УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ АНАЛИЗЫ ДЛЯ ОДИНОЧНЫХ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА Российский патент 2022 года по МПК G01N33/53 G01N33/68 

Настоящее изобретение в целом относится к улучшенным фармакокинетическим анализам для измерения уровней одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (также называемых в настоящем документе «ISVs» или «ISVDs») и белков и полипептидов, которые включают, по меньшей мере, один ISV (как описано далее в настоящем документе) в биологических образцах.

В особенности, изобретение относится к усовершенствованным способам выполнения таких анализов.

Другие аспекты, воплощения, применения и преимущества изобретения станут понятны из приведенного ниже дальнейшего описания.

В разработке лекарственных средств, фармакокинетический (ПК) анализ лекарственного препарата проводят для определения судьбы данного препарата (например, распределения, поглощения и/или выделения) после введения животному или человеку. Как правило, такой анализ включает в себя определение наличия, уровня или концентрации лекарственного средства в биологическом образце, полученном от субъекта (таком как кровь, сыворотка или плазма), часто в нескольких точках во времени.

Для этой цели применяют фармакокинетические анализы, и способы и методики выполнения таких анализов, как правило, известны специалисту. В общем, обычные способы проведения фармакокинетических анализов включают стадии контактирования образца с захватывающим агентом, который может связывать соединение, подлежащее измерению (т.е. в условиях, при которых указанный захватывающий агент может захватывать измеряемое соединение), и затем определения количества соединения, подлежащего измерению, которое было захвачено захватывающим агентом (которое служит мерой количества соединения в образце). На практике, часто применяют конфигурацию «сэндвич», в которой захватывающий агент иммобилизован на поверхности (такой как поверхность многолуночного планшета или чипа), и количество соединения, захваченного захватывающим агентом, определяют путем добавления детектирующего агента, который может генерировать сигнал, который может быть обнаружен и/или измерен. В количественных ПК-анализах, сила данного сигнала представляет собой меру количества соединения, подлежащего измерению, которое было захвачено захватывающим агентом, что, в свою очередь, представляет собой меру количества соединения, подлежащего измерению в исходном образце.

Как уже упоминалось, подходящие методики выполнения данных анализов (таких как ELISA, платформа MSD от компании MesoScale Diagnostic LLC, платформа Gyrolab™ от компании Gyros АВ и платформа Singulex™ от компании Merck Millipore) хорошо известны в данной области техники. Часто захватывающий агент представляет собой антитело (поликлональное, но предпочтительно моноклональное), которое может связываться с соединением (и часто может специфически индуцироваться против соединения), подлежащим измерению (хотя настоящее изобретение также предусматривает применение других захватывающих агентов, таких как ISVDs, или целевых соединений, подлежащих измерению; смотри, например, фигуры 2, 4 и 5 и дальнейшее описание в настоящем документе). Детектирующий агент может представлять собой любой подходящий агент, который может быть применен для обеспечения детектируемого/измеримого сигнала. Например, детектирующий агент может представлять собой (предпочтительно моноклональное) антитело против соединения, подлежащего измерению, которое было сопряжено с детектируемой меткой или маркером. Некоторые не ограничивающие примеры, которые часто применяют на практике, включают флуоресцентные метки, метку или маркер, которые могут быть обнаружены с помощью электрохемилюминесцентных методик (такие метки как SULFO-TAG™ на основе рутения, применяемые как часть платформы MSD), или пероксидазы хрена или другого фермента, который может преобразовать субстрат в детектируемый/измеряемый продукт. Как хорошо известно, для иммуноферментных сэндвич-анализов (таких как сэндвич-ELISA), также можно применять, в качестве детектирующего агента, комбинацию детектирующего антитела, которое связывается с соединением, подлежащим измерению, и со связанным с ферментом вторичным антителом, которое может катализировать превращение субстрата в детектируемый продукт. Для общего описания этих методик и похожих методик, была сделана отсылка на стандартные справочники, а также, например, на работы О Kennedy et al., Biochemical Education 18(3), 1990, и Gan and Patel, Journal of Investigative Dermatology (2013), 133, el2. doi:10.1038/jid.2013.287 (онлайн публикация).

На фигурах 1-6 схематически изображены некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, конфигурации выполнения фармакокинетических анализов предусмотренного настоящей заявкой вида.

На фигуре 1 и на других фигурах изобретение проиллюстрировано с помощью бивалентной конструкции ISVD (т.е. включающей два ISVD, каждый из которых представлен овалом и которые в проиллюстрированных конструкциях связаны друг с другом через подходящий линкер, представленный сплошной линией) в качестве соединения, подлежащего измерению (обозначено как (1) на каждой из фигур 1-6). Следует отметить, что как описано далее в настоящем документе, выбор этой двухвалентной конструкции ISVD был сделан только для целей иллюстрации, и что изобретение может, в общем, быть применено к любому анализу определения количества в биологическом образце любого белка, полипептида или другого соединения или конструкции, которые включают, по меньшей мере, один ISVD (и в особенности таких, как описано в настоящем документе, которые включают, по меньшей мере, один ISVD с открытым С-концом, т.е. так что указанный С-конец - и, в более широком смысле, белок, полипептид, соединение или конструкция - находятся при выполнении анализа под угрозой связывания ранее существовавшими в образце антителами). Другие примеры таких белков, полипептидов, соединений или конструкций будут понятны специалисту на основании раскрытия, приведенного в настоящем документе, и как уже упоминалось в настоящем документе, например, включают одновалентные, двухвалентные, трехвалентные, моноспецифичные, биспецифичные, триспецифичные и/или бипаратопные ISVD полипептиды или конструкции (например, в примере 1 применяют ALX-0171, трехвалентную конструкцию наноантитела против RSV).

В анализе фигуры 1 моноклональное антитело (2), связанное с твердой подложкой (4) через ковалентную связь или с помощью другого подходящего линкера или методики иммобилизации (3), применяют для захвата соединения, подлежащего измерению (1). После удаления всех несвязанных соединений (1) (т.е. с помощью промывки), количество соединения (1), захваченного моноклональным антителом (2), определяют добавлением детектирующего агента, который в конфигурации, показанной на фигуре 1, представляет собой моноклональное антитело (5), конъюгированное с детектируемой меткой (6) через линкер (7) или с помощью другой подходящей методики конъюгации (такой как пара стрептавидин-биотин). Любой избыток детектирующего агента затем удаляют (т.е. снова с помощью промывки), после чего количество детектирующего агента, связанного с соединением (1), захваченным захватывающим агентом, определяют с помощью сигнала, обеспечиваемого детектируемой меткой (6).

Конфигурация анализа, показанная на фигуре 2, была по существу такой же, как конфигурация, показанная на фигуре 1, за исключением того, что вместо моноклонального антитела против соединения (1), мишень (8) соединения (1) была иммобилизована на твердой подложке (4) (т.е. с помощью линкера (3)).

В конфигурации анализа, показанной на фигуре 3, соединение, подлежащее измерению (1), снова захвачено моноклональным антителом (2), связанным с твердой подложкой (4), но в данном случае анализ осуществляют в присутствии (растворимой) мишени (8) конструкции наноантитела (1), подлежащей измерению, и детектирующего агента (включающего моноклональное антитело (5) и детектируемую метку (6), связанные линкером (7)), направленного на мишень (8), а не на соединение (1).

Конфигурация анализа, показанная на фигуре 4, была по существу такая же, как конфигурация, показанная на фигуре 3, за исключением того, что вместо моноклонального антитела в качестве захватывающего агента применяют «анти-ISVD ISVD» (9) (например, наноантитела, направленные против каркасных последовательностей VHHs).

Конфигурация анализа, показанная на фигуре 5, была по существу такая же, как конфигурация, показанная на фигуре 2, за исключением того, что в качестве детектирующего агента вместо моноклонального антитела (5), применяют комбинацию биотинилированного (11) анти-ISVD ISVD (10) и меченного пероксидазой хрена (HRP) стрептавидина (12).

Конфигурация анализа, показанная на фигуре 6, была по существу такая же, как конфигурация, показанная на фигуре 2, за исключением того, что в качестве детектирующего агента, применяют комбинацию детектирующего антитела (13) и меченого вторичного антитела (5)/(6)/(7).

