СРЕДСТВО ДЛЯ БИОДЕСТРУКЦИИ КЕТОПРОФЕНА Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-2190, обладающий высокой деградирующей активностью в отношении фармполлютанта природной среды кетопрофена.

Увеличение объемов производства и потребления лекарственных средств стало причиной новой экологической проблемы мирового масштаба - медикаментозного загрязнения окружающей среды [Wilkinson J.L., Boxall А.В.А., Kolpin D.W. et al. Pharmaceutical pollution of the world's rivers // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2022. Vol. 119. №8. P. e2113947119]. Одним из наиболее часто детектируемых в среде фармацевтических загрязнителей является кетопрофен (CAS # 22071-15-4, С₁₆Н₁₄О₃₂, 3-бензоилфенил)пропановая кислота) - бициклический нестероидный противовоспалительный препарат, широко используемый в медицинской практике и ветеринарии [Wang J., Zhao S, Zhang M., He B. et al. Targeted eco-pharmacovigilance for ketoprofen in the environment: Need, strategy and challenge // Chemosphere. 2018. Vol. 194. P. 450-462]. Накопление кетопрофена и продуктов его абиотической трансформации в окружающей среде нарушает функционирование экосистем и оказывает негативное воздействие на растения, беспозвоночные и позвоночные животные, а также микроорганизмы [Neale P.A., Branch А., Khan S.J., Leusch F.D.L. Evaluating the enantiospecific differences of non-steroidal anti-inflammatory drags (NSAIDs) using an ecotoxicity bioassay test battery // Science of the Total Environment. 2019. Vol. 694. P. 133659; Rangasamy В., Hemalatha D., Shobana C. et al. Developmental toxicity and biological responses of zebrafish (Danio rerio) exposed to anti-inflammatory drag ketoprofen// Chemosphere. 2018. Vol. 213. P. 423-433].

В связи с этим актуальны исследования по поиску эффективных и экологически безопасных способов нейтрализации данного фармполлютанта. В качестве активных природных агентов, обладающих высоким трансформирующим и деструктирующим действием в отношении фармацевтических соединений, рассматриваются нокардиоформные бактерии рода Rhodococcus (класс Actinomycetes), занимающие доминирующее положение в антропогенно загрязненных биотопах, выделяющиеся среди других микроорганизмов наибольшим разнообразием деградируемых поллютантов и таким образом связанных с деятельностью человека и участвующих в восстановлении затронутых этой деятельностью экосистем [Krivoruchko A., Kuyukina М., Ivshina I. Advanced Rhodococcus biocatalysts for environmental biotechnologies // Catalysts. 2019. Vol. 9. P. 236].

Ранее была изучена биодеструкция фармпрепаратов группы обезболивающих и спазмолитических средств, в том числе анальгетика парацетамола [Ившина И.Б., Рычкова М.И., Вихарева Е.В. и др. Алканотрофные родококки как катализаторы процесса биодеструкции не пригодных к использованию лекарственных средств // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. №4. С. 443-447] и спазмолитика дротаверина гидрохлорида (Патент RU 2496866, 2013). Недавно подтверждена способность родококков к биоконверсии моно- и полициклических нестероидных противовоспалительных средств, в том числе ацетилсалициловой кислоты [Хренков А.Н., Вихарева Е.В., Тумилович Е.Ю. и др. Хроматографический анализ ацетилсалициловой кислоты в культуральных жидкостях родококков // Вестник Московского университета. Серия Химия. 2020. Т. 61. №5. С. 388-393], диклофенака натрия [Патент RU 2707536, 2019], ибупрофена [Патент RU 2762007, 2021].

Ранее нами был отобран штамм R. erythropolis ИЭГМ 746, проявляющий биодеградирующую активность в отношении кетопрофена [Bazhutin G.A., Polygalov M.A., Tyumina E.A., Tyan S.M., Ivshina LB. 2021. Cometabolic Bioconversion of Ketoprofen by Rhodococcus erythropolis IEGM 746 // In: Rocha A., Isaeva E. (eds) Science and Global Challenges of the 21st Century - Science and Technology. Perm Forum 2021. Springer, Cham. Lecture Notes in Networks and Systems. 2021. Vol. 342. P. 404-410]. Однако убыль фармпрепарата была невысокой: на 14 сут эксперимента штамм деградировал только 38% кетопрофена.

