Способ газохроматографического определения метиловых эфиров жирных кислот в крови человека Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 A61K35/14 

Изобретение относится к медицине, биохимии, в частности, способ предназначен для газохроматографического исследования по определению состава насыщенных, мононенасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот в крови человека методом внутренней нормализации.

Уникальная роль липидов осуществляется на уровне клеточных мембран. В связи с этим о тяжести липидных нарушений, имеющих патогенетическое значение в развитии различных заболеваний, дает представление изучение липидного матрикса клетки. Структурную основу мембран клеток составляют фосфолипиды и входящие в их состав жирные кислоты (Антонюк М.В., Шестопалов Е.Ю., Горборукова Т.В. Методологические и методические подходы оценки состояния липидного обмена при заболеваниях внутренних органов // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2006. - №. 23. - С. 59-61). По данным ряда авторов, содержание жирных кислот в крови свидетельствует о состоянии жирового обмена у человека в норме и при различных патологических состояниях, которые могут служить биомаркероми, ранних стадий развития различных патологий (Эндакова Э.А., Новгородцева Т.П., Светашев В.И. Модификация состава жирных кислот крови при сердечно-сосудистых заболеваниях. - Владивосток: Дальнаука, 2002. 296 с.; Астафьева О.В. и др. Современные представления о роли жирных кислот в диагностике сердечно-сосудистых заболеваний (обзор) // Сибирский научный медицинский журнал. - 2021. - Т. 41. - №. 4. - С. 1-11). Расширение диапазона определяемых жирных кислот в крови человека позволяет не только изучить многообразные метаболические пути жирных кислот, обеспечивающие развитие патологических состояний, но и имеет большое теоретическое и практическое значение, так как позволяет выявить механизмы развития патологии и способствовать обоснованности и эффективности лечебно-диагностических и профилактических мероприятий.

Для определения жирных кислот был предложен способ газохроматографического исследования липидов крови (Синяк К.М., Оргель М.Я., Крук В.И. Метод приготовления липидов крови для газохроматографического исследования // Лабораторное дело. - 1976. - №1. - С. 37-41), включающий экстрагирование липидов хлороформ-метанольной смесью, гидролиз и метилирование липидов на водяной бане при 80°С в течение 20 минут, последующего проведения газохроматографического анализа полученных метиловых эфиров жирных кислот на газовом хроматографе "Цвет-110" с пламенно-ионизационным детектором. Анализ проводится на стеклянной колонке с неполярной неподвижной фазой 1% SE-30 на хромосорбе DMCS при температуре термостата колонки с программированием от 120 до 240°С.

Основными недостатками данного аналога являются: сложность и сравнительно большая продолжительность исследования, и недостаточно информативный перечень определяемых жирных кислот (не более 9 наименований с недостаточным разделением С 18:2), трудности в их количественном подсчете.

Известен способ определения жирных кислот по методу: Машковской С.В., Котловского Ю.В., Гехман А.Г., Котловского М.Ю., Машковского Д.В., Гребенниковой В.В. (Патент РФ №2237245, опубл. 27.09.2004 г.), включающий обработку крови хлороформ-метанольной смесью в соотношении 2:1, гидролиз и метилирование липидов во влажной камере в течение 6 часов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим растворителем в течение 30 мин в присутствии гексана и дистиллированной воды, высушивание в токе азота и проведение газохроматографического разделения жирных кислот с помощью неподвижной полярной фазы 20% диэтиленгликольсукцината на хроматоне N-AW-DMCS при температуре термостата стеклянной колонки 180°С.

Основными недостатками данного аналога являются: сложность и сравнительно большая продолжительность исследования (не менее 7 часов) и недостаточно информативный перечень наименований определяемых жирных кислот (не более 16).

Также известен способ Машковской С.В., Новицкого В.В., Карпова Р.С., Котловского М.Ю., Чикун Н.В.., Васильевой И.В., Котловского Ю.В. (Патент РФ 2298793, опубл. 10.05.2007 г.), включающий обработку крови смесью хлороформа и метанола в соотношении 2:1, проведение гидролиза и метилирования липидов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С в течение 3 часов, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим раствором, сушку в токе азота и проведение газохроматографического определения и разделения жирных кислот на полярной жидкой фазе 20% диэтиленгликольсукцинатом, покрывающей поверхность колонки длиной 50 м с внешним диаметром 0,32 мм, при температуре колонок в хроматографическом шкафу 140°С.

