ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ОДИНОЧНЫЕ ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ, НАЦЕЛИВАЮЩИЕСЯ НА IL-13 И TSLP Российский патент 2025 года по МПК C07K16/24 A61K39/395 A61P11/00 A61P17/00 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1 Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полипептидам, нацеливающимся на IL-13 и TSLP. Оно также относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим полипептид, и векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, а также к композициям, содержащим полипептид, нуклеиновую кислоту или вектор. Настоящее изобретение дополнительно относится к этим продуктам для применения в способе лечения субъекта, страдающего воспалительным заболеванием. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения этих продуктов.

2 Уровень техники

Хотя неограниченные иммунные реакции необходимы для защиты хозяина, они могут приводить к ряду воспалительных заболеваний, таких как астма, атопический дерматит и ревматоидный артрит. Каскад иммунных реакций, опосредованных врожденной и адаптивной ветвями иммунной системы (например, распознавание антигена, процессинг антигена, презентация антигена, продуцирование цитокинов, продуцирование антител, уничтожение клеток-мишеней), приводит к инициированию и распространению ряда иммунологических заболеваний. Воспалительные заболевания часто являются хроническими и даже могут быть опасными для жизни. Аллергические и атопические заболевания, такие как астма и атопический дерматит, запускаются преимущественно иммунными реакциями 2 типа и характеризуются отличительными признаками иммунитета 2 типа, такими как высокий уровень продуцирования IgE и эозинофилия.

Тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP) и интерлейкин-13 (IL-13) являются растворимыми цитокинами-мишенями, продуцируемыми стромальными и/или иммунными клетками (Ziegler & Artis, Nat Rev Immunol (2010) 11:289, Gieseck III et al., Nat Rev Immunol (2018) 18:62). TSLP и IL-13 человека управляют различными, перекрывающимися и синергическими аспектами иммунитета 2 типа, воспалительных заболеваний 2 типа, таких как астма и атопический дерматит, а также широкого спектра иммунологических заболеваний.

Передача сигнала, опосредованная TSLP, начинается с гетеродимерного рецепторного комплекса, состоящего из рецептора тимического стромального лимфопоэтина (TSLPR) и альфа-цепи IL-7R (IL-7Rα). Аналогичным образом, передача сигнала, опосредованная IL-13, начинается со связывания с гетеродимерным рецепторным комплексом, состоящим из альфа-субъединицы рецептора IL-4 (IL-4Rα) и альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-13 (IL-13R1α). Высокая аффинность IL-13 к IL-13R1 приводит к образованию их комплекса, что дополнительно увеличивает вероятность образования гетеродимера с IL-4Rα.

TSLP управляет созреванием дендритных клеток, развитием и пролиферацией тучных клеток, а также активацией других иммунных клеток, таких как базофилы и лимфоидные клетки врожденного иммунитета (ILC2). Аналогичным образом, IL-13 вызывает ряд иммунопатологий, таких как нарушение проницаемости эпителиального барьера, продуцирование слизи эпителиальными клетками поверхностей слизистых оболочек и ремоделирование дыхательных путей, а также индукцию хемокинов, привлекающих эозинофилы, таких как эотаксин. Эти механизмы занимают центральное место в инициировании и распространении воспалительной реакции 2 типа, а также занимают центральное место в развитии ряда иммунопатологий при таких заболеваниях, как атопический дерматит и астма.

В настоящее время пациенты с умеренной/тяжелой астмой в недостаточной степени отвечают на доступные в настоящее время стандартные средства лечения, включая биологические препараты, такие как моноклональное антитело к IL4Rα Dupixent (дупилумаб; представлено на рынке), антитело к IL5 (представлено на рынке), моноклональное антитело к IgE Xolair (омализумаб; представлено на рынке), в частности, у пациентов с астмой с фенотипом низкого уровня эозинофилов. Хотя антагонистические моноклональные антитела к TSLP (тезепелумаб) и IL-13 (лебрикизумаб) в настоящее время проходят клинические испытания, не существует активных программ клинических разработок с нацеливанием как на TSLP, так и на IL-13. Двойное нацеливание на TSLP и IL-13 с помощью одного средства потенциально может обеспечивать эффективность как при низкоинтенсивной астме 2 типа, так и при высокоинтенсивной астме 2 типа, а также при атопическом дерматите, и потенциально может обеспечивать эффективность в субпопуляциях с этими показаниями, где терапия одним моноспецифическим средством может не быть полностью эффективной. Соответственно, все еще существует неудовлетворенная медицинская потребность в лечении воспалительных заболеваний 2 типа, таких как астма и атопический дерматит, которое не только более эффективно, но также и удобно в применении для пациента.

Такая терапия может включать нацеливание на несколько факторов заболевания, таких как IL-13 и TSLP.

Нацеливание на несколько факторов заболевания может быть достигнуто, например, посредством совместного введения или комбинированного применения двух отдельных биологических препаратов, например, антител, связывающихся с различными терапевтическими мишенями. Однако совместное введение или комбинированное применение отдельных биологических препаратов может быть проблематичным как с практической, так и с коммерческой точки зрения. Например, две инъекции отдельных продуктов приводят к более неудобному и более болезненному режиму лечения для пациентов, что может отрицательно повлиять на приверженность режиму лечения. Что касается однократной инъекции двух отдельных продуктов, то может быть сложным или невозможным получение составов, которые обеспечивают приемлемую вязкость при требуемых концентрациях и подходящую стабильность обоих продуктов. Кроме того, совместное введение и совместное составление требуют получения двух отдельных лекарственных средств, что может приводить к увеличению общих затрат.

Биспецифические антитела, которые способны связываться с двумя разными антигенами, были предложены в качестве одной из стратегий устранения таких ограничений, связанных с совместным введением или комбинированным применением отдельных биологических препаратов, таких как антитела.

Конструкции биспецифических антител были предложены в нескольких форматах. Например, форматы биспецифических антител могут предусматривать химическую конъюгацию двух антител или их фрагментов (Brennan, M, et al., Science, 1985. 229(4708): p. 81-83; Glennie, M. J., et al., J Immunol, 1987. 139(7): p. 2367-2375).

Недостатки таких форматов биспецифических антител включают, однако, высокую вязкость при высокой концентрации, что делает, например, подкожное введение проблематичным, и то, что каждая связывающая единица требует взаимодействия двух вариабельных доменов для специфичного и высокоаффинного связывания, что предполагает влияние на стабильность и эффективность получения полипептидов. Такие форматы биспецифических антител также могут потенциально приводить к проблемам химического состава, производственного процесса и контроля качества (CMC), связанным с ошибочным спариванием легких цепей или с ошибочным спариванием тяжелых цепей.

3 Сущность изобретения

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду, специфично нацеливающемуся одновременно на IL-13 и TSLP, что приводит к повышенной эффективности модулирования воспалительной реакции 2 типа по сравнению с моноспецифическими полипептидами, направленными против IL-13 или против TSLP, in vitro. В некоторых вариантах осуществления полипептиды эффективно продуцируются (например, в микробных хозяевах). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления такие полипептиды характеризуются ограниченной реактивностью в отношении уже существующих антител у субъекта, подлежащего лечению (т. е. антител, присутствующих у субъекта до первого лечения с помощью конструкции на основе антитела). В других вариантах осуществления такие полипептиды у субъекта, подлежащего лечению, демонстрируют период полужизни, достаточно продолжительный для того, чтобы последовательно применяемые средства лечения можно было вводить с удобными интервалами.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен полипептид, содержащий по меньшей мере один одиночный вариабельный домен иммуноглобулина (ISVD), который специфично связывается с IL-13, или состоящий из него. В дополнительном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению содержит по меньшей мере два ISVD, которые специфично связываются с IL-13, или состоит из них, где два ISVD необязательно связаны посредством пептидного линкера. В одном варианте осуществления два ISVD, специфично связывающиеся с IL-13, представляют собой разные ISVD. Кроме того, в одном варианте осуществления полипептид дополнительно содержит одну или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, необязательно связанных посредством одного или нескольких пептидных линкеров, при этом указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида по сравнению с соответствующим полипептидом без указанных одной или нескольких других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц. Например, связывающая единица может представлять собой ISVD, который связывается с белком сыворотки крови (человека), таким как сывороточный альбумин человека.

В другом аспекте полипептид по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один ISVD, который специфично связывается с TSLP, или состоит из него. В дополнительном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению содержит по меньшей мере два ISVD, которые специфично связываются с TSLP, или состоит из них, где два ISVD необязательно связаны посредством пептидного линкера. В одном варианте осуществления два ISVD, специфично связывающиеся с TSLP, представляют собой разные ISVD. Кроме того, в одном варианте осуществления полипептид дополнительно содержит одну или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, необязательно связанных посредством одного или нескольких пептидных линкеров, при этом указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида по сравнению с соответствующим полипептидом без указанных одной или нескольких других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц. Например, связывающая единица может представлять собой ISVD, который связывается с белком сыворотки крови (человека), таким как сывороточный альбумин человека.

В другом варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению содержит по меньшей мере четыре ISVD или состоит из них, где по меньшей мере два ISVD специфично связываются с IL-13, и по меньшей мере два ISVD специфично связываются с TSLP. В одном варианте осуществления по меньшей мере два ISVD, специфично связывающиеся с IL-13, специфично связываются с IL-13 человека, и по меньшей мере два ISVD, специфично связывающиеся с TSLP, специфично связываются с TSLP человека. В одном варианте осуществления по меньшей мере два ISVD, специфично связывающиеся с IL-13, представляют собой разные ISVD, и по меньшей мере два ISVD, связывающиеся с TSLP, представляют собой разные ISVD. В другом варианте осуществления полипептид, содержащий по меньшей мере четыре ISVD или состоящий из них, дополнительно содержит одну или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, необязательно связанных посредством одного или нескольких пептидных линкеров, при этом указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида по сравнению с соответствующим полипептидом без указанных одной или нескольких других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц. Например, связывающая единица может представлять собой ISVD, который связывается с белком сыворотки крови (человека), таким как сывороточный альбумин человека.