Технической задачей данного изобретения является изыскание средства, обеспечивающего эффективную и экологически безопасную биотрансформацию фармполлютанта кетопрофена. Для этого авторами изобретения был осуществлен поиск активного штамма-биодеструктора кетопрофена и проведены эксперименты по изучению закономерностей процесса биоразложения молекулы кетопрофена в зависимости от условий эксперимента.

Настоящее изобретение относится к культуре штамма Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 1188 (регистрационный номер ВКПМ Ас-2190), который может использоваться для биодеструкции фармполлютанта кетопрофена.

Техническим результатом изобретения является эффективная биодеструкция кетопрофена штаммом Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 1188. На 14 сутки эксперимента биодеградация кетопрофена (100 мг/л) в условиях кометаболизма достигает 49,6%.

Предлагаемый в качестве эффективного биодеструктора ибупрофена штамм Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 1188 выделен в естественных условиях из почвы солеотвала, г. Соликамск, Пермский край, Россия. Штамм депонирован в Национальный биоресурсный центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" -ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2190.

Данный штамм характеризуется следующими признаками.

Культуральные и морфологические признаки

Клетки штамма R. erythropolis ВКПМ Ас-2190 грамположительны, аэробны, неподвижны, некислотоустойчивые, неспорообразующие. Клетки палочковидные, шириной 0,5-1,0 мкм, длиной 1-5 до 7-15 мкм. Характерно V-, Y-образное и палисадное расположение клеток, наличие плеоморфизма, трехстадийный морфогенетический цикл развития (кокки - ветвящиеся клетки - кокки). Дифтероидный рост присутствует. Конидии не образуются. При окрашивании флуоресцентным красителем Нильским красным в клетках выявляются внутриклеточные липидные включения. На стандартных лабораторных средах (МПА) при температуре 28°С, рН 6,8-7,0 на 3-5 сут инкубирования образуют блестящие, гладкие колонии (∅ 1-5 мм) с выпуклым профилем и ровным краем, мягкой консистенции, без воздушного мицелия, с палево-телесным недиффундирующим пигментом. Образование пигмента не стимулируется светом.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм R. erythropolis ВКПМ Ас-2190 имеет каталазную и уреазную активность, характеризуется хемоорганотрофным и окислительным типом обмена веществ. В качестве единственного источника азота использует нитраты или соли аммония. Гидролизует эскулин. Нитратредуцирующая активность отсутствует. Образует кислоту из глюкозы, лактозы, фруктозы, инозитола, трегалозы, но не продуцирует ее из ксилозы, галактозы, целлобиозы, дульцитола, фукозы, раффинозы, рамнозы. Усваивает в качестве единственного источника гамма-аминомасляную кислоту. Использует в качестве единственного источника углерода такие углеводороды, как н-пропан (С3), н-додекан (С12), н-пентадекан (С15), н-гексадекан (С16), а также сырую нефть. Содержит миколовые кислоты с 36-48 атомами углерода. Штамм характеризуется высокой устойчивостью к солям тяжелых металлов, а именно Pb²⁺ (20,0 мМ), Cr⁶⁺ (10,0 мМ), Cu²⁺, Мо⁶⁺, Ni²⁺, Zn²⁺ (5,0 мМ).

Изучение технологических свойств штамма

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры в защитной сахарозо-желатиновой среде при температуре 4±2°С не менее 12 месяцев. Генетическая идентификация штамма подтверждена с помощью анализа 16S pPHK (Genbank # MG637011; по последовательности 1123 нуклеотидов имеет 100% сходства с фрагментом ДНК, кодирующим ген 16S рРНК Rhodococcus erythropolis DSM 43066).

Изобретение поясняется следующими графическими материалами.

На Фиг. 1. Приведен график - Динамика биодеструкции 100 мг/л кетопрофена свободными клетками R. erythropolis ВКПМ Ас-2190 в присутствии дополнительных источников углерода.

Изобретение поясняется следующим примером.

Пример. Динамика биотрансформации кетопрофена клетками Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-2190 в присутствии н-гексадекана.

Кетопрофен (C₁₃H₁₇O₂Na; CAS: 31121-93-4; (RS)-2-(4-(2-метилпропил)фенил)пропановая кислота в виде натриевой соли) использовали в виде фармацевтической субстанции, представляющей собой белый мелкозернистый порошок, без запаха и практически нерастворимый в воде, с чистотой 99,0%) (BLD Pharmatech Ltd., Китай).

