Линейный замещенный глипролин с антидепрессивным и анальгетическим действием Российский патент 2021 года по МПК C07K5/62 A61K38/05 A61P29/00 A61P25/24 

Область изобретения

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается нового применения линейного замещенного глипролина - этилового эфира N-фенилацетилглицил-L-пролина (ГЗК-111) - в качестве антидепрессивного и анальгетического средства.

Уровень техники

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, примерно 4-5% населения земного шара страдает депрессиями, при этом риск развития клинической депрессии составляет 15-20%. Депрессия является хроническим рецидивирующим заболеванием, причем повторные эпизоды возникают примерно у 60% больных (Ayso-Mateos JL et al. Br J Psychiatr. 2001; 179:308-16). Взаимное влияние хронической боли и депрессии хорошо изучено в популяционных исследованиях и на моделях клинических выборок первичного звена и специализированной медицинской помощи. Так, из 18980 обследованных в странах Европы у 4% обнаружены симптомы, отвечающие критериям DSM-IV, среди них 43,3% больных указывали на наличие, по крайней мере, одного симптома боли, тогда как среди не имевших признаков депрессивных расстройств на боль жаловались только 16,1% (Ohayon MM. J Clin Psychiatry. 2004; 65 suppl 12:5-9).

Согласно глутаматной гипотезе, при депрессии возникают нарушения в глутаматергической системе, в частности, затрагивающие АМРА-рецепторы, которые вовлечены в передачу быстрых возбуждающих сигналов в синапсах ЦНС, что подтверждается следующими фактами. Во-первых, мыши-нокауты по гену GluAl проявляют повышенную чувствительность к развитию депрессии (Chourbaji S et al. The FASEB J. 2008; 22 (9):3129-3134), во-вторых, антидепрессанты способны увеличивать экспрессию GluAl и GluA2 субъединиц АМРА-рецепторов в префронтальной коре и прилежащем ядре (Tan С.-Н et al. Exper. Br. Res. 2006; 170(4):448-456), и, наконец, модуляторы АМРА-рецепторов, повышающие функциональную активность указанных рецепторов, демонстрируют антидепрессивные свойства (Skolnick P. Biol. Psych. 2008; 63 (4):347-348). По данным фармакологических исследований, кетамин и ампакины, увеличивающие глутаматергическую передачу посредством активации АМРА-рецепторов, купируют симптомы депрессии на фоне хронической боли (Le AM et al. Anesthesiology. 2014; 121(5): 1080-1090), что подтверждает участие АМРА-рецепторов в регуляции депрессии, боли и депрессии в условиях хронической боли.

Известно, что BDNF играет одну из центральных ролей в патогенезе депрессии (Jiang С, Salton R. Transl Neurosci. 2013; 1: 46-58; Autry AE, Monteggia LM. Pharmacological Reviews. 2012; 2: 64: 238-258). Связывание BDNF с TrkB рецепторами способствует формированию долговременного потенцирования (long-term potentiation) и нейрогенезу de novo. Снижение содержания BDNF выявлено у пациентов, страдающих депрессивными расстройствами, и, наоборот, увеличение уровня BDNF зафиксировано у больных, прошедших успешную фармакотерапию антидепрессантами (Karege F et al. Psychiatry Res. 2002; 109 (2): 143-148; Boulle F et al. Mol. Psych. 2012; 17(6):584-596).

В результате многолетних фундаментальных исследований в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова был сконструирован предполагаемый пептидный прообраз классического ноотропного препарата пирацетама - цикло-L-пролилглицин (ЦПГ), который позднее был обнаружен в головном мозге крыс как эндогенное соединение (Гудашева Т.А. и соавт. Хим.-фарм. Ж. 1991; 6: 25:12-16; Gudasheva Т.А. et al. FEBS Letters. 1996; 391: 149-152). По данным фармакологических исследований, ЦПГ регулирует память и реакцию на эмоционально-стрессовое воздействие (Гудашева Т.А. и соавт. Бюлл. экспер. биол. и мед. 1999; 10 (128): 411-413; Гудашева Т.А. и соавт. Бюлл. экспер. биол. и мед. 2001; 5(131): 545-550; Середенин С.Б. и соавт. Бюлл. экспер. биол. и мед. 2002; 4 (133):417-419), обладает антигипоксическим (Колясникова К.Н. и соавт. Эксп. и клин. фармакол. 2012; 75: 9: 3-6), нейропротекторным (Поварнина П.Ю. и соавт. Бюл. экспер. биол. мед. 2015; 11: 160: 600-603), анальгетическим (Ferro JN et al. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2015; 42(12):1287-1295) и антидепрессивным действием (Абдуллина А.А. и соавт. Эксп. и клин. фармакол. 2018; 81(S):8). ЦПГ оказывает положительное модулирующее действие на глутаматные АМРА-рецепторы (Гудашева Т.А. и соавт. ДАН. 2016; 1(471):106-108) и стимулирует синтез мозгового нейротрофического фактора (brain derived neurotrophic factor, BDNF) (Гудашева Т.А. и соавт. ДАН. 2016; 4: 469:492-495).

