КОМПЛЕКТ ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИЛИ ДИАГНОСТИКИ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/569 

[ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ]

Настоящее изобретение относится к комплекту для прогнозирования или диагностики неалкогольной жировой болезни печени и к способу диагностики этого заболевания.

[ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ]

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) характеризуется нарушением обмена веществ в печени от простого стеатоза до неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), которые являются инвазивной формой ткани, что в конечном итоге приводит к прогрессирующему фиброзу и циррозу. По данным большинства эпидемиологических исследований распространенность НАЖБП в мире оценивается на уровне 24-30% и растет параллельно с ожирением и метаболическим синдромом. Хотя НАЖБП обычно ассоциируется с ожирением, клинические симптомы и степень развития заболевания, сходные с наблюдающимися у пациентов с НАЖБП, страдающих ожирением, могут проявляться у пациентов без ожирения. Если не принимать во внимание пороговые значения различных индексов массы тела (ИМТ), определяющие ожирение (азиаты ≥25, другие расы ≥30), принято считать, что 3-30% населения без ожирения страдают НАЖБП как в странах Запада, так и в странах Востока. Хотя НАЖБП без ожирения может быть связана с висцеральным жиром, составом пищи и генетическими факторами, для выяснения патогенеза НАЖБП без ожирения необходимы дополнительные исследования с учетом других факторов окружающей среды.

В последнее время возрастающий интерес направлен преимущественно на выявление и осознание специфической роли кишечной микробиоты при различных болезнях обмена веществ. Дисбиоз кишечника, который относится к аномальным изменениям кишечной микробиоты по сравнению с нормальной микробиотой, связан с уменьшением количества бактерий, производящих полезные короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), изменением состава желчных кислот, активацией иммунных реакций на липополисахарид (ЛПС), увеличением производства этанола в результате избыточного роста производящих этанол бактерий, и преобразованием фосфатидилхолина в холин и триметиламин. Изменения кишечной микрофлоры, влияющие на ось «кишечник-печень», способствуют прогрессированию хронических заболеваний печени, таких как НАЖБП и цирроз, а также прогрессирующего фиброза.

Boursier с соавт. сравнили изменения кишечной микрофлоры у пациентов с легким и средним фиброзом и наблюдали значительный дисбаланс кишечных бактерий и функциональные изменения у пациентов с тяжелым фиброзом (непатентный документ 1). Loomba с соавт. использовали метагеномные данные для идентификации 37 бактерий, содержание которых значительно увеличилось или уменьшилось у пациентов с НАЖБП с прогрессирующим фиброзом, и предложили биомаркер на основе кишечной микрофлоры для прогнозирования фиброза (непатентный документ 2). Bajaj с соавт. определили профиль кишечной микрофлоры при прогрессирующем циррозе (непатентный документ 3). В китайском когортном исследовании выявлены изменения в кишечной микрофлоре пациентов с циррозом печени (непатентный документ 4). Тем не менее, микробные таксоны, связанные со степенью развития заболевания и стадией фиброза, не соответствовали предыдущим исследованиям НАЖБП. Это расхождение может быть обусловлено региональными различиями (непатентный документ 5). Кроме того, такие противоречивые результаты могут быть объяснены различиями в исходном статусе ИМТ. Более того, специфические изменения кишечной микрофлоры и связанных с ней метаболитов в группе больных с НАЖБП без ожирения выявлялись редко.

Поэтому существует потребность в способе предупреждения, терапевтического воздействия и диагностики НАЖБП без ожирения, определяющем гистологическую тяжесть НАЖБП, достоверно определяющем изменения кишечной микрофлоры и отличающемся эффективностью.

[РАСКРЫТИЕ]

[ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА]

Настоящее изобретение направлено на решение вышеуказанной проблемы, и его задачей является разработка маркера обнаружения неалкогольной жировой болезни печени, содержащего один или несколько маркеров обнаружения выбранных из группы, состоящей из микробиологического биомаркера, желчной кислоты и ее компонентов, и кишечной короткоцепочечной жирной кислоты, комплекта для прогнозирования или диагностики степени риска развития неалкогольной жировой болезни печени с использованием маркера обнаружения, способа прогнозирования или диагностики или способа предоставления информации для прогнозирования или диагностики степени риска развития неалкогольной жировой болезни печени с использованием маркера обнаружения, и способа скрининга терапевтического средства для неалкогольной жировой болезни печени.

[ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ]

Для достижения вышеуказанной цели настоящим изобретением предложен маркер обнаружения неалкогольной жировой болезни печени и комплект для прогнозирования или диагностики степени риска развития неалкогольной жировой болезни печени, содержащий одно или несколько средств обнаружения, определяющих маркер обнаружения.

Комплект может быть использован для прогнозирования или диагностики степени риска развития неалкогольной жировой болезни печени за счет содержания вышеупомянутых средств обнаружения определенного субъекта, определения количества, активности, популяции и иных подобных характеристик определенного субъекта обнаружения, или сравнения результатов с другими субъектами обнаружения.

В настоящем изобретении диагностика включает подтверждение наличия или отсутствия заболевания, степени риска заболевания, состояния заболевания и прогноза заболевания, и содержит все виды анализов, используемых для установления состояния заболевания и принятия решения.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения неалкогольная жировая болезнь печени может представлять собой неалкогольную жировую печень, неалкогольный стеатогепатит или цирроз.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения прогнозирование степени риска развития заболевания может прогнозировать степень тяжести фиброза. Степень тяжести фиброза может быть выражена как F=0 до F=4, причем F=0 означает отсутствие фиброза печени; F=1 означает легкий фиброз печени; F=2 означает значительный фиброз печени; F=3 означает развитый фиброз печени; и F=4 означает цирроз.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комплект может быть предназначен для пациента без ожирения, например, для пациента с ИМТ 25 кг/м² и менее.

Маркер обнаружения неалкогольной жировой болезни печени может содержать один или несколько видов из микробиологических биомаркеров, общей желчной кислоты и ее компонентов, а также кишечной короткоцепочечной жирной кислоты.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комплект может содержать средство обнаружения, позволяющее обнаруживать один или несколько маркеров обнаружения, выбранных из следующего:

(a) одно или несколько средств обнаружения, соответственно обнаруживающих один или несколько, выбранных из группы, состоящей из микробиологических биомаркеров неалкогольной жировой болезни печени;

(b) одно или несколько средств обнаружения, соответственно обнаруживающих одно или несколько выбранных из группы, состоящей из общей желчной кислоты и компонентов желчной кислоты; и

(с) одно или несколько средств обнаружения, соответственно обнаруживающих одно или несколько выбранных из группы, состоящей из кишечных короткоцепочечных жирных кислот.

Комплект может содержать, например, (a); (b); (c); (a) и (b); (a) и (c); (b) и (c); или (a), (b) и (c).

В настоящем описании общая желчная кислота и компоненты желчной кислоты, короткоцепочечная жирная кислота и т.п. используются в значении, содержащем все их метаболиты.

Микробиологические биомаркеры неалкогольной жировой болезни печени, на уровне семейства, могут представлять собой один или несколько выбранных из группы, состоящей из Enterobacteriaceae, Veillonellaceae, Rikenellaceae, Fusobacteriaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Actinomycetaceae, Desulfovibrioceae и Desulfovibrionaceaea. Например, это может быть один или несколько выбранных из группы, состоящей из Enterobacteriaceae, Veillonellaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae и Actinomycetaceae, один или несколько выбранных из группы, состоящей из Enterobacteriaceae, Veillonellaceae, Lachnospiraceae и Ruminococcaceae, или один или несколько выбранных из группы, состоящей из Enterobacteriaceae, Veillonellaceae и Ruminococcaceae.

Один пример микроорганизма Enterobacteriaceae может представлять собой один или несколько из Citrobacter и/или Klebsiella, один пример микроорганизма Veillonellaceae может представлять собой один или несколько из Veillonella и Megamonas, один пример микроорганизма Fusobacteriaceae может представлять собой Fusobacterium, один пример микроорганизма Desulfovibrionaceae может представлять собой Desulfovibrio, микроорганизм Ruminococcaceae может представлять собой один или несколько из Ruminococcus, Faecalibacterium и Oscillospira, микроорганизм Lachnospiraceae может представлять собой один или несколько из Coprococcus и Lachnospira, и микроорганизм Actinomycetaceae может представлять собой актиномицет.

В одном из примеров (a) может представлять собой одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать один или несколько выбранных из группы, состоящей из Enterobacteriaceae, Veillonellaceae, Lachnospiraceae и Ruminococcaceae.

Микробиологический биомаркер согласно настоящему изобретению на уровне рода может представлять собой один или несколько выбранных из группы, состоящей из Citrobacter, Klebsiella, Ruminococcus, Faecalibacterium, Oscillospira, Coprococcus и Lachnospira, а точнее говоря, это может быть один или несколько видов, выбранных из группы, состоящей из Ruminococcus, Faecalibacterium, Oscillospira, Coprococcus, Veillonella, Megamonas и Lachnospira, а еще точнее говоря, это может быть один или несколько видов из группы, состоящей из Ruminococcus, Faecalibacterium, Oscillospira, Coprococcus и Lachnospira, или один или несколько видов из группы, состоящей из Veillonella и Megamona.

Общая желчная кислота и компоненты желчной кислоты могут представлять собой одно или несколько выбранных из группы, состоящей из первичной желчной кислоты, содержащей общую желчную кислоту, холевую кислоту или хенодезоксихолевую кислоту; и вторичной желчной кислоты, содержащей урсодезоксихолевую кислоту, литохолевую кислоту и дезоксихолевую кислоту.

В одном из примеров (b) может представлять собой одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из общей желчной кислоты, холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, литохолевой кислоты и дезоксихолевой кислоты.

В одном из примеров (c) может представлять собой одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранное из группы, состоящей из ацетата, пропионата и бутирата.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комплект может содержать одну или несколько, выбранных из следующих комбинаций от (a) до (h):

средства обнаружения из (a),

средства обнаружения из (b),

средства обнаружения из (c),

(d) одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из Enterobacteriaceae, Veillonellaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты и пропионата;

(e) одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из Ruminococcus, Faecalibacterium, Oscillospira, Coprococcus, Lachnospira, общей желчной кислоты, холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, литохолевой кислоты и дезоксихолевой кислоты;

(f) одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из Ruminococcus, Faecalibacterium, Oscillospira, Coprococcus, Lachnospira и фекального пропионата;

(g) одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из Veillonella, Megamonas, общей желчной кислоты, холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, литохолевой кислоты и дезоксихолевой кислоты; и

(h) одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из Veillonella, Megamonas и фекального пропионата;

Средства обнаружения по (a) могут представлять собой, например, одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из Enterobacteriaceae, Veillonellaceae, Lachnospiraceae и Ruminococcaceae.

