Штамм бактерий Escherichia coli С41для получения пробиотического препарата для профилактики колибактериоза сельскохозяйственных животных Российский патент 2023 года по МПК A61K35/741 C12N1/20 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к средствам для профилактики колибактериоза и других желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы.

Бактериальные инфекции в животноводческих и птицеводческих хозяйствах России ежегодно регистрируются у 20-50% поголовья. Согласно многочисленным исследованиям, распространенность колибактериоза колеблется в широких пределах, а связанная с ним смертность животных, по приблизительным оценкам, составляет от 20 до 70% (Мотузко С.Н. Возрастные особенности амилолитической активности желудочно-кишечного тракта у коров. Ученые записки УО ВГАВМ. 2015, 51(1): 84-87; Sola-Gines М. et al. Diversity of multi-drug resistant avian pathogenic Escherichia coli (APEC) causing outbreaks of colibacillosis in broilers during 2012 in Spain. PLoS One. 2015, 10(11): e0143191; Bashahun G.M., Amina A. Colibacillosis in calves: A review of literature. Journal of Animal Science and Veterinary Medicine Volume. 2017, 2(3): 62-71. doi.org/10.31248/JASVM2017.041; Barros M.M. et al. Swine Colibacillosis: Global Epidemiologic and Antimicrobial Scenario. Antibiotics. 2023, 12(4):682. doi.org/10.3390/antibioticsl2040682). Наиболее значимые в эпизоотическом плане представители энтерогеморрагических и энтеротоксигенных штаммов Е. coli различных серогрупп, в том числе О8, О15, О20, О101, О115, О149, О157 (Ishimaru К. et al. Escherichia coli 08:H8 Carrying a Novel Variant of the Heat-Labile Enterotoxin LT2 Gene Caused Outbreaks of Diarrhea. Open Forum Infect Dis. 2020, 7(1): ofaa021. doi: 10.1093/ofid/ofaa021; Frydendahl K. Prevalence of serogroups and virulence genes in Escherichia coli associated with postweaning diarrhoea and edema disease in pigs and a comparison of diagnostic approaches. Vet Microbiol. 2002, 85(2):169-182. doi: 10.1016/s0378-1135(01)00504-1; Veilleux S., Dubreuil D.J. Presence of Escherichia coli carrying the EAST1 toxin gene in farm animals. Veterinary Research. 2006, 37(1), pp. 3-13.10.1051/vetres:2005045.hal-00903013).

Распространение заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), и, в частности, колибактериоза на животноводческих и птицеводческих комплексах зависит от многих факторов: наличия источника возбудителя инфекции, восприимчивости животных, а также от эффективности проводимых профилактических мероприятий (Овод А.С, Ирский А.Г., Сидоренко Н.М. Система профилактических мероприятий и контроль за их выполнением при бактериальных и вирусных заболеваниях телят, 2001: 19). Специфическая профилактика животных осуществляется путем вакцинации поголовья препаратами, имеющими в своем составе эшерихиозные антигены факторов адгезии и энтеротоксинов ограниченного ряда. При этом, показано, что О-серотипы применяемых вакцинных штаммов Е. coli встречаются у полевых изолятов с частотой от 30,3 до 55,2%, а у заболевших и павших телят отмечался рост числа изолятов, несущих антигены, отсутствующие в коммерческих вакцинах (Ломако Ю.В., Андросик Н.Н. Антигенная структура изолятов кишечной палочки, выделяемых в Республике Беларусь при колибактериозе новорожденных телят. Известия Академии аграрных наук Республики Беларусь. 2002, 2: 70-72). Еще одним крайне важным аспектом профилактики, а также лечения заболеваний ЖКТ и колибактериоза на предприятиях животноводства считается применение пробиотических препаратов, имеющих различную природу и состав, и обеспечивающих позитивное воздействие на микробиоту животных (Markowia Р., K. The role of probiotics, prebiotics and synbiotics in animal nutrition. Gut Pathog. 2018, 10:21). Можно полагать, что для профилактики колибактериоза в качестве дополнительного этапа/шага в регионах целесообразно использовать пероральный краткосрочный прием штаммов микроорганизмов, относящихся к серогруппам, представители которых постоянно циркулируют и вызывают заболевания животных в регионе.

