Способ определения вероятности наличия фиброза печени у пациентов, перенесших Covid-19 Российский патент 2022 года по МПК A61B6/03 A61B5/93 A61B5/107 

Изобретение относится к медицине, в частности, к гастроэнтерологии и может быть использовано для раннего выявления фиброза печени у пациентов, перенесших Covid-19.

Недавняя вспышка коронавирусного заболевания 2019 г. (COVID-19), вызванная Коронавирусом-2 тяжелого острого респираторного синдрома Коронавирус-2 (SARS-CoV-2), привела к всемирной пандемии. Диссеминированное повреждение легких с развитием острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) - основная причина смертности при COVID-19. Однако высокая частота поражения вирусом органов вне дыхательных путей, включая печень и желудочно-кишечный тракт, указывает на то, что COVID-19 можно рассматривать как системное инфекционное и воспалительное заболевание [1].

Показано, что вирус SARS-CoV-2 может поражать желудочно-кишечный тракт несколькими путями. Во-первых, возможно его прямое рецептор-опосредованное проникновение в клетки слизистых оболочек с их последующей гибелью. Во-вторых, он способен индуцировать мукозиты и изменять проницаемость эпителиальных барьеров. Наконец, вирус, возможно, влияет на состав микробиоты кишечника, нарушает взаимодействие оси «кишка-легкие» и таким образом дополнительно способствует прогрессированию респираторных симптомов [2].

Имеются данные о том, что типичные респираторные симптомы были свойственны преимущественно первой волне заболевших коронавирусной инфекцией, а симптомы поражения желудочно-кишечного тракта - второй волне [3, 4].

При оценке течения заболевания у 74 больных с COVID-19, имевших гастроэнтерологические жалобы, было показано, что тяжелые и критические ее формы встречались у них достоверно чаще (соответственно в 22,97 и 31,08% случаев), чем у пациентов, у которых эти симптомы отсутствовали (8,14 и 20,45% больных) [5].

Известно, что коронавирус проникает в организм через рецепторы ангиотензинпревращающего фермента 2 (АПФ2) [angiotensin converting enzyme 2, АСЕ2). Высокая экспрессия рецепторов АПФ2 при COVID-19 отмечается не только во II типе альвеолярных клеток (АТ2) в легких, но и в железистых эпителиальных клетках желудка, двенадцатиперстной кишки и прямой кишки [6-9], что может приводить к возникновению желудочно-кишечных симптомов [10]. В некоторых случаях диарея может выступать на первый план в клинической картине COVID-19 [11].

Хотя печеночная недостаточность, по-видимому, не возникает при отсутствии ранее существовавшего заболевания печени, поражение печени при COVID-19 может коррелировать с общей тяжестью заболевания и служить прогностическим фактором для развития ОРДС. Спектр потенциальных патофизиологических механизмов поражения печени при COVID-19 обширен, включает прямую цитотоксичность в результате активной вирусной репликации SARS-CoV-2 в печени, иммуно-опосредованное повреждение печени из-за тяжелой воспалительной реакции, гипоксические изменения, вызванные дыхательной недостаточностью, сосудистые изменения из-за коагулопатии, эндотелита или правожелудочковой сердечной недостаточности, лекарственное поражение печени и обострение основного заболевания печени [12].

Исследование гистологических препаратов печени 48 умерших пациентов с COVID-19 выявило обширный тромбоз просвета на портальном и синусоидальном уровнях, а также портальный фиброз, сопровождающийся значительной активацией перицитов [13]. В источнике [14] показано, что развитие фиброза печени с увеличением ее плотности ассоциировано с тяжелым течением COVID-19.

Вирус SARS-CoV-2 может непосредственно поражать клетки печени, что подтверждается обнаружением повышенной экспрессии рецепторов АПФ-2 в холангиоцитах [15, 16]. Показано, что вирус может напрямую связываться с АСЕ2-позитивными холангиоцитами, но не обязательно с гепатоцитами. Эти результаты свидетельствуют, что поражения печени у пациентов с атипичной пневмонией и SARS-CoV-2 могут быть вызваны дисфункцией холангиоцитов и другими причинами, такими как медикаментозное и системное воспалительное повреждение [17].

Наряду с печенью, мишенью COVID-19 является и кишечник. Известно, что АСЕ2 в изобилии содержится в эпителии легких и кишечника, другие авторы указывают, что экспрессия АСЕ2 в первую очередь выражена на люминальной поверхности дифференцированных клеток тонкокишечного эпителия, тогда как более низкая экспрессия наблюдается в криптовых клетках и толстой кишке [18]. Hashimoto Т. Et al. связали аминокислотную транспортную функцию АСЕ2 с микробной экологией в желудочно-кишечном тракте. При этом эпителиоциты с мутантным АСЕ2 проявляли пониженную экспрессию антимикробных пептидов. Авторы предположили возможную связь COVID-19 с измененной микробиотой кишечника [18].

Trottein F. Et al. показано, что дефицит АСЕ2 изменяет состав микробиоты кишечника у мышей, а у пациентов с COVID-19 развивается дисбиоз кишечника, сопровождающийся уменьшением разнообразия и численности бактерий. Этот дисбиоз имеет серьезные последствия: микробиота кишечника может дистанционно стимулировать реакцию организма хозяина на вирусные инфекции дыхательных путей. Дисбиоз может ухудшить исход заболевания, поскольку количество бактерий-комменсалов уменьшается, что способствует размножению патогенов. Роль микробиоты кишечника при коронавирусной инфекции еще предстоит уточнить с целью определения того, может ли дисбиоз служить биомаркером тяжести заболевания, а восстановление эубиоза - методом его лечения [19].