Средства обнаружения по (b) могут представлять собой, например, одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из общей желчной кислоты, холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, литохолевой кислоты и дезоксихолевой кислоты.

Средства обнаружения по (с) могут представлять собой, например, одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из короткоцепочечной жирной кислоты, ацетата, пропионата и бутирата.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комплект может содержать одну или несколько, выбранных из следующих комбинаций от (i) до (k):

(i) одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из Enterobacteriaceae, Veillonellaceae, Ruminococcaceae, Citrobacter, Klebsiella, Veillonella, Megamonas, Ruminococcus, Faecalibacterium и Oscillospira;

(j) одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты и их метаболитов; и

(k) одно или несколько средств обнаружения, каждое из которых способно обнаруживать одно или несколько выбранных из группы, состоящей из кишечных короткоцепочечных жирных кислот и пропионата.

В одном из примеров маркер обнаружения неалкогольной жировой болезни печени согласно настоящему изобретению может содержать один или несколько видов, выбранных из группы, состоящей из Enterobacteriaceae, Veillonellaceae, Rikenellaceae, Fusobacteriaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Actinomycetaceae, Desulfovibrioceae, Desulfovibrionaceae, Citrobacter, Klebsiella, Veillonella, Megamonas, Fusobacterium, Ruminococcus, Faecalibacterium, Oscillospira, Coprococcus, Lachnospira, Actinomyces, Desulfovibrio, общей желчной кислоты, холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, литохолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, короткоцепочечных жирных кислот, ацетата, пропионата и бутирата.

В одном из конкретных примеров маркер обнаружения неалкогольной жировой болезни печени согласно настоящему изобретению может содержать Enterobacteriaceae, Veillonellaceae и Ruminococcaceae. Согласно примерам настоящей заявки, в случае использования трех бактериальных маркеров в комбинации неалкогольная жировая печень может быть спрогнозирована с высокой точностью AUROC 0,8 или выше у субъекта без ожирения (ФИГ. 5a).

В одном из конкретных примеров маркер обнаружения неалкогольной жировой болезни печени, согласно настоящему изобретению, может содержать Megamonas и Ruminococcus. Согласно примерам настоящей заявки, в случае использования двух бактериальных маркеров в комбинации неалкогольная жировая печень может быть спрогнозирована с высокой точностью AUROC 0,7 или выше у субъекта без ожирения (ФИГ. 5b).

В одном из конкретных примеров маркер обнаружения неалкогольной жировой болезни печени, согласно настоящему изобретению, может содержать холевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту, урсодезоксихолевую кислоту и пропионат. Согласно примерам настоящей заявки, в случае использования четырех метаболитных маркеров в комбинации неалкогольная жировая печень может быть спрогнозирована с высокой точностью AUROC 0,7 или выше у субъекта без ожирения.

В одном из конкретных примеров маркер обнаружения неалкогольной жировой болезни печени согласно настоящему изобретению может содержать Enterobacteriaceae, Veillonellaceae, Ruminococcaceae, холевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту, урсодезоксихолевую кислоту и пропионат. Согласно примерам настоящей заявки, в случае использования трех бактериальных и четырех метаболитных маркеров в комбинации неалкогольная жировая печень может быть спрогнозирована с высокой точностью AUROC 0,9 или выше у субъекта без ожирения. В другом примере маркер обнаружения неалкогольной жировой болезни печени согласно настоящему изобретению может содержать Megamonas, Ruminococcus, холевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту, урсодезоксихолевую кислоту и пропионат. Согласно примерам настоящей заявки, в случае использования двух бактериальных и четырех метаболитных маркеров в комбинации неалкогольная жировая печень может быть спрогнозирована с высокой точностью AUROC 0,9 или выше у субъекта без ожирения. Это является значительно более высокой точностью, чем у традиционно используемого биомаркера неалкогольной жировой печени, то есть можно видеть, что биомаркер для прогнозирования неалкогольной жировой печени, согласно настоящему изобретению, позволяет точно прогнозировать неалкогольную жировую печень, и в частности, более точно прогнозировать неалкогольную жировую печень у субъекта без ожирения.

Настоящим изобретением предложен способ прогнозирования или диагностики, или способ предоставления информации для прогнозирования или диагностики степени риска развития неалкогольной жировой болезни печени, предусматривающий обнаружение одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из (a) одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из микробиологических биомаркеров неалкогольной жировой болезни печени; (b) одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из общей желчной кислоты и компонентов желчной кислоты; и (c) одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из кишечных короткоцепочечных жирных кислот.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения неалкогольная жировая болезнь печени может представлять собой неалкогольную жировую печень, неалкогольный стеатогепатит или цирроз. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения прогнозирование степени риска может быть прогнозированием степени тяжести фиброза. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ диагностики или способ предоставления информации для диагностики может быть предназначен для пациента без ожирения с ИМТ<25 кг/м².

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ может содержать один или несколько этапов, выбранных из следующего:

(i) измерение количества микробиологических биомаркеров в качестве одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из микробиологических биомаркеров неалкогольной жировой болезни печени;

(ii) измерение содержания в фекалиях одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из общей желчной кислоты и компонентов желчной кислоты; и

(iii) измерение содержания в фекалиях одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из кишечных короткоцепочечных жирных кислот, например, ацетата, пропионата и бутирата.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ может предусматривать сравнение обнаруженных значений у исследуемого индивидуума с соответствующим эталонным значением у здорового индивидуума для маркеров обнаружения (a)-(c), (a)-(h), (i)-(k) или (a)-(k), которые могут входить в состав комплекта.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ может предусматривать определение, что степень тяжести фиброза является высокой, причем обнаруженное значение у исследуемого индивидуума по сравнению с эталонным значением у здорового индивидуума увеличивается или уменьшается в соответствии с увеличением или уменьшением следующих маркеров обнаружения в результате сравнения обнаруженных значений у исследуемого субъекта и соответствующих эталонных значений у здорового индивидуума:

(a) в отношении одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из микробиологических биомаркеров неалкогольной жировой болезни печени, количество Enterobacteriaceae увеличиено, количество Veillonellaceae увеличено, или количество Ruminococcaceae уменьшено,

(b) в отношении одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из общей желчной кислоты и компонентов желчной кислоты, содержание холевой кислоты в фекалиях повышено, содержание хенодезоксихолевой кислоты в фекалиях повышено, или содержание урсодезоксихолевой кислоты в фекалиях повышено, или

(c) в отношении одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранного из группы, состоящей из кишечных короткоцепочечных жирных кислот, например, в случае, когда содержание в фекалиях одного или нескольких, выбранных из группы, состоящей из ацетата, пропионата и бутирата, является повышенным, например, в случае, когда содержание пропионата в фекалиях является повышенным, можно предусматривать определение, что степень тяжести фиброза является высокой.

Настоящим изобретением предложен способ скрининга терапевтического средства для неалкогольной жировой болезни печени, содержащий следующие этапы:

(1) введение тестируемого вещества экспериментальному животному с неалкогольной жировой болезнью печени;

(2) измерение одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из (a) одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из микробиологических биомаркеров неалкогольной жировой болезни печени; (b) одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из общей желчной кислоты и компонентов желчной кислоты; и (c) одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из кишечных короткоцепочечных жирных кислот, у экспериментального животного, не получавшего тестируемое вещество, и у экспериментального животного, получавшего тестируемое вещество; и

(3) сравнение результатов измерений в контрольной группе, не получавшей тестируемое вещество, и в экспериментальной группе, получавшей тестируемое вещество.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения неалкогольная жировая болезнь печени может представлять собой неалкогольную жировую печень, неалкогольный стеатогепатит или цирроз.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экспериментальное животное на этапе (1) может иметь одну или несколько из следующих характеристик (1) - (5):

(1) состояние, в котором концентрация АЛТ в крови повышена, например, состояние в котором она превышает более чем в 1 раз, в 1,1 раза и более, в 1,2 раза и более, в 1,3 раза и более, в 1,4 раза и более, в 1,5 раза и более, в 1,6 раза и более, в 1,7 раза и более, в 1,8 раза и более, в 1,9 раза и более, в 2 раза и более, в 2,1 раза и более, в 2,2 раза и более, в 2,3 раза и более, в 2,4 раза и более, в 2,5 раза и более, в 2,6 раза и более, в 2,7 раза и более, в 2,8 раза и более, в 2,9 раза и более, в 3 раза и более, в 3,5 раза и более, в 4 раза и более, в 4,5 раза и более, в 5 раз и более, в 5,5 раз и более, в 6 раз и более, в 6,5 раз и более, в 7 раз и более, в 7,5 раз и более, в 8 раз и более, в 8,5 раз и более, в 9 раз и более, в 9,5 раз и более, или в 10 раз и более по сравнению с концентрацией АЛТ в крови в обычной контрольной группе.

(2) состояние, в котором концентрация АСТ в крови повышена, например, состояние в котором она превышает более чем в 1 раз, в 1,1 раза и более, в 1,2 раза и более, в 1,3 раза и более, в 1,4 раза и более, в 1,5 раза и более, в 1,6 раза и более, в 1,7 раза и более, в 1,8 раза и более, в 1,9 раза и более, в 2 раза и более, в 2,1 раза и более, в 2,2 раза и более, в 2,3 раза и более, в 2,4 раза и более, в 2,5 раза и более, в 2,6 раза и более, в 2,7 раза и более, в 2,8 раза и более, в 2,9 раза и более, в 3 раза и более, в 3,5 раза и более, в 4 раза и более, в 4,5 раза и более, в 5 раз и более, в 5,5 раз и более, в 6 раз и более, в 6,5 раз и более, в 7 раз и более, в 7,5 раз и более, в 8 раз и более, в 8,5 раз и более, в 9 раз и более, в 9,5 раз и более, или в 10 раз и более по сравнению с концентрацией АСТ в крови в обычной контрольной группе.

(3) состояние, в котором концентрация вторичных желчных кислот в слепой кишке понижена, например, состояние в котором она понижена менее чем в 1 раз, в 0,9 раза и менее, в 0,8 раза и менее, в 0,7 раза и менее, в 0,6 раза и менее, в 0,5 раза и менее, в 0,4 раза и менее, в 0,3 раза и менее, в 0,2 раза и менее, или в 0,1 раза и менее по сравнению с концентрацией вторичных желчных кислот в слепой кишке в обычной контрольной группе.

