Способ детекции антител в биоматериале с использованием стеклянных микроструктурных волноводов Российский патент 2021 года по МПК G01N21/17 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии определения специфических антител с использованием стеклянных микроструктурных волноводов с полой сердцевиной (СМВ ПС) в качестве оптических иммуносенсоров, и касается способа детектирования в исследуемом образце присутствия анализируемых антител в режиме реального времени. Изобретение может быть использовано в разработке экспрессных способов учета иммунных комплексов и создании чувствительных, селективных и стабильных бесферментных сенсоров для прямой детекции антител и антигенов, а также множества биомолекул и их коньюгатов.

В настоящее время наблюдается высокая степень востребованности в медицине и ветеринарии систем экспрессного определения системы антиген-антитело, а также необходимость совершенствования существующих методов серодиагностики [Nakano S., Tsukimura Т., Togawa Т., Ohashi Т., Kobayashi М., Takayama К.., Kobayashi Y., Abiko H., Satou M., Nakahata Т. Rapid immunochromatographic detection of serum anti-α-galactosidase A antibodies in fabry patients after enzyme replacement therapy. 2015 PloSOne. V. 10, №6. P. e0128351]. Для выявления в биоматериале как антигенов инфекционного агента, так и специфических антител к ним широко используют иммунохимические тест-системы. Наиболее распространенными методиками традиционно остаются иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноагглютинация. Параллельно развивается технология анализа сложных биологических систем с помощью биологических микрочипов (биочипов). Востребованным аналитическим инструментом являются биологические микрочипы, содержащие упорядоченно размещенные биомолекулярные зонды, прикрепленные к поверхности носителя, такого как стекло, пластик, металл, и др. В работе [Уткин Д.В., Киреев М.Н., Гусева Н.П., Каплун Г.А., Куклев В.Е., Осина Н.А. Разработка биологического микрочипа для выявления антител к антигенам возбудителя чумы. 2019. Инфекция и иммунитет. Т. 9(2), 393-398] описан состав белкового иммуночипа, который содержит нескольких антигенных маркеров, что позволяет выявить больший процент сероконверсии, чем при использовании иммуноферментного анализа.

В патенте RU 2528099 предложен биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител в сыворотке крови человека, содержащий массив дискретно нанесенных и иммобилизованных на поверхности подложки О-антигенов V. cholerae и холерного токсина, сгруппированных в отдельные зоны. Изобретение обеспечивает проведение параллельного иммунологического анализа нескольких образцов сыворотки крови человека на наличие противохолерных антител к широкому спектру антигенов возбудителя холеры с определением иммуноглобулинов класса G и М за короткое время. К недостаткам метода можно отнести необходимость использования иммунофлуоресцентной метки и видоспецифичных вторичных антител и многоэтапность выполнения анализа.

В большинстве экспериментальных работ, посвященных исследованию связывания антигена с антителом, традиционно определяется равновесная характеристика – константа равновесия комплекса антиген-антитело. Гораздо реже используется кинетический подход, хотя он и более информативен. Это связано с методическими трудностями в получении и анализе кинетических кривых. В последние годы с разработкой новых методов исследования появляется все больше работ, посвященных изучению кинетики образования комплексов антиген-антитело. Наиболее распространенным методом исследования кинетики связывания антигена с антителом на поверхности одиночных клеток является проточная цитометрия [Schulz A.R., Baumgart S., Schulze J., Urbicht M., Grützkau A., Mei H.E. Stabilizing Antibody Cocktails for Mass Cytometry 2019 Cytometry A. №95(8), 910-916]. К недостаткам метода можно отнести сложность технического оборудования и необходимость специальной подготовки пробы: ее метят специальными флуоресцирующими красителями (флуорохромами).