Подходящие конфигурации анализа, отличные от тех, которые были подробно описаны на фигурах, будут понятны специалисту на основании раскрытия и примеров, приведенных в настоящем документе, и как уже упоминалось, анализы, показанные на фигурах 1-6, и аналогичные анализы могут быть выполнены с помощью, в общем, известных методик и технологий, которые будут понятны специалисту на основании раскрытия в настоящем документе.

В WO 12/175741 было описано, что в некоторых анализах может возникать интерференция белков (такая как, например, в иммуноанализах ADA), которые применяют для анализа биологических образцов (таких как образцы крови, включая цельную кровь, сыворотку и плазму, глазная жидкость, бронхоальвеолярная жидкость /BALF, спинномозговая жидкость или другие образцы биологических жидкостей), содержащих ISVD's, и что такая интерференция белков может привести к появлению неспецифического сигнала в некоторых из данных анализов и/или для некоторых из этих образцов. В WO 12/175741 также упоминается, что такая интерференция белков может иметь место не только в образцах, которые получены от субъектов, которые были обработаны ISVD и/или которым вводили ISVD (таких как пациенты или участники клинических испытаний), но также в образцах от субъектов, которые никогда не получали ISVD. Как далее упомянуто в WO 12/175741, это указывает на то, что такая интерференция, вероятно, обусловлена неспецифическим белок-белковым взаимодействием с ранее существовавшими белками, а не с любыми появляющимся ADA. В WO 12/175741 далее указывают, что эти мешающие факторы наиболее вероятно представляют собой (ранее существовавшие) IgG, которые могут связываться с С-концом вариабельного домена, если он открыт (смотри, например, также WO 13/024069, Holland et al., J. Clin. Immunol. 2013, 33(7):1192-203 и WO 2015/173325).

Поскольку фармакокинетические анализы, в общем, включают применение образцов сыворотки (т.е. от субъектов, которым вводили ISVD или лекарственное средство, включающее ISVD), то возможно, что такие «ранее существовавшие антитела» против экспонированного С-конца ISVD, если они присутствуют в таких образцах, могут интерферировать с указанным анализом. С учетом этого, изобретение ставит своей целью обеспечение улучшенных фармакокинетических анализов и способов их выполнения, в которых такая интерференция (и/или риск возникновения такой интерференции) снижен.

В общем, изобретение решает проблему возможной интерференции белка путем осуществления анализа в присутствии (достаточного количества) «гасителя », т.е. белка или полипептида, с которым любые ранее существовавшие антитела, которые присутствуют в образце, могут связываться. В результате, интерферирующие факторы не могут (или больше не способны) мешать ассоциации между захватывающим агентом, соединением, подлежащим измерению и детектирующим агентом (т.е. таким образом, что могут повлиять на анализ или исказить его).

В общем, как описано далее в настоящем документе, гасители, примененные в настоящем документе, представляют собой ISVD's или белки и полипептиды, которые включают ISVD с экспонированным С-концом, кроме того, данные ISVDs, белки или полипептиды такие, что они не могут быть захвачены захватывающим агентом и не могут быть связаны соединением, подлежащим измерению, или детектирующим агентом.

Таким образом, в первом аспекте, изобретение относится к способу определения количества и/или концентрации в образце, по меньшей мере, одного ISVD, или белка, полипептида или другого соединения или конструкции, которые включают, по меньшей мере, один ISVD (данный белок, полипептид или другое соединение или конструкция такие, как описано в настоящем документе), способу, включающему следующий стадии;

a) контактирование образца с захватывающим агентом, таким образом, что ISVD, белок, полипептид, соединение или конструкция захватываются указанным захватывающим агентом;

b) контактирование ISVD, белка, полипептида, соединения или конструкции, захваченных захватывающим агентом, с детектирующим агентом, так что указанный детектирующий агент связывается с ISVD, белком, полипептидом, соединением или конструкцией, захваченных захватывающим агентом;

c) генерирование сигнала, соответствующего количеству детектирующего агента, связанного с ISVD, белком, полипептидом, соединением или конструкцией, которые были захвачены захватывающим агентом,

в котором указанный способ осуществляют в присутствии гасителя, указанный гаситель, представляющий собой белок или полипептид, с которым могут связываться (т.е. специфически связываются) ранее существовавшие антитела, но с которым захватывающий агент и детектирующий агент (в основном) не может связываться (т.е. кроме неспецифического связывания). Для этой цели, гаситель предпочтительно должен быть такой, как описано далее в настоящем документе.

Как будет понятно специалисту на основании раскрытия в настоящем документе, в общем, в описанном выше способе, образец будет представлять собой образец биологической жидкости, которая, как известно, содержит и/или предположительно содержит ранее существовавшие антитела, которые направлены против экспонированного С-конца в ISVD. В особенности, образец будет представлять собой образец биологической жидкости, которая, как известно, содержит и/или предположительно содержит ранее существовавшие антитела, которые направлены против экспонированного С-конца в ISVD (и в особенности против наноантитела или другого ISVD, которые представляют собой или получены из домена VH или VHH).

Образец будет дополнительно содержать (по меньшей мере, один) ISVD, белок, полипептид, соединение или конструкцию, подлежащие измерению. В особенности, указанные ISVD, белок, полипептид, соединение или конструкция, подлежащие измерению, могут представлять собой ISVD, белок, полипептид, соединение или конструкцию, которые вводили субъекту, от которого был получен образец, т.е. как часть клинического испытания или для терапевтических или диагностических целей. В одном из аспектов, образец получают для определения фармакологических свойств ISVD, белка, полипептида, соединения или конструкции, подлежащих измерению, и, в особенности, их фармакокинетических свойств (например, параметров их PK или периода полувыведения из сыворотки).

Образец может представлять собой любой желаемый и подходящий образец биологической жидкости, полученный от субъекта, такой как образец цельной крови, сыворотки, плазмы, лимфатической жидкости, глазной жидкости, бронхоальвеолярной жидкости /BALF, спинномозговой жидкости или другой биологической жидкости (такой как мокрота или назальные смывы); и, в особенности, образец цельной крови, сыворотки или плазмы. Указанный образец также может быть/был надлежащим образом подготовлен для применения в анализе изобретения (например, с помощью подходящих способы разбавление или экстракции, при необходимости, и/или с помощью одной или нескольких подходящих стадий предварительной обработки, известных per se в данной области техники, такой как подходящая стадия кислотной диссоциации). На практике, как правило, будет известно, что образец содержит, или ожидается, что образец будет содержать, определенное количество ISVD, белка, полипептида, соединения или конструкции, подлежащих измерению, например, поскольку - как уже упоминалось в настоящем документе - указанный образец был получен от субъекта, которому вводили указанный ISVD, белок, полипептид, соединение или конструкцию.

ISVD, белок, полипептид, соединение или конструкция, подлежащие измерению с помощью анализа изобретения, могут включать или в основном состоять из моновалентного ISVD или могут представлять собой белок, полипептид, соединение или конструкцию, которые включают или в основном состоят из одного или нескольких (например, одного, двух, трех, четырех или пяти) ISVDs. Это может, например, включать белки, полипептиды, соединения или конструкции, которые включают, по меньшей мере, один (например, один, два или три) ISVDs, и необязательно один или несколько других фрагментов или объектов, соответствующим образом связанных друг с другом, например, через прямую химическую связь или с помощью одного или нескольких подходящих линкеров. Отсылка сделана на дальнейшее описание и предшествующий уровень техники, упомянутые в настоящем документе.

В одном из аспектов в таких белках, полипептидах, соединениях или конструкциях, по меньшей мере, один из присутствующих ISVD будет направлен против терапевтически значимой мишени. В одном из специфических аспектов такие белки, полипептиды, соединения или конструкции будет иметь период полураспада в человеке (выраженный как t1/2-бета), равный, по меньшей мере, одному дню, например, по меньшей мере, трем дням, например, вплоть до 5 дней или более. Для этой цели, белок, полипептид, соединение или конструкция могут содержать фрагмент, связывающий домен или связывающую единицу, которые обеспечивают, по меньшей мере, один «терапевтический» ISVD с таким увеличенным периодом полураспада. Это, например, может представлять собой ISVD против (человеческого) сывороточного белка, например, против (человеческого) сывороточного альбумина. Отсылка сделана на дальнейшее раскрытие в настоящем документе.