(4) состояние, в котором экспрессия маркерного гена фиброза повышена, например, состояние в котором он сверхэкспрессирован более чем в 1 раз, в 1,1 раза и более, в 1,2 раза и более, в 1,3 раза и более, в 1,4 раза и более, в 1,5 раза и более, в 1,6 раза и более, в 1,7 раза и более, в 1,8 раза и более, в 1,9 раза и более, в 2 раза и более, в 2,1 раза и более, в 2,2 раза и более, в 2,3 раза и более, в 2,4 раза и более, в 2,5 раза и более, в 2,6 раза и более, в 2,7 раза и более, в 2,8 раза и более, в 2,9 раза и более, в 3 раза и более, в 3,5 раза и более, в 4 раза и более, в 4,5 раза и более, в 5 раз и более, в 5,5 раз и более, в 6 раз и более, в 6,5 раз и более, в 7 раз и более, в 7,5 раз и более, в 8 раз и более, в 8,5 раз и более, в 9 раз и более, в 9,5 раз и более, в 10 раз и более, в 11 раз и более, в 12 раз и более, в 13 раз и более, в 14 раз и более, в 15 раз и более, в 16 раз и более, в 17 раз и более, в 18 раз и более, в 19 раз и более, или в 20 раз и более по сравнению с экспрессией маркерного гена фиброза в обычной контрольной группе. Маркерный ген фиброза может представлять собой Col1a1 и/или Timp1 и/или α-SMA

(5) состояние, в котором отношение массы печени к массе тела повышено, например, состояние в котором оно превышает более чем в 1 раз, в 1,1 раза и более, в 1,2 раза и более, в 1,3 раза и более, в 1,4 раза и более, в 1,5 раза и более, в 1,6 раза и более, в 1,7 раза и более, в 1,8 раза и более, в 1,9 раза и более, в 2 раза и более, в 2,1 раза и более, в 2,2 раза и более, в 2,3 раза и более, в 2,4 раза и более, в 2,5 раза и более, в 2,6 раза и более, в 2,7 раза и более, в 2,8 раза и более, в 2,9 раза и более или в 3 раза и более по сравнению с отношением массы печени к массе тела в обычной контрольной группе.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тестовое вещество может содержать вещество-кандидат терапевтического средства для неалкогольной жировой болезни печени, например, это может быть одно или несколько выбранных из группы, состоящей из пептида, белка, непептидного соединения, активного соединения, ферментированного продукта, клеточного экстракта, растительного экстракта, экстракта тканей животных и плазмы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ может содержать один или несколько этапов, выбранных из следующего:

измерение содержания в фекалиях одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из

(i) измерение количества микробиологических биомаркеров в качестве одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из микробиологических биомаркеров неалкогольной жировой болезни печени;

(ii) измерение содержания в фекалиях одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из общей желчной кислоты и компонентов желчной кислоты; и

(iii) измерение содержания в фекалиях одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из кишечных короткоцепочечных жирных кислот, например, ацетата, пропионата и бутирата.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ может предусматривать сравнение значений обнаружения экспериментальной группы, получавшей тестируемое вещество, и контрольной группы, не получавшей тестируемое вещество, для экспериментального животного с неалкогольной жировой болезнью печени для маркеров обнаружения (a)-(c), (a)-(h), (i)-(k) или (a)-(k).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ может предусматривать выбор тестируемого вещества в качестве терапевтического средства для неалкогольной жировой болезни печени в соответствии с результатом увеличения или уменьшения обнаруженного значения для каждого маркера обнаружения в экспериментальной группе по сравнению с эталонным значением контрольной группы, как результата сравнения обнаруженных значений экспериментальной группы и обнаруженного значения контрольной группы:

(a) в отношении одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из микробиологических биомаркеров неалкогольной жировой болезни печени, количество Enterobacteriaceae увеличено, количество Veillonellaceae увеличено, или количество Ruminococcaceae понижено,

(b) в отношении одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из общей желчной кислоты и компонентов желчной кислоты, содержание холевой кислоты в фекалиях повышено, содержание хенодезоксихолевой кислоты в фекалиях повышено, или содержание урсодезоксихолевой кислоты в фекалиях повышено, или

(c) в отношении одного или нескольких маркеров обнаружения, выбранных из группы, состоящей из кишечных короткоцепочечных жирных кислот, например, в случае, когда содержание в фекалиях одного или нескольких выбранных из группы, состоящей из ацетата, пропионата и бутирата, повышено, или, например, содержание пропионата в фекалиях повышено, этап определения того, что степень тяжести фиброза высокая, может быть предусмотрен.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ может предусматривать выбор тестируемого вещества, в котором снижено количество Enterobacteriaceae, снижено количество Veillonellaceae, повышено количество Ruminococcaceae, снижено содержание холевой кислоты в фекалиях, снижено содержание хенодезоксихолевой кислоты в фекалиях, снижено содержание урсодезоксихолевой кислоты в фекалиях или снижено содержание пропионата в фекалиях по сравнению с контрольной группой, не получавшей тестируемое вещество.

Способ прогнозирования степени риска развития неалкогольной жировой болезни печени, способ предоставления информации для прогнозирования, способ диагностики или способ предоставления информации для диагностики согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения может дополнительно предусматривать введение субъекту терапевтического средства для неалкогольной жировой болезни печени.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу терапевтического воздействия на неалкогольную жировую болезнь печени, предусматривающему введение терапевтического средства для неалкогольной жировой болезни печени субъекту, определенного как имеющего риск неалкогольной жировой болезни печени, с помощью комплекта для прогнозирования или диагностики степени риска развития неалкогольной жировой болезни печени, способа прогнозирования степени риска развития неалкогольной жировой болезни печени, способа предоставления информации для прогнозирования, способа диагностики или способа предоставления информации для диагностики согласно настоящему изобретению.

[ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ]

Комплект для прогнозирования или диагностики, согласно настоящему изобретению, позволяет эффективно прогнозировать или диагностировать степень риска развития неалкогольной жировой болезни печени, в частности, обеспечивает высокую предсказуемость и значимость предоставленной информации у субъектов без ожирения. Поэтому его можно эффективно использовать для предупреждения или терапевтического воздействия на соответствующее заболевание, предоставляя посредством этого эффективную информацию о неалкогольной жировой болезни печени.

[КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ]

На ФИГ. 1a-1l представлены результаты сравнения разнообразия кишечной микрофлоры. Значения, разделяющие альфа- и бета-разнообразие по гистологическому спектру НАЖБП или тяжести фиброза для всех субъектов показаны на ФИГ. 1a-1d, для субъектов без ожирения - на ФИГ. 1e-1h, а для субъектов с ожирением - на ФИГ. 1i-1l. Кривые разрежения построены с использованием индекса Шеннона при 12 000 последовательностей на образец. Статистический анализ выполнен с использованием непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Графики NMDS построены с использованием данных об относительном количестве ОТЕ в соответствии с расстоянием Брея-Кертиса, а статистическая значимость определена с помощью анализа Adonis. ^**P<0,01

На ФИГ. 2a-2d изображены результаты одномерного анализа различий в специфических микробиологических таксонах в зависимости от степени тяжести фиброза. Для наглядности 13 таксонов на уровне семейств и 14 таксонов на уровне родов показаны вместе с их верхним относительным количеством. Графики показывают интерквартильный размах (IQR) между первым и третьим квартилями с усами Тьюки. Цвет в рамке указывает на степень тяжести фиброза. Для определения статистической значимости использовали непараметрический критерий Краскела-Уоллиса. ^*P<0,05, ^**P<0,01, ^***P<0,001

На ФИГ. 2e-2h изображены результаты многомерного анализа различий в специфических микробиологических таксонах в зависимости от степени тяжести фиброза. Преобразование «арксинус-квадрат» количества четырех бактерий регрессировали по возрасту, полу и ИМТ в зависимости от степени тяжести фиброза, а стандартный остаток показали в виде диаграммы размаха. ^*P<0,05, ^**P<0,01, ^***P<0,001

На ФИГ. 2i - 2k представлены результаты анализа коэкспрессии специфических элементов микробиоты кишечника в целом, у субъектов без ожирения и субъектов с ожирением. Сплошные линии (оранжевые) и пунктирные линии (серые) указывают на положительные и отрицательные корреляции, соответственно. Размер узла указывает на относительное количество бактерий, а цвет - на степень корреляции в зависимости от степени фиброза.

На рис. 3a - 3j представлены результаты оценки фекальных метаболитов, в основном связанных с микробиотой кишечника. На ФИГ. 3a представлены результаты профилирования желчных кислот в различных клинических средах, и столбчатые диаграммы построены с использованием среднего количества пяти желчных кислот. На ФИГ. 3b - 3g диаграммы размаха иллюстрируют стратифицированные уровни желчных кислот в фекалиях в зависимости от степени тяжести фиброза и статуса ожирения. Концентрации пяти желчных кислот в фекалиях стратифицировали по степени тяжести фиброза и статусу ожирения. На ФИГ. 3h - ФИГ. 3j диаграммы размаха показывают наиболее распространенные короткоцепочечные жирные кислоты в фекалиях (ацетат, пропионат и бутират) в зависимости от степени тяжести фиброза и статуса ожирения. Интерквартильные размахи (IQR) между первым и третьим квартилями описаны как усы Тьюки. Для определения статистической значимости использовали непараметрический критерий Краскела-Уоллиса. ^*P<0,05, ^**P<0,01, ^***P<0,001

На ФИГ. 4 представлен результат сетевого профиля между микробиологическими таксонами и компонентами фекальных метаболитов у субъектов без ожирения (a) и с ожирением (b). Коэффициенты коэкспрессии между элементами микробиоты на уровне семейства и фекальными метаболитами рассчитали с помощью SparCC и описали с помощью Cytoscape. Сплошные линии (оранжевые) и пунктирные линии (серые) указывают на положительные и отрицательные корреляции, соответственно. Форма узла указывает на компоненты, использованные в настоящем исследовании (овал: микробиота, ромб: фекальная желчная кислота, скругленный прямоугольник: короткоцепочечная жирная кислота), а цвет указывает на степень корреляции в зависимости от степени тяжести фиброза.