Совершенствование инструментальных средств серодиагностики в значительной степени опирается на развитие концепции биосенсоров – портативных устройств, привлекающих своей мобильностью, доступностью, дешевизной и предназначенных для скрининга биологически важных компонентов, в т.ч. антител. Подавляющее число работ, направленных на создание биосенсоров, посвящено электрохимическим методам регистрации сигнала [Higson S. Biosensors for medical applications. 2012 Woodhead Publishing Limited. 337 p.]. Они обладают рядом преимуществ, таких как низкие затраты на изготовление, простота конструкции, надежность измерения, достигаемые низкие пределы обнаружения и небольшие операционные объемы. Последнее особенно важно при анализе биологических проб [Tian K., Prestgard М., Tiwar A. A review of recent advances in nonenzymatic glucose sensors. 2014. Materials Science and Engineering V. 41. P. 100-118]. Недостатки электрохимических биосенсоров связаны с температурной и временной нестабильностью применяемых биохимических рецепторов, их высокой стоимостью, а также с необходимостью введения в анализируемый раствор дополнительных реагентов и сигналообразующих веществ.

Оптические методы регистрации, как и электрохимические, в основном детектируют иммунные комплексы с использованием вторичных антител, меченных наночастицами коллоидного золота [Спицын А.Н., Уткин Д.В., Киреев М.Н., Шарапова Н.А., Ерохин П.С., Германчук В.Г., Кочубей В.И. Оптическая регистрация образования иммунных комплексов с использованием наночастиц коллоидного золота. 2018. Оптика и спектроскопия. Т. 125. №5. С. 716-720]. Описаны биологический сенсор, а также способ создания биологического сенсора на основе использования поверхностного плазмонного резонанса (патент RU 2527699), относящегося к оптическому явлению. Метод позволяет проводить анализ взаимодействий в режиме реального времени посредством регистрации свойств и изменений свойств исследуемого вещества на матрице. Данный метод обладает возможностью безметочного биодетектирования, то есть без использования радиоактивных или флуоресцентных меток. Недостатками метода плазмонного резонанса являются сложность создания многослойной структуры для избирательного химического взаимодействия только с определенными биологическими молекулами анализируемого вещества, оптические помехи и необходимость применения фотоприемников.

Наиболее перспективным, на наш взгляд, является создание чувствительных, селективных и бесферментных оптических сенсоров для прямой детекции антител и антигенов. Одним из таких примеров является способ (патент RU 2315313), по которому определение аутоантител осуществляют по изменению частоты колебаний пьезокварцевого резонатора на основе объемно-акустических волн. Недостатком данного метода является трудоемкость, многоэтапность и длительность проведения анализа.

В патенте WO 2013090177 раскрыты способы оптической фильтрации с использованием SPPC-резонатора с каплевыми резонаторами.

Известен способ безметочного множественного зондирования аналитов, биосенсинга и диагностического анализа (патент US 20130005604).

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, не выявил сведения о способах детекции иммунных комплексов, в частности антител, с помощью биосенсоров на основе стеклянных микроструктурных волноводов с полой сердцевиной (СМВ ПС).

Задача изобретения заключается в разработке способа, позволяющего в короткие сроки с высокой точностью определять наличие антител в биологическом материале с использованием мультифункциональной сенсорной платформы на основе микроструктурных волноводов, объединяющих функции микро- и нано- реактора и преобразователя оптического сигнала, в режиме реального времени на стандартном оборудовании для измерения спектров пропускания СМВ ПС без дополнительных затрат на дополнительное оборудование и трудовые ресурсы.

Технический результат заключается в реализации указанного назначения.

Технический результат достигается способом детекции антител в биоматериале с использованием стеклянных микроструктурных волноводов, который предусматривает получение оптического иммуносенсора путем введения реакционной смеси со специфическим антигеном и анализируемого образца в структурную оболочку стеклянного микроструктурного волновода (СМВ ПС) с последующим определением наличия антител по разнице положения локальных максимумов спектра пропускания образца в режиме реального времени сразу и по истечении 1 минуты после заполнения смесью специфического антигена и анализируемого раствора, содержащего искомые антитела к данному антигену. Смещение положения максимумов линейно зависит от количества образовавшихся комплексов антиген-антитело. Для регистрации спектров сравнения используют излучение от источника белого света, которое по оптоволоконному кабелю подается на микрообъектив, закрепленный на юстировочной трехкоординатной подвижке. С помощью микрообъектива происходит фокусировка излучения и создание фокусного пятна малого диаметра для ввода излучения строго в полую сердцевину образца СМВ ПС.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

