Слитый белок, содержащий модифицированный безметиониновый белок GroEL и димер полипептида полифемузина I Российский патент 2021 года по МПК C07K1/00 C07K19/00 

Изобретение относится к области биохимии, а именно, к получению димера полипептида полифемузина из организма L. polyphemus слитого с модифицированным белком GroEL из микроорганизма Т. thermophilus. Может быть использовано в фармакологической промышленности с целью получения изолированных стабилизированных белков, биосинтез которых затруднен или невозможен, либо их физико-химические свойства не позволяют выделить и получить синтезированные белки в очищенном и активном виде.

Создание слитых белков - распространенный метод, часто использующийся для биосинтетического получения целевых рекомбинантных пептидов и белков. Его суть заключается в создании конструкции, содержащей белок-носитель (например, тиоредоксин, мальтоза-связывающий белок, глютотион-S-трансфераза и многие другие [2, 5, 6, 8]) и целевой белок.

Если есть необходимость получить целевой белок в чистом виде, без белка-носителя, применяют дополнительные стадии обработки полученного конечного белкового конструкта: обработка высокоспецифичными протеазами (например, энтерокиназой человека или TEV-протеазой), либо химическое расщепление, специфичное к определенной аминокислоте (как обработка бромцианом натрия, специфичного к остаткам метионина).

Семейство белков-шаперонов GroEL выглядит привлекательным как белок-носитель для системы слитых белков [1]. Данный шаперон представляет собой большую частицу, состоящую из двух гептамеров. Полость, образованная протомером, вмещает белковый субстрат. GroEL является хорошо изученным шапероном, его структура и функционирование подробно описаны [3, 4]. Обычно одна молекула белкового субстрата связывается с одним протомером GroEL; что касается всей частицы, обычно между двумя протомерами при связывании субстратного белка наблюдается отрицательная кооперативность. Общая полость, образованная внутри гептамера, достаточна для размещения достаточно большого субстратного белка [7, 9]. Кроме того, молекулярные шапероны семейства GroEL являются необходимыми для выживания любого организма, в том числе и микроорганизмов, и присутствуют также у микроорганизмов, адаптированных к экстремальным условиям функционирования, в частности к высоким температурам. GroEL таких микроорганизмов отличается чрезвычайно высокой термостабильностью структуры и функциональностью при повышенных температурах. Термостабильный GroEL может быть использован в качестве белка-носителя в слитых системах с целью упрощения очистки целевых пептидов от внутриклеточных белков.

Присоединение дополнительных аминокислотных последовательностей к N- или С-концу молекулы GroEL, погруженных в белковую глобулу, может повлиять и сильно дестабилизировать третичную и четвертичную структуры. Так, например, некоторые результаты исследований показывают, что размещение 6His-tag дестабилизирует исходную структуру частиц GroEL и что очистка His-tagged GroEL происходит с низкой эффективностью. Анализ кристаллической структуры мономера GroEL с разрешением 2,8 показывает, что каждая субъединица имеет три домена. В большинстве организмов GroEL имеет сложную четвертичную структуру, состоящую из двух колец по семь мономеров в каждом, и стабилизированную кольцом из семи мономеров кофактора GroES (фиг. 1).

Для успешного использования шаперонов в качестве белков-носителей должны быть разработаны их формы, которые могли бы адекватно функционировать в качестве белков-носителей. Для точечного расщепления белков возможно использованием бромциана натрия, специфичного к остаткам метионина. При наличии метионина между белком-носителем и целевым полипептидом, такая связь гидролизуется бромцианом, что позволяет выделять целевой полипептид. Как правило, в любом белке присутствуют остатки метионина в составе полипептидной цепи, поэтому при наличии в белке-носителе остатков метионина он также будет гидролизоваться бромцианом, давая набор полипептидов, которые будут затруднять выделение целевого продукта. Замена остатков метионина в белке-носителе на другие аминокислотные остатки, позволяет избежать действия на него бромциана натрия, и таким образом упростить процедуру очистки целевых пептидов. В состав полипептидной цепи мономера GroEL входит 6 остатков метионина [6], достаточно равномерно распределенных вдоль полипептидной цепи. Это делает затруднительным использование бромциана натрия, в силу того, что пришлось бы выделять целевой полипептид среди большого числа пептидов, близких по размерам и физико-химическим свойствам. Привлекательным подходом является замена остатков метионина на другие аминокислотные остатки, что делает белок нечувствительным к указанному химическому реагенту. Необходимым условием использования такого подхода, т.е. замены остатков метионина, является сохранение структуры и функциональности белка-носителя, в данном случае частицы GroEL.