Основными недостатками данного аналога являются: сложность и сравнительно большая продолжительность исследования (не менее 5 часов) и недостаточно информативный перечень наименований определяемых жирных кислот (не более 16).

Аналогом-прототипом является способ, описанный Филоновым В.П. («Методика газохрохроматографического определения жирных кислот и холестерина в продуктах питания и сыворотке крови» Республика Беларусь МВИ.МН 1364-2000), основанный на выделении липидов продуктов питания и сыворотки крови экстракцией органическими растворителями, растворении отфильтрованного сухого липидного экстракта в 5-10 мл гексана и выпаривании на ротационном испарителе при температуре 40°С, метанолизе метиловых эфиров в 2 мл гексанового раствора со стандартами метиловых эфиров жирных кислот, высушивании материала в сушильном шкафу при температуре 102±2°С в течении одного часа и гидролизе, с последующим встряхиванием полученной смеси с целью разделения гексанового слоя, хроматографировании 5 мкл верхнего гексанового слоя и количественном определении методом внутреннего стандарта с использованием градуировочного графика, выражающего зависимость отношений площадей пиков метиловых эфиров жирных кислот к внутреннему стандарту от концентрации соответствующих жирных кислот.

Основными недостатками прототипа являются сложность и сравнительно большая продолжительность процедуры приготовления нескольких градуировочных смесей и внутренних стандартов с добавлением образцов исследуемой сыворотки, проведения калибровки хроматографа градуировочными смесями жирных кислот, общей продолжительностью всех процедур исследования (не менее 7 часов); недостаточно информативный перечень наименований определяемых жирных кислот (не более 10); трудоемкость процесса повторной калибровки хроматографа при проведении процедуры внутрилабораторного оперативного контроля каждой стандартной смесью метиловых эфиров жирных кислот.

Эти недостатки не дают возможности получения конкретного технического результата - повышение эффективности способа.

Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что основными недостатками известных способов являются: сложность и сравнительно большая продолжительность исследования (от 5 до 8 часов) и недостаточно информативный перечень наименований определяемых жирных кислот (от 9 до 16), трудоемкость процесса калибровки хроматографа каждой стандартной смесью метиловых эфиров жирных кислот от С_4:0 до С_24:1.

Технический результат заявленного способа достигается тем, что пробу плазмы или сыворотки крови предварительно обезвоживают однократно в вакууме на водяной бане ротационного испарителя при температуре 75-79°С в течение 20 минут, затем сушат в сушильном шкафу в течении 20 минут, высушенную жировую пленку растворяют в 2 мл гексана и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут, после 15 минутного отстаивания проводят газохроматографическое исследование 1 мл супернатанта образца на 100 метровой капиллярной кварцевой колонке с высокополярной неподвижной фазой CR-Sil 88 FAME, после этого определяют массовую долю индивидуальных жирных кислот методом внутренней нормализации.

Предлагаемое изобретение направлено на повышение эффективности, заключающееся в сокращении сроков проведения процедур и этапов исследования (не более 3 часов), снижении затрат на приобретение всего одной стандартной смеси метиловых эфиров, ускорении по времени процесса калибровки хроматографа методом внутренней нормализации и повышении информативности определяемых жирных кислот (не менее 20 наименований). Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Все результаты количественного определения жирных кислот в крови человека заявленным способом всегда были индивидуальными и колебались от 23 до 37 наименований в одном образце в диапазоне от 0,03 до 50%. Количество жирных кислот в одном образце крови менее диапазона 0,03% колебалось от 1 до 14 наименований жирных кислот.

Данный способ апробировали на 70 образцах крови человека (26 мужчин, 44 женщины), определяли достоверность полученных результатов каждого образца и проводили их сравнение с количественными референсными значениями (табл. 1, фиг. 1, 2). В ходе исследования рассчитывали индекс соотношений омега-6 к омега-3 жирных кислот, и был равен отношению суммы всех жирных кислот омега-6 к сумме всех жирных кислот омега-3 (табл. 2). Одним из этапов разработки способа явился подбор условий выполнения процедур экстрагирования, метанолиза и гидролиза.

Ниже приводятся примеры апробации способа.