В другом аспекте такие белки, полипептиды, соединения или конструкции будут включать, по меньшей мере, один ISVD против (человеческого) сывороточного белка, такого как (человеческий) сывороточный альбумин, для которого снова сделана отсылка на дальнейшее раскрытие в настоящем документе. В общем, в данном аспекте, белок, полипептид, соединение или конструкция, как правило, будут дополнительно содержать, по меньшей мере, один терапевтически активный фрагмент, связывающий домен или связывающую единицу, такие как один или несколько связывающих доменов или связывающих единиц (опять включая ISVDs, такие как наноантитела) против одной терапевтически соответствующей мишени или нескольких терапевтически соответствующих мишеней. В таких белках, полипептидах, соединениях или конструкциях, ISVD, связывающий сывороточный альбумин, в общем, будет применен для увеличения периода полураспада одного или нескольких терапевтических фрагментов или объектов. Снова, такие белки, полипептиды, соединения или конструкции будут иметь период полураспада в человеке (выраженный как t1/2-бета), равный, по меньшей мере, одному дню, например, по меньшей мере, трем дням, например, вплоть до 5-ти дней или более.

Белки и полипептиды, к которым отсылают в настоящем документе, предпочтительно представляют собой слитые белки. В одном из аспектов, белки и полипептиды включают или в основном состоят из ISVD, необязательно связанные через один или несколько подходящих линкеров.

В общем, в изобретении ISVD, белок, полипептид, соединение или конструкция, подлежащие измерению, будут такими, что они включают, по меньшей мере, один ISVD (такой как ISVD против терапевтической мишени и/или ISVD с продленным периодом полураспада, такой как ISVD против сывороточного белка), который восприимчив к связыванию, и/или находится под угрозой связывания, ранее существовавшими антителами, и, в особенности, ранее существовавшими антителами против экспонированного С-конца указанного ISVD. Часто, указанный ISVD будет располагаться на С-конце белка, полипептида, соединения или конструкции, подлежащих измерению.

В одном особом аспекте ISVD, белок, полипептид, соединение или конструкция, подлежащие измерению, будут такими, что они будут включать, по меньшей мере, один ISVD тяжелой цепи (т.е. ISVD, который представляет собой наноантитело или другой ISVD, который представляет собой домен или был получен из домена VHH или VH, как описано далее в настоящем документе), который восприимчив к связыванию, и/или находится под угрозой связывания, ранее существовавшими антителами, и, в особенности, ранее существовавшими антителами против экспонированного С-конца указанного ISVD. Часто, указанный ISVD тяжелой цепи будет располагаться на С-конце белка, полипептида, соединения или конструкции, подлежащих измерению.

Один или несколько ISVD, присутствующие в ISVD, белке, полипептиде, соединении или конструкции, подлежащих измерению, также могут иметь оптимизированную последовательность для снижения связывания ранее существовавшими антителами, например, при наличии С-концевого удлинения (как, например, описано в WO 12/175741) и/или при наличии мутаций в каркасной области, которые снижают связывание ранее существовавшими антителами (смотри WO 2015/173325).

Для ISVD, белков, полипептидов, соединений или конструкций, который могут быть измерены с помощью способов и анализов изобретения, была сделана дополнительная отсылка на раскрытие и предшествующий уровень техники, приведенный в настоящем документе.

Примененный гаситель может представлять собой любой ISVD, который имеет экспонированный С-конец, или любые белок, полипептид, соединение или конструкцию, которые включают, по меньшей мере, один ISVD с экспонированным С-концом (и, в особенности, с ISVD на своем С-конце). Например, в одном из специфических, но не ограничивающих аспектов, гаситель включает два (или даже может включать три) ISVD, связанных друг с другом с помощью подходящего линкера, известного per se.

Гаситель выбирают так, чтобы любые ранее существовавшие антитела в образце могли с ним (специфически) связываться, в особенности, с такой аффинностью, как описано в настоящем документе.

Чтобы убедиться, что ранее существовавшие антитела будут связываться с гасителем (т.е. а не с белком, полипептидом, соединением или конструкцией, подлежащими измерению), гаситель может быть выбран таким образом, что аффинность связывающего взаимодействия между гасителем и ранее существовавшими антитела стала больше (как описано в настоящем документе) по сравнению с аффинностью связывающего взаимодействие между белком, полипептидом, соединением или конструкцией, подлежащими измерению, и ранее существовавшими антителами (например, и без ограничений, если белок, полипептид, соединение или конструкция, подлежащие измерению, содержат С-концевое удлинение и/или мутации в каркасной области, которые снижают связывание ранее существовавшими антителами, то этого можно легко достичь, выбрав гаситель, который не содержит такого С-концевого удлинения и таких мутаций).

Таким образом, в одном не ограничивающем аспекте, гаситель, примененный в способах изобретения, выбирают таким образом, что аффинность связывающего взаимодействия между гасителем и ранее существовавшими антителами будет, по меньшей мере, в 10 раз (такая как, по меньшей мере, в 100 раз) больше (как описано в настоящем документе), чем аффинность связывающего взаимодействия между белком, полипептидом, соединением или конструкцией, подлежащими измерению, и ранее существовавшими антителами (в общем, в контексте настоящей заявки, с помощью иллюстрации, аффинность, равная 10 нМ, считается 10х «больше»», чем аффинность, равная 100 нМ).

Как описано далее в настоящем документе, в целях сравнения аффинностей, как описаны в предыдущих пунктах, аффинность связывающего взаимодействия между гасителем и антителом 21-4 (которое может быть применено в качестве модели/суррогата для ранее существовавших антител) можно сравнить с аффинностью связывающего взаимодействия между белком, полипептидом, соединением или конструкцией, подлежащими измерению, и антителом 21-4. Таким образом, в одном из специфических, но не ограничивающих аспектов, в способах изобретения, гаситель может быть выбран таким образом, что аффинность связывающего взаимодействия между гасителем и антителом 21-4 будет больше (как определено в настоящем документе, и в особенности, по меньшей мере, в 10 раз больше, такая как, по меньшей мере, в 100 раз больше), чем аффинность связывающего взаимодействия между белком, полипептидом, соединением или конструкцией, подлежащими измерению, и антителом 21-4.

Другой способ обеспечения того, что ранее существовавшие антитела будут связываться с гасителем (т.е. а не с белком, полипептидом, соединением или конструкцией, подлежащими измерению) заключается в применении подходящего избытка (такого как, по меньшей мере, 10-кратный избыток, например, по меньшей мере, 100-кратный избыток) по сравнению с количеством белка, полипептида, соединения или конструкции, подлежащих измерению, которое, как ожидается, будет (максимально) присутствовать в образце. В общем, такой подходящий избыток следует применять, когда (ожидается, что) аффинность связывающего взаимодействия между гасителем и ранее существовавшими антителами будет примерно такая же или еще меньше, чем аффинность связывающего взаимодействия между белком, полипептидом, соединением или конструкцией, подлежащими измерению, и ранее существовавшими антителами (в общем, в контексте настоящей заявки, с помощью иллюстрации, аффинность, равная 100 нМ считается 10х «меньше», чем аффинность, равная 10 нМ). Кроме того, подходящий избыток гасителя также может быть применен, когда (ожидается, что) аффинность связывающего взаимодействия между гасителем и ранее существовавшими антителами больше, чем аффинность связывающего взаимодействия между белком, полипептидом, соединением или конструкцией, подлежащими измерению, и ранее существовавшими антителами.

Предпочтительно, гаситель (и в особенности ISVD в гасителе, с которым ранее существовавшие антитела предположительно связываются) не имеет оптимизации последовательности для снижения связывания ранее существовавшими антителами. Например, он может заканчиваться последовательностью VTVSS без какого-либо С-концевого удлинения, и он, предпочтительно, также не содержит мутации, которые предположительно снижают связывание с ранее существовавшими антителами. Кроме того, и ISVD или белок, полипептид, соединение или конструкция, включающие ISVD с экспонированным С-концом, могут быть применены до тех пор, пока они не мешают анализу (например, потому что они могут связываться с любым, и/или могут быть связаны с помощью любого, из других компонентов, примененных в анализе).

На практике в отношении (возможного) связывания гасителя ранее существовавшими антителами и также в отношении выбора подходящего гасителя, с которым ранее существовавшие антитела могут связываться, отмечают, что, возможно, ранее существовавшие в образце антитела могут образовывать гетерогенную поликлональную популяцию, а также вполне возможно, что ранее существовавшие антитела (и их аффинности для ISVDs) также могут иногда отличаться от образца к образцу и/или от субъекта к субъекту.

