Изобретение касается получения антигена из фимбрий.
Хорошо известны антигены, состоящие из нескольких белков, которые совместно образуют индивидуальный фенотип в патогенном бактериальном штамме или видах, содержат большое количество- иммуноген- ных детерминант. Однако, такие антигены и полученные из них вакцины имеют целый ряд недостатков.
При иммунизации этими антигенами образуются антитела, направленные против каждой из этих иммуногенных детерминант, которые вместе друг с другом идентифицируют один специфический бактериальный штамм, из которого образован антиген, но не идентифицируют других бактериальных штаммов тех же видов.
Предложен способ получения антигена, который включает иммуногенную детерминанту или иммуногенные детерминанты, и
которые не ограничиваются одним специфическим штаммом патогенных бактерий.
Каждый рецептор склеивается с различными адгезивными структурами. Этот рецептор может представлять собой пептидный рецептор или углевод, например нейрамовая кислота (2-3)-галактоза, мэнно- за-о(1-2)-манноза или дигалактозид
a-D-Ga1p-( )-/3-D-GA1p группа присутствует в цепях гликолипидов и в данном контексте будет называться гло- бозидом,
Полученный антиген в качестве основного иммунизирующего компонента включает детерминанту адгезивного по- липептида или его иммуногенно активную последовательность или его предшественник, который способен превращаться в иммуногенно активную форму, антитела, против которых детерминанта реагирует с адгезивным полипептидом, который обраXI00 VJ
т-А
О
ел
со
зует патогенные дающие адгезин бактерии, и который склеивается с тканью млекопитающих животных. Этот антиген может включать аминокислотную последовательность, включающую не менее пяти аминокислот, вплоть до полной аминокислотной последовательности адгезивного полйпептида.
Адгезивный полипептид наиболее успешным образом может быть получен из образующих адгезин бактерий. Эта группа бактерий включает как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии; бактериальные виды, представляющие наибольший интерес для данного изобретения, из которых наиболее успешно получаются один или большее число видов адгезивных полипептидов, включают: уропатогенные или энтеропатогенные штаммы Escherichia coli или другие кишечные или ростовые бактерии, Nelsseria gonorrhocae, Nelsseria meningitidis, Nelsseria catarrhalis, Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa или другие Pseudomonas spp., Moraxelia bovls или другие Moraxella spp., Bacteroides nodosus, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. или Bordetella spp. такие как Bordetella pertussis.
Наряду с этим адгезивный полипептид может быть получен-путем синтеза, как описано ниже.
В некоторых патогенных бактериях данной группы нитевидные структуры, заканчивающиеся пили (волосяным) краем (pili), идущим от стенки клетки, некоторым образом могут быть связаны путем адгезии.и, следовательно, а также ввиду того, что волосяная структура (пила) легко очищается - все препараты пили используются как антигены в вакцинах, например, антиген гоно- коккус пили , испытанный в армии США.
Исследователи, работающие ранее над препаратами пили, сделали много усилий, чтобы получить чистый белок пили, достиг-, нутые этими исследователями результаты были успешными в том отношении, что пол ученные ими препараты показали лишь одну полосу в гелях SDS.
Полученные белковые препараты пили проявляли но меньшей мере три функции. Первая функция - это способность образовывать полимеры, по всей вероятности, за счет процессов гидрофобного связывания; это очень важное свойство, способствующее возможности образования волосовидной нити (пили) из мономерных субмолекулярных структур. Вторая функция - это способность порождать антитела, это свойство, которое играет основную роль для использования белка и в качестве вакцины. Третья функция - это способность склеи0
ваться с рецепторами поверхности клетки. Поскольку исследователи не были в состоянии идентифицировать более чем один белок в их волосяных (пили) белковых
препаратах, а также в самих пили, то был сделан вывод, что пили представляют собой полимерные агрегаты, состоящие из идентичных мономерных белковых субмолекулярных структур, причем каждая из этих
субмолекулярных структур обладает всеми тремя указанными выше функциями.
Однако, как указывалось выше, неповрежденный цельный пили от одного единст- венного бактериального вида имеет
5 огромную антигенную разновидность. Кроме того, было продемонстрировано, что при использовании в качестве вакцины, неповрежденное целое пили одного антигенного типа образует антитело, являющееся основной для указанного единственного антигенного типа, а не разделенных антигенов пили. В более ранних работах исследователи осуществляли химическое расщепление очищенных пилусовых субмолекуля.рных
5 структур на фрагменты, имеющие указанные функции. Каждая отдельная функция была идентифицирована с отдельным фрагментом очищенной пилусовой субмолеку-. лярной структуры. Таким образом, можно
0 считать, что очищенные препараты белка пили содержат единственный белок - пили- новый мономер. Этот пилиновый мономер химически расщеплен и имеет связывающую функцию и основную антигенность - то же, что полимеризованный чистый пилусо- вый белок.
Однако обширные исследования, проведенные авторами, показали, что предлагаемый чистый белок пили фактически
0 состоит из нескольких белковых фракций.
Подтверждением данного наблюдения являются другие мутированные организмы, сохраняющие распознаваемые волосяные структуры, но неспособные к адгезии. В ре5 зультате дальнейших-наблюдений установлено, белок пили„ который ранее предполагался как чистый, должен включать не менее двух фракций, одна из которых представляет собой структурный элемент,
0 составляющий фактическую формацию пили и другая - представляет собой фракцию, ответственную за адгезионную способность. Тот факт, что обе фракции обладают антигенными свойствами, открывает возможность порождения антител, направленных против ответственной за адгезию фракции.
Для бактерий, имеющих пили, желательно также получать антиген, проявляющий меньшую избирательность или вообще
5
5
ее не проявляющий, такой антиген получают путем идентификации и образования одного или более компонентов, которые составляют часть общей пилусовой структуры и которые специально способствуют ад- гезии, В тексте такой компонент будет называться пилусовым адгезивным по- липептидом, Согласно тому, то говорилось выше, пилусовый адгезивный полипептид включает (в очень незначительном количестве от общей пилусовой аминокислотной последовательности), пили, образованный от дающих пилус патогенных бактерий, который отличен от пилина (субмолекулярная структура очищенного пилуса, образующая основную часть пилусовой нити). Примерами образующих пилус бактерий, используемых для целей данного изобретения, являются уропатогенные и энтеропатоген- ные штаммы Neisseria gonorrhocae, Neisseria menlngitidis, Neisseria catarrhalis, Moraxella bovls или другие Moraxella spp. и Bordetella pertussis.
В изобретении в первую очередь использовали уропатогенный штамм E.coli, который вызывает пилонефрит. Однако, следует иметь в виду, что другая генетическая система E.coli, кодирующая пилусовые адгезины, является очень аналогичной первой. Рецептор, ответственный за связывание патогенных образующих пилус бактерий за счет замкнутых структур рецептора - или части рецептора - и молекул адгезина, соответственно, был идентифицирован для уропатогенных бактерий E.coll как дигалактозид, звено a -D-Galp-() /3 -D-Galp, присутствующее в глобусариях гликолипидов, к которому могут прилипать бактерии в уроэпителии и которое присутствует также в эритроцитах крови человека как часть антигенов кровяной группы Р.
В ходе исследования авторы идентифицировали участок хромосомы уропатогенно- го штамма E.coli, который кодирует Par пили (пили, связанный с пилрнефритом), размер которого составляет 8,5 кВ. Этот участок, как было установлено, кодирует по меньшей мере восемь различных полипептидов. Авторы настоящего изобретения определили также те полипептиды, отсутствие которых приводит к неадгёзивности (неклейкости) клеток E.coli. Предполагается, таким образом, что эти полипептиды ответственны за адгезионный фенотип уропатогенных бактерий E.coli. Следовательно настоящее изобретение касается антигена аминокислотной последовательности:
Met-Lys-Lys-lle-Arg-Gly-Leu-Cys-Leu-Pro- Val-Met-Leu-Gly-Ala-Va - Leu-Met-Ser-GlnHls-Val-His-Ala-Val-Asp-Asn-Leu-Thr-Phe-Arg-Gly- Lys-Leu-lle-lle-Pro-Als-Cys-Thr-Val- Ser-Asn-Thr-Thr-Val-Asp-Trp- Gin-Asp-Val-Glu- Ile-Gln-Thr-Leu-Ser-Gln-Asn-Gly-Asn-His - Glu-Lys- Glu-Phe-Thr-Val-Asn-Met-Arg-Cys- Pro-Tyr-Asn-Leu-Gly-Thr-Met- Ser-lle-Tyr- Cys-Asp-Val-Pro-Val-Ser-Val-Lys-lle-Ser-Leu- Leu-Arg- Asn-Thr-Pro-Pro-lle-Tyr-Asn-Asn- Asn-Lys-Phe-Ser-Val-Gly-Leu- Giy-Asn-GlyTrp-Asp-Ser-lle-lle-Ser-Leu-Asp-Gly-Val-Glu-Gln-Ser- Glu-Glu-lle-Leu-Arg-trp-Tyr-Thr-Ala- Gly-Ser-Lys-Thr-Val-Lys- le- Glu-Ser-Arg-Leu- Tyr-Gly-Glu-Glu-Gly-Lys-Arg-Lys-Pro-G y-Gtu- Leu-Ser-Gly-Ser-Met-Thr-Met-Val-Leu-SerPhe-Pro
или ее любая иммуногенно активная последовательность.
Ранее было установлено, что отсутствие последних двух антигенов является причиной отсутствия связывания с глобозидным рецептором во всех случаях, и таким образом можно полагать, что оба они являются отвечающими требованиям адгезивных полипептидов, в то время как первый антиген является причиной отсутствия связывания лишь при некоторых обстоятельствах и следовательно он необходим для прочного связывания образующегося адгезионного полипептида с наружной поверхностью
стенки клетки.
Следует отметить, что указанные выше аминокислотные последовательности представляют собой формы предшественника пилусовых адгезионных полипептидов, содержащих пептидоподобные последовательности N-концевого сигнала, которые расщепляются, когда полипептид выводится через внутреннюю бактериальную мембрану.
Желательно, чтобы антиген, отвечающий данному изобретению, был в основном свободен от других компонентов, связанных с адгезионной функцией, таких как дру,- гие компоненты пилусз тем, чтобы
устранялось образование широкой разновидности антител, когда антиген используется для иммунизации с указанными выше недостатками. Предпочтительно, чтобы антиген находился в практически чистом состоянии, то есть был свободен от других детерминант, которые каким-либо образом не связаны с образованием адгезина.