Связь между легкими и желудочно-кишечным трактом до конца не изучена. Хорошо известно, что в респираторном тракте обитает своя микробиота, но у пациентов с респираторными инфекциями обычно наблюдается дисфункция кишечника или вторичные осложнения дисфункции кишечника, которые связаны с более тяжелым клиническим течением заболевания, что свидетельствует о кишечно-легочной перекрестности. Этот феномен наблюдается у пациентов с COVID-19. Многочисленные исследования показали, что модулирование микробиоты кишечника может уменьшить энтерит и связанную с ИВЛ пневмонию, а также может обратить вспять некоторые побочные эффекты антибиотиков [20].

Существует тесное взаимодействие между кишечником и печенью, именуемое «ось кишечник-печень» [21]. Более 70% кровотока печени обеспечивается воротной веной, осуществляющей венозный отток из кишечника. При нарушении кишечного барьера печень подвергается воздействию токсических факторов, поступающих из кишечника. В свою очередь, изменение физиологических процессов в печени может стать толчком для развития дисфункции кишечника [22, 23]. Было продемонстрировано, что избыточный бактериальный рост в тонкой кишке может играть определенную роль в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени [24], алкогольной болезни печени [25], патологии печени, связанной с полным парентеральным питанием и интестинальной недостаточностью [26]. В этом контексте при заболеваниях печени актуальны вопросы распознавания синдрома избыточного бактериального роста (СИБР), а воздействие на кишечную микробиоту становится потенциальной терапевтической и профилактической стратегией.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время для определения вероятности образования фиброза печени используются подходы, связанные с определением уровня биомаркеров, патогенетически связанных с фиброгенезом.

Биохимические исследования. Определение уровня тканевого ингибитора матричных металлопротеиназ-1 (ТИМП-1) позволило прогнозировать риск развития шистосомно-ассоциированного фиброза печени у человека. После корректировки на потенциально влияющие факторы, в том числе базовый уровень фиброза, у пациентов с обнаруживаемыми уровнями ТИМП-1, риск возникновения фиброза печени через год после проведенной терапии оказался в 3,5 раза выше по сравнению с лицами с неопределяемыми уровнями ТИМП-1 (отношение шансов - 3.48; 95% доверительный интервал, 1.41-8.43; P=0.007). Поскольку TIMP-1 ингибирует большинство матриксных металлопротеаз, которые отвечают за деградацию коллагена, эти данные подтверждают, что шистосомно-ассоциированный фиброз печени частично является результатом чрезмерного ингибирования ремоделирования коллагена. Эти результаты свидетельствуют о том, что TIMP-1 является перспективным биомаркером для оценки риска развития фиброза печени при шистосомозе и, возможно, других инфекционных и неинфекционных причинах заболеваний печени [Valeria Fabre, Haiwei Wu, Sunthorn PondTor, Hannah Coutinho, Luz Acosta, Mario Jiz, Remigio Olveda, Ling Cheng, Eric S. White, Blanca Jarilla, Stephen T. McGarvey, Jennifer F. Friedman, Jonathan D. Kurtis, Tissue Inhibitor of Matrix-Metalloprotease-1 Predicts Risk of Hepatic Fibrosis in Human Schistosoma japonicum Infection, The Journal of Infectious Diseases, Volume 203, Issue 5, 1 March 2011, Pages 707-714, https://doi.orgl0.1093/infdis/jiq0991].

Определение клинико-биохимических показателей. При рассмотрении факторов, влияющих на риск развития фиброза печени у ВИЧ-инфицированных пациентов в процессе проведения многофакторного анализа установлена значимость наличия вируса иммунодефицита человека (отношение шансов 1.84 [95% Ди 1,17-2.88]; p<0.01); старший возраст (каждые десять лет: ОШ 3.34 [95% Ди, 1.81-6.18]; p<0.01); активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) (в 10 МЕ/л: ОШ 1.25 [95% Ди 1,05-1.49]; p<0.01); индекс массы тела (ИМТ) (на 1 кг/м2: ОШ 1.17 [95% Ди 1.05-1.29]; p<0,01) и предыдущее воздействие диданозина (в год: ОШ 2,26 [95% ДИ 1,01-5,06]; p=0,04). Совокупная оценка уровней данных показателей позволила стратифицировать риск развития фиброза печени [Kirkegaard-Klitbo DM, Bendtsen F, Lundgren J, de Knegt RJ, Kofoed KF, Nielsen SD, Benfield T. Increased prevalence of liver fibrosis in people living with HIV without viral hepatitis compared to population controls. J Infect Dis. 2020 Dec 15:jiaa763. doi: 10.1093/infdis/jiaa763. Epub ahead of print. PMID: 33320268].

При обследовании пациентов, перенесших Covid-19, использование фибротеста FIB-4, включающего такие показатели, как возраст, активности АЛТ, ACT, количество тромбоцитов, позволило выявить пациентов с выраженным фиброзом (FIB-4>2.67) и использовалось как независимый прогностический фактор [ Bighelli F, Caravaca С, Romero M, Barreales M, Marcos AC, Albillos A, Calleja JL, Elevation of Liver Fibrosis Index FIB-4 Is Associated With Poor Clinical Outcomes in Patients With COVID-19. J Infect Dis. 2020 Aug 4;222(5):726-733. doi: 10.1093/infdis/jiaa355. PMID: 32563190; PMCID: PMC7337860].