Полипептид полифемузин I, выделенный из гемоцитов краба вида L. polyphemus, является одним из наиболее активных пептидов с антимикробной активностью (АМП), применяющихся в качестве антибиотиков. Данный пептид длинной 18 аминокислот стабилен в виде структуры с двумя амфифильными антипаралельными β-структурами, соединенными дисульфидным мостиком (фиг. 2). Он обладает высоким сродством к липосахаридам, и его минимальная ингибирующая концентрация составляет 2 мкг/мл. Предполагается, что свои антибиотические свойства АМП наиболее активно проявляют в олигомерных формах. В связи с этим создание димера полипептида полифемузина представляется перспективным вариантом для увеличения его антибиотической активности.

Задача изобретения состоит в том, чтобы получить модифицированный безметиониновый белок GroEL, стабильный и высокоэкспрессируемый в клетке-хозяине, не подвергающийся протеолизу и содержащий в кодирующей части полилинкер, и слитый с ним в области полилинкера димер полипептида полифемузина.

Технический результат изобретения достигается тем, что на первом этапе работы создается безметиониновый конструкт шаперона GroEL микроорганизма Т. thermophilus, с помощью изменения кодирующей последовательности ДНК GroEL. Все триплеты последовательности ATG, кодирующие остатки метионина в положениях Met164, Met209, Met286, Met314, Met489, Met541, заменяли на последовательности CTG, кодирующие остатки лейцина. Частица GroELS обладает высокой молекулярной массой (более 850 кДа), что технологически упрощает выделение конструкта из клеточного лизата методами гель-фильтрации и ультрафильтрации. Использование шаперона термофильного микроорганизма, кроме того, позволяет проводить первую стадию очистки с помощью тепловой денатурации эндогенных белков мезофильной бактерии.

На втором этапе работы создается конструкт на основе безметиониновой версии шаперона GroEL, с помощью изменения кодирующей последовательности ДНК GroEL - между кодонами по положениям Ser199 и Tyr201 интегрировали полилинкер с последовательностью GGATCCAAGCTTGAATTC. Эта последовательность содержит рестрикционные сайты BamHI, HindIII и EcoRI и соответствует транскрипции Gly-Ser-Lys-Leu-Glu-Phe. Анализ третичной структуры мономера GroEL показывает, что аминокислотные остатки Ser199 и Tyr201 расположены на субстрат-связывающей поверхности апикального домена GroEL, но не входят в состав жестких структур, образующих субстрат-связывающую поверхность. В стабильной частице GroELS аминокислотные остатки Ser199 и Tyr201 находятся на поверхности, обращенной внутрь полости частицы (фиг. 3), что делает возможным последующее использование модифицированного белка в качестве белка-носителя в слитых конструктах с целевым пептидом.

На третьем этапе создается конструкт на основе модифицированной безметиониновой версии шаперона GroEL с интеграцией последовательности димера полифемузина, содержащей между мономерами короткий линкер GGTAGCGGC, в область полилинкера по сайтам BamHI / EcoRI. Последовательность полифемузина была оптимизирована для использования в E.coli. В последовательность димера были введены кодоны для двух остатков Met, непосредственно фланкирующих вставку, чтобы сделать возможным химическое отщепление целевого пептида: ATGCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTATCGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCGGTAGCGGCCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTATCGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCATG. Нуклеотидная последовательность димера была получена методом секвенирования. Праймеры для клонирования были сконструированы таким образом, что полученная опследовательность димера имел готовые липкие концы для клонирования по сайтам BamHI / EcoRI полилинкера, введенного в ген GroEL.