В продолжение исследований сконструирован и синтезирован линейный замещенный глипролин - этиловый эфир N-фенилацетилглицил-L-пролина (соединение ГЗК-111), содержащий аминокислотную последовательность Gly-Pro с высокой долей цисоидной пептидной связи (Ovchinnikov YuA and Ivanov VT, 1975; Baldoni HA et al. J. Molec. Struct. (Theochem). 2000; 500: 97-111), которая способствует циклизации молекулы (Rydon HN et al. J. Chem. Soc. 1956; 3642-3650; Manabe S. et al. Med. Chem. Commun. 2013; 4: 792-796). Согласно выдвинутой гипотезе, соединение ГЗК-111 подвергается биотрансформации с образованием ЦПГ и проявляет спектр эффектов, характерный для последнего (Гудашева Т.А. et al. Хим.-фарм. журн. 2016; 11(50):3-8), что подтверждается фармакологическими исследованиями, доказавшими наличие в фармакологическом профиле ГЗК-111 ноотропной, анксиолитической, антигипоксической и нейропротекторной активности в диапазоне доз 0,1-1,5 мг/кг (Гудашева Т.А. и соавт. Хим.-фарм. журн. 2016; 11: 50:3-8; Колясникова К.Н. и соавт. Хим.-фарм. журн. 2018; 52(6): 13-17).

Нейропсихотропное действие метаболита ГЗК-111, ЦПГ, являющегося положительным модуляторов АМРА-рецепторов, предположительно реализуется по BDNF-ергическому механизму (Гудашева ТА и соавт. ДАН. 2016; 4: 469:492-495), что дает основание предположить наличие у ГЗК-111 антидепрессивной активности.

Ранее анальгетическая активность была показана в опытах in vivo для фрагмента АКТГ_4-10 (Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly) в дозе 0.5 мг/кг и его аналога семакса (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), при этом семакс проявлял более выраженную антиноцицептивную активность в диапазоне доз 0.015-0.5 мг/кг, по-видимому, за счет замены С-концевых аминокислотных остатков в АКТГ_4-10 на последовательность Pro-Gly-Pro (Ivanova DM et al. Bull Exp Biol Med. 2007; 143(1):5-8). Известно, что АМРА-рецепторы играют центральную роль в проведении болевых стимулов, при этом положительные аллостерические модуляторы АМРА-рецепторов ампакины проявляют анальгетические свойства (Sun Y et al. Behav Brain Res. 2017. 334:1-5). Согласно работам J.N. de Souza Ferro et al. (2015), ЦПГ увеличивает порог болевой реакции и обладает противовоспалительным действием, что может быть связано с его положительным модулирующим влиянием на глутаматные АМРА-рецепторы (Гудашева Т.А. и соавт. Доклады Академии наук. 2016; 1(471):106-108). Совокупность представленных данных позволяет предположить наличие анальгетических свойств у соединения ГЗК-111.

В настоящее время информация об антидепрессивных и анальгетических свойствах ГЗК-111, характерных для ЦПГ, отсутствует.

Сущность изобретения

Сущность изобретения состоит в применении ГЗК-111 в качестве антидепрессивного и анальгетического средства.

Цель изобретения - разработка новых антидепрессантов и анальгетиков. Эта цель была достигнута путем исследования фармакологических эффектов ГЗК-111 в опытах in vivo в тесте вынужденного плавания по Порсолту и в тесте «горячая пластина».