При определении вероятности образования фиброза у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени уровни холестерина липопротеинов низкой плотности, глюкозы, маталлопротеиназы-9 и лептина в сыворотке крови предложены для прогнозирования прогрессии начальных стадий фиброза (1 стадии в 2), тогда как гепатомегалия, уровень систолического артериального давления, наличие нарушений углеводного обмена, уровни АЛТ/АСТ, окружность талии/окружность бедер, TIMP 1 и 2 -в отношении прогрессирования фиброза 2 в 3 стадию. Для расчета индивидуального риска прогрессирования фиброза печени для пациентов с НАЖБП (неалкогольная жировая болезнь печени) предложена формула:

где ObR - уровень растворимых рецепторов к лептину (нг/мл), Lep - уровень лептина в сыворотке крови (нг/мл), N - количество показателей, I - ожидаемый показатель риска: 1 - низкий, 2 - высокий.

Для упрощенного понимания настоящей математической модели каждый из показателей в данной формуле принимает значение 0 - его отсутствие как в случае НАСГ (неалкогольный стеатогепатит) или нормальные значения для лептина, его рецепторов и ОТ, и 1 - его наличие или повышение [Кролевец Т.С., Ливзан М.А., Чебаненко Е.В., Мазур И.И., Повжик А.А., Николаев Н.А. Прогностическая модель неинвазивной оценки формирования и прогрессирования фиброза печени у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени // Современные проблемы науки и образования. - 2018. - №3.;URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=27713 (дата обращения: 27.05.2021)].

Исследование генетических показателей. При данном подходе количественно определяют процент мутантных ДНК - HBV методом пиросеквенирования с использованием образцов сыворотки крови, полученных в фазе воспаления и после сероконверсии HBeAg у исходно HBeAg-позитивных хронических HBV-инфицированных пациентов (больных вирусным гепатитом В). Процент A1762T/G1764A ≥20% после сероконверсии HBeAg предсказывал уровень фиброза печени >7 кПа (отношение рисков = 6,37, p<0,001). Присутствие A1762T/G1764A приводило к снижению уровня рибонуклеиновой кислоты-мессенджера и уровня белка лиганда программируемой смерти-1 (PD-L1) в гепатоцитах [Wu JF, Chang KC, Ni YH, Hsu HY, Chang MH. Impacts of the Percentage of Basal Core Promoter Mutation on the Progression of Liver Fibrosis After Hepatitis В e Antigen Seroconversion. J Infect Dis. 2021 Apr 23; 223(8):1381-1389. doi: 10.1093/infdis/jiaa545. PMID: 32860707].

У пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП) предложена оценка полиморфизма гена PNPLA3 или адипонутрина, поскольку он считается независимым генетическим фактором развития и прогрессирования фиброза печени. Носители G-аллеля данного гена имели достоверно более высокие стадии фиброза, особенно на ранней стадии заболевания (Х2=4,156, р<0,05) [Кролевец Т.С., Ливзан М.А., Чебаненко Е.В., Мазур И.И., Повжик А.А., Николаев Н.А. Прогностическая модель неинвазивной оценки формирования и прогрессирования фиброза печени у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени // Современные проблемы науки и образования. - 2018. - №3.; URL: http://www.science-education.ru/m/article/view?id=27713 (дата обращения: 27.05.2021)].

Известен способ диагностики фиброза печени на основании выявления трех новых сывороточных биомаркеров, а именно - активатора плазминогена урокиназного типа (uPA), матрицы металлопротеиназы 9 (ММР9; GenBank Accession Number) и β-2 микроглобулина (β-2-MGB) [Патент РФ №2505821, МПК G01N 33/68, опубл. 27.01.2014]. Недостатками предлагаемого способа являются трудоемкость, предполагающая необходимость выполнения 4 стадий, применение диагностических наборов, включающих специфичные антитела, ассоциированные с биомаркерами фиброза, что труднодоступно; использование дорогостоящей аппаратуры и методов определения маркеров - твердофазный иммунноферментный анализ (ELISA) или вестерн-блоттинга, потребность в определении дополнительных биомаркеров (глутаминовой оксалоацетиктрансаминазы, глутаминовой пировиноградной трансаминазы и альфа-фетопротеина), сложность трактовки полученных результатов.

Известен способ диагностики нарушений функции печени путем определения количества ацетаминофена (АРАР)-глюкоронида в образце плазмы и/или образце мочи после введения пациенту с риском наличия печеночных нарушений ацетаминофена (АРАР) с последующим сравнением полученного количества (АРАР)-глюкоронида с контролем без нарушений функции печени; идентификации субъекта как страдающего неалкогольным стеатогепатитом или фиброзом печени при повышенных уровнях АР АР-глюкоронида в одном или обоих образцах плазмы и образцах мочи в сравнении со здоровым контролем [Патент РФ №2555331, МПК G01N 33/94, опубл. 10.07.2015]. Недостатками указанного способа являются возможность выявления нарушений функции печени только при неалкогольном генезе заболевания, необходимость приема пациентом неопиоидного анальгетика (ацетаминофена) с риском осложнений и аллергических реакций; возможностью получения некорректных результатов у пациентов с наследственными ферментопатиями с нарушенным метаболизмом целого ряда препаратов, включая анальгетики (синдром Жильбера).

Известен способ оценки степени фиброза печени у детей раннего возраста с помощью индекса APRI, основанный на определении уровня фермента аспартатаминотрансферазы (ACT) и количества тромбоцитов с последующим вычислением индекса APRI по известной формуле с последующим соотнесением величины индекса со степенью фиброза печени, установленными ранее [Патент РФ №2585387, МПК G01N 33/50, опубл. 27.05.2016]. Изобретение позволяет вычислять индекс APRI у детей раннего возраста, с помощью которого можно неинвазивным способом без проведения биопсии печени максимально точно, доступно и недорого мониторировать прогрессирование фиброза, прогнозировать исходы, своевременно назначать лечение и контролировать результаты терапии. Недостатками предложенного способа являются возможность выявления только выраженного фиброза печени (3-4 степень) или его отсутствие (0 степень), легкий и умеренный фиброз оказываются в «серой зоне»; вероятность получения завышенных или заниженных значений индекса APRI при изменениях активности ACT и количества тромбоцитов при патологиях, не связанных с патологией печени (повреждение сердца, мыщц, поджелудочной железы, системные патологии, перенесенные инфекции, дефицит железа, паразитозы, прием некоторых лекарственных средств и др.); предложенный способ охватывает лишь детей раннего возраста и не может быть применен у взрослых.

