Биопротектор для улучшения кондиционных свойств семян и снижения фитотоксичности тяжелых металлов Российский патент 2023 года по МПК A01C1/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, микробиологии и биотехнологии, в частности, к защите растений от ионов тяжелых металлов, а также биоудобрений и стимуляторов роста.

В настоящее время во всем мире наблюдается тенденция к повышению концентрации тяжелых металлов (ТМ) в объектах окружающей среды. Основными источниками загрязнения тяжелыми металлами являются промышленные предприятия металлургической и нефтегазовой отрасли, а также высокий уровень выбросов выхлопных газов автотранспорта [Dietrich Μ. et al. The first pollution investigation of road sediment in Gary, Indiana: Anthropogenic metals and possible health implications for a socioeconomically disadvantaged area//Environ. Int. 2019. Vol. 128. P. 175-192].

По данным Росстата в 2020-2021 гг. добывающие отрасли промышленности, являющиеся непосредственным источником загрязнения почвы ТМ, в РФ выросли на 10,0% и 14,2%, соответственно, по сравнению с 2019 г. [https://rosstat.gov.ru/folder/313/document/151988]. Показано, что наиболее часто в загрязненных почвах, в том числе и в почвах сельскохозяйственного назначения, встречаются такие ТМ, как Cd, Со, Cr, Cu, Ni, Mo, Pb и Zn [Li D. Soil heavy metal contamination related to roasted stone coal slag: a study based on geostatistical and multivariate analyses // Environ. Sci. Pollut. Res. 2016. Vol.23, No. 14. P. 14405-14413; Zhang J. et al. Distinction between Cr and other heavy-metal-resistant bacteria involved in C/N cycling in contaminated soils of copper producing sites // J. Hazard. Mater. 2021. Vol.402. doi: 10.1016/j.jhazmat. 2020.123454].

Необходимо отметить, что в разных странах существуют свои показатели предельно-допустимой концентрации содержания ТМ в почвах [Ayangbenro А.А, Babalola О.О. New Strategy for Heavy Metal Polluted Environments: A Review of Microbial Biosorbents // Int. J. Environ. Res. Public Health. 2017. Vol. 14, No. 1. P. 94]. Так, например, стандарты допустимого содержания ТМ в почвах Индии и стран Евросоюза составляют 3 6, 135 270, 75-150, 250-500 и 300-600 мг/кг для Cd, Cu, Ni, Pb и Zn, тогда как в России к содержанию ТМ в почвах относятся более требовательно и предельно-допустимые концентрации ТМ значительно ниже [ГН. 2.1.7.2041-06, 2006; Nagajyoti Р.С., Lee K.D., Т. Sreekanth V.M. Heavy metals, occurrence and toxicity for plants: a review // Environ. Chem. Lett. 2010. Vol.8, No. 3. P. 199-216].

При попадании в почву ТМ вступают в ряд физических, химических, физико-химических и физиолого-биохимических взаимодействий, в ходе которых они свободно аккумулируются в живых объектах, в том числе и в сельскохозяйственных растениях [Lu Η. et al. Alkaline amendments improve the health of soils degraded by metal contamination and acidification: Crop performance and soil bacterial community responses // Chemosphere. 2020. Vol. 257. doi: 10.1016/j.chemosphere.2020.127309]. Вследствие этого происходит постоянное повышение содержания токсичных элементов в сельскохозяйственной продукции, снижается урожайность и содержание питательных элементов в растениях. Регулярное употребление в пищу данной сельскохозяйственной продукции приводит к накоплению ТМ в организме человека и оказывает цитотоксичное, канцерогенное и мутагенное влияние [Pan L. et al. A review of heavy metal pollution levels and health risk assessment of urban soils in Chinese cities // Environ. Sci. Pollut. Res. 2018. Vol. 25, No. 2. P. 1055-1069; Shen Z. et al. Ecological and health risks of heavy metal on farmland soils of mining areas around Tongling City, Anhui, China// Environ. Sci. Pollut. Res. 2019. Vol. 26, No. 15. P. 15698-15709].