Также предусмотрены молекула нуклеиновой кислоты, способная экспрессировать полипептид по настоящему изобретению, нуклеиновая кислота или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, и композиция, содержащая полипептид, нуклеиновую кислоту или вектор. В одном варианте осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

Также предусмотрены хозяин или клетка-хозяин, содержащие нуклеиновую кислоту или вектор, который кодирует полипептид в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, предусмотрен способ получения полипептида в соответствии с настоящим изобретением, при этом указанный способ включает по меньшей мере следующие стадии:

a. обеспечение экспрессии в подходящих клетке-хозяине или организме-хозяине или в другой подходящей системе экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид по настоящему изобретению; за которым необязательно следует:

b. выделение и/или очистка полипептида в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены полипептид, композиция, содержащая полипептид, или композиция, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, для применения в качестве лекарственного препарата. В одном варианте осуществления полипептид или композиция предназначены для применения при лечении воспалительного заболевания, такого как воспалительное заболевание 2 типа. В одном варианте осуществления воспалительное заболевание 2 типа выбрано из атопического дерматита и астмы.

Кроме того, предусмотрен способ лечения воспалительного заболевания, такого как воспалительное заболевание 2 типа, где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества полипептида или композиции в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления воспалительное заболевание 2 типа выбрано из атопического дерматита и астмы. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение одного или нескольких дополнительных терапевтических средств.

Кроме того, предусмотрено применение полипептида или композиции по настоящему изобретению при получении фармацевтической композиции для лечения воспалительного заболевания, такого как воспалительное заболевание 2 типа. В одном варианте осуществления воспалительное заболевание 2 типа выбрано из атопического дерматита и астмы.

В частности, в настоящем изобретении предусмотрены следующие варианты осуществления.

Вариант осуществления 1. Полипептид, композиция, содержащая полипептид, или композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, для применения в качестве лекарственного препарата, где полипептид содержит по меньшей мере один одиночный вариабельный домен иммуноглобулина (ISVD) или состоит из него, где указанный ISVD содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно), и где по меньшей мере один ISVD содержит:

a) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17,

b) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18,

c) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9;

CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14; и

CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19, или

d) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11;

CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16; и

CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21.

Вариант осуществления 2. Полипептид или композиция для применения в соответствии с вариантом осуществления 1, где по меньшей мере один ISVD содержит:

a) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17,

b) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18,

c) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, или

d) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

Вариант осуществления 3. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1 или 2, где аминокислотная последовательность по меньшей мере одного ISVD характеризуется:

a) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2,

b) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3,

c) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 или

d) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 4. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-3, где по меньшей мере один ISVD содержит:

a) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

b) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3,

c) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4 или

d) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 5. Полипептид или композиция для применения в соответствии с вариантом осуществления 1, где полипептид содержит по меньшей мере два ISVD или состоит из них, где каждый из указанных ISVD содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно), где по меньшей мере два ISVD необязательно связаны посредством одного или нескольких пептидных линкеров, и где:

a) первый и второй ISVD содержат:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17,

b) первый и второй ISVD содержат:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18,

c) первый ISVD содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17, и

второй ISVD содержит:

iv. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

v. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

vi. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18,

d) первый ISVD содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18, и

второй ISVD содержит:

iv. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

v. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

vi. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17,

e) первый ISVD содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21, и

второй ISVD содержит:

iv. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9;

v. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14; и

vi. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19, или

f) первый ISVD содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19, и/или

второй ISVD содержит:

iv. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11;

v. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16; и

vi. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21,

где порядок ISVD указывает на их относительное расположение друг с другом, рассматриваемое от N-конца до C-конца указанного полипептида.

Вариант осуществления 6. Полипептид или композиция для применения в соответствии с вариантом осуществления 5, где:

a) первый и второй ISVD содержат CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17,

b) первый и второй ISVD содержат CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18,

c) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18,

d) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17,

e) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, или

f) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

Вариант осуществления 7. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 5 или 6, где:

a) аминокислотные последовательности первого и второго ISVD характеризуются более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2,

b) аминокислотные последовательности первого и второго ISVD характеризуются более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3,

c) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3,

d) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2,

e) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4,

f) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 8. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 5-7, где:

a) первый и второй ISVD содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

b) первый и второй ISVD содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3,

c) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3,

d) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

e) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, или

f) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 9. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 5-8, где полипептид содержит:

a) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 148,

b) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 149,

c) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 150,

d) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 151,

e) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 152,

f) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 153,

g) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 154,

h) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 155,

i) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 156,

j) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 157,

k) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 158 или

l) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 159 или состоит из них.

Вариант осуществления 10. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1 или 5, где полипептид содержит по меньшей мере четыре ISVD или состоит из них, где каждый из указанных ISVD содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно), где по меньшей мере четыре ISVD необязательно связаны посредством одного или нескольких пептидных линкеров, и где:

a) первый ISVD содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17;

b) второй ISVD содержит:

iv. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

v. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

vi. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18;

c) третий ISVD содержит:

vii. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9;

viii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14; и

ix. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19; и

d) четвертый ISVD содержит:

x. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11;

xi. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16; и

xii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21,

где порядок ISVD указывает на их относительное расположение друг с другом, рассматриваемое от N-конца до C-конца указанного полипептида.

Вариант осуществления 11. Композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-10, представляющая собой фармацевтическую композицию, которая дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель и/или вспомогательное средство и необязательно содержит один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

Вариант осуществления 12. Полипептид или композиция для применения в соответствии с вариантами осуществления 10 или 11, где:

a) указанный первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17;

b) указанный второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18;

c) указанный третий ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19; и

d) указанный четвертый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

Вариант осуществления 13. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 10-12, где:

a) аминокислотная последовательность указанного первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2;

b) аминокислотная последовательность указанного второго ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3;

c) аминокислотная последовательность указанного третьего ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4; и

d) аминокислотная последовательность указанного четвертого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 14. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 10-13, где:

a) указанный первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2;

b) указанный второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

c) указанный третий ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

d) указанный четвертый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 15. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-14, где указанный полипептид дополнительно содержит одну или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, необязательно связанных посредством одного или нескольких пептидных линкеров, при этом указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида по сравнению с соответствующим полипептидом без указанных одной или нескольких других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц.

Вариант осуществления 16. Полипептид или композиция для применения в соответствии с вариантом осуществления 15, в которых указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, которые обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида, выбраны из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, белков сыворотки крови или их фрагментов, связывающих единиц, которые могут связываться с белками сыворотки крови, Fc-части и небольших белков или пептидов, которые могут связываться с белками сыворотки крови.

Вариант осуществления 17. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-16, в которых указанные одна или несколько других связывающих единиц, которые обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида, выбраны из группы, состоящей из связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточным альбумином (таким как сывороточный альбумин человека) или сывороточным иммуноглобулином (таким как IgG).

Вариант осуществления 18. Полипептид или композиция для применения в соответствии с вариантом осуществления 17, в которых указанная связывающая единица, которая обеспечивает увеличенный период полужизни полипептида, представляет собой ISVD, который может связываться с сывороточным альбумином человека.

Вариант осуществления 19. Полипептид или композиция для применения в соответствии с вариантом осуществления 18, где ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 10;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 15; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 20.

Вариант осуществления 20. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 18-19, где ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.

Вариант осуществления 21. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 18-20, где аминокислотная последовательность указанного ISVD, связывающегося с сывороточным альбумином человека, характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5.

Вариант осуществления 22. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 18-21, где указанный ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5.

Вариант осуществления 23. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 10-22, где аминокислотная последовательность полипептида характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1.

Вариант осуществления 24. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 10-23, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 или состоит из нее.

Вариант осуществления 25. Полипептид или композиция для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-24, предназначенные для применения при лечении воспалительного заболевания, такого как воспалительное заболевание 2 типа.

Вариант осуществления 26. Полипептид или композиция для применения в соответствии с вариантом осуществления 25, где воспалительное заболевание 2 типа выбрано из астмы и атопического дерматита.

Вариант осуществления 27. Полипептид, содержащий по меньшей мере один одиночный вариабельный домен иммуноглобулина (ISVD) или состоящий из него, где указанный ISVD содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно); и где по меньшей мере один ISVD содержит:

a) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17,

b) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18,

c) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9;

CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14; и

CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19, или

d) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11;

CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16; и

CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21.

Вариант осуществления 28. Полипептид в соответствии с вариантом осуществления 27, где по меньшей мере один ISVD содержит:

a) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17,

b) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18,

c) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, или

d) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

Вариант осуществления 29. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 27 или 28, где аминокислотная последовательность по меньшей мере одного ISVD характеризуется:

a) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2,

b) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3,

c) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 или

d) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 30. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 27-29, где по меньшей мере один ISVD содержит:

a) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

b) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3,

c) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4 или

d) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 31. Полипептид в соответствии с вариантами осуществления 1 или 27, где полипептид содержит по меньшей мере два ISVD или состоит из них, где каждый из указанных ISVD содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно), где по меньшей мере два ISVD необязательно связаны посредством одного или нескольких пептидных линкеров, и где:

a) первый и второй ISVD содержат:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17,

b) первый и второй ISVD содержат:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18,

c) первый ISVD содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17, и

второй ISVD содержит:

iv. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

v. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

vi. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18,

d) первый ISVD содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18, и

второй ISVD содержит:

iv. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

v. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

vi. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17,

e) первый ISVD содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21, и

второй ISVD содержит:

iv. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9;

v. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14; и

vi. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19, или

f) первый ISVD содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19, и

второй ISVD содержит:

iv. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11;

v. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16; и

vi. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21,

где порядок ISVD указывает на их относительное расположение друг с другом, рассматриваемое от N-конца до C-конца указанного полипептида.