Техническим результатом изобретения является антидепрессивный и анальгетический эффекты ГЗК-111.

Животные. Эксперименты выполнены на белых беспородных мышах-самцах (n=160) с массой тела 18-20 г. и инбредных мышах-самцах линии С57В1/6 (n=50) с массой тела 18-22 г. (ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая»). Животных содержали по 15 особей в клетке стандарта Т/3 в условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (температура 21-23°С, относительная влажность воздуха 40-60%) при естественной освещенности и свободном доступе к воде и брикетированному корму в течение 10 суток до начала тестирования. Организация и проведение работ осуществлялись в соответствии с приказом Минздрава России №199 от 01 апреля 2016 года «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Животные содержались в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29 августа 2014 г. №51. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».

Препараты. ГЗК-111 (субстанция, синтезированная в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова») в дозах 0.01-20.0 мг/кг, внутрибрюшинно (в/б), вводили из расчета 0,1 мл/10 г веса животного. Животные контрольных групп получали воду для инъекций. В качестве препарата сравнения использовали классический трициклический антидепрессант амитриптилин, который разводили в воде и вводили в/б в дозе 10 мг/кг. Выбор дозы референтного препарата основан на данных литературы (Takamori K et al. Pharmacology. 2001; 3: 63: 147-53).

Методики

Для оценки антидепрессивной активности использовали тест «вынужденного плавания» по Порсолту (Porsolt R.D. et al. Eur. J. Pharmacol. 1978; 47: 379-391). Мышей помещали в цилиндры (высотой 30 см и диаметром 10 см), заполненные на две трети водой температурой 22°С на 5 мин, в течение которых оценивали время сохранения характерной позы иммобилизации (отказ от активно-оборонительного и исследовательского поведения). Поведение животных регистрировали с помощью видеокамеры. Видеозапись эксперимента обрабатывали в полуавтоматическом режиме с помощью программы RealTimer (ООО «НПК Открытая Наука»). Уменьшение длительности иммобилизации расценивали как проявление антидепрессивной активности.

Тест «горячая пластина» использовали для оценки ноцицептивной реакции. С помощью анальгезиметра «Ugo Basile» (Италия) регистрировали латентное время реакции (лизание задней лапы или прыжок). За 1-2 ч до начала опыта отбирали животных на основе базовой реактивности в условиях данной экспериментальной модели, исключая мышей, остававшихся на нагретой до 55±0.5°С пластине дольше 10 с. Латентный период в 20 с (максимальное время экспозиции) расценивали как 100% анальгезию. Фиксировали время появления реакции у мышей через 30, 60, 90 и 120 мин после однократного введения изучаемых препаратов. Полученные результаты выражали в виде максимально возможного эффекта (МВЭ) в %. МВЭ = (латентный период реакции после введения препарата минус фоновый латентный период реакции)/(максимальное время экспозиции минус фоновый латентный период реакции) X 100%

Статистика. Обработку полученных результатов производили при помощи Т-критерия Стьюдента. Критический уровень значимости α=0.05.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры

Пример 1. Получение ГЗК-111

Получение ГЗК-111

C₆H₅-CH₂-C(O)-Gly-OH. К раствору 7,5 г (100 ммоль) глицина в 25 мл 4 М NaOH при -10°С при интенсивном перемешивании прибавляли 13,24 мл (100 моль) фенилацетилхлорида и 25 мл 4 М NaOH. Далее реакционную смесь перемешивали при охлаждении в течение 30 мин, потом снимали внешнее охлаждение и экстрагировали примеси и непрореагировавший хлорангидрид этилацетатом (3×15 мл). Затем раствор подкисляли 4 М HCl до рН 2-3 по универсальному индикатору, выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой и высушивали на воздухе в течение суток. Получали 5,83 г (30%) N-фенилацетилглицина; т. пл. 143-144°С; Rf 0,8 (А). ПМР-спектр (ДМСО-d6+ CF3COOD) δ, м.д.: 3,47 (с, 2Н, CH₂Ar), 3,76 (д, J 6,0 Гц, 2Н, СН₂ Gly), 7,27 (м, 5Н, ArH), 8,40 (т, J 6,0 Гц, 1Н, NH Gly). (Young DW et al. Eur. J. Biochem. 1977; 75: 133-147) т. пл. 138-143°C.