Известен способ прогнозирования неблагоприятного течения фиброза печени при хроническом гепатите С путем определения выраженности клеточно-опосредованного иммунного повреждения паренхимы печени, при этом в иммуногистоморфометрическом методе проводят количественное определение абсолютного содержания CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв. мм среза паренхимы биоптата печени и при содержании более 200 CDS-позитивных лимфоцитов в 1 кв. мм паренхимы печени и инфицировании 3 генотипом вируса гепатита С прогнозируют неблагоприятное течение фиброза печени при хроническом гепатите С [Патент РФ №2706699, МПК G01N 33/48, опубл. 20.11.2019]. Предложенный способ обладает повышенной точностью прогнозирования неблагоприятного течения фиброза печени при хроническом гепатите С. Недостатками данного способа является его инвазивность - необходимость проведения биопсии печени и последующим иммуногистоморфометрическим исследованием с труднодоступными и дорогостоящими оборудованием и реактивами; возможность определения неблагоприятного течения фиброза только при вирусном гепатите С и невозможность его использования при гепатитах другой этиологии.

Наиболее близким аналогом по назначению - прототипом, является способ определения цирроза печени, заключающийся в проведении 13С-метацетинового дыхательного теста [Патент РФ №2692988, МПК G01N 33/497, опубл. 28.06.2019]. При значении кумулятивной дозы 13С указанного теста на 30-й минуте <5,65% определяют цирроз печени. Способ обеспечивает возможность неинвазивного определения цирроза печени, что обусловливает возможность исключения риска развития осложнений. Принцип дыхательного теста основан на оценке определения метаболизируемого субстрата в выдыхаемом воздухе. Когда субстрат метацетин, меченный 13С, попадает в организм, он проходит через кровоток, метаболизируется в печени (проходит деметилирование) с образованием ацетаминофена (парацетамола) и летучего соединения (формальдегида), который затем выводится через легкие в виде 13СО2. По скорости и объему выведения субстрата определяют метаболическую функцию печени. К недостаткам данного метода следует отнести необходимость приема пациентом метацетина, что может вызвать аллергические реакции у пациента; потребность в специальном оборудовании - инфракрасном (ИК) газовом анализаторе Iris, Германия; возможность определения только выраженного фиброза - на стадии цирроза (F4) без информации о легкой и умеренной степени фиброза, что значимо для пациентов, перенесших Covid-19. Данный способ недостаточно точен и объективен и требует подтверждения результатов исследования другими способами диагностики (биохимические исследования, показатели вирусной активности, биопсия печени).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является обеспечение возможности раннего выявления фиброза печени у пациентов, перенесших Covid-19, а также повышение специфичности и точности выявления диффузной патологии печени на более ранних стадиях (легкой, умеренной степени фиброза).

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения вероятности наличия фиброза печени, согласно изобретению, у пациента выясняют степень тяжести перенесенной инфекции Covid-19: проявления ОРВИ, или перенесенная пневмония с процентом поражения легочной ткани - от 5 до 30% или более 30%; определяют индекс массы тела пациента, измеряемый в кг/м², по формуле: I=m/h², где: т - масса тела в килограммах; h - рост в метрах. Проводят градацию индекса массы тела пациента: менее или равно 30 кг/м², от 31 до 35 кг/м², более 35 кг/м²; осуществляют измерение базисных уровней водорода (Н2) и метана (СН4) в выдыхаемом воздухе пациентом с помощью прибора GastroCheck Gastrolyzer в миллионных долях (м.д.). При превышении базисных уровней водорода и/или метана 10 м.д., состояние расценивают как наличие синдрома избыточного бактериального роста (СИБР) в тонкой кишке и дальнейшее исследование не проводится. Если базисные уровни водорода и метана не превышают 5 м.д., то проводят дальнейшие исследования с провоцирующей дозой лактулозы 15 мл: 1 пакетик - 667 мг/мл сиропа, Abbott, Нидерланды, растворенной в 200 мл воды, с последующей регистрацией пробы выдыхаемых газов каждые 15 мин в течение первого часа и каждые 30 мин в течение последующего часа. Тест на наличие СИБР считают положительным при повышении уровня водорода более или равно 20 м.д. и/или при повышении уровня метана более или равно 10 м.д. в течение от 80 до 90 минут после приема лактулозы. Оценивают скорость транзита кишечного содержимого по времени появления пиков газов: быстрый транзит при появлении пиков газов более 20 м.д. через 55-60 минут, нормальный транзит - через 75-80 минут, медленный транзит - через 95 минут или позже. Далее оценивают продукцию газов: не-продуцентами водорода/метана считают обследуемых пациентов, у которых уровень газов за весь период исследования от 115 до 120 мин не превышает 2 м.д., средними уровнями газов считают уровни водорода и/или метана от 10 до 30 м.д. и значения более 30 м.д. расценивают как высокие. Затем сопоставляют данные о тяжести перенесенной инфекции Covid-19, значения индекса массы тела и данные уровней газов в выдыхаемом воздухе:

