция которой заключается в локализации полипептида внутри клетки.

В одном аспекте изобретения предложена конструкция ДНК, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению. В одном варианте осуществления изобретения эта конструкция ДНК содержит в функциональном соединении с последовательностью нуклеиновой кислоты по данному изобретению нацеливающую последовательность, функция которой заключается в локализации полипептида внутри клетки. Молекула ДНК может присутствовать в геноме трансгенного растения, семени или клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид придает клетке, растению, семени или части растения устойчивость к гербицидам.

В другом аспекте изобретения предложено трансгенное растение, семя, клетка или часть растения, которая содержит рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению или рекомбинантный полипептид по данному изобретению. Таким образом, трансгенное растение, семя, клетка или часть растения могут обладать, т. е. проявлять, устойчивостью к по меньшей мере одному PPO гербициду. В некоторых вариантах осуществления изобретения трансгенное растение, семя, клетка или часть растения обладает дополнительным трансгенным свойством устойчивости к гербицидам.

В другом аспекте изобретения предложен способ придания устойчивости к гербицидам растению, семени, клетке или части растения, включающий в себя гетерологичную экспрессию рекомбинантного полипептида по данному изобретению в растении, семени, клетке или части растения. В некоторых вариантах осуществления способа растение, семя, клетка или часть растения обладает активностью протопорфириногеноксидазы, которая обеспечивается рекомбинантным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления изобретения устойчивость к гербицидам представляет собой устойчивость по меньшей мере к одному PPO гербициду, выбранному из группы, состоящей из ацифлуорфена, фомесафена, лактофена, флуорогликофен-этила, оксифлуорфена, флумиоксазина, азафенидина, карфентразон-этила, сулфентразона, флутиацет-метила, оксадиаргила, оксадиазона, пирафлуфен-этила, сафлуфенацила и S-3100.

Другой аспект изобретения относится к способу трансформации растения, включающий в себя стадии: a) введения рекомбинантной молекулы ДНК по данному изобретению в клетку растения; и b) регенерации из нее трансгенного растения, которое содержит рекомбинантную молекулу ДНК. Способ может дополнительно включать в себя стадию отбора растения, которое является устойчивым к по меньшей мере одному PPO гербициду. Способ может также дополнительно включать в себя стадию скрещивания регенерированного растения с самим собой или с другим растением и сбора семян гибрида.

Еще в одном аспекте изобретения предложен способ контроля сорной растительности на участке для выращивания растений, включающий в себя приведение участка для выращивания растений, содержащего трансгенное растение или семя, в контакт с по меньшей мере одним PPO гербицидом, причем трансгенное растение или семя устойчиво к PPO гербициду, и сорную растительность контролируют на участке для выращивания растений.

Также предложен способ установления нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обладающий активностью протопорфириногеноксидазы, причем способ включает в себя: a) трансформацию штамма E. coli, имеющего нокаут гена, отвечающего за нативный фермент PPO E. coli, с помощью бактериального экспрессионного вектора, содержащего рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок с вероятной устойчивостью к гербициду; и b) выращивание указанной трансформированной E. coli с использованием среды для выращивания бактерий, не содержащей гем, причем рост при использовании указанной среды для выращивания бактерий, указывает на белок, обладающий активностью протопорфириногеноксидазы.

Дополнительно, согласно настоящему изобретению предложен способ установления нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обладающий активностью нечувствительной к гербицидам протопорфириногеноксидазы, причем способ включает в себя: a) трансформацию штамма E. coli, имеющего нокаут гена, отвечающего за нативный фермент PPO E. coli, с помощью бактериального экспрессионного вектора, содержащего рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую рекомбинантный белок; и b) выращивание указанной трансформированной E. coli с использованием среды для выращивания бактерий, содержащей по меньшей мере один PPO гербицид, причем рост бактерий указывает на белок, обладающий активностью нечувствительной к гербицидам протопорфириногеноксидазы.

Другой аспект изобретения относится к способу отбора гена устойчивости к гербицидам, включающему в себя: a) экспрессию рекомбинантной молекулы ДНК по данному изобретению в клетке растения; и b) идентификацию клетки растения, которая демонстрирует устойчивость к PPO гербициду.

Дополнительно, согласно настоящему изобретению предложены способы отбора гена, отвечающего за устойчивость к гербицидам, включающие в себя: a) экспрессию рекомбинантной молекулы ДНК по данному изобретению в бактериальной клетке, в которой отсутствует HemG, причем бактериальную клетку выращивают в среде, не содержащей гем, в присутствии PPO гербицида; и b) идентификация бактериальной клетки, которая демонстрирует устойчивость к PPO гербициду.

В другом аспекте изобретения предложен способ получения растения, устойчивого к PPO гербициду и по меньшей мере одному другому гербициду, включающий в себя: a) получение растения, содержащего рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению; b) скрещивание трансгенного растения с другим растением, имеющим устойчивость к по меньшей мере одному другому гербициду, и c) отбор растения-потомка, возникающего в результате указанного скрещивания, который обладают устойчивостью к PPO гербициду и по меньшей мере одному другому гербициду.

В другом аспекте изобретения также предложен способ уменьшения развития устойчивых к гербицидам сорных растений, включающий в себя: a) культивирование в среде для выращивания сельскохозяйственных культур растения по настоящему изобретению, которое обладает устойчивостью к PPO гербициду, например за счет содержания молекулы ДНК по настоящему изобретению, и обладает устойчивостью к по меньшей мере одному другому гербициду; и b) применение PPO гербицида и по меньшей мере одного другого гербицида в среде для выращивания сельскохозяйственных культур, причем сельскохозяйственная культура устойчива к PPO гербициду и по меньшей мере одному другому гербициду. В некоторых вариантах осуществления способа PPO гербицид может быть выбран из группы, состоящей из ацифлуорфена, фомесафена, лактофена, флуорогликофен-этила, оксифлуорфена, флумиоксазина, азафенидина, карфентразон-этила, сулфентразона, флутиацет-метила, оксадиаргила, оксадиазона, пирафлуфен-этила, сафлуфенацила и S-3100. В некоторых вариантах осуществления способа по меньшей мере один другой гербицид выбран из группы, состоящей из ингибитора ACCазы (ацетил-КоА-карбоксилазы), ингибитора ALS (ацетолактатсинтазы), ингибитора EPSPS (5-енолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы), синтетического ауксина, ингибитора фотосинтеза, ингибитора синтеза глутамина, ингибитора HPPD (гидроксифенилпируват-диоксигеназы), ингибитора PPO и ингибитора длинноцепочечных жирных кислот. В конкретных вариантах осуществления изобретения ингибитор ACCазы представляет собой арилоксифеноксипропионат или циклогександион; ингибитор ALS представляет собой сульфонилмочевину, имидазолинон, триазолопиримидин или триазолинон; ингибитор EPSPS представляет собой глифосат; синтетический ауксин представляет собой феноксильный гербицид, бензойную кислоту, карбоновую кислоту или семикарбазон; ингибитор фотосинтеза представляет собой триазин, триазинон, нитрил, бензотиадиазол или мочевину; ингибитор синтеза глутамина представляет собой глюфосинат; ингибитор HPPD представляет собой изоксазол, пиразолон или трикетон; ингибитор PPO представляет собой дифениловый эфир, N-фенилфталимид, арилтриазинон или пиримидиндион; или ингибитор длинноцепочечных жирных кислот представляет собой хлорацетамид, оксиацетамид или пиразол.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Выравнивание белковых последовательностей H_N90, H_N20, H_N60, H_N10, H_N30, H_N40, H_N50, H_N70, H_N100 и H_N110 (SEQ ID № 1-10), при этом положения консенсуса показаны снизу.

Фиг. 2. Результаты анализа, полученные из бактериальной системы отбора PPO, при этом влияние PPO гербицидов определяли через 8 часов роста E. coli, содержащей исследуемую iPPO.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID № 1 представляет собой аминокислотную последовательность H_N90.

SEQ ID № 2 представляет собой аминокислотную последовательность H_N20.

SEQ ID № 3 представляет собой аминокислотную последовательность H_N60.

SEQ ID № 4 представляет собой аминокислотную последовательность H_N10, которая представляет собой протопорфириногеноксидазу HemG дикого типа E. coli (№ доступа в NCBI GenBank WP_021498199).

SEQ ID № 5 представляет собой аминокислотную последовательность H_N30.

SEQ ID № 6 представляет собой аминокислотную последовательность H_N40.

SEQ ID № 7 представляет собой аминокислотную последовательность H_N50.

SEQ ID № 8 представляет собой аминокислотную последовательность H_N70.

SEQ ID № 9 представляет собой аминокислотную последовательность H_N100.

SEQ ID № 10 представляет собой аминокислотную последовательность H_N110.

SEQ ID № 11 - SEQ ID № 17 представляют собой аминокислотные последовательности, в которых отсутствует начальный метионин, соответствующие SEQ ID № 1, 2, 4, 5, 6, 7 и 9, соответственно.

SEQ ID № 18 и SEQ ID № 19 представляют собой аминокислотные варианты SEQ ID № 11.

SEQ ID № 20 представляет собой аминокислотный вариант SEQ ID № 17.

SEQ ID № 21 представляет собой аминокислотную последовательность WH, которая представляет собой протопорфириногеноксидазу дикого типа, полученную от Amaranthus tuberculatus (щирицы бугорчатой).

SEQ ID № 22 - SEQ ID № 31 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID № 1 - SEQ ID № 10, соответственно, кодон оптимизирован для экспрессии в E. coli.

SEQ ID № 32 - SEQ ID № 41 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID №: 1 - SEQ ID № 10, соответственно, кодон оптимизирован для экспрессии в двудольных растениях.

SEQ ID № 42 - SEQ ID № 48 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID № 11 - SEQ ID № 17, соответственно, кодон оптимизирован для экспрессии в двудольных растениях.

SEQ ID № 49 и SEQ ID № 52 представляют собой нуклеотидные варианты SEQ ID № 11 и SEQ ID № 12, соответственно.

SEQ ID № 50, 51 и 53 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID № 18, 19 и 20.

SEQ ID № 54 - SEQ ID № 63 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID №: 1 - SEQ ID № 10, соответственно, кодон оптимизирован для экспрессии в однодольных растениях.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующее описание и определения представлены для лучшей характеризации изобретения и для инструктирования специалистов в данной области техники при практическом осуществлении данного изобретения. Если не указано иное, термины необходимо понимать в соответствии с традиционным использованием специалистами в соответствующей области техники.

Согласно данному изобретению предложены новые рекомбинантные молекулы ДНК и белки, которые кодируют нечувствительные к гербицидам протопорфириногеноксидазы (iPPO). Например, согласно настоящему изобретению в одном варианте осуществления предложены векторы и экспрессионные кассеты, кодирующие iPPO бактериального происхождения, для экспрессии в клетках и растениях. Также предложены способы получения клеток и растений, устойчивых к PPO гербицидам. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены способы и композиции для применения в белковой инженерии и методах биоинформатики для получения и улучшения iPPO.

В конкретных аспектах изобретения предложены рекомбинантные молекулы ДНК и белки. При использовании в данном документе, термин «рекомбинантный» относится к не встречающимся в природе ДНК, белку, клетке, семени или организму, которые представляют собой результат генной инженерии, и следовательно обычно не обнаруживались бы в природе. «Рекомбинантная молекула ДНК» представляет собой молекулу ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая обычно не встречается в природе, и следовательно представляет собой результат вмешательства человека, как, например, молекула ДНК, состоящая из по меньшей мере двух гетерологичных друг другу молекул ДНК. Пример рекомбинантной молекулы ДНК представляет собой молекулу ДНК, представленную в данном документе, кодирующую нечувствительную к гербицидам протопорфириногеноксидазу, функционально присоединенную к гетерологичному регуляторному или другому элементу, такому как гетерологичный промотор. «Рекомбинантный белок» представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая обычно не встречается в природе, и следовательно представляет собой результат вмешательства человека, как, например, генно-инженерный белок или химерный белок. Рекомбинантная клетка, семя или организм представляет собой клетку, семя или организм, содержащий трансгенную ДНК, например трансгенную клетку, семя, растение или часть растения, содержащую рекомбинантную молекулу ДНК, и следовательно полученную в результате трансформации растения.

При использовании в данном документе, термин «генная инженерия» относится к созданию искусственной ДНК, белка или организма, который обычно не встречался бы в природе, а поэтому требует вмешательства человека. Генную инженерию можно использовать для получения генно-инженерной ДНК, белка или организма, который был зарожден и создан в лаборатории с использованием одного или большего количества способов биотехнологии, как например молекулярной биологии, биохимии белков, трансформации бактерий и трансформации растений. Например, генную инженерию можно использовать для создания химерного гена, содержащего по меньшей мере две молекулы ДНК, гетерологичные друг другу, с использованием одного или большего количества методов молекулярной биологии, таких как клонирование генов, лигирование ДНК и синтез ДНК. Химерный ген может состоять из двух или большего количества гетерологичных молекул ДНК, которые функционально связаны, так что последовательность, кодирующая белок, функционально присоединена к элементу экспрессии гена, такому как последовательность, кодирующая транзитный пептид, или гетерологичный промотор. Генную инженерию можно использовать для создания генно-инженерного белка, полипептидная последовательность которого была получена с использованием одного или большего количества способов инженерии белков, как например конструирование белка с использованием сайт-направленного мутагенеза и направленная эволюция с использованием случайного мутагенеза и ДНК-перетасовок. Генно-инженерный белок может содержать одно или большее количество удалений, вставок или замен относительно кодирующей последовательности белка дикого типа, и каждое удаление, вставка или замена может содержать одну или большее количество аминокислот. В другом варианте осуществления изобретения генно-инженерный белок может состоять из двух гетерологичных пептидов, которые функционально соединены, как например фермент, функционально присоединенный к транзитному пептиду.

При использовании в данном документе, «нечувствительный к гербицидам» означает способность протопорфириногеноксидазы (PPO) сохранять по меньшей мере некоторую часть ее ферментативной активности в присутствии одного или большего количества PPO гербицидов. Ферментативную активность протопорфириногеноксидазы можно измерить с помощью любых способов, известных в данной области техники, например с помощью ферментного анализа, в котором выработку продукта протопорфириногеноксидазы или потребление субстрата протопорфириногеноксидазы в присутствии одного или большего количество PPO гербицидов измеряют посредством флуоресценции, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или масс-спектрометрии (МС). Другой пример анализа для измерения ферментативной активности протопорфириногеноксидазы представляет собой бактериальный анализ, такой как анализы роста, описанные в данном документе, в которых рекомбинантная протопорфириногеноксидаза экспрессируется в бактериальной клетке, в которой в противном случае отсутствует активность PPO, и измеряют способность рекомбинантной протопорфириногеноксидазы дополнять этот нокаутный фенотип. Нечувствительность к гербицидам может представлять собой полную или частичную нечувствительность к конкретному гербициду и может быть выражена в процентах (%) устойчивости или нечувствительности к конкретному PPO гербициду. При использовании в данном документе, «нечувствительная к гербицидам протопорфириногеноксидаза» или «iPPO» демонстрирует нечувствительность к гербицидам в присутствии одного или большего количества PPO гербицидов.

При использовании в данном документе, «штамм, нокаутный по hemG» означает организм или клетку организма, такого как E. coli, в котором отсутствует активность HemG в такой степени, что он не способен расти в среде для роста, не содержащей гем, или так, что его рост заметно нарушен в отсутствие гема по сравнению с в остальном изогенным штаммом, содержащим активный HemG. Штамм, нокаутный по hemG, например, для E. coli можно получить принимая во внимание сведения, известные в данной области техники, например исходя из последовательности hemG E. coli (номер доступа Ecogene EG11485; Sasarman et al., "Nucleotide sequence of the hemG gene involved in the protoporphyrinogen oxidase activity of Escherichia coli K12" Can J Microbiol 39:1155-1161, 1993).