По результатам определения минимальных подавляющих концентраций (МПК) ибупрофена микропланшетным методом [Ivshina I.B., Tyumina Е.А., Kuzmina M.V., Vikhareva E.V. Features of diclofenac biodegradation by Rhodococcus ruber IEGM 346 // Scientific Reports. 2019. Vol. 9. P. 9159.] выявлена выраженная устойчивость штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-2190 в отношении фармвещества (МПК ≥5000 мг/л).

В экспериментах по биотрансформации кетопрофена применяли минерально-солевую среду RS (г/л): K₂HPO₄-2,0; KH₂PO₄-2,0; KNO₃-1,0; (NH₄)₂SO₄-2,0; NaCl-1,0; MgSO₄×7 H₂O-0,2; CaCl₂×2 H₂O-0,02; FeCl₃×7 H₂O-0,001; а также фосфатный буфер (г/л): Na₂HPO₄-8,9; KH₂PO₄-3,39 (рН 6,9) с добавлением раствора микроэлементов [http://www.iegmcol.ru/ strains/index.html]. Кетопрофен вносили в среду культивирования из 2% маточного раствора в этаноле, стерилизованного фильтрацией через нейлоновый фильтр (0,20 мкм, Filter-Bio, Китай), до конечной концентрации 100 мг/л. В качестве дополнительного источника углерода и энергии использовали ацетат натрия, глицерин, глюкозу или н-гексадекан в концентрации 0,1%, а инокулята - клетки штамма ВКПМ Ас-2190, предварительно выращенные в течение трех сут на мясопептонном агаре, в концентрации 3×10⁶. Эксперименты по биодеструкции кетопрофена проводили в условиях периодического культивирования (160 об/мин, 28°С) в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с объемом среды 100 мл, содержащей 100 мг/л кетопрофена. В качестве абиотического контроля использовался стерильный раствор 100 мг/л кетопрофена в минеральной среде RS.

Содержание кетопрофена в среде культивирования актинобактерий определяли методом жидкостной хроматографии с использованием хроматографа LC Prominence 20А (Shimadzu, Япония), оборудованного хроматографической колонкой с обращенно-фазным сорбентом Discovery® С18, 25 cm × 4.6 mm, and 5 μm (Supelco, США) и диодно-матричным детектором (SPD-M20A). Оптимальные условия для определения кетопрофена: подвижная фаза фосфатный буферный раствор (рН 3.5) - ацетонитрил (40:60), поток элюента - 0,5 мл/мин, температура колонки 40°С, объем вводимой пробы - 20 мкл, длина волны детектирования - 254 нм. В данных условиях время удерживания субстрата составило 7,8±0,05 мин. Регистрацию и обработку хроматографической информации осуществляли с помощью программы LCSolution (v/1,25 rus). Для хроматографического анализа аликвотную часть культуральной жидкости родококков (1 мл) центрифугировали при 14500 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость фильтровали через мембранный шприцевой нейлоновый фильтр (Filter-Bio, Китай) с диаметром пор 0,20 мкм.

По данным сравнительных экспериментов, наибольшую убыль кетопрофена регистрировали в присутствии 0,1 об.% н-гексадекана: на 14 сут биодеструкция составила 49,6% (Фиг. 1). На настоящий момент это наиболее высокая убыль кетопрофена, задокументированная для отдельного бактериального штамма. В присутствии глюкозы и глицерина биодеструкция кетопрофена на 14 сут эксперимента составила 24,2 и 17,3% соответственно.

Таким образом, заявленный штамм Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 1188, депонированный в Национальный биоресурсный центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2190, может рассматриваться как эффективный биодеструктор кетопрофена.

Изобретение поясняется нижеследующими графическими материалами, на которых изображены:

на Фиг. 1. Динамика биодеструкции 100 мг/л кетопрофена свободными клетками штамма R. erythropolis ВКПМ Ас-2190 в присутствии дополнительных источников углерода.

Изобретение относится к биотехнологии. Применение штамма бактерий Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 1188, ВКПМ Ac-2190 в качестве биодеструктора кетопрофена. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств экологически безопасной биотрансформации фармполлютанта кетопрофена с помощью микроорганизмов. 1 ил., 1 пр.

Применение штамма бактерий Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 1188, ВКПМ Ac-2190 в качестве биодеструктора кетопрофена.