Пример 1. Газохроматографическое определение метиловых эфиров жирных кислот проводят в плазме и сыворотке крови человека. Для исследования взвешивают 2,0 г с точностью до 0,01 г анализируемого вещества (сыворотки крови из пробирок с активатором свертывания и разделительным гелем, плазмы - из пробирок с этилендиаминуксусной кислотой) и гомогенизируют в фарфоровой ступке с 30 - 35 г безводного сернокислого натрия в течение 15 минут. Из полученной смеси экстрагируют общие липиды крови 30 мл бинарной смеси хлороформ - этанол в соотношении 2:1. Экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр, оставшуюся в колбе пробу повторно экстрагируют 30 мл экстракционной смеси растворителей также 15 минут и снова отфильтровывают в колбу с первой порцией фильтрата. Таким образом операцию экстракции повторяют 3 раза. Затем пробу упаривают досуха на водяной бане ротационного испарителя при температуре 45°С в течение 20 минут. После упаривания всего экстракта остаток в колбе сушат в сушильном шкафу при температуре 102±2°С в течении часа. Колбу охлаждают до комнатной температуры и растворяют сухой липидный экстракт в 1,9 мл гексана с добавлением 0,1 мл метанольного раствора 2 моль/дм³ метилата натрия. Полученную смесь подвергают гидролизации на шейкере, после чего отбирают верхний гексановый слой. Выделенный экстракт метиловых эфиров жирных кислот крови вводят дозирующим устройством (1-3 мкл) в испаритель газового хроматографа «Хроматэк-Кристалл-5000.2» с пламенно - ионизационным детектором, применяя установленную в термостат хроматографа 100 метровую капиллярную кварцевую колонку с высокополярной неподвижной фазой CR-Sil 88 FAME (70% - цианопропилполисилфенилен - силоксаном 100 м*0,25 мм*0,25 мкм), для разделения полиненасыщенных, мононенасыщенных и насыщенных жирных кислот. Количественное определение массовой доли индивидуальных жирных кислот (37 наименований) проводят методом внутренней нормализации (площади всех 37 пиков жирных кислот принимаем за 100%) с применением сертифицированного стандартного образца (смеси) с указанием метрологической прослеживаемости результатов исследования.

В результате определения жирных кислот в крови 26 мужчин и 44 женщин, в возрасте от 35 до 75 лет, количество жирных кислот всегда индивидуальное и колеблется от 13 до 37 наименований в одном образце в диапазоне от 0,03 до 50%. Количество жирных кислот в одном образце крови менее диапазона 0,03% колеблется от 1 до 24 наименований жирных кислот (табл. 1 и табл. 2). При анализе жирных кислот в крови, определяемых не менее 3 раз в одном образце расхождение определяемых компонентов при хроматографировании параллельных проб, отличалось более чем на 2-5%, что является не допустимым.

Пример 2. Условия эксперимента как в примере 1, только после гомогенизации экстракцию общих липидов крови из полученной смеси проводят 90 мл бинарной смеси хлороформ - этанол в соотношении 2:1. Экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр и упаривают пробу в вакууме на водяной бане ротационного испарителя при температуре 75°С в течение 20 минут. В сушильном шкафу остаток в колбе сушат 20 минут при температуре 102±2°С. Колбу охлаждают до комнатной температуры и растворяют сухой липидный экстракт в 1,9 мл гексана, после добавляют 0,1 мл метанольного раствора 2 моль/дм³ метилата натрия и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут. Исключают этап гидролизации, полученную смесь отстаивают 15 минут и хроматографируют верхний гексановый слой.

В результате определения жирных кислот в крови 26 мужчин и 44 женщин, в возрасте от 35 до 75 лет, количество жирных кислот всегда индивидуальное и колеблется от 20 до 37 наименований в одном образце в диапазоне от 0,03 до 50%. Количество жирных кислот в одном образце крови менее диапазона 0,03% колеблется от 1 до 17 наименований жирных кислот (табл. 1 и табл. 2). При определении метиловых эфиров жирных кислот в 3-х параллельных пробах одного образца расхождение определяемых компонентов при хроматографировании не отличалось более чем на 1%, следовательно, было достоверным.

Пример 3. Условия эксперимента как в примере 2, только этап обезвоживания в вакууме на водяной бане ротационного испарителя проводили при температуре 79°С.