На ФИГ. 5a и ФИГ. 5b изображены кривые операционных характеристик приемника (ROC-кривая) для прогнозирования значительного фиброза в целом, у субъектов без ожирения и у субъектов с ожирением. На ФИГ. 5a изображена ROC-кривая с использованием комбинации трех выбранных бактерий (Veillonellaceae, Ruminococcacea и Enterobacteriaceae) и четырех фекальных метаболитов (холевая кислота, хенодезоксихолевая кислота, урсодезоксихолевая кислота и пропионат), построенная для прогнозирования значительного фиброза в целом, у субъектов без ожирения и субъектов с ожирением, с рассчитанными площадями под кривой (AUC). На ФИГ. 5b изображена ROC-кривая с использованием комбинации двух выбранных бактерий (Megamonas и Ruminococcus) и четырех фекальных метаболитов (холевая кислота, хенодезоксихолевая кислота, урсодезоксихолевая кислота и пропионат), построенная для прогнозирования значительного фиброза в целом, у субъектов без ожирения и субъектов с ожирением, с рассчитанными площадями под кривой (AUC).

На ФИГ. 6 схематично изображена диаграмма, комплексно обобщающая содержание, соответствующее различиям кишечной флоры, изменениям микроорганизмов и метаболитов, и результат прогнозирования фиброза по комбинации репрезентативных микроорганизмов и метаболитов, показанных у субъектов без ожирения и субъектов с ожирением.

На ФИГ. 7 изображена диаграмма, показывающая гистологическое распределение субъектов исследования по степени тяжести фиброза.

На ФИГ. 8 изображена диаграмма, показывающая корреляцию между микробиологическими таксонами и метаболическими индексами у пациентов без ожирения и с ожирением.

На ФИГ. 9a-9e изображены диаграммы, показывающие корреляцию между микробиологическими таксонами и метаболическими индексами у пациентов без ожирения и с ожирением.

На ФИГ. 10a-10c изображены диаграммы, показывающие взаимосвязь между относительным количеством определенных микробиологических таксонов кишечника и степенью тяжести фиброза на уровне рода в зависимости от степени ожирения.

На ФИГ. 11 изображена диаграмма, показывающая связь между относительным количеством Actiomyces в зависимости от степени ожирения и вариантом TM6SF2 (rs58542926).

На ФИГ. 12a - 12d изображены диаграммы, показывающие взаимосвязь между относительным количеством определенных микробиологических компонентов кишечника и наличием или отсутствием сахарного диабета.

На ФИГ. 13a-13e изображены диаграммы, показывающие относительное содержание желчных кислот в фекалиях в зависимости от степени тяжести фиброза и статуса ожирения.

[ПРИНЦИП ИЗОБРЕТЕНИЯ]

Ниже приведены примеры, помогающие понять настоящее изобретение, при этом они просто иллюстрируют настоящее изобретение, и специалистам в данной области техники очевидна возможность различных изменений и модификаций в рамках объема и технической идеи настоящего изобретения; при этом очевидно, что изменения и модификации подпадают под объем охраны настоящего изобретения. В следующих Примерах и сравнительных Примерах «%» и «часть», указывающие на содержание, относятся к массе, если не указано иное.

Значения, представленные в следующем экспериментальном примере, выражены как среднее значение ± среднеквадратическая погрешность (S.D.), и статистическая значимость различий между каждой группой лечения определена по односторонней ANOVA с использованием Graph Pad Prism 4.0 (Сан-Диего, Калифорния).

[Экспериментальный пример 1]

1. Материалы и способ

1) Субъект экспериментального исследования

В исследование были включены 171 субъект, у которых по результатам биопсии была выявлена НАЖБП, и 31 субъект без НАЖБП. Если НАЖБП была подтверждена гистологически, а ИМТ составлял <25 кг/м², ее классифицировали как группу НАЖБП без ожирения.

2) Критерии включения и исключения субъектов

Субъектов подбирали в течение длительного периода с января 2013 года по февраль 2017 года, а критерии включения были следующими:

1. Взрослый человек не моложе 18 лет,

2. Результаты ультразвукового исследования, подтверждающие жировую инфильтрацию печени, и

3. Повышение уровня аланин-аминотрансферазы (АЛТ) неизвестной этиологии в последние 6 месяцев.

С другой стороны, были исключены субъекты, соответствующие любому из следующих критериев:

1. Инфекция гепатита В или С,

2. Аутоиммунный гепатит, первичный билиарный холангит или первичный склерозирующий холангит,

3. Онкологические заболевания желудочно-кишечного тракта или гепатоцеллюлярная карцинома,

4. Лекарственный стеатоз или поражение печени,

5. Болезнь Вильсона или гемохроматоз,

6. Чрезмерное употребление алкоголя (мужчины: >210 г/неделю, женщины: >140 г/неделю),

7. Прием антибиотиков в течение предыдущего месяца,

8. Диагноз злокачественного новообразования в течение последнего года,

9. Инфекция вируса иммунодефицита человека, и

10. Хронические заболевания, связанные с липодистрофией или иммуносупрессией.

В контрольные группы без ожирения и с ожирением входили субъекты без подозрений на НАЖБП (а) во время оценки трансплантации печени живого донора или (б) во время биопсии печени для определения плотного образования печени, с подозрением на аденому печени или фокальную нодулярную гиперплазию на основании визуализирующих исследований (Koo BK, Joo SK, Kim D, Bae JM, Park JH, Kim JH, et al. Additive effects of PNPLA3 and TM6SF2 on the histological severity of non-alcoholic fatty liver disease. J Gastroenterol Hepatol 2018;33:1277-1285.).

3) Гистология печени

Гистология печени оценивалась одним патологоанатомом с использованием системы гистологического скоринга NASH CRN. НАЖБП определялась как наличие ≥5% макровезикулярного стеатоза по результатам гистологического исследования. НАСГ определяли на основании общей картины поражения печени, состоящей из стеатоза, лобулярного воспаления или баллонирования гепатоцитов в соответствии с критериями Brunt с соавт. (Brunt EM, Janney CG, Di Bisceglie AM, Neuschwander-Tetri BA, Bacon BR. Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histological lesions. Am J Gastroenterol 1999;94:2467-2474; Brunt EM, Kleiner DE, Wilson LA, Belt P, Neuschwander-Tetri BA. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology 2011;53:810-820). Кроме того, стеатоз, воспаление и отечность долей печени оценивали в соответствии с системой скоринга активности НАЖБП, а выраженность фиброза оценивали в соответствии с критериями Kleiner с соавт. (Kleiner DE, Brunt EM, Van Natta M, Behling C, Contos MJ, Cummings OW, et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2005;41:1313-1321).

4) Анализ микрофлоры с помощью секвенирования 16S рРНК

ДНК из образцов фекалий выделили с помощью комплекта QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Хильден, Германия). Секвенирование V4 региона 16S рРНК проводили с использованием платформы MiSeq (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США), а дополнительную обработку исходных данных секвенирования проводили с помощью конвейера QIIME (v 1.8.0) (Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods 2010;7:335-336).

5) Измерение фекальных метаболитов с помощью газового хроматографа с пламенно-ионизационным детектором и системы Q-TOP

Фекальную короткоцепочечную жирную кислоту измеряли с помощью системы Agilent Technologies 7890A GC (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) по методу Дэвида (David LA, Maurice CF, Carmody RN, Gootenberg DB, Button JE, Wolfe BE, et al. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature 2014;505:559-563), а профиль желчных кислот оценивали с помощью масс-спектрометра Q-TOF (Waters Micromass Technologies, Манчестер, Великобритания).

6) Биоинформационный анализ и статистические тесты

Статистическое сравнение проводили по критерию Краскела-Уоллиса с использованием программного обеспечения GraphPad Prism верс. 7.0d (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Для кривых разрежения таблицу OUT выбирали по 12000 последовательностей на образец, а индекс Шеннона измеряли с помощью QIIME. Графики непараметрического многомерного шкалирования (NMDS) представлены с помощью пакета Vergan R (Oksanen J, Kindt R, Legendre P, O'Hara B, Stevens MHH, Oksanen MJ, et al. The vegan package. Community ecology package 2007;10.), а расстояние измеряли по методу Брея-Кертиса. Статистическую значимость между группами оценивали по функции Adonis. Анализ многомерных связей с использованием данных микрофлоры проводился на многомерной связи с использованием линейной модели (MaAsLin) для идентификации определенных таксонов, связанных с фенотипом хозяина, без влияния других метаданных (Morgan XC, Tickle TL, Sokol H, Gevers D, Devaney KL, Ward DV, et al. Dysfunction of the gut microbiome in inflammatory bowel disease and treatment. Genome Biol 2012;13:R79.). Кроме того, возраст, пол и ИМТ или диабет были обозначены как фиксированные переменные, и когда p-значение, скорректированное по коэффициенту ложноположительных результатов Бенджамини-Хохберга, было ниже 0,20, уровень связи считался значимым.

7) Значимое прогнозирование фиброза по ROC-кривым

Для демонстрации пригодности биомаркеров на основе микрофлоры к прогнозированию фиброза использовали метод площади под кривой операционной характеристики приемника (AUROC). Три бактерии уровня семейства, основные характеристики субъектов (возраст, пол и ИМТ) и относительное количество FIB-4, подтвержденное в настоящем эксперименте, использовали в качестве входных данных для AUROC, а комбинацию их факторов рассчитали методом бинарной логистической регрессии в SPSS верс. 25,0 (SPSS Inc., Армонк, Нью-Йорк, США). Сравнение AUROC выполнили с помощью теста DeLong с использованием программного обеспечения MedCalc верс. 18.2.1 (MedCalc Software BVBA, Остенде, Бельгия).

2. Результаты эксперимента

1) Основные характеристики

В исследование включен 171 субъект, у которых при биопсии выявлена НАЖБП (НАЖП, n=88; НАСГ, n=83), и 31 субъект без НАЖБП. Все субъекты были разделены на две группы (без ожирения, ИМТ<25; с ожирением, ИМТ≥25), и каждый субъект был отнесен к одной из трех подгрупп в соответствии с гистологическим спектром НАЖБП или фиброза. В таблицы 1 и 2 сведены результаты подробных характеристик каждой группы, включая клинические, метаболические, биохимические и гистологические профили.