При использовании в данном документе, термин «трансген» относится к молекуле ДНК, искусственно включенной в геном организма вследствие вмешательства человека, такого как способ трансформации растений. При использовании в данном документе, термин «трансгенный» означает включающий в себя трансген, например, «трансгенное растение» относится к растению, содержащему трансген в своем геноме, а «трансгенное свойство» относится к характеристике или фенотипу, который передан или придан вследствие присутствия трансгена, включенного в геном растения. Вследствие таких изменений генома трансгенное растение заметно отличается от соответствующего растения дикого типа, а трансгенное свойство представляет собой свойство, которое не встречается в природе у растения дикого типа. Трансгенные растения по данному изобретению содержат рекомбинантные молекулы ДНК и генно-инженерные белки, предложенные в данном изобретении.

При использовании в данном документе, термин «гетерологичный» относится к взаимосвязи между двумя или большим количеством объектов, полученных из различных источников, и следовательно обычно не взаимодействующих в природе. Например, рекомбинантная молекула ДНК, кодирующая белок, гетерологична по отношению к функционально присоединенному промотору, если такая комбинация обычно не встречается в природе. Дополнительно, конкретная рекомбинантная молекула ДНК может быть гетерологична по отношению к клетке, семени или организму, в который она встроена, если она обычно не встречается в этой конкретной клетке, семени или организме.

При использовании в данном документе, термин «выделенный» относится к по меньшей мере частичному отделению молекулы от других молекул, как правило, связанных с ней в ее природном состоянии. В одном варианте осуществления изобретения термин «выделенный» относится к молекуле ДНК, которая отделена от нуклеиновых кислот, которые обычно контактируют с молекулой ДНК в ее природном состоянии. Например, молекула ДНК, кодирующая белок, который обычно присутствует в бактерии, будет представлять собой выделенную молекулу ДНК, если она не находится в составе ДНК бактерии, в которых обычно обнаруживают молекулу ДНК, кодирующую белок. Таким образом, молекула ДНК слитая с или функционально присоединенная к одной или большему количеству других молекул ДНК, с которыми она не была бы связана в природе, например в результате применения способов получения рекомбинантной ДНК или трансформации растений, считается в данном документе выделенной. Такие молекулы считаются выделенными, даже когда они входят в состав хромосомы клетки-хозяина или присутствуют в растворе нуклеиновых кислот с другими молекулами ДНК.

При использовании в данном документе, термин «молекула ДНК, кодирующая белок» относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок. «Последовательность, кодирующая белок» обозначает последовательность ДНК, которая кодирует белок. «Последовательность» означает последовательное расположение нуклеотидов или аминокислот. Границы последовательности, кодирующей белок, могут быть определены путем трансляции инициирующего кодона на 5'-конце и трансляции стоп-кодона на 3'-конце. Молекула, кодирующая белок, может содержать последовательность ДНК, кодирующую белковую последовательность. При использовании в данном документе, «трансгенная экспрессия», «экспрессия трансгена», «белковая экспрессия» и «экспрессия белка» означает выработку белка посредством процесса считывания молекулы ДНК матричной РНК (мРНК) и трансляции мРНК в полипептидные цепи, которые в конечном итоге сворачиваются в белки. Молекула ДНК, кодирующая белок, может быть функционально связана с гетерологичным промотором в конструкции ДНК для использования при экспрессии белка в клетке, трансформированной с помощью рекомбинантной молекулы ДНК. При использовании в данном документе, «функционально соединенный» обозначает две молекулы ДНК, соединенные так, что одна может влиять на функционирование другой. Функционально соединенные молекулы ДНК могут представлять собой часть одной непрерывной молекулы и могут являться или не являться непосредственно примыкающими. Например, промотор функционально связан с молекулой ДНК, кодирующей белок, в конструкции ДНК, в которой две молекулы ДНК так расположены, что промотор может влиять на экспрессию трансгена.

При использовании в данном документе, «конструкция ДНК» представляет собой рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую две или большее количество гетерологичных последовательностей ДНК. Конструкции ДНК пригодны для трансгенной экспрессии и могут содержаться в векторах и плазмидах. Конструкции ДНК можно использовать в векторах с целью трансформации, т. е. введения гетерологичной ДНК в клетку-хозяина, для получения трансгенных растений или клеток, и в связи с этим они могут содержаться также в пластидных ДНК или геномных ДНК трансгенного растения, семени, клетки или части растения. При использовании в данном документе, «вектор» означает любую рекомбинантную молекулу ДНК, которую можно использовать с целью трансформации бактерии или растения. Рекомбинантные молекулы ДНК, представленные в перечне последовательностей, могут, например, быть введены в вектор как часть конструкции, содержащей рекомбинантную молекулу ДНК, функционально присоединенную к элементу экспрессии гена, который функционирует в клетке, для воздействия на экспрессию генно-инженерного белка, который закодирован рекомбинантной молекулой ДНК. Общие способы, используемые для воздействия на молекулы ДНК для получения и использования рекомбинантных конструкций ДНК и векторов для трансформации растений, хорошо известны в данной области техники и подробно описаны, например, в справочниках и лабораторных руководствах, в том числе MR Green and J Sambrook, ʺMolecular Cloning: A Laboratory Manualʺ (Fourth Edition) ISBN:978-1-936113-42-2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2012). Компоненты конструкции ДНК или вектора, содержащего конструкцию ДНК, включают в себя один или большее количество элементов экспрессии гена, функционально присоединенных к транскрибируемой последовательности ДНК, такой как следующие: промотор для экспрессии функционально присоединенной ДНК, функционально присоединенная молекула ДНК, кодирующая белок, и функционально присоединенная 3'-нетранслируемая область (НТО). Элементы экспрессии гена, пригодные при практическом осуществлении настоящего изобретения, включают в себя, но не ограничиваясь ими, один или большее количество из следующих типов элементов: промотор, 5'-НТО, энхансер, лидерная последовательность, действующий в цис-положении элемент, интрон, нацеливающая последовательность, 3'-НТО и один или большее количество выбираемых маркерных трансгенов.

Конструкции ДНК по данному изобретению могут включать в себя промотор, функционально присоединенный к молекуле ДНК, кодирующей белок, предложенной в данном изобретении, при этом промотор запускает экспрессию рекомбинантной белковой молекулы. Промоторы, пригодные для практического осуществления настоящего изобретения, включают в себя те, которые функционируют в клетке, экспрессируя функционально связанный полинуклеотид, такие как промоторы бактерий или растений. Промоторы растений различны и хорошо известны в данной области техники и включают в себя, например, те, которые являются индуцируемыми, вирусными, синтетическими, конститутивными, регулируемыми во времени, пространственно регулируемыми и/или регулируемыми пространственно и во времени.

В одном варианте осуществления изобретения конструкция ДНК, предложенная в данном документе, включает в себя нацеливающую последовательность, которая функционально связана с гетерологичной нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу полипептида, который обладает активностью нечувствительной к гербицидам протопорфириногеноксидазы, при этом нацеливающая последовательность облегчает локализацию молекулы полипептида внутри клетки. Нацеливающие последовательности известны в данной области техники как сигнальные последовательности, нацеливающие пептиды, локализирующие последовательности и транзитные пептиды. Пример нацеливающей последовательности представляет собой транзитный пептид для хлоропластов (CTP), нацеливающую последовательность для митохондрий (MTS) или двойной нацеливающий пептид для хлоропластов и митохондрий. Посредством облегчения локализации белка внутри клетки нацеливающая последовательность может повышать накопление рекомбинантного белка, защищать белок от протеолитического распада и/или усиливать уровень устойчивости к гербицидам, а следовательно уменьшать степень повреждения трансгенной клетки, семени или организма после применения гербицида.

CTP и другие нацеливающие молекулы, которые можно использовать в связи с настоящим изобретением, известны в данной области техники и включают в себя, но не ограничиваясь ими, EPSPS CTP Arabidopsis thaliana (Klee et al., Mol Gen Genet. 210:437-442, 1987), EPSPS CTP Petunia hybrida (della-Cioppa et al., PNAS 83:6873-6877, 1986), сигнальную последовательность cab-m7 кукурузы (Becker et al., Plant Mol Biol. 20:49-60, 1992; PCT WO 97/41228), митохондриальную препоследовательность (например, Silva Filho et al., Plant Mol Biol 30:769-780, 1996) и сигнальную последовательность глутатионредуктазы гороха (Creissen et al., Plant J. 8:167-175, 1995; PCT WO 97/41228).

Рекомбинантные молекулы ДНК по настоящему изобретению можно синтезировать и модифицировать с помощью способов, известных в данной области техники, или полностью, или частично, если необходимо обеспечить последовательности, пригодные для воздействия на ДНК (такие как участки распознавания эндонуклеаз рестрикции или сайты клонирования, основанные на рекомбинации), последовательности, предпочтительные для растений (такие как использование кодона растений или консенсусные последовательности Козак), или последовательности, пригодные для построения конструкций ДНК (такие как спейсерные или линкерные последовательности). Настоящее изобретение включает в себя рекомбинантные молекулы ДНК и генно-инженерные белки, последовательность которых идентична по меньшей мере на 70%, идентична по меньшей мере на 80%, идентична по меньшей мере на 85%, идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 95%, идентична по меньшей мере на 96%, идентична по меньшей мере на 97%, идентична по меньшей мере на 98% и идентична по меньшей мере на 99% последовательностям любой рекомбинантной молекулы ДНК или полипептида, предложенным в данном документе, и которые обладают активностью нечувствительной к гербицидам протопорфириногеноксидазы. При использовании в данном документе, термин «процент идентичности последовательности» или «% идентичности последовательности» относится к процентному содержанию идентичных нуклеотидов или аминокислот в линейной полинуклеотидной или полипептидной последовательности для контрольной последовательности («предназначенной для сравнения») (или ее комплементарной цепи) по сравнению с исследуемой («испытуемой») последовательностью (или ее комплементарной цепью), когда две последовательности выравнены оптимальным образом (при этом соответствующие вставки, удаления или пробелы нуклеотидов или аминокислот в сумме составляют менее 20 процентов от контрольной последовательности на всем интервале сравнения). Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания интервала сравнения хорошо известно специалистам в данной области техники и может быть осуществлено с помощью таких средств, как алгоритм поиска локального сходства Смита-Ватермана, алгоритм поиска глобального сходства Нидлмана-Вунша, метод поиска подобия Пирсона-Липмана, и за счет реализации этих алгоритмов с использованием вычислительной техники, как например GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, доступные как часть комплекта программного обеспечения для анализа последовательностей GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Сан-Диего, Калифорния), MEGAlign (DNAStar Inc., 1228 S. Park St., Мэдисон, WI 53715) и MUSCLE (версии 3.6) (Edgar, ʺMUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughputʺ Nucleic Acids Research 32(5):1792-7 (2004)), например, с использованием параметров, заданных по умолчанию. «Степень идентичности» для выравненных сегментов исследуемой последовательности и контрольной последовательности представляет собой количество идентичных компонентов, общее для двух выравненных последовательностей, разделенное на общее количество компонентов в части контрольной последовательности, которая была выравнена, т. е. в целой контрольной последовательности или в меньшей заданной части контрольной последовательности. Процент идентичности последовательности представляют как степень идентичности, умноженную на 100. Сравнение одной или большего количества последовательностей можно выполнять с последовательностью такой же длины, или ее частью, или более длинной последовательностью.

Генно-инженерные белки можно получать путем изменения (т.е. модифицирования) белков дикого типа с получением нового белка с модифицированными характеристиками, например с особой локализацией в клетке, например нацеленностью на хлоропласт или митохондрию, или новой комбинацией полезных характеристик белка, например, среди прочего, измененными V_max, K_m, K_i, IC₅₀, субстратной специфичностью, специфичностью к ингибиторам/гербицидам, субстратной селективностью, способностью взаимодействовать с другими компонентами в клетке, такими как белки-партнеры или мембраны, стабильностью белка. Модификации могут быть выполнены по конкретным аминокислотным положениям в белке и могут представлять собой замену аминокислоты, находящейся в этом положении в природе (т.е. в белке дикого типа), на другую аминокислоту. Таким образом, генно-инженерные белки, предложенные в данном изобретении, обеспечивают новый белок с одним или большим количеством измененных характеристик белка по сравнению с подобным белком, встречающимся в природе. В одном варианте осуществления изобретения генно-инженерный белок имеет измененные белковые характеристики, например те, которые приводят к уменьшению чувствительности к одному или большему количеству гербицидов по сравнению подобным белком дикого типа или повышению способности придавать устойчивость трансгенному растению, которое экспрессирует генно-инженерный белок, к одному или большему количеству гербицидов. В одном варианте осуществления изобретения предложен генно-инженерный белок, и рекомбинантная молекула ДНК, кодирующая его, содержащий по меньшей мере одну замену аминокислоты, выбранную из Таблицы 1, и последовательность которого идентична по меньшей мере на около 70%, идентична на около 80%, идентична на около 85%, идентична на около 90%, идентична на около 95%, идентична на около 96%, идентична на около 97%, идентична на около 98% и идентична на около 99% любым последовательностям генно-инженерных белков, представленным в данном документе, в том числе, но не ограничиваясь ими, SEQ ID № 1-20. Аминокислотные мутации могут быть выполнены в виде одной замены аминокислоты в белке или в комбинации с одной или большим количеством других мутаций, таких как одна или большее количество замен, удалений или добавлений аминокислот. Мутации могут быть выполнены любым способом, известным специалистам в данной области техники.

Таблица 1. Замены аминокислот

Остаток Консервативная
замена Остаток Консервативная
замена Ala Ser Leu Ile; Val Arg Lys Lys Arg; Gln Asn Gln; His Met Leu; Ile Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr Gln Asn Ser Thr; Gly Cys Ser Thr Ser; Val Glu Asp Trp Tyr Gly Pro Tyr Trp; Phe His Asn; Gln Val Ile; Leu Ile Leu; Val

При использовании в данном документе, «дикий тип» обозначает подобную, но не идентичную, версию, которая встречается в природе. «Молекула ДНК дикого типа» или «белок дикого типа» представляет собой встречающуюся в природе версию молекулы ДНК или белка, т. е. версию молекулы ДНК или белка, которая уже существует в природе. Пример белка дикого типа, пригодного для сравнения с генно-инженерными белками, предложенными в данном изобретении, представляет собой протопорфириногеноксидазу, полученную от Arabidopsis thaliana. «Растение дикого типа» представляет собой генетически неизмененное растение того же типа, что и трансгенное растение, и фактически генетически отличается от трансгенного растения, обладающего свойством устойчивости к гербицидам. Примеры растений дикого типа, пригодных для сравнения с трансгенными растениями маиса, представляют собой генетически неизмененный маис LH244 (номер доступа ATCC PTA-1173) и инбредную линию маиса 01DKD2 (I294213) (номер доступа ATCC PTA-7859). Для трансгенных растений сои иллюстративной сравнительной линией будет генетически неизмененная соя A3555 (номер доступа ATCC PTA-10207), а для трансгенных растений хлопка иллюстративной сравнительной линией будет генетически неизмененный Coker 130 (номер организации по охране новых сортов растений 8900252).

Трансгенные растения и гербициды

Один аспект изобретения включает в себя трансгенные клетки растений, трансгенные ткани растений, трансгенные растения и трансгенные семена, которые содержат рекомбинантные молекулы ДНК и генно-инженерные белки, предложенные в данном изобретении. Эти клетки, ткани, растения и семена, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК и генно-инженерные белки, демонстрируют устойчивость к одному или большему количеству PPO гербицидов и необязательно устойчивость к одному или большему количеству дополнительных гербицидов.

Пригодные способы для трансформации клеток растения-хозяина, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают в себя практически любой способ, с помощью которого ДНК можно ввести в клетку (например, когда рекомбинантная конструкция ДНК стабильно встроена в хромосому растения), и хорошо известны в данной области техники. Иллюстративным и широко используемым способом введения рекомбинантной конструкции ДНК в растения является трансформационная система на основе Agrobacterium, которая хорошо известна специалистам в данной области техники. Другой иллюстративный способ введения рекомбинантной конструкции ДНК в растения представляет собой вставку рекомбинантной конструкции ДНК в геном растения в заранее определенный сайт с помощью методов сайт-направленного встраивания. Сайт-направленное встраивание можно выполнять любым способом, известным в данной области техники, например, путем использования нуклеазы «цинковые пальцы», генно-инженерных или нативных мегануклеаз, TALE-эндонуклеаз или управляемых при помощи РНК-гидов эндонуклеаз (например, системы CRISPR/Cas9). Трансгенные растения можно регенерировать из трансформированной клетки растения с помощью способов культивирования растительных клеток. Гомозиготное трансгенное растение по отношению к трансгену (т. е. две аллельные копии трансгена) можно получить путем самоопыления (самооплодотворения) трансгенного растения, которое содержит один трансгенный аллель, с самим собой, например растением R0, для получения семени R1. Одна четвертая часть полученных семян R1 будет гомозиготной по отношению к трансгену. Растения, выращенные из семени R1, можно исследовать на зиготность с использованием анализа ОНП, определения последовательности ДНК или термического амплификационного анализа, которые позволяют различать гетерозигот и гомозигот, именуемые как анализы на зиготность.