В результате определения жирных кислот в крови 26 мужчин и 44 женщин, в возрасте от 35 до 75 лет, количество жирных кислот всегда индивидуальное и колеблется от 23 до 37 наименований в одном образце в диапазоне от 0,03 до 50%. Количество жирных кислот в одном образце крови менее диапазона 0,03% колеблется от 1 до 14 наименований жирных кислот (табл. 1 и табл. 2, фиг. 1 и 2). При анализе достоверности определения метиловых эфиров жирных кислот в 3-х параллельных пробах одного образца отмечалось допустимое расхождение определяемых компонентов не более чем на 0,5%.

Анализ приведенных примеров показывает, что наиболее стабильные результаты достигаются при условиях экстракции общих липидов крови из полученной смеси 90 мл бинарной смеси хлороформ - этанол, обезвоживания в вакууме на водяной бане ротационного испарителя при температуре 75-79°С, выдерживания пробы в сушильном шкафу в течении 20 минут и центрифугирования после метанолиза (примеры 2, 3). В примерах 2 и 3 исключают этап гидролизации полученной смеси, заменяя его отстаиванием пробы в течение 15 минут перед хроматографированием верхнего гексанового слоя. Результаты этих двух примеров идентичны и достоверны.

Таким образом, предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение эффективности способа, а именно: позволяет значительно сократить сроки проведения подготовки пробы и свести к минимуму затраты на используемое оборудование путем изменения процедур экстрагирования и метанолиза; расширение нижнего диапазона чувствительности до 0,03% и общего спектра выхода жирных кислот до 37 наименований индивидуальных жирных кислот за счет использования одной стандартной смеси жирных кислот; упрощение исследования благодаря исключению этапа гидролиза и проведения калибровки хроматографа методом внутренней нормализации.

Авторами предложен новый, никем ранее незаявленный способ при сочетании нескольких приемов для экстрагирования жирных кислот крови человека, а именно: изменение процедур экстрагирования и метанолиза; использование эталона в виде стандартной смеси метиловых эфиров жирных кислот из 37 компонентов, исключение этапа гидролиза и проведения калибровки хроматографа методом внутренней нормализации, что является существенным отличием в подходе к определению метиловых эфиров жирных кислот в крови человека, и именно это отличие позволило получить положительный эффект в виде значительного упрощения и сокращения сроков определения жирных кислот в пробе венозной крови, а также расширения спектра выхода жирных кислот до 37 наименований и чувствительности определения их в анализируемом объеме крови.

Предлагаемый способ также может быть рекомендован для использования в научных и клиническо-диагностических лабораториях системы здравоохранения.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ газохроматографического определения метиловых эфиров жирных кислот в крови человека. Способ включает экстрагирование, метанолиз и хроматографическое определение массовой доли индивидуальных жирных кислот, и отличается тем, что пробу плазмы или сыворотки крови предварительно обезвоживают однократно в вакууме на водяной бане ротационного испарителя при температуре 75-79°С в течение 20 минут, затем сушат в сушильном шкафу в течении 20 минут, высушенную жировую пленку растворяют в 2 мл гексана и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут, после 15-минутного отстаивания проводят газохроматографическое исследование 1 мл супернатанта образца на 100 метровой капиллярной кварцевой колонке с высокополярной неподвижной фазой CR-Sil 88 FAME. Изобретение расширяет арсенал способов газохроматографического определения метиловых эфиров жирных кислот в крови человека. 2 ил., 2 табл., 3 пр.

Способ газохроматографического определения метиловых эфиров жирных кислот в крови человека, включающий экстрагирование, метанолиз и хроматографическое определение массовой доли индивидуальных жирных кислот, отличающийся тем, что пробу плазмы или сыворотки крови предварительно обезвоживают однократно в вакууме на водяной бане ротационного испарителя при температуре 75-79°С в течение 20 минут, затем сушат в сушильном шкафу в течение 20 минут, высушенную жировую пленку растворяют в 2 мл гексана и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут, после 15-минутного отстаивания проводят газохроматографическое исследование 1 мл супернатанта образца на 100-метровой капиллярной кварцевой колонке с высокополярной неподвижной фазой CR-Sil 88 FAME, после этого определяют массовую долю индивидуальных жирных кислот методом внутренней нормализации.