[Таблица 1]
Исходные характеристики субъектов исследования, разделенные по статусу ожирения и гистологическому спектру НАЖБП. Без ожирения (n=64) С ожирением (n=138) Без НАЖБП НАС НАСГ P-значение Без НАЖБП НАС НАСГ P-значение N (Мужчин/женщин) 7/14 13/11 7/12 4/6 37/27 24/40 Возраст (лет) 58,7 ± 10,7 58,3 ± 10,2 60,2 ± 8,84 0,8601 ^ns 58 ± 12,6 52,7 ± 14,8 53,6 ± 16,7 0,6463 ^ns ИМТ (кг/м²) 22,8 ± 1,67 23,6 ± 1,34 23,6 ± 0,83 0,0871 ^ns 27 ± 2,09 28,8 ± 3,25 28,8 ± 3,02 0,1374 ^ns ОТ (см) 80 ± 6,53^a 82,7 ± 3,45^ab 85,4 ± 4b 0,0141 ^* 92,7 ± 5,93 94,3 ± 8,04 96,6 ± 7,81 0,2328 ^ns АСТ (МЕ/л) 31,6 ± 24,4^a 28,4 ± 9,05^b 54,7 ± 45,7^bc 0,002 ^** 25,6 ± 7,5a 42,3 ± 26,5^b 62 ± 32,3^bc < 0,0001 ^*** АЛТ (МЕ/л) 32,5 ± 32,6^a 32,8 ± 17,3^b 59 ± 52,9c < 0,0001 ^*** 27,8 ± 25,8^a 56,9 ± 48,5^b 79,1 ± 57,6^c < 0,0001 ^*** ГГТ (МЕ/л) 44,6 ± 54^a 31,8 ± 34,1^a 66,7 ± 55,2^b 0,0016 ^** 44,7 ± 51,8^a 49,2 ± 57,4^a 78,5 ± 79,2^b < 0,0001 ^*** Холестерин ЛПВП (мг/дл) 54 ± 14 46,3 ± 10,8 43,8 ± 11,7 0,0527 ^ns 58,9 ± 14,3^a 47 ± 11,6^b 45,5 ± 11,2^bc 0,0196 ^* Холестерин ЛПНП (мг/дл) 93,5 ± 25,7 111 ± 39,8 97,3 ± 32,1 0,5322 ^ns 123 ± 35,8 103 ± 32,3 107 ± 32,7 0,1782 ^ns Альбумин (г/дл) 4,1 ± 0,285 4,24 ± 0,257 4,03 ± 0,413 0,1128 ^ns 4,12 ± 0,312 4,2 ± 0,254 4,15 ± 0,279 0,516 ^ns Тромбоциты (×10³/мкл) 223 ± 72,2^ab 259 ± 54,4^a 179 ± 79^bc 0,0023 ^** 232 ± 53 234 ± 59,9 215 ± 69 0,3027 ^ns Ферритин (нг/мл) 103 ± 57,2 109 ± 80,2 173 ± 114 0,1285 ^ns 63,8 ± 26,9^a 137 ± 88,4^b 159 ± 95,1^bc 0,0026 ^** Гиалуроновая кислота HA (нг/мл) 66,6 ± 70,2^ab 37,1 ± 30,2^a 93,9 ± 64,9^bc 0,0048 ^** 76,8 ± 99,2^ab 62,1 ± 95,4^a 95,7 ± 112^bc 0,0344 ^* Инсулин (мкМЕ/мл) 9,45 ± 3,77^a 11,2 ± 5,96^ab 13,6 ± 5,85^b 0,037 ^* 11,2 ± 5,55a 18,1 ± 17,1^ab 18,2 ± 11,1^b 0,0227 ^* HbA1c (%) 5,71 ± 0,481^a 6,06 ± 0,676^a 7,12 ± 1,96^b < 0,0001 ^*** 5,72 ± 0,326^a 6,1 ± 0,814^ab 6,6 ± 1,27^b 0,0099 ^** C-пептид (нг/мл) 1,91 ± 0,61^a 2,43 ± 0,832^ab 2,88 ± 1,09^b 0,0005 ^*** 2,42 ± 0,916^a 4,42 ± 3,4^b 4,19 ± 2,39^bc 0,0087 ^** HOMA-IR 2,56 ± 1,17^a 3,12 ± 1,72^ab 4,39 ± 2,19^bc 0,0085 ^** 2,92 ± 1,77^a 4,96 ± 4,36^ab 5,77 ± 4,42^bc 0,0131 ^* Adipo-IR 4,68 ± 2,85^a 6,6 ± 3,59^ab 9,63 ± 5,39^bc 0,0027 ^** 6,42 ± 3,28^a 10,1 ± 10,1^ab 12,8 ± 9,51^bc 0,0096 ^** Свободные жирные кислоты FFA (мкг-экв/л) 493 ± 166^ab 620 ± 240^a 720 ± 268^bc 0,0121 ^* 605 ± 289a 603 ± 259^ab 712 ± 238^bc 0,0089 ^** hsCRP (мг/дл) 0,249 ± 0,428^a 0,0896 ± 0,066^a 0,354 ± 0,549^b 0,0119 ^* 0,152 ± 0,154^ab 0,206 ± 0,403^a 0,278 ± 0,336^bc 0,0294 ^* Холестерин (мг/дл) 167 ± 28,2 185 ± 41,8 167 ± 42,9 0,3932 ^ns 200 ± 43,2 183 ± 34,8 181 ± 40,7 0,4122 ^ns ТГ (мг/дл) 102 ± 47^a 140 ± 44,7^b 141 ± 70,9^ab 0,0105 ^* 87 ± 34^a 161 ± 82,2^b 151 ± 61,9^bc 0,0024 ^** FPG (мг/дл) 110 ± 25,6 113 ± 28,8 132 ± 42,5 0,0986 ^ns 102 ± 14,1 113 ± 27,4 128 ± 55,8 0,2074 ^ns HTN, n (%) 8 (38,1) 8 (33,3) 9 (47,4) 0,641 ^ns 4 (40,0) 24 (37,5) 32 (50,0) 0,352 ^ns Диабет, n (%) 1 (4,76) 8 (33,3) 13 (68,4) 0,0001 ^*** 1 (10,0) 19 (29,7) 30 (46,9) 0,026 ^*

Сокращения: ИМТ - индекс массы тела; ОТ - окружность талии; АСТ - аспартатаминотрансаминаза; АЛТ - аланин-аминотрансаминаза; ГГТ - гамма-глутамилтрансфераза; NAS - балл активности неалкогольной жировой болезни печени; ЛПВП - липопротеины высокой плотности; ЛПНП - липопротеины низкой плотности; HA - гиалуроновая кислота; HbA1c - гликозилированный гемоглобин; HOMA-IR - оценка инсулинорезистентности по модели гомеостаза; Adipo-IR - инсулинорезистентность жировой ткани; FFA - свободная жирная кислота; hsCRP - С-реактивный белок высокой плотности; ТГ - триглицериды; FBG - глюкоза крови натощак; HTN - гипертония. Данные выражены как среднее значение ± среднеквадратическая погрешность или n (%). Среднее значение ± среднеквадратическая погрешность или n (%) с различными надстрочными буквами указывают на существенные различия по непараметрическому критерию Краскела-Уоллиса или критерию хи-квадрат. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001

[Таблица 2]
Исходные характеристики субъектов исследования, разделенные по статусу ожирения и степени тяжести фиброза. Без ожирения (n=64) С ожирением (n=138) Стадия фиброза 0 1 ≥ 2 P-значение 0 1 ≥ 2 P-значение N (Мужчин/женщин) 27 (11/16) 20 (9/11) 17 (7/10) 25 (17/8) 73 (38/35) 40 (10/30) Возраст (лет) 57,67 ± 9,01 57,85 ± 11,80 62,47 ± 8,32 0,2371 ^ns 57,08 ± 12,41^ab 48,36 ± 15,70^a 60,63 ± 13,56^b 0,0001 ^*** ИМТ (кг/м²) 22,81 ± 1,42^a 23,76 ± 1,46^b 23,71 ± 0,92^ab 0,0084 ^** 27,48 ± 2,58^a 29,30 ± 3,20^b 28,27 ± 2,97^ab 0,0119 ^* ОТ (см) 79,95 ± 5,2^a 83,22 ± 3,53^ab 86,33 ± 4,22^b 0,0010 ^** 91,82 ± 6,56 96,16 ± 7,35 95,73 ± 8,98 0,0074 ^ns АСТ (МЕ/л) 29,11 ± 21,64^a 32,20 ± 10,63^ab 56,06 ± 48,13^b 0,0017 ^** 28,40 ± 13,03^a 48,99 ± 26,74^b 66,13 ± 36,43^c < 0,0001 ^*** АЛТ (МЕ/л) 31,89 ± 27,83 39,10 ± 30,99 55,71 ± 52,04 0,0886 ^ns 38,88 ± 43,67^a 70,85 ± 53,02^bc 70,85 ± 56,63^c 0,0003 ^*** ГГТ (МЕ/л) 33,6 ± 41,4^a 44 ± 46,2^ab 69,7 ± 58,3^b 0,0046 ^** 39,6 ± 41^a 57,5 ± 56,1^ab 85,9 ± 95,2^b 0,0016 ^** Холестерин ЛПВП (мг/дл) 51,4 ± 13,4 47,9 ± 11,1 43,1 ± 12,3 0,1701 ^ns 48,4 ± 13,1 47,2 ± 12 46,3 ± 11,5 0,9175 ^ns Холестерин ЛПНП (мг/дл) 104 ± 29,9 108 ± 38,6 90,8 ± 32,3 0,3250 ^ns 105 ± 35,7 109 ± 31,7 102 ± 33,8 0,5024 ^ns Альбумин (г/дл) 4,14 ± 0,25 4,22 ± 0,29 3,99 ± 0,43 0,1781 ^ns 4,12 ± 0,24^ab 4,24 ± 0,26^a 4,08 ± 0,27^b 0,0027 ^** Тромбоциты (×10³/мкл) 230,19 ± 48,76^a 247,75 ± 74,84^a 183,88 ± 95,35^b 0,0255 ^* 238,2 ± 55,38^a 241,44 ± 62,49^a 188,33 ± 58,05^b 0,0001 ^*** Ферритин (нг/мл) 117,75 ± 73,97 100,94 ± 74,93 282,19 ± 386,91 0,053 ^ns 145,55 ± 89,51 219,37 ± 255,97 169,26 ± 133,32 0,8403 ^ns Гиалуроновая кислота HA (нг/мл) 33,08 ± 19,62^a 64,2 ± 67,47^a 109,59 ± 65,56^b 0,0002 ^*** 51,32 ± 66,4^a 61,58 ± 90,48^a 127,28 ± 129,4^b 0,0001 ^*** Инсулин (мкМЕ/мл) 10,76 ± 5,57 10,05 ± 4,15 13,71 ± 6,19 0,1103 ^ns 14,22 ± 11,57^a 17,83 ± 15,46^ab 19,50 ± 12,58^b 0,0148 ^* HbA1c (%) 5,86 ± 0,69^a 5,98 ± 0,44^ab 7,23 ± 2,05^c 0,0007 ^*** 5,87 ± 0,54^a 6,15 ± 0,85^ab 6,87 ± 1,42^c 0,0007 ^*** C-пептид (нг/мл) 2,23 ± 0,87^a 2,23 ± 0,64^ab 2,85 ± 1,17^bc 0,0256 ^* 3,22 ± 1,57^a 4,43 ± 3,43^ab 4,29 ± 2,28^bc 0,0498 ^* HOMA-IR 2,94 ± 1,61^a 2,81 ± 1,33^ab 4,50 ± 2,28^b 0,0207 ^* 3,84 ± 3,35^a 4,82 ± 4,18^ac 6,69 ± 4,70^b 0,0006 ^*** Adipo-IR 5,72 ± 3,01 6,33 ± 3,72 9,49 ± 5,95 0,0645 ^ns 7,48 ± 6,2^a 10,76 ± 9,7^ab 13,86 ± 10,55^bc 0,0043 ^** Свободные жирные кислоты FFA (мкг-экв/л) 553,96 ± 186,66 615,65 ± 238,13 684,88 ± 308,55 0,2678 ^ns 556,08 ± 209,52^a 642,76 ± 257,61^ab 737,1 ± 259,42^bc 0,0059 ^** hsCRP (мг/дл) 0,17 ± 0,33^a 0,23 ± 0,41^ab 0,29 ± 0,48^bc 0,0186 ^* 0,14 ± 0,17^a 0,23 ± 0,39^b 0,3 ± 0,39^bc 0,0121 ^* Холестерин (мг/дл) 177,7 ± 28 180,75 ± 43,68 158,53 ± 44,94 0,1860 ^ns 180,96 ± 38,04 188,58 ± 34,01 175,33 ± 44,67 0,2143 ^ns ТГ (мг/дл) 120,70 ± 45,23 128,42 ± 51,84 137,12 ± 77,04 0,9889 ^ns 127,36 ± 51,42 156,23 ± 80,68 155,43 ± 67,19 0,2363 ^ns FPG (мг/дл) 111,15 ± 31,51^a 111,85 ± 19,58^ab 134,47 ± 43,79^b 0,0402 ^* 110,96 ± 34,36^a 107,82 ± 21,43^a 144,53 ± 63,53^b 0,0001 ^*** HTN, n (%) 7 (25,9) 9 (45,0) 9 (52,9) 0,163 ^ns 9 (36,0) 30 (41,1) 21 (52,5) 0,357 ^ns Диабет, n (%) 4 (14,8) 5 (25,0) 13 (76,5) 0,0001 ^*** 3 (12,0) 23 (31,5) 24 (60,0) 0,0002 ^***