СМВ ПС помещают в специальную одноразовую кювету, которая при помощи трехкоординатной юстировочной подвижки располагается так, чтобы торец волновода находился точно в фокусе микрообъектива. Таким образом, пучок излучения вводится именно в полую сердцевину волновода. Излучение, выходящее из полой сердцевины СМВ ПС, собирается вторым микрообъективом и подается на вход оптоволоконного кабеля спектр-анализатора, напрямую связанного с компьютером.

Затем в структурную оболочку СМВ ПС вводят специфически-связующиеся вещества: водный раствор антигена в концентрации 5-15 мкг/мл и раствор анализируемой сыворотки крови. Для количественного определения специфических антител в стандартных иммунологических методиках используют геометрический ряд разведений аналита (сывороток крови). Оптимальное разведение сыворотки, содержащее в своем составе специфические антитела, в среднем составляют 1:100-1:800 [Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля, пер. с нем. А.П. Тарасова. 1987. М.: Медицина. 472 с.].

Оптический спектр зондирует связывание аналитов в массиве структурной оболочки СМВ ПС, образующих множество аналит-чувствительных устройств. Таким образом увеличивается площадь (объем) измерения и пропускная способность иммуносенсора на основе СМВ ПС. По мере образования комплексов антиген-антитело измеряют новые положения локальных максимумов спектра пропускания модифицированного образца и осуществляют построение линейной зависимости положения локального максимума от количества образованных комплексов антиген-антитело. Типичный спектр пропускания СМВ ПС представлен на Фиг. 1. Пики пропускания полученного спектра трансформируются и смещаются в длинноволновую либо в коротковолновую область, меняя свою интенсивность по мере образования комплексов антиген-антитело (Фиг. 2). В структурной оболочке анализируемые антитела, если они содержатся в опытных образцах, избирательно связываются со специфическими для аналита антигенными молекулами, в результате чего происходит смещение или падение длины волны, что приводит к изменению положения и формы локальных максимумов полосы в спектре пропускания образца СМВ ПС (Фиг. 3). В контрольных образцах, не содержащих анализируемые антитела, специфической реакции не происходит и изменения формы локальных максимумов в спектре пропускания образца СМВ ПС не детектируются (Фиг. 4). На положение и интенсивность максимумов влияют несколько характеристик вещества, помещаемых в структурную оболочку, а именно: показатель преломления, поглощение, рассеяние и пропускание самого волновода. При образовании комплексов антиген-антитело прежде всего начинает увеличиваться рассеяние излучения в полой сердцевине СМВ ввиду того, что молекула комплекса увеличивается в размерах и в соответствии с этим начинает падать интенсивность. Это наглядно демонстрируется на Фиг. 3 и Фиг. 4. Кроме того, характеристические пики пустого волновода трансформируются ввиду изменения показателя преломления сердцевины. Так, в пустом волноводе каналы априори заполнены воздухом с показателем преломления 1, при попадании жидкости, например воды, показатель преломления 1,33 количества пиков уменьшается и их полуширина увеличивается (синяя, отдельно стоящая кривая на Фиг. 3 и Фиг. 4).

Пример 1.