Накопление ТМ вегетативными органами высших растений приводит к ингибированию их роста, укорачиванию побегов, подавлению процесса корнеобразования, снижению интенсивности фотосинтеза, уровня транспирации и тургорного давления, а также к снижению содержания каротиноидов и разрушению хлорофилла [Пугаев С.В. Содержание свинца, меди и марганца в компонентах антропогенно-измененных биогеоценозов // Российский научный мир. 2013. №1. С. 43-49; Аветисян А.А., Колесников В.Α., Аветисян А.Т. Содержание тяжелых металлов (свинец и кадмий) в почвах и растениях нетрадиционных кормовых культур и их эколого-токсикологическая оценка в лесостепи Восточной Сибири // Вестник КрасГАУ. 2017. №6. С. 17-27].

В настоящее время актуален поиск экологически безопасных способов снижения токсического действия ТМ на рост и развитие сельскохозяйственных культур растений. Перспективными соединениями, способствующими увеличению устойчивости растений к ТМ, являются экологически безопасные Rhodococcus-биосурфактанты. Ранее нами было показано влияние Rhodococcus-биосурфактантов из Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 на снижение фитотоксичности некоторых ионов ТМ [Литвиненко Л.В., Тищенко А.В. Влияние Rhodococcus Rhodococcus-биосурфактантов на фитотоксичность ионов свинца // Вестник Пермского государственного университета. Серия Биология. 2017. Вып. 1. С. 80-87; Тищенко А.В., Литвиненко Л.В., Ившина И.Б. Снижение фитотоксичности кадмия с использованием Rhodococcus-биосурфактантов // Вестник Пермского университета. Серия Биология. 2018. №4. С. 385-392; Tishchenko Α., Litvinenko L., Shumikhin S. Effects of Rhodococcus-hiosurfactants on the molybdenum ion phytoxicity // IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 2019. Vol. 487, No. 1. P. 1-6. doi: 10.1088/1757-899X/487/1/012021; Литвиненко Л.В., Тищенко A.B. Изучение фитотоксичности никеля в присутствии Л/гос/ососсмв-биосурфактантов // Вестник Удмуртского университета. Биология. Науки о земле. 2019. №1. С. 71-79; Litvinenko L.V., Tishchenko Α.V., Ivshina I.B. Decreasing the Copper Ion Phytotoxicity Using Rhodococcus Bio surfactants // Biology Bulletin. 2019. Vol. 46, No. 10. P. 135-140].

Сравнительные данные по изучению степени токсичности гликолипидных биосурфактантов из R. ruber свидетельствуют о том, что Rhodococcus-биосурфактанты в 10-1000 раз менее токсичны, чем синтетические сурфактанты (стеарат сукрозы DK50; корексит 9597; инипол ЕАР22; финазол OSR-5) и в 2 10 раз, чем трегалозо- и рамнолипиды из R. erythropolis и Pseudomonas aeruginosa [Куюкина Μ.С. Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение: дис… д-ра биол. наук. Пермь, 2006. 295 с; Костина Л.В., Куюкина М.С, Ившина И.Б. Методы очистки загрязненных тяжелыми металлами почв с использованием (био)сурфактантов (Обзор) // Вестник Пермского государственного университета. Серия Биология. 2009. Вып. 10, №36. С. 95-110; Christofi N, Ivshina I.B. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation // Journal of Applied Microbiology. 2002. Vol.93. P. 915-929].

Показано, что Rhodococcus-биосурфактаты могут являться дополнительным источником микроэлементов, необходимых для прорастания семян сельскохозяйственных растений, а также способствуют улучшению кондиционных свойств семян и их проростков [Christofi Ν., Ivshina I.B. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation // Journal of Applied Microbiology. 2002. Vol. 93. P. 915-929; Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Krivoruchko A.V. Hydrocarbon-oxidizing bacteria and their potential in eco-biotechnology and bioremediation. In: I. Microbial Resources: From Functional Existence in Nature to Industrial Applications, Academic Press, Cambridge. 2017. P. 121 148; Litvinenko L.V., Tishchenko A.V., Ivshina I.B. Reduction of Copper Ion Phytotoxicity Using Rhodococcus-Biosurfactants // Biology Bulletin, 2019. Vol.46, No. 10. P. 135-140; Tishchenko A.V., Litvinenko L.V., Shumikhin S. A. Effects of Rhodococcus-hiosuifactants on the molybdenum ion phytotoxicity // IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 2019. Vol. 487, No. 1. 012021. doi: 10.1088/1757-899Х/487/1/012021; Litvinenko L.V., Tishchenko A.V., Peshkur T.A., Cunningham C.J., Ivshina I.B. Smart innovation to reduce phytotoxicity of heavy metals using Rhodococcus biosurfactants // Lecture Notes in Networks and Systems. 2021. Vol. 342. P. 411 420].

