Способ изменения адсорбции микроорганизмов Российский патент 2021 года по МПК C12N1/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к модулированию жизненного цикла микроорганизмов. Изобретение охватывает способ изменения адсорбции микроорганизмов, включая следующие штаммы микроорганизмов (паспортизированные и приобретенные из официальных коллекций):

- Candida albicans (Номер ВКПМ Y-3108);

- Escherichia coli (Номер ВКПМ В-6645);

- Staphylococcus aureus subsp. Aureus (Номер ВКПМ В-6646).

Изобретение может быть использовано для блокирования образования биопленок указанных микроорганизмов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рецептор D-маннозы (ген CD206) представляет собой С-лектин, который в основном присутствует на поверхности макрофагов, фибробластов и кератиноцитов [1]. Рецептор CD206 распознает «открытые» остатки D-маннозы, N-ацетилглюкозамина и фукозы на гликанах поверхности патогенных микроорганизмов. Тем самым рецептор D-маннозы опосредует уничтожение таких микроорганизмов как Candida albicans [2] Escherichia coli и Staphylococcus aureus subsp. Aureus поддерживает врожденный и приобретенный иммунитет [3].

Бактерии имеют фимбрии (также известные как «пили» или «ворсинки»). Фимбрии - нитевидные белковые структуры, расположенные на поверхности бактерий. Длина фимбрий варьирует от долей мкм (т.е. долей от размера бактерии) до 20 мкм (~20 размеров бактерий), а диаметр - от 2 до 11 нм (сопоставимо с диаметром глобулярных белков). Фимбрии осуществляют адгезию бактерий к различным поверхностям, в том числе к клеткам тканей, и участвуют в формировании бактериальных биопленок. При колонизации эпителия бактериальные фимбрии и расположенные на них адгезины фактически «сканируют» поверхности на наличие «открытых» остатков D-манноза-содержащих полисахаридов.

Вирулентность бактерий зависит от многих генетических факторов, которые в основном обеспечивают повышенную адгезию бактерий к слизистой: гены, кодирующие белки фимбрий (гены pil, pap, FimH, FedF и др.) [4]; ген curli fimbria (csgA), связанный с образованием бактериальной биопленки [5]; гены, кодирующие гемагглютинин (draA, draB, draC, draD) [6]; и др. Например, уропатогенный штамм UTI89 содержин ген, кодирующий адгезии FimH, расположенный на окончаниях фимбрий. Структура каждого белка-адгезина приспособлена к адсорбции на поверхностях соответствующих тканей. Энтеротоксигенные клинические изоляты Escherichia coli 107/86 и att25 содержат гены, кодирующие другие фимбриальные адгезины (FedF, F17a-G и др.). Присутствие дополнительных генов, кодирующих факторы вирулентности, усиливает патогенное воздействие штамма. При наличии одного фактора вирулентности формируется цистит; двух, трех и более факторов вирулентности - пиелонефрит и простатит. Одни сочетания факторов вирулентности избирательно способствуют развитию пиелонефрита или простатита, другие сочетания - циститу, а третьи - бессимптомной бактериурии [7].

Например, результаты экспериментов направленных на изучение образования биопленок перечисленных выше микроорганизмов показали связь образования биопленок с риском заболевания циститом. Так например образование биопленок, обусловленной наличием гена рар (кодирует адгезии Р-фимбрий), были положительным у 73,8% пациентов с острым пиелонефритом и только у 4% пациентов с острым циститом. Этот результат подтверждает главную роль штаммов, несущих адгезины рар, в патогенезе острого пиелонефрита [8]. Патогенные штаммы Escherichia coli при остром бактериальном простатите и при острых мочевых инфекциях включают гены фимбрии-1 (ген pil), Р-фимбрии (ген рар), афимбриального адгезина AFA-I (ген afal) и аэробактина (ген aer) [9]. Анализ 2010 изолятов уропатогенных бактерий показал, что только 10% содержат ген рар. Только изоляты, содержащие Escherichia coli (956 изолятов, т.е. 48%), оказались Р-фимбрированными (22% от всех изолятов Escherichia coli). В случаях необструктивного острого пиелонефрита 100% заражающих бактерий содержали Р-фимбрии [10].

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Уровни D-маннозы в крови, моче, слизи и в других средах организма существенно влияют на образование биопленок бактерий на поверхности слизистой оболочке тканей. Предотвращая адсорбцию патогенных штаммов кишечной палочки и других бактерий (шигеллы, Pseudomonas aeruginosa, лейшмании, микобактерии), D-манноза способствует профилактике бактериальных заболеваний и в том числе острого и хронического цистита.

Действие D-маннозы на бактерии связано с воздействием на фимбрии бактерий (также известных как или «ворсинки»). Фимбрии - нитевидные белковые структуры, расположенные на поверхности бактерий. Длина фимбрий варьирует от долей мкм (т.е. долей от размера бактерии) до 20 мкм (~20 размеров бактерий), а диаметр - от 2 до 11 нм (сопоставимо с диаметром глобулярных белков). Фимбрии осуществляют адгезию бактерий к различным поверхностям, в том числе к клеткам тканей, и участвуют в формировании бактериальных биопленок. При колонизации эпителия бактериальные фимбрии и расположенные на них адгезины фактически «сканируют» поверхности на наличие «открытых» остатков D-манноза-содержащих полисахаридов.