Наиболее известен штамм Escherichia coli М-17, на основе которого создан пробиотический препарат «Колибактерин», содержащий лиофилизированные живые бактерии (Авторское свидетельство №189128 опубл. 17.11.1966), который секционирован на основе штаммаЕ. coli 06:К5:Н1 Nissle 1917 (Schultz М., Burton J.P. Chapter 5 - Escherichia coli Nissle 1917, Editor(s): Floch M.H., Ringel Y., Walker W.A. The Microbiota in Gastrointestinal Pathophysiology. Academic Press. 2017, pp. 59-69). Штамм содержит введенную неконъюгативную, немо бил изуемую плазмиду pColap с генами продукции колицина Е1 и устойчивости к ампициллину. Лечебное действие обусловлено антагонистической активностью Е. coli в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Недостатком штамма является то, что он создан на основе штамма М-17, выделенным от человека, то есть имеет невысокий уровень колонизационной активности в отношении животных. Штамм имеет антигены комменсальной группы. Кроме того, штамм не в достаточной степени адаптирован к изменившимся современным условиям окружающей среды (рост антибиотикорезистентности и толерантности к бактериоцинам у бактерий - возбудителей кишечных инфекций сельскохозяйственной птицы), а именно, данный штамм теряет свои антагонистические свойства и обладает выраженной чувствительностью к колицинам.

Известен также штамм природный штамм ЛЭГМ N18 (ВКПМ В-6240), предложенный для производства колибактерина средства, способствующего восстановлению нормального биоценоза кишечника (Пшеничнов Р.А., Вотяков В.Н., Колотов В.М. Патент РФ №2065875 С1. 1996.). Штамм ЛЭГМ N18 отличается высокими репродуктивными свойствами, высокой антагонистической активностью в отношении болезнетворных шигелл Флекснера и Зонне, повышенной резистентностью к большинству колицинов и антибиотиков, апатогенен, нетоксичен, обладает повышенной устойчивостью к действию активного хлора и УФ облучения. Недостатком штамма является то, что он выделен от человека, то есть имеет невысокий уровень колонизационной активности в отношении животных. Штамм имеет антигены комменсальной группы эшерихий.

Наиболее близким к данному изобретению может быть препарат, созданный на основе штаммов Е. coli, выделенных от животных (Е. coli 271 АТСС 202020, Е. coli 786 АТСС 202018, Е. coli 797 АТСС 202019) (US 5965128 A, Doyle et al., 12.10.1999; WO 99/08532 A1, 25.02.1999). Штаммы способны снижать или уничтожать инокулированную предварительно в кишечник телят Е. coli 0157:Н7. Недостатком штаммов, входящих в препарат, является также их серогрупповая принадлежность - штаммы отнесены к комменсальным серогруппам эшерихий.

В связи с этим изучение лечебной эффективности пробиотиков в ветеринарной практике является актуальным и своевременным. Арсенал штаммов, используемых для создания препаратов при лечении и профилактике бактериальных кишечных инфекций, может быть значительно расширен за счет новых культур, адаптированных к имеющимся условиям, выделенных от здоровых животных, с высокой колонизационной и антагонистической активностью.

Задачей изобретения является получение штамма с более высокими качественными и количественными действующими характеристиками по сравнению со штаммом М-17, а именно, обладающего более высокой колонизационной способностью и антагонистической активностью против возбудителей колибактериоза животных, и более широким спектром протективной активности в отношении энтеропатогенных эшерихий.

Данная задача решается путем выделения и характеристики нового штамма-продуцента бактериоцинов, выделенного от здорового животного (коровы) Е. coli С41, что повышает шанс «прижиться» бактериям в кишечнике сельскохозяйственных животных и птицы. Кроме того, штамм является представителем энтеропатогенной серогруппы эшерихий, но не имеет энтеротоксинов, что может приводить к антигенной стимуляции и формированию адаптивного иммунитета в отношении представителей энтеропатогенных Е. coli.

Технический результат, обеспечивающий решение задачи, заключается в получении штамма с более выраженным и расширенным спектром антагонистической активности, более высоким уровнем колонизационной способности, принадлежащем к группе энтеротоксигенных эшерихий (ЕТЕС), но не продуцирующем энтеротоксины, что создает предпосылки для создания препарата, эффективного для профилактики и лечения колибактериоза и других заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц.

Заявляемый штамм бактерий Е. coli С41 депонирован во «Всероссийской коллекции микроорганизмов» (ВКМ), и имеет регистрационный символ ВКМ В-3707Д как штамм с антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов iv vitro и защитным действием in vivo. Штамм выделен из фекалий здоровой коровы крупного животноводческого хозяйства Пермского края, Россия.

Заявляемое изобретение полезно для предотвращения инфицирования, либо снижения или элиминации энтеропатогенных эшерихий у животных и/или птицы путем введения эффективного количества штаммов или комбинации потенциально пробиотических штаммов бактерий.