Технической задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение биопротектора из Rhodococcus ruber ИЭГМ 346, улучшающего кондиционные свойства семян сельскохозяйственных растений и их проростков и снижающего фитотоксическую нагрузку ТМ (Cd, Со, Cr, Cu , Ni, Mo, Pb, Zn).

Техническим результатом изобретения является снижение (до 50 раз) фитотоксичности тяжелых металлов и улучшение (до 33,5 раз) кондиционных свойств семян и их проростков.

Данный технический результат достигается посредством предварительной обработки семян водной эмульсией 2,0 г/л неочищенного препарата Rhodococcus-биосурфактантов, продуцируемого штаммом Rhodococcus ruber ИЭГМ 346 при культивировании в жидкой минеральной среде с н-гексадеканом или н-додеканом (1,0 об.%).

Применение заявленного способа способствовало снижению (до 50 раз) фитотоксичности тяжелых металлов (Cd, Со, Cr, Cu, Ni, Mo, Pb, Zn) и улучшению (до 33,5 раз) кондиционных свойств семян сельскохозяйственных культур растений (Avena sativa L., Medicago sativa L., Sinapis alba L., Phleum pretense L., Raphanus sativus var. radicula, Trifolium pretense L., Trifolium repens L., Vicia sativa L.) и их проростков. После предварительной обработки семян биопрепаратом интенсивность прорастания корней и проростков возрастала до 33,5 раз по сравнению с таковой без добавления биопрепарата даже в условиях загрязнения окружающей среды ионами тяжелых металлов. Уровень всхожести и энергии прорастания семян сельскохозяйственных растений усиливался в среднем до 30 раз и зависел от концентрации ионов тяжелых металлов в среде. Устойчивость сельскохозяйственных растений к тяжелым металлам возрастала до 50 раз.

В способе используется чистая бактериальная культура Rhodococcus ruber ИЭГМ 346 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер 285 во Всемирной федерации коллекции культур, www.iegmcol.ru; реестровый номер УНУ 73559, www.ckp-rf.ru/usu/73559). Данный штамм выделен из бытовой сточной воды в г. Харбин, КНР и депонирован в Национальный биоресурсный центр Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ АС-2106.

Изобретение осуществляется следующим образом:

Бактериальную культуру выращивают в жидкой минеральной среде RS (Rhodococcus Surfactant) на орбитальном шейкере или в ферментере в течение 7 сут (140 об./мин, 28°С). Состав среды RS (г/л): Na₂HPO₄ - 2,00; KH₂PO₄ - 2,00; KNO₃ - 1,00; (NH₄)₂SO₄ - 2,00; NaCl - 1,00; MgSO₄×7H₂O - 0,20; CaCl₂×2H₂O - 0,02; FeCl₃×7H₂O - 0,01. В качестве единственного источника углерода и энергии используют н-додекан (С₁₂) либо н-гексадекан (C₁₆) в концентрации 1,00 об. %. В качестве источника витаминов и фактора роста добавляют раствор микроэлементов по Пфеннигу 1,00 мл/л и 10%-ный дрожжевой экстракт - 1,00 мл/л. Неочищенную эмульсию Rhodococcus-биосурфактантов подвергают ультразвуковому озвучиванию (30 мин) в условиях обязательного охлаждения. Семена сельскохозяйственных растений перед проращиванием или посадкой обрабатывают (замачивают) в водным растворе, содержащем эмульсию Rhodococcus-биосурфактантов (2,0 г/л), в течение 30 мин. Изучение влияния Rhodococcus-биосурфактантов на фитотоксичность тяжелых металлов проводили в условиях загрязнения среды прорастания солями ТМ (СН₃СОО)₂Cd×2H₂O, Со(NO₃)₂×6H₂O, CuSO₄×5H₂O, K₂CrO₄, (NH₄)₆Mo₇O₂₄×4H₂O, NiSO₄×7H₂O, Pb(NO₃)₂, ZnSO₄×7H₂O в концентрациях 1, 10, 50, 100 и 200 ПДК. Все эксперименты проводили в пятикратной повторности. В таблицах для условного обозначения биосурфактантов, продуцируемых родококками в жидкой минеральной среде с н-додеканом, нами использована аббревиатура БС C₁₂; для биосурфактантов, продуцируемых родококками в среде с н-гексадеканом, - БС С₁₆.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами

На Фиг. 1. приведена гистограмма, иллюстрирующая влияние Rhodococcus-бисурфактантов (БС) 2,00 г/л на всхожесть и энергию прорастания семян, где: В - вика полевая; Г - горчица белая, К1 - клевер луговой; К2 - клевер ползучий; Л - люцерна посевная; О - овес посевной, Ρ - редис красный; Τ - тимофеевка луговая.