Полученный слитый белок после всех проведенных этапов не должен изменять нативную конформацию, должен оставаться стабильным и хорошо растворимым.

Существенными признаками, характеризующими изобретение, в отличие от исходной версии белка, является использование модифицированной термостабильной, безметиониновой версии шаперона GroEL микроорганизма Т. thermophilus. с наличием полилинкера; и использование в качестве целевого пептида - димера полифемузина. Экспрессия конечного слитого белка была высокоэкспрессивной, не подверженной протеолизу, с нейтрализацией любой пептидной цитотоксичности.

Предложенный способ поясняется следующими материалами:

В качестве первого шага все кодоны, кодирующие остатки метионина, были заменены теми, которые кодируют остатки лейцина. GroEL из Т. thermophilus (RefSeq assembly: GCF_000091545.1; GenBank: AP008226.1) имеет шесть остатков Met в своей последовательности в положениях Met164, Met209, Met286, Met314, Met489, Met541 (инициаторный Met отщепляется во время полипептидного синтеза, как это происходит почти для всех белков); ген, кодирующий GroEL, со всеми кодонами ATG, кодирующими Met, замененными на кодоны CTG, кодирующие Leu, получали методом ПЦР пар праймеров SeqID №1-10.

Реакцию проводили в следующих условиях: Pfu-буфер 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH₄)SO₄, 10mM KCl, 0.1% Triton Х-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-полимеразы, 10пкмоль каждого праймера, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.

Комбинационную ПЦР проводили со праймерами SeqID№11-12. Реакцию проводили в следующих условиях: Pfu-буфер 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH₄)SO₄, 10mM KCl, 0.1% Triton Х-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-полимеразы, 10пкмоль каждого праймера, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты. Схема метода представлена на фиг. 3. В результате получали ген безметионинового варианта GroEL, заканчивающийся стоп-кодоном ТАА и фланкированный рестрикционными сайтами NdeI и BglII.

На втором шаге проводили введение полилинкера в конструкцию гена GroEL. Небольшой полилинкер, содержащий BamHI, HindIII и EcoRI, вводили для клонирования в ген между триплетами, кодирующими аминокислоты Ser199 и Tyr201. На первой стадии два сегмента желаемой генной конструкции отдельно амплифицировали с использованием в качестве матрицы не содержащей метионина последовательности GroEL. Первый фрагмент амплифицировали с использованием праймеров SeqID№15-16, второй с использованием праймеров SeqID№17-18. Реакции проводили в следующих условиях: Pfu buffer 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH₄)SO₄, 10mM KCl, 0.1% Triton X-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-polymerase, 10pmol each primers, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.

Фрагменты очищали методом агарозного гель-электрофореза в 1% агарозном геле в 1× буфере ТБЕ, очищали фрагмент с помощью набора для очистки ДНК из геля «QIAEX II Gel Extraction Kit».

Комбинационная амплификация с использованием очищенных фрагментов, полученных на предыдущей стадии, в виде матриц и двух праймеров SeqID№15 и SeqID№18, продуцировала нуклеотидную последовательность гена, кодирующую GroEL с полилинкером. Реакцию проводили в следующих условиях: Pfu buffer 1×(20mM Tris-HCl pH=8.8; 10mM (NH₄)SO₄, 10mM KCl, 0.1% Triton X-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-polymerase, 10pmol each primers, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.

Фрагмент очищали методом агарозного гель-электрофореза в 1% агарозном геле в 1× буфере ТБЕ с помощью набора для очистки ДНК из геля «QIAEX II Gel Extraction Kit».