При использовании в данном документе, «гербицид ингибитор PPO» или «PPO гербицид» представляет собой химическое соединение, которое воздействует и ингибирует ферментативную активность протопорфириногеноксидазы (PPO), которая катализирует дегидрирование протопорфириногена IX с образованием протопорфирина IX, который является предшественником гема и хлорофилла. Ингибирование протопорфириногеноксидазы вызывает образование активных частиц кислорода, что приводит к разрушению клеточной мембраны и в конечном итоге смерти клеток, подверженных воздействию. PPO гербициды хорошо известны в данной области техники и имеются в продаже. Примеры PPO гербицидов включают в себя, но не ограничиваясь ими, дифениловые эфиры (такие как ацифлуорфен, его соли и сложные эфиры, аклонифен, бифенокс, его соли и сложные эфиры, этоксифен, его соли и сложные эфиры, флуоронитрофен, фурилоксифен, галосафен, хлометоксифен, флуорогликофен, его соли и сложные эфиры, лактофен, его соли и сложные эфиры, оксифлуорфен и фомесафен, его соли и сложные эфиры); тиадиазолы (такие как флутиацет-метил и тидиазиним); пиримидиндионы или фенилурацилы (такие как бензфендизон, бутафенацил, этил[3-2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (регистрационный номер CAS 353292-31-6 и именуемый в данном документе как S-3100), флупропацил, сафлуфенацил и тиафенацил); фенилпиразолы (такие как флуазолат, пирафлуфен и пирафлуфен-этил); оксадиазолы (такие как оксадиаргил и оксадиазон); триазолиноны (такие как азафенидин, бенкарбазон, карфентразон, его соли и сложные эфиры и сульфентразон); оксазолидиндионы (такие как пентоксазон); N-фенилфталимиды (такие как цинидон-этил, флумиклорак, флумиклорак-пентил и флумиоксазин); производные бензоксазинона (такие как 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифтор-3,4-дигидро-3-оксо-4-проп-2-инил-2H-1,4-бензоксазин-6-ил)-1,3,5-триазинан-2,4-дион); флуфенпир и флуфенпир-этил; пираклонил; и профлуазол. Протопорфириногеноксидазы и клетки, семена, растения и части растений, предложенные в данном изобретении, демонстрируют устойчивость к одному или большему количеству PPO гербицидов.

Гербициды можно применять на участке для выращивания растений, содержащем растения и семена, предложенные в данном изобретении, в качестве способа контроля сорных растений. Растения и семена, предложенные в данном изобретении, обладают свойством, заключающимся в устойчивости к гербицидам, и в связи с этим они устойчивы к применению одного или большего количества PPO гербицидов. Гербицид можно применять в рекомендуемой коммерческой норме (1X) или в любом дробном или кратном количестве, таком как двойная рекомендуемая коммерческая норма (2X). Нормы гербицидов могут быть выражены как кислотный эквивалент в расчете фунт на акр (фунт кэ/акр) или кислотный эквивалент в расчете грамм на гектар (г кэ/га) или как фунты активного ингредиента на акр (фунт аи/акр) или граммы активного ингредиента на гектар (г аи/га) в зависимости от гербицида и состава. Применение гербицида включает в себя по меньшей мере один PPO гербицид. Участок для выращивания растений может содержать или не содержать сорные растения в момент применения гербицидов. Гербицидно эффективная доза PPO гербицида(-ов) для применения на участке для контроля сорных растений может состоять из интервала от около 0,1X до около 30X заявленной нормы (норм) в течение периода роста. Заявленная норма 1X для некоторых иллюстративных PPO гербицидов представлена в Таблице 2. Один (1) акр эквивалентен 2,47105 гектара, а один (1) фунт эквивалентен 453,592 грамма. Нормы гербицидов можно пересчитывать между английской и метрической системой мер следующим образом: (фунт кэ/акр) умноженный на 1,12=(кг аи/га) и (кг аи/га) умноженный на 0,89=(фунт аи/акр).

Таблица 2. Иллюстративные PPO гербициды

PPO гербицид Химическое семейство Доза 1X ацифлуорфен дифениловые эфиры 420 г аи/га фомесафен дифениловые эфиры 420 г аи/га лактофен дифениловые эфиры 7-220 г аи/га флуорогликофен-этил дифениловые эфиры 15- 40 г аи/га оксифлуорфен дифениловые эфиры 0,28-2,24 кг аи/га флумиоксазин N-фенилфталимид 70 г аи/га азафенидин триазолинон 240 г аи/га карфентразон-этил триазолинон 4-36 г аи/га сулфентразон триазолинон 0,1-0,42 кг аи/га флутиацет-метил тиадиазол 3-15 г аи/га оксадиаргил оксадиазол 50-150 г аи/га оксадиазон оксадиазол 2,24-4,48 кг аи/га пирафлуфен-этил фенилпиразол 6-12 г аи/га сафлуфенацил пиримидиндион 25-50 г/га S-3100 пиримидиндион 5-80 г/га

Применять гербициды можно последовательно или смешивать в резервуаре с одним, двумя или комбинацией нескольких PPO гербицидов или любым другим совместимым гербицидом. Многократное применение одного гербицида или двух или большего количества гербицидов в комбинации или отдельно можно использовать в течение периода роста на участках, содержащих трансгенные растения по данному изобретению, для контроля широкого круга двудольных сорных растений, однодольных сорных растений или и тех, и тех, например двукратное применение (например, допосевное применение и послевсходовое применение или довсходовое применение и послевсходовое применение) или трехкратное применение (например, допосевное применение, довсходовое применение и послевсходовое применение или довсходовое применение и двукратное послевсходовое применение).

При использовании в данном документе, «устойчивость» или «устойчивость к гербицидам» означает способность растения, семени или клетки противостоять токсическому действию гербицида при его применении. Сельскохозяйственные культуры, устойчивые к гербицидам, могут продолжать расти и не быть пораженными или быть минимально пораженными вследствие присутствия внесенных химических веществ. При использовании в данном документе, «свойство устойчивости к гербицидам» представляет собой трансгенное свойство, придающее растению повышенную устойчивость к гербицидам по сравнению с растением дикого типа. Предполагаемые растения, которые могут быть получены со свойством устойчивости к гербицидам по настоящему изобретению, могут включать в себя, например, любое растение, в том числе сельскохозяйственные растения, такие как, среди прочего, соя (например, Glycine max), кукуруза (маис), хлопок (Gossypium sp.) и канола.

Трансгенные растения, потомство, семена, растительные клетки и части растений по данному изобретению также могут обладать одним или большим количеством дополнительных свойств. Дополнительные свойства могут быть введены путем скрещивания растения, содержащего трансген, который содержит рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в данном изобретении, с другим растением, содержащим одно или большее количество дополнительных свойств. При использовании в данном документе, «скрещивание» означает размножение двух отдельных растений с получением растения-потомка. Таким образом, два растения можно скрещивать с получением потомства, которое обладает желаемыми свойствами от каждого родителя. При использовании в данном документе, «потомство» означает потомков любого поколения родительского растения, а трансгенный потомок содержит конструкцию ДНК, предложенную в данном изобретении и унаследованную от по меньшей мере одного родительского растения. Дополнительное свойство (свойства) также могут быть введены путем совместной трансформации конструкции ДНК для этого дополнительного трансгенного свойства (свойств) с конструкцией ДНК, содержащей рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в данном изобретении (например, со всеми конструкциями ДНК, присутствующими как часть одного и того же вектора, используемого для трансформации растения) или путем внесения дополнительного свойства (свойств) в трансгенное растение, содержащее конструкцию ДНК, предложенную в данном изобретении, или наоборот (например, путем использования любого из способов трансформации растения или редактирования генома в трансгенном растении или растительной клетке). Такие дополнительные свойства включают в себя, но не ограничиваясь ими, повышенную устойчивость к насекомым, повышенный коэффициент полезного использования воды, повышенную урожайность, повышенную засухоустойчивость, повышенное качество семян, улучшенные питательные качества, получение гибридных семян и устойчивость к гербицидам, если свойство измеряют относительно растения дикого типа. Иллюстративные дополнительные свойства устойчивости к гербицидам могут включать в себя трансгенную или генетически неизмененную устойчивость к одному или большему количеству гербицидов, таких как ингибиторы ACCазы (например, арилоксифеноксипропионаты и циклогександионы), ингибиторы ALS (например, производные сульфонилмочевины, имидазолиноны, триазолопиримидины и триазолиноны), ингибиторы EPSPS (например, глифосат), синтетические ауксины (например, феноксильные гербициды, производные бензойной кислоты, карбоновые кислоты, семикарбазоны), ингибиторы фотосинтеза (например, триазины, триазиноны, нитрилы, бензотиадиазолы и производные мочевины), ингибиторы синтеза глутамина (например, глюфосинат), ингибиторы HPPD (например, изоксазолы, пиразолоны и трикетоны), ингибиторы PPO (например, дифениловые эфиры, N-фенилфталимид, арилтриазиноны и пиримидиндионы) и ингибиторы длинноцепочечных жирных кислот (например, хлорацетамиды, оксиацетамиды и пиразолы), среди прочего. Иллюстративные свойства устойчивости к насекомым могут включать в себя устойчивость, среди прочего, к одному или большему количеству членов класса насекомых в пределах одного или большего количества отрядов: чешуекрылые, жесткокрылые, полужесткокрылые и равнокрылые. Такие дополнительные свойства хорошо известны специалисту в данной области техники; например, перечень таких трансгенных свойств представлен Службой контроля здоровья животных и растений (APHIS) министерства сельского хозяйства США (USDA)

Клетка, трансформированная полинуклеотидом по настоящему изобретению, таким как экспрессионная конструкция, может быть отобрана на основании наличия полинуклеотида или кодируемой им ферментативной активности до или после превращения такой клетки в трансгенное растение. Таким образом, трансгенные растения, содержащие такой полинуклеотид, могут быть отобраны, например, на основании выявления трансгенного растения, которое содержит полинуклеотид или обладает кодируемой им ферментативной активностью и/или демонстрирует измененное свойство относительно во всем остальном изогенного контрольного растения. Таким свойством может быть, например, устойчивость к PPO гербициду.

Трансгенные растения и потомство, которое содержит трансгенное свойство, предложенные в данном изобретении, можно использовать вместе с любыми методами селекции, известными в данной области техники. В линиях растений, содержащих два или большее количество трансгенных свойств, трансгенные свойства могут быть независимо разделены, объединены или и разделены, и объединены в линиях растений, содержащих три или большее количество трансгенных свойств. Также предполагаются возвратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с генетически неизмененным растением, как и вегетативное размножение. Описание методов селекции, которые пригодны для различных свойств и сельскохозяйственных культур, хорошо известны специалистам в данной области техники. Для подтверждения присутствия трансгена(-ов) в конкретном растении или семени можно выполнять большое количество анализов. Такие анализы включают в себя, например, анализы молекулярной биологии, такие как саузерн-блоттинг и нозерн-блоттинг, ПЦР, секвенирование ДНК; биохимические анализы, такие как обнаружение присутствия белкового продукта, например, с помощью иммунологических способов (ИФА и вестерн-блоттинг) или по ферментной функции; анализы частей растений, такие как анализы листьев или корней; а также по анализу фенотипа целого растения.

Интрогрессия трансгенного свойства в генотип растения достигается в результате процесса возвратного скрещивания. Генотип растения, в который введено трансгенное свойство, может называться генотипом, линией, инбредным растением или гибридом, измененным за счет возвратного скрещивания. Подобным образом, генотип растения, в котором отсутствует необходимое трансгенное свойство, может называться неизмененным генотипом, линией, инбредным растением или гибридом.

После подробного описания изобретения понятно, что возможны модификации, вариации и эквивалентные варианты осуществления без отклонения от объема изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения. Кроме того, необходимо понимать, что примеры в настоящем описании представлены в качестве неограничивающих примеров.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры включены для демонстрации вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области техники следует понимать, что способы, описанные в примерах, представляющие способы, разработанные авторами изобретения, хорошо работают при практическом осуществлении изобретения, а следовательно, их можно рассматривать, как представляющие собой предпочтительные варианты для его практического осуществления. Однако специалистам в данной области техники ввиду настоящего описания следует понимать, что в конкретных вариантах осуществления изобретения, которые раскрыты, можно сделать много изменений, и тем не менее получить сходный или подобный результат, не отклоняясь от концепции, сущности и объема изобретения. Конкретнее, очевидно, что некоторые агенты, которые как химически, так и физиологически связаны, можно использовать вместо агентов, описанных в данном документе с достижением такого же или подобного результата. Предполагается, что все подобные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, находятся в рамках сущности, объема и концепции изобретения, что определено в прилагаемой формуле изобретения.

Пример 1. Обнаружение микробной протопорфириногеноксидазы

Новые протопорфириногеноксидазы были идентифицированы на основании баз последовательностей для микроорганизмов с использованием методов биоинформатики и новой бактериальной системы отбора для протопорфириногеноксидазы. Последовательность HemG E. coli (SEQ ID № 4) использовали как исходную последовательность для биоинформатического анализа баз последовательностей микроорганизмов. Биоинформатический анализ выявил тридцать три новых предполагаемых протопорфириногеноксидазы семейства PPO HemG из различных бактериальных источников. Последовательности, кодирующие эти предполагаемые ферменты PPO HemG, сравнивали путем построения филогенетического дерева, и установили, что они довольно различны. Для дальнейшего анализа из этой группы из тридцати трех было отобрано десять ввиду того, что на филогенетическом дереве они представлены как отдельные индивидуальные расположенные группой элементы.

Кодирующие последовательности для десяти выбранных ферментов PPO HemG были оптимизированы для экспрессии в E. coli для устранения каких-либо редких кодонов, обнаруживаемых в последовательности ДНК дикого типа. Кодирующие последовательности для десяти ферментов PPO HemG, оптимизированные для E. coli, затем клонировали с помощью бактериальных экспрессионных векторов. Устойчивый к гербицидам фермент PPO, обнаруживаемый в природе у щирицы бугорчатой (Amaranthus tuberculatus), клонировали с использованием бактериального экспрессионного вектора для применения в качестве контроля как функции PPO, так и устойчивости к гербицидам (называемый «WH» и представленный последовательностью SEQ ID № 21; номер доступа в GenBank NCBI ABD52326; Patzoldt, et al. ʺA codon deletion confers resistance to herbicides inhibiting protoporphyrinogen oxidaseʺ Proceedings of the National Academy of Science USA. 103(33):12329-12334 (2006)). Фермент PPO щирицы не является членом семейства HemG. Фермент PPO HemG, обнаруживаемый в природе у E. coli, клонировали с помощью бактериального экспрессионного вектора для применения в качестве контроля как активности PPO, так и в анализе на устойчивость к гербицидам (называемый H_N10 и представленный последовательностью SEQ ID № 4).

Бактериальную систему отбора для протопорфириногеноксидазы создавали, чтобы определить у рекомбинантных белков наличие протопорфириногеноксидазной активности и таким образом подтвердить, что они являются функциональными ферментами PPO. Эта система отбора использовала функциональный анализ выживания в штамме E. coli с нокаутом гена для фермента PPO E. coli (SEQ ID № 4). Штамм E. coli, нокаутный по hemG, который был использован, продемонстрировал крайне незначительный рост в среде для выращивания бактерий, не содержащей гем (такой как лизогенная среда (LB)), но рост восстанавливался, когда в среду для выращивания бактерий добавляли свободный гем, или когда в E. coli экспрессировалась активная рекомбинантная протопорфириногеноксидаза. Таким образом, штамм E. coli, нокаутный по hemG, можно использовать с экспрессией рекомбинантного белка для быстрого и простого определения протопорфириногеноксидазной активности у белков.