ATGAAAAAGATAAGGTTTGTGTCTTCC GGTAATGCTGGGGGCAGTGTTAATGTCTCAGCATGTACATGCAGTTGATAATCTGACCTTCAGAGGAAA- ACTGATTATTCCTGCCTGTACTGTAAGCAA CACAACTGTTGACTGGCAG- GATGTAGAGATTCAGACCCTGAGTCAAAAT
GGAAATCACGAAAAAGAGTTTACTGTGAATATGCGGTGTCCCTATAATCTGG
GAACAATGAAGGTTAC
GATAACGGCAACAAACACTTATAACAATGCTAT
TTTAGTTCAGAATACATCAAACACATCTTCTGATGGGTTACTCGTTTATC
TTTATAACAGTAATGCAGGAAATATTGGGACTGCGATAACTrTAGGGA
CTCCATTTACGCCCGGAAAAATCACAGGTAATAATGCAGATAAAACTAT
ATCACTTCATGCGAAA
CTTGGATATQAAGGGAATATGCAGAATTTGATA
G- С С G G Т С С Т Т Т С Т С Т
GCAACAGCAACGCTGGTTGCATCATATTCGTAA, или
ATGATTCGTTTATCATTATTTATATCGT TGCTTCTGACATCGGTCGCT- GTACTGG CTGATGTGCAGATTAACATCAGG. GGGAATGTTTATATCCCC- CCATGCACCATTAATAACGQGCACAATATT GTTGTTGATTTTGGGAAT- ATTAATC CTG AG С ACGTG G А С AA CTCA CGT GGTGAAGTCACAAAAACe- ATAAGCATATCCTGTCCGTATAAGAGTGGC TCTCTCTGGATAAAAGTT- ACGGGAAATACTATGGGAGGAGGTCAGAA TAATGTAGTGGCAACAAAT- ATAACTCATTTTGGTATAGCGCTGTATCAG GGAAAAGGAATGTCAACAC- CTTATATTAGGTAATGGTTCAGGMATGGT Т А С G G A G T.G А С A G С A G G Т CTGGACACAGCACGTTCAACGTTCACCTTT ACTTCAGTGCCCTTTCGT AATGGGAGCGGGATACTGAATGGCGGGGA TTTCCAGACCACGGCCAGTA TGAGCATGATTTATAACTGA, или
ATG AAAAAATGGTTCCCTG CTTTTTTAT TTTTAT. CCCTGTCAGGCGGT AATGATG CTTTAGCTGGATGGCACAATGTC ATGTTTTATGCTTTTAAC GACTATTTAACTACAAATG CTGGTAATGTT AAGGTTATTGACCA-AC..CT CAGCTATATATACCCTGGAATACAGGCTCT GCTACAGCAACTTATTAT TCGTGCTCAGGTCCGGAATTTGCGAGTGG AGTGTATTTTCAGGAGTAT CTGGCCTGGATGGTTGTTCCTAAACATGTC Т А Т А С Т A A J G A G G G G Т Т Т AATATATTTCTTG ATGTTCAG AG CAAATAT GGTTGGTCTATGGAGAAT GAAAATGACAAAGATTTTTACTTCTTTGTTA ATGGTTATGAATGGGAT ACATGG ACAAATAATGGTG CCCGTATATGT TTCT.ATCCTGGAAATATG AAG CAGTTG AACAATAAATTTAATG ATTTAG TATTCAGGGTTCT.TTTG CCAGTAGATCTCCCCAAGGGACATTATAAT TTTCCTGTGAGATATATA CGTGGAATACAGCACCATTACTATGATCTC TGGCAGGATCATTATAAA
ATG С CTTA CG ATCAG ATT AAG С AG СТА ССТ GCCACTAATACATTGATG- TTATCATTCGATAATGTTGGGGGATGCCAG CCGTCAACACAAGTACTTAATATAGACCATGGGAGTATTGTGATTGATCGTGCTAACGGAAATATT- G CAAGTCAG ACG CTTTCAATTTATTG CG AT GTACCAGTTAGTGTAAA- ATATCTCTGCTCAGAAATACACCACCAATA
0 TACAATAATAATAAATTT- TCGGTTGGGTTAGGTAATGGCTGGGATTCG ATAATATCTCTTGATGGG- GTTGAACAGAGTGAGGAAATATTACGCTGG TACAC-AGCCGGCTCAAAA5 ACAGTAAAGATTGAGAGCAGGTTGTATGGT GAAGAGGGAAAGAGAAAA- CCCGGGGAGCTATCTTGGTTCTATGACTAG TGTTCTGAGTTTCCCCTGA
Согласно заявленному способу, нуклео0 тидная последовательность, кодирующая антиген, как указано выше, сливается с нук- леотидной последовательностью, кодирующей физиологически пригодный носитель полипетид, слившаяся последовательность
5 ДНК вводится в соответствующий вектор, гибридный вектор транформируется в соответствующего бактериального хозяина,этот хозяин выращивается в соответствующей среде, и слитый пли полипептид извлекает0 ся из культуры и при желании очищается.
Содержащийся в описанной конструкции фрагмент ДНК может быть последовательностью ДНК или частью последовательности ДНК, кодирующей пи5 лусовый адгезивный полипептид. который получен от патогенных образующих пилус бактерий, таких как уропатогенные или эн- теропатогенные штаммы Escherlchia coll, Neisserla gonorrhocae, Neisserla
0 meningitidis, Neisseria catarrhails, Moraxella bovls или другие Moraxella spp. или Bordetella pertussis.
Примером такого фрагмента ДНК может быть фрагмент, который полностью или час5 тично включает последовательность ДНК, кодирующую один или более адгезивный полипептид от уропатогенного штамма E.coli. Следовательно, настоящее изобретение касается фрагмента ДНК, который как
0 основной элемент состоит из последовательности ДНК или любой его последовательности, которая после ее выражения составляет иммуногенно активную последовательность адгезионного полипептида, ко5 дированного одной из последовательностей ДНК.
Важным аспектом данного изобретения является способ получения антигена, включающего в качестве его основного иммуни- зирующего компонента детерминанту
адгезивного полипептида, в котором осуществляют выращивание бактериального хозяина, заключающего в себе гибридный .вектор, содержащий введенный фрагмент .ДИК, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей антиген, и этот фрагмент ДНК не кодирует .никакого другого антигена, и данный продукт извлекается и при желании далее подвергается очистке.
Хромосомная ДНК от образующей адге- зивный полипептид бактерии отделяется посредством ограничительной эндонуклеа- зы, и отдельные фрагменты ДНК вводятся в соответствующий вектор, которые затем трансформируются в соответствующих бактериальных хозяев. Затем трансформированные бактерии исследуют в отношении их адгезивной функции путем определения их способности связываться с любой твердой поверхностью, включающей специфический рецептор, например путем испытания на склеивание с эритроцитами, стандартными методами. Фрагменты ДНК от клонов, которые сохранили адгезивную функцию, затем субклонируют в соответствующий вектор и подвергают транспозонному мута- генезу и/или частичной обработке рестрик- тазой и религации, далее определяют субклоны, которые содержат наименьшие фрагменты ДНК, кодирующие адгезионную функцию в бактериальном хозяине. Таким образом, получают наименьшую последовательность оперона, которая выражает адгезионную функцию поверхности клетки. Манипуляции либо транспозонным мутаге- незом, либо делецией используют для идентификации отдельных генов в пределах оперона, которые сохраняют или не сохраняют способность выражать адгезивный полипептид, Ген или гены, выражающие адгезивный полипептид, затем вводятся в соответствующий вектор с вводом соответствующих промоторов для усиления выражения адгезионного полипептида или полипептидов. Затем этот вектор трансформируется в соответствующий организм хозяина такой как бактерии, например грамм-отрицательные бактерии, такие как E.coli или B.subtilis.
Возможно также избирательное блокирование или удаление ген ов в случае E.coli рарА и рарС генов, что не сказывается на экспрессии адгезивного полипептида.
Поскольку очистка классическими химическими способами пилусового адгезивного полипептида из препарата, в котором он присутствует в виде смеси с основным пилу- совым структурным компонентом, чрезвычайно затруднительна и даже бывает совершенно невозможна ввиду того, что
структурный компонент, который является иммуногенным как таковой, присутствует в значительно большем количестве, то данный метод рекомбинантной ДНК для пол5 учения второстепенного пилусового адгезивного полипептида имеет принципиальное значение для получения иммуноген- но эффективного и достаточно чистого антигена согласно данному изобретению,
0 поскольку метод рекомбинантной ДНК позволяет осуществлять избирательное удаление генов, кодирующих нежелательные антигены, или выраженный другим образом, он позволяет осуществлять отбор гена
5 или генов, кодирующих желательные второстепенные адгезивные полипептиды. В результате клонирования данного гена или данных генов в соответствующие векторы, как описано выше, можно получить большие
0 количества второстепенных пилусовых ад- гезивных полипептидов, которые в противных случаях присутствуют лишь в иммуногенно неэффективных ничтожно малых пропорциях в уже известных пилусовых
5 препаратах.
Согласно изобретению несколько генов, кодирующих один или несколько желаемых адгезивных полипептидов, могут быть клонированы в один и тот же вектор, так что
0 продукт, образованный данным микроорганизмом, будет представлять собой продукт с периодически повторяющимся детерминантами данного антигена, способствующими усилению эффективности связывания
5 рецептора.
Все эти операции осуществляют способами, хорошо известными для приемов рекомбинантной ДНК.
Вектор, используемый при осуществле0 нии данного способа, может представлять собой любой вектор, обычно применяемый, например, для таких производных как pBR 322, векторы с промотором Lac UV5, векторы широкого круга хозяев, такие как векто5 ры с промотором tac, челночные векторы,
. Питательная среда в которой выращивается
бактериальный хозяин, может быть любой
питательной средой, обычно используемой
для процессов ферментации, например L0 питательным бульоном или средой М9-гли- церина. Бактериальный хозяин обычно выбирается из числа хозяев, поведение которых уже известно в условиях ферментации таких как Escherichla coli или Bacillus
5 subtilis.