Чтобы учесть это в изобретении, связывание (т.е. аффинность) клона мышиного моноклонального антитела «21-4-3» (также называемого в настоящем документе «21-4» или «АВН0015») может быть применено в качестве модели/инструмента, чтобы определить, будет ли или нет кандидат на роль гасителя связываться ранее существовавшими антителами. 21-4-3 (и производящая его гибридома, также называемая «АВН0015») известно из WO 12/175741 (смотри страницу 19, строки 3-28), где оно было описано и применено в качестве заменителя/модели для определения того, будет ли белок или полипептид, который содержит ISVD с экспонированным С-концом, иметь тенденцию претерпевать интерференцию белка (т.е. будет связан ранее существовавшими антителами, которые могут присутствовать в биологическом образце, который был получен от субъекта). WO 12/175741 также предоставляет последовательности VH и VL в АВН0015 (смотри WO 12/175741, SEQ ID NO: 35 и 36). Как уже упоминалось в примере 7 в WO 12/175741, 21-4 получают с помощью гибридомной технологии, начиная с мыши, иммунизированной конструкцией наноантитела по последовательности SEQ ID N0:98 из W0 2006/122825, и линии гибридомных клеток (называемых «АВН0015»), экспрессирующих 21-4, депонированной 4 июня 2012 в ВССМ, Гент, Бельгия, под номером доступа LMBP-9680-CB. Как показано в примере 8 в WO 12/175741, моноклональное антитело 21-4 распознает С-концевые конструкции наноантитела по последовательности SEQ ID N0:98 в WO 2006/122825, данный С-конец состоит из наноантитела (гуманизированный VHH), выработанного против фактора фон Виллебранда (vWF), и может быть применено для того, чтобы предсказать, имеет ли ISV тенденцию претерпевать неспецифическую белковую интерференцию. В примере 9 WO 12/175741 также приведен протокол, в котором АВН0015 применяют для предсказания/определения того, будет или не будет белок или полипептид (в особенности, белок или полипептид, включающий ISVD с экспонированным С-концом) иметь тенденцию претерпевать интерференцию белка (т.е. быть связан ранее существовавшими антителами, которые могут присутствовать в биологическом образце, полученном от субъекта).

В настоящем изобретении связывание с/с помощью 21-4 может быть применено в качестве заменителя для измерения/определения того, подходит ли белок или полипептид для применения в качества гасителя или нет (смотри также пример 5 в настоящем документе).

В общем, в изобретении белок или полипептид будут подходящим для применения в качества гасителя, если 21-4 связывает их с аффинностью (выраженной как KD), больше, чем 1 мкМ, такой как от 1000 до 1 нМ, при определении с помощью «BIAcore» в соответствии с протоколом, описанным в примере 5 (для большей ясности, и посредством неограничивающего примера, отмечено, что, в общем, в настоящем описании изобретения, аффинность, равная 1 нМ, считается «больше» 1 мкМ/1000 нМ аффинности).

Как уже упоминалось, если в способах изобретения предполагается применять гаситель, который имеет более высокую/лучшую аффинность для ранее существовавших антител, чем аффинность, с которой ISVD, белок, полипептид, соединение или конструкция, подлежащие измерению, связываются с ранее существовавшими антителами, то, предпочтительно, примененный гаситель будет связываться с 21-4 с аффинностью, которая с фактором 10х (в десять раз) больше, предпочтительно, которая с фактором 100х (в 100 раз) больше, чем аффинность, с которой ISVD, белок, полипептид, соединение или конструкция, подлежащие измерению, связываются с 21-4 (снова, в данном контексте, посредством иллюстрации, аффинность, равная 10 нМ, считается в 10 раз «выше», чем аффинность, равная 100 нМ).

Таким образом, в одном из аспектов, изобретение относится к способу, как описан выше в настоящем документе, в котором белок или полипептид, применяемые в качестве гасителя, представляют собой белок или полипептид, который связывается 21-4 с аффинностью больше, чем 1 мкМ, например, от 1000 до 1 нМ, при определении с помощью «BIAcore» в соответствии с протоколом, описанным в примере 5.

Гаситель также не должен существенным образом связываться (или не связываться с, кроме неспецифического связывания) захватывающим агентом или детектирующим агентом. На практике, это означает, что аффинность гасителя для захватывающего агента и для детектирующего агента (или наоборот, аффинность захватывающего агента для гасителя и аффинность детектирующего агента для гасителя) должна быть меньше, чем 3 мкМ, предпочтительно, меньше, чем 10 мкМ, более предпочтительно, меньше, чем 50 мкМ, такая как меньше, чем 100 мкМ (для большей ясности, и посредством неограничивающего примера, отмечено, что, в общем, в настоящем описании изобретения, 10 мкМ аффинность считается «меньше», чем 1 мкМ аффинность). После того, как (кандидат на роль захватывающего агента) захватывающий агент и (кандидат на роль детектирующего агента) детектирующий агент были выбраны, квалифицированный специалист в пределах своей компетенции способен определить аффинность, равную таковой для (кандидата на роль гасителя) гасителя и таким образом выбрать гаситель, который подходит для применения с предполагаемым захватывающим агентом и детектирующим агентом.

Таким образом, в дополнительном аспекте, изобретение относится к способу, как описан выше в настоящем документе, в котором белок или полипептид, применяемые в качестве гасителя, представляют собой белок или полипептид, которые: (i) связываются с 21-4 с аффинностью больше, чем 1 мкМ, например, от 1000 до 1 нМ, при определении с помощью «BIAcore» в соответствии с протоколом, описанным в примере 5; и (и) связываются с предполагаемым захватывающим агентом и предполагаемым детектирующим агентом с аффинностью меньше, чем 3 мкМ, предпочтительно, меньше, чем 10 мкМ, более предпочтительно, меньше, чем 50 мкМ, например, меньше, чем 100 мкМ.

В изобретении примененный гаситель может представлять собой моновалентный ISVD (такой как моновалентное наноантитело) или слитый белок или конструкцию, включающие два или более (например, два или три) ISVDs (из которых, по меньшей мере, один имеет экспонированный С-конец). На практике, гаситель, как правило, будет представлять собой полипептид, (слитый) белок или конструкцию, которые имеют ISVD на своем С-конце (данный ISVD будет тогда иметь экспонированный С-конец в силу формирования С-конца полипептида, белка или конструкции).

Поскольку гаситель должен быть в состоянии связываться ранее существовавшими антителами, VHH, который формирует С-конец гасителя, предпочтительно, не будет иметь какого-либо С-концевого удлинения (как описано в WO 12/175741), никаких мутаций, которые предположительно снижают связывание ранее существовавшими антителами (такими как описанные в WO 2015/173325).

Соответственно и предпочтительно гаситель представляют собой белок или полипептид, который имеет ISVD (и предпочтительно наноантитело) на своем С-конце, и (ISVD, который формирует С-конец) гасителя, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность VTVSS (SEQ ID NO: 1) на своем С-конце. Гаситель, например, соответственно, может представлять собой моновалентную, бивалентную, биспецифическую, трехвалентную или триспецифическую конструкцию ISVD-конструкции. Предпочтительно, гаситель представляет собой моновалентное наноантитело, бивалентную конструкцию наноантитела (которое может быть моноспецифическим или биспецифическим) или трехвалентную конструкцию наноантитела (которое может быть моноспецифическим, биспецифическим или триспецифическим).

Как показано на фигурах 2-6, в некоторых возможных для анализа изобретения конфигурациях, мишень для соединения, подлежащего измерению (указано как (8) на фигурах 2-6), может быть применена, либо как часть захватывающего агента или как часть детектирующего агента (или и то, и другое). Соответственно, хотя ISVD(ISVDs), присутствующие в гасителе, могут быть направлены против любой мишень(мишени), они не должны быть направлены против соединения-мишени, подлежащего измерению, если указанную мишень применяют в качестве части анализа.

Таким образом, в дополнительном аспекте, изобретение относится к способу, как описан выше в настоящем документе, в котором белок или полипептид, применяемые в качестве гасителя, представляют собой белок или полипептид, которые содержат, по меньшей мере, один ISVD, имеющий экспонированный С-конец, в котором С-конец указанного ISVD заканчивается С-концевой аминокислотной последовательностью VTVSS (SEQ ID NO: 1). Снова, указанный гаситель предпочтительно: (i) связывается с 21-4 с аффинностью больше, чем 1 мкМ, например, от 1000 до 1 нМ, при определении с помощью «BIAcore» в соответствии с протоколом, описанным в примере 5; и (ii) связывается с предполагаемым захватывающим агентом и предполагаемым детектирующим агентом с аффинностью меньше, чем 3 мкМ, предпочтительно, меньше, чем 10 мкМ, более предпочтительно, меньше, чем 50 мкМ, например, меньше, чем 100 мкМ.