Далее клонировали полученный фрагмент GroEL с интегрированным целевым полилинкером в полилинкер экспрессирующего бицистронного вектора pETDuet™-1 Novagen, Merck Millipore вместе с геном, кодирующим Т. thermophilus GroES. Лигирование проводили в следующих условиях: Ligation buffer 1×(40mM Tris-HCl pH=7.9, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 0.5mM ATP), 20нг плазмиды, 1:5 молярном соотношении вектор-вставка, 2ед.а. лигазы по Вейсу. Лигирование проводили при 22° в течение 1 часа, что дает экспрессирующий вектор ploop/ES.

На третьей стадии последовательность димера полифемузина с линкером между двумя мономерами была оптимизирована для использования в E.coli, и в нее были введены кодоны для двух остатков Met, непосредственно фланкирующих вставку, чтобы сделать возможным химическое отщепление целевого пептида: ATGCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTATCGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCGGTAGCGGCCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTATCGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCATG. Нуклеотидная последовательность димера была получена методом секвенирования.

Данная нуклеотидная подследовательность, кодирующая димер полипептида полифемузина, была клонирована в полученную плазмиду ploop/ES в область полилинкера по сайтам BamHI / EcoRI. Гибридизация проводилась при 94°С с использованием двух олигонуклеотидов: Di-phemu-for: 5'GATCCATGCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTATCGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCGGTAGCGGCCGTCGCTGGTGCTTTCGTGTGTGCTAT CGCGGCTTTTGCTATCGTAAATGCCGCATGG3' и Di-phemu-rev: 5'AATTCCATGCGGCATTTACGATAGCAAAAGCCGCGATAGCACACACGAAAGCACCAGCGACGGCCGCTACCGCGGCATTTACGATAGCAAAAGCC GCGATAGCACACACGAAAGCACCAGCGACGCATG3'. Праймеры были сконструированы таким образом, что полученный димер полифемузина имел готовые липкие концы для клонирования по сайтам BamHI / EcoRI полилинкера, введенного в ген GroEL. Бицистронный векторный конструкт был расщеплен рестрикционными ферментами BamHI и EcoRI, и в него клонирован полученный фрагмент димера полифемузина по сайтам BamHI / EcoRI. Рестрикцию вектора ploop/ES проводили в следующих условиях: 1× буфер для BamHI и EcoRI (50mM Tris-HCl рН=7.5, 10mM MgCl₂, 100mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA), по 5 ед.а. каждого фермента BamHI и EcoRI, 50нг ДНК. Рестрикцию проводили при 37° в течение 16 часов. Лигирование полученного линейного вектора ploop/ES и последовательности димера полифемузина проводили в следующих условиях: Ligation buffer 1×(40mM Tris-HCl pH=7.9, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 0.5mM ATP), 20нг плазмиды, 1:5 молярном соотношении вектор-вставка, 2ед.а. лигазы по Вейсу. Лигирование проводили при 22° в течение 1 часа.

Все результаты процедур клонирования были подтверждены секвенированием.

Экспрессия генов в экспрессионном штамме E.coli pLysE осуществлялась в среде LB, при 37°С в течение 3 часов; селективный агент - ампициллин 200 мкг / мл (фиг. 4).

Для очистки целевого белка проводили лизис с помощью френчпресса в буфере PBS(0.137M NaCl, 0.0027М KCl, 0.01М Na₂HPO₄, 0.0018M KH2PO4) при 4°. Далее разбавляли в 5 раз буфером PBS с последующим прогреванием клеточного лизата при 62°С в течение 5 мин на водяной бане, и далее центрифугировали при 13000g в течение 15 мин (фиг. 5).

Очистку в обращенных фазах проводили на колонке Symmetry300 С4 (3,9 × 150 мм, 5 мкм, Waters) в системе вода / ацетонитрил в присутствии 0,1% TFA. Белки элюировались в градиенте ацетонитрила. Фракции, содержащие GroEL с димером полифемузина лиофилизировали перед обработкой CNBr.