Для осуществления способа детекции антител в исследуемых образцах, согласно заявляемому изобретению, берется водный раствор молекул антигена (водный раствор белка F1 из вакцинного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, в концентрации 5 мкг/мл), смешивают с исследуемыми образцами (в данном примере это опытные образцы сывороток от людей, иммунизированных вакциной чумной живой (ВЧЖ), а также контрольные образцы сывороток от людей контрольной группы, ранее не вакцинированных против чумы и не имеющих контакта с возбудителем или переносчиком этого заболевания), разведенные фосфатно-солевым буфером (PBS) в соотношении 1:320. Анализируемые антитела, если они присутствуют в указанном образце, взаимодействуют с указанным антигеном с образованием комплексов, содержащих антигенную молекулу – анализируемое антитело. Для детекции присутствия указанных комплексов, с получением показателя присутствия анализируемых антител в указанном образце, его вносят в структурную оболочку СМВ ПС. Детекцию проводят в режиме реального времени без применения средств мечения образующихся комплексов антиген-антитело, с использованием излучения (от широкополосного источника, светодиода, суперконтинуумного источника), соединенного с СМВ ПС. В структурной оболочке СМВ ПС анализируемые антитела, если они содержатся в опытных образцах, избирательно связываются со специфическими для аналита антигенными молекулами, в результате чего происходит изменение положения и формы локальных максимумов в спектре пропускания образца СМВ ПС (Фиг. 3). В контрольных образцах, не содержащих анализируемые антитела, специфической реакции не происходит и изменения формы локальных максимумов в спектре пропускания образца СМВ ПС не детектируются (Фиг. 4).

Пример 2.

Специфичность способа детекции антител в исследуемом образце, согласно изобретению, определяли по взаимодействию молекул антигена с диагностическими сыворотками против антигенов чумы, холеры и туляремии. Для этого смесь молекул антигена (водный раствор белка F1 из штамма Yersinia pestis EV в концентрации 5 мкг/мл) и препарата одной из указанных сывороток, разведенных PBS до диагностического титра согласно инструкции, вносили в структурную оболочку СМВ ПС. Детекцию проводили в режиме реального времени, без применения средств мечения образующихся комплексов антиген-антитело, с использованием излучения (от широкополосного источника, светодиода, суперконтинуумного источника), соединенного с СМВ ПС. Специфичность способа подтверждали детекцией антител только в смеси молекул антигена с препаратом диагностической сыворотки против антигенов чумы. В структурной оболочке СМВ ПС анализируемые антитела, содержащиеся в диагностической сыворотке против антигенов чумы, избирательно связывались с молекулами белка F1, о чем свидетельствовало изменение положения максимумов, изменение формы спектра и падение интенсивности пропускания образца СМВ ПС, заполненного указанной смесью (Фиг. 5). В образцах СМВ ПС, содержащих смесь молекул белка F1 и препарата сыворотки против антигенов холеры, либо препарата против антигенов туляремии, не содержащих анализируемые антитела, специфической реакции не происходило и изменения положения максимумов, изменения формы спектра и падение интенсивности пропускания образца СМВ ПС не происходило (Фиг. 6, 7).

Способ, согласно изобретению, может частично осуществляться вручную или автоматически. Детекция антител, согласно изобретению, может быть частично автоматизированной, с использованием подходящего сенсорного оборудования и/или компьютеризованной обработки и/или оценки первичных сигналов.

Сравнительный анализ и преимущества заявляемого способа с наиболее распространенными современными иммунологическими методами детекции антител приведены в таблице.

Таблица

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу детектирования антител. Способ детекции антител в биоматериале с использованием стеклянных микроструктурных волноводов включает получение оптического иммуносенсора путем введения реакционной смеси анализируемого образца с антигеном в полую сердцевину стеклянного микроструктурного волновода с последующим определением антител по положению локальных максимумов спектра пропускания образца, в режиме реального времени, до и после заполнения смесью антигена и анализируемого раствора, содержащего искомые антитела к данному антигену. Техническим результатом является возможность определять наличие антител в биологическом материале с высокой точностью в режиме реального времени. 7 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ детекции антител в биоматериале с использованием стеклянных микроструктурных волноводов характеризуется тем, что предусматривает получение оптического иммуносенсора путем введения реакционной смеси анализируемого образца с антигеном в полую сердцевину стеклянного микроструктурного волновода с последующим определением антител по положению локальных максимумов спектра пропускания образца, в режиме реального времени, до и после заполнения смесью антигена и анализируемого раствора, содержащего искомые антитела к данному антигену.