Исследование адсорбции штаммов уропатогенных Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus subsp методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) проводили на упрощенных модельных системах на основе пленок из золота и восстановленного оксида графита (rGO). Эти модельные поверхности обрабатывали различными органическими лигандами: полиэтил енимином (PEI), поли4-стиролсульфонатом натрия (PSS), D-маннозой и лактозой путем погружения в соответствующие водные растворы. Было установлено, что уропатогенный штамм Escherichia coli UTI89, несущий адгезии FimH, максимально адсорбируется на поверхностях, обработанных именно D-маннозой. Ингибиторы адгезина FimH на основе D-маннозы эффективно блокируют адгезию бактерий на уроэпителиальных клетках и, кроме того, противодействуют инвазии и образованию биопленок.

Образование биопленок на поверхности слизистой оболочки, опосредованная фимбриями бактерий (в частности, D-манноза-связывающими фимбриями типа 1 - ген FimH и др.), является важным условием для развития ИМП. Если в моче присутствует повышенное количество D-маннозы, то молекулы D-маннозы, взаимодействуя с FimH и с другими адгезинами фимбрий, будут блокировать образование биопленок уропатогенных бактерий к мукозе уротелия. У пациенток с ИМП концентрации D-маннозы в моче достаточно низки и составляют 2,6-108,7 мкг/мл, у большинства - менее 20 мкг/мл [33]. Низкие уровни D-маннозы у пациенток с ИМП делают необходимым насыщение мочи экзогенной D-маннозой для эффективной профилактики цистита. D-манноза (1 г/сут, 2 нед) эффективна при лечении острого цистита (n=50). После завершения терапии D-маннозой состояние пациенток достоверно улучшалось (повышение среднего балла по шкале симптоматики цистита UTISA; р<0,05). Прием D-маннозы в течение 6 мес был ассоциирован с существенным снижением рецидивов цистита (4,5%; контрольная группа - 33,3%) без каких-либо побочных эффектов.

В клиническом исследовании группы женщин с рецидивирующим циститом (n=308) все участницы прошли стартовую терапию острой стадии цистита ципрофлоксацином (1000 мг/сут, 1 нед). Затем группа пациенток была рандомизирована на прием 2 г/сут D-маннозы, 50 мг/сут нитрофурантоина - одного из самых эффективных антибиотиков для терапии цистита или плацебо в течение 6 мес. В течение 6-месячного периода наблюдения рецидивы цистита были зарегистрированы у 98 из 308 (32%) пациенток. Частота рецидивов цистита была значительно выше в группе плацебо (60%) по сравнению с группами, получавшими нитрофурантоин (20%) или D-маннозу (15%). В целом, пациентки, принимавшие D-маннозу, характеризовались значительно более низким риском рецидивов цистита (ОШ 0,24; 95% ДИ=0,15-0,39; р=0,0001). Сравнительная оценка безопасности применения D-маннозы и нитрофурантоина в исследовании показала, что пациенты, получавшие D-маннозу, характеризовались в 3 раза более низким риском побочных эффектов (ОР 0,27; р=0,0001). При этом единственным побочным эффектом применения D-маннозы являлась легкая диарея (у 8 из 130 пациентов; 7,8%). В то же время побочные эффекты при применении нитрофурантоина наблюдали у 29 из 103 (27%) пациентов, которые включали диарею (10%), тошноту (5,8%), ощущение жжения во влагалище (8,7%), головную боль (2,9%) и высыпания на коже (0,97%). Антибактериальное действие D-маннозы может быть дополнено другими молекулами-синергистами. Например, комбинацию N-ацетилцистеина (100 мг/сут) и D-маннозы (500 мг/сут) можно использовать для лечения рецидивирующего цистита у пациенток с раком молочной железы (n=60). Использование такой комбинации вместе с антибиотикотерапией показало значительное снижение бактериальной нагрузки мочи по сравнению с применением только антибиотиков.

Примеры

Пример 1

Изоляты уропатогенных уропатогенных Escherichia coli,

Candida albicans, Staphylococcus aureus subsp от 156 пациентов с инфекцией мочеполовых путей (ИМП) были собраны и протестированы на формирование биопленок, продукцию гемолизина, маннозо-резистентную гемагглютинацию, D-маннозо-чувствительную гемагглютинацию и резистентность к противомикробным препаратам. Из 156 изолятов образование биопленки наблюдали в 133 (85,3%) и образование гемолизина - в 53 (34%) изолятах. В 98 изолятах (62,8%) найдены фимбрии 1-го типа (маннозочувствительная гемагглютинация) и в 58 изолятах (37,2%) были найдены Р-фимбрии (маннозо-резистентная гемагглютинация).