Штамм E. coli, нокаутный по hemG, трансформировали с использованием бактериальных экспрессионных векторов, содержащих ген, кодирующий десять предполагаемых ферментов PPO HemG, фермент PPO HemG E. coli и фермент PPO щирицы. Затем бактерии высевали штрихом в чашки со средой LB, которая представляет собой среду для выращивания бактерий, не содержащую гем. Экспрессия рекомбинантного фермента PPO способствовала росту E. coli, что приводило к увеличению их количества в чашках со средой LB. Рост трансформированного штамма E. coli, нокаутного по hemG, в чашках со средой LB указывал на то, что белковая последовательность функционировала как протопорфириногеноксидаза. Десять ферментов PPO HemG (SEQ ID № 1-10) и фермент PPO щирицы (SEQ ID № 21) были способны восстанавливать рост трансформированного штамма E. coli, нокаутного по hemG, в этом анализе, подтверждая таким образом их активность PPO. Выравнивание белковых последовательностей ферментов PPO с положениями консенсуса представлено на фиг. 1. Используя этот анализ, можно провести скрининг большого количества новых или генно-инженерных белков для подтверждения и измерения протопорфириногеноксидазной активности.

Пример 2. Нечувствительность к ингибиторам протопорфириногеноксидазы

Были идентифицированы новые протопорфириногеноксидазы, которые устойчивы к PPO гербицидам, с использованием гербицидной бактериальной системы отбора. В этой системе отбора для обнаружения протопорфириногеноксидаз, которые не чувствительны к PPO гербициду, использовали анализ роста штамма E. coli, нокаутного по hemG, в жидкой среде LB с PPO гербицидом.

Штамм E. coli, нокаутный по hemG, трансформировали с помощью бактериального экспрессионного вектора, имеющего подтвержденную протопорфириногеноксидазную активность, и культивировали в жидкой среде LB. К среде добавляли очищенную кристаллическую форму одного из пяти различных PPO гербицидов (ацифлуорфен (1 мM), флумиоксазин (0,5 мM), лактофен (0,5 mM), фомесафен (1 мM) и S-3100 (100 мкM)), представляющих три различных химических подкласса ингибиторов PPO. Рекомбинантные белки экспрессировались, и измеряли скорость роста E. coli. Кривые роста (поглощение при 600 нм (OD600)) измеряли для различных вариантов в присутствии и в отсутствие PPO гербицидов в выбранные моменты времени от нулевого момента времени до двадцати четырех часов. Рост трансформированного штамма E. coli, нокаутного по hemG, в среде LB в присутствии PPO гербицида указывал на то, что ген, используемый для трансформации E. coli, кодировал нечувствительную к гербицидам протопорфириногеноксидазу (iPPO).

В этом анализе использовали новые протопорфириногеноксидазы для исследования нечувствительности к PPO гербицидам. Установлено, что все десять протопорфириногеноксидаз, представленные как SEQ ID № 1 - SEQ ID № 10, обеспечивают нормальные скорости роста штамма E. coli, нокаутного по hemG, в среде LB в присутствии PPO гербицида, указывая на то, что эти белки являются нечувствительными к гербицидам протопорфириногеноксидазами (iPPO) (фиг. 2). Штамм E. coli, нокаутный по hemG, экспрессирующий PPO щирицы (SEQ ID № 21), являлся чувствительным ко всем пяти PPO гербицидам, подтверждая то, что анализ был способен различать чувствительные и нечувствительные протопорфириногеноксидазы для каждого из гербицидов. Используя этот анализ, можно провести скрининг большого количества новых или генно-инженерных белков для подтверждения протопорфириногеноксидазной активности в присутствии PPO гербицида(-ов).

Пример 3. Анализ ферментативной активности протопорфириногеноксидазы (PPO)

С точки зрения ферментативной активности протопорфириногеноксидазы характеризовали путем измерения способности связываться с субстратом (K_m) и чувствительности к PPO гербициду (IC50) для каждого фермента PPO. Растительные ферменты PPO дикого типа, полученные от щирицы, сои и маиса, использовали для сравнения с микробными протопорфириногеноксидазами HemG (представленными как SEQ ID № 1 - SEQ ID № 10).

Этиопласты и хлоропласты получали из лишенных хлорофилла семядоль (соя, Glycine max), лишенных хлорофилла листьев/колеоптилей (маис, Zea mays) и развернутых верхушечных листьев (щирица, Amaranthus tuberculata), как правило, с помощью методики, описанной Grossmann et al., (ʺThe Herbicide Saflufenacil (Kixor™) is a New Inhibitor of Protoporphyrinogen IX Oxidase Activityʺ Weed Science, 58(1):1-9 (2010)). Семена сои (A3555) и маиса (LH244) помещали между двумя листками влажной бумаги для проращивания (Anchor Paper Company, Сент-Пол, Миннесота, США) в стакане воды в постоянной темноте в течение восьми-десяти дней. Щирицу выращивали в течение 30 дней в теплице. Ткань собирали, помещали между влажными листами бумажных салфеток, после чего измельчали до мелкого порошка с использованием ступки и песта в жидком азоте. Гомогенизационный буферный раствор (50 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 500 мM сахарозы, 1 мM ЭДТА, 1 мM хлорида магния и 2 г/л бычьего сывороточного альбумина) добавляли к замороженному порошку в соотношении 4:1 (мл гомогенизационного буферного раствора на г ткани в сыром виде), энергично перемешивали и фильтровали через четыре слоя предварительно увлажненной Miracloth™ (Merck-Millipore, Дармштадт, Германия). Фильтрат центрифугировали при 9299g в течение пяти минут. Осадок после центрифугирования повторно суспендировали в гомогенизационном буферном растворе и центрифугировали при 150g в течение двух минут. Надосадочный раствор центрифугировали при 4000g в течение пятнадцати минут. Все стадии центрифугирования проводили при 4°C. Осадок (фракция неповрежденных пластид) повторно суспендировали в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 2 мМ ЭДТА и 20% (объем/объем) глицерина и хранили в виде аликвот при -80°C. Общее количество белка в препаратах пластид измеряли по методу Бредфорда (MM Bradford, ʺA rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utility the principle of protein-dye bindingʺ Analytical Biochemistry, 72:248-254 (1976)) с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.

Отобранные ферменты PPO были экспрессированы в клеточной линии E. coli, нокаутной по hemG. Бактериальные клетки из культуры, полученной накануне вечером, использовали для засевания 20 мл свежей среды. Этим культурам давали расти в течение приблизительно 48 ч при 20°C до плотной культуры. Бактериальные клетки собирали с помощью центрифугирования, и клеточные осадки хранили при -80°C до выполнения ферментных анализов. Замороженные бактериальные осадки повторно суспендировали в экстракционном буферном растворе (50 мM Трис-HCl, pH 7,6, 1 мM ЭДТА и 1 мM MgCl₂) и обрабатывали ультразвуком (Sonics VibraCell™, Ньютаун, Коннектикут, США) в течение трех циклов по 30 секунд в ледяной бане с одноминутным перерывом между циклами. Разрушенные клетки центрифугировали при 200g в течение 2 минут при 4°C, и надосадочный раствор использовали для анализа ферментов PPO после разбавления экстракционным буферным раствором. Общее количество белка измеряли по методу Бредфорда (1976) с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Протопорфириноген IX (протоген) синтезировали путем восстановления коммерчески доступного протопорфирина амальгамой натрия с ртутью, как описано JM Jacobs и NJ Jacobs (ʺMeasurement of Protoporphyrinogen Oxidase Activityʺ in Current Protocols in Toxicology (1999) 8.5.1-8.5.13, John Wiley & Sons, Inc.). Протопорфирин (прото) добавляли к 0,01 н. раствору гидроксида калия в 20% этаноле и перемешивали в темноте до растворения (около 40 минут). Объем, составляющий 0,8 мл, помещали в полипропиленовый флакон вместимостью 2 мл с завинчивающейся крышкой, имеющей уплотнительное кольцо, и добавляли около 1 г (на кончике шпателя, масло сливали) амальгамы натрия с ртутью (номер товара 451908, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, хранили под маслом). Пробирку сразу же закрывали, и энергично перемешивали на вихревой мешалке, и примерно каждые 30 секунд удаляли газы, ослабляя крышку, пока раствор не переставал светиться красным светом под УФ-излучением (около пяти минут). Реакционный флакон продували аргоном и быстро центрифугировали, чтобы осадить оставшуюся амальгаму натрия. Надосадочный раствор сразу разбавляли 1:1 (объем/объем) раствором ДТТ с концентрацией 0,1 М и Трис-HCl с концентрацией 0,5 М, pH 7,5, и флаконы продували аргоном. Полученный раствор разделяли на меньшие аликвоты в полипропиленовые пробирки с крышками вместимостью 0,5 мл, которые продували аргоном сразу после добавления аликвоты. Закрытые пробирки оборачивали алюминиевой фольгой и хранили при -80°C. Для ферментного анализа аликвоты протогена размораживали, хранили накрытыми на льду и использовали в тот же день. Концентрацию протогена в препаратах рассчитывали, вычитая концентрацию прото, которая измерена с помощью ВЭЖХ с флуоресцентным детектором (методика, описанная Matsumoto et al, ʺPorphyrin Intermediate Involved in Herbicidal Action of delta-Aminolevulinic Acid on Duckweed (Lemna paucicostata Hegelm.)ʺ Pesticide Biochem. and Phys. 48:214-221 (1994)), в конечном растворе протогена (как правило, около 1% от исходного материала) из концентрации прото в исходном материале и предполагая, что ни в каком из образцов нет значительного количества примесей. Протоген, который получили и хранят в этих условиях, был стабильным в течение по меньшей мере шести месяцев.

Активность PPO в препаратах растительных пластидных экстрактов и бактериальных экстрактов измеряли, как правило, как описано у Grossmann. et al. (2010). Десять микролитров или пластидного экстракта (общий белок 40 мкг), или бактериального экстракта (общий белок от 16 до 35 мкг для различных бактериальных экстрактов) добавляли к буферу для анализа (100 мM Трис-HCl, pH 7,4, 5 мM ДТТ, 1 мM ЭДТА и 0,085% (объем/объем) Твин 80). S-3100 (также известный как «SYN-523»; например, публикация патента США US20100062941 A1) добавляли в виде аликвоты объемом два микролитра из исходного раствора 100X, приготовленного в ацетоне. S-3100 аналитической степени чистоты был предоставлен Sumitomo Chemical Company. Все анализы проводили при конечной концентрации ацетона, составляющей 1% (объем/объем). Экстракты (пластидный или бактериальный), буферный раствор и S-3100 инкубировали при 30°C (растительные экстракты) или 37°C (бактериальные экстракты) в течение пяти минут до добавления двух микролитров протогена для инициации анализа. Все анализы проводили в 96-луночном черном полистирольном титрационном микропланшете (Costar® 3925, Corning, Inc., Корнинг, Нью-Йорк), конечный объем составлял 200 микролитров. После добавления протогена (3 мкМ для определения IC₅₀; переменная величина для определения K_m) во все лунки планшет инкубировали при 30°C (растительные экстракты) или 37°C (бактериальные экстракты) до начала сбора данных. Флуоресценцию в зависимости от времени измеряли при 30°C (растительные экстракты) или 37°C (бактериальные экстракты) при длинах волн возбуждения и испускания 405 мм и 630 мм, соответственно, с помощью многорежимного ридера для микропланшетов SpectraMax® M5 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Анализ холостой пробы проводили путем добавления инактивированного нагреванием (пять минут при 100°C) экстракта к смеси для анализа.

Способность связываться с субстратом (протопорфириноген) протопорфириногеноксидаз измеряли в виде K_m. Кажущиеся значения K_m для каждого оцениваемого PPO рассчитывали, аппроксимируя кривую равносторонней гиперболой с использованием комплекта программного обеспечения для кинетических исследований SoftPro® (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Чувствительность активности фермента к PPO гербициду S-3100 определяли как концентрацию, которая давала 50%-ое ингибирование контрольной активности (IC₅₀). Значения IC₅₀ для S-3100 для каждого оцениваемого PPO определяли графически из полулогарифмической зависимости концентрации S-3100 от активности PPO.

Установлено, что K_m для ферментов PPO из трех растительных источников (щирица, соя или маис) и микробных ферментов PPO HemG (SEQ ID № 1 - SEQ ID № 10) являлись подобными, изменяясь от 0,3 мкМ до 2,0 мкМ. Три исследуемых растительных фермента PPO были чувствительны к S-3100, при этом величины IC₅₀ составляли 0,009, 0,004 и 0,003 мкM, соответственно. В отличие от этого ферменты PPO из бактериального источника (SEQ ID № 1 - SEQ ID № 10) были нечувствительны к S-3100, при этом величины IC₅₀ были выше 100 мкМ. Данные представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Ферментативная активность ферментов PPO, выделенных из растительных или микробных источников

Источник K_m (мкM) IC₅₀для S-3100 (мкM) Щирица 0,7 0,009 Соя 1,8 0,004 Маис 2,0 0,003 H_N10 (SEQ ID № 4) 0,7 > 100 H_N20 (SEQ ID № 2) 0,8 > 100 H_N30 (SEQ ID № 5) 1,0 > 100 H_N40 (SEQ ID № 6) 1,4 > 100 H_N50 (SEQ ID № 7) 1,0 > 100 H_N60 (SEQ ID № 3) 1,1 > 100 H_N70 (SEQ ID № 8) 1,4 > 100 H_N90 (SEQ ID № 1) 1,2 > 100 H_N100 (SEQ ID № 9) 0,6 > 100 H_N110 (SEQ ID № 10) 0,3 > 100

Пример 4. Ферментная оптимизация протопорфириногеноксидаз

Белковую оптимизацию используют для улучшения или изменения ферментативных свойств новых протопорфириногеноксидаз. Для того чтобы оптимизировать ферменты, используют один или большее количество методов белковой инженерии. Неограничивающие примеры подходов, используемых в белковой инженерии, включают в себя мутации за счет последовательной замены на аланин; мутации за счет последовательной замены гомологичных элементов, мутации за счет последовательной замены на Pro/Gly; обмен областями или мутации; и комбинации этих разнообразных приемов (см. M Lehmann and M Wyss, Current Opinion in Biotechnology 12(4):371-375 (2001); B Van den Burg and VGH Eijsink, Current Opinion in Biotechnology 13(4):333-337 (2002); и Weiss et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97(16):8950-8954 (2000)). Последовательности ДНК, кодирующие генно-инженерные протопорфириногеноксидазы, синтезируют и клонируют с помощью бактериального экспрессионного вектора. Вектор используют для трансформации штамма E. coli, нокаутного по hemG, для первоначального отбора выживших бактерий с высокой пропускной способностью, как описано в примере 1. Для генно-инженерных протопорфириногеноксидаз, которые способствуют выживанию штамма E. coli, нокаутного по hemG, исследуют чувствительность к одному или большему количеству PPO гербицидов с использованием анализа роста бактерий, как описано в примере 2. Как альтернативный вариант, трансформированный штамм E. coli, нокаутный по hemG, высевают в среду, содержащую и не содержащую PPO гербицид. Генно-инженерные варианты, которые демонстрируют устойчивость к PPO гербицидам, экспрессируются в бактериальной экспрессионной системе, а подробные биохимические характеристики получают с использованием очищенного белка с помощью непрерывного флуориметрического анализа, как описано в примере 3. Отбирают генно-инженерные варианты, которые нечувствительны к PPO гербицидам, для клонирования с помощью растительных трансформационных векторов, трансформации растения и тестирования в полевых условиях.