- если пациент перенес Covid-19 в форме ОРВИ, его индекс массы тела менее или равен 30 кг/м², он является не-продуцентом водорода или метана при базисных уровнях водорода и метана и уровнях указанных газов после приема лактулозы в течение 120 мин не превышали 2 м.д., не выявлено замедленного транзита по кишке при появлении пиков водорода и/или метана через 95 мин или позже после приема лактулозы, нет признаков синдрома избыточного бактериального роста при базисных уровнях водорода и/или метана не превышающих 5 м.д., повышении уровня водорода менее 20 м.д. и/или метана менее 10 м.д. в течение 90 минут после приема лактулозы, то делают заключение о низкой вероятности наличия фиброза печени у данного пациента;

- если пациент перенес Covid-19 в форме пневмонии с поражением от 5 до 30% ткани легких, индекс массы тела находится в пределах от 31 до 35 кг/м², он является не-продуцентом водорода или метана при базисных уровнях водорода и метана и уровнях газов после приема лактулозы в течение 120 мин не превышали 2 м.д., выявлен медленный транзит кишечного содержимого при появлении пиков водорода и/или метана через 95 мин или позже после приема лактулозы, нет признаков синдрома избыточного бактериального роста при базисных уровнях водорода и/или метана не превышающих 5 м.д., повышения уровня водорода менее 20 м.д. и/или метана менее 10 м.д. в течение 90 минут после приема лактулозы, то делают заключение о средней вероятности наличия фиброза печени у данного пациента;

- если пациент перенес Covid-19 в форме пневмонии с поражением более 30% ткани легких, индекс массы тела превышает 35 кг/м², он не является не-продуцентом водорода или метана при базисных уровнях водорода и метана и уровнях указанных газов после приема лактулозы в течение 120 мин превышающих 2 м.д., не выявлено медленного транзита по кишке при появлении пиков водорода и/или метана через 95 мин или позже после приема лактулозы, есть признаки синдрома избыточного бактериального роста в тонкой кишке при базисных уровнях водорода и/или метана превышающих 10 м.д. или базисные уровни водорода и/или метана не превышают 5 м.д., но наблюдается повышение уровня водорода более или равно 20 м.д. и/или метана не более или равно 10 м.д. в течение 90 минут после приема лактулозы, то делают заключение о высокой вероятности наличия фиброза печени у данного пациента.

Для облегчения и ускорения определения вероятности наличия фиброза печени у пациентов, перенесших Covid-19, разработана таблица 1.

Заявляемый способ иллюстрируется графическими материалами, приведенными на фиг. 1. На фиг. 1 представлен ROC-анализ пациентов, перенесших Covid-19, с различным риском наличия фиброза печени. 1 - низкая вероятность наличия фиброза печени против среднего (AUC 0,93, чувствительность 0,84, специфичность 0,92); 2 - средняя вероятность против высокой (AUC 0,86, чувствительность 0,80, специфичность 0,86).

Пример 1

Для подтверждения достижения технического результата и проверки заявляемого способа привлекались волонтеры с одобрения Этического Комитета Научно-исследовательского института терапии и профилактической медицины - филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" (26.05.2020, протокол №23). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.

Обследовано 30 пациентов, перенесших COVID-19 (2 группа) через 12-16 недель после появления первых симптомов, средний возраст 51,8±2,91, из них 13 мужчин и 17 женщин. 10 из обследованных перенесли неосложненный COVID-2019 (проявления ОРВИ), в 11 случаях установлен диагноз пневмонии с поражением от 5 до 30% легочной ткани, 9 пациентов перенесли тяжелую пневмонию на фоне COVID-2019 с поражением более 30% легочной ткани (65±4%).

Диагноз COVID-2019 считался верифицированным при наличии положительного результата лабораторного исследования на РНК SARS-CoV-2 (с применением методов амплификации нуклеиновых кислот) или антигена SARS-CoV-2 (с применением иммунохроматографического анализа) вне зависимости от клинических проявлений [27] и/или антитела класса IgA, IgM и/или IgG к SARS-CoV-2 у пациентов с клинически подтвержденной инфекцией COVID-19 [28].

В качестве группы сравнения обследованы 19 человек (средний возраст 47,1±3,09, 8 мужчин и 11 женщин) - 1 группа - без манифестирующей патологии внутренних органов, не перенесшие COVID-2019 (подтверждено результатами лабораторных исследований).

Для выявления синдрома раздраженного кишечника, синдрома избыточного бактериального роста, определения времени кишечного транзита, мальабсорбции лактозы, в режиме реального времени использовался GastroCheck Gastrolyzer (Bedfont Scientific Ltd., England). Одновременно измерялись уровни водорода (Н2) и метана (СН4) в выдыхаемом воздухе. Проводилось измерение базовых уровней газов в выдыхаемом воздухе (в миллионных долях - м.д.). Если базисные уровни водорода и метана не превышали 5 м.д., пациентам проводилось исследование с провоцирующей дозой лактулозы 15 мл (1 пакетик - 667 мг/мл сиропа, Abbott, Нидерланды), растворенной в 200 мл воды. С помощью GastroCheck Gastrolyzer регистрировали пробы выдыхаемых газов каждые 15 мин в течение первого часа и каждые 30 мин в течение последующего часа.

Степень фиброза печени установлена методом непрямой эластометрии (FibroScan® 502 Echosens, Франция).

Пациенты исследованных групп не различались по частоте непродуцентов водорода, а также доле лиц со средними и высокими его уровнями в выдыхаемом воздухе после приема раствора лактулозы. В таблице 2 представлены данные по частоте параметров выдыхаемых газов в изучаемых группах, %.

