СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИТОСТИМУЛЯТОРА НА ОСНОВЕ ПРОДУКТА БИОДЕСТРУКЦИИ ПАРАЦЕТАМОЛА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2023 года по МПК A01N37/22 A01N63/20 A01P21/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к созданию биостимулятора растений лекарственного и сельскохозяйственного назначения, обеспечивающего улучшение качества посевного материала за счет активизации всхожести и усиления энергии прорастания семян, повышения прироста биомассы лекарственных и сельскохозяйственных растений, а также являющегося индуктором накопления биологически активных веществ в лекарственных растениях.

Наиболее близким к заявляемому способу получения фитостимулятора является способ получения стимулятора роста «Циркон» (0,1 г/л смеси гидроксикоричных кислот - ГКК) фирмы ННПП «НЭСТ М» (патент №2257059, опуб. 27.07. 2005). Недостатком его является низкая эффективность полученного стимулятора.

Техническим результатом данного изобретения является получение эффективного биостимулятора растений лекарственного и сельскохозяйственного назначения, относящихся к разным семействам. Всхожесть, энергия прорастания и морфологические характеристики проростков семян, обработанных продуктом биодеструкции парацетамола (ПБП), имеют наибольшие значения по сравнению с семенами, обработанными водой и стимулятором роста «Циркон». Так, у семян календулы лекарственной, обработанных ПБП, энергия прорастания, всхожесть семян, средняя длина наибольшего корешка и средняя длина побега больше контроля (воды) на 6,3%, 4,9%, 44,3% и 23,8% соответственно, в то время как при обработке «Цирконом» - только на 1,0%, 3,5%, 26,3% и 9,5% соответственно. У семян овса посевного средняя длина побега и наибольшего корешка при обработке ПБП больше по сравнению с контролем на 19,8% и 20,0% соответственно, в то время как при обработке «Цирконом» - меньше по сравнению с контролем на 50,0 % и 9,0%.

Применение ПБП повышает общий сбор биомассы цветков календулы лекарственной на 55% по сравнению с контролем (водой), а стимулятора роста «Циркон» - только на 24%. Эффективность применения ПБП вместо стимулятора роста «Циркон» составляет 25%. Содержание сердечных гликозидов в листьях ландыша майского после обработки растений ПБП больше на 4%, чем в листьях, собранных с растений контрольной площадки, и только на 1% больше, чем в листьях, собранных с растений после обработки стимулятором роста «Циркон».

Получение продукта биодеструкции парацетамола биотехнологическим способом из отходов производства парацетамола и выявление возможности его использования в качестве фитостимулирующего средства обусловлено поиском эффективных способов переработки фармацевтических отходов для получения на их основе новых биологически активных соединений, в том числе фитостимулирующего действия. Актуальность поиска эффективных способов переработки фармацевтических отходов связана с проблемой глобального загрязнения окружающей среды лекарственными средствами и их метаболитами. Так, в водных объектах 71 страны мира обнаружено уже более 600 веществ, относящихся к фармацевтическим препаратам [aus der Beek T., Weber F.A., Bergmann A., Hickmann S., Ebert I., Hein A., Küster A. Pharmaceuticals in the environment - Global occurrences and perspectives // Environmental Toxicology and Chemistry. 2016. Vol.35. P. 823-835]. Фармацевтические поллютанты, признанные новым классом ксенобиотиков, обнаруживаются в почве, донных осадках водоемов, поверхностных, сточных, грунтовых водах и даже питьевой воде [Fatta-Kassinos D., Meric S., Nikolaou A. Pharmaceutical residues in environmental waters and wastewater: current state of knowledge and future research // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011. Vol.399. P. 251-275]. Неизбежное попадание лекарственных средств (парацетамола в частности) в окружающую среду обусловлено их широким использованием и несовершенством способов утилизации фармацевтических отходов (растворение в воде, сжигание, размещение на полигонах).

Способ получения продукта биодеструкции парацетамола из отходов производства парацетамола заключается в следующем.

В минеральную среду RS состава (г/л): K₂HPO₄ - 2,0; KH₂PO₄ - 2,0; KNO₃ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 2,0; NaCl - 1,0; MgSO₄×7 Н₂О - 0,2; CaCl₂×2 Н₂О - 0,02; FeCl₃×7 Н₂О - 0,001 добавляют парацетамол в концентрации 2 г/л и клетки Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 до начальной концентрации 3,8×10⁷ клеток/см³.

Клетки родококков предварительно выращивают в течение 3-х суток на мясопептонном агаре и дважды отмывают 10 мМ K-Na-фосфатным буферным раствором (pH 7,0).

Процесс биодеструкции парацетамола проводят в условиях периодического культивирования родококков при температуре инкубации 28°С и скорости орбитального вращения 160 об/мин в течение 20 сут.

Окончание процесса контролируют по отсутствию парацетамола в культуральной среде родококков методом тонкослойной хроматографии в системе хлороформ-спирт этиловый (8:2) при детектировании в УФ (254 нм).

Образовавшийся черный осадок продукта биодеструкции парацетамола отделяют от культуральной среды фильтрованием, трижды промывают водой очищенной и высушивают на воздухе до постоянной массы.

Используемый в заявленном способе штамм актинобактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 хранится в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер 285 во Всемирной федерации коллекции культур, www.iegmcol.ru, УНУ 73559, ЦКП 480868).