Пример 5. Экспрессия и исследование ферментов PPO HemG в маисе

Микробные ферменты PPO HemG экспрессировали в трансгенных растениях маиса, и для трансгенных растений определяли устойчивость к PPO гербицидам. Растительные трансформационные вектора конструировали так, что они содержали рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую один из микробных ферментов PPO HemG, представленных как SEQ ID № 1-20. Последовательность ДНК, кодирующая фермент PPO, может включать в себя на 5'-конце кодон для метионина, общеизвестный как инициаторный кодон, или этот кодон может быть удален, чтобы облегчить функциональное присоединение последовательности транзитного пептида к 5'-концу кодирующей последовательности. Примеры белковых последовательностей ферментов PPO, содержащих метионин на амино-конце, представлены как SEQ ID № 1-10. Примеры белковых последовательностей ферментов PPO без метионина на амино-конце представлены как SEQ ID № 11-20. Для трансформации растений кодоны нуклеотидных последовательностей, кодирующих предполагаемые ферменты PPO, оптимизированы для экспрессии как в двудольных, так и в однодольных растениях. В Таблице 4 приведены последовательности SEQ ID №, соответствующие белковой и нуклеотидной последовательностям микробных ферментов PPO HemG в трансформационных векторах.

Таблица 4. SEQ ID №, соответствующая вариантам PPO

PPO Белок Бактери-альная ДНК Оптимизи-рованный кодон для двудольных растений Оптимизи-рованный кодон для однодольных растений H_N10 4, 13 25 35, 44 57 H_N20 2, 12 23 33, 43, 52 55 H_N30 5, 14 26 36, 45 58 H_N40 6, 15 27 37, 46 59 H_N50 7, 16 28 38, 47 60 H_N60 3 24 34 56 H_N70 8 29 39 61 H_N90 1, 11, 18, 19 22 32, 42, 49, 50, 51 54 H_N100 9, 17, 20 30 40, 48, 53 62 H_N110 10 31 41 63 PPO щирицы 21 нет данных нет данных нет данных

Четыре растительных трансформационных вектора были созданы для экспрессии PPO HemG H_N10 (SEQ ID № 4) с использованием двух различных комбинаций промотора плюс лидерная последовательность плюс интрон с двумя различными последовательностями нацеливающих пептидов (TP) и двумя различными последовательностями 3'-НТО. Конструкции для трансформации растений представляли собой указанные конструкции 1, 6, 11 и 16. Для полевых испытаний маиса незрелые зародыши маиса (LH244) трансформировали с использованием Agrobacterium tumefaciens и стандартных способов, известных в данной области техники.

Трансгенные растения маиса получали с использованием конструкций для трансформации растений 6 и 16, содержащих ген, кодирующий PPO HemG H_N10 (SEQ ID № 4). Образцы листьев собирали у растений R0 и проводили скрининг с помощью ПЦР, чтобы определить количество копий трансгена, встроенного в геном растения. Растения, содержащие одну копию (однокопийные), самоопыляли и скрещивали с особью из другой линии, чтобы получить семена R1 и F1 для последующих исследований, соответственно. Растения, содержащие множество копий (многокопийные), опрыскивали следующим образом: (1) 5 г/га S-3100 приблизительно на стадии роста V5, затем 10 г/га S-3100 приблизительно на стадии роста V7, общее внесение составляло 15 г/га S-3100 или (2) 10 г/га S-3100 приблизительно на стадии роста V5. Среднюю степень повреждения в процентах по шкале 0-100, при этом ноль соответствует отсутствию повреждений и 100 полной гибели растения, оценивали через 7 дней после последней обработки каждой партии. Опрысканный генетически неизмененный маис LH244, который использовали в качестве контроля, показал в среднем степень повреждения 43,3% при обработке в общем 15 г/га S-3100 (обработка 1) и в среднем степень повреждения 26,7% при обработке в общем 10 г/га S-3100 (обработка 2). Трансгенные растения маиса, экспрессирующие HemG H_N10 (SEQ ID № 4), превзошли контрольные растения со средней степенью повреждения 28,9% при обработке в общем 15 г/га S-3100 (обработка 1) и со средней степенью повреждения 24,2% при обработке в общем 10 г/га S-3100 (обработка 2). Данные представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Устойчивость трансгенного маиса к гербицидам I

Обработка Белок Конструкция Исследуемое растение Средняя степень повреждения 1 нет данных генетически неизмененное 12 43,3 1 H_N10 6 18 28,9 2 нет данных генетически неизмененное 6 26,7 2 H_N10 16 12 24,2

Трансгенные растения маиса были получены с использованием конструкций для трансформации растений 6, 20, 21, 22 и 23, содержащих ген, кодирующий ферменты PPO HemG H_N90 (SEQ ID № 1), H_N10 (SEQ ID № 4), H_N60 (SEQ ID № 3), H_N110 (SEQ ID № 10) и H_N40 (SQ ID № 6), соответственно. Эти пять конструкций имели одну и ту же комбинацию промотора плюс лидерной последовательности плюс интрона с двумя различными последовательностями нацеливающих пептидов (TP) и одной и той же последовательностью 3'-НТО. Образцы листьев собирали у растений R0 и анализировали с помощью ПЦР, чтобы определить количество копий трансгена. Однокопийные растения вплоть до 12 уникальных событий на конструкцию пересаживали в горшки, самоопыляли и скрещивали с особями из других линий, чтобы получить семена R1 и F1, соответственно, для дальнейших исследований. Многокопийные растения и оставшиеся однокопийные растения опрыскивали S-3100 в количестве 40 грамм/га приблизительно на стадии роста V5 и определяли степени повреждения через 7 дней после обработки. Отмечали среднюю степень повреждения в процентах (%) для всех растений, экспрессирующих каждый фермент PPO, и количество растений, которые были признаны высокоустойчивыми (степень повреждения меньше 10%), при этом каждое растение представляет собой уникальный одно- или многокопийный трансформант. Трансгенные растения маиса, экспрессирующие H_N10 (SEQ ID № 4), продемонстрировали общую среднюю степень повреждения 39,5% и дали 31 высокоустойчивое растение из 139 исследованных растений. Трансгенные растения маиса, экспрессирующие H_N60 (SEQ ID № 3), продемонстрировали общую среднюю степень повреждения 55,8% и дали 19 высокоустойчивых растений из 86 исследованных растений. Трансгенные растения маиса, экспрессирующие H_N90 (SEQ ID № 1), продемонстрировали наиболее низкую общую среднюю степень повреждения 31,4% и дали 44 высокоустойчивых растения из 99 исследованных растений. Трансгенные растения маиса, экспрессирующие H_N40 (SEQ ID № 6), продемонстрировали общую среднюю степень повреждения 47,0% и дали наибольший процент высокоустойчивых растений: 53 высокоустойчивых растения из 98 исследованных растений. Трансгенные растения маиса, экспрессирующие H_N110 (SEQ ID № 10), продемонстрировали среднюю степень повреждения 43,0%, но не дали ни одного высокоустойчивого растения. Данные представлены в Таблице 6.

Таблица 6. Устойчивость трансгенного маиса к гербицидам II

Конструкция Белок SEQ ID № Исследуемые растения Средняя степень повреждения Высоко-устойчивые растения 6 H_N10 4 139 39,5% 31 20 H_N60 3 86 55,8% 19 21 H_N90 1 99 31,4% 44 22 H_N110 10 94 43,0% 0 23 H_N40 6 98 47,0% 53

Данные для трансгенного маиса R0 показали, что пять вырабатываемых микробных ферментов PPO HemG: H_N90 (SEQ ID № 1), H_N10 (SEQ ID № 4), H_N60 (SEQ ID № 3), H_N40 (SEQ ID № 6) и H_N110 (SQ ID № 10) уменьшали степени повреждения при экспрессии в трансгенных растениях и таким образом придавали сельскохозяйственным культурам устойчивость к PPO гербициду.

Трансгенные растения F1, полученные при ауткроссинге однокопийных растений R0, экспрессирующих H_N10 (SEQ ID № 4) в одной из двух конфигураций конструкций, исследовали в теплице относительно их устойчивости к гербицидам. Растения обрабатывали S-3100 в количестве 40 грамм/га на стадии роста V3 и определяли степени повреждения через семь дней после обработки. Трансгенные растения маиса, экспрессирующие H_N10 (SEQ ID № 4) в конфигурации конструкции 6, давали 13 высокоустойчивых растений из 18 событий (степень повреждения 10% или менее), тогда как конфигурация конструкции 16 не приводила к событиям появления высокоустойчивых растений.

Трансгенные растения F1, полученные при ауткроссинге однокопийных растений R0, экспрессирующих H_N10 (SEQ ID № 4) в одной из двух конфигураций конструкций (конструкции 6 и 16), исследовали на поле относительно их устойчивости к гербицидам. Эту популяцию F1 разделяли (50% гемизиготных и 50% нулевых), и отбор трансгенных растений не производили до определения степеней повреждения. Ожидается, что общие средние степени повреждения для таких популяций будут выше, чем для гомогенной трансгенной популяции, поскольку сложно отличить генетически неизмененные растения от трансгенных растений. Испытания проводили в двух местах с двумя повторениями и 3 обработками на конструкцию. Генетически неизмененные растения маиса использовали в качестве отрицательного контроля. Обработку с применением гербицида проводили следующим образом: обработка 1 представляла собой 0,036 фунтов аи/акр S-3100, внесенные на стадии V2, затем, V4, затем V8; обработка 2 представляла собой 0,072 фунтов аи/акр S-3100, внесенные на стадии V2, затем V4, затем V8; обработка 3 представляла собой 0,144 фунтов аи/акр S-3100, внесенные на стадии V2, затем V4, затем V8. Степени повреждения сельскохозяйственных культур в процентах оценивали на стадии роста V2 (CIPV2) и на стадии роста V4 (CIPV4) через 5-7 дней после обработки (ошибка для V2 и ошибка для V4 представляла собой половину от наименьшей значимой разности (НЗР)). Степени повреждения сельскохозяйственных культур объединяли для обоих местоположений. Все генетически неизмененные растения и растения с событиями, вызванными с использованием конструкции 16, продемонстрировали степень повреждения 94,6-99,5% после применения гербицида как на стадии V2, так и V4 для каждой из трех обработок. Растения с событиями, вызванными с использованием конструкции 6, продемонстрировали степени повреждения всего лишь от 30% до 50% после применения гербицида на стадии V2 и отсутствие повреждения после применения гербицида на стадии V4. Данные представлены в Таблице 7.

Таблица 7. Эффективность полевых испытаний маиса F1, содержащего H_N10 (SEQ ID № 4)

Обработка Конструкция CIPV2 CIPV4 Ошибка V2 Ошибка V4 Обработка 1 дикого типа 94,6 99 8,6 1,2 6 37,5 0 8,6 1,2 16 96,3 98,5 8,6 1,2 Обработка 2 дикого типа 99,5 99,5 5,4 0 6 37,5 0 5,4 0 16 99,5 99,5 5,4 0 Обработка 3 дикого типа 99,5 99,5 0 0 6 50 0 0 0 16 99,5 99,5 0 0

Данные об исследованиях трансгенного маиса F1 в теплице и в полевых условиях продемонстрировали, что вырабатываемый микробный фермент PPO HemG H_N10 (SEQ ID № 4) уменьшал степени повреждения при экспрессии в трансгенных растениях и таким образом придавал сельскохозяйственным культурам устойчивость к PPO гербициду.

Пример 6. Экспрессия и исследование ферментов PPO HemG в растениях сои

Микробные ферменты PPO HemG экспрессировали в трансгенных растениях сои, и для трансгенных растений определяли устойчивость к PPO гербицидам. Были сконструированы растительные трансформационные векторы, содержащие рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую один из микробных ферментов PPO HemG, представленных как H_N10 (SEQ ID № 4 и SEQ ID № 13); H_N20 (SEQ ID № 12); H_N30 (SEQ ID № 14); H_N40 (SEQ ID № 15); H_N50 (SEQ ID № 16); H_N90 (SEQ ID № 11, 18, 19); и H_N100 (SEQ ID № 17, 20).

Для сои вырезанные зародыши (A3555) трансформировали с помощью трансформационных конструкций 1 и 11 с использованием A. tumefaciens и стандартных способов, известных в данной области техники. Трансформационные конструкции 1 и 11 имели одну и ту же комбинацию промотора плюс лидерной последовательности плюс интрона, одну и ту же последовательность 3'-НТО, одну и ту же микробную последовательность PPO HemG H_N10 (SEQ ID № 4), но различные последовательности нацеливающих пептидов (TP). Регенерированные трансгенные ростки R0 выращивали в теплице. Растения, представляющие двадцать однокопийных событий для сои R0, полученные из конструкции 11 и экспрессирующие микробный фермент PPO H_N10 (SEQ ID № 4), опрыскивали флумиоксазином (Valor®, Valent U.S.A. Corporation, Уолнат-Крик, Калифорния) в количестве 210 г/га. Гербицид распыляли на стадии развития V3 с тремя полностью развитыми трилистниками, и степени повреждения оценивали через 8 дней после обработки. Отмечали процент растений, которые были признаны высокоустойчивыми (степень повреждения 15% или меньше). После внесения 210 г/га флумиоксазина генетически неизмененные контрольные растения сои демонстрировали среднюю степень повреждения 30%, и не наблюдалось высокоустойчивых растений. Растения сои, экспрессирующие микробный фермент PPO H_N10 (SEQ ID № 4), демонстрировали среднюю степень повреждения 22%, и 9% исследованных растений являлись высокоустойчивыми к гербициду.

Растения, представляющие десять многокопийных событий для сои R0, полученные из конструкции 11 и экспрессирующие микробный фермент PPO H_N10 (SEQ ID № 4), обрабатывали 5 г/га S-3100. Гербицид распыляли на стадии развития V3 с тремя полностью развитыми трилистниками, и степени повреждения определяли через 8 дней после обработки. Отмечали процент растений, которые были признаны высокоустойчивыми (степень повреждения 25% или меньше). После внесения S-3100 (5 г/га) генетически неизмененные контрольные растения сои демонстрировали среднюю степень повреждения 60%, и не наблюдалось высокоустойчивых растений. Растения сои, экспрессирующие микробный фермент PPO H_N10 (SEQ ID № 4), демонстрировали среднюю степень повреждения 47%, и 30% исследуемых растений являлись высокоустойчивыми к гербициду.

Однокопийные трансгенные растения сои R1 в теплице опрыскивали в соответствии с одной из трех норм внесения гербицида: обработка 1 представляла собой 5 грамм аи/га S-3100, внесенные на стадии V4, затем R1; обработка 2 представляла собой 10 грамм аи/га S-3100, внесенные на стадии V4, затем R1; обработка 3 представляла собой 30 грамм аи/га S-3100, внесенные на стадии V4, затем R1. Степени повреждения сельскохозяйственной культуры в процентах на стадии V2 (CIPV2) оценивали через десять дней после обработки. Генетически неизмененные растения продемонстрировали средние степени повреждения от 89% до 100% и не были доступны для оценивания на стадии роста R1. Растения, полученные из конструкции 1 и экспрессирующие микробный фермент PPO H_N10 (SEQ ID № 4), продемонстрировали степени повреждения от 3% до 15,7%. Данные представлены в Таблице 8.

Таблица 8. Эффективность защиты сои R1 от S-3100 в условиях теплицы

Конструкция Обработка Доза S-3100 Степень повреждения, %, на стадии V4 Степень повреждения, %, на стадии R1 1 1 5 г/га 4,2 3 1 2 10 г/га 7,8 6,5 1 3 30 г/га 9,4 15,7 генетически неизмененное 1 5 г/га 89 генетически неизмененное 2 10 г/га 98 генетически неизмененное 3 30 г/га 100

Высокопроизводительную трансформацию растений и метод отбора использовали для оценки большого количества конструкций в трансгенных растениях относительно устойчивости к гербицидам ткани трансформированного ростка на ранней стадии развития. Это позволило производить отбор конфигураций конструкций и ферментов PPO быстрее и в большем объеме.

Гены, кодирующие семь микробных ферментов PPO HemG H_N10 (SEQ ID № 13); H_N20 (SEQ ID № 12); H_N30 (SEQ ID № 14); H_N40 (SEQ ID № 15); H_N50 (SEQ ID № 16); H_N90 (SEQ ID № 11, 18, 19); и H_N100 (SEQ ID № 17, 20), функционально присоединяли к тридцати семи различным нацеливающим пептидам и клонировали с помощью базового трансформационного вектора растений. Это дало возможность непосредственно сравнивать семь различных ферментов PPO HemG с тридцатью семью различными нацеливающими пептидами с использованием одного и того же промотора и 3'-НТО для экспрессии гена. Эти растительные трансформационные конструкции использовали для трансформации вырезанных зародышей сои (зародышевая плазма A3555) с использованием A. tumefaciens и стандартных способов, известных в данной области техники. Для каждой конструкции инокулировали четыреста эксплантатов, что давало двенадцать емкостей на конструкцию. Для исследования устойчивости к гербицидам использовали стерильный раствор PPO гербицида. Раствор гербицида состоял из 0,3 г S-3100 в масляном концентрате, который улучшает нанесение гербицида, (5,0 мл) и 495 мл деионизированной воды. Его фильтровали через мембранный фильтр из ацетилцеллюлозы с размером пор 0,45 мкм, не содержащий поверхностно-активных веществ, для фильтрования тканевых культур Nalgene® Rapid-Flow™ (VWR, Раднор, Пенсильвания, США). Полученный стерильный раствор встряхивали перед применением.