Реакцию химического расщепления проводили в течение ночи при комнатной температуре в 70% муравьиной кислоте в воде, концентрация CNBr составляла 50 мг / мл. Реакцию терминировали путем замораживания при -70°С; образцы лиофилизировали и повторно растворяли в подходящих растворах для хроматографии в обращенных фазах на колонке С18 или для электрофореза.

Отделение димера полифемузина проводили на колонке Symmetry 300 С18 (4,6 × 150 мм, 5 мкм, Waters), градиент ацетонитрила от 0 до 60% (в присутствии 0,1% TFA) в течение 30 мин, скорость потока 1 мл / мин. Фракции, содержащие димер, лиофилизировали перед использованием для масс-спектрометрии и теста на антибактериальную активность.

Гель-фильтрационную хроматографию для определения размера комплекса GroELS проводили на колонке Tricorn 10/300, заполненной Sephacryl S-400, в PBS, скорость потока составляла 1 мл / мин. Колонку калибровали с помощью набора для калибровки гель-фильтрационных колонок HMW (GE Healthcare). Голубой декстран (около 2000 кДа, исключенный объем), который по размеру соответствует нашим ожиданиям 14-mer GroELS, элюируется через 16 минут, BSA (MW 67 кДа, соответствует мономеру GroEL) в 19,5 мин, а соли через 22 мин.

Лиофилизированный димер полифемузина повторно растворяли в PBS в разных концентрациях. Концентрацию измеряли по оптической плотности при 280 нм. Клетки МС1061 (не экспрессионный штамм E.coli) выращивали при 37°С до OD600 0,4, затем разбавляли до 10⁶ клеток / мл в среде LB и добавляли различные количества полифемузина. Затем клетки выращивали в течение ночи при 37°С и устанавливали минимальную концентрацию полифемузина, которая полностью ингибировала рост клеток.

Пример 1 - получение высокоэкспрессируемого в клетке-хозяине модифицированного безметионинового белка GroEL, не подвергающегося протеолизу и содержащего в кодирующей части полилинкер, и слитый с ним в области полилинкера белок полифемузин.

Стадия 1

Получение безметионинового белка GroEL.

Провести ПЦР с использованием пар праймеров SeqID№l-10 в следующих условиях: Pfu-буфер 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH₄)SO₄, 10mM KCl, 0.1% Triton Х-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-полимеразы, 10пкмоль каждого праймера, 10нг геномной ДНК Т. thermophilus по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.

Провести комбинационную ПЦР с праймерами SeqID№11-12 в следующих условиях: Pfu-буфер 1x(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10тМ (NH₄)SO₄, 10mM KCl, 0.1% Triton Х-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-полимеразы, 10пкмоль каждого праймера, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.

Фрагмент очистить методом агарозного гель-электрофореза в 1% агарозном геле в 1× буфере ТБЕ с помощью набора для очистки ДНК из геля «QIAEX II Gel Extraction Kit».

Стадия 2

Клонирование полилинкера внутрь последовательности безметионинового белка GroEL.

Отдельно амплифицировать с использованием в качестве матрицы ДНК полученный фрагмент с использованием двух пар праймеров: SeqID№15-16 и SeqID№17-18. Реакцию провести в следующих условиях: Pfu buffer 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH₄)SO₄, 10mM KCl, 0.1% Triton X-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-polymerase, 10pmol each primers, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.

Фрагменты очистить методом агарозного гель-электрофореза в 1% агарозном геле в 1× буфере ТБЕ с помощью набора для очистки ДНК из геля «QIAEX II Gel Extraction Kit».