Из данных таблицы 2 следует, что среди перенесших COVID-19 оказалось достоверно больше не-продуцентов метана (р=0,02), меньше лиц со средним уровнем метана в выдыхаемом воздухе (р=0,016). У реконвалесцентов COVID-19 реже выявлялся СИБР по сравнению с контролем (р=0,04), но чаще регистрировались признаки замедленного транзита по кишечнику (р<0,05). При анализе уровня газов в выдыхаемом воздухе у пациентов, перенесших COVID-19 и имеющих фиброз печени, оказалось, что большая часть из них 7 человек (87,5%) имеют СИБР. Сочетание СИБР и фиброза в группе реконвалесцентов COVID-19 оказалось достоверно чаще, чем в группе сравнения (23,3% против 5,2%, р<0,001).

У пациентов, перенесших COVID-19 с учетом тяжести перенесенного заболевания, и лиц группы сравнения определена степень фиброза печени методом непрямой эластометрии и эти данные сопоставлены с результатами теста на водород и метан в выдыхаемом воздухе. В таблице 3 представлены показатели выдыхаемых газов в группах, отличающихся по степени фиброза печени, где в столбцах указано количество больных, относящихся к группам, отличным по степени тяжести перенесенной COVID-19, имеющих данный признак: ОРВИ / пневмония 5-30% / пневмония более 30%.

Из данных таблицы 3 следует, что отсутствие фиброза печени или его легкие степени были ассоциированы с более низкими значениями индекса массы тела, большей частотой выявления непродуцентов водорода или метана и замедленным транзитом кишечного содержимого.

Более тяжелые степени фиброза печени с большими значениями в кПа оказались связанными с большими величинами индекса массы тела, наличием синдрома избыточного бактериального роста.

При проведении ROC-анализа комплексное использование вышеописанных параметров позволило достичь достаточной диагностической точности при различении пациентов с низкой вероятностью наличия фиброза печени от средней, а также средней от высокой вероятности (фиг. 1).

Ниже приведены клинические примеры 2 и 3 осуществления заявляемого способа определения вероятности наличия фиброза печени у пациентов, перенесших Covid-19, на основе индекса массы тела и метано-водородного теста.

Пример 2

Пациент К., 62 лет, инженер, обратился по поводу слабости, субфебрилитета, одышки при небольшой физической нагрузке, периодически - чувства тяжести в правом подреберье. 7 месяцев назад перенес Covid-19, осложнившуюся двусторонней пневмонией средней степени тяжести. При проведении компьютерной томографии органов грудной клетки установлено поражение 47% легочной ткани.

Пациент избыточного питания, ИМТ=36,7 кг/м², что соответствует 2 степени ожирения. При осмотре язык с минимальным беловатым налетом. Живот мягкий, печень - выступает из-под края реберной дуги на 2-2,5 см, край печени плотноват, чувствителен при пальпации, селезенка - без особенностей. Дополнительных образований, симптомов тревоги нет. Минимальная желтушность склер.

Состав крови больного на момент обращения (количество эритроцитов - 5,8⋅10¹²/л, содержание гемоглобина - 152 г/л, цветовой показатель - 0,91, количество лейкоцитов - 4,8⋅10⁹/л, формула не изменена, количество тромбоцитов - 251⋅10⁹ /л, СОЭ - 7 мм/ч, гликемия натощак - 6,3 ммоль/л, общий билирубин - 8,2 мкмоль/л, связанный (прямой) - 3,1 мкмоль/л, свободный (непрямой) - 5,1 мкмоль/л, щелочная фосфатаза (ЩФ) - 120 U/1 (норма до 290 U/1), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТП) - 26 U/1 (норма до 49 U/1), АЛТ - 21 U/1 (норма до 40 U/1), ACT - 19 U/1 (норма до 37 U/1), общий белок - 71 г/л, мочевина - 6,9 мг/дл, креатинин 102 мкмоль/л, общий холестерин 287.6 мг/дл, триглицериды 137,3 мг/дл, ХС ЛПВП 49,7 мг/дл, фибриноген - 3,1 г/л).

По данным УЗИ выявлена гепатомегалия, диффузные изменения печени по типу стеатоза печени, поджелудочной железы.

На ЭКГ выявлены умеренные метаболические изменения признаки гипертрофии миокарда левого желудочка.

С помощью GastroCheck Gastrolyzer у пациента проведено исследование проб выдыхаемых газов - водорода и метана. Базисные уровни водорода составили 59 м.д., метана - 61 м.д., что свидетельствовало о наличии у пациента синдрома избыточного бактериального роста в тонкой кишке. В связи с высокими базисными уровнями газов нагрузочные тесты с лактулозой не проводились.

Таким образом, у данного пациента, перенесшего Covid-19, осложненную пневмонией, отмечено поражение более 30% легких (47%), индекс массы тела превышает 35 кг/м2 (36,7 кг/м²), при исследовании газов в выдыхаемом воздухе выявлен синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке. Признаков замедленного транзита кишечного содержимого, непродуцента водорода, метана нет. В соответствии с вышеприведенными критериями (таблица 1) у данного пациента высокая вероятность наличия фиброза печени.

Проведенное исследование плотности печени методом непрямой эластометрии подтвердило наличие у пациента фиброза 3 степени (10,3 кПа). Последующее определение сывороточных маркеров фиброза печени - тест Fibro Max (Fibro Test) выявило значение 0,64, что также соответствовало третьей степени фиброза, т.е. высокая вероятность наличия фиброза печени была подтверждена двумя независимыми методами.

Пример 3

Пациент С., 35 лет, находился на обследовании в связи с перенесенной 6 месяцев назад COVID-19, во время которой отмечено повышение температуры до 38,5°С в течение 10 дней с последующим субфибрилитетом до месяца, аносмия, миалгии, скачки артериального давления, выраженная астения. При проведении компьютерной томографии поражения легких не выявлено.

При осмотре - пациент повышенного питания - ИМТ 28,1 кг/м², что соответствует избыточной массе тела. Язык влажный, обложен у корня беловатым налетом. При пальпации - живот мягкий, чувствительный при пальпации в правом подреберье, печень - у края реберной дуги, размеры печени не увеличены, край эластичен, безболезненный. Селезенка не увеличена.