В результате подтверждения, субъекты с НАСГ или значительным фиброзом (F2-4) имели высокие уровни аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланин-аминотрансферазы (АЛТ) и диабетических маркеров во всех группах с ожирением и без ожирения. Субъекты со значительным фиброзом имели более высокие баллы активности НАЖБП и более тяжелую гистологию печени по гистологической классификации НАЖБП (таблица 3 и ФИГ. 7). Более подробные стандартные характеристики каждой стадии фиброза, включающие известные генетические вариации, связанные с НАЖБП, такие как PNPLA3, TM6SF2, MBOAT7-TMC4 и SREBF-2, раскрыты в таблице 4.

[Таблица 3]
Гистологические характеристики субъектов исследования, разделенные по статусу ожирения и степени тяжести фиброза. Без ожирения (n=64) С ожирением (n=138) Стадия фиброза 0 1 2 0 1 2 Стеатоз, n (%) 0 (<5%) 15 (55,6) 5 (25,0) 1 (5,9) 7 (28,0) 2 (2,7) 1 (2,5) 1 (5-33%) 7 (25,9) 6 (30,0) 8 (47,1) 12 (48,0) 9 (12,3) 13 (32,5) 2 (34-66%) 4 (14,8) 7 (35,0) 2 (11,8) 3 (12,0) 29 (39,7) 12 (30,0) 3 (>66%) 1 (3,7) 2 (10,0) 6 (35,3) 3 (12,0) 33 (45,2) 14 (35,0) Лобулярное воспаление, n (%) 0 15 (55,6) 3 (15,0) 1 (5,9) 13 (52,0) 5 (6,9) 3 (7,5) 1 12 (44,4) 14 (70,0) 11 (64,7) 12 (48,0) 60 (82,2) 30 (75,0) 2-3 0 3 (15,0) 5 (29,4) 0 8 (11,0) 7 (17,5) Баллонирование, n (%) 0 22 (81,5) 7 (35,0) 0 22 (88,0) 18 (24,7) 5 (12,5) 1-2 5 (18,5) 13 (65,0) 17 (100,0) 3 (12,0) 55 (75,3) 35 (87,5) Гистологическая классификация, n (%) Без НАЖБП 15 (55,6) 5 (25,0) 1 (5,9) 7 (28,0) 2 (2,7) 0 НАЖП 11 (40,7) 13 (65,0) 0 18 (72,0) 40 (54,8) 7 (17,5) НАСГ 1 (3,7) 2 (10,0) 16 (94,1) 0 31 (42,5) 33 (82,5) Балл активности неалкогольной жировой болезни печени NAS 1,30 ± 1,46 2,95 ± 1,61 4,00 ± 1,32 1,68 ± 1,22 4,11 ± 1,23 4,08 ± 1,10

Сокращения: НАЖБП - неалкогольная жировая болезнь печени; НАЖП - неалкогольный жировая печень; НАСГ - неалкогольный стеатогепатит; NAS - балл активности NAFLD. Данные выражены как среднее значение ± среднеквадратическая погрешность или n (%).

[Таблица 4]
Исходные клинические, метаболические, гистологические и генетические характеристики субъектов исследования, разделенные по степени ожирения и стадии фиброза. Без ожирения (n=64) С ожирением (n=138) Стадия фиброза 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 N (Мужчин/женщин) 27 (11/16) 20 (9/11) 9 (5/4) 4 (1/3) 4 (1/3) 25 (17/8) 73 (38/35) 20 (5/15) 7 (2/5) 13 (3/10) Возраст (лет) 57,7 ± 9,01 57,8 ± 11,8 58,6 ± 9,9 67,2 ± 2,5 66,5 ± 1,73 57,1 ± 12,4 48,4 ± 15,7 55,6 ± 16,4 65,6 ± 8,89 65,8 ± 6,92 ИМТ 22,8 ± 1,42 23,8 ± 1,46 23,5 ± 0,862 23,9 ± 1,33 24 ± 0,66 27,5 ± 2,58 29,3 ± 3,2 28,5 ± 3,26 28 ± 3,43 28 ± 2,39 ОТ (см) 79,9 ± 5,2 83,2 ± 3,53 85,5 ± 2,27 88,1 ± 4,3 86,1 ± 8,37 91,8 ± 6,55 96,2 ± 7,35 95,8 ± 9,02 95,8 ± 13,2 95,6 ± 7,76 Систолическое кровяное давление SBP (мм рт.ст.) 128 ± 16,9 127 ± 14,3 132 ± 17,1 158 ± 37,4 124 ± 21,7 130 ± 14,8 136 ± 18,4 133 ± 17 132 ± 11,3 126 ± 17,9 Диастолическое кровяное давление DBP (мм рт.ст.) 76,8 ± 12,8 77,4 ± 8,26 80,2 ± 12,9 86,8 ± 19,1 74,5 ± 10,8 80 ± 9,78 84,1 ± 11,8 77,4 ± 13,4 77 ± 10,8 74,3 ± 9,55 АСТ (МЕ/л) 29,1 ± 21,6 32,2 ± 10,6 55,1 ± 55,8 80,5 ± 50,1 33,8 ± 8,34 28,4 ± 13 49 ± 26,7 66,6 ± 46,5 70,4 ± 27,9 63 ± 21,7 АЛТ (МЕ/л) 31,9 ± 27,8 39,1 ± 31 52,6 ± 53,2 93,5 ± 60,5 25 ± 7,53 38,9 ± 43,7 70,8 ± 53 87,2 ± 74,3 58 ± 19,3 52,6 ± 24,6 ГГТ (МЕ/л) 33,6 ± 41,4 44 ± 46,2 69,7 ± 64 373 ± 592 63 ± 43,8 39,6 ± 41 57,5 ± 56,1 79,4 ± 86,1 86,6 ± 68,5 95,6 ± 123 Инсулин (мкМЕ/мл) 10,8 ± 5,57 10 ± 4,15 15 ± 6,14 15,3 ± 7,18 9,32 ± 4,29 14,2 ± 11,6 17,8 ± 15,5 21,3 ± 16,1 13,5 ± 4,73 20 ± 8,1 HbA1c (%) 5,86 ± 0,688 5,98 ± 0,445 6,8 ± 0,689 6,05 ± 0,557 9,38 ± 3,52 5,87 ± 0,538 6,15 ± 0,851 7,01 ± 1,45 6,79 ± 1,15 6,74 ± 1,59 HOMA-IR 2,94 ± 1,61 2,81 ± 1,33 4,57 ± 2,05 4,56 ± 2,04 4,27 ± 3,5 3,84 ± 3,36 4,82 ± 4,18 7,28 ± 5,79 4,4 ± 1,42 7,01 ± 3,71 Adipo-IR 5,72 ± 3,01 6,33 ± 3,72 11,1 ± 6,82 8,94 ± 5,18 6,44 ± 4,2 7,48 ± 6,2 10,8 ± 9,7 14,3 ± 12,9 9,29 ± 7,57 15,1 ± 7,42 Диабет, n (%) 4 (14,8) 5 (25,0) 7 (77.8) 2 (50,0) 4 (100) 3 (12,0) 23 (31,5) 12 (60,0) 4 (57,1) 8 (61,5) Альбумин (г/дл) 4,15 ± 0,259 4,22 ± 0,291 4,19 ± 0,285 3,92 ± 0,45 3,62 ± 0,499 4,12 ± 0,243 4,24 ± 0,26 4,11 ± 0,192 4,06 ± 0,207 4,04 ± 0,393 Тромбоциты (×10³/мкл) 230 ± 48,8 248 ± 74,8 222 ± 67,2 206 ± 123 76,8 ± 32,1 238 ± 55,4 241 ± 62,5 206 ± 50,6 195 ± 48,8 157 ± 63,7 ТГ (мг/дл) 121 ± 45,2 128 ± 51,8 180 ± 82,9 82,5 ± 26,6 96 ± 31,1 127 ± 51,4 156 ± 80,7 175 ± 71,5 140 ± 48,6 134 ± 64,5 FPG (мг/дл) 111 ± 31,5 112 ± 19,6 123 ± 26,7 123 ± 37 172 ± 66,6 111 ± 34,4 108 ± 21,4 148 ± 78,3 138 ± 30,6 143 ± 53,9 Гистологическая классификация Без НАЖБП 15 (55,6) 5 (25,0) 0 1 (25,0) 0 7 (28,0) 2 (2,7) 0 0 0 НАЖП 11 (40,7) 13 (65,0) 0 0 0 18 (72,0) 40 (54,8) 6 (30,0) 1 (14,3) 0 НАСГ 1 (3,7) 2 (10,0) 9 (100) 3 (75,0) 4 (100) 0 31 (42,5) 14 (70,0) 6 (85,7) 13 (100) Генетические варианты PNPLA3
(rs738409) G/G 6 (22,2) 4 (20,0) 1 (11,1) 0 2 (50,0) 4 (27,4) 20 (27,4) 11 (55,0) 2 (28,6) 6 (46,2) C/G 13 (38,1) 13 (65,0) 5 (55,6) 1 (25,0) 2 (50,0) 11 (44,0) 35 (47,9) 4 (20,0) 4 (57,1) 4 (30,8) C/C 7 (25,9) 3 (15,0) 2 (22,2) 3 (75,0) 0 7 (17,8) 13 (17,8) 4 (20,0) 1 (14,3) 1 (7,7) TM6SF2
(rs58542926) C/C 21 (77,8) 18 (90,0) 6 (66,7) 2 (50,0) 3 (75,0) 18 (72,0) 56 (76,7) 16 (80,0) 4 (57,1) 10 (76,9) C/T 5 (18,5) 2 (10,0) 2 (22,2) 2 (50,0) 1 (25,0) 4 (16,0) 11 (15,1) 3 (15,0) 2 (28,6) 1 (7,7) T/T 0 0 0 0 0 0 1 (1,4) 0 1 (14,3) 0 MBOAT7-TMC4
(rs641738) C/C 17 (63,0) 13 (65,0) 5 (55,6) 1 (25,0) 4 (100) 15 (60,0) 42 (57,5) 11 (55,0) 3 (42,9) 7 (53,8) C/T 9 (33,3) 5 (25,0) 3 (33,3) 3 (75,0) 0 4 (16,0) 21 (28,8) 8 (40,0) 4 (57,1) 4 (30,8) T/T 0 2 (10,0) 0 0 0 3 (12,0) 5 (6,8) 0 0 0 SREBF-2
(rs133291) C/C 7 (25,9) 6 (30,0) 1 (11,1) 2 (50,0) 2 (50,0) 6 (24,0) 23 (31,5) 8 (40,0) 1 (14,3) 3 (23,1) C/T 12 (44,4) 8 (40,0) 6 (66,7) 1 (25,0) 2 (50,0) 7 (28,0) 27 (37,0) 5 (25,0) 5 (71,4) 5 (38,5) T/T 3 (11,1) 6 (30,0) 1 (11,1) 1 (25,0) 0 3 (12,0) 8 (11,0) 4 (20,0) 1 (14,3) 2 (15,4)