Вариант осуществления 32. Полипептид в соответствии с вариантом осуществления 31, где:

a) первый и второй ISVD содержат CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17,

b) первый и второй ISVD содержат CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18,

c) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18,

d) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17,

e) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, или

f) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

Вариант осуществления 33. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 31 или 32, где:

a) аминокислотные последовательности первого и второго ISVD характеризуются более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2,

b) аминокислотные последовательности первого и второго ISVD характеризуются более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3,

c) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3,

d) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2,

e) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4,

f) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 34. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 31-33, где:

a) первый и второй ISVD содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

b) первый и второй ISVD содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3,

c) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3,

d) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

e) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, или

f) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 35. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 31-34, где полипептид содержит:

a) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 148,

b) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 149,

c) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 150,

d) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 151,

e) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 152,

f) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 153,

g) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 154,

h) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 155,

i) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 156,

j) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 157,

k) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 158 или

l) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 159 или состоит из них.

Вариант осуществления 36. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 27 или 31, где полипептид содержит по меньшей мере четыре ISVD или состоит из них, где каждый из указанных ISVD содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно), где по меньшей мере четыре ISVD необязательно связаны посредством одного или нескольких пептидных линкеров, и где:

a) первый ISVD содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17;

b) второй ISVD содержит:

iv. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

v. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

vi. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18;

c) третий ISVD содержит:

vii. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9;

viii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14; и

ix. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19; и

d) четвертый ISVD содержит:

x. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11;

xi. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16; и

xii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21,

где порядок ISVD указывает на их относительное расположение друг с другом, рассматриваемое от N-конца до C-конца указанного полипептида.

Вариант осуществления 37. Полипептид в соответствии с вариантом осуществления 36, где:

a) указанный первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17;

b) указанный второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18;

c) указанный третий ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19; и

d) указанный четвертый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

Вариант осуществления 38. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 36 или 37, где:

a) аминокислотная последовательность указанного первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2;

b) аминокислотная последовательность указанного второго ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3;

c) аминокислотная последовательность указанного третьего ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4; и

d) аминокислотная последовательность указанного четвертого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 39. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 36-38, где:

a) указанный первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2;

b) указанный второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

c) указанный третий ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

d) указанный четвертый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6.

Вариант осуществления 40. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 27-39, где указанный полипептид дополнительно содержит одну или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, необязательно связанных посредством одного или нескольких пептидных линкеров, при этом указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида по сравнению с соответствующим полипептидом без указанных одной или нескольких других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц.

Вариант осуществления 41. Полипептид в соответствии с вариантом осуществления 40, в котором указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, которые обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида, выбраны из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, белков сыворотки крови или их фрагментов, связывающих единиц, которые могут связываться с белками сыворотки крови, Fc-части и небольших белков или пептидов, которые могут связываться с белками сыворотки крови.

Вариант осуществления 42. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 40-41, в котором указанные одна или несколько других связывающих единиц, которые обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида, выбраны из группы, состоящей из связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточным альбумином (таким как сывороточный альбумин человека) или сывороточным иммуноглобулином (таким как IgG).

Вариант осуществления 43. Полипептид в соответствии с вариантом осуществления 42, в котором указанная связывающая единица, которая обеспечивает увеличенный период полужизни полипептида, представляет собой ISVD, который может связываться с сывороточным альбумином человека.

Вариант осуществления 44. Полипептид в соответствии с вариантом осуществления 43, где ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 10;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 15; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 20.

Вариант осуществления 45. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 43-44, где ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.

Вариант осуществления 46. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 43-45, где аминокислотная последовательность указанного ISVD, связывающегося с сывороточным альбумином человека, характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5.

Вариант осуществления 47. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 43-46, где указанный ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5.

Вариант осуществления 48. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 36-47, где аминокислотная последовательность полипептида характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1.

Вариант осуществления 49. Полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 36-48, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 или состоит из нее.

Вариант осуществления 50. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 27-49 или полипептид в соответствии с вариантами осуществления 36-49.

Вариант осуществления 51. Хозяин или клетка-хозяин, содержащие нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 50.

Вариант осуществления 52. Способ получения полипептида в соответствии с любым из вариантов осуществления 27-49 или полипептида в соответствии с вариантами осуществления 36-49, при этом указанный способ включает по меньшей мере следующие стадии:

a) обеспечение экспрессии в подходящих клетке-хозяине или организме-хозяине или в другой подходящей системе экспрессии нуклеиновой кислоты в соответствии с вариантом осуществления 50; за которым необязательно следует:

b) выделение и/или очистка полипептида в соответствии с любым из вариантов осуществления 27-49 или полипептида в соответствии с вариантами осуществления 36-49.

Вариант осуществления 53. Композиция, содержащая по меньшей мере один полипептид в соответствии с любым из вариантов осуществления 27-49 или по меньшей мере один полипептид в соответствии с вариантами осуществления 36-49 или нуклеиновую кислоту в соответствии с вариантом осуществления 50.

Вариант осуществления 54. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 53, представляющая собой фармацевтическую композицию, которая дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель и/или вспомогательное средство и необязательно содержит один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

Вариант осуществления 55. Способ лечения воспалительного заболевания, такого как воспалительное заболевание 2 типа, где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества полипептида в соответствии с любым из вариантов осуществления 27-49 или в соответствии с вариантами осуществления 36-49 или композиции в соответствии с любым из вариантов осуществления 53-54.

Вариант осуществления 56. Способ в соответствии с вариантом осуществления 55, где воспалительное заболевание 2 типа выбрано из астмы и атопического дерматита.

Вариант осуществления 57. Применение полипептида в соответствии с любым из вариантов осуществления 27-49 или в соответствии с вариантами осуществления 36-49 или композиции в соответствии с любым из вариантов осуществления 53-54 при получении фармацевтической композиции для лечения воспалительного заболевания, такого как воспалительное заболевание 2 типа.

Вариант осуществления 58. Применение полипептида или композиции в соответствии с вариантом осуществления 57, где воспалительное заболевание 2 типа выбрано из астмы и атопического дерматита.

4 Краткое описание графических материалов

Фигура 1. Сенсограмма, на которой показано одновременное связывание IL13 и HSA с F027400161, захваченным посредством TSLP.

Фигура 2. Ингибирование IL13 человека, яванского макака и макака-резуса в анализе высвобождения эотаксина с помощью V_HH F027400161 и эталонных соединений mAb1 к hIL-13 и mAb2 к hIL-13.

Фигура 3. Ингибирование IL13 человека и яванского макака в анализе по репортерному белку SEAP с помощью F027400161 и эталонных соединений mAb1 к hIL-13 и mAb2 к hIL-13.

Фигура 4. Ингибирование пролиферации BaF3, индуцированной TSLP человека и яванского макака, с помощью F027400161 и эталонного соединения mAb1 к hTSLP. IRR00096 представляет собой Nb отрицательного контроля.

Фигура 5. Диаграмма размаха, на которой показано связывание уже существующих антител, присутствующих в 96 образцах сыворотки крови человека, с F027400161, 163 и 164 по сравнению с контрольным F027301186.

Фигура 6. Профили ответов в виде дозозависимого ингибирования для F-27400161 (также обозначаемого как F027400161) и эталонного антитела сравнения mAb1 к hTSLP в отношении индуцированного TSLP ответа с образованием CCL17 в человеческих DC. Обогащенные человеческие DC обрабатывали с помощью 4 нг/мл TSLP и инкубировали с 8 концентрациями конструкции на основе ISVD и эталонным mAb1 к hTSLP в течение 36 часов. Концентрацию CCL17 в свежесобранной надосадочной жидкости измеряли с помощью ELISA. Значения IC₅₀ рассчитывали с помощью нелинейной регрессии (ответы в зависимости от логарифма концентрации ингибитора - четырехпараметрическая аппроксимация методом наименьших квадратов с переменным углом наклона) в GraphPad Prism 8.0 без ограничений. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) для всех 8 доноров, объединенных из 8 отдельных экспериментов.

Фигура 7. Ответы в виде дозозависимого ингибирования для F-27400161 (также обозначаемого как F027400161) и препаратов сравнения - эталонного mAb1 к hIL-13 и эталонного mAb1 к hTSLP - в отношении индуцированного с помощью 0,5 нг/мл IL-13 и TSLP синергического продуцирования CCL17 в человеческих PBMC. РВМС здоровых доноров стимулировали с помощью 0,5 нг/мл рекомбинантного IL-13+TSLP и инкубировали с 10 дозами конструкции на основе ISVD (Nb) и препаратов сравнения в течение 20 часов. Концентрацию CCL17 в надосадочной жидкости культуры клеток измеряли с помощью набора MSD V-Plex. Значения IC₅₀ рассчитывали с помощью нелинейной регрессии (ответы в зависимости от логарифма концентрации ингибитора - четырехпараметрическая аппроксимация методом наименьших квадратов с переменным углом наклона) в GraphPad Prism 8.0 без ограничений. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) для всех доноров, объединенных из 8 отдельных экспериментов.

Фигура 8. Ответы в виде дозозависимого ингибирования для F-27400161 (также обозначаемого как F027400161) и антител сравнения - эталонного mAb1 к hIL-13 и эталонного mAb1 к hTSLP - в отношении индуцированного с помощью 5 нг/мл IL-13 и TSLP синергического продуцирования CCL17 в человеческих PBMC. РВМС здоровых доноров стимулировали с помощью 5 нг/мл рекомбинантного IL-13+TSLP и инкубировали с 10 дозами конструкции на основе ISVD (Nb) и антител сравнения в течение 20 часов. Концентрацию CCL17 в свежесобранной надосадочной жидкости измеряли с помощью набора MSD V-Plex. Значения IC₅₀ рассчитывали с помощью нелинейной регрессии (ответы в зависимости от логарифма концентрации ингибитора - четырехпараметрическая аппроксимация методом наименьших квадратов с переменным углом наклона) в GraphPad Prism 8.0 без ограничений. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) для всех доноров, объединенных из 8 отдельных экспериментов.