Через пять недель после трансформации четыре из двенадцати емкостей с растениями на конструкцию дважды опрыскивали стерильным раствором PPO гербицида. Обработанные ростки затем помещали в емкость и подвергали воздействию света в течение по меньшей мере 15 часов каждый день после опрыскивания в течение четырех дней. В конце четвертого дня после нанесения S-3100 обработанные ростки фотографировали и оценивали по визуальной шкале зеленого окрашивания (зеленое окрашивание являлось показателем здоровой фотосинтезирующей ткани у растений по сравнению обесцвеченной под действием света тканью) в отношении повреждений. Значения оценок представляли собой 0 для плохой устойчивости, сильного повреждения, слабого зеленого окрашивания; 1 для незначительной устойчивости, повреждения средней степени, умеренного зеленого окрашивания; и 2 для хорошей устойчивости, слабого повреждения, интенсивного зеленого окрашивания. Оценка для каждой конструкции представлена в Таблице 9, где н. д. указывает на то, что анализ не проводили. Результаты указывают, что в этом высокопроизводительном скрининге ряд конструкций обеспечивал устойчивость к PPO гербициду.

Таблица 9. Высокопроизводительный скрининг сои на устойчивость к гербициду: оценка по окрашиванию

Нацеливающий пептид H_10 H_N20 H_N30 H_N40 H_N50 H_N90 H_N100 TP1 н. д. 0 2 2 1 2 2 TP2 н. д. 0 0 1 1 2 1 TP3 1 1 н. д. 1 1 2 1 TP4 н. д. 1 н. д. 2 1 1 н. д. TP5 н. д. н. д. н. д. н. д. 0 1 н. д. TP6 0 1 0 н. д. 2 2 2 TP7 н. д. 2 1 2 1 2 2 TP8 0 1 1 2 1 0 0 TP9 1 1 1 0 1 1 0 TP10 н. д. н. д. 0 н. д. 1 2 1 TP11 н. д. 1 1 1 0 2 0 TP12 1 2 1 1 1 2 2 TP13 1 2 1 1 1 2 0 TP14 0 0 н. д. 2 1 2 1 TP15 н. д. 1 1 2 2 2 2 TP16 1 1 н. д. н. д. 0 1 1 TP17 н. д. 2 1 1 1 2 1 TP18 1 1 0 1 1 2 1 TP19 0 1 0 1 0 1 1 TP20 0 2 н. д. н. д. н. д. 2 2 TP21 0 0 н. д. 2 1 1 0 TP22 1 1 н. д. н. д. 2 2 2 TP23 1 1 н. д. 1 1 1 2 TP24 0 1 1 0 1 1 0 TP25 н. д. 1 н. д. 2 2 1 1 TP26 0 1 0 1 1 0 н. д. TP27 1 1 0 1 1 1 1 TP28 н. д. 1 0 1 1 2 1 TP29 н. д. 1 1 1 1 1 1 TP30 н. д. 1 н. д. 1 1 1 1 TP31 1 1 н. д. 1 0 0 1 TP32 н. д. 0 н. д. 1 1 0 2 TP33 1 1 1 0 1 2 1 TP34 н. д. н. д. н. д. н. д. 0 2 0 TP35 н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. 1 1 TP36 0 н. д. н. д. н. д. 0 2 1 TP37 н. д. н. д. н. д. н. д. 0 н. д. н. д.

Ростки в неопрысканных емкостях, соответствующие конструкциям, имеющим оценку 2, пересаживали приблизительно через 7 дней после трансформации и выращивали как растения R0 с использованием стандартных способов, известных в данной области техники. Ростки, соответствующие оценкам неустойчивости 0 и 1, также выращивали для того, чтобы использовать их в качестве отрицательного контроля. Растения R0 выращивали в теплице в условиях питомника для светолюбивых растений (18 ч на свету при 80°F, затем 6 ч в темноте при 74°F) в течение приблизительно четырех недель. Через одиннадцать недель растения R0 дважды опрыскивали тем же раствором гербицида (0,3 г S-3100), что описан выше. Степени повреждения от гербицида оценивали через семь дней после обработки.

Результаты об устойчивости к применению гербицидов через одиннадцать недель для растений R0 подтвердили низкие оценки степени повреждения, наблюдаемые при высокопроизводительном скрининге через пять недель. Любая степень повреждения, составляющая 30% или выше, была эквивалентна степеням повреждения для генетически неизмененной сои. Несколько конструкций выделялись среди других, как обеспечивающие очень хорошую устойчивость к применению гербицида. Например, TP1 с PPO H_N90 (SEQ ID № 11) продемонстрировал степень повреждения всего лишь 3%, а с PPO H_N30 (SEQ ID № 14) или PPO H_N40 (SEQ ID № 15) степень повреждения всего лишь 5%; TP20 с PPO H_N90 (SEQ ID № 11) продемонстрировал степень повреждения всего лишь 5%. В отличие от этого TP32 с PPO H_N90 (SEQ ID № 11) продемонстрировал показатель повреждения 50%. Данные представлены в Таблице 10, где н. д. указывает на то, что анализ не проводили.

Таблица 10. Устойчивость к гербицидам для трансгенной сои R0: показатели повреждения в процентах

Нацеливающий пептид H_N20 H_N30 H_N40 H_N50 H_N90 H_N100 TP1 н. д. 5 5 н. д. 3 15 TP2 н. д. н. д. н. д. н. д. 35 н. д. TP3 н. д. н. д. н. д. н. д. 30 н. д. TP4 н. д. н. д. 15 н. д. н. д. н. д. TP5 н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. TP6 25 н. д. н. д. 40 25 30 TP7 20 н. д. 40 н. д. 15 30 TP8 н. д. н. д. 30 н. д. 40 н. д. TP9 н. д. 35 н. д. 40 30 н. д. TP10 н. д. н. д. н. д. н. д. 30 35 TP11 н. д. 35 н. д. н. д. 30 н. д. TP12 20 н. д. н. д. н. д. 30 50 TP13 20 н. д. 15 40 15 н. д. TP14 н. д. н. д. 35 40 25 н. д. TP15 30 35 30 40 35 30 TP16 н. д. н. д. н. д. н. д. 35 н. д. TP17 25 н. д. н. д. 40 15 н. д. TP18 н. д. н. д. н. д. н. д. 30 н. д. TP19 н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. TP20 20 н. д. н. д. н. д. 5 35 TP21 н. д. н. д. 35 н. д. 25 н. д. TP22 н. д. н. д. н. д. 40 30 30 TP23 н. д. н. д. н. д. н. д. 30 35 TP24 н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. TP25 н. д. н. д. 15 35 н. д. н. д. TP26 н. д. 35 н. д. н. д. 40 н. д. TP27 н. д. н. д. н. д. н. д. 35 н. д. TP28 н. д. н. д. н. д. н. д. 30 35 TP29 30 н. д. н. д. н. д. н. д. 40 TP30 н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. TP31 н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. TP32 н. д. н. д. н. д. н. д. 50 40 TP33 н. д. н. д. н. д. н. д. 25 н. д. TP34 н. д. н. д. н. д. н. д. 35 н. д. TP35 н. д. н. д. н. д. н. д. 15 35 TP36 н. д. н. д. н. д. н. д. 15 н. д. TP37 н. д. н. д. н. д. н. д. н. д. н. д.

Для дальнейшей оценки растительных трансформационных конструкций в сое вырезанные зародыши (A3555) трансформируют с использованием растительных трансформационных векторов с помощью A. tumefaciens и стандартных способов, известных в данной области техники. Регенерированные трансгенные ростки R0 выращивают в теплице и делят на группы. Группы опрыскивают одним или большим количеством PPO гербицидов на группу для оценки устойчивости к гербицидам. Например, трансгенные растения R0 опрыскивают приблизительно на стадии роста V2-V4 лактофеном в дозе 110 г аи/га (0,09 фунтов аи/акр) или 220 г аи/га (0,19 фунтов аи/акр). Растения оценивают на наличие повреждений через от одного до четырнадцати дней после обработки, и показатели повреждения записывают. Образцы листьев используют для выявления трансгенных растений с единственной копией трансгенной ДНК-вставки, и растения R0, которые содержат только единственную копию и проходят испытание распыленным гербицидом, самоопыляют для получения семян R1.

Растения R1 выращивают в теплице и делят на группы. Группы опрыскивают одним или большим количеством PPO гербицидов на группу для оценки устойчивости к гербицидам. Например, PPO гербицид лактофен применяют до всхода растений и/или на стадии роста V2 - V6 в дозе 220 г аи/га (0,19 фунтов аи/акр). Растения оценивают на наличие повреждений через от одного до четырнадцати дней после обработки, и показатели повреждения записывают. Неопрысканные трансгенные растения используют для сравнения фенотипа с неопрысканными растениями дикого типа.

Растения R2 получают путем самоопыления гомозиготного трансгенного растения R1 и сбора семян. Растения R2 оценивают на одном или большем количестве полей или в тепличных испытаниях. Проводят обработку гербицидами, и для участков или растений оценивают степень повреждения сельскохозяйственных культур через от одного до четырнадцати дней после нанесения гербицида по шкале 0-100, при этом 0 соответствует отсутствию повреждений, а 100 соответствует полной гибели сельскохозяйственной культуры.

Пример 7. Анализ с использованием дисков из листьев

Анализ с использованием дисков из листьев выполняли для быстрой и наименее повреждающей оценки устойчивости к гербициду трансгенных растений, экспрессирующих рекомбинантный фермент PPO. Образцы ткани листьев отбирали от самых молодых полностью зеленых листьев растений кукурузы и сои. Пять дисков из листьев диаметром 4 мм вырезали из образцов листьев с использованием одноразового пуансона для биопсии с поршнем (Integra® Miltex®, Inc., Йорк, Пенсильвания), и диски из листьев помещали в один миллилитр раствора для инкубации (1 мМ MES, pH 6,5, 1% масса/объем сахарозы, 1% (объем/объем) ацетона) в 24-луночные полистирольные планшеты с крышками. Для анализа устойчивости к гербицидам в раствор для инкубации добавляли S-3100 так, чтобы конечная концентрация была 1 микромолярной. Применяли вакуум-инфильтрацию, и планшеты с дисками из листьев инкубировали в постоянной темноте в течение одного дня при комнатной температуре (23-24°C), после чего инкубировали в течение одного (соя) или двух (кукуруза) дней при непрерывном освещении под расположенными сверху флуоресцентными лампами и лампами накаливания (520 мкE) при 26-27°C. Затем оценивали повреждение дисков из листьев визуально по шкале от 0 (наименьшее повреждение) до 4 (наибольшее повреждение), при этом более низкие оценки указывают на лучшую устойчивость к PPO гербициду.

Диски из листьев трансгенных растений маиса, полученных с использованием конструкции 6 и экспрессирующих фермент PPO H_N10 (SEQ ID № 4), продемонстрировали значительную устойчивость к гербицидам, исходя из средней оценки для дисков из листьев, равной 0,4. Этот результат был сопоставим с устойчивостью к PPO гербицидам, наблюдаемой у цельных растений, трансформированных с помощью конструкции 6 и экспрессирующих фермент PPO H_N10 (SEQ ID № 4). Диски из листьев трансгенных растений сои, полученных с использованием конструкции 1 и конструкции 11 и экспрессирующих фермент PPO H_N10 (SEQ ID № 4), продемонстрировали, что растения с конструкцией 1 обладают значительной устойчивостью к гербицидам со степенью повреждения, равной нулю, тогда как растения с конструкцией 11 имели степень повреждения 1,6, а генетически неизмененные растения имели степень повреждения 2,6.

Пример 8. Экспрессия и исследование ферментов PPO HemG в хлопке

Микробные ферменты PPO HemG экспрессируют в трансгенных растениях хлопка, и для трансгенных растений определяют устойчивость к PPO гербицидам. Для хлопка вырезанные зародыши (Coker 130) трансформируют с помощью этих векторов с использованием A. tumefaciens и стандартных способов, известных в данной области техники. Регенерированные трансгенные ростки R0 выращивают в теплице и делят на группы. Группы используют для распыления PPO гербицидов (один PPO гербицид на группу) для оценки устойчивости. Например, трансгенные ростки R0 опрыскивают приблизительно на стадии появления 2-4 настоящих листьев лактофеном в дозе 110 г аи/га (0,09 фунтов аи/акр) или 220 г аи/га (0,19 фунтов аи/акр). Растения оценивают на наличие повреждений через от одного до четырнадцати дней после обработки, и показатели повреждения записывают. Образцы листьев используют для выявления трансгенных растений с одной копией трансгенной вставки. Растения R0, которые содержат только одну копию и проходят испытания распылением гербицида, размножают самоопылением, чтобы получить семена R1.

Растения R1 выращивают в теплице и делят на группы. Группы опрыскивают одним или большим количеством PPO гербицидов на группу для оценки устойчивости к гербицидам. Например, PPO гербицид лактофен применяют до всхода растений и/или на стадии от появления двух настоящих листьев до появления первых цветков в дозе 220 г аи/га (0,19 фунтов аи/акр) (1X). Растения оценивают на наличие повреждений через от одного до четырнадцати дней после обработки, и показатели повреждения записывают. Неопрысканные трансгенные растения используют для сравнения фенотипа с неопрысканными растениями дикого типа.