Изобретение поясняется иллюстрирующими материалами:

На Фиг. 1. Представлена гистоархитектоника кишечника крыс, инфицированных Е. coli С55: А - интактные животные, Б - инфицированные животные, В - животные, предварительно получившие Е. coli С41 в течение 5 дней в дозе 5x10⁸ КОЕ/голову. Примечание. Черной стрелкой указаны участки десквамации эпителия.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Характеристика комменсального генотипа штамма Е. coli С41.

Полный геном штамма Е. coli С41 был получен методом секвенирования длинными прочтениями с использованием технологии Oxford Nanopore (MinlON, проточная ячейка R10.4.1). Функциональная аннотация генома Е. coli С41 подтвердила отсутствие генов энтеротоксинов (stxl/2, est, elt, ehxa и пр.), гемолизинов, капсул, вирулент-ассоциированных фимбрий (pap, sfa, qfa/drd), мобильных генов устойчивости к антибиотикам. Штамм Е. coli С41 содержал кластеры генов, кодирующих фимбрий типа 1 (fimB, fimE, fimAICDFGH), длинные полярные фимбрий (гены lpfABCDE) и керли (гены csgDEFG и csgBAC). Геном Е. coli С41 также содержал полный набор генов биосинтеза порообразующего колицина Е1, расположенных на хромосоме (cei - ген иммунности к колицину) и в неконъюгативной плазмиде рС41_2 (гены сеа и cel). Кластер синтеза энтеробактина был обнаружен в хромосоме. Согласно результатам мультилокусного сиквенс-типирования штамм Е. coli С41 принадлежал к серогруппе O149.

Пример 2. Антагонистическая активность in vtro штамма Е. coli С41. При

изучении антагонистической активности использовали методику отсроченного антагонизма в жидкой питательной среде. В качестве патогенных использовали полевые и референтные культуры: Е. coli - возбудители колибактериоза птиц (Е. coli BR4, Е. coli BR35, Е. coli BR37), диареегенные Е. coli (Е. coli СА29, Е. coli СА43, Е. coli СА46), Klebsiella pneumoniae АТСС®700603, Staphylococcus aureus ATCC®25923, Shigella flexneri, Salmonella enterica serotype Typhimurium (далее Salmonella Typhimurium), P. aeruginosa ATCC®27853, Proteus mirabilis. О наличии и степени антагонистического действия судили по снижению оптической плотности в присутствии супернатантов пробиотических бактерий в сравнении с контролем ростом культуры без добавления супернатантов. Рассчитывали индекс ингибирования (ИИ) для 22 ч культивирования. Антагонистическая активность штамма в отношении ряда представителей условно-патогенных и патогенных микроорганизмов представлена в таблице 1.

Супернатанты оказывали антагонистическое действие на патогенные для птиц E. coli (BR4, BR35, BR37), диареегенные Е. coli (СА29, СА43, СА46, O157), К. pneumoniae, и, в меньшей степени, на S. flexneri и S. aureus. После 22 ч культивирования супернатанты Е. coli С41 ингибировали рост птичьей патогенной Е. coli BR35 более эффективно, чем Е. coli М-17 (р=0,02), а также энтеротоксигенного штамма Е. coli СА46 (р=0,02 соответственно) (таблица 1). Следует отметить, что супернатанты Е. coli С41 эффективно ингибировали рост K. pneumoniae на 55,1%.

Пример 3. Изучение специфической и неспецифической адгезии штамма Е. coli С41. Изучение бактериальной адгезии к эритроцитам проводили по методу Бриллиса в эппендорфах (Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. Лабораторное дело. 1986. №4. С. 210 212). Для учета адгезивных свойств бактерий использовали эритроциты человека О (I) группы крови Rh (+) и животных (коровы). Эритроциты отмывали фосфатным буфером, затем разводили до концентрации 10⁸ эритроцитов в мл. Суспензию бактерий готовили в концентрации 10⁸ клеток/мл, смешивали с эритроцитарной массой в соотношении 1:1 и инкубировали при 37°С с перемешиванием 120 об/мин в течение 30 мин. Мазки крови готовили и окрашивали 0,5% раствором генцианвиолета (Lenchenko Е. et al. Morphological and adhesive properties of Klebsiella pneumoniae biofilms. Veterinary World. 2020, 13:197-200. doi: 10.14202/vetworld.2020.197-200). При оптической микроскопии препаратов учитывали три следующих показателя: 1 средний индекс адгезии (AAI), представляющий собой среднее количество микроорганизмов, прикрепленных к поверхности одного эритроцита; 2 - коэффициент адгезии (АС), процент эритроцитов, имеющих на поверхности бактерии; 3 индекс адгезии микроорганизмов (IAM), известный как соотношение AAI и АС. Подсчет проводили на 100 клетках, просматривая все предметное стекло. В зависимости от значений IAM микроорганизмы считались: неадгезивными (IAM<1,75), низкоадгезивными (IAM 1,76-2,49), среднеадгезивными (IAM - 2,50-3,99), высокоадгезивными (IAM>4,0).