Фигура 9. Профили ингибирования для F-27400161 (также обозначаемого как F027400161) и антител сравнения - эталонного mAb1 к hIL-13 и эталонного mAb1 к hTSLP - в отношении индуцированного аллергеном Der P продуцирования IL-5, CCL17 и CCL26 человеческими PBMC в анализе с тремя культурами. Нормальные донорские РВМС, совместно культивируемые с фибробластами MRC5 и эпителиальными клетками A549, стимулировали с помощью 3 мг/мл Der P и инкубировали с 11,1 нМ ISVD, эталонного mAb1 к hIL-13 или эталонного mAb1 к hTSLP в 24-луночном планшете в течение 6 дней в инкубаторе для культивирования клеток при 37^oC. Концентрацию IL-5, CCL17 и CCL26 в свежесобранной надосадочной жидкости измеряли с помощью анализов Magnetic Luminex для человека. Процентное значение ингибирования рассчитывали относительно нестимулированных (min) и стимулированных (max) контрольных образцов, которые не получали ни полипептиды ISVD, ни антитела. Все расчеты проводили с помощью GraphPad Prism 8.0. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) для всех доноров, объединенных из 3 независимых экспериментов.

Фигура 10. F027400161 значительно снижало выявляемые уровни TSLP человека в плазме крови мышей NSG-SGM3. По сравнению с мышами, получавшими лечение средой-носителем (376,166 пг/мл), уровни TSLP человека в плазме крови снижались при дозе 0,1 мг/кг F027400161 (45,772 пг/мл) и дозе 10 мг/кг F027400161 (0,072 пг/мл), что демонстрировало, что TSLP-плечо F027400161 может связываться с TSLP человека в плазме крови гуманизированных мышей NSG-SGM3.

Фигура 11. F027400161 значительно снижало выявляемые уровни IL-13 человека в плазме крови мышей NSG-SGM3. По сравнению с мышами, получавшими лечение средой-носителем (274,052 пг/мл), уровни IL-13 человека снижались при дозе 0,01 мг/кг F027400161 (201,286 пг/мл), дозе 0,05 мг/кг F027400161 (22,028 пг/мл), дозе 0,1 мг/кг F027400161 (40,740 пг/мл) и дозе 10 мг/кг F027400161 (1,777 пг/мл), что демонстрировало, что IL-13-плечо F27400161 может связываться с IL-13 человека в плазме крови гуманизированных мышей NSG-SGM3.

Фигуры 12 и 13. F027400161 значительно снижало экспрессию мышиных транскриптов Retnla и Clca1 в легких мышей NSG-SGM3, получавших hTSLP и hIL-4 путем гидродинамической доставки. Сверхэкспрессия TSLP и IL-4 человека у мышей NSG-SGM3 индуцирует продуцирование hIL-13 иммунными клетками человека, происходящими из CD34⁺ предшественников. Нейтрализация IL-13 человека с помощью F027400161 приводила к ингибированию мышиных маркерных генов Retnla и Clca1 при дозе 10 мг/кг.

Фигура 14. Схематическое представление конструкции на основе ISVD F027400161, в которой показаны от N-конца к C-концу одновалентные структурные элементы/ISVD 4B02, 4B06, 501A02, 529F10, а также средство, связывающее альбумин - ALB23002. Хотя 4B02 и 4B06 связаны посредством линкера 35GS, остальные структурные элементы связаны посредством линкеров 9GS.

5 Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение направлено на получение нового типа лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний, таких как атопический дерматит и астма.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду, нацеливающемуся одновременно на IL-13 и TSLP, что приводит к повышенной эффективности модулирования воспалительной реакции 2 типа по сравнению с моноспецифическими полипептидами, направленными против IL-13 или против TSLP, in vitro и/или in vivo. В некоторых вариантах осуществления полипептиды эффективно продуцируются (например, в микробных хозяевах). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления может быть показано, что такие полипептиды обладают ограниченной реактивностью в отношении уже существующих антител у субъекта, подлежащего лечению (т. е. антителам, присутствующим у субъекта до первого лечения с помощью конструкции на основе антитела). В других вариантах осуществления такие полипептиды у субъекта, подлежащего лечению, демонстрируют период полужизни, достаточно продолжительный для того, чтобы последовательно применяемые средства лечения можно было вводить с удобными интервалами.

5.1 Полипептиды по настоящему изобретению

Моноспецифические одновалентные полипептиды

В одном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению является моноспецифическим и одновалентным.

Термин "моноспецифический" относится к связыванию с одним (специфическим) типом молекулы-мишени(молекул-мишеней). Таким образом, моноспецифический полипептид по настоящему изобретению специфично связывается с IL-13. Другой моноспецифический полипептид по настоящему изобретению специфично связывается с TSLP.

Термин "одновалентный" указывает на присутствие только одной связывающей единицы/структурного элемента, (специфично) нацеливающихся на молекулу, таких как ISVD.

Соответственно, в одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен моноспецифический одновалентный полипептид, содержащий один ISVD, который специфично связывается с IL-13 и содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно), или состоящий из него. ISVD может быть выбран из ISVD, содержащего:

a) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17; или

b) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения ISVD специфично связывается с IL-13 человека.

В дополнительном варианте осуществления ISVD, специфично связывающийся с IL-13, выбран из ISVD, содержащего:

a) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17; или

b) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18.

В дополнительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения ISVD, специфично связывающийся с IL-13, выбран из ISVD, характеризующегося:

a) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или

b) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления ISVD, специфично связывающийся с IL-13, выбран из ISVD, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен моноспецифический одновалентный полипептид, содержащий один ISVD, который специфично связывается с TSLP и содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно), или состоящий из него. ISVD может быть выбран из ISVD, содержащего:

a) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19; или

b) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения ISVD специфично связывается с TSLP человека.

В дополнительном варианте осуществления ISVD, специфично связывающийся с TSLP, выбран из ISVD, содержащего:

a) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19; или

b) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

В дополнительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения ISVD, специфично связывающийся с TSLP, выбран из ISVD, характеризующегося:

a) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 или

b) более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6.

В одном варианте осуществления ISVD, специфично связывающийся с TSLP, выбран из ISVD, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4 или аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6.

Моноспецифические поливалентные полипептиды

В другом аспекте полипептид по настоящему изобретению является моноспецифическим и по меньшей мере двухвалентным, но также может быть, например, трехвалентным, четырехвалентным, пятивалентным, шестивалентным и т. д.

Все из терминов "двухвалентный", "трехвалентный", "четырехвалентный", "пятивалентный" или "шестивалентный" подпадают под термин "поливалентный" и указывают на наличие соответственно двух, трех, четырех, пяти или шести связывающих единиц/структурных элементов, таких как ISVD.

Соответственно, в одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен моноспецифический двухвалентный полипептид, содержащий два ISVD, которые специфично связываются с IL-13, или состоящий из них, где каждый из двух ISVD содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно), где два ISVD необязательно связаны посредством одного или нескольких пептидных линкеров, и где:

a) первый и второй ISVD содержат CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17;

b) первый и второй ISVD содержат CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18;

c) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17, и

второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18; или

d) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18, и

второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17.

В одном варианте осуществления этого аспекта настоящего изобретения ISVD связаны посредством одного или нескольких пептидных линкеров. В одном варианте осуществления два ISVD специфично связывают IL13 человека.

В дополнительном варианте осуществления моноспецифический двухвалентный полипептид содержит два ISVD, которые специфично связываются с IL-13, или состоит из них, где:

a) первый и второй ISVD содержат CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17;

b) первый и второй ISVD содержат CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18;

c) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18; или

d) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17.

В дополнительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения моноспецифический двухвалентный полипептид содержит два ISVD, которые специфично связываются с IL-13, или состоит из них, где:

a) аминокислотные последовательности первого и второго ISVD характеризуются более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2;

b) аминокислотные последовательности первого и второго ISVD характеризуются более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3;

c) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3; или

d) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2.

В одном варианте осуществления моноспецифический двухвалентный полипептид содержит два ISVD, которые специфично связываются с IL-13, или состоит из них, где:

a) первый и второй ISVD содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2;

b) первый и второй ISVD содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

c) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3; или

d) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен моноспецифический двухвалентный полипептид, содержащий два ISVD, которые специфично связываются с TSLP, или состоящий из них, где каждый из двух ISVD содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно), где два ISVD необязательно связаны посредством одного или нескольких пептидных линкеров, и где:

a) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21, и

второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19, или

b) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19, и

второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления этого аспекта настоящего изобретения ISVD связаны посредством одного или нескольких пептидных линкеров. В одном варианте осуществления два ISVD специфично связывают TSLP человека.

В дополнительном варианте осуществления моноспецифический двухвалентный полипептид содержит два ISVD, которые специфично связываются с TSLP, или состоит из них, где:

a) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, или

b) первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19, и второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

В дополнительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения моноспецифический двухвалентный полипептид содержит два ISVD, которые специфично связываются с TSLP, или состоит из них, где:

a) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, или

b) аминокислотная последовательность первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, и второй ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6.

В одном варианте осуществления моноспецифический двухвалентный полипептид содержит два ISVD, которые специфично связываются с TSLP, или состоит из них, где:

a) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; или

b) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, и второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6.