Провести комбинационная амплификацию с использованием очищенных фрагментов, полученных на предыдущей стадии, в виде матриц и двух праймеров SeqID№15 и SeqID№18 в следующих условиях: Pfu buffer 1×(20mM Tris-HCl рН=8.8; 10mM (NH₄)SO₄, 10mM KCl, 0.1% TritonX-100 v/v, 0.1mg/ml BSA), 1.2u Pfu-polymerase, 10pmol each primers, по следующей схеме ПЦР: 94° 3 минуты, 40 циклов (94° 40 сек, 60° 40 сек, 72° 2 минуты), 72° 3 минуты.

Фрагмент очистить методом агарозного гель-электрофореза в 1% агарозном геле в 1× буфере ТБЕ с помощью набора для очистки ДНК из геля «QIAEX II Gel Extraction Kit».

Стадия 3

Клонирование безметионинового белка GroEL с целевым полилинкером в бицистронный вектор pETDuet™-1 Novagen, Merck Millipore.

Клонировать фрагмент GroEL с интегрированным целевым полилинкером, полученным на стадии 2, в полилинкер экспрессирующего бицистронного вектора pETDuet™-1 Novagen, Merck Millipore вместе с геном, кодирующим Т. thermophilus GroES. Лигирование проводить в следующих условиях: Ligation buffer 1×(40mM Tris-HCl pH=7.9, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 0.5mM ATP), 20нг плазмиды, 1:5 молярном соотношении вектор-вставка, 2ед.а. лигазы по Вейсу. Лигирование проводить при 22° в течение 1 часа.

Стадия 4

Клонирование димера полифемузина в вектор pETDuet™-1 Novagen, Merck Millipore, содержащий фрагмент GroEL с интегрированным целевым полилинкером, по сайтам BamHI и EcoRI, находящимся в целевом полилинкере.

Рестрикцию вектора провести в следующих условиях: 1× буфер для BamHI и EcoRI (50mM Tris-HCl рН=7.5, 10mM MgCl₂, 100mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA), по 5 ед.а. каждого фермента BamHI и EcoRI, 50нг ДНК, при 37° в течение 16 часов.

Лигирование полученного линейного вектора и последовательности димера полифемузина провести в следующих условиях: Ligation buffer 1×(40mM Tris-HCl pH=7.9, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 0.5mM ATP), 20нг плазмиды, 1:5 молярном соотношении вектор-вставка, 2ед.а. лигазы по Вейсу, при 22° в течение 1 часа.

Стадия 5

Получение клеток-продуцентов, синтезирующих целевой слитый белок.

Химически компетентные клетки штамма E.coli pLysE в объеме 50 мкл разморозить на льду, затем добавить 5 мкл лигазной смеси, полученной на стадии 7, и инкубировать 30 минут на льду. Затем провести термический шок при 42°в течение 30 сек с последующим инкубированием на льду в течение 5 минут. Далее к трансформантам добавить 1 мл среды SOC, предварительно нагретой до 37°, и инкубировать в течение 1 часа при постоянном покачивании в термостате-качалке. Далее 20 мкл проинкубированной смеси рассеить на чашки с твердой питательной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Выращивать колонии в течение ночи при 37°. Далее провести аналитическую экспрессию по индивидуальным клонам, с индуктором 0.4 мМ ИПТГ.

Пример 2 - обработка бромцианом и получение целевого белка - димера полифемузина

Стадия 1

Осадить клетки центрифугированием в течение 15 минут при 4000 g. К осадку клеток добавить летучий буфер (10мМ ацетат аммония рН 7,5). Лизировать клетки ультразвуком (мощность 20%, 6 раз по 10 сек с перерывом 20 сек), полученный раствор центрифугировать 15 мин при 4° и 15000g.

Стадия 2.

Супернатант после стадии 1 подвергнуть ультрафильтрации. Собрать с фильтра целевой белок (задержится благодаря большой молекулярной массе). Полученный раствор высушить до состояния порошка с использованием лиофильной сушилки.

Стадия 3.

К сухому осадку добавить 700 мкл муравьиной кислоты, затем 50 мг CNBr и 300 мкл воды, проводить реакцию в течение 8 ч в фольге при комнатной температуре. Для остановки реакции заморозить пробу при -70°. После заморозки лиофилизировать с использованием лиофильной сушилки.