Оценка адгезивных свойств исследуемых бактерий показала, что штамм Е. coli С41 имел уровень адгезии к гидрофобной поверхности, сравнимый с Е. coli М-17, а к гидрофильной поверхности продемонстрировал адгезионную способность на уровне 22,7±1,2%, что значимо выше, чем у контрольного штамма Е. coli М-17. К эритроцитам человека и животных Е. coli С41 имел средний уровень адгезии и лучше адгезировался к эритроцитам животных, чем Е. coli М-17.

Пример 4. Безвредность штамма Е. coli С41. Оценку безвредности (токсичности) препарата для животных проводили в соответствии с ГОСТ Р 54063-2010 «Средства лекарственные для животных. Методы определения безвредности» (https://docs.cntd.ru/document/1200084458). Эксперименты выполняли в условиях вивария на крысах линии Wistar в период 10 дней. Животные были разделенных на три группы (контрольная и две опытные) по 6 особей в каждой. Опытным животным препарат вводили перорально в дозе 5×10⁸ и 5×10¹⁰ клеток/голову. Условия содержания (плотность посадки, фронт кормления и поения, температура, влажность, освещенность) были в пределах норм, рекомендуемых ВНИТИП. Общий уход за животными осуществлялся в соответствии с ГОСТ №33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур» (https://docs.cntd.ru/document/1200127789). В период проведения испытания вели ежедневное наблюдение.

Выживаемость крыс при 5-дневном пероральном введении в дозах 5×10⁸ и 5×10¹⁰ клеток/голову штамма Е. coli С41 составила 100%. Симптомов заболеваний, отклонений в поведении не было, животные были активны, хорошо потребляли корм и воду. Введение бактерий в дозе 5×10¹⁰ не оказывало токсических эффектов (была безвредна). При изучении гематологических и биохимических показателей отклонений от норы не выявлено. При вскрытии животных патологических изменений в органах не обнаружено.

Пример 5. Защитная активность пробиотика Е. coli С41 in vivo. Протективная активность потенциально пробиотического штамма оценивалась по изменениям в составе микробиома кишечника крыс, а также по влиянию на клетки кишечного эпителия в экспериментальной инфекции. Предварительное введение штамма Е. coli С41 на протяжении 5 дней в дозе 5×10⁸ КОЕ/голову оказывало профилактическое действие, защищая крыс от колонизации и патогенного действия Е. coli С55, введенного животным однократно в дозе 5х10⁸ КОЕ/голову. В группе без предварительного введения потенциально пробиотического штамма (инфекционный контроль) после инфицирования токсигенным штаммом Е. coli С55 в кишечной микробиоте крыс появилась гемолитическая кишечная палочка (Е. coli hem+). У крыс, которые предварительно получали Е. coli С41 гемолитических эшерихий обнаружено не было. Важно подчеркнуть, что при применении Е. coli С41 не происходило сдвигов в составе нативной комменсальной микробиоты: уровень полезных представителей, таких как Bifidobacterium, Lactobacillus и Enterococcus, сохранялся или даже был с тенденцией к увеличению.

В крысиной модели показано, что предварительное пероральное введение Е. coli С41 эффективно предотвращало разрушение кишечного барьера, блокирующего доступ патогенных микроорганизмов и их метаболитов к субэпителиальным клеткам (Фиг. 1).

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой штамм бактерий Escherichia coli C41 под регистрационным номером ВКМ В-3707Д, обладающий антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов iv vitro и защитным действием in vivo. Изобретение позволяет получить штамм с более выраженным и расширенным спектром антагонистической активности, более высоким уровнем колонизационной способности, принадлежащий к группе энтеротоксигенных эшерихий (EТEC), но не продуцирующий энтеротоксины, что создает предпосылки для создания препарата, эффективного для профилактики и лечения колибактериоза и других заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы. 1 ил., 3 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Escherichia coli C41 под регистрационным номером ВКМ В-3707Д, обладающий антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов iv vitro и защитным действием in vivo.