Термины "первый ISVD" и "второй ISVD" в этом отношении указывают только на относительное расположение конкретно указанных ISVD, связывающихся с IL-13/TSLP, друг с другом, где нумерация начинается с N-конца полипептида по настоящему изобретению. Таким образом, "первый ISVD" находится ближе к N-концу, чем "второй ISVD". Соответственно, "второй ISVD", таким образом, находится ближе к С-концу, чем "первый ISVD". Поскольку нумерация, таким образом, не является абсолютной и указывает только на относительное расположение двух ISVD, это не исключает возможности того, что в полипептиде могут присутствовать дополнительные связывающие единицы/структурные элементы, такие как ISVD, связывающиеся с IL-13 и TSLP соответственно. Кроме того, это не исключает возможности того, что между ними могут быть размещены другие связывающие единицы/структурные элементы, такие как ISVD. Например, как дополнительно описано ниже (см., в частности, разделы "Полиспецифические поливалентные полипептиды" и 5.4 "Увеличение периода полужизни (in vivo)"), полипептид может дополнительно содержать другой ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, который даже может находиться между "первым ISVD" и "вторым ISVD" (такая конструкция, следовательно, обозначается как полиспецифическая, как описано в следующем разделе).

В одном варианте осуществления (по меньшей мере два) ISVD моноспецифических поливалентных полипептидов, в частности описанных выше моноспецифических двухвалентных полипептидов, связаны посредством пептидных линкеров. Использование пептидных линкеров для соединения двух или более (поли)пептидов хорошо известно из уровня техники. Иллюстративные пептидные линкеры, которые можно использовать с моноспецифическими поливалентными полипептидами, в частности с описанными выше моноспецифическими двухвалентными полипептидами, показаны в таблице А-5. Один часто используемый класс пептидных линкеров известен как линкеры "Gly-Ser" или "GS". Они представляют собой линкеры, которые по существу состоят из остатков глицина (G) и серина (S) и обычно содержат один или несколько повторов пептидного мотива, такого как мотив GGGGS (SEQ ID NO: 73) (например, предусматривающий формулу (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, в которой n может равняться 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или больше). Некоторыми часто используемыми примерами таких линкеров GS являются линкеры 9GS (GGGGSGGGS, SEQ ID NO: 76), линкеры 15GS (n=3) и линкеры 35GS (n=7). Например, ссылка дается на Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369; и Klein et al., Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ISVD моноспецифических поливалентных полипептидов, в частности моноспецифических двухвалентных полипептидов по настоящему изобретению, связаны посредством линкера, представленного в таблице A-5. В одном варианте осуществления (по меньшей мере) два ISVD связаны посредством линкера(линкеров) 35GS.

Соответственно, в одном варианте осуществления моноспецифический двухвалентный полипептид содержит:

a) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 148,

b) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 149,

c) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 150,

d) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 151,

e) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 152,

f) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 153,

g) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 154,

h) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 155,

i) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 156,

j) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 157,

k) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 158 или

l) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 159 или состоит из них.

Полиспецифические поливалентные полипептиды

В дополнительном аспекте полипептид по настоящему изобретению является по меньшей мере биспецифическим, но также может быть, например, триспецифическим, тетраспецифическим, пентаспецифическим и т. д. Кроме того, полипептид является по меньшей мере двухвалентным, но также может быть, например, трехвалентным, четырехвалентным, пятивалентным, шестивалентным и т. д.

Все из терминов "биспецифический", "триспецифический", "тетраспецифический", "пентаспецифический" и т. д. подпадают под термин "полиспецифический" и относятся к связыванию соответственно с двумя, тремя, четырьмя, пятью и т. д. различными молекулами-мишенями.

Все из терминов "двухвалентный", "трехвалентный", "четырехвалентный", "пятивалентный", "шестивалентный" и т. д. подпадают под термин "поливалентный" и указывают на наличие соответственно двух, трех, четырех, пяти, шести и т. д. связывающих единиц/структурных элементов, таких как ISVD.

Например, полипептид может быть биспецифическим и четырехвалентным, таким как полипептид, содержащий по меньшей мере четыре ISVD или состоящий из них, где по меньшей мере два ISVD специфично связываются с IL-13, и по меньшей мере два ISVD специфично связываются с TSLP. В одном варианте осуществления IL-13 и TSLP представляют собой IL-13 человека и TSLP человека. В другом примере полипептид может быть триспецифическим и пятивалентным, таким как полипептид, содержащий пять ISVD или состоящий из них, где два ISVD специфично связываются с IL-13 человека, два ISVD специфично связываются с TSLP человека, и один ISVD связывается с сывороточным альбумином человека. Такой полипептид может быть в то же время бипаратопным, например, если два ISVD связывают два разных эпитопа на IL-13 человека или TSLP человека. Термин "бипаратопный" относится к связыванию с двумя разными частями (например, эпитопами) одной и той же молекулы-мишени. В одном варианте осуществления триспецифический пятивалентный полипептид по настоящему изобретению представляет собой, например, конструкцию на основе ISVD F027400161, содержащую два ISVD, специфично связывающихся с IL-13 человека, два ISVD, специфично связывающихся с TSLP человека, один ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, и которая является бипаратопной в отношении связывания как с IL-13, так и с TSLP.

В одном варианте осуществления полиспецифический поливалентный полипептид содержит по меньшей мере четыре ISVD или состоит из них, где каждый из указанных ISVD содержит три определяющие комплементарность области (от CDR1 до CDR3 соответственно), где по меньшей мере четыре ISVD необязательно связаны посредством одного или нескольких пептидных линкеров, и где:

a) первый ISVD, который специфично связывается с IL-13, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17;

b) второй ISVD, который специфично связывается с IL-13, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18;

c) третий ISVD, который специфично связывается с TSLP, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19, и

d) четвертый ISVD, который специфично связывается с TSLP, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления IL-13 и TSLP, связываемые указанным полипептидом, представляют собой IL-13 человека и TSLP человека соответственно.

В дополнительном варианте осуществления полиспецифического поливалентного полипептида:

a) указанный первый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17;

b) указанный второй ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18;

c) указанный третий ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19; и

d) указанный четвертый ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

В дополнительном аспекте полиспецифического поливалентного полипептида:

a) аминокислотная последовательность указанного первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2;

b) аминокислотная последовательность указанного второго ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3;

c) аминокислотная последовательность указанного третьего ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4; и

d) аминокислотная последовательность указанного четвертого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6.

В одном варианте осуществления полиспецифического поливалентного полипептида:

a) первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2;

b) второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

c) третий ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

d) четвертый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6.

Термины "первый ISVD", "второй ISVD", "третий ISVD" и т. д. в этом отношении указывают только относительное расположение ISVD друг с другом, где нумерация начинается с N-конца полипептида по настоящему изобретению. Таким образом, "первый ISVD" находится ближе к N-концу, чем "второй ISVD", тогда как "второй ISVD" находится ближе к N-концу, чем "третий ISVD". Соответственно, расположение ISVD является обратным при рассмотрении с С-конца. Поскольку нумерация не является абсолютной и указывает только на относительное расположение по меньшей мере четырех ISVD, не исключается, что в полипептиде могут присутствовать другие связывающие единицы/структурные элементы, такие как дополнительные ISVD, связывающиеся с IL-13 или TSLP, или ISVD, связывающиеся с другой мишенью. Кроме того, это не исключает возможности того, что между ними могут быть размещены другие связывающие единицы/структурные элементы, такие как ISVD. Например, как дополнительно описано ниже (см., в частности, раздел 5.4 "Увеличение периода полужизни (in vivo)" ниже), полипептид может дополнительно содержать другой ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, который даже может находиться между, например, "третьим ISVD" и "четвертым ISVD".

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен биспецифический двухвалентный полипептид, содержащий ISVD, который специфично связывается с IL-13 или TSLP, как подробно описано для моноспецифических одновалентных полипептидов выше (раздел 5.1; "Моноспецифические одновалентные полипептиды"), и ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, как подробно описано ниже (раздел 5.4; "Увеличение периода полужизни (in vivo)").

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен биспецифический трехвалентный полипептид, содержащий моноспецифические двухвалентные полипептиды, указанные выше (раздел 5.1; "Моноспецифические двухвалентные полипептиды"), и ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, как подробно описано ниже (раздел 5.4; "Увеличение периода полужизни (in vivo)").

Компоненты указанного полиспецифического поливалентного полипептида, такие как ISVD, могут быть связаны друг с другом с помощью одного или нескольких подходящих линкеров, таких как пептидные линкеры.

Использование линкеров для соединения двух или более (поли)пептидов хорошо известно из уровня техники. Иллюстративные пептидные линкеры показаны в таблице А-5. Один часто используемый класс пептидных линкеров известен как линкеры "Gly-Ser" или "GS". Они представляют собой линкеры, которые по существу состоят из остатков глицина (G) и серина (S) и обычно содержат один или несколько повторов пептидного мотива, такого как мотив GGGGS (SEQ ID NO: 73) (например, предусматривающий формулу (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, в которой n может равняться 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или больше). Некоторыми часто используемыми примерами таких линкеров GS являются линкеры 9GS (GGGGSGGGS, SEQ ID NO: 76), линкеры 15GS (n=3) (SEQ ID NO: 78) и линкеры 35GS (n=7) (SEQ ID NO: 83). Например, ссылка дается на Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369; и Klein et al., Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330. В полипептиде(полипептидах) по настоящему изобретению линкеры 9GS (SEQ ID NO: 76) и 35GS (SEQ ID NO: 83) используются для связывания компонентов полипептида друг с другом.

В одном аспекте полиспецифического поливалентного полипептида по настоящему изобретению полипептид, содержащий по меньшей мере четыре ISVD или состоящий из них, содержит по меньшей мере два ISVD, специфично связывающихся с IL-13, и по меньшей мере два ISVD, специфично связывающихся с TSLP. В этом аспекте настоящего изобретения по меньшей мере два ISVD, связывающиеся с IL-13, связаны посредством линкера 35GS, тогда как по меньшей мере два ISVD, специфично связывающиеся с TSLP, связаны посредством линкера 9GS. В одном варианте осуществления по меньшей мере два ISVD, специфично связывающиеся с TSLP, разделены ISVD, связывающимся с альбумином (9GS-Alb-9GS) (как описано в разделе 5.4 "Увеличение периода полужизни (in vivo)" ниже). Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что такая конфигурация может приводить к увеличению выхода продукции полипептида.