В другом аспекте изобретение относится к способу, как описан выше в настоящем документе, в котором белок или полипептид, применяемые в качестве гасителя, представляют собой белок или полипептид, которые имеют ISVD на своем С-конце, в котором указанный С-концевой ISVD (и как следствие, белок или полипептид, применяемые в качестве гасителя) заканчивается С-концевой аминокислотной последовательностью VTVSS (SEQ ID NO: 1). Снова, указанный гаситель предпочтительно: (i) связывается с 21-4 с аффинностью больше, чем 1 мкМ, например, от 1000 до 1 нМ, при определении с помощью «BIAcore» в соответствии с протоколом, описанным в примере 5; и (ii) связывается с предполагаемым захватывающим агентом и предполагаемым детектирующим агентом с аффинностью меньше, чем 3 мкМ, предпочтительно, меньше, чем 10 мкМ, более предпочтительно, меньше, чем 50 мкМ, например, меньше, чем 100 мкМ.

Одним из удобных способов применения гасителя в способах изобретения заключается в разбавлении образцов для тестирования (которые, как уже упоминалось выше, могли уже быть подвергнуты одной или нескольким подходящим хорошо известным стадиям предварительной обработки, таким как стадия кислотной диссоциации) с подходящим буфером для разведения, содержащим гаситель (избыток гасителя) перед стадией захвата. В этом случае, ранее существовавшие в образце антитела будут связаны гасителем до стадий захвата и обнаружения, таким образом, гарантируя, что они не могут мешать измерению и/или считыванию анализа.

Другие аспекты, воплощения, преимущества и приложения изобретения станут ясны из дальнейшего описания в настоящем документе.

В настоящем описании:

- термин «одиночный вариабельный домен иммуноглобулина» (также называемый «ISV» или ISVD»), в общем, применяют для обозначения вариабельных доменов иммуноглобулина (которые могут представлять собой домены тяжелой цепи или легкой цепи, включая домены VH, VHH или VL), которые могут сформировать функциональный сайт связывания антигена без взаимодействия с другим вариабельным доменом (например, без взаимодействия VH/VL, которое требуется между доменами VH и VL обычного 4-х цепочечного моноклонального антитела). Примеры ISVDs будут понятны специалисту и, например, включают наноантитела (включая VHH, гуманизированный VHH и/или верблюдизированные VHs, такие как верблюдизированные человеческие VH's), IgNAR, домены, (о дно доменные) антитела (такие как dAb's™), которые представляют собой VH-домены или которые получают из VH-домена и (однодоменные) антитела (такие как dAb's™), которые представляют собой VL-домены или которые получают из VL-домена. Если в явном виде в настоящем документе не указано иное, ISVDs которые основаны на и/или получены из тяжелых цепей вариабельных доменов (таких как домены VH или VHH), в общем предпочтительны. Наиболее предпочтительно, если явно в настоящем документе не указано иное, чтобы ISVD представляли собой наноантитело.

- термин «наноантитело», в общем, такой, как определено в WO 2008/020079 или WO 2009/138519, и, таким образом, в специфическом аспекте, в общем, обозначает VHH, гуманизированный VHH или верблюдизированный VH (такой как верблюдизированный человеческий VH) или, в общем, VHH с оптимизированной последовательностью (такой, например, как оптимизированной для химической стабильности и/или растворимости, максимального перекрытия с известными человеческими каркасными областями и максимальной экспрессии). Следует отметить, что термины «наноантитело» или «наноантитела» представляют собой зарегистрированные товарные знаки компании Ablynx N.V. и, таким образом, также могут быть названы «наноантитело»^® и/или «наноантитела»^®);

- в общем, если в настоящем документе не указано иное, ISVD's, наноантитела, полипептиды, белки и другие соединения и конструкции, к которым отсылают в настоящем документе, предполагаются для применения в профилактике или лечении заболеваний или нарушений в человеке (и/или, необязательно, также у теплокровных животных и, в особенности, у млекопитающих). Таким образом, в общем, ISVD's, наноантитела, полипептиды, белки и другие соединения и конструкции, описанные в настоящем документе, предпочтительны, таким образом, что они могут быть применены как, и/или может соответствующим образом представлять собой часть, (биологического) лекарственное средства или другого фармацевтически или терапевтически активного соединения и/или фармацевтического изделия или композиции. Такие лекарственное средство, соединение или изделие предпочтительны, поскольку они подходят для введения человеку, например, для профилактики или лечения субъекта, нуждающегося в такой профилактике или лечении, или, например, как часть клинического испытания. Как описано далее в настоящем документе, для этой цели, такие лекарственные средство или соединение могут содержать другие фрагменты, объекты или связывающие единицы помимо ISVDs, обеспечиваемые изобретением (которые, поскольку также описаны в настоящем документе, могут, например, представлять собой один или несколько других дополнительных терапевтических фрагментов и/или один или несколько других фрагментов, которые влияют на фармакокинетические или фармакодинамические свойства основанных на ISVD или основанных на наноантителе биопрепаратах, таких как их период полураспада). Подходящие примеры таких дополнительных терапевтических или других фрагментов будут понятны специалисту, и, например, в общем, могут включать любой терапевтически активный белок, полипептид или другой связывающий домен или связывающую единицу, так же как, например, модификации, такие как описанные на страницах 149-152 в WO 2009/138159. Основанный на ISVD биопрепарат или основанный на наноантителе биопрепарат, предпочтительно, представляет собой терапевтический препарат или предполагается для применения в качестве терапевтического препарата (который включает в себя профилактику и диагностику) и для этой цели предпочтительно содержит, по меньшей мере, один ISVD против терапевтически релевантной мишени (такой как, например, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 или другие интерлейкины или их рецепторы и т.п.). Для некоторых специфических, но неограничивающих примеров таких основанных на ISVD или основанных на наноантителах биопрепаратах отсылают к примерам 8-18, а также, например, делают отсылки на различные заявки компании Ablynx N.V. (такие как, например, и без ограничений WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 и WO 2009/068627), так же как, например (и без ограничений), на такие заявки, как WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 и WO 2007/085814. Также, как описано далее в настоящем документе, дополнительный фрагмент может представлять собой ISVD или наноантитела, как описано в настоящем документе, направленные против (человеческого) сывороточного белка, такого как (человеческий) сывороточный альбумин, и такие ISVD или наноантитело также могут найти терапевтическое применение, в особенности, в и/или для продления периода полураспада одного или нескольких терапевтических ISVDs. Отсылку, например, делают на WO 2004/041865, WO 2006/122787 и WO 2012/175400, которые, в общем, описывают применение связывания сывороточного альбумина наноантителами для продления периода полураспада. Также, в настоящем описании, если в настоящем документе явно не указано иное, все термины, упомянутые в настоящем документе, имеют значение, данное в WO 2009/138519 (или в предшествующем уровне техники, приведенном в WO 2009/138519) или в WO 2008/020079 (или в предшествующем уровне техники, приведенном в WO 2008/020079). Также, если способ или методика не описаны конкретно в настоящем документе, они могут быть выполнены, как описано в WO 2009/138519 (или в предшествующем уровне техники, приведенном в WO 2009/138519) или в WO 2008/020079 (или в предшествующем уровне техники, приведенном в WO 2008/020079). Так же, как описано в настоящем документе, любые фармацевтическое изделие или композиция, включающие любой ISVD или соединение изобретения, также могут включать один или несколько дополнительных компонентов, хорошо известных для применения в фармацевтических изделиях или композициях (т.е. в зависимости от предполагаемой фармацевтической формы) и/или например, одно или несколько других соединений или активных начал, предполагаемых для терапевтического применения (т.е. для обеспечения комбинационного изделия).