После очистки второй полипептид мо- жет.быть отщеплен от сигнального пептида с помощью протеазы, такой как трипсин или химотропсин. Желаемые фрагменты, образованные лишь от фрагмента ДНК, кодирующего первый полипептид, с которым сливается ген, кодирующий второй полипептид, отбираются по принципу их им- муногенной активности, например, при испытании в условиях In vitro.
Отделение этих двух полипептидов может осуществляться стандартными методами, такими как ионообменная хромэ- тография, жидкостная хроматография высокого давления или хроматография сродства, например, хроматография имму- нологического сродства или рецепторного сродства. ;В случае хроматографии йммуно- логического сродства любые антитела, действующие против антигенов согласно данному изобретению (включающих первый полипептид), или антитела, действующие против второго полипептида, могут использоваться как антитела, иммобилизованные в колонке. В хроматографии рецепторного сродства может аналогичным образом использоваться рецептор получаемого адгези- на. Фрагмент ДНК, используемый для слияния с последовательностью ДНК, кодирующей второй полипептид, может быть любым указанным выше фрагментом ДНК.
Способ получения антигена, адгезйв- ный полипептид, такой как пилусовый адге- зивный полипептид или его иммуногенно активное вещество, может быть получен путем синтеза пептида согласно хорошо известным способам, таким как жидкофазный синтез пептида или твердофазный синтез пептида.
В твердофазном синтезе аминокислотная последовательность создается путем связывания исходной аминокислоты с носителем и последующего ввода других аминокислот в данную последовательность путем пептидного связывания, в дан Ном случае до длины цепи не менее пяти аминокислот, При получении адгезивного полипептида или его последовательности методом твер- дофазного синтеза пептида желательно, таким образом, использовать физиологически пригодный полимер, который может использоваться в качестве носителя для антигена в вакцине, в качестве носителя, с которым связывается исходная аминокислота в данной последовательности.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример. Общие материалы и методы.
Химические препараты и ферменты. , Ограничительные ферменты и-лигазуТ4 ДНК получают от Boehrlnger Mannheim GMBH или New England Biolab, и используют по рекомендации изготовителей, Пополнение з концов осуществлялось с
использованием фрагмента Кленова в буфер, в который добавляют 200 мкмол каждого требуемого dNTPs. Связывающее звено Xhol/51 - CCTCGAGG-3Y и связывающее
звено BamH /5 -CGGAT CCG-3/ получают из Collaboratite Research и 5 -фосфорили- рованные препараты получают с использованием полинуклеотидной киназы из Нью Инглэнд Биолэб. Все химические препара0 ты имеют максимальную степень чистоты. Очистка пили.
Клетки выращивают в течение 22 ч при
. температуре 37°С на пяти лотках (400x250 мм),
содержащих .L-arap без глюкозы. Клетки
5 удаляют с лотков, суспендируют в 340 мл охлажденного льдом 5 ммоль Трис-НС (рН. 8) и перемешивают в течение 10 мин на льду в смесителе. После зернения (грануляции) клеток и продуктов распада (двукрат0 ное в течение по 30 мин при 20000 х д) во
всплывший слой вводят сульфат аммония до
степени насыщения 55% и пили осаждают
. на льду в течение ночи. Осадок извлекают
. путем центрифугирования и снова суспен5 дируют в 5 ммоль Трис (рН 8), После диализа в течение ночи с использованием того же буфера при 4°С, нерастворенный продукт . удаляют путем центрифугирования в течение 30 мин при числе оборотов центрифуги
0 40 000 х д. Процедуру осаждения - диализ повторяют еще 3 раза (осаждение в течение Зч), после чего пили осаждают путем добавления 0,2 объемов 1 моль МдС12 1,5 моль NaCI - 100 ммоль Трис-HCI (рН 7,5). Осадок
5 растворяют до получения концентрации белка 2 мг/мл. Выход составляет примерно 15 мг для беспорядочного типа и 2-30 мг для мутантов.. .
Анализ на связывание рецептора.
0 Для определения агглютинации на предметном стекле бактериальные клетки, выращенные в течение 22 ч на не содержащем глюкозы L-arape, суспендируют до примерно 1010 клеток/мл в клейком буфере 5 150 ммоль NaCI, 10 ммоль Трис-HCI, (рН 7,5), содержащем 3% гепаринизированных и промытых эритроцитов человека. Реакция, в случае если она положительна, обычно протекает в течение в пределах 60 с. В
0 случае положительной реакции скопления эритроцитов были макроскопически видимыми. В полуколичественном анализе клетки, выращенные как указано выше, снова суспендируют до Абоо-200. Затем их последо5 вательно двукратно разбавляют в 50 мкл агглютинирующего буфера с использованием микротитровальных чашек с приемником. К ним добавляют 10 мкл 3%-ной суспензии эритроцитов в том же буферном растворе. Разбааленный. раствор в последнем приемнике, где наблюдалась положительная агглютинация по прошествии 2 ч при 4иС, был взят как титр агглютинации. Число клеток исходной суспензии используют совместно с титром для расчета ми- нимальной концентрации бактерий, требуемой для агглютинации.
Титр агглютинации очищенных пили определяют в основном таким же образом, как для всех клеток в целом.Однако, при испо
льзовании , агглютирйующего. буферного раствора концентрация пилус, необходимая для агглютинации, была очень высокой и были сделаны попытки увеличить чувствительность анализируемой пробы. Поскольку пили имеют отрицательный заряд при физи- ологической величине рН и скапливаются в присутствии 167 ммоль MgCl2, пилусовый препарат беспорядочного .типа титровали при повышенных концентрациях MgCI, ис- пользуя Р-эритроциты, содержащие глобо- зидный рецептор (включая дигалактозид) и р-эритроциты, в которых отсутствует данный углевод. Обнаруживают, что титр агглютинации увеличивается в 128 раз при
увеличении концентрации MgCI до 100 ммоль.
Это сопровождается параллельным увеличением Ладо составляющем 200 мкг/мл раствора пилуса в тех же буферных раство- pax. При использовании CaClan 10-кратном увеличении концентраций получают те же результаты, позволяющие утверждать что оказывается влияние на взаимодействие пилус-пилус, а не на связывание специфического рецептора. Кроме того, на титр агглютинации .всех пилитированных клеток незначительно влияет введение
MgCte вплоть до концентрации 200 ммоль.. Наряду с этим увеличение титра агглютинации с использованием р-эритроцитов показывает, что скоплению неспецифических пилус-эритроцитов благоприятствует введение ионов Мд2+, хотя на специфичность анализа (Р-титр на р-титр) это не оказывает влияния.Таким образом, все титрования пилусовых препаратов, осуществляемые в агглютинирующем буферном растворе с использованием 1.00 ммоль MgCl2, дают полуколичественные данные для специфи- ческой агглютинации. Получение антитела. Преимунную сыворотку получают от двух здоровых весом по 1,8 кг самок Новозеландских белых кроликов путём сердеч- ной пункции, подвергают стерилизации фильтрованием и выдерживают при -20°С, 75 мкг очищенного Рар пили в 10 мл изотонического солевого раствора эмульгируют равным объемом полного стимулятора
. Freun.d s и вводят в количествах 0,5 мл в четыре точки, а именно - в двух точках под- капиллярно и в две задние лапы подмышеч- но. Спустя шесть недель дают повышенную инъекцию полного стимулятора Freund s. Через десять дней после этой второй иммунизации осуществляют кровопускание у животных путем сердечной пункции, и данная сыворотка подвергается стерилизации фильтрованием вместе с 0,02% азидом на.трия при -20°С.
Анализ пилусового антигена.
Для агглютинации на предметном стекле бактерии выращивают и подготавливают, как- описано для проб гемагглютинации. Анализы агглютинации всех клеток в целом осуществляют с 500-кратным разбавлением (PBS, рН 7,5) антисыворотки, действующей против Рар пили (смотри выше). Положительную реакцию определяют как макроскопически видимое скопление бактерий, которое обнаруживалось в течение в пределах 600 с.
Выражение белка в миниклетках.
Плазмида рРАР5 и её-производные трансформировались в штамм Р678-54, Радиоактивные образцы подвергают электрофорезу в SDS полиакриламиде (смотри ниже). Данные гели затем закрепляют, окрашивают и усиливают и подвергают ауторадиографическому исследованию. . Осуществляют параллельный электрофорез продуктов со стандартными молекулярными весами и очищенного пилина.
Гель-электрофорез в SDS - полмакрилз- миде (SDS - додецилсульфат натрия).
Радиоактивные образцы суспендир.уют в 100 мкл взятом для пробного анализа буферном растворе, содержащем 62,5 мк моль Трис-HCI (рН 6,8), 1% додецилсульфата натрия (SDS), 0,5%-/ -меркаптоэтанола и 10% глицерина. После кипения в течение пяти минут экстракты подвергают электрофорезу в 15%-ных полиакриламидных вязких гелях, содержащих 0,1 % SDS. Одновременно анализируют белковые стандарты с молекулярными весами в пределах от 3000 до 94000. После закрепления, окрашивания и обесцвечивания, гель подвергают флюорографии.
Клеточные экстракты.
Клетки штамма Р678-54 с содержанием различных гибридных плазмид выращивают на триптиновом соевом агаре в присутствии соответствующих антибиотиков. Бактерии собирают после выращивания в течение ночи при 37°С, суспензируют в PBS (рН 7,2) Brij - 35 до достижения плотности клеток, соответствующей 1,5 единиц поглощения света при 560 нм, и извлекают путем центрифугирования (со скоростью вращения
центрифуги 12000 g в течение 10 мин). Клеточную гранулу затем суспендируют в 400 мкл 1%-го Nonldet Р-40-1% натрийдиокси- холята - 0,1 % SDS - 0,15 моль NaC - 0,01 моль Трис-HCI (рН 7,2), содержащем лизо- цим концентрацией 1 мг/мл, и инкубируют в течение 10 мин при 4°С. 400 мкл пробы антисыворотки Рар с разбавлением 1/15000 вводят в данный клеточный экстракт. После инкубации при 4°С в течение 16ч смесь антител клеточного экстракта очищают путем центрифугирования (12000 х g в течение 10 мин).
Анализ с конкурентным связанным ферментом иммуносорбентом.