Соответственно, в одном варианте осуществления полипептид содержит следующие элементы или состоит из них в порядке, начиная с N-конца полипептида: первый ISVD, специфично связывающийся с IL-13, второй ISVD, специфично связывающийся с IL-13, первый ISVD, специфично связывающийся с TSLP, необязательную связывающую единицу, обеспечивающую увеличенный период полужизни полипептида, как определено в данном документе, и второй ISVD, специфично связывающийся с TSLP. В одном варианте осуществления связывающая единица, обеспечивающая увеличенный период полужизни полипептида, представляет собой ISVD.

В дополнительном варианте осуществления полипептид содержит следующие элементы или состоит из них в порядке, начиная с N-конца полипептида: ISVD, специфично связывающийся с IL-13, линкер, второй ISVD, специфично связывающийся с IL-13, линкер, первый ISVD, специфично связывающийся с TSLP, линкер, ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, линкер и второй ISVD, специфично связывающийся с TSLP. В одном конкретном варианте осуществления линкер между двумя ISVD, связывающимися с IL-13, представляет собой линкер 35GS, тогда как другие линкеры представляют собой линкеры 9GS.

Такие конфигурации полипептида могут обеспечивать увеличенный выход продукции, хорошие характеристики CMC, такие как достаточная растворимость и биофизическая стабильность, сильную активность в отношении модулирования иммунного ответа 2 типа, а также низкую степень связывания с уже существующими антителами.

В одном варианте осуществления полиспецифический поливалентный полипептид по настоящему изобретению демонстрирует сниженное связывание с уже существующими антителами в сыворотке крови человека. Для этой цели в одном варианте осуществления полипептид содержит валин (V) в аминокислотном положении 11 и лейцин (L) в аминокислотном положении 89 (согласно нумерации по Kabat) в по меньшей мере одном ISVD. В одном варианте осуществления полипептид содержит валин (V) в аминокислотном положении 11 и лейцин (L) в аминокислотном положении 89 (согласно нумерации по Kabat) в каждом ISVD. В другом варианте осуществления полипептид содержит удлинение из 1-5 (встречающихся в природе) аминокислот, такое как удлинение из одного аланина (А), на С-конце С-концевого ISVD. С-конец ISVD обычно представляет собой VTVSS (SEQ ID NO: 138). В другом варианте осуществления полипептид содержит лизин (K) или глутамин (Q) в положении 110 (согласно нумерации по Kabat) в по меньшей мере одном ISVD. В другом варианте осуществления ISVD содержит лизин (K) или глутамин (Q) в положении 112 (согласно нумерации по Kabat) в по меньшей мере одном ISVD. В этих вариантах осуществления С-конец ISVD представляет собой VKVSS (SEQ ID NO: 139), VQVSS (SEQ ID NO: 140), VTVKS (SEQ ID NO: 166), VTVQS (SEQ ID NO: 167), VKVKS (SEQ ID NO: 168), VKVQS (SEQ ID NO: 169), VQVKS (SEQ ID NO: 170) или VQVQS (SEQ ID NO: 171), так что после добавления одного аланина С-конец полипептида, например, содержит последовательность VTVSSA (SEQ ID NO: 141), VKVSSA (SEQ ID NO: 142), VQVSSA (SEQ ID NO: 143), VTVKSA (SEQ ID NO: 172), VTVQSA (SEQ ID NO: 173), VKVKSA (SEQ ID NO: 174), VKVQSA (SEQ ID NO: 175), VQVKSA (SEQ ID NO: 176) или VQVQSA (SEQ ID NO: 177). В одном варианте осуществления C-конец содержит VTVSSA (SEQ ID NO: 141). В другом варианте осуществления полипептид содержит валин (V) в аминокислотном положении 11 и лейцин (L) в аминокислотном положении 89 (согласно нумерации по Kabat) в каждом ISVD, необязательно лизин (K) или глутамин (Q) в положении 110 (согласно нумерации по Kabat) в по меньшей мере одном ISVD и содержит удлинение из 1-5 (встречающихся в природе) аминокислот, такое как удлинение из одного аланина (A), на С-конце С-концевого ISVD (так что С-конец полипептида, например, имеет последовательность VTVSSA (SEQ ID NO: 141), VKVSSA (SEQ ID NO: 142) или VQVSSA (SEQ ID NO: 143), например, VTVSSA (SEQ ID NO: 141)). См., например, WO 2012/175741 и WO 2015/173325 для получения дополнительной информации в этом отношении.

В одном варианте осуществления полиспецифический поливалентный полипептид по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся более чем 90%, как, например, более чем 95% или более чем 99%, идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, или состоит из нее, где CDR пяти ISVD определены в пунктах A-E (или A'-E', если используется определение согласно Kabat), изложенных соответственно в разделах "5.2 Одиночные вариабельные домены иммуноглобулина" и "5.4 Увеличение периода полужизни (in vivo)" ниже, где, в частности:

? первый ISVD, специфично связывающийся с IL-13, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17;

? второй ISVD, специфично связывающийся с IL-13, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18;

? третий ISVD, специфично связывающийся с TSLP, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19;

? четвертый ISVD, специфично связывающийся с TSLP, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21; и

? ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20,

или в качестве альтернативы при использовании определения согласно Kabat:

? первый ISVD, специфично связывающийся с IL-13, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 37, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 42, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17;

? второй ISVD, специфично связывающийся с IL-13, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 43, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18;

? третий ISVD, специфично связывающийся с TSLP, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 44, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19;

? четвертый ISVD, специфично связывающийся с TSLP, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 41, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21; и

? ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.

В другом варианте осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 или состоит из нее. В другом варианте осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере половинной аффинностью связывания или по меньшей мере такой же аффинностью связывания с IL-13 человека и с TSLP человека по сравнению с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1, где аффинность связывания измеряется с помощью одного и того же способа, такого как поверхностный плазмонный резонанс (SPR).

5.2 Одиночные вариабельные домены иммуноглобулина

Термин "одиночный вариабельный домен иммуноглобулина" (ISVD), используемый взаимозаменяемо с термином "одиночный вариабельный домен", определяет молекулы иммуноглобулинов, в которых антигенсвязывающий участок присутствует в одиночном домене иммуноглобулина и образован им. Это отличает ISVD от "традиционных" иммуноглобулинов (например, моноклональных антител) или их фрагментов (таких как Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, ди-scFv), где два домена иммуноглобулина, в частности два вариабельных домена, взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего участка. Как правило, в традиционных иммуноглобулинах вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L) взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего участка. В этом случае определяющие комплементарность области (CDR) как V_H, так и V_L вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка, т. е. в общей сложности 6 CDR участвуют в образовании антигенсвязывающего участка.

С учетом вышеприведенного определения антигенсвязывающий домен из традиционного 4-цепочечного антитела (такого как молекула IgG, IgM, IgA, IgD или IgE; известного из уровня техники) или из Fab-фрагмента, F(ab')₂-фрагмента, Fv-фрагмента, такого как Fv-фрагмент, стабилизированный дисульфидными связями, или scFv-фрагмента или диатела (все из которых известны из уровня техники), полученных из такого традиционного 4-цепочечного антитела, обычно не рассматривается как ISVD, поскольку в этих случаях связывание с соответствующим эпитопом антигена обычно происходит не с помощью одного-единственного домена иммуноглобулина, а с помощью пары ассоциирующих доменов иммуноглобулина, таких как вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, т. е. с помощью пары доменов иммуноглобулина V_H-V_L, которые совместно связываются с эпитопом соответствующего антигена.

В отличие от этого, ISVD способны специфично связываться с эпитопом антигена без образования пары с дополнительным вариабельным доменом иммуноглобулина. Связывающий участок ISVD образован одним доменом V_H, одним доменом V_HH или одним доменом V_L.

Таким образом, одиночный вариабельный домен может представлять собой последовательность вариабельного домена легкой цепи (например, последовательность V_L) или ее подходящий фрагмент или последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (например, последовательность V_H или последовательность V_HH) или ее подходящий фрагмент; при условии, что он способен образовывать одиночную антигенсвязывающую единицу (т. е. функциональную антигенсвязывающую единицу, которая по существу состоит из одиночного вариабельного домена, так что одиночный антигенсвязывающий домен не должен взаимодействовать с другим вариабельным доменом для образования функциональной антигенсвязывающей единицы).

ISVD может, например, представлять собой ISVD тяжелой цепи, такой как V_H, V_HH, в том числе камелизированный V_H или гуманизированный V_HH. В одном варианте осуществления он представляет собой V_HH, в том числе камелизированный V_H или гуманизированный V_HH. ISVD тяжелой цепи могут быть получены из традиционного четырехцепочечного антитела или из антитела из тяжелых цепей.

Например, ISVD может представлять собой однодоменное антитело (или аминокислотную последовательность, подходящую для применения в качестве однодоменного антитела), "dAb" или dAb (или аминокислотную последовательность, подходящую для применения в качестве dAb), или Nanobody® (определенное в данном документе и включающее в себя без ограничения V_HH); другие одиночные вариабельные домены или любой подходящий фрагмент любого из них.

В частности, ISVD может представлять собой Nanobody® (такое как V_HH, в том числе гуманизированный V_HH или камелизированный V_H) или его подходящий фрагмент. Nanobody®, Nanobodies® and Nanoclone® являются зарегистрированными товарными знаками Ablynx N.V.