Кроме того, если применены в настоящем описании или формуле изобретения, то следующие термины имеют такое же значение, как указано на, и/или где это применимо, могут быть определены способом, описанным на страницах 62-75 в WO 2009/138519: «агонист», «антагонист», «обратный агонист», «неполярный незаряженный аминокислотный остаток», «полярный незаряженный аминокислотный остаток», «полярный заряженный аминокислотный остаток», «идентичность последовательности», «точно такой же» и «различие в аминокислотах» (при отсылке к сравнению последовательности из двух аминокислотных последовательностей), «(в существенным образом изолированной форме) существенным образом изолированный», «домен», «связывающий домен», «антигенная детерминанта», «эпитоп», «против» или «направленный против» (антигена), «специфичность» и «период полураспада». Кроме того, термины «модулирование» и «модулировать», «сайт взаимодействия», «специфический для», «перекрестный блок», «перекрестно блокированный» и «перекрестное блокирование» и «существенным образом независящий от рН» как определены на (и/или могут быть определены, как описано на) страницах 74-79 в WO 2010/130832 компании Ablynx N.V. Также, при отсылке к конструкции, соединению, белку или полипептиду изобретения, такие термины как «моновалентный», «бивалентный» (или «поливалентный»), «биспецифический» (или «полиспецифический»), и «бипаратопный» (или «полипаратопный») могут иметь значение, данное в WO 2009/138519, WO 2010/130832 или WO 2008/020079.

Термин «периодом полураспада», как применен в настоящем документе по отношению к ISVD, наноантителу, основанному на ISVD биопрепарату, основанному на наноантителах биопрепарату или любой другой аминокислотной последовательности, соединению или полипептиду, к которым отсылают в настоящем документе, в общем, может быть определен, как описано в пункте о) на странице 57 в WO 2008/020079 и, как уже упоминалось в этом документе, относится ко времени, взятом для снижения сывороточной концентрации аминокислотной последовательности, соединения или полипептида на 50%, in vivo, например, из-за деградации последовательности или соединения и/или выведения или разрушения последовательности или соединение естественными механизмами. In vivo период полураспада аминокислотной последовательности, соединения или полипептида изобретения может быть определен любым хорошо известным способом, таким как путем фармакокинетического анализа. Подходящие методики будут понятны специалисту в данной области техники, и, например, в общем, могут быть такими, как описано в пункте о) на странице 57 в WO 2008/020079. Как также указано в пункте о) на странице 57 в WO 2008/020079, период полураспада может быть выражен с помощью таких параметров, как t1/2-альфа, t1/2-бета и площадь под кривой (AUC). В этом отношении следует отметить, что термин «период полураспада», как применен в настоящем документе, в особенности относится к t1/2-бета или конечному периоду полураспада (в котором 11/2-альфа и/или AUC или и то, и другое могут быть исключены из соображений). Отсылку, например, делают на приведенную ниже Экспериментальную часть, так же как на стандартные справочники, такие как Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Отсылку также делают на «Pharmacokinetics», М Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982). Аналогично, термины «увеличивается в периоде полураспада» или «увеличенный период полураспада» будут такими же, как определено в пункте о) на странице 57 в WO 2008/020079 и, в особенности, по отношению к увеличению t1/2-бета, или с увеличением или без увеличения t1/2-альфа и/или AUC или и того и другого.

Если термин не определен специфически в настоящем документе, то он имеет свое обычное в данной области техники значение, которое будет понятно специалисту. Отсылку, например, делают на стандартные справочники, такие как Sambrook et al, «Molecular Cloning: A Laboratory Manuals (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., «Current protocols in molecular biology», Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, «Genes II», John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., «Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering)), 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., «Immunology» (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); и Janeway et al., «Immunobiology>>(6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), так же как на общий уровень техники, приведенный в настоящем документе.

Кроме того, как уже было указано в настоящем документе, аминокислотные остатки наноантитела пронумерованы в соответствии с общей нумерацией для VHs, данной Kabat et al. («Sequence of proteins of immunological interest US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), применительно к доменам VHH из Camelids in the article of Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; или к которым отсылают в настоящем документе. Согласно этой нумерации, наноантитело FR1 включает аминокислотные остатки в положениях 1-30, наноантитело CDR1 включает аминокислотные остатки в положениях 31-35, наноантитело FR2 включает аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 наноантитело включает аминокислотные остатки в положениях 50-65, наноантитело FR3 включает аминокислотные остатки в положениях 66-94, наноантитело CDR3 включает аминокислотные остатки в положениях 95-102 и наноантитело FR4 включает аминокислотные остатки в положениях 103-113. [В этом отношении, следует отметить, что - как хорошо известно в данной области техники для доменов VH и для доменов VHH - общее количество аминокислотных остатков в каждом из CDR может варьировать и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, указанных в нумерации Кабата (то есть одна или несколько позиций согласно нумерации Кабата могут быть не заняты в фактической последовательности, или фактическая последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем число, разрешенное нумерацией Кабата). Это означает, что, в общем, нумерация в соответствии с Кабатом может соответствовать или может не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в фактической последовательности. В общем, однако, может быть указано, что в соответствии с нумерацией Кабата и независимо от количества аминокислотных остатков в CDR, положение 1 в соответствии с нумерацией Кабата соответствует началу FR1 и наоборот, положение 36 в соответствии с нумерацией Кабата соответствует началу FR2 и, наоборот, положение 66 в соответствии с нумерацией Кабата соответствует началу FR3 и, наоборот, и положение 103 в соответствии с нумерацией Кабата соответствует началу FR4 и наоборот.

Альтернативные способы нумерации аминокислотных остатков доменов VH, способы, которые также могут быть применены аналогичным образом к доменам VHH из Camelids и к наноантителу, представляют собой способ, описанный в работе Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), так называемое «АЬМ определение» и так называемое «контактное определение». Однако, если не указано иное, в настоящих описании, аспектах и фигурах, для доменов VHH будут применять нумерацию в соответствии с Кабатом, следуя Riechmann и Muyldermans.

Также следует отметить, что фигуры, любой список последовательностей и экспериментальная часть/примеры даны только для дополнительной иллюстрации изобретения и не должны быть интерпретированы или истолкованы как ограничивающие объем изобретения и/или прилагаемую формулу изобретения каким-либо образом, если в настоящем документе явно не указано иное.

Изобретение теперь будет дополнительно описано посредством следующих неограничивающих предпочтительных аспектов, примеров и фигур, где фигуры 1-6 схематично иллюстрирую разные конфигураций выполнения фармакокинетических анализов вида, который может быть применен в настоящем изобретении (в каждом случае, примененный гаситель в изобретение не показан).

Если не указано иное, все стадии, осуществленные в приведенной ниже Экспериментальной части, выполняли в соответствии с инструкциями производителя или в противном случае в стандартных условиях, в общем известных специалисту.

Пример 1. Применение гасителей в PK-анализе с помощью платформы Mesoscale Discovery™ (MSD)

Данный пример иллюстрирует применение гасителя в фармакокинетических анализах, применяемых для определения общей концентрации основанных на наноантителах (слитых) белках в образце человеческой сыворотки. В данном примере, платформу Mesoscale Discovery применяют для определения концентрации ALX-0171 (трехвалентная конструкция наноантитела против респираторно-синцитиального вируса человека; смотри WO 2010/139808) в образцах сыворотки человека, к которым были добавлены различные концентрации ALX-0171. Конфигурация анализа была существенным образом такая, как схематически представлено на фигуре 1 (несмотря на то, что ALX-0171 представляет собой трехвалентную конструкцию наноантитела вместо бивалентной конструкции наноантитела, показанной для иллюстративных целей на фигуре 1).

Примененный гаситель представлял собой трехвалентную конструкцию наноантитела (с N-концевой HIS-меткой и С-концом, который представлял собой последовательность по SEQ ID NO: 1 (т.е. без какого-либо C-концевого удлинения)), последовательность которого представлена на фигуре 7 в виде SEQ ID No: 2.

Биотинилированное мышиное моноклональное антитело, связывающееся с и нейтрализующее наноантитело ALX-0171, применяли в качестве захватывающего агента (в концентрации 5,0 микрограмм/мл в PBS/0,1% казеин), и его иммобилизовали на стрептавидин-золото многоэлементном 96-луночном планшете. Образцы сыворотки человека, подлежащие тестированию, разводили в 50 раз (исходно в 5 раз в PBS/0,1% казеин, затем в 5 раз в 1000 мМ уксусной кислоте. После инкубации в течение 60-ти минут при RT, разводили в 2 раза в 1 М Tris-буфере, рН 9,5 содержавшем 4,0 микрограмма гаситель /мл). После инкубации в течение ночи при RT, образцы наносили (в аликвотах по 50 микролитров) на 96-луночные планшеты, покрытые захватывающим агентом в стандартных условиях, которые позволяли захватывающему агенту захватить ALX-0171.