Микротитровальные чашки гемагглюти- нации подвергают воздействию 100 мкл раствора, очищенного Рар пили концентрацией 1 мкг/мл в 0,1 моль буферном растворе карбоната натрия (рН 9,6) в течение 16 ч при 25°С. Приемники промывают три раза OJ5 моль NaCI, содержащим 0,05% (об/об) Brij ®- 35 (Сигма) с целью удаления несвязанного пили. Анти-Рар пилусовую антисыворотку кролика разбавляют в pBS (рН 7,2), 0,05%- ной (об/об) Brlj® - 35 до концентрации, приводящей в результате к 50%-ному мак- симальному связыванию (разбавление 1 /30000), и затем смешивают с последовательно разбавленными растворами в pBS-Brij лизатах бактерий, свободных от клеток экстрактов, или Рар пили (положительный контроль), или без вводимых пили (отрицательный контроль). После инкубации в течение 16 ч при 4°С 100 мкл образцов переносят в сенсибилизированные приемники тйтровальных чашек. Эти чашки инкубируют в течение трех часов при 37°С и затем трехкратно промывают NaCI-Brij ®. Во все приемники титроваяьных чашек вво- дят соединенный с щелочной фосфатазой противокроликовый иммуноглобулин G коз, разбавленный до 1/1000 в PBS-Brij , и их инкубируют в течение одного часа при 37°С. Чашки промывают 3 раза pBS-Brij® и в каждый приемник чашек вводят 1 мг пара- нитрофенилфосфата на миллилитр в 1 моль диэтаноламинового буферного раствора (рН 9,9) и осуществляют инкубацию в течение 20 мин при 37°С. Реакцию прекращают при вводе 2н NaOH и определяют поглощение света при 405 нм с помощью аутореги- стрирующего устройства MR 580 Микро ELISA.
Построение плазмидных производных.
Фрагмент EcoRI-BamHI длиной 9,6 кв от PR НИЗО, содержащий все необходимые гены для выражения Рар пили и специфического связывания дмгалактозиды, клонируют в pBR322. Вектор представляет собой
0
5
0 5 0 5 0
5
0
5
pBR322, обработанный рестриктазой Pvu II и лигированный с 20-кратным избытком связывающего звена Bam HI. Данную ДНК последовательно обрабатывают фрагментами EcoRI и BamHI, и самый большой фрагмент, несущий нуклеотиды 2065-4360 плазмиды pBR322, выделяют из 0,7%-ного агароз- ного геля. Этот фрагмент, сшитый с EcoRI-BamHI фрагментом pRHl/130, трансформируют штаммом E.coli HB101. Изолированный клон кодируют рРАР22 и он идентичен рРАР5, стой разницей, что в этом клоне отсутствует сегмент BamHI-Pvu II, Производное рРАР23, несущее смещенную рамку считывания в единственной точке Pvu II в рар А, построено путем гидролиза рРАР22 с помощью Pvu II и лигирования с 20-кратным избытком связывающего звена Xhol. После обработки полученной конструкции в течение трех часов с использованием 20 единиц Xhol/мкг ДНК данный фрагмент очищают на колонке с введением 10 ммоль Трис-HCI (рН 8) и 1 мМол.ЕДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). После привязывания и трансформации в штамм E.coli HB 10-1 ДНК от шести клонов извлекают, анализируют, Пять таких клонов имеют новый сайт рестрикции Xhol вместо сайта Pvu и один из них называют р РАР23 и используют в последующих исследованиях. Плазмиду рРАР 1 конструируют путем гидролиза 2 мкг р BR322 с Clal и тупые концы получают с использованием 5 звеньев фрагмента Кленова и 200 мкМол каждого из dGTP и с)СТР(15мин при 30°С в связывающем буферном растворе). Эту ДНК после инактивации нагреванием данного фермента лигируют с очищенным фрагментом Smali-Sma 2 от рРАР5 и выделяют плазми- ду, несущую данный фрагмент в такой ее ориентации относительно вектора, как и рРАР5 Клон рРАР1 выражает полипептид размером 35 Kd. Таким образом ген для данного, полипептида простирается за пределы точки Smal2 и присутствует в срезанной форме в р РАР1. Данную мутацию выделяют из фрагмента Kpnl-BamHI, который лигируют с отрезком р РАР5 этими ферментами. Данное производное рРАР7 содержит фрагмент рар ДНК вплоть до точки Smate. Плазмиду рРАРЭ, содержащую всю зону Sma i-BamHi, строят путем фрагмента Kpnl-BamHI плазмиды рРАР5 в избыточном количестве с Kpnl-BamHI фрагментом плазмиды pPAPI. Для получения мутаций типа сдвига рамки считывая во вставке р РАР9, данную плазмиду частично гидроли- зуютс Hincll в присутствии 150 мкг/мл эти- дийбромидэ. Гидролизованную плазмиду затем извлекают из 0,70%-го агарозного геля и привязывают к избытку звеньев Xhol. После вываривания Xho l, х роматографии на геле Siphadex ® ДНК трансформируют в штамм E.coll HB101 с отбором по стойкости к ампициллину. ДНК, очищенную от 23 клонов, анализируют путем гидролиза с Xhol и .Sail. . :. - . - ;-. . х;:: . .
Производные рРАРБ, несущие эти мутации, конструируют аналогично рРАР7.
Эти плазмиды носят название рРАР15
(Hinelli)H pPAP14(Hlncl)2J. pPAP 19 конструируют путем делеции фрагмента Xhol-Sa.ll из плазмиды рР.АР 14 путем сшивки с фрагментом Xhol-Sal| последней плазмиды. Построение рРАР20 от рРАР 15 осуществляют аналогичным образом. Для получения плазмиды р РАР 2.6 /papAt, papEl двойного мутанта/ большой фрагмент Kpnl-Bam HI рРАР23 /papAl/ привязывают к небольшому фрагменту Kpnl-BarhHI от рРАР10 /рарЕ /. Плазмида рРАРЭ не включает вставок Тп5 в пределах зоны Smah-BamHI. Следовательно, фрагмент EcoRI, содержащий промотор lacUV5, выделяют из PSK 106 и привязывают с избыточным .количеством обработанной рестриктазой EcoRI плазми- дой рРАРЭ. Клон с данным фрагментом находится в правильной ориентации и таким образом рРАР 16 извлекают путем отбора препаратов с ДНК, гидролизованной Pstl, поскольку данный фрагмент промотора несет асимметрично расположенную точку данного фрагмента. Ту же процедуру используют для других производных рРАРЭ дающих в результате рРАР4 (Smal2-Bam HI делеция), рРАР18 (Hlncih мутация) и pPAP17/Hin.cll2 мутация/.
- Л р и м е р 2. Высокомолекулярную хромосомную ДНК из Lac-уропатогенного изолята извлекают согласно стандартным методам. Эту ДНК затем обрабатывают эн- донуклеазой Sau 3 A.Sau ЗА линкеры пришивают, к плазмидному вектору рНС79, который предварительно гидролизуют эн- донуклеазой BamHL Эту ДНК в условиях in vitro вводят в частицы Я-фага. Эти частицы используют для заражения штамма E.coii Р678-54.-Затем данные бактерии распределяют по пластинам, содержащим ампицмл- лин. что приводит к образованию колоний, содержащих рекомбинантную плазмиду, которая стойка к ампициллину.
Индивидуальные колонии отбирают для агглютинации эритроцитов человека в присутствии 1 % маннозы. В результате был отобран клон /рРН 807/, вызывающий стойкую к маннозе гемагглютинацию. Субклоны рРНИЗО и pRHI/l 845 конструируют с сохранением MRHA для анализа пробы.
В результате введения в периферическую часть рарДН К устраняется гемагглюти- нация, что позволяет образовываться Рар пил;и. -. -;- 5 Далее фрагмент Small-BamHI субкло- нируют в pBR322. Поскольку полученная плазмида не дополняет вставки Тп5 в зону Small-BamHI, то клонированный фрагмент . находится под транскрипционным контро0 лем промотора lac UV5 (так чтобы гарантировать требуемую транскрипцию, генов на данном фрагменте), который вводят в плазмиду как фрагмент EcoRI, являющийся производным от pSK 106. Такую структуру
5 рРАР 16 дополняют четырьмя негемагглюти- нирующимися мутантами Тп5 с точками вставки в фрагменте Smah-BamHI. Строят производные данных мутантов со сдвигом рамки считывания ot рРАР5, содержащих
0 повреждения в данной зоне. Обе мутантные плазмиды рРАР14 и рРАР15 несут линкеры Xhol в точках Hinclla и Hinclh соответственно. В третьем мутанте рРАР7 удаляют рар ДНК от Smala до BamHI. Полипептиды, экс5 прессирующиеся с рРАР5 и его трех мутан- тных производных, подвергают мечению 355 метионином вминиклетках Е.соИи полученные полипептиды анализируют на SDS- полиакриламидном геле. При сравнении с
0 рРАР 5 плазмида рРАР 7 экепрёссирует пол- ипептид 35 Kd. Вместо этого экспрессиро- вался полипептид 34 xd,
. Получают миниклетки от мутанта Hiclli рРАР15, что не приводит к образованию
5 полипептида 16,5 xd. Ген для данного пол- ипептида заканчивается рар Б и мутация со сдвигом рамки считывания рассматривает- ся как papEl. Эффекты полярности, вызванные вставками Тп5 в рарЕ и papF на papG,
0 показывают, что транскрипция всех трех ге- / нов происходит в данном направлении.
Для подтверждения положения мутаций Тп5, относящихся к генам рарС, Тп5
. мутации 002, 021, 026 и 042 дополняют му5 тированной зоной Smali-BamHI. Строят производные papEl, papFI и papGI от рРАР16, несущей зону Srnah-BamHI под контролем промотора lacUVS. Затем их трансформируют в штамм E.coii НВ 101, не0 сущий производные Тп5 от рРНИ 746, и анализируют на глюкозидо-специфическую гемагглютинацию с использованием Pi- и р-зритроцитов. Производное papEl допол- . няет все мутации Тп5, как родственная плаз5 мида рРАР16. Плазмида papEl дополняет Тп5 мутации 026 и 042, а.плазмида, несущая papGI, дополняет мутации 002 и 021. Это определяет вставки 002 и 021 Тп5 как мутации в papF, и показывает, что Тп5 вставки 026 и 042 сохраняются в papG гене.