H-L-Pro-OC₂H₅⋅HCl. К 60 мл абсолютного этанола, охлажденного до -20°С, прибавляли по каплям 2,54 мл (35 ммоль) тионилхлорида и порциями вносили 2,0 г (17,5 ммоль) L-пролина. Далее реакционную смесь перемешивали 2 ч при -5°С и 2 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляли в вакууме; эту операцию повторяли дважды, каждый раз добавляя 30 мл абсолютного этанола. Получали 2,4 г (77%) хлоргидрата этилового эфира L-пролина в виде масла. [α]23D -43° (с 3, этанол); Rf 0.75 (Б). ПМР-спектр (ДМСО-d6) δ, м.д.: 1,19 (м, 3H, CH₃CH₂O), 1,8-2,1 (м, 4Н, СγН₂ Pro, СβН₂ Pro), 3,2 (м, 2Н, СδН₂ Pro), 4,2 (м, 2Н, CH₃CH₂O), 4,5 (м, 1Н, CαH Pro), 9,9 (уш.с, 1Н, NH) (Назарова Л.С. И соавт. Хим.-фарм. журн. 1984; 18(12): 1445-1448), масло; [α]23D -44,8° (с 3,03, этанол).

C₆H₅-CH₂-C(O)-Gly-L-Pro-OEt (ГЗК-111). 1,93 г (10 ммоль) N-фенилацетилглицина растворяли в 10 мл сухого DMF. При -10°С при интенсивном перемешивании одновременно прибавляли 1,35 мл (10 ммоль) изобутилхлорформиата и 1,1 мл (10 ммоль) N-метилморфолина. После 2-3 мин перемешивания прибавляли по каплям раствор 1,79 г (10 ммоль) хлоргидрата этилового эфира пролина и 1,1 мл (10 ммоль) N-метилморфолина в 15 мл DMF. Реакционную смесь перемешивали 30 мин при -10°С, далее снимали внешнее охлаждение и перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Осадок отфильтровывали, фильтрат упаривали в вакууме, остаток растворяли в 25 мл CHCl₃, раствор последовательно промывали 3% NaHCO₃ (3×7 мл), водой (3×7 мл), 1 М раствором HCl (3×7 мл) и вновь водой (3×7 мл), высушивали над сульфатом натрия, осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали на роторном испарителе. Получали 2,87 г (90%) хроматографически гомогенного продукта в виде масла оранжевого цвета, кристаллизовали из смеси этилацетата и диэтилового эфира. т.пл. 111-112°С; [a]23D -90,0° (с 1, вода); Rf=0,80 (В). ПМР-спектр (ДМСО-d6) δ, м.д.: 1,2 (м, 3Н, CH₃CH₂O), 1,8-2,1 (м, 4Н, СγН₂ Pro, СβН₂ Pro), 3,5 (с, 2Н, CH₂ArH), 3,6 (м, 2H, СδН₂ Pro), 3,85-4,0 (2 д.д., J 17.6 Гц, J 5.6 Гц, 2Н, СαН₂ Gly), 4,2 (м, 2Н, CH₃CH₂O), 4,5 (д.д., J 4,0 Гц, J 8,5 Гц, 1Н, СαН Pro), 6,4 (уш. т, J 5,6 Гц, 1Н, NH), 7.3 (м, 5Н, ArH). Найдено, %: С 64,27; Н 7,05%; N 8,63. C₁₇H₂₂N₂O₄. Вычислено, %: С 64,13; Н 6,97; N 8,80.

Пример 2. Антидепрессивные свойства ГЗК-111

Эксперименты выполнены на беспородных мышах-самцах (n=160). ГЗК-111 в интервале доз 0.01-20 мг/кг, внутрибрюшинно (в/б) в водном растворе вводили мышам ежедневно в течение 7 дней или 14 дней. Контрольные животные получали в том же режиме воду для инъекций. В первой серии опытов оценивали антидепрессивное действие ГЗК-111 в дозах 0,1; 0,5; 1,0 и 5,0 мг/кг при 7-дневном введении, во второй серии - в дозах 0,01; 5,0; 10,0 и 20,0 мг/кг при 7-дневном введении, а в третьей серии - 0,1; 1,0 и 10,0 мг/кг и 10,0 мг/кг перорально при 14-дневном введении. В каждой группе было по 10 мышей.