Анализ 73 штаммов Escherichia coli от женщин с рецидивирующими ИМП показал, что 90% уропатогенных штаммов продемонстрировали адгезию к эпителиальным клеткам. D-манноза полностью ингибировала адгезию 25 (42%) штаммов и на 50% ингибировала адгезию еще 11 (18%) штаммов. Таким образом, D-манноза-зависимая адгезия Escherichia coli характерна для 60% уропатогенных штаммов Escherichia coli, что говорит о взаимосвязи адгезии уропатогенных бактерий с D-маннозой.

Для культивирования была использована обогащенная тиогликолевая среда, содержащая на 1000 мл 1 мл 1%-ного раствора гемина, 1 мл 1%-ного раствора менадиона и 1 мл твина-80, модифицированные варианты кровяных сред, а именно: модифицированная среда Цейсслера, содержащая 5% кровяного агара с добавлением 1% глюкозы и 1% дрожжевого экстракта, и модифицированный кровяной агар, содержащий питательный агар или эритрит-агар с добавлением 2% эритроцитарной массы человека и 5% лошадиной сыворотки.

Тестирование производилось при использование 1-6 гр маннозы перорально в составе композиции:

D - манноза - от 1 до 6 гр. - 97% Примеси: 1. Мальтотриоза - 0,07 - 0,1% 2. Мальтоза+Изомальтоза - 0,03 - 0,08% 3. Глюкоза - 0,6 - 1,0% 4. Фруктоза - 0,2 - 0,5% Вспомогательные вещества - 3%: 1. Тальк - 2%; 2. Магний стеарат - 1%.

Список литературы:

1. Lee S.J., Evers S., Roeder D. et al. Mannose receptor-mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis. Science. 2002;295(5561): 1898-901. DOI: 10.1126/science.1069540.PMID: 11884756

2. Szolnoky G., Bata-Csorgo Z., Kenderessy A.S. et al. A mannose-binding receptor is expressed on human keratinocytes and mediates killing of Candida albicans. J Invest Dermatol. 2001;117(2):205-13. DOI: 10.1046/j.1523-1747.2001.14071.x. PMID: 11511295

3. Gazi U., Martinez-Pomares L. Influence of the mannose receptor in host immune responses. Immunobiology. 2009;214(7):554-61. DOI: 10.1016/j.imbio.2008.11.004. PMID: 19162368

4. Agata N., Ohta M., Miyazawa H. et al. Serological response to P-fimbriae of Escherichia coli in patients with urinary tract infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1989;8(2): 156-9. PMID: 2566483

5. Cordeiro M.A., Werle C.H., Milanez G.P., Yano T. Curli fimbria: an Escherichia coli adhesin associated with human cystitis. Braz J Microbiol. 2016;47(2):414-6. DOI: 10.1016/j.bjm.2016.01.024. PMID: 26991275

6. Nowicki В., Svanborg-Eden C., Hull R., Hull S. Molecular analysis and epidemiology of the Dr hemagglutinin of uropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 1989;57(2):446-51. PMID: 2643568

7. Johnson J.R. Virulence factors in Escherichia coli urinary tract infection. Clin Microbiol Rev. 1991;4(1):80-128. PMID: 1672263

8. Monard A., Benoit G., Jacques L., Jardin A. Frequency of adherent colibacillus in a population with acute pyelonephritis and a population with acute cystitis. Prog Urol. 1993;3(4):583-9. PMID: 8104638

9. Terai A., Yamamoto S., Mitsumori K. et al. Escherichia coli virulence factors and serotypes in acute bacterial prostatitis. Int J Urol. 1997;4(3):289-94. PMID: 9255669

10. Domingue G.J., Roberts J.A., Laucirica R. et al. Pathogenic significance of P-fimbriated Escherichia coli in urinary tract infections. J Urol. 1985;133(6):983-9. PMID: 2860251

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к модулированию жизненного цикла микроорганизмов. Изобретение охватывает способ изменения адсорбции микроорганизмов, включая Candida albicans, шигеллы, Pseudomonas aeruginosa, лейшмании, микобактерии, и композицию для изменения адсорбции микроорганизмов. Изобретение может быть использовано для коррекции жизненного цикла микроорганизмов, в частности приводящей к распаду указанных микроорганизмов. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ изменения адсорбции микроорганизмов на слизистой, заключающийся в использовании композиции следующего состава: D - манноза - 97%, мальтотриоза - 0,07 - 0,1%, мальтоза+изомальтоза - 0,03 - 0,08%, глюкоза - 0,6 - 1,0%, фруктоза - 0,2 - 0,5%, вспомогательные вещества остальное.

2. Способ по п. 1, где микроорганизмы представляют собой Candida albicans, шигелл, Pseudomonas aeruginosa, лейшманий, микобактерий, Escherichia coli.

3. Композиция для изменения адсорбции микроорганизмов на слизистой:

D - манноза - 97%, мальтотриоза - 0,07 - 0,1%, мальтоза+изомальтоза - 0,03 - 0,08%, глюкоза - 0,6 - 1,0%, фруктоза - 0,2 - 0,5%, вспомогательные вещества остальное.