Как указывалось выше, .Тп5 вставки в papF и papG полностью исключают агглютинацию, хотя образуются пили. Для опре- деленйя в каждом случае значения гемаНглютинации рарЕ,papF и papG генных продуктов ос щёетвляют анализ;на гемагг ./тютинаадно нёпр/гярных мУтантных произ: водных вставки Связывающего звена от JDPAP5. BW/ID найдено, что ни papFH- ни рарбй производное не показывает никакой агглютинации Р-эрйтроцитов, демонстрируя тем самым, что как papF, так и papG геннь1е продукты; необходимы для эгглюти- нации. Мутант papEl сам по себе не оказывает влияния на титр гёмагглютйнации, но двойной мутант рРАР2б не аглютинирует Pi-эритроциты, когда трансформируется в штамм E.eoli HB101. ..; ; . Образование пмлусового антигена и характеристики дигалактозидо-специфиче: скрго связывания различных производных мутантов рРАР5 или рРАР22 в штамме E.coli НВ101 суммированы в табл, 1./ ; Плазмиды PSN представляют собой производные р А СУ С164, несущие фрагмеи- ты EcoRI от pRHU 845, каждая плазмида Содержит различные вставки Тп5, в то время как рРАР плазмиды являются производными от р BR322. Пилусовый антиген определяют путем агглютинации на предметном стекле клеточной суспензии с антисыворот- кой, действующей против Рар пили.
Из табл.1 видно, что мутация рарАГ в рРАР23 полностью устраняет образование основного Рар пилусового субзвена (РарА генный продукт) без влияния на дигалакто- зидоспецифическое связывание. И наоборот, мутация papFI в рРАР14 H papGI в рРАРТ устраняет дигалактозидоспецифиче- ское связывание без предотвращения обра- зования; Рар пили. Мутация в генах papG и рарД устраняет как образование пилуса, так й; дигалактозидоспецифическое связывание. Лишь мутации в papF и рарС приводят к устранению дигалактозидоспецифическо- гО связывания без препятствия образованию Рар пили. Единственным исключением является двойной мутант papAI-pap. Е1 который отрицателен для агглютинации. Лишь мутации в рарА или рарЕ являются скрепля- . Этот эффект обусловлен тем факто- рбм, что полипептиды рар А или papF являются предположительно такими, которые требуются для склеивания адгезина со стенкой клетки. Отсюда можно сделать вы- вод, что гены papF и/или рарС. кодируют :дигалактрзидос.пецифическую адгезию.
При м е р 3. Определение ДНК последовательности ДНК пилусового адгезина 100. мкг рРАР9 обрабатывают рестрактазами EcoRI и ВагаН), подвергают препаратив- ному гель-электрофорезу на агарозе для выделения фрагмента EeoRI-BamHI, содержащего зону Smali-BamHl.
Ал и квоты этого parMeHta гиДролизуют с эндонуклеазами .Haelil. Rsal, Aiul, Hpa II, SaK3A, Tag I, Hfnc (I и Bgl II отдельно или в комбинации. Полученные фрагменты клонируют либо непосредственно в ходе, либо после препаративного гельэлёктрофореза на атаррзе, и выделение фрагмента осуществляют в векторы фага М13 (МТЗтрВУи М13тр9). Эти ставки вводят в последовательном порядке до тех пор, пока для обеих ниток не получают однозначные, частично совпадающие показания последовательности ДНК фрагмента Smal-BanrtHI.v
П р и м е р 4. Гены рарЕ, papF и рарС идентифицируют из известного положения генов, определяемых посредством линкеров и вставок ТпБтранспозона и известного: размера их соответствующих генных продуктов, 16,5 Kd 15 Kd и 35 Kd. Идентифицируют N-концы этих генов. Аминокислотную последовательность получают от последовательности ДНК с использованием генетического кода, установленного для Е.срП. Поскольку все генные продукты получают предшественники, содержащие сигнальные пептиды, то можно считать, что 5 -конец гена является метионином с последующей .сигнальной пептидоподобной последовательностью. . /л; V : :. -:;
П р.и м.е р 5. Гомология с ДНК другой уропатогенной E.coli.
Выделяют некоторые фрагменты от зоны SmaH-BamHI и подвергают их 32 Р-мече- нию посредством- ник трансляции. Фрагменты отбирают таким образом, чтобы охватить всю зону в небольших сегментах. Их используют как пробы при гибридизации плазмид рДС5 и pPIL 110-35 в строго контролируемых условиях. От генов рарЕ и papF получают сильные сигналы гибридизации, в то время как от зоны, гена рарС не было получено никаких сигналов. Сильную гибридизацию в строго контролируемых условиях получают от пробы гена рарС между точками Hnai примерно при 3,,4 кв от точки EcoRI.
Строят рестриктные ограничительные карты РДС5 и pPIL 1.10-35 и отмечают, что они почти идентичны ограничительной карте РРАР5 в отношении зон рарС и рарД. Меньшая, хотя м довольно высокая степень сходства наблюдалась для генов рарЕ и papF, Ввиду этого делают вывод, что ДНК, которая кодирует РНА в других уропатоген- ных штамма Е.соН, очень близка ДНК, клонированной в рРАР5 (образованной от
штамма E.coli J 96), и этот результат, полученный для системы Рар, может относиться к большинству пилонефритогенных штаммов. В отношении pPL 110-35 также было продемонстрировано, что мРНА явля- 5 етсядигалактозидоепецифическим. Аналогичные результаты получают с хромосомной ДНК от клинических изолятов, выделенных авторами данного изобретения, а также другими исследователями.10 Слияние между геном рарС и геном
; Плазмиду рРАРЭ обрабатывают с Bgl I и Sal, расположёнными на расстоянии примерно 375 Ьр вправо от точки Bam HI и рРАР9. Полученный фрагмент связывают с 15
плаЗмидойрМС874, который предваритёльно гидролизуют с Bam HI и Sail. После
трансформации в рМС1061 и.посева на пла стйнах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, рекомбинанты анализируют. Была 20
выделена плазмида pHMG51, состоящая из
рРАРЭ, в которой фрагмент Bglljl-Sall замещают рМС874 (фрагмент BamHI и Sail), пбказыйают что она кодирует пептид слияния papQ-uac Z. Этот результат был получен 25 также из известной последовательности гена рарС и последовательности гена lacZ, присутствующего в рМС875.
П р и м е р б. В другом возможном способе, являющемся вариантом способа 30 N-концевые фрагменты ДНК, включающие ген pPF, получают путем гидролиза рРАРЭ с Bgtll. Эту ДНК инкубируют в течение увеличивающихся периодов времени вместе с зн-, донуклеазой Exolll, затем обрабатывают 35 нуклеазой Sli что приводит в результате к увеличивающимся делениям из точки Bgl П. Подсоединяют линкеры Hind III. Эту ДНК затем повторно гидролизуют Smal и Hind 111 и подвергают препаративному гель-элект- 40 рофорезу из агарозе. Фрагменты длиной в . пределах от 1400 до 1000 Ьр выделяют и привязывают к соответствующему вектору, который предварительно гидролизуют с Smal и Hind III.45
Построение фрагментов, содержащих ген рарС осуществляют методом, описанным выше, но путем гидролиза с Bam HI вместо Bgl If. Отбирают фрагменты длиной от 2400 до 1500 Ьр на гель. Построение 50 фрагментов, содержащих ген рарЕ, осуществляют таким же образом с отбором фрагментов в пределах от 800 до 400 Ьр.
Фрагменты ДНК. кодирующие М-конце- вую часть гена papF, клонируют в вектор 55 слияния, такой как pSKS 10, pSKS 105 или pSKS 106, получают гены слияния с геном lacZ, Слившийся ген (ген слияния в этих структурах) транскрибируют промотором lac UV5.
Данную структуру трансформируют в штамм, содержащий ген lacq, например штамм E.coli JM10S, отбираемый для стойкости к ампициллину. Затем этот штамм выращивают в подходящей среде, такой как LB бульон, до оптической плотности ОД 0,4. Транскрипцию слившегося гена индуцируют путем ввода IPTG. Инкубацию продолжают, пока не получается максимальное выражение слившегося генного продукта. Данные клетки затем собирают и слившийся генный продукт очищают.стандартными методами, с использованием анализа на ак- тивноеть/ -галзктозидазы. Этот очищенный продукт слияния используют в испытаниях вакцины, например, на грызунах, обезьянах, СВИНЬЯХ.. : / ; . - ;;
В. Приготовление вакцины.
Любые генные продукты papF, или papG или их соответствующие фрагменты получают следующим образом.
Очищенные белки слияния гена lacZ и генов рарЕ, papF или papG гидролизуют протеазой, например с трипсином или хи- мотрипсином, или химическим реагентом, таким как бромистый цианоген или гидро- ксиламин. Пептид получают из образуемой пептидной смеси стандартными методами. например методом ионообменной хрома- тографии или жидкостной хроматографии высокого давления с обратимыми фазами.
Согласно другому возможному способу антитела, действующие против белков слияния, усиливают свое действие при инъекции их в организм кроликов. Полученные в результате антитела могут использоваться для очистки, нёслившихся чистых генных продуктов рарЕ, papF, или papG от бактерий lacZ, содержащих плазмиду. несущую эти гены. Эта плазмида может быть производной pBR 22, такой как рРАР5, или рРАР16. или производной быстроудаляемой плазми- ды, например рВЕИ28...
Очистку осуществляют методом гель- хроматографии и, иммуносродства или ее антитело используется для анализа ELISA, которое используется для обнаружения пол- ипептидов, когда ведется протокол очистки.
Фрагменты этих очищенных полипепти- дов получают путем расщепления протеазой или другими агентами, как описывалось выше, .Фрагменты, состоящие из 5-30 аминокислот или более генных продуктов рарЕ, papF или papG, синтезируют путем твердо- фазного синтеза пептидов. Затем их могут использовать для вакцинации как таковые или в сочетании с молекулой носителя или с физиологически пригодным носителем, таким как поли L-лизин или поли D.L-аланин,
как со стимулятором, так и без стимулятора. :- . v-:.;-.-,, ,s- -::- ;/Ч.. . -. ..
С. Система; псёвдомонас.