Предлагаемый способ получения ПБП был осуществлен также в интервалах граничных значений технологических параметров (температуры инкубации 18 - 35°С, орбитальной скорости вращения 160-200 об/мин.) и при выходе за рамки граничных значений. При этом было установлено следующее:

- при осуществлении процесса биодеструкции парацетамола при температуре ниже 28°С он становится более длительным (более 20 часов), а при температуре выше 35°С происходит подавление роста микроорганизмов и неполная деструкция парацетамола;

- при скорости вращения менее 160 об/мин. происходит недостаточное перемешивание культуральной жидкости, а при увеличении скорости вращения до 200 об/мин. - уменьшение продолжительности процесса, однако и уменьшение массы образующегося продукта, что связано, очевидно, с недостаточной скоростью образования ПБП.

Для выявления механизма действия, полученного способом по п.1 ПБП на растительные организмы устанавливали химический состав продуктов его гидролитического разложения. Для этого проводили гидролитическое разложение ПБП: навеску ПБП около 0,05 (точная масса) помещали в мерную колбу вместимостью 100 см³, прибавляли 100 см³ воды очищенной, настаивали в течение 28 суток, периодически перемешивая, и фильтровали.

Идентификацию гидролизатов ПБП, а именно гидроксикоричных кислот (ГКК), осуществляли методом тонкослойной хроматографии в системе хлороформ - этанол (8:2). В качестве растворов сравнения использовали 0,05% спиртовые растворы цикориевой, кофейной, 2,4-дигидроксикоричной и транс-коричной кислот. Детекцию пятен осуществляли в УФ свете при длине волны 254 нм.

Таблица 1 Результаты хроматографирования ГКК (гидролизатов ПБП) в системе хлороформ - этанол (8:2) Объекты анализа Значения R_f Окраска зон исследуемых веществ Водное извлечение из ПБП после 28 сут настаивания 0,81±0,05
0,78±0,05
0,48±0,05 Темно-фиолетовая
Светло-фиолетовая
Зелено-желтая Кофейная кислота 0,83±0,05 Темно-фиолетовая 2,4-Дигидроксикоричная кислота 0,79±0,05 Светло-фиолетовая Цикориевая кислота 0,48±0,05 Зелено-желтая

Результаты хроматографирования показали наличие в водных извлечениях из ПБП кофейной (R_f 0,81±0,05), 2,4-дигидроксикоричной (R_f 0,78±0,05) и цикориевой кислот (R_f 0,48±0,05) (табл. 1).

Определение количественного содержания ГКК в водных извлечениях из ПБП проводили методом ВЭЖХ с использованием хроматографа LC Prominence 20А (Shimadzu, Япония), оснащенного хроматографической колонкой Luna 5 μm C18 100 Å (250 × 4.6 мм) и диодно-матричным детектором (SPD-M20A) в следующих условиях: подвижная фаза: 0,1% раствор фосфорной кислоты-ацетонитрил; скорость потока элюента - 1 мл/мин.; температура колонки - 40°С; детектирование при длине волны 290 нм; объем вводимой пробы - 20 мкл (табл. 2).

Таблица 2 Схема градиента при определении содержания ГКК в водных извлечениях из ПБП методом ВЭЖХ Время, мин. Концентрация ацетонитрила, % 0,01 10 8,00 22 9,00 22 10,00 40 15,00 40 19,00 10 25,00 10

Количественное содержание цикориевой кислоты в водных извлечениях из ПБП составило 0,393 мкг/мл, 2,4-дигидроксикоричной кислоты - 2,535 мкг/мл (табл.3).

Таблица 3 Содержание ГКК в водных извлечениях из ПБП Пик № Время удерживания, мин ГКК Площадь
пика Высота
пика Концентрация, мкг/мл 1 10,548 2,4-Дигидроксикоричная кислота 45185 6518 2,535 2 14,151 Цикориевая кислота 5820 1287 0,393

Таким образом, фитостимулирующий эффект ПБП обусловлен присутствием гидроксикоричных кислот в составе продуктов его гидролитического разложения.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, в частности к стимуляторам роста растений. Способ получения стимулятора роста растений на основе продукта биодеструкции парацетамола включает ферментативную биотрансформацию парацетамола штаммом Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 в концентрации 3,8×10-7 клеток/см³ в условиях периодического культивирования при температуре 28°C и скорости перемешивания 160 об/мин в минерально-солевой среде RS в течение 20 суток с последующим отделением от культуральной жидкости полученного в виде осадка продукта и его высушиванием. Предлагаемый способ получения стимулятора роста растений обеспечивает утилизацию отходов производства парацетамола с получением высокоэффективного стимулятора роста растений, обеспечивающего повышение всхожести, энергии прорастания, ускорение цветения у сельскохозяйственных и лекарственных растений. 3 табл., 1 пр.

Способ получения стимулятора роста растений на основе продукта биодеструкции парацетамола, заключающийся в ферментативной биотрансформации парацетамола штаммом Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 в концентрации 3,8×10-7 клеток/см³ в условиях периодического культивирования при температуре 28°C и скорости перемешивания 160 об/мин в минерально-солевой среде RS в течение 20 суток с последующим отделением от культуральной жидкости полученного в виде осадка продукта и его высушиванием.