Растения R2 получают путем самоопыления гомозиготного трансгенного растения R1 и сбора семян. Растения R2 оценивают на одном или большем количестве полей или в тепличных испытаниях. Проводят обработку гербицидами, и для участков или растений оценивают степень повреждения сельскохозяйственных культур через от одного до четырнадцати дней после нанесения гербицида по шкале 0-100, при этом 0 соответствует отсутствию повреждений, а 100 соответствует полной гибели сельскохозяйственной культуры.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Monsanto Technology LLC

<120> Способы и композиции для устойчивости растений к гербицидам

<130> MONS:383WO

<150> US 62/200428

<151> 2015-08-03

<160> 63

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 179

<212> PRT

<213> Enterobacter cloacae

<400> 1

Met Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala

1 5 10 15

Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp

20 25 30

Val Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp

35 40 45

Gln Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val

50 55 60

Leu Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro

65 70 75 80

Ser Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Thr Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Glu Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu Ser Tyr Lys

165 170 175

Lys Ala Leu

<210> 2

<211> 178

<212> PRT

<213> Pantoea ananatis

<400> 2

Met Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Gln Lys

1 5 10 15

Ile Ala Ser Ala Ile Ala Asp Glu Ile Lys Gly Gln Gln Ser Cys Asp

20 25 30

Val Ile Asn Ile Gln Asp Ala Lys Thr Leu Asp Trp Gln Gln Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Gln Pro Val

50 55 60

Val Asn Glu Phe Val Lys His Asn Leu Leu Ala Leu Gln Gln Arg Val

65 70 75 80

Ser Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Ser Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Val Lys Phe Leu Ala Gln Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Tyr Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Phe Ile Met Arg Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ala Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Gln Gln Val Gln Arg Phe Ala Arg Asp Phe Ala Gln Leu Pro Gly Lys

165 170 175

Ser Tyr

<210> 3

<211> 177

<212> PRT

<213> Pantoea stewardii

<400> 3

Met Lys Ala Leu Ile Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Lys

1 5 10 15

Ile Ala Ser Ser Ile Ala Asp Val Ile Arg Gln Gln Gln Gln Cys Asp

20 25 30

Val Leu Asn Ile Lys Asp Ala Ser Leu Pro Asp Trp Ala Gln Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Gln Pro Val

50 55 60

Val Asp Lys Phe Val Lys Gln His Leu His Glu Leu Gln Gln Arg Thr

65 70 75 80

Ser Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Ser Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Phe Leu Ala His Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Tyr Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ser Thr Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Gln Gln Val Ser Thr Phe Ala Asn Asp Phe Ala Gln Leu Pro Gly Lys

165 170 175

Ser

<210> 4

<211> 181

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 4

Met Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Leu Gly Ile Gln Ala

20 25 30

Asp Val Ala Asn Val His Arg Ile Glu Glu Pro Gln Trp Glu Asn Tyr

35 40 45

Asp Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Tyr His Ser

50 55 60

Ala Phe Gln Glu Phe Val Lys Lys His Ala Thr Arg Leu Asn Ser Met

65 70 75 80

Pro Ser Ala Phe Tyr Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys

85 90 95

Arg Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Ala Arg Lys Phe Leu Met Asn Ser

100 105 110

Gln Trp Arg Pro Asp Arg Cys Ala Val Ile Ala Gly Ala Leu Arg Tyr

115 120 125

Pro Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Lys Leu Ile Met Lys

130 135 140

Met Ser Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Trp Glu Gln Val Ala Asn Phe Ala Arg Glu Ile Ala His Leu Thr Asp

165 170 175

Lys Pro Thr Leu Lys

180

<210> 5

<211> 178

<212> PRT

<213> Erwinia toletana

<400> 5

Met Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Ser Arg Glu Gly Gln Thr Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Cys Asp

20 25 30

Val Phe Asn Ile Leu Arg Val Glu Gln Ile Asp Trp Ser Gln Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Leu Ile Gly Gly Ser Ile His Tyr Gly His Phe His Pro Ala

50 55 60

Val Ala Lys Phe Val Lys Arg His Leu His Glu Leu Gln Gln Arg Ser

65 70 75 80

Ser Gly Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Ala Asp Lys Arg

85 90 95

Thr Pro Gln Thr Asn Ala Tyr Met Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Thr

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Thr Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Glu Phe Ala His Leu Pro Gly Lys

165 170 175

Thr Gln

<210> 6

<211> 179

<212> PRT

<213> Pectobacterium carotovorum

<400> 6

Met Lys Ala Leu Ile Val Phe Ser Ser Arg Asp Gly Gln Thr Arg Ala

1 5 10 15

Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Thr Leu Lys Gly Thr Leu Glu Cys Asp

20 25 30

Val Val Asn Val Leu Asn Ala Asn Asp Ile Asp Leu Ser Gln Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Ala Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly Arg Phe His Pro Ala

50 55 60

Val Asn Gln Phe Ile Arg Lys His Leu Thr Ser Leu Gln Gln Leu Pro

65 70 75 80

Ser Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Thr Ile Gln Thr Asn Ala Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Asp Leu Cys Cys Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Ile

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ser Thr Lys Glu Ile Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Gln Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Asp Phe Ala Gln Leu Ala Ala Lys

165 170 175

Asn Pro Ala

<210> 7

<211> 179

<212> PRT

<213> Shimwellia blattae

<400> 7

Met Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Lys

1 5 10 15

Ile Ala Arg His Ile Ala Gly Val Leu Glu Glu Gln Gly Lys Ala Cys

20 25 30

Glu Leu Val Asp Leu Leu Gln Pro Gly Glu Pro Asp Trp Ser Thr Val

35 40 45

Glu Cys Val Val Leu Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Lys

50 55 60

Ser Phe Ile Arg Phe Val Asn Thr His Ala Gln Arg Leu Asn Asn Met

65 70 75 80

Pro Gly Ala Leu Phe Thr Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys

85 90 95

Gln Ser Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Ala Ala Ser

100 105 110

Pro Trp Gln Pro Gln Arg Cys Gln Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr

115 120 125

Pro Arg Tyr Ser Trp Tyr Asp Arg Met Met Ile Arg Leu Ile Met Lys

130 135 140

Met Ala Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Trp Gln Ser Val Thr Arg Phe Ala Arg Glu Ile Ala Gln Leu Pro Gly

165 170 175

Glu Thr Arg

<210> 8

<211> 178

<212> PRT

<213> Pantoea stewardii

<400> 8

Met Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Ser Arg Asp Gly Gln Thr Gln Leu

1 5 10 15

Ile Ala Ser Ser Ile Ala Lys Glu Leu Glu Gly Lys Gln Ala Cys Asp

20 25 30

Val Leu Asn Ile Leu Asp Thr Thr Asn Val Glu Trp Thr Gln Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro Ala

50 55 60

Val Ala Glu Phe Val Lys Arg His Gln Arg Glu Leu Gln Gln Arg Ser

65 70 75 80

Ser Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Ser Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Ala Lys Phe Leu Asn Gln Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Ile Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ser Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Gln Gln Val Thr Arg Phe Ala Gln Glu Phe Ala Arg Leu Pro Gly Lys

165 170 175

Thr Ser

<210> 9

<211> 180

<212> PRT

<213> Enterobacter cloacae

<400> 9

Met Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ala Ala Phe Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Gly Ile Tyr Ala

20 25 30

Asp Val Ile Asn Leu Asn Arg Thr Glu Glu Ile Ala Trp Gln Glu Tyr

35 40 45

Asp Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro

50 55 60

Ala Val Asp Arg Phe Val Lys Lys His Thr Glu Thr Leu Asn Ser Leu

65 70 75 80

Pro Gly Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Ala Glu Lys

85 90 95

Arg Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser

100 105 110

Pro Trp Lys Pro Ala Ala Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr

115 120 125

Pro Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Arg Leu Ile Met Lys

130 135 140

Met Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Trp Ser Gln Val Ala Ser Phe Ala Arg Glu Ile Val Gln Leu Thr Arg

165 170 175

Ser Ser Arg Leu

180

<210> 10

<211> 177

<212> PRT

<213> Enterobacter mori

<400> 10

Met Lys Ile Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ala Ala Ser Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Ala Phe Asp Val

20 25 30

Asp Val Val Asn Leu His Arg Ala Glu Asn Ile Ala Trp Glu Glu Tyr

35 40 45

Asp Gly Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Ser

50 55 60

Thr Leu Asn Ser Phe Val Lys Lys His Gln Gln Ala Leu Lys Lys Leu

65 70 75 80

Pro Gly Ala Phe Tyr Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys

85 90 95

Arg Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asp Ser

100 105 110

Pro Trp Gln Pro Asp Leu Ser Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr

115 120 125

Pro Arg Tyr Asn Trp Tyr Asp Arg Ile Met Ile Arg Leu Ile Met Lys

130 135 140

Ile Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Trp Gln Gln Val Thr His Phe Ala His Glu Ile Val Gln Leu Val Arg

165 170 175

Lys

<210> 11

<211> 178

<212> PRT

<213> Enterobacter cloacae

<400> 11

Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp Val

20 25 30

Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp Gln

35 40 45

Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val Leu

50 55 60

Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro Ser

65 70 75 80

Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr

85 90 95

Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Glu

145 150 155 160

Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu Ser Tyr Lys Lys

165 170 175

Ala Leu

<210> 12

<211> 177

<212> PRT

<213> Pantoea ananatis

<400> 12

Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Gln Lys Ile

1 5 10 15

Ala Ser Ala Ile Ala Asp Glu Ile Lys Gly Gln Gln Ser Cys Asp Val

20 25 30

Ile Asn Ile Gln Asp Ala Lys Thr Leu Asp Trp Gln Gln Tyr Asp Arg

35 40 45

Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Gln Pro Val Val

50 55 60

Asn Glu Phe Val Lys His Asn Leu Leu Ala Leu Gln Gln Arg Val Ser

65 70 75 80

Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Ser

85 90 95

Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Val Lys Phe Leu Ala Gln Ser Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Tyr Tyr Pro Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Phe Ile Met Arg Met Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Ala Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Gln

145 150 155 160

Gln Val Gln Arg Phe Ala Arg Asp Phe Ala Gln Leu Pro Gly Lys Ser

165 170 175

Tyr

<210> 13

<211> 180

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 13

Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Leu Gly Ile Gln Ala Asp

20 25 30

Val Ala Asn Val His Arg Ile Glu Glu Pro Gln Trp Glu Asn Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Tyr His Ser Ala

50 55 60

Phe Gln Glu Phe Val Lys Lys His Ala Thr Arg Leu Asn Ser Met Pro

65 70 75 80

Ser Ala Phe Tyr Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg

85 90 95

Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Ala Arg Lys Phe Leu Met Asn Ser Gln

100 105 110

Trp Arg Pro Asp Arg Cys Ala Val Ile Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Lys Leu Ile Met Lys Met

130 135 140

Ser Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Glu Gln Val Ala Asn Phe Ala Arg Glu Ile Ala His Leu Thr Asp Lys

165 170 175

Pro Thr Leu Lys

180

<210> 14

<211> 177

<212> PRT

<213> Erwinia toletana

<400> 14

Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Ser Arg Glu Gly Gln Thr Arg Glu Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Cys Asp Val

20 25 30

Phe Asn Ile Leu Arg Val Glu Gln Ile Asp Trp Ser Gln Tyr Asp Arg

35 40 45

Val Leu Ile Gly Gly Ser Ile His Tyr Gly His Phe His Pro Ala Val

50 55 60

Ala Lys Phe Val Lys Arg His Leu His Glu Leu Gln Gln Arg Ser Ser

65 70 75 80

Gly Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Ala Asp Lys Arg Thr

85 90 95

Pro Gln Thr Asn Ala Tyr Met Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Thr Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Thr

145 150 155 160

Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Glu Phe Ala His Leu Pro Gly Lys Thr

165 170 175

Gln

<210> 15

<211> 178

<212> PRT

<213> Pectobacterium carotovorum

<400> 15

Lys Ala Leu Ile Val Phe Ser Ser Arg Asp Gly Gln Thr Arg Ala Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Thr Leu Lys Gly Thr Leu Glu Cys Asp Val

20 25 30

Val Asn Val Leu Asn Ala Asn Asp Ile Asp Leu Ser Gln Tyr Asp Arg

35 40 45

Val Ala Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly Arg Phe His Pro Ala Val

50 55 60

Asn Gln Phe Ile Arg Lys His Leu Thr Ser Leu Gln Gln Leu Pro Ser

65 70 75 80

Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr

85 90 95

Ile Gln Thr Asn Ala Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Asp Leu Cys Cys Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Ile Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Ser Thr Lys Glu Ile Glu Tyr Thr Asp Trp Gln

145 150 155 160

Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Asp Phe Ala Gln Leu Ala Ala Lys Asn

165 170 175

Pro Ala

<210> 16

<211> 178

<212> PRT

<213> Shimwellia blattae

<400> 16

Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Lys Ile

1 5 10 15

Ala Arg His Ile Ala Gly Val Leu Glu Glu Gln Gly Lys Ala Cys Glu

20 25 30

Leu Val Asp Leu Leu Gln Pro Gly Glu Pro Asp Trp Ser Thr Val Glu

35 40 45

Cys Val Val Leu Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Lys Ser

50 55 60

Phe Ile Arg Phe Val Asn Thr His Ala Gln Arg Leu Asn Asn Met Pro

65 70 75 80

Gly Ala Leu Phe Thr Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys Gln

85 90 95

Ser Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Ala Ala Ser Pro

100 105 110

Trp Gln Pro Gln Arg Cys Gln Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Ser Trp Tyr Asp Arg Met Met Ile Arg Leu Ile Met Lys Met

130 135 140

Ala Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Gln Ser Val Thr Arg Phe Ala Arg Glu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu

165 170 175

Thr Arg

<210> 17

<211> 179

<212> PRT

<213> Enterobacter cloacae

<400> 17

Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu Ile

1 5 10 15

Ala Ala Phe Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Gly Ile Tyr Ala Asp

20 25 30

Val Ile Asn Leu Asn Arg Thr Glu Glu Ile Ala Trp Gln Glu Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro Ala

50 55 60

Val Asp Arg Phe Val Lys Lys His Thr Glu Thr Leu Asn Ser Leu Pro

65 70 75 80

Gly Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Ala Glu Lys Arg

85 90 95

Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro

100 105 110

Trp Lys Pro Ala Ala Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Arg Leu Ile Met Lys Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Ser Gln Val Ala Ser Phe Ala Arg Glu Ile Val Gln Leu Thr Arg Ser

165 170 175

Ser Arg Leu

<210> 18

<211> 178

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 18

Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp Val

20 25 30

Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp Gln

35 40 45

Val Leu Ile Gly Ala Asn Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val Leu

50 55 60

Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro Ser

65 70 75 80

Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr

85 90 95

Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Glu

145 150 155 160

Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu Ser Tyr Lys Lys

165 170 175

Ala Leu

<210> 19

<211> 172

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 19

Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala Ile

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp Val

20 25 30

Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp Gln

35 40 45

Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val Leu

50 55 60

Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro Ser

65 70 75 80

Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr

85 90 95

Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro Trp

100 105 110

Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg

115 120 125

Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Glu

145 150 155 160

Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu

165 170

<210> 20

<211> 179

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 20

Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu Ile

1 5 10 15

Ala Ala Phe Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Gly Ile Tyr Ala Asp

20 25 30

Val Ile Asn Leu Asn Arg Thr Glu Glu Ile Ala Trp Gln Glu Tyr Asp

35 40 45

Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro Ala

50 55 60

Val Asp Arg Phe Val Lys Lys His Thr Glu Thr Leu Asn Ser Leu Pro

65 70 75 80

Gly Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Ala Glu Lys Arg

85 90 95

Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro

100 105 110

Trp Lys Pro Ala Ala Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro

115 120 125

Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Arg Leu Ile Met Lys Met

130 135 140

Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp Trp

145 150 155 160

Ser Gln Ile Ala Ser Phe Ala Arg Glu Ile Val Gln Leu Thr Arg Ser

165 170 175

Ser Arg Leu

<210> 21

<211> 504

<212> PRT

<213> Amaranthus tuberculatus

<400> 21

Met Gly Asn Ile Ser Glu Arg Glu Glu Pro Thr Ser Ala Lys Arg Val

1 5 10 15

Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Leu

20 25 30

Lys Ser His Gly Leu Ser Val Thr Leu Phe Glu Ala Asp Ser Arg Ala

35 40 45

Gly Gly Lys Leu Lys Thr Val Lys Lys Asp Gly Phe Ile Trp Asp Glu

50 55 60

Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ser Glu Ala Glu Val Ser Ser Leu Ile

65 70 75 80

Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gln Gln Leu Pro Ile Ser Gln Asn

85 90 95

Lys Arg Tyr Ile Ala Arg Asp Gly Leu Pro Val Leu Leu Pro Ser Asn

100 105 110

Pro Ala Ala Leu Leu Thr Ser Asn Ile Leu Ser Ala Lys Ser Lys Leu

115 120 125

Gln Ile Met Leu Glu Pro Phe Leu Trp Arg Lys His Asn Ala Thr Glu

130 135 140

Leu Ser Asp Glu His Val Gln Glu Ser Val Gly Glu Phe Phe Glu Arg

145 150 155 160

His Phe Gly Lys Glu Phe Val Asp Tyr Val Ile Asp Pro Phe Val Ala

165 170 175

Gly Thr Cys Gly Gly Asp Pro Gln Ser Leu Ser Met His His Thr Phe

180 185 190

Pro Glu Val Trp Asn Ile Glu Lys Arg Phe Gly Ser Val Phe Ala Gly

195 200 205

Leu Ile Gln Ser Thr Leu Leu Ser Lys Lys Glu Lys Gly Gly Glu Asn

210 215 220

Ala Ser Ile Lys Lys Pro Arg Val Arg Gly Ser Phe Ser Phe Gln Gly

225 230 235 240

Gly Met Gln Thr Leu Val Asp Thr Met Cys Lys Gln Leu Gly Glu Asp

245 250 255

Glu Leu Lys Leu Gln Cys Glu Val Leu Ser Leu Ser Tyr Asn Gln Lys

260 265 270

Gly Ile Pro Ser Leu Gly Asn Trp Ser Val Ser Ser Met Ser Asn Asn

275 280 285

Thr Ser Glu Asp Gln Ser Tyr Asp Ala Val Val Val Thr Ala Pro Ile

290 295 300

Arg Asn Val Lys Glu Met Lys Ile Met Lys Phe Gly Asn Pro Phe Ser

305 310 315 320

Leu Asp Phe Ile Pro Glu Val Thr Tyr Val Pro Leu Ser Val Met Ile

325 330 335

Thr Ala Phe Lys Lys Asp Lys Val Lys Arg Pro Leu Glu Gly Phe Gly

340 345 350

Val Leu Ile Pro Ser Lys Glu Gln His Asn Gly Leu Lys Thr Leu Gly

355 360 365

Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Ser Asp Met

370 375 380

Cys Leu Phe Thr Thr Phe Val Gly Gly Ser Arg Asn Arg Lys Leu Ala

385 390 395 400

Asn Ala Ser Thr Asp Glu Leu Lys Gln Ile Val Ser Ser Asp Leu Gln

405 410 415

Gln Leu Leu Gly Thr Glu Asp Glu Pro Ser Phe Val Asn His Leu Phe

420 425 430

Trp Ser Asn Ala Phe Pro Leu Tyr Gly His Asn Tyr Asp Ser Val Leu

435 440 445

Arg Ala Ile Asp Lys Met Glu Lys Asp Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala

450 455 460

Gly Asn His Lys Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ala Met Ala Ser Gly

465 470 475 480

Cys Lys Ala Ala Glu Leu Val Ile Ser Tyr Leu Asp Ser His Ile Tyr

485 490 495

Val Lys Met Asp Glu Lys Thr Ala

500

<210> 22

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 22

atgaaagcgc tggtgctgta tagcacccgc gatggccaga cccatgcgat tgcgagctat 60

attgcgagct gcatgaaaga aaaagcggaa tgcgatgtga ttgatctgac ccatggcgaa 120

catgtgaacc tgacccagta tgatcaggtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat 180

tttaacgcgg tgctggataa atttattaaa cgcaacgtgg atcagctgaa caacatgccg 240

agcgcgtttt tttgcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcac cccgcagacc 300

aacccgtatg tgcgcaaatt tctgctggcg accccgtggc agccggcgct gtgcggcgtg 360

tttgcgggcg cgctgcgcta tccgcgctat cgctggattg ataaagtgat gattcagctg 420

attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat accagcaaag aagtggaata taccgattgg 480

gaacaggtga aaaaatttgc ggaagatttt gcgaaactga gctataaaaa agcgctg 537

<210> 23

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 23

atgaaagcgc tgattctgtt tagcacccgc gatggccaga cccagaaaat tgcgagcgcg 60

attgcggatg aaattaaagg ccagcagagc tgcgatgtga ttaacattca ggatgcgaaa 120

accctggatt ggcagcagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat 180

tttcagccgg tggtgaacga atttgtgaaa cataacctgc tggcgctgca gcagcgcgtg 240

agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc 300

aacgcgtata ccgtgaaatt tctggcgcag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360

tttgcgggcg cgctgtatta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagttt 420

attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat gcgagcaaag aagtggaata taccgattgg 480

cagcaggtgc agcgctttgc gcgcgatttt gcgcagctgc cgggcaaaag ctat 534

<210> 24

<211> 531

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 24

atgaaagcgc tgattctgta tagcacccgc gatggccaga cccgcaaaat tgcgagcagc 60

attgcggatg tgattcgcca gcagcagcag tgcgatgtgc tgaacattaa agatgcgagc 120

ctgccggatt gggcgcagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat 180

tttcagccgg tggtggataa atttgtgaaa cagcatctgc atgaactgca gcagcgcacc 240

agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc 300

aacgcgtata cccagaaatt tctggcgcat agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360

tttgcgggcg cgctgtatta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagctg 420

attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat agcaccaaag aagtggaata taccgattgg 480

cagcaggtga gcacctttgc gaacgatttt gcgcagctgc cgggcaaaag c 531

<210> 25

<211> 546

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 25

gtgaaaacat taattctttt ctcaacaagg gacggacaaa cgcgcgagat tgcctcctac 60

ctggcttcgg aactgaaaga actggggatc caggcggatg tcgccaatgt gcaccgcatt 120

gaagaaccac agtgggaaaa ctatgaccgt gtggtcattg gtgcttctat tcgctatggt 180

cactaccatt cagcgttcca ggaatttgtc aaaaaacatg cgacgcggct gaattcgatg 240

ccgagcgcct tttactccgt gaatctggtg gcgcgcaaac cggagaagcg tactccacag 300

accaacagct acgcgcgcaa gtttctgatg aactcgcaat ggcgtcccga tcgctgcgcg 360

gtcattgccg gggcgctgcg ttacccacgt tatcgctggt acgaccgttt tatgatcaag 420

ctgattatga agatgtcagg cggtgaaacg gatacgcgca aagaagttgt ctataccgat 480

tgggagcagg tggcgaattt cgcccgagaa atcgcccatt taaccgacaa accgacgctg 540

aaataa 546

<210> 26

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 26

atgaaagcgc tgattctgtt tagcagccgc gaaggccaga cccgcgaaat tgcgagctat 60

attgcgaaca gcattaaaga agaaatggaa tgcgatgtgt ttaacattct gcgcgtggaa 120

cagattgatt ggagccagta tgatcgcgtg ctgattggcg gcagcattca ttatggccat 180

tttcatccgg cggtggcgaa atttgtgaaa cgccatctgc atgaactgca gcagcgcagc 240

agcggctttt tttgcgtgaa cctgaccgcg cgcaaagcgg ataaacgcac cccgcagacc 300

aacgcgtata tgcgcaaatt tctgctgcag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360

tttgcgggcg cgctgcgcta tacccgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagctg 420

attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat accagcaaag aagtggaata taccgattgg 480

acccaggtgg cgcgctttgc gcaggaattt gcgcatctgc cgggcaaaac ccag 534

<210> 27

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 27

atgaaagcgc tgattgtgtt tagcagccgc gatggccaga cccgcgcgat tgcgagctat 60

attgcgaaca ccctgaaagg caccctggaa tgcgatgtgg tgaacgtgct gaacgcgaac 120

gatattgatc tgagccagta tgatcgcgtg gcgattggcg cgagcattcg ctatggccgc 180

tttcatccgg cggtgaacca gtttattcgc aaacatctga ccagcctgca gcagctgccg 240

agcgcgtttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcac cattcagacc 300

aacgcgtata cccgcaaatt tctgctgaac agcccgtggc agccggatct gtgctgcgtg 360

tttgcgggcg cgctgcgcta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagctg 420

attatgcgca ttaccggcgg cgaaaccgat agcaccaaag aaattgaata taccgattgg 480

cagcaggtgg cgcgctttgc gcaggatttt gcgcagctgg cggcgaaaaa cccggcg 537

<210> 28

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 28

atgaagacct tgatcctatt ctccaccagg gacggccaaa cacacaagat cgcaaggcac 60

atcgcaggag tcctcgaaga gcaggggaag gcctgcgagt tggtcgatct gttacagccc 120

ggcgaaccag actggagtac cgttgaatgc gtcgttctag gggccagcat tagatatggt 180

cacttccata agtctttcat caggttcgta aacactcacg cgcagcgctt gaataatatg 240

ccaggcgccc ttttcacagt taacttagtc gcccgaaagc ccgagaagca gagtccacag 300

acgaactctt acacccgcaa gtttctcgcc gcctcccctt ggcagccaca gcgatgccaa 360

gttttcgcgg gcgctttgag gtaccctagg tactcgtggt acgacagaat gatgatacgt 420

ttgataatga agatggccgg gggcgagact gacacaagga aggaggttga gtacactgac 480

tggcagtcgg tgactcggtt cgcgagggag atcgctcagc tgccgggaga gacgcgg 537

<210> 29

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 29

atgaaagcgc tgattctgtt tagcagccgc gatggccaga cccagctgat tgcgagcagc 60

attgcgaaag aactggaagg caaacaggcg tgcgatgtgc tgaacattct ggataccacc 120

aacgtggaat ggacccagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat 180

tttcatccgg cggtggcgga atttgtgaaa cgccatcagc gcgaactgca gcagcgcagc 240

agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc 300

aacgcgtata ccgcgaaatt tctgaaccag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg 360

tttgcgggcg cgctgcgcta tccgcgctat cgctggtttg atcgcattat gattcagctg 420

attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat agcagcaaag aagtggaata taccgattgg 480

cagcaggtga cccgctttgc gcaggaattt gcgcgcctgc cgggcaaaac cagc 534

<210> 30

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 30

atgaaaaccc tgattctgtt tagcacccgc gatggccaga cccgcgaaat tgcggcgttt 60

ctggcgagcg aactgaaaga acagggcatt tatgcggatg tgattaacct gaaccgcacc 120

gaagaaattg cgtggcagga atatgatcgc gtggtgattg gcgcgagcat tcgctatggc 180

cattttcatc cggcggtgga tcgctttgtg aaaaaacata ccgaaaccct gaacagcctg 240

ccgggcgcgt tttttagcgt gaacctggtg gcgcgcaaag cggaaaaacg caccccgcag 300

accaacagct atacccgcaa atttctgctg aacagcccgt ggaaaccggc ggcgtgcgcg 360

gtgtttgcgg gcgcgctgcg ctatccgcgc tatcgctggt atgatcgctt tatgattcgc 420

ctgattatga aaatgaccgg cggcgaaacc gatacccgca aagaagtggt gtataccgat 480

tggagccagg tggcgagctt tgcgcgcgaa attgtgcagc tgacccgcag cagccgcctg 540

<210> 31

<211> 531

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 31

atgaaaattc tgattctgtt tagcacccgc gatggccaga cccgcgaaat tgcggcgagc 60

ctggcgagcg aactgaaaga acaggcgttt gatgtggatg tggtgaacct gcatcgcgcg 120

gaaaacattg cgtgggaaga atatgatggc gtggtgattg gcgcgagcat tcgctatggc 180

cattttcata gcaccctgaa cagctttgtg aaaaaacatc agcaggcgct gaaaaaactg 240

ccgggcgcgt tttatagcgt gaacctggtg gcgcgcaaac cggaaaaacg caccccgcag 300

accaacagct atacccgcaa atttctgctg gatagcccgt ggcagccgga tctgagcgcg 360

gtgtttgcgg gcgcgctgcg ctatccgcgc tataactggt atgatcgcat tatgattcgc 420

ctgattatga aaattaccgg cggcgaaacc gatacccgca aagaagtggt gtataccgat 480

tggcagcagg tgacccattt tgcgcatgaa attgtgcagc tggtgcgcaa a 531

<210> 32

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 32

atgaaggcct tggtactgta ctcgacgcgg gacggccaga cccacgcaat tgcttcatac 60

atcgcctcct gcatgaagga gaaggccgaa tgcgacgtga tcgacctcac ccacggggag 120

cacgtgaacc tcacccaata cgatcaggtg ctaatcggtg cgagtattcg ttacggccac 180

ttcaacgccg tgcttgacaa gttcatcaag agaaacgtgg atcagctgaa caacatgcca 240

agcgcgttct tctgcgtaaa cctcacagca aggaagcccg agaagcgtac tccccagaca 300

aacccttatg tccgaaaatt cttgcttgct accccctggc agcccgcgtt gtgcggagtg 360

ttcgcagggg cccttcggta cccgcgatac cggtggatcg acaaggtgat gatccagcta 420

ataatgcgga tgactggggg agagacagac acgagcaagg aggtcgagta cacggattgg 480

gagcaggtta agaagttcgc ggaggatttt gcaaagctat cgtacaagaa ggccctctag 540

<210> 33

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 33

atgaaggcct tgatcctgtt ctctacacgc gacggacaga cacagaagat cgcatctgcc 60

atcgctgatg agataaaggg gcagcaatcg tgcgacgtga ttaacataca ggatgccaaa 120

accctcgact ggcagcagta cgaccgggta ctcatcggcg cctccattcg ttacgggcat 180

ttccagcccg ttgtgaatga gtttgtcaag cacaacctct tggccctaca gcagagagtt 240

tccggattct tctccgtgaa cttgacagcc cgaaagccag agaagcggag ccccgagact 300

aacgcttata cagtcaaatt cttggcgcag tcaccctggc aaccggactg ctgcgctgtt 360

tttgcggggg ccctgtacta cccacggtac cggtggttcg atagggtgat gatacagttc 420

ataatgcgaa tgacgggggg agagaccgac gcatcgaaag aggtggagta cactgactgg 480

cagcaggtgc agcggttcgc gcgagacttc gcgcagttac cgggtaagtc ctactga 537

<210> 34

<211> 534

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 34

atgaaggcgc tgatcttgta ctcaaccagg gacggtcaga ctcgcaagat tgcaagtagc 60

attgcggacg tcatcaggca gcagcagcag tgcgacgtct taaacattaa agacgcatca 120

cttcctgact gggcccaata tgaccgagtg ctcatcggag ctagcatccg ttacgggcat 180

ttccagcccg ttgtagacaa gttcgtgaag cagcacttgc acgagcttca gcagcggacc 240

tccggcttct tctccgtgaa cctgacggcg aggaagcctg aaaaaaggag ccctgagacc 300

aatgcctaca cccagaaatt cttggcgcac tccccttggc agcccgattg ctgtgccgtt 360

ttcgcggggg ccctttacta ccccaggtac cgttggttcg accgggtgat gatccagttg 420

attatgcgca tgactggtgg agagaccgac tctaccaagg aagtggagta cactgactgg 480

cagcaggtga gtaccttcgc caacgatttt gcccagcttc caggcaagag ctaa 534

<210> 35

<211> 546

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 35

atgaagacct tgattctatt ctccacaagg gacggccaga ctagggagat cgcttcctac 60

ctggccagcg agctaaagga gcttggcatt caggcagacg tggctaacgt gcaccgaatt 120

gaggagccgc agtgggagaa ctacgatcgg gtcgtgatcg gcgccagcat ccggtatgga 180

cactaccaca gcgcgttcca ggagttcgtg aaaaagcacg cgacccgtct gaatagcatg 240

ccatcagcgt tctactcggt caacctcgtg gctcgtaagc ccgagaagcg gacaccccag 300

accaactcgt atgccaggaa gttccttatg aactcgcagt ggcgaccgga ccgctgcgcg 360

gtgatcgccg gtgcgctcag gtaccctcgt tataggtggt acgacaggtt tatgattaaa 420

cttataatga aaatgagcgg cggagagacc gacaccagaa aagaggtggt ttacacagac 480

tgggagcagg tagcaaactt cgctagggag attgctcacc tcaccgacaa gccgaccttg 540

aagtaa 546

<210> 36

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 36

atgaaggccc ttatactgtt cagttccaga gaaggccaga cgagggagat agcgagttac 60

attgccaact cgataaagga ggaaatggaa tgcgacgtgt tcaacatcct tcgtgtggag 120

cagatcgact ggtctcaata cgaccgcgtc ctgatcgggg gctcgataca ctacggccat 180

ttccacccag cggtggcaaa atttgtcaag aggcacctcc atgagttgca acagaggtct 240

tccggctttt tctgcgtcaa cctgacggcc aggaaggccg acaagcggac tccccagacc 300

aatgcctaca tgagaaagtt cttgttgcag tccccatggc aacccgattg ctgcgccgtg 360

tttgcggggg cccttaggta cacccgttac aggtggttcg acagggtaat gattcagctg 420

atcatgagga tgacgggcgg agagactgac acatcgaagg aggtggagta cacagactgg 480

acgcaggtcg cccgcttcgc gcaggagttc gcccatttgc ccggcaaaac tcagtga 537

<210> 37

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 37

atgaaggctc ttatcgtatt ctcttcgagg gatggccaaa cccgagcgat cgcgtcttat 60

attgctaata ccctcaaagg gaccctagag tgcgacgtcg tcaacgtcct caatgctaac 120

gacattgatt tgagccagta cgaccgtgtg gccattggcg cctccattcg ctacgggagg 180

ttccacccag ctgttaacca gtttatccgg aagcacctta cgagcctcca gcagctacca 240

tctgcgttct tctccgtgaa cctcacagct cggaagcccg agaagaggac tatacaaacc 300

aacgcgtaca ctaggaagtt tctactgaac tcgccgtggc agccggacct gtgctgcgtg 360

ttcgcgggag cccttcgcta tccccgttac aggtggtttg accgagtgat gattcaactc 420

ataatgcgca taacgggggg cgagacagac tccaccaagg agatcgagta caccgactgg 480

cagcaggtcg cgcgattcgc ccaggatttt gcacagcttg ccgcaaagaa cccggcatga 540

<210> 38

<211> 540

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная

<400> 38