Сокращения: ИМТ - индекс массы тела; ОТ - окружность талии; SBP - систолическое артериальное давление; DBP - диастолическое артериальное давление; АСТ - аспартатаминотрансаминаза; АЛТ - аланинаминотрансаминаза; ГГТ - гамма-глутамилтрансфераза; HbA1c - гликозилированный гемоглобин; HOMA-IR - оценка инсулинорезистентности по модели гомеостаза; Adipo-IR - инсулинорезистентность жировой ткани; ТГ - триглицериды; FBG - глюкоза крови натощак; НАЖБП - неалкогольная жировая болезнь печени; НАСГ - неалкогольный стеатогепатит; PNPLA3 - пататиноподобный фосфолипазный домен-содержащий белок 3; TM6SF2, трансмембранное 6 суперсемейство 2; MBOAT7-TMC4 - мембраносвязанный О-ацилтрансферазный домен-содержащий ген 7 и трансмембранный каналоподобный ген 4; SREBF-2 - транскрипционный фактор 2, связывающий стеролрегулирующие элементы. Данные выражены как среднее значение ± среднеквадратическая погрешность или n (%).

2) Наблюдение за изменениями микрофлоры в зависимости от степени тяжести фиброза

В зависимости от степени тяжести фиброза, изменения микрофлоры проявлялись по-разному у субъектов с НАЖБП без ожирения и субъектов с НАЖБП и ожирением.

В частности, микробиологическое разнообразие сравнивали в зависимости от гистологического спектра НАЖБП или степени тяжести фиброза (ФИГ. 1). Для сравнения альфа-разнообразия были построены кривые разрежения, основанные на метрике Шеннона, а для бета-разнообразия - графики NMDS, основанные на расстоянии Брея-Кертиса. В результате подтверждения, какие-либо значимые изменения между группами, стратифицированными по гистологическому спектру НАЖБП или степени тяжести фиброза, не были обнаружены у сведенных в группы субъектов (ФИГ. 1a - 1d).

Субъекты были разделены на две группы в соответствии со своим индексом массы тела. В группе без ожирения наблюдалось значительное снижение микробиологического разнообразия между F1 и F0 (p=0,0074), а также между F2-4 и F0 (p=0,0084) (ФИГ. 1e - 1h). Более того, наблюдалась отчетливая кластеризация между F0 и F2-4 (p=0,038). В группе с ожирением не наблюдалось значительных изменений в разнообразии между группами, стратифицированными по гистологической классификации НАЖБП или степени фиброза (ФИГ. 1i - 1l).

Результат показывает, что степень тяжести фиброза больше связана с изменением кишечной микрофлоры, чем с некровоспалительной активностью, а базовый статус ИМТ также может быть важным фактором, способствующим изменению кишечной микрофлоры.

3) Наблюдение за пролиферацией микробиологических таксонов, связанных с фиброзом

Пролиферация связанных с фиброзом микробиологических таксонов была отмечена у субъектов с НАЖБП без ожирения. В частности, у субъектов без ожирения и с ожирением различия между определенными микробиологическими таксонами в зависимости от степени фиброза сравнивали с применением одномерного и многомерного анализа (ФИГ. 2a - 2d и 2e - 2h).

В одномерном анализе в зависимости от степени тяжести фиброза у субъектов без ожирения наблюдалось постепенное распространение не только Veillonellaceae, в основном обнаруженных в ротовой полости, тонком и толстом кишечнике, но и Enterobacteriaceae. У субъектов с ожирением постепенно распространялся Rikenellaceae. Напротив, количество Ruminococcaceae значительно снижалось по мере нарастания фиброза, что наблюдалось только у субъектов без ожирения. Этот результат можно подтвердить на графиках корреляции (ФИГ. 8). Enterobacteriaceae и Veillonellaceae показали положительную корреляцию со степенью тяжести фиброза (p=1,09×10^-4, p=2,44×10^-3, соответственно), а Ruminococcaceae показали обратную корреляцию.

На уровне рода содержание Faecalibacterium (Ruminococcaceae), Ruminococcus (Ruminococcaceae), Coprococcus (Lachnospiraceae) и Lachnospira (Lachnospiraceae) было значительно снижено в группе со значительным фиброзом, а количество прочих Enterobacteriacea (Enterobacteriaceae) и Citrobacter постепенно увеличивалось в зависимости от степени тяжести фиброза. Это изменение наблюдалось только у субъектов без ожирения.

Для многомерного анализа возраст, пол и ИМТ были скорректированы с помощью MaAsLin. Многочисленное семейство Enterobacteriaceae существенно связано со степенью тяжести фиброза у субъектов без ожирения (p=0,0108, q=0,214) (ФИГ. 2e - 2h). В типе Firmicutes микроорганизмы Veillonellaceae показали резкое увеличение относительного количества у субъектов без ожирения по сравнению с субъектами с ожирением (без ожирения, p=0,0002, q=0,0195), а количество Ruminococcaceae показало обратную корреляцию со степенью фиброза у субъектов без ожирения (p=0,0019, q=0,0908). Представители рода Ruminococcaceae, Ruminococcus, также показали значительную обратную корреляцию в зависимости от степени фиброза (p=0,0009, q=0,135) (ФИГ. 10a - 10c). Кроме того, Veillonellaceae и Enterobacteriaceae показали значительную положительную корреляцию с уровнем свободных жирных кислот (FFA) в сыворотке крови у субъектов без ожирения (q=0,178, q=0,118, соответственно), но не у субъектов с ожирением (ФИГ. 9a-9e).

Adipo-IR и гликозилированный гемоглобин (HbA1c) также показали положительную корреляцию в зависимости от количества Veillonellaceae (adipo-IR, q=0,142; HbA1c, q=0,157). Напротив, уровень FFA в сыворотке крови показал обратную корреляцию с количеством Ruminococcus у всех субъектов (q=0,0838) и субъектов без ожирения (q=0,0838), но не у субъектов с ожирением (q=1,00).

Чтобы выяснить, связаны ли эти заметные изменения микрофлоры у субъектов без ожирения с влиянием генов-хозяев, была проанализирована связь между бактериями и генетическими мутациями PNPL3, TM6SF2, MBOAT7-TMC4 и SREBF-2 с помощью MaAsLin. Тем не менее, существенной связи четырех генетических мутаций с тремя бактериями не выявлено. Только актиномицеты обогатили минорный аллель TM6SF2 (C/T) (q=0,169) у субъектов без ожирения (ФИГ. 11).

Помимо трех переменных - возраста, пола и ИМТ, хорошо известно, что наличие сахарного диабета 2 типа влияет на общие изменения микрофлоры (Qin J, Li Y, Cai Z, Li S, Zhu J, Zhang F, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes. Nature 2012;490:55-60.). После дополнительной поправки на сахарный диабет было обнаружено, что Enterobacteriaceae (p=0,00197, q=0,0616) и Faecalibacterium (p=0,00242, q=0,0707) связаны с наличием сахарного диабета у всех субъектов (ФИГ. 12a - 12d). У субъектов без ожирения при сахарном диабете наблюдалось не только уменьшение количества Lachnospira (p=5,26×10^-4, q=0,0676), но и пролиферация Klebsiella (p=0,00339, q=0,141), относящихся к Enterobacteriaceae.

Для иллюстрации взаимодействия между микробиологическими компонентами и характеристиками сети микробиоты кишечника у субъектов с ожирением и без ожирения была измерена коэкспрессия таксонов, связанных со степенью тяжести фиброза, и показаны относительные количества (ФИГ. 2i - 2k).