Предположив, что образование пилуса и адгезия связаны в видах Pseudomonas, хромо сомную ДНК от склеивающегося штэмма Ps;eudomonas обрабатывают эндо- нуклеазой, в результате чего получают фрагменты, которые клонируют в производную pBR322, челночный вектор Pseudomonas E.coll, плазмидный вектор или фаговый вектор и трансформируют в E.coll. Бактерии заключающие в себе гибридный вектор, отбирают для получения основного субзвена Pseudomonas пили с использованием антител, д е и ст в у ю щи х п рот и в очищенного Pseudomona s пили. ,.
Полученный клон затем используют для получения последовательности ДНК, содержащей пилиновый ген. Данный фрагмент затем клонируют в челночный вектор Pseudomonas / Е.соН. который переносят в нещлированный, несклеивающийся штамм Pseudomonas, котбры затем анализируют на адгезию и на образование пилуса. Затем осуществляют мутагёнез данного фрагмента в основном таким же образом, как описанов примере 2 в отнощеййи уропатогённых Е.соПстой разницей, что осуществляют анализы в Pseudomohas.
Кроме того, если: хромосомную ДНК клонируют непосредственно в вектор Pseudomonas или челночный вектор Pseudomonas / E.coll и трансформируют в нёсклёивающийся штамм Pseudomonasi то клоны могут быть отобраны путём непосредственного склеивания. Могут использоваться другие анализы, например с определением связывания растворимого рецептора.
Получение белка слияния в E.coll осуществляют способом, аналогичным описанному, хотя возможно должны быть искусственно изменены сигналы инициирования транскрипции и трансляции. Кроме того/получение белка может осуществляться в гомологичных системах в Pseudomonas с использованием например, векторов промотора Тас в широких пределах (Gene 26, 1983, стр. 273-282).: : Анализ на последовательность ДНК и аминокислотный анализ осуществляют в основном, как описано в примерах А и 5, и исходя из анализа этой последовательности могут быть получены синтетические пеп- тиды, как описано выше. Методы, эналогичныетем, которые описаны в примерах 1-5, а также те, которые разработаны для Pseudomonas, могут быть использованы для идентификации и получения адгезивных полипептидов из других склеивающихся бактерий, таких как Nels.seria sp. и др.
В принципе, все исследования могут осуществляться с использованием химии
5 белков, Данные адгезивные полипептиды могут быть обогащены (очищены рецептором, например дйсалактозидом, хроматог- рафиёй сродства или каким-либо другим .подходящим методом (таким как хроматог-0 рафия сродства антитела). Чистота белка может быть определена методом гель-электрофореза полиакриламйда, как описано в разделе Материалы и методы.
При м е р 7. Материалы и методы,
5 используемые в Данном примере.
Бактериальные штаммы, плазмиды и ус ;лрвйя роста.;: .--: ;; ;: : -; ;;;:- : ; .::-:; .; :; ,. .. Все бактериальные штаммы представляют собой производные Ё.соН. К 12. за
0 исключением клинических изолятов, приведенных в табл.2. Для анализа выражения ;белка используют ДАЮ, производное rec A от Р678-54. Клонирование М 1 3 и распределение фага осуществляют в JM 103. Во всех
5 экспериментах хозяином является НВ101
; ;Е;СОМ. ..,:; л.-;,ч,--. .;: ;
ПлаЗмида р РАР5 представляет собой производную pBR322, несущую хромосомный фрагмент EcoR l-Bam HI, 9,5 тпо от
0 E.colf J 96. Этот клон выражает пилусовый антиген F C134.3, который серологически связан с F12. Плазмида РДС 5 представляет собой производное рАСУС284, несущее фрагмент Glal-BamHI 8,0 т.п.о. от E.coll IA2
5 в то время как pPIL 110-35 представляет собой производное рАСУС184, содержащее фрагмент EcoRl 16 т.п.о., выделенный из E.coll АД110, ответственный за образование пилусового антигена Р7г.
0 Для отбора используют указанные концентрации антител: карбенциллин 100 мкг/мл, тетрациклин 15 мкг/мл, канамицин 20 мкг/мл и хлорамфеникол 20 мкг/мл. Бактерии выращивают при температуре 37°С в
5 питательном бульоне, Lurla или на агаре Lurla, .,.... ; ..;. . , / Общие процедуры.
Для трансформации используют процедуру с использованием CaCla. Плазмидную
0 ДНК выделяют путем модификации методики щелочного лизиса, после чего ее подвергают двум последовательным равновесным центрифугированиям в этидийбромиде. Эн- донуклеазы используют в условиях, реко5 мендуёмых изготовителями. ДНК выделяют в 0,5%-1,5%-ном (вес/об) агарозном геле. ДНК фага Я и ДНК фага DIX174, расщеплен- ныесоответственно Hlndlll и Haelll, используют как стандарты молекулярных весов. Фрагменты ДНК получают в чистой форме
путем электроэлюирования из 5%-ных (вес./об) полиакриламидных гелей.
Процедуры мечения и гибридизации,
Меченые (32Р) пробы ДНК приготавливают путем ник-трансляции или путем синтеза основной ДНК, клонированной в однонитевой М13. ДНК плазмиды, фракционированную в агарозном геле, трансформируют на нитроцеллюлозные фильтры.
Точечные меченые фильтры предварительно гибридизуют в течение 2 ч при 68°С в растворе, содержащем: 4xSSC (IxSSC 150 мМ NaCI; 15 мМ цитрата натрия, рН 7), 10 х раствора Denhardt, 0,1% SDS, 2 мМ ЕДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), и ДНК, полученную из клеток зобной железы теленка, озвученную ультразвуком, в концентрации 50 мкг/мл. Затем радиоактивно меченую пробу в свежем растворе гибридизации (1 х 10е отсч/мл) вводят на фильтры, которые инкубируют в течение 18 часов в пластмассовых мешках, при температуре 68°С, промывку осуществляют при той же температуре или концентрациях солей от 2 х SSC и 0,1% SDS до 0,1 х SSC и 0,1% SDS.
Анализ экспрессии белка.
Плазмиды рРАР5, рРАР502, рДС5 и р PIL10-35 трансформируют в клетку с образованием штамма АА10. Радиоактивные образцы разделяют в 15% {вес./об) SDS-полиакриламидном геле. Эти гели последовательно закрепляют, окрашивают, обесцвечивают и.экспонируют в течение 1- 6 дней с использованием рентгеновской пленки.
Определение нуклеотидной последовательности.
Фрагменты ДНК клонируют в М13тр8 и М13тр 9 векторах фага М13 и трансформируют в штамм E.coll М103.
Анализ связывания рецептора.
Связывающие свойства генных продуктов, кодированных плазмидами, приведены в табл.Т и 2, что определяют путем агглютинации на предметном стекле с использованием Pi эритроцитов, содержащих глобозидный рецепторный, и р-эритроциты, в которых отсутствует глобозид.
Анализ пилусового антигена.
Агглютинацию на предметном стекле с использованием антисыворотки, действующей против очищенных Рар пили осуществляют, как описано в разделе Общие материалы и методы. Антисыворотку используют в 500-кратном разбавлении в PBS рН 7,5/,
Построение производных плазмиды для дополнительных анализов.
Плазмида рРАР43 является производной рРАР5, полученной путем гидролиза Smal с последующим связыванием при низкой концентрации ДНК. В этой плазмиде 5 отсутствует зона Smah-SmaU от рРАР5 и, следовательно, она несет лишь гены рарВ и рарА, Для того, чтобы построить производную рРАР502, плазмиду рДС5 полностью гидролизуют рестриктазой Bglll и частично
0 Bam HI с последующей трансформацией в НВ101. Плазмидную ДНК выделяют из трансформантов и отбирают по размеру, Один клон рРАР502 с правильным размером анализируют дополнительно на ртсут5 ствие гена рарС. Плазмиду рРАР503 строят
. путем связывания фрагмента EcoRI-Hlndlll
из pSKS106, несущей протор lac и правый
фрагмент Hindlll-BamHt от рДС5, с pBR322.
гидролизованной EcoRI и BamHl. Плазмиду
0 рРАР504 получают путем гидролиза рРАРБОЗ, рестриктазами Bglll и Bam HI с последующим связыванием при низкой концентрации ДНК. Плазмиду рРАР507 строят путем клонирования фрагмента Hlndlll из
5 рДС5, несущей гены эквивалентные рарА, рарН и рарС, в уникальную точку Hindlll от рРАРБОЗ, отобранную на устойчивость к ам- пициллину и для гемагглютинации. Это про- межуточное звено (рРАР5,06) затем
0 гидролизуют Bglll и BamHl с последующим связыванием с образованием рРАР507, аналогичной построению рРАР504 от рРАР503. Электронная микроскопия. Электронную микроскопию осуществ5 ляют с использованием электронного микроскопа JEOL 100В с медной сеткой размерами отверстий 100 меш. (0,15 мм), покрытой тонкой пленкой из 2% формвара. Бактерии суспендируют в 10 мМ Трис-НС1
0 (рН 7,5), 10 мМ NgCh и помещают на сетку, Избыток бактерий немедленно удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Затем сетку промывают буферным раствором и негативно покрывают в течение пяти секунд
5 3,55% молибдатом аммония с последующей промывкой двукратно дистиллированной водой.
Результаты.
Структурное сравнение рРАР5 с рДС5 и
0 pPIL 10-35.
Хромосомные вставки плазмид наносят на карту с несколькими ограничительными эндонуклеазами. Центральный фрагмент Smai-Kpnl имеет одинаковый размер (4,6
5 т.п.о.) во всехтрех плазмидах, В рРАРбэтот фрагмент кодирует часть дополнительного гена, а также гены рарС и рарД. Никаких различий в физической карте этого центрального фрагмента не обнаружено. Следо- вательно, фрагмент Pstl размером
примерно 370 п.о. и образованный от зоны кодирования рарС в рРАРБ, гибридизуют с фрагментом Pstl равного размера в рДС5 и pPIL 100-35. Аналогичным образом фрагмент Нра 128 п.о. от N - концевой зоны рарС гибридизуют с фрагментами Hpal аналогичного размера от рД С5 pPIL 110-35.