Стадия 4.

Для идентификации белка провести масс-спектрометрию полученного сухого осадка.

Пример 3 - установка минимальной ингибирующей концентрации

Стадия 1

Нарастить жидкую культуры клеток E.coli неэкспрессионного штамма МС1061 в 1 л питательной среды LB при 37°С до OD600 0,4. Рассчитать количество клеток по оптической плотность, развести до концентрации 1*10⁶ клеток в 1 мл, разлить в пробирки по 1 мл полученной культуры.

Стадия 2

Приготовить последовательные двукратные разведения димера полифемузина со следующими конечными концентрациями (мкг на мл культуральной жидкости, содержащей 1*10⁶ клеток): 40 мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 0,6 мкг/мл, 0,3 мкг/мл. Внести в пробирки с культуральной жидкостью образец разведения в соответствующей концентрации (по три повтора на каждое разведение), для контроля реакции в три пробирки с культуральной жидкостью не вносить ничего.

Стадия 3

Инкубировать полученные образцы в течение ночи при 37°. Провести оценку наименьшей концентрации, при которой не наблюдался рост микроорганизмов (минимальная ингибирующая концентрация).

1. Alexey N. Fedorov*, and Maria S. Yurkova Molecular Chaperone GroEL - toward a Nano Toolkit in Protein Engineering, Production and Pharmacy // NanoWorld Journal. 2018. №1 (4). C. 8-15.

2. Bell M.R. [и др.]. To fuse or not to fuse: what is your purpose? // Protein Science: A Publication of the Protein Society. 2013. №11 (22). C. 1466-1477.

3. Horwich A.L. [и др.]. Two families of chaperonin: physiology and mechanism // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007. (23). С. 115-145.

4. Horwich A.L., Fair G.W., Fenton W.A. GroEL-GroES-mediated protein folding // Chemical Reviews. 2006. №5 (106). C. 1917-1930.

5. Kapust R.B., Waugh D.S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused // Protein Science: A Publication of the Protein Society. 1999. №8 (8). C. 1668-1674.

6. Riggs P., La Vallie E.R., McCoy J.M. Introduction to expression by fusion protein vectors // Current Protocols in Molecular Biology / Edited by Frederick M. Ausubel … [et Al.]. 2001. (Chapter 16). C. Unit 16.4A.

7. Saibil H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation//Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2013. №10 (14). C. 630-642.

8. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Applied Microbiology and Biotechnology. 2003. №5 (60). C. 523-533.

9. Thirumalai D., Lorimer G.H. Chaperonin-mediated protein folding // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 2001. (30). C. 245-269.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к созданию нового слитого белка, содержащего полипептид полифемузина I из L Polyphemus и модифицированный шаперон GroEL из микроорганизма T.thermophilys. Новый белок может быть использован в фармацевтической промышленности для получения изолированных стабилизированных белков, биосинтез которых затруднен или невозможен, либо их физико-химические свойства не позволяют выделить и получить синтезированые белки в очищенном и активном виде. Новый белок представляет собой модифицированный безметиониновый белок GroEL, стабильный, не подвергающийся протеолизу, содержащий в кодирующей части между кодонами Ser199 и Tyr201 полилинкер, и слитый с ним в области полилинкера полипептид полифемузина I, высокоэкспрессируемый в клетке-хозяине. 3 ил., 3 пр.

Слитый белок для биосинтеза изолированного стабилизированного белка, содержащий модифицированный безметиониновый белок GroEL, имеющий в кодирующей части полилинкер и слитый с ним в области полилинкера димер полипептида полифемузина I, имеющего 39 аминокислот, в котором два полипептида полифемузина I, имеющего 18 аминокислот следующей последовательности RRWCFRVCYRGFCYRKCR, связаны линкером GSG, высокоэкспресируемый в клетке-хозяине.