В результате, у субъектов без ожирения, Veillonellaceae и Enterobacteriaceae имели обратную корреляцию с Ruminococcaceae (rho=-0,275 и -0,333, соответственно), а Prevotellaceae - обратную корреляцию с Bacteroidaceae (rho=-0,391). Тем не менее, значимое взаимодействие между Veillonellaceae/Enterobacteriaceae и Ruminococcaceae не наблюдалось у субъектов с ожирением и всех субъектов. В частности, корреляция Veillonellaceae и степени фиброза не была значительной у субъектов с ожирением и всех субъектов, что позволяет предположить его специфическую роль в прогрессировании фиброза у субъектов без ожирения.

В целом, пролиферация определенных таксонов в зависимости от степени тяжести фиброза была более выражена в группе без ожирения, чем в группе с ожирением.

4) Наблюдение за уровнем фекальных метаболитов в зависимости от степени тяжести фиброза у субъектов с НАЖБП без ожирения и с ожирением

У субъектов с НАЖБП без ожирения и с ожирением уровни фекальных метаболитов различались в зависимости от степени фиброза. В частности, были оценены фекальные метаболиты, в основном связанные с микробиотой кишечника.

Общий состав желчных кислот у субъектов без ожирения и с ожирением различался, и субъекты без ожирения имели повышенный уровень первичной желчной кислоты в соответствии с более тяжелой стадией фиброза (ФИГ. 3a).

Общий уровень желчных кислот в фекалиях был в три раза выше у субъектов без ожирения со значительным фиброзом (F2-4), чем у субъектов без фиброза (F0) (ФИГ. 3b - ФИГ. 3g). В частности, уровни холевой кислоты (CA), хенодезоксихолевой кислоты (CDCA) и урсодезоксихолевой кислоты (UDCA) были повышены в соответствии со степенью фиброза у субъектов без ожирения (ФИГ. 3b - ФИГ. 3g и ФИГ. 13a - 13e). Уровни литохолевой кислоты (LCA) и дезоксихолевой кислоты (DCA) были значительно повышены у субъектов с ожирением и значительным фиброзом, и только литохолевая кислота показала значительное улучшение по процентному содержанию.

Среди трех короткоцепочечных жирных кислот уровень пропионата в фекалиях постепенно увеличивался по мере развития фиброза у субъектов без ожирения (без ожирения; p=0,0032, с ожирением; p=0,7979), и показал значительную положительную корреляцию с количеством Veillonellaceae, известных как пропионат-продуцирующие бактерии (p=0,0155) (ФИГ. 3h - 3j).

В отличие от профиля желчных кислот, корреляция между значительным изменением фекальных короткоцепочечных жирных кислот и их бактериальными таксонами наблюдалась только у субъектов без ожирения (ФИГ. 4b). Ruminococcus (p=0,0189), Oscillospira (p=1,57×10^-4) и Desulfovibrio (p=9,76×10^-4), хорошо известные как бактерии, продуцирующие короткоцепочечные жирные кислоты, показали обратную корреляцию с уровнем пропионата в фекалиях. Изменение уровня бутирата в фекалиях в зависимости от степени тяжести фиброза не было обнаружено у всех субъектов без ожирения и с ожирением, а уменьшение количества Ruminococcaceae не повлияло на уровень бутирата в фекалиях (без ожирения, p=0,597; с ожирением, p=0,109).

5) Наблюдение за схемой сети бактериальных таксонов-метаболитов при НАЖБП без ожирения и с ожирением

Сеть бактериальных таксонов-метаболитов отличается уникальной схемой при НАЖБП без ожирения и с ожирением. В частности, при сравнении элементов микробиоты кишечника в зависимости от степени тяжести фиброза и статуса ожирения, выраженные изменения микрофлоры наблюдались только у субъектов без ожирения. Для выяснения основной причины заболевания был проведен анализ генетических вариантов, связанных с НАЖБП, и кишечных метаболитов.

На основании полученных результатов была проведена оценка коэкспрессии таксонов и метаболитов, и представлена сеть взаимодействия на ФИГ. 4. Значимое взаимодействие между желчными кислотами наблюдалось у всех субъектов без ожирения и с ожирением. Тем не менее, бактериальные таксоны и паттерн коэкспрессии метаболитов в зависимости от степени тяжести фиброза различались у субъектов без ожирения и с ожирением: Субъекты без ожирения показывали более значительный паттерн коэкспрессии, чем субъекты с ожирением.

Интересно, что первичная желчная кислота имела обратную корреляцию с Ruminococcaceae и Rikenellaceae, известными как показатели здорового кишечника, у всех субъектов без ожирения и с ожирением. Veillonellaceae проявляли положительную корреляцию как с пропионатом, так и с первичной желчной кислотой. Желчная кислота обычно способна регулировать рост чувствительных бактерий или размножать относительно устойчивые бактерии независимо от статуса ожирения. Тем не менее, корреляция кишечных бактериальных таксонов и фекальных метаболитов со степенью фиброза была более заметной у субъектов с НАЖБП без ожирения, чем у субъектов с ожирением.

6) Прогнозирование НАЖБП у субъектов без ожирения по сочетанию микробиоты и метаболитов

По сочетанию микробиоты и метаболитов был точно спрогнозирован значительный фиброз у субъектов с НАЖБП без ожирения. В частности, чтобы оценить полезность микробиоты кишечника и соответствующих фекальных метаболитов в качестве прогнозирующего фиброз биомаркера, сравнивали показатели AUROC для прогнозирования значительного фиброза (ФИГ. 5a и ФИГ. 5b).

Enterobacteriaceae, Veillonellaceae и Ruminococcaceae были выбраны как наиболее представительные и значимые бактериальные таксоны, связанные с фиброзом. Как показано на ФИГ. 5a, комбинированный бактериальный маркер для прогнозирования значительного фиброза дал результат AUROC 0,824 у субъектов без ожирения (0,661 для всех субъектов; 0,584 для субъектов с ожирением).

Кроме того, были отобраны Megamonas, принадлежащие к семейству Veillonellaceae, и Ruminococcus, принадлежащие к семейству Ruminococcaceae. Как показано на ФИГ. 5b, AUROC для прогнозирования значительного фиброза составил 0,718 (0,673 для всех субъектов; 0,648 для субъектов с ожирением).

В качестве связанных с фиброзом метаболитов выбраны четыре фекальных метаболита (холевая кислота, хенодезоксихолевая кислота, урсодезоксихолевая кислота и пропионат), и комбинация этих четырех метаболитов прогнозировала значительный фиброз с показателем AUROC 0,758 у субъектов без ожирения (0,505 для всех субъектов; 0,520 для субъектов с ожирением).

В случае добавления кишечных метаболитов к бактериальному маркеру на уровне семейства, как показано на ФИГ. 5a, точность прогноза существенно повысилась, так как улучшенный AUROC составил 0,977 (0,786 для всех субъектов; 0,609 для субъектов с ожирением). Кроме того, в случае добавления кишечных метаболитов к бактериальному маркеру на уровне рода, как показано на ФИГ. 5b, улучшенный AUROC составил 0,955 (0,590 для всех субъектов; 0,636 для субъектов с ожирением). Прогностическая пригодность нового биомаркера микробиоты-метаболитов оказалась значительно выше, чем у FIB-4, широко используемого в качестве неинвазивного биомаркера НАЖБП.

Результат показал, что точность диагностики комбинации выявленных таксонов кишечных бактерий и фекальных метаболитов для прогнозирования значительного фиброза у субъектов с НАЖБП была значительно выше у субъектов без ожирения, чем у субъектов с ожирением, и были подтверждены отчетливые различия специфических бактериальных таксонов и метаболитов толстой кишки между группами субъектов с НАЖБП с ожирением и без ожирения. Этот результат подчеркивает не только важность кишечной флоры как фактора риска, объясняющего патогенез НАЖБП без ожирения, но и важность применения в диагностике новой комбинации микрофлоры и метаболитов в качестве неинвазивного биомаркера значительного фиброза при НАЖБП без ожирения.

Настоящее изобретение относится к комплекту для прогнозирования или диагностики степени риска развития заболевания, способу предоставления информации для прогнозирования или диагностики степени риска развития заболевания, способу скрининга терапевтического средства для заболевания и фармацевтической композиции для предупреждения или терапевтического воздействия на заболевание, в частности неалкогольную жировую болезнь печени. В частности, посредством комплекта для прогнозирования или диагностики, согласно настоящему изобретению, можно эффективно прогнозировать или диагностировать степень риска развития неалкогольной жировой болезни печени, в частности, прогностическая значимость и значение предоставленной информации у субъектов без ожирения являются отличными. Поэтому его можно эффективно использовать для предотвращения или терапевтического воздействия на соответствующее заболевание, получая эффективную информацию о неалкогольной жировой болезни печени. Кроме того, фармацевтическая композиция для предотвращения или терапевтического воздействия, согласно настоящему изобретению, может быть эффективно использована для лечения неалкогольной жировой болезни печени. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 13 ил., 4 табл.

1. Комплект для прогнозирования или диагностики степени риска развития неалкогольной жировой болезни печени для пациента без ожирения, содержащий средства обнаружения, определяющие по меньшей мере одну группу маркеров обнаружения, выбранных из (а) - (с) ниже:

(a) Enterobacteriaceae, Veillonellaceae и Ruminococcaceae;

(b) Megamonas и Ruminococcus; и

(c) холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты и пропионата.

2. Комплект по п. 1, в котором неалкогольная жировая болезнь печени представляет собой неалкогольную жировую печень, неалкогольный стеатогепатит, фиброз печени или цирроз.

3. Комплект по п. 1, в котором прогнозирование степени риска представляет собой прогнозирование степени тяжести фиброза от F=0 до F=4.

4. Способ предоставления информации для прогнозирования или диагностики степени риска развития неалкогольной жировой болезни печени для пациента без ожирения, предусматривающий обнаружение по меньшей мере одной группы маркеров обнаружения, выбранных из (а) - (с) ниже:

(a) Enterobacteriaceae, Veillonellaceae и Ruminococcaceae;

(b) Megamonas и Ruminococcus; и

(c) холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты и пропионата.

5. Способ по п. 4, при этом способ содержит один или несколько этапов, выбранных из (а) - (с) ниже:

(a) сравнение количества Enterobacteriaceae, Veillonellaceae и Ruminococcaceae, измеренного у субъекта, с эталонным значением у здорового индивидуума;

(b) сравнение количества Megamonas и Ruminococcus, измеренного у субъекта, с эталонным значением у здорового индивидуума;

(c) сравнение содержания в фекалиях холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты и пропионата, измеренного у субъекта, с эталонным значением у здорового индивидуума.

6. Способ по п. 4, в котором неалкогольная жировая болезнь печени представляет собой неалкогольную жировую печень, неалкогольный стеатогепатит, фиброз печени или цирроз.