Плазмида pPIL 110-35 несет фрагмент ДНК 5,7 т.п.о., который простирается влево от зоны Smah-Kpnl. Эта зона заключает в себе структурный ген для Р72-пилин, который сохраняет положение, эквивалентное рарА. В этой зоне гомология ограничительной точки не сохраняется. Кроме того, проба длиной 221 п.о. центральной зоны рарАдает лишь слабый сигнал гибридизации с pPtL 110-35 даже при слабом контроле, хотя та же самая зона 5 рар А хорошо гибридизи- руется в строго контролируемых условиях. Это говорит о том, что 5 конец двух пилино- вых генов хорошо сохраняется, в то время как центральная зона значительно отходит от нормы.
Проба ДНК, образованная обычным образом от кодирующей части рарВ, дает сильный сигнал гибридизации с фрагментом Hindlll бт.п.о. OTpPIL 110-35, подтверждая, что этот ген сохраняется и присутствует в эквивалентных положениях в двух клонах. Три гена, рарЕ и рарС, присоединяют к фрагменту 5та1з Ват HI плазмиды рРАР5. Ограничительная структура этого фрагмента меньше сохраняется в рДС5 и pPIL 110-35, чем центральный фрагмент Smali-Kpnl. Фрагмент Smab-Bglli от рРАРб несет рарЕ, papF и 5 -половину papG. Используя этот фрагмент как пробу в экспериментах .по точечному, мечению, обнаруживают сигналы равной силы во всех трех анализируемых плазмидах. Проба Bglll-SmalL, несущая 3 -половину рарС, давая сильный сигнал с рРАР5 ДНК, а гибри- дизируется с рДС5 или pPIL 110-35, даже при слабо контролируемых условиях. Следует отметить, что эти две плазмиды кодируют белки, которые имеют размер, аналогичный размеру рарС от этой зоны. Они имеют аналогичную ограничительную структуру, отличную от рРАР5 в зоне рарС. Для того, чтобы более точно определить границу между гомологией и негомологией, используют большое число клонов М13, несущих зоны рарЕ,papF и papG.
. В качестве проб используют транслированные никрДС5 и pPIL 110-35, Положительные сигналы обнаруживаются во всех М13 пробах, содержащих рарЕ и рарРДНК, Ни один из клонов М13, несущих лишь рарСДНК, не дает положительный сигнал,
Экспрессия белка в клетках.
Белки, кодируемые плазмидами рРАР5, рДС5 и pPIL 110-35, мэтят (35S) метионином в клетках E.coli и радиоактивно меченые генные продукты анализируют в 15% SDS
полиакриламидных гелях. Белки близкого молекулярного веса, такие как рарВ и pap A плазмиды рРАРб, экспрессируются плазми- дой pPIL 110-35, но не от рДС5. Плазмида рДДС5, как и pPIL 110-35, экспрессирует
0 белок. 71-75К и находится примерно в том же положении, что и рарС от рРАРб. Генные продукты рарС от рДС5 и pPIL 110-35 являются слабо выраженными белками с несколько более низким молекулярным весом,
5 чем белок рар С плазмиды рРАР5, в то время как РДС5 и pPIL 110-35 экспрессируют белок с тем же молекулярным весом, что и белок рарД. Для pPIL 110-35 ген, кодирующий данный белок, приближается к зоне,
0 соответствующей рарД,.
Белок рарЕ плазмиды рРАР5 имеет кажущийся молекулярный вес 16,5 КД. Невозможно обнаружить белок того же размера в рДС5 и pPIL 110-35, однако несколько мень5 ший белок, выраженный от обеих плазмид, может быть генным продуктом рарЕ от этих генных скоплений. Все три плазмиды экспрессируют белок 15К, который, как известно, кодирует papF, существенный для
0 связывания глобозида. Белок papG плазмиды рРАР5 представляет собой полипептид 35К. Дальний фрагмент Bglil-BamHI, являющийся производным от рДС5, рРАР502, не экспрессирует полипептид 36К. Он локали5 зует ген для данного белка в той же зоне, что и рарС в рРАР5.
Высоко выраженный полипептид 17К от РДС5 и pPIL 110-35 был приписан периферическому фрагменту Smal-BamH .этих
0 плазмид.
В структурах рРАР5 отсутствует ДНК, эквивалентная данной зоне, и следовательно белок 17К не экспрессируется в этих плазмидах рРАР502,
5. Дополнение между генными скоплениями в рРАР5 и рДС5.
Поскольку рДС5 содержит ДНК в высокой степени гомологичную рарС, рарД, ра- рЕ, papF, то возникает вопрос, может ли
0 рДС5 быть дополненным рарА в рРАР5, чтобы дать информацию о пилусе рарА. Плазмида несет лишь гены рарВ и рарА. Ни НВ101, несущий эту плазмиду, ни тот же штамм с рДС5 не агглютинируются анти-пи5 лусовой сывороткой. Однако когда обе эти совместимые плазмиды присутствуют в одной и той же клетке, то рарА-пилин поверхностно локализуется, как это продемонстрировано путем агглютинации антисыворотки, Исследование с по.мощью
электронного микроскопа подтверждает, что рарА-пилин собирается в форме пили. Ни рРАР43, ни рДС5 индивидуально не выражает поверхностно локализованные пили, когда они заключены в НВ101.
Чтобы выявить может ли адгезивная функция также быть дополнена между генными скоплениями, строят рРАР502 с удалением ДНК от точки Bglll к точке BamHI с правого конца рДС5. По сравнению с рДС5 эта производная не выражает 36К и 17К полипептид в клетках. Предполагается, что согласно структурной карте и данным гибридизации, белок 36К соответствует белку 35К, кодированному рарС от генного скопления рар. Плазмида рРАР502, в противопо- ложность рДС5, не участвует в гемагглютинации. Используя рРАР16 плаз- миду, выражающую рарЕ, papF и papG в рРАР5 в транс, возможно дополнение деле- ции производной от рРАР502 до гемагглютинации. Таким образом, адгезивная функция может быть также транс-дополне- на от одного генного скопления к другому. Плазмиды рРАР18, рРАР17 и рРАР4, которые представляют собой мутанты papEl, papFI и papGI, а также плазмида рРАР16 не дополняют делецию на рРАР502. Плазмида рРАР-503, содержащая фрагмент Hindlll- BamHI от рДС5 под контролем lac промотора, также не участвует в гемагглютинации. Однако рРАРВОЗ может дополнять дефект в рРАР502, как показано на реакции позитивной гемагглютинации с клетками, содержащими обе эти плазмиды. Эти плазмиды используются для дополнения мутаций в клоне рар. рРАРБОЗ дополняет все мутанты вставки Тп5 в papF и papG, в то время как дальняя производная рРАР504 лишь дополняет их в papF. рДС5-производная рРАР507, кодирующая генные эквиваленты papG, рарЕ и papF, дополняет pSN 021, несущую Тп5 мутацию в гене papF. Эти результаты показывают, что данные белки, функционально аналогичные генным продуктам papF и papG, кодированы соответствующими зонами на рДС5. Из экспериментов данного примера можно сделать вывод, что ген рарА и в некоторой степени ген рарС, проявляют непостоянство по трем штаммам E.coli, в то время как ген papF проявляет очень небольшое непостоянство.
Специфичность глобозидного связывания определяют по положительной гемагглютинации на предметном, стекле (НА) Pi-эритроцитов, содержащих глобозидный рецептор, и по отрицательной гемагглютинации (НА)-р-эритроцитов, где отсутствует глобозид (табл.3).
Дополнение плазмидных мутаций, заключающихся в НВ101, осуществляют путем гемагглютинации на предметном стекле Pi-эритроцитов. Мутации papEl и papFI яв- ляются неполярными мутациями, создаваемыми путем мутагенеза вставок связывающего звена.
Мутация papGI является делецией фрагмента SmaM-BamHI, приводящей к срезу
белка papG посредством IK. Тп5 мутации papF::Tn5-021 и papG::Tn5-0,42 внесены в papF и papG гены, соответственно. Плазмиды рРАР16, рРАР18, рРАР17 и рРАРА представляют собой производные рРАРб.
Плазмиды в левой колонке имеют репликой PBR322 (рМВ1), в то время как плазмида в верхней колонке имеет репликон рАСУСИ84 (р15А). Гены, указанные в скобках представляют собой рДС5, эквивалентные соответствующим рар генерам в рРАР5.
П р и м е р 8. Гибридизация клинических изолятов E.coll.
Материалы и методы, используемые в данном примере.
Бактериальные штаммы и плазмиды.
Образцы, состоящие из 6 изол.ятов E.coli, взяты из мочи пациентов со значительным количеством мочевых бактерий ( 10 бактерий/мл) и 96 фекалиевых изолятов E.coli, взятых от здоровых людей. Плазмида рРАР5 несет фрагмент EcoRI-BamHI, который содержит все pap-генные скопления. Плазмида рДС5 кодирует глобозидо- специфический адгезин уропатогенното
штамма E.coli 1A (0:6). Недавно было показано, что эти две плазмиды проявляют значительную гомологию по всей основной части pap-генного скопления. Однако ДНК плазмиды рРАР5, производной гена papG,
не гибридизируется с рДС5. Последовательность ДНК подтверждает значительные расхождения между генами papG в этих двух клонах.
Среда и условия роста.
Полная среда представляет собой питательный бульон Luria om Bertani, дополненный средой Е и 0,2% глюкозы. Бактерии выращивают при 37°С со встряхиванием. Для анализа агглютинации используют чашки (или пластины) с агаровой средой агар Luria.
Анализ связывания рецептора.
Для идентификации диглзктозидного связывания E.coli бактериальные клетки, выращенные в течение 22 ч на не содержащем глюкозу питательном агаре Luria, повторно суспендируют в растворе латексных шариков, покрытых дигалактозидным рецептором. Клетки экспрессируют адгезин.
если они агглютинируют шарики в течение одной минуты.
Приготовление хромосомной ДНК.
Каждый бактериальный изолят выращивают в 100 мл среды LB с содержанием 4x108 кл./мл. Бактерии собирают путем центрифугирования, суспендируют в 40 мл PBS (100 мМ К-фосфатного буфера, рН 7,2, 150 мМ NaCI), повторно центрифугируют и суспендируют в 5 мл PBS н- 0,1 мг/мл протеиназы К, 5 мМ ЕДТА и 0,5% SDS (до- децилсульфат натрия). Суспензию инкубируют в течение ночи при комнатной температуре и, наконец, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом, операцию повторяют дважды.