"V_HH-домены", также известные как V_HH, V_HHфрагменты антител и V_HH-антитела, первоначально были описаны как антигенсвязывающий вариабельный домен иммуноглобулина из "антител из тяжелых цепей" (т. е. из "антител, лишенных легких цепей"; Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993). Термин "V_HH-домен" был выбран для того, чтобы отличить эти вариабельные домены от вариабельных доменов тяжелой цепи, присутствующих в традиционных 4-цепочечных антителах (которые упоминаются в данном документе как "V_H-домены"), и от вариабельных доменов легкой цепи, присутствующих в традиционных 4-цепочечных антителах (которые упоминаются в данном документе как "V_L-домены"). Для дополнительного описания V_HH ссылка дается на обзорную статью Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001).

Как правило, получение иммуноглобулинов включает иммунизацию экспериментальных животных, слияние клеток, продуцирующих иммуноглобулины, для создания гибридом и скрининг в отношении желаемых форм специфичности. В качестве альтернативы иммуноглобулины могут быть получены с помощью скрининга наивных или синтетических библиотек, например, с помощью фагового дисплея.

Получение последовательностей иммуноглобулинов, таких как Nanobody®, было подробно описано в различных публикациях, среди которых можно привести в качестве примера WO 94/04678, Hamers-Casterman et al. 1993 и Muyldermans et al. 2001. В этих способах верблюдовых иммунизируют антигеном-мишенью, чтобы индуцировать иммунный ответ на указанный антиген-мишень. Репертуар Nanobody, полученных в результате указанной иммунизации, дополнительно подвергают скринингу в отношении Nanobody, которые связывают антиген-мишень.

В этих случаях для образования антител требуется очищенный антиген для иммунизации и/или скрининга. Антигены могут быть очищены из природных источников или в ходе рекомбинантного получения.

Иммунизация и/или скрининг последовательностей иммуноглобулинов могут осуществляться с использованием пептидных фрагментов таких антигенов.

В настоящем изобретении могут использоваться последовательности иммуноглобулинов различного происхождения, в том числе последовательности иммуноглобулинов мыши, крысы, кролика, осла, человека и верблюдовых. Настоящее изобретение также включает полностью человеческие, гуманизированные или химерные последовательности. Например, в настоящем изобретении предусмотрены последовательности иммуноглобулинов верблюдовых и гуманизированные последовательности иммуноглобулинов верблюдовых или антитела с камелизированными доменами, например, камелизированное dAb, как описано в Ward et al (см., например, WO 94/04678 и Davies and Riechmann (1994 и 1996)). Кроме того, в настоящем изобретении также используются слитые последовательности иммуноглобулинов, например, образующие поливалентную и/или полиспецифическую конструкцию (в отношении поливалентных и полиспецифических полипептидов, содержащих один или несколько V_HH-доменов, и их получения также дается ссылка на Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001, а также, например, на WO 96/34103 и WO 99/23221), и последовательности иммуноглобулинов, содержащие маркеры или другие функциональные фрагменты, например, токсины, метки, радиоактивные химические вещества и т. д., которые могут быть получены из последовательностей иммуноглобулинов по настоящему изобретению.

"Гуманизированный V_HH" содержит аминокислотную последовательность, которая соответствует аминокислотной последовательности встречающегося в природе V_HH-домена, но которая была "гуманизирована", т. е. подвергнута замене одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности указанной встречающейся в природе последовательности V_HH (и, в частности, в последовательностях каркасных областей) одним или несколькими аминокислотными остатками, которые встречаются в соответствующем(соответствующих) положении(положениях) в V_H-домене из традиционного 4-цепочечного антитела человека (например, указанного выше). Это может осуществляться широко известным способом, который будет понятен специалисту в данной области, например, на основании дополнительного описания в данном документе и предшествующего уровня техники (например, WO 2008/020079). Опять же, следует отметить, что такие гуманизированные V_HH могут быть получены любым подходящим широко известным способом, и, таким образом, они строго не ограничены полипептидами, которые были получены с использованием полипептида, содержащего встречающийся в природе V_HH-домен, в качестве исходного материала.

"Камелизированный V_H" содержит аминокислотную последовательность, которая соответствует аминокислотной последовательности встречающегося в природе V_H-домена, но которая была "камелизирована", т. е. подвергнута замене одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности встречающегося в природе V_H-домена из традиционного 4-цепочечного антитела одним или несколькими аминокислотными остатками, которые встречаются в соответствующем(соответствующих) положении(положениях) в V_HH-домене антитела из тяжелых цепей. Это может осуществляться широко известным способом, который будет понятен специалисту в данной области, например, на основании дополнительного описания в данном документе и предшествующего уровня техники (например, WO 2008/020079). Такие "камелизирующие" замены обычно вставляются в аминокислотных положениях, которые формируют границу раздела V_H-V_L и/или присутствуют на ней, и/или в так называемых характерных остатках верблюдовых, как определено в данном документе (см., например, WO 94/04678 и Davies and Riechmann, 1994 и 1996, выше). В одном варианте осуществления последовательность V_H, используемая в качестве исходного материала или отправной точки для получения или разработки камелизированного V_H, представляет собой последовательность V_H млекопитающего или последовательность V_H человека, такую как последовательность V_H3. Однако следует отметить, что такие камелизированные V_H могут быть получены любым подходящим широко известным способом, и, таким образом, они строго не ограничены полипептидами, которые были получены с использованием полипептида, содержащего встречающийся в природе V_H-домен, в качестве исходного материала.

Можно считать, что структура последовательности ISVD состоит из четырех каркасных областей ("FR"), которые упоминаются в данной области техники и в данном документе как "каркасная область 1" ("FR1"); как "каркасная область 2" ("FR2"); как "каркасная область 3" ("FR3") и как "каркасная область 4" ("FR4") соответственно; при этом данные каркасные области прерываются тремя определяющими комплементарность областями ("CDR"), которые упоминаются в данной области техники и в данном документе как "определяющая комплементарность область 1" ("CDR1"); как "определяющая комплементарность область 2" ("CDR2") и как "определяющая комплементарность область 3" ("CDR3") соответственно.

Как дополнительно описано в абзаце q) на страницах 58 и 59 в WO 08/020079, аминокислотные остатки ISVD могут быть пронумерованы в соответствии с общей нумерацией V_H-доменов, даваемой Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, № публикации 91), как применяется к V_HH-доменам верблюдовых в статье Riechmann and Muyldermans, 2000 (J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195; см. например, фигуру 2 из этой публикации). Следует отметить, что, как хорошо известно из уровня техники для V_H-доменов и для V_HH-доменов, общее количество аминокислотных остатков в каждой из CDR может варьироваться и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, указанному с помощью нумерации по Kabat (иными словами, одно или несколько положений согласно нумерации по Kabat могут не быть заняты в фактической последовательности, или фактическая последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем количество, допускаемое согласно нумерации по Kabat). Это означает, что, как правило, нумерация в соответствии с Kabat может соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в фактической последовательности или не соответствовать ей. Общее количество аминокислотных остатков в V_H-домене и V_HH-домене обычно находится в диапазоне от 110 до 120, часто от 112 до 115. Однако, следует отметить, что более короткие и более длинные последовательности также могут быть подходящими для целей, описанных в данном документе.

В настоящей заявке, если не указано иное, последовательности CDR определялись в соответствии с определением AbM, как описано в Kontermann and Dübel (Eds. 2010, Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51). Согласно этому способу FR1 содержит аминокислотные остатки в положениях 1-25, CDR1 содержит аминокислотные остатки в положениях 26-35, FR2 содержит аминокислотные остатки в положениях 36-49, CDR2 содержит аминокислотные остатки в положениях 50-58, FR3 содержит аминокислотные остатки в положениях 59-94, CDR3 содержит аминокислотные остатки в положениях 95-102, и FR4 содержит аминокислотные остатки в положениях 103-113.

Определение CDR-областей также можно проводить различными способами. При определении CDR в соответствии с Kabat FR1 из ISVD содержит аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 из ISVD содержит аминокислотные остатки в положениях 31-35, FR2 из ISVD содержит аминокислотные остатки в положениях 36-49, CDR2 из ISVD содержит аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 из ISVD содержит аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 из ISVD содержит аминокислотные остатки в положениях 95-102, и FR4 из ISVD содержит аминокислотные остатки в положениях 103-113.

В такой последовательности иммуноглобулина последовательности каркасных областей могут представлять собой любые подходящие последовательности каркасных областей, и примеры подходящих последовательностей каркасных областей будут понятны специалисту в данной области, например, на основании нормативных справочных пособий и дальнейшего раскрытия и предшествующего уровня техники, упомянутых в данном документе.

Последовательности каркасных областей представляют собой подходящую комбинацию последовательностей каркасных областей иммуноглобулина или последовательностей каркасных областей, которые были получены из последовательностей каркасных областей иммуноглобулина (например, путем гуманизации или камелизации). Например, последовательности каркасных областей могут представлять собой последовательности каркасных областей, полученные из вариабельного домена легкой цепи (например, последовательности V_L) и/или из вариабельного домена тяжелой цепи (например, последовательности V_H или последовательности V_HH). В одном аспекте последовательности каркасных областей представляют собой последовательности каркасных областей, которые были получены из последовательности V_HH (в которой указанные последовательности каркасных областей необязательно могут быть частично или полностью гуманизированы), либо представляют собой традиционные последовательности V_H, которые были камелизированы (как определено в данном документе).

В частности, последовательности каркасных областей, присутствующие в последовательности ISVD, используемой в настоящем изобретении, могут содержать один или несколько характерных остатков (как определено в данном документе), так что последовательность ISVD представляет собой Nanobody®, такое как V_HH, в том числе гуманизированный V_HH или камелизированный V_H. Некоторые неограничивающие примеры (подходящих комбинаций) таких последовательностей каркасных областей станут понятны из дальнейшего раскрытия в данном документе.