* - статистически достоверно (р<0.05) от Rhodococcus-биосурфактантов.

На Фиг. 2. гистограмма, иллюстрирующая влияние кадмия на всхожесть семян Sinapis alba L в присутствии биосурфактантов.

Где: А - БС C₁₂, В - БС C₁₆, Вода - контроль; 1, 10, 50, 100 - кадмий в концентрации 1, 10, 50, 100 ПДК; 1/2, 1/4, 1/8 концентрация биосурфактантов, г/л.

* Статистически достоверно (р<0.05) от Rhodococcus-биосурфактантов.

Изобретение поясняется следующими табличными материалами.

Табл. 1. Влияние Rhodococcus-биосурфактантов на длину (мм) побегов и корней проростков семян сельскохозяйственных растений.

Табл. 2. Влияние тяжелых металлов на энергию прорастания (%) семян в присутствии Rhodococcus-биосурфактантов.

Табл. 3. Влияние никеля на формирование побегов и корневой системы (мм) проростков овса, горчицы и вики в присутствии БС C₁₆.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Предварительная обработка семян сельскохозяйственных культур растений (Avena sativa L., Medicago sativa L., Sinapis alba L., Phleum pretense L., Raphanus sativus var. radicula, Trifolium pretense L., Trifolium repens L., Vicia sativa L.) водными эмульсиями Rhodococcus-биосурфактантов способствовала улучшению кондиционных свойств семян и их проростков. Так, после предварительной обработки семян биопрепаратом уровень всхожести и энергии прорастания семян сельскохозяйственных растений усиливался в среднем до 2,5 раз (Фиг. 1), а интенсивность прорастания корней и проростков возрастала до 2,7 раз по сравнению с таковой без предварительной обработки Rhodococcus-биосурфактантами (Таблица 1).

Пример 2.

В экспериментах было изучено влияние Rhodococcus-биосурфактантов (в концентрациях 2,0, 4,0 и 8,0 г/л) на энергию прорастания и фитотоксичность ионов ТМ: Cd²⁺, Со²⁺, CrO₄^2-, Cu²⁺, MoO₄^2-, Ni²⁺, Pb²⁺, Zn²⁺ в отношении всхожести семян растений: овса посевного (Avena sativa L.), горчицы белой (Sinapis alba L.) и вики полевой (Vicia sativa L.). Уровень фитотоксичности определяли в соответствии со стандартными Методическими рекомендациями Фитотест [MP 2.1.7.2297-07]. Эксперименты по определению фитотоксичности проводили в лаборатории на базе учебного Ботанического сада Пермского государственного национального исследовательского университета. Условия проращивания: подсветка белыми люминесцентными лампами, спектр которых максимально приближен к дневному свету; температура 23-25°С; рН среды проращивания семян 6,3-6,5. Растворы солей ТМ вносили в количестве 1, 10, 50, 100 и 200 ПДК с учетом фона по Кларк, содержание ТМ рассчитывали на основании атомных масс.

В каждую чашку Петри помещали по 25 сухих здоровых семян и вносили по 5 мл водного раствора неочищенных биосурфактантов и тяжелые металлы. Энергию прорастания определяли на третьи сутки, всхожесть и длину проростков - на седьмые сутки эксперимента. В качестве контроля использовали дистиллированную воду, водные эмульсии биосурфактантов и растворы солей ТМ.

Предварительная обработка семян сельскохозяйственных растений водными эмульсиями Rhodococcus-биосурфактантов в условиях загрязнения среды ТМ способствовала снижению (до 33,5 раз) фитотоксичности тяжелых металлов и улучшению (до 30 раз) кондиционных свойств семян и их проростков. В условиях загрязнения окружающей среды ионами ТМ интенсивность прорастания корней и проростков возрастала до 33,5 раз после предварительной обработки семян Rhodococcus-биосурфактантами. Уровень всхожести и энергии прорастания семян сельскохозяйственных растений усиливался в среднем до 30-50 раз и зависел от концентрации ионов ТМ в среде. Устойчивость сельскохозяйственных растений к тяжелым металлам возрастала в 2-75 раз.