После инкубации в течение 1-го часа и отмывки, добавляли детектирующий агент (SULFO-меченое мышиное моноклональное антитело, связывающее и нейтрализующее наноантитело ALX-0171) и позволяли связываться с ALX-0171, захваченным иммобилизованным захватывающим агентом. После промывки, количество электролюминесцентного сигнала в каждой лунке планшета измеряли с помощью Sector Imager 2400 в течение 10-ти минут после добавления буфера для считывания MSD.

Было установлено, что ни присутствие каких-либо ранее существовавших антител в примененных образцах сыворотки человека, ни присутствие или применение гасителя в качестве части анализа не влияет каким-либо существенным образом на определение концентрации ALX-0171, если ALX-0171 была добавлена в образцы сыворотки человека в известных концентрациях от 987 пг/мл до 658537 пг/мл. Данные концентрации находятся в пределах общего диапазона концентраций, который, среди прочего, должен быть репрезентативным для концентраций основанных на наноантителах терапевтических средств, которые, как ожидается, встречаются в образцах сыворотки, полученных от субъектов во время клинических испытаний, включавших основанные на наноантителах терапевтические средства (например, для целей определения РК основанных на наноантителах терапевтических средствах), необязательно после подходящего разведения.

Пример 2. Применение гасителей в основанном на ELISA РК-анализе

Данный пример иллюстрирует применение гасителя в основанных на ELISA фармакокинетических анализах, применяемых для определения общей активной концентрации основанных на наноантителах (слитых) белках в образце человеческой сыворотки.

В данном примере, наноантитела представляют собой биспецифическую конструкцию, направленную против IL-6 рецептора и человеческого сывороточного альбумина (смотри WO 2008/020079 и WO 2009/095489). Как хорошо известно, рецептор IL-6 встречается как в мембраносвязанной форме, так и в растворимой форме. Анализ, описанный в данном примере, способен определить общую активную концентрацию, включая «свободные» наноантитела (т.е. не связанные с растворимым IL-6 рецептором, который присутствует в примененном образце плазмы) и наноантитела, которые связаны с растворимым рецептором IL-6, присутствующим в образце.

Конфигурация анализа была существенным образом такая, как схематично показано на фигуре 4.

Примененный гаситель представлял собой моновалентное наноантитело (с N-концевой HIS-меткой и С-концом, который представлял собой последовательность по SEQ ID NO: 1 без какого-либо С-концевого удлинения), последовательность которого представлена на фигуре 7 в виде SEQ ID No: 3.

Бивалентное наноантитело, узнающее каркасную область (каркасные области) наноантитела, применяли в качестве захватывающего агента (в концентрации 3,0 микрограмм/мл в буфере BICA) и наносили его на планшет С96 Maxisorp.Образцы сыворотки человека, подлежащие тестированию, разводили в 200 раз (исходно в 20 раз в PBS/0,1% казеин, затем в 5 раз в 1600 мМ уксусной кислоте. После инкубации в течение 90 минут при RT, затем разводили в 2 раза в 1М Tris-буфере, рН 9,5 содержавшем 0,5 микрограмм/мл рецептора человеческого IL-6 и 4,0 микрограмм/мл гасителя). После 60 мин инкубации при RT, образцы наносили (в аликвотах по 100 микролитров) на 96-луночные планшеты, покрытые захватывающим агентом в стандартных условиях, которые позволяли захватывающему агенту захватывать анти-IL-6R наноантитело.

После инкубации в течение 1-го часа и отмывки, добавляли раствор растворимого рецептора IL-6 (0,25 микрограмм/мл) и инкубировали в течение 30-ти мин при RT. После отмывки планшета, добавляли детектирующий агент (0,25 мкг/мл мышиного моноклонального антитела, распознающего другой эпитоп на IL-6R по сравнению с наноантителом, позволяя одновременное связывание антитела и наноантитела) и позволяли связываться с IL-6R, захваченным наноантителом, которое само по себе было связано с иммобилизованным захватывающим агентом. После промывки, добавляли 0,65 мкг/мл HRP-меченых кроличьих антител к Ig мыши и инкубировали в течение 30-ти мин при RT. После промывки добавляли ТМВ-субстрат и измеряли сигнал OD в каждой лунке при 450 нМ, применяя 620 нМ в качестве сравнения.

Было установлено, что ни присутствие любых ранее существовавших антител в примененных образцах сыворотки человека, ни присутствие или применение гасителя в качестве части анализа не влияло каким-либо существенным образом на определение концентрации анти-IL-6R наноантитела, при добавлении его в образцы сыворотки человека в известных концентрациях от 20,0 нг/мл до 1483,1 нг/мл. Данные концентрации находятся в пределах общего диапазона концентраций, который, среди прочего, должен быть репрезентативным для концентраций основанных на наноантителах терапевтических средств, которые, как ожидается, встречаются в образцах сыворотки, полученных от субъектов во время клинических испытаний, включавших основанные на наноантителах терапевтические средства (например, для целей определения РК основанных на наноантителах терапевтических средствах), необязательно после подходящего разведения.

Пример 3. Применение гасителей в PK-анализе с помощью платформы Mesoscale Discovery™ (MSD)

Данный пример иллюстрирует применение гасителя в фармакокинетических анализах, применяемых для определения общей активной концентрации основанных на наноантителах (слитых) белках в образце человеческой сыворотки. В данном примере, платформу Mesoscale Discovery применяли для определения концентрации ALX-0761 (трехвалентная конструкция наноантитела против интерлейкина 17 А и F) в образцах сыворотки человека, к которым были добавлены различные концентрации ALX-0761.

Конфигурация анализа была существенным образом такой же, как схематически показано на фигуре 3. Примененный гаситель представлял собой моновалентное наноантитело (которое имело С-конец, имеющий последовательность по последовательности SEQ ID NO: 1 без какого-либо С-концевого удлинения), последовательность которого представлена на фигуре 7 как SEQ ID No: 4.

Биотинилированное мышиное моноклональное антитело, распознающее каркасные области наноантитела, применяли в качестве захватывающего агента (в концентрации 1,0 микрограмм/мл в PBS/0,1% казеин), и его иммобилизовали на стрептавидин-золото многоэлементном 96-луночном планшете. Образцы сыворотки человека, подлежащие тестированию, разводили 100 раз (исходно в 50 раз, затем в 2 раза, оба раза в PBS/0,1% казеин, содержавшем 20,0 микрограмм/мл гасителя и 50,0 микрограмм/мл анти-IL-17 mAb, которые добавляли для предотвращения какой-либо интерференции свободного IL-17c анализом). После инкубации в течение ночи при RT, образцы наносили (в аликвотах по 50 микролитров) на 96-луночные планшеты, покрытые захватывающим агентом в стандартных условиях, которые позволяли захватывающему агенту захватывать ALX-0761.

После инкубации в течение 1-го часа и отмывки, добавляли раствор растворимого IL-17A (2,0 микрограмм/мл) и инкубировали в течение 1-го часа при RT. После промывки планшета, добавляли детектирующий агент (0,25 мкг/мл SULFO-меченое мышиное моноклональное антитело, связывающее мишень IL-17A) и позволяли связываться IL-17A, захваченному наноантителом, который сам по себе связывался с иммобилизованным захватывающим агентом. После промывки, количество электролюминесцентного сигнала в каждой лунке планшета измеряли с помощью Sector Imager 2400в течение 10-ти минут после добавления буфера для считывания MSD.

Было установлено, что ни присутствие каких-либо ранее существовавших антител в примененных образцах сыворотки человека, ни присутствие или применение гасителя в качестве части анализа не влияло каким-либо существенным образом на определение концентрации ALX-0761, если ALX-0761 добавляли в образцы сыворотки человека в известных концентрациях от 99,7 нг/мл до 3280,9 нг/мл. Данные концентрации находятся в пределах общего диапазона концентраций который, среди прочего, должен быть репрезентативным для концентраций основанных на наноантителах терапевтических средств, которые, как ожидается, встречаются в образцах сыворотки, полученных от субъектов во время клинических испытаний, включая основанные на наноантителах терапевтические средства (например, для целей определения РК основанных на наноантителах терапевтических средствах), необязательно после подходящего разведения.