По данным УЗИ органов брюшной полости выявлены косвенные признаки стеатогепатоза.

Данные биохимии свидетельствовали о наличии отклонений в уровне печеночных проб, показателей липидного обмена: общий билирубин - 16,7 мкмоль/л, связанный (прямой) - 5,3 мкмоль/л, свободный (непрямой) - 11,4 мкмоль/л, щелочная фосфатаза (ЩФ) - 168 U/1 (норма до 290 U/1), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТП) - 61 U/1 (норма до 49 U/1), АЛТ - 53 U/1 (норма до 40 U/1), ACT - 55 U/1 (норма до 37 U/1), общий белок - 72 г/л, мочевина - 5,1 мг/дл, креатинин 92 мкмоль/л, общий холестерин 206,1 мг/дл, триглицериды 149,9 мг/дл, ХС ЛПВП 41 мг/дл, фибриноген - 4,0 г/л).

Пациенту проведено исследование проб выдыхаемых газов с помощью прибора GastroCheck Gastrolyzer. Базисные уровни водорода составили 5 м.д., метана - 0 м.д., поскольку базисные уровни газов были ниже (или равно) 5 м.д. пациенту было проведено дальнейшее исследование после приема предложено провоцирующей дозы лактулозы 15 мл (1 пакетик - 667 мг/мл сиропа, Abbott, Нидерланды), растворенной в 200 мл воды. Затем фиксировались уровни газов в выдыхаемом воздухе - каждые 15 минут в течение первого часа и каждые полчаса - в течение второго часа.

В таблице 4. представлены уровни газов в выдыхаемом воздухе у пациента С. Поскольку у пациента базисные уровни водорода и метана не превышали 5 м.д. и в течение 90 минут после приема раствора лактулозы не отмечено повышение уровня водорода более или равно 20 м.д. и/или метана на более или равно 10 м.д., у данного пациента нет признаков синдрома избыточного бактериального роста в тонкой кишке. Скорость транзита кишечного содержимого не нарушена, поскольку отмечено появление пика водорода на 90-й минуте обследования. Вместе с тем, у пациента отсутствовал метан в выдыхаемом воздухе в течение всех интервалов обследования, т.е. пациент является непродуцентом метана.

Таким образом, у пациента, перенесшего COVID-19 без поражения легких, с массой тела не превышающей 30 кг/м, при исследовании газов в выдыхаемом воздухе выявлено, что он относится к непродуцентам метана, не имеет признаков синдрома избыточного бактериального роста, нарушенного транзита кишечного содержимого. Согласно данным таблицы 1, у данного пациента низкая вероятность наличия фиброза печени.

При проведении исследования методом непрямой эластометрии у пациента установлена эластичность печени 4,8 кПа, что соответствует 0 степени фиброза по системе METAVIR. Результаты сывороточных маркеров фиброза печени - Fibro Test - соответствующие 0,20, подтвердили отсутствие у пациента фиброза печени.

Диагностическая эффективность предлагаемого неинвазивного способа определения вероятности наличия фиброза печени у пациентов, перенесших Covid-19 и его пригодность подтверждается результатами биохимических, инструментальных исследований. Проведенный ROC-анализ (фиг. 1) демонстрирует высокий диагностический потенциал предлагаемого способа: различение низкой вероятности наличия фиброза печени у реконвалесцентов Covid-19 против средней вероятности с чувствительностью 0,84, специфичностью 0,92); средней вероятности от высокой вероятности с чувствительностью 0,80, специфичностью 0,86.

Данные результаты свидетельствуют о том, что данный неинвазивный способ эффективен и пригоден в определении вероятности наличия фиброза печени у реконвалесцентов Covid-19.

Преимущество предложенного способа по сравнению с существующими заключается в том, что данный способ определения вероятности наличия фиброза печени у пациентов, перенесших Covid-19, позволяет выявить группу пациентов, нуждающихся в углубленном обследовании по поводу диффузной патологии печени, изменить тактику терапии в короткие сроки. Носит неинвазивный характер (не связанный с проведением биопсии печени, взятием образцов крови), что предотвращает возможные серьезные осложнения в состоянии здоровья пациента. Пациенту не требуется госпитализация. Оценка показателей исследования объективна и не зависит от квалификации и опыта специалиста, производящего данные исследования. Способ позволяет установить наличие фиброза печени независимо от этиологии заболевания. Используются общедоступные реактивы, тем самым повышается доступность данного способа для массовой диагностик. У способа низкие трудоемкость и стоимость. Высокая чувствительность, специфичность и четкие критерии оценки вероятности наличия фиброза печени у пациентов, перенесших Covid-19, высокая диагностическая точность повышают ценность заявленного способа. Ограничения для применения заявленного способа, связанные с физическим и психологическим состоянием пациента, отсутствуют. Заявленный способ обеспечивает хорошую физическую и психологическую переносимость исследования пациентом.

Неинвазивный способ определения вероятности наличия фиброза печени реализуется на аттестованном устройстве GastroCheck Gastrolyzer для определения уровня газов в выдыхаемом воздухе.