Как видно из табл. 2, уровень энергии прорастания семян сельскохозяйственных растений варьировал от 0 до 100% в зависимости от концентрации ионов ТМ. По степени фитотоксичности ионы ТМ распределяются в ряд Cd²⁺ > Pb²⁺ > Cu²⁺ > Zn²⁺ > Ni²⁺ > CrO₄^2- > Co²⁺ MoO₄^2-, в котором наиболее токсичными является кадмий, а менее токсичным - молибден.

По нашим данным всхожесть семян в условиях загрязнения среды ТМ после обработки биосурфактантами до 75 раз превышает всхожесть семян без обработки. Так, например, добавление кадмия в концентрации 100 ПДК приводило к полному ингибированию всхожести семян горчицы, тогда как после обработки их биосурфактантами до 48% семян прорастало в присутствии данного уровня загрязнения среды ионами кадмия (Фиг. 2). Подобные закономерности по всхожести семян сохраняются со всеми, использованными в работе семенами сельскохозяйственных растений в присутствии всех, использованных в работе солей ТМ.

Интенсивность прорастания корней и проростков семян была в 2,0-35,0 раз выше по сравнению с таковой в условиях загрязнения среды тяжелыми металлами без добавления эмульсий биосурфактантов.

В табл. 3 представлены результаты влияния ионов Ni²⁺ на прорастание семян растений в присутствии Rhodococcus-биосурфактантов C₁6. Наиболее интенсивная всхожесть, а также формирование корней и побегов проростков выявлены у овса и вики, семена которых прорастали даже при концентрации ионов Ni²⁺ 200 ПДК в условиях предварительной обработки семян эмульсиями Rhodococcus-биосурфактантов (Табл. 3). Данные закономерности сохраняются со всеми, использованными в работе семенами сельскохозяйственных растений в присутствии всех, использованных в работе солей ТМ. Обработка семян эмульсиями Rhodococcus-биосурфактантов снижает токсичность ТМ и способствует более интенсивному росту корней и побегов исследуемых растений (до 33,5 раз) по сравнению с прорастанием семян в среде, загрязненной ТМ без предварительной обработки их биосурфактантами.

Следует отметить, что прорастание семян после их обработки эмульсией биосурфактантов, полученных при выращивании в жидкой минеральной среде с н-гексаденом, более эффективно (до 3 раз), чем с использованием биосурфактантов, полученных при выращивании бактериальной культуры в среде с н-додеканом. Предварительная обработка семян эмульсиями Rhodococcus-биосурфактантов существенно снижает ингибирующее действие тяжелых металлов на проростки семян. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности предварительной обработки семян водными эмульсиями Rhodococcus-биосурфактантов с целью снижения токсического действия ионов тяжелых металлов на рост сельскохозяйственных культур растений, а также для улучшения кондиционных свойств семян.

Действие биосурфактантов снижает негативное влияние тяжелых металлов за счет их связывания с последующим образованием стабильных комплексов "биосурфактант-металл". Биосурфактанты являются дополнительным источником полезных микроэлементов для сельскохозяйственных растений, они не токсичны и биодеградабельны.

Таким образом, заявленный штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 231, депонированный в Национальный биоресурсный центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ АС-2106, может рассматриваться, как эффективный продуцент Rhodococcus-биосурфактантов, которые обладают способностью улучшать кондиционные свойства семян сельскохозяйственных растений и снижать фитотоксичность ионов тяжелых металлов.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой биопротектор для биологической обработки семян высших растений, представляющий собой водную эмульсию Rhodococcus-биосурфактантов 2,00 г/л на основе штамма микроорганизмов Rhodococcus ruber ИЭГМ 346 под регистрационным номером ВКПМ АС-2106. Изобретение позволяет снизить (до 50 раз) фитотоксичность тяжелых металлов и улучшить (до 33,5 раз) кондиционные свойства семян и их проростков. 2 ил., 3 табл.

Биопротектор для биологической обработки семян высших растений, представляющий собой водную эмульсию Rhodococcus-биосурфактантов 2,00 г/л на основе штамма микроорганизмов Rhodococcus ruber ИЭГМ 346 под регистрационным номером ВКПМ АС-2106.