Опять же, как в целом описано в данном документе для последовательностей иммуноглобулинов, также возможно применять подходящие фрагменты (или комбинации фрагментов) любых из вышеперечисленных, такие как фрагменты, которые содержат одну или несколько последовательностей CDR, подходящим образом фланкированных одной или несколькими последовательностями каркасных областей и/или связанных посредством них (например, в том же порядке, в котором эти CDR и последовательности каркасных областей могут встречаться в полноразмерной последовательности иммуноглобулина, из которой был получен фрагмент).

Однако следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается ни происхождением последовательности ISVD (или нуклеотидной последовательности, используемой для ее экспрессии), ни способом, которым последовательность ISVD или нуклеотидная последовательность создана или получена (или была создана или получена). Таким образом, последовательности ISVD могут представлять собой встречающиеся в природе последовательности (из любого подходящего вида) или синтетические или полусинтетические последовательности. В конкретном, но не ограничивающем аспекте последовательность ISVD представляет собой встречающуюся в природе последовательность (из любого подходящего вида) или синтетическую или полусинтетическую последовательность, в том числе без ограничения "гуманизированные" (как определено в данном документе) последовательности иммуноглобулинов (такие как частично или полностью гуманизированные последовательности мышиных или кроличьих иммуноглобулинов и, в частности, частично или полностью гуманизированные последовательности V_HH), "камелизированные" (как определено в данном документе) последовательности иммуноглобулинов, а также последовательности иммуноглобулинов, которые были получены с помощью таких методик, как созревание аффинности (например, начиная с синтетических, случайных или встречающихся в природе последовательностей иммуноглобулинов), пересадка CDR, венирование, объединение фрагментов, полученных из различных последовательностей иммуноглобулинов, сборочная ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров и аналогичные методики конструирования последовательностей иммуноглобулинов, хорошо известные специалисту в данной области; или любую подходящую комбинацию любых из вышеперечисленных.

Аналогичным образом, нуклеотидные последовательности могут представлять собой встречающиеся в природе нуклеотидные последовательности или синтетические или полусинтетические последовательности и могут представлять собой, например, последовательности, выделенные с помощью ПЦР из подходящей встречающейся в природе матрицы (например, ДНК или РНК, выделенных из клетки), нуклеотидные последовательности, которые были выделены из библиотеки (и, в частности, экспрессионной библиотеки), нуклеотидные последовательности, которые были получены путем введения мутаций во встречающуюся в природе нуклеотидную последовательность (с использованием любой подходящей широко известной методики, такой как ПЦР с ошибками спаривания), нуклеотидные последовательности, которые были получены с помощью ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров, или нуклеотидные последовательности, которые были получены с использованием широко известных методик синтеза ДНК.

Как описано выше, ISVD может представлять собой Nanobody® или его подходящий фрагмент. Для общего описания Nanobody® дается ссылка на дополнительное описание ниже, а также на предшествующий уровень техники, цитируемый в данном документе. В этом отношении, однако, следует отметить, что это описание и предшествующий уровень техники главным образом описывают Nanobody из так называемого "класса V_H3" (т. е. Nanobody с высокой степенью гомологии последовательностей с последовательностями зародышевого типа человека класса V_H3, такими как DP-47, DP-51 или DP-29). Однако следует отметить, что в настоящем изобретении в самом широком смысле может, как правило, применяться любой тип Nanobody и, например, также применяются Nanobody, принадлежащие к так называемому "классу V_H4" (т. е. Nanobody с высокой степенью гомологии последовательностей с последовательностями зародышевого типа человека класса V_H4, такими как DP-78), как, например, описано в WO 2007/118670.

Как правило, Nanobody (в частности последовательности V_HH, в том числе (частично) гуманизированные последовательности V_HH и камелизированные последовательности V_H) могут характеризоваться наличием одного или нескольких "характерных остатков" (как описано в данном документе) в одной или нескольких последовательностях каркасных областей (опять же, как описано в данном документе). Таким образом, обычно Nanobody может быть определено как последовательность иммуноглобулина с (общей) структурой

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям от 1 до 4 соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к определяющим комплементарность областям от 1 до 3 соответственно, и в которой один или несколько характерных остатков дополнительно определены в данном документе.

В частности, Nanobody может представлять собой последовательность иммуноглобулина с (общей) структурой

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям от 1 до 4 соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к определяющим комплементарность областям от 1 до 3 соответственно, и в которой последовательности каркасных областей дополнительно определены в данном документе.

Более конкретно, Nanobody может представлять собой последовательность иммуноглобулина с (общей) структурой

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4,

в которой FR1-FR4 относятся к каркасным областям от 1 до 4 соответственно, и в которой CDR1-CDR3 относятся к определяющим комплементарность областям от 1 до 3 соответственно, и в которой:

один или несколько аминокислотных остатков в положениях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и 108 согласно нумерации по Kabat выбраны из характерных остатков, упомянутых в таблице A-0 ниже.

Таблица A-0. Характерные остатки в Nanobody

Положение V_H3 человека Характерные остатки 11 L, V; преимущественно L L, S, V, M, W, F, T, Q, E, A, R, G, K, Y, N, P, I; предпочтительно L 37 V, I, F; обычно V F⁽¹⁾, Y, V, L, A, H, S, I, W, C, N, G, D, T, P, предпочтительно F⁽¹⁾ или Y 44⁽⁸⁾ G E⁽³⁾, Q⁽³⁾, G⁽²⁾, D, A, K, R, L, P, S, V, H, T, N, W, M, I;
предпочтительно G⁽²⁾, E⁽³⁾ или Q⁽³⁾; наиболее предпочтительно G⁽²⁾ или Q⁽³⁾_. 45⁽⁸⁾ L L⁽²⁾, R⁽³⁾, P, H, F, G, Q, S, E, T, Y, C, I, D, V; предпочтительно L⁽²⁾ или R⁽³⁾ 47⁽⁸⁾ W, Y F⁽¹⁾, L⁽¹⁾ или W⁽²⁾, G, I, S, A, V, M, R, Y, E, P, T, C, H, K, Q, N, D; предпочтительно W⁽²⁾, L⁽¹⁾ или F⁽¹⁾ 83 R или K; обычно R R, K⁽⁵⁾, T, E⁽⁵⁾, Q, N, S, I, V, G, M, L, A, D, Y, H; предпочтительно K или R; наиболее предпочтительно K 84 A, T, D; преимущественно A P⁽⁵⁾, S, H, L, A, V, I, T, F, D, R, Y, N, Q, G, E; предпочтительно P 103 W W⁽⁴⁾, R⁽⁶⁾, G, S, K, A, M, Y, L, F, T, N, V, Q, P⁽⁶⁾, E, C; предпочтительно W 104 G G, A, S, T, D, P, N, E, C, L; предпочтительно G 108 L, M или T; предпочтительно L Q, L⁽⁷⁾, R, P, E, K, S, T, M, A, H; предпочтительно Q или L⁽⁷⁾ Примечания.
(1) В частности, но не исключительно, в комбинации с KERE или KQRE в положениях 43-46.
(2) Обычно как GLEW в положениях 44-47.
(3) Обычно как KERE или KQRE в положениях 43-46, например, как KEREL, KEREF, KQREL, KQREF, KEREG, KQREW или KQREG в положениях 43-47. В качестве альтернативы возможны также такие последовательности, как TERE (например, TEREL), TQRE (например, TQREL), KECE (например, KECEL или KECER), KQCE (например, KQCEL), RERE (например, REREG), RQRE (например, RQREL, RQREF или RQREW), QERE (например, QEREG), QQRE (например, QQREW, QQREL или QQREF), KGRE (например, KGREG), KDRE (например, KDREV). Некоторые другие возможные, но менее предпочтительные последовательности включают, например, DECKL и NVCEL.
(4) Одновременно с GLEW в положениях 44-47 и KERE или KQRE в положениях 43-46.
(5) Часто как KP или EP в положениях 83-84 встречающихся в природе V_HH-доменов.
(6) В частности, но не исключительно, в комбинации с GLEW в положениях 44-47.
(7) При условии, что если положения 44-47 представляют собой GLEW, то положение 108 всегда представляет собой Q в (негуманизированных) последовательностях V_HH, которые также содержат W в положении 103.
(8) Группа GLEW также содержит GLEW-подобные последовательности в положениях 44-47, такие как, например, GVEW, EPEW, GLER, DQEW, DLEW, GIEW, ELEW, GPEW, EWLP, GPER, GLER и ELEW.

В настоящем изобретении, среди прочего, используются ISVD, которые могут связываться с IL-13 или TSLP. В контексте настоящего изобретения выражение "связывающийся с" определенной молекулой-мишенью имеет обычное значение в данной области техники, понятное применительно к антителам и их соответствующим антигенам.

Полиспецифический поливалентный полипептид по настоящему изобретению может содержать два или более ISVD, специфично связывающихся с IL-13, и два или более ISVD, специфично связывающихся с TSLP. Например, полипептид может содержать два ISVD, которые специфично связываются с IL-13, и два ISVD, которые специфично связываются с TSLP.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один ISVD может функционально блокировать свою молекулу-мишень. Например, нацеливающие фрагменты могут блокировать взаимодействие между IL-13 и IL-13Rα1 (альфа-1-субъединицей рецептора интерлейкина-13) и/или взаимодействие между комплексом IL-13/IL-13Rα1 и IL-4Rα (альфа-субъединицей рецептора интерлейкина-4) или могут блокировать взаимодействие между TSLP и TSLPR (рецептором TSLP) и/или комплексом TSLP/TSLPR и IL-7Rα (альфа-субъединицей рецептора интерлейкина-7). Соответственно, в одном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению содержит по меньшей мере два ISVD, которые специфично связываются с IL-13 и функционально блокируют его взаимодействие с IL-13Rα1 и/или взаимодействие между комплексом IL-13/IL-13Rα1 и IL-4Rα, и два ISVD, которые специфично связываются с TSLP и функционально блокируют его взаимодействие с TSLPR и/или взаимодействие между комплексом TSLP/TSLPR и IL-7Rα.

ISVD, применяемые в настоящем изобретении