Установлено, что суммарное время иммобилизации у контрольных животных составляло в среднем 235,8 с в первом эксперименте, 275,3 с во втором эксперименте и 180,1 с в третьем эксперименте. При 7-дневном введении ГЗК-111 в дозе 10 мг/кг статистически значимо уменьшал время иммобилизации на 11% (табл. 1), эффект ГЗК-111 по выраженности был сопоставим с действием амитриптилина в дозе 10 мг/кг. При 14-дневном введении ГЗК-111 обладал достоверным антидепрессивным эффектом в дозе 10 мг/кг, и ГЗК-111 проявлял тенденцию к снижению времени иммобилизации в дозе 10 мг/кг (р=0.08) при парентеральном введении и в дозе 10,0 мг/кг (р=0.06) при пероральном введении (табл. 2).

Таким образом, в стандартном тесте для оценки депрессивного поведения выявлена дозо-зависимая антидепрессивная активность ГЗК-111, в наибольшей степени проявляющаяся в дозе 10 мг/кг при парентеральном 7-дневном и 14-дневном введении. Отмечена тенденция к сохранению антидепрессивной активности в максимально эффективной дозе 10,0 мг/кг при пероральном 14-дневном введении.

Пример 3. Анальгетические свойства ГЗК-111

Эксперименты выполнены на инбредных мышах-самцах линии С57В1/6 (n=50) ГЗК-111 в дозах 0.5, 1.0, 2.0 и 4.0 мг/кг, в/б, вводили однократно из расчета 0,1 мл/10 г веса животного за 30 минут до начала тестирования в первой точке времени. Животные контрольных групп получали воду для инъекций.

Средний базовый уровень ноцицептивной реакции для мышей С67В1/6 в тесте «горячая пластина» составил 6,7±0,4 с. Животные с латентным периодом реакции более 10 с в эксперимент не включались.

При моделировании острой соматической боли установлено, что через 30 мин после введения препарата пороги болевой реакции в опытных группах не отличались от контрольной, выраженный анальгетический эффект развивался через 60 мин после системного введения ГЗК-111 в дозах 1.0 и 2.0 мг/кг (р<0.05) и через 60 и 120 мин - в дозах 2.0 и 4.0 мг/кг (р<0.05) (фиг. 1). Максимально выраженный антиноцицептивный эффект ГЗК-111 проявлялся в дозе 2.0 мг/кг через 60 мин после введения. Полученные данные свидетельствуют о том, что ГЗК-111 дозо-зависимо проявлял анальгетическую активность, начиная с 60-й мин по 120-ю мин наблюдений, статистически значимо (р<0.01, р<0.05) увеличивал порог болевой реакции у мышей в тесте «горячая пластина» (фиг. 1).

Таким образом, впервые показаны центральные анальгетические свойства ГЗК-111 при моделировании острой соматической боли на супраспинальном уровне.

Описание чертежей

Фиг. 1 Влияние ГЗК-111 на изменения порога болевой реакции при термическом раздражении у мышей C57BL/6

По оси абсцисс - время развития эффекта после введения препарата (мин),

по оси ординат - максимально возможный эффект (МВЭ), %.

Экспериментальные группы:

«Контроль» - белый столбец;

"ГЗК-111 в дозе 0.5 мг/кг" - светло серый столбец;

"ГЗК-111 в дозе 1.0 мг/кг" - серый столбец;

"ГЗК-111 в дозе 2.0 мг/кг" - темно серый столбец;

"ГЗК-111 в дозе 4.0 мг/кг" - черный столбец.

* - р<0.05, ** - р<0.01 - статистически значимо по отношению к соответствующему контролю, согласно Т-критерию Стьюдента, число животных в группах n=10; данные представлены в виде средних значений (mean).

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается нового применения известного линейного замещенного глипролина - этилового эфира N-фенилацетилглицил-L-пролина (ГЗК-111) в качестве анальгетического средства. Установлено, что N-фенилацетилглицил-L-пролин обладает как антидепрессивным, так и анальгетическим действием. 1 ил., 2 табл., 3 пр.

Применение замещенного глипролина - этилового эфира N-фенилацетилглицил-L-пролина (ГЗК-111) в качестве средства, обладающего анальгетической активностью.