Пример 4. Применение гасителей в основанном на ELISA PK-анализе

Данный пример иллюстрирует применение гасителя в основанном на ELISA фармакокинетическом анализе, применяемом для определения концентраций основанных на наноантителах (слитых) белков в образце плазмы мыши.

В данном примере наноантитела были направлены против Her3. Анализ, описанный в данном примере, способен определить концентрацию ALX-0751, которое присутствует в образце.

Конфигурация анализа была существенным образом такая, как схематически показано на фигуре 5.

Примененный гаситель представлял собой биспецифическую конструкцию наноантитела (которое имело С-конец, имеющий последовательность по последовательности SEQ ID NO: 1 без какого-либо С-концевого удлинения), последовательность которого представлена на фигуре 7 как SEQ ID No: 5.

В данном анализе ELISA, HER3-ECD (1,5 микрограмм/мл в буфере 10:10 Trizma NaCl) наносили на планшет С96 Maxisorp. Образцы плазмы мыши, подлежащие тестированию, разводили в 20 раз в смеси PBS/0,1% казеин, содержавшей 200 микрограмм гасителя на мл. После 2-х часов инкубации при 37°С, образцы наносили (в аликвотах по 50 микролитров) на 96-луночные планшеты, покрытые захватывающим агентом (мишень) в стандартных условиях, которые позволяли захватывающему агенту захватывать ALX-0751.

После инкубации в течение 1-го часа и отмывки, добавляли реагент обнаружения (1 микрограмм/мл биотинилированного наноантитела, узнающего каркасную область наноантитела ALX-0751) и инкубировали в течение 1-го часа при RT. После промывки добавляли HRP-меченный стрептавидин и инкубировали в течение 30-ти мин при RT. После промывки добавляли ТМВ-субстрат и сигнал OD в каждой лунке измеряли при 450 нМ, применяя 620 нМ в качестве сравнения.

Было установлено, что ни присутствие любых ранее существовавших антител в примененных образцах плазмы мыши, ни присутствие или применение гасителя в качестве части анализа не влияло каким-либо существенным образом на определение концентрации наноантитела ALX-0751, если его добавляли в образцы плазмы мыши в известных концентрациях от 24,9 нг/мл до 266,7 нг/мл. Данные концентрации находятся в пределах общего диапазона концентраций который, среди прочего, должен быть репрезентативным для концентраций основанных на наноантителах терапевтических средств, которые, как ожидается, встречаются в образцах плазмы, полученные от мышей в ходе доклинических исследований, включающих основанных на наноантителах терапевтические средства (например, для целей определения РК основанных на наноантителах терапевтических средствах), необязательно после подходящего разведения.

Пример 5. Протокол для определения аффинности для 21-4

Измерения связывания выполняли с помощью Biacore Т100 с помощью сенсорного чипа СМ5, с электродным буфером HBS-EP+, 25°С. 21-4 захватывали с помощью иммобилизованных кроличьих антител к IgG мыши, поскольку было установлено, что поверхность непосредственно иммобилизованных mAb 21-4 не может быть эффективно регенерирована. Примененные антитела к IgG мыши представляли собой поликлональные кроличьи антитела к IgG мыши, реагирующие со всеми подклассами IgG, IgA и IgM (GE Healthcare; Cat#BR-1008-38; Lot#10111487). Иммобилизацию антител к IgG мыши выполняли с помощью иммобилизации по аминогруппе вручную путем 7-минутной инъекции EDC/NHS для активации и 7-минутной инъекции 1М этаноламина-HCl, рН 8,5 для деактивации («Biacore>>, набор для иммобилизации по аминогруппе). Условия связывания перечислены в таблице I. На основании уровня иммобилизации и MW белков, теоретический Rmax для mAb21-4 связывания с иммобилизованными антителами к IgG мыши был равен ~13000RU (если одна молекула mAb21-4 связывается с одной молекулой антитела к IgG мыши).

Условия, примененные для эксперимента по связыванию (Biacore Т100) с помощью 21-4, иммобилизованными способом, приведены на фигуре 8. Поверхность антител к IgG мыши может быть успешно регенерирована после захвата mAb21-4 и инъекции всех образцов (с ограниченным увеличением базового уровня после каждого восстановления).

Вышеуказанный протокол применяли для генерирования данных по аффинности 21-4 для различных гасителей, как указано в приведенной ниже таблице II.

Изобретение относится к усовершенствованным фармакокинетическим анализам. Раскрыт способ определения количества и/или концентрации в образце по меньшей мере одного иммуноглобулинового одиночного вариабельного домена (ISVD), или белка или полипептида, включающего по меньшей мере один ISVD, который включает следующие стадии: a) контактирование образца с захватывающим агентом, таким образом, что ISVD, белок или полипептид захватывается указанным захватывающим агентом; b) контактирование ISVD, белка или полипептида, захваченного захватывающим агентом с детектирующим агентом, таким образом, что указанный детектирующий агент связывается с ISVD, белком или полипептидом, захваченным захватывающим агентом; c) генерирование сигнала, соответствующего количеству детектирующего агента, связанного с ISVD, белком или полипептидом, захваченным захватывающим агентом, который осуществляют в присутствии гасителя, где указанный гаситель, представляет собой белок или полипептид, который включает последовательность VTVSS (SEQ ID NO: 1) на своем С-конце; который связывается с моноклональным антителом 21-4, продуцируемым гибридомой ABH0015, депонированной в BCCM, Гент, Бельгия, с номером LMBP-9680-CB, с аффинностью, равной или превышающей 1 мкМ; который связывается с захватывающим агентом и с детектирующим агентом с аффинностью менее 3 мкМ. Изобретение решает проблему возможной интерференции белка путем осуществления анализа в присутствии гасителя, с которым любые ранее существовавшие антитела, присутствующие в образце, могут связываться. 8 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Способ определения количества и/или концентрации в образце по меньшей мере одного иммуноглобулинового одиночного вариабельного домена (ISVD), или белка или полипептида, включающего по меньшей мере один ISVD, который включает следующие стадии:

a) контактирование образца с захватывающим агентом, таким образом, что ISVD, белок или полипептид захватывается указанным захватывающим агентом;

b) контактирование ISVD, белка или полипептида, захваченного захватывающим агентом с детектирующим агентом, таким образом, что указанный детектирующий агент связывается с ISVD, белком или полипептидом, захваченным захватывающим агентом;

c) генерирование сигнала, соответствующего количеству детектирующего агента, связанного с ISVD, белком или полипептидом, захваченным захватывающим агентом,

который осуществляют в присутствии гасителя, где указанный гаситель представляет собой белок или полипептид

- который включает последовательность VTVSS (SEQ ID NO: 1) на своем С-конце;

- который связывается с моноклональным антителом 21-4, продуцируемым гибридомой ABH0015, депонированной в BCCM, Гент, Бельгия, с номером LMBP-9680-CB, с аффинностью, равной или превышающей 1 мкМ;

- который связывается с захватывающим агентом и с детектирующим агентом с аффинностью менее 3 мкМ.

2. Способ по.1, в котором гаситель представляет собой моновалентный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина или слитого белка или конструкции, включающей не более пяти, например, четыре, три, два или один одиночный вариабельный домен иммуноглобулина.

3. Способ по п.2, в котором по меньшей мере один из одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, присутствующий в гасителе, включает экспонированный C-конец.

4. Способ по п.3, в котором по меньшей мере один из одиночных вариабельных доменом иммуноглобулина, который включает экспонированный С-конец, включает последовательность VTVSS (SEQ ID NO:1) на своем C-конце.

5. Способ по любому из пп.2-4, в котором по меньшей мере гаситель включает одиночный вариабельный домен иммуноглобулина на своем C-конце.

6. Способ по п.1, в котором гаситель связывается с моноклональным антителом 21-4, продуцируемым гибридомой ABH0015, депонированной в BCCM, Гент, Бельгия, с номером LMBP-9680-CB, с аффинностью от 1000 до 1 нМ.

7. Способ по п.1, в котором гаситель связывается с захватывающим агентом и детектирующим агентом с аффинностью менее 10 мкМ.

8. Способ по п.1, в котором гаситель связывается с захватывающим агентом и детектирующим агентом с аффинностью менее 50 мкМ.

9. Способ по п.1, в котором гаситель связывается с захватывающим агентом и детектирующим агентом с аффинностью менее 100 мкМ.