Получение Р-радиоактивномеченых фрагментов ДНК.
Плазмиду рРАРВ и рДС5 гидролизуют с соответствующими ограничительными ферментами, и фрагменты ДНК очищают и подвергают Р-мечению посредством пик- трансляции.
Процедуры точечного мечения и гибридизации.
Два микрограмма хромосомной ДНК растворяют в 170 мкл 0,1 моль Трис (рН 7,4). После ввода ЗОмкл2ММаОН и 100 мкл 3 моль NaCI, 0,3 моль цитрата натрия смесь инкубируют при 80°С в течение 20 мин. Денатурированную ДНК охлаждают, нейтрализуют 40 мкл 2 моль Трис (рН 7) и наносят на поверхность нитроцеялюлозного фильтра площадью 7 мм2, высушивают воздухом и затем подвергают сушке в вакууме при 65°С в течение 12 ч. Фильтры инкубируют в течение 2ч в 10 х Денхардт (Денхардт: 0,02% поливинилпирролидон, 0,02% Flcoll, 0,02% BSA). Их еще раз инкубируют в растворе, содержащем 4xSSC 0,1% SOS, 2 ммоль ЕДТА, 10 х Денхардт и 50 мкг) мд ДНК клеток зобной железы теленка (нагретой в течение 3 мин при 95°С) и инкубируют в течение часа при 65°С. И наконец их инку-, бируют с радиоактивномеченой пробой в том же растворе, что описан выше, в течение 16 ч при 60°С, затем промывают а 4х SSC 2 раза по 5 мин и 2х SSC 2 раза по 20 мин при 60°С, а затем высушивают воздухом. Фильтры экспонируют с использованием Dupont Cronex 4Х-рентгеновской пленки с усиливающим экраном при -70°С, затем проявляют.
Результаты гибридизации на изолятах E.coll, используемых в данном исследовании, Изоляты
Р-спец.МЙНА Моча Фекалии
Р-спец.МВНА 174
Р-спец.МЯНА 73
г-спец.МРША Общая MRHA Без MRHA Штаммы мочи (66 штаммов)
103 34 10 32 86
Штаммы фекалия (96 штаммов) Р-спец MRHA включает штаммы, которые агглютинируют также эритроциты животных.
0 Р-спец MRHA-эритроциты, которые агглютинируют р-кровь человека.
2-спец. MRHA - Никакой гемагглютина- ции к эритроцитам человека, но к любому из эритроцитов следующих животных: свиньи, 5 овцы,коровы.
Полученные в данном примере резуль- тэты показывают, что большое число клинических изолятов штаммов E.coll, которые связываются с дигалактозидом. содержат 0 области Е, F и G в их рар оперонах, и что штаммы, которые не связываются с дигалактозидом, не содержат зон Е, F, G-pap оперо- на, хотя они имеют другие зоны в опероне.
Формулаизобретения 5 Способ получения антигенного препарата, обладающего адгезивными свойствами, из фимбрий, предусматривающий выделение хромосомной ДНК из урапато- генного штамма Escherichia coll, обработку 0 выделенной ДНК рестриктазой Sau ЗА, кло- .нирование полученных Фрагментов в плаз- мидный вектор рНС 7 , предварительно гидролиоованный рестриктазой, упаковку полученной ДНК в частицы Я-фага, инфици- 5 рование упакованными частицами штамма E.coli K12 или его производных выращивание бактерий на пластинах, содержащих ам- пициллин, и анализ клонов на функцию адгезии, субклонирование EcoR - фрагмен- 0 тов клонов, сохранивших функцию адгезии, в pBR322 или рАСУС184, получение мутантов со вставной транспозона с помощью А-фага CI857 в 221 чех: Тп5, повторное субклонирование фрагмента EcoRl-BamHI, ко- 5 дирующего образование фимбрий и агглютинина в вектор pBR 322 или рАСУС 184, и получение плазмиды рРАР5, или рАР22, или рДС5, или pPIL 110-35, конструирование производных плазмид рРАР14, 0 или рАР115. или рРВРЭ, рРАР1б, или рРАР17, или рРАР138, или рРАР4, или рРАР32, или рРАР58, или рРАР54, или рРАР502, или рРАР504, или рРАРБОЗ, или рРАР507, сохранивших ген рарЕ со следую- 5 щей нуклеотидной последовательностью: ATGAAAAAGATAAGAGGTTTGTGTCTT CCGGTAATGCTGGGGGCAGTGT- TAATGTCTCAGCATGTACATGCAGTTGATA ATCTGACCTTCAGAGGAAAACTGATTATTCCTGCCTGTACTGTAAGCAA
CACAACTGTTGACTGGCAGGATGTAGAGATTCAGACCCTGAGTCAAAAT
GGAAATCACGAAAAAGAGTTTACTGTGAATATGCGGTGTCCCTATAATC
TGGGAACAATGAAGGTTACG ATAACGG С AAC AAACACTTATAAC AATG С
TATTTTAGTTCAGAATACATCAAACACATCTTCTGATGGGTTACTCGTT
TATCTTTATAACAGTAATGCAGGAAATATTGGGACTGCGATAACTTTAG
GGACTCCATTTACGCCCGGAAAAATCACAGGTAATAATGCAGATAAAAC
TATATCACTTCATGCCAAACTTGGATATQ AAGGG AATATG С AG AATTTG
TMAGCCGGTCCTTTCTCTG С A AC AG С AACG CTGGTTG CATC AT ATTCG
TAA
или ген рарЕ со следующей нуклеотидной
последовательностью
ATGATTCGTTTATCATTATTTATATCGT TGCTTCTGACATCGGTCGCT- GTACTGGCTGATGTGCAGATTAACATCAGG GGGAATGTTTATATCCCC- CCATGCACCATTAATAACGGGCAGAATATT GTTGTTGATTTTGGGAAT- ATTAATCCTGAGCACGTGGACAACTCACGT G G Т G A A G Т С А С А А А А А С С - ATAAGCATATCCTGTCCGTATAAGAGTGGC TCTCTCTGGATAAAAGTT- ACGGGAAATACTATGGGAGGAGGTCAGAA TAATGTACTGGCAACAAAT- ATAACTCATTTTGGTATAGCGCTGTATCAG GGAAAAGGAATGTCAACAC- CTCTTATATTAGGTAATGGTTCAGGAAATG GTTACGGAGTGACAGCAG- GTCTGG AC ACAG С ACGTTCAACGTTCACCT TTACTTCAGTGCCCTTTC- GTAATGGCAGCGGGATACTGAATGGCGGG G А Т JT С С A G А С С А С G G С С A G - TATGAGCATGATTTATAACTGA или ген papG со следующей нуклеотидной последовательностью
ATGAAAAAATGGTTCCCTGCI I I I ПАТ TTTTATCCCTGTCAGGCGGTAATGATGCTTTAGCTGGATGGCACAATGTCATGT.TTTATGCTTTTAACGACTATTTAACTACAAATGCTGGTAATGTTAA. GGTTATTGACCAACCT- CAGCTATATATACCCTGGAATACAGGCTCT G С Т А С A G С А А С Т Т-А Т Т А Т - 5 TCGTGCTCAGGTCCGGAATTTGCGAGTGG AGTGTATTTTCAGGAGTAT- CTGG CCTGGATGGTTGTTCCTAAACATGTC TATACTAATGAGGGGTTT- ААТАТАТГТ CTTG ATGTTC AG AG CAAATATG
0GTTGGTCTATGGAGAAT- СААААТСАСАААОАТПТТАСТГСТТТСТТА ATGGTTATGAATGGGAT- ACATGGACAAATAATGGTG-CCCGTATATGT TTCTATCCTGGAAATATG5 AAGCAGTrGAACAATAAATTTAATGATTTAG TATTCAGGGTTCTTTTG- CCAGTAGATCTCCCCAAGGGACATTATAAT TTTCCTGTGAGATATAT A- CGTGGAATACAGCACCATTACTATGATCTC
0 TGGCAGGATCATTATAAA- ATGCCTTACGATCAGATTAAGCAGCTACCT GCCACTAATACATTGATG- TrATCATTCGATAATGTTGGGGGATGCCAG CCGTCAACACAAGTACTT5 AATATAGACCATGGGAGTATTGTGATTGAT CGTGCTAACGGAAATATT-. AGCAAGTCAGACGCTTTCAATTTATTGCGA Т G Т А С С A G Т Т A G Т G Т А А А- ATATCTCTGCTCAGAAATACACCACCAATA
0 TACAATAATAATAAATTT- TCGGTTGGGTTAGGTAATGGCTGGGATrCG ATAATATCTCTTGATGGG- GTTG AACAG AGTG AG G AAATATTACG CTGG TACACAGCCGGCTCAAAA5 ACAGTAAAGATTGAGAGCAGGTTGTATGGT. GAAGAGGGAAAGAGAAAA- CCCGGGGAGCTATCTGGTTCTATGACTATG GTTCTGAGTTrCCCCTGA лигирование BglU-Salll фрагмента - произ0 водных плазмиды с вектором рМС 874, последовательно обработанным эйдонук- леазами Bglll и Salll, трансформацию ре- комбинантными плазмидными ДНК штамма бактерий Escherlchia coll, выра5 щивание, выделение и очистку целевого продукта с помощью аффинной хроматограф ии.
Таблица 1
Характеристики плазмид, используемых для составления карты и функционального
анализа рарА, рарЕ, papF и papG
Изобретение касается получения антигена из фимбрий. Способ получения антигенного препарата из фимбрий состоит в том, что выделяют в ДНК из уропатогенного штамма фимбрий Escherichia coli с последующим субклонированием данной ДН К в век- торы. Получены ряд плазмидных ДНК рРАР14,рАР115. рРАРЭ, рРАР16, рРАР17, рРА138, рРАР4, рРАР32, рРАР58, рРАР54, рРАР502, рРА504, рРАР503, рРАР507 с геном рарЕ и papG, трансформируют получен- ными ДНК штаммы Escherichia coll, выращивают трансформированные штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта с помощью аффинной хро- матографии. 3 табл.
Характеристики штаммов E.coll и Tl и плазмидных клонов, кодирующих
соответствующий адгезин
Т а б л и ц а 3
Поверхностное выражение глобозидо-специфического адгезина путем дополнения
между генами от рРАРБ и рДС5
Таблица.2