Изобретение относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии. У пациента выясняют степень тяжести перенесенной инфекции, измеряют индекс массы тела и данные уровней газов в выдыхаемом воздухе. Затем сопоставляют данные о тяжести перенесенной Covid-19 инфекции, значения индекса массы тела и данные уровней газов в выдыхаемом воздухе. Если пациент перенес Covid-19 в форме ОРВИ, его индекс массы тела менее или равен 30 кг/м², он является непродуцентом водорода или метана, не выявлен медленный транзит по кишке, нет признаков синдрома избыточного бактериального роста, то у данного пациента низкая вероятность наличия фиброза печени. Если пациент перенес Covid-19 в форме пневмонии с поражением от 5 до 30% ткани легких, индекс массы тела находится в пределах от 31 до 35 кг/м², он является непродуцентом водорода или метана, выявлен медленный транзит кишечного содержимого, нет признаков синдрома избыточного бактериального роста, то у данного пациента средняя вероятность наличия фиброза печени. Если пациент перенес Covid-19 в форме пневмонии с поражением более 30% ткани легких, индекс массы тела превышает 35 кг/м², он не является непродуцентом водорода или метана, не выявлено медленного транзита по кишке, есть признаки синдрома избыточного бактериального роста в тонкой кишке, то у данного пациента высокая вероятность наличия фиброза печени. Способ позволяет установить наличие фиброза печени независимо от этиологии заболевания, выявить группу пациентов, нуждающихся в углубленном обследовании по поводу диффузной патологии печени, изменить тактику терапии в короткие сроки, при этом способ носит неинвазивный характер, что предотвращает возможные осложнения в состоянии здоровья пациента. Кроме того, способ обладает высокой чувствительностью, специфичностью и высокой диагностической точностью, а также имеет четкие критерии оценки вероятности наличия фиброза печени у пациентов, перенесших Covid-19. 4 табл., 3 пр., 1 ил.

Способ определения вероятности наличия фиброза печени у пациентов, перенесших Covid-19, характеризующийся тем, что у пациента выясняют степень тяжести перенесенной инфекции Covid-19: проявления ОРВИ или перенесенная пневмония с процентом поражения легочной ткани от 5 до 30% или более 30%; определяют индекс массы тела пациента, проводят градацию индекса массы тела пациента: менее или равно 30 кг/м², от 31 до 35 кг/м², более 35 кг/м²; осуществляют измерение базисных уровней водорода (Н2) и метана (СН4) в выдыхаемом воздухе пациентом в миллионных долях (м.д.); при превышении базисных уровней водорода и/или метана 10 м.д., состояние расценивают как наличие синдрома избыточного бактериального роста (СИБР) в тонкой кишке и нагрузочный тест с лактулозой не проводят; если базисные уровни водорода и метана не превышают 5 м.д., то проводят дальнейшие исследования с провоцирующей дозой лактулозы 15 мл с последующей регистрацией пробы выдыхаемых газов каждые 15 мин в течение первого часа и каждые 30 мин в течение последующего часа; при этом тест на наличие СИБР считают положительным при повышении уровня водорода более или равно 20 м.д. и/или при повышении уровня метана более или равно 10 м.д. в течение от 80 до 90 минут после приема лактулозы; оценивают скорость транзита кишечного содержимого по времени появления пиков газов: быстрый транзит при появлении пиков газов более 20 м.д. через 55-60 минут, нормальный транзит - через 75-80 минут, медленный транзит - через 95 минут или позже; оценивают продукцию газов: непродуцентами водорода/метана считают обследуемых пациентов, у которых уровень газов за весь период исследования от 115 до 120 мин не превышает 2 м.д., средними уровнями газов считают уровни водорода и/или метана от 10 до 30 м.д. и значения более 30 м.д. расценивают как высокие; затем сопоставляют данные о тяжести перенесенной инфекции Covid-19, значения индекса массы тела и данные уровней газов в выдыхаемом воздухе:

- если пациент перенес Covid-19 в форме ОРВИ, его индекс массы тела менее или равен 30 кг/м², он является непродуцентом водорода или метана при базисных уровнях водорода и метана и уровнях указанных газов после приема лактулозы в течение 120 мин не превышали 2 м.д., не выявлено медленного транзита по кишке при появлении пиков водорода и/или метана через 95 минут или позже после приема лактулозы, нет признаков синдрома избыточного бактериального роста при базисных уровнях водорода и/или метана не превышающих 5 м.д., повышении уровня водорода менее 20 м.д. и/или метана менее 10 м.д. в течение 90 минут после приема лактулозы, то делают заключение о низкой вероятности наличия фиброза печени у данного пациента;

- если пациент перенес Covid-19 в форме пневмонии с поражением от 5 до 30% ткани легких, индекс массы тела находится в пределах от 31 до 35 кг/м², он является непродуцентом водорода или метана при базисных уровнях водорода и метана и уровнях газов после приема лактулозы в течение 120 мин не превышали 2 м.д., выявлен медленный транзит кишечного содержимого при появлении пиков водорода и/или метана через 95 мин или позже после приема лактулозы, нет признаков синдрома избыточного бактериального роста при базисных уровнях водорода и/или метана не превышающих 5 м.д., повышения уровня водорода менее 20 м.д. и/или метана менее 10 м.д. в течение 90 минут после приема лактулозы, то делают заключение о средней вероятности наличия фиброза печени у данного пациента;

- если пациент перенес Covid-19 в форме пневмонии с поражением более 30% ткани легких, индекс массы тела превышает 35 кг/м², он не является непродуцентом водорода или метана при базисных уровнях водорода и метана и уровнях указанных газов после приема лактулозы в течение 120 мин превышающих 2 м.д., не выявлено медленного транзита по кишке при появлении пиков водорода и/или метана через 95 мин или позже после приема лактулозы, есть признаки синдрома избыточного бактериального роста в тонкой кишке при базисных уровнях водорода и/или метана превышающих 10 м.д. или базисные уровни водорода и/или метана не превышают 5 м.д., но наблюдается повышение уровня водорода более или равно 20 м.д. и/или метана не более или равно 10 м.д. в течение 90 минут после приема лактулозы, то делают заключение о высокой вероятности наличия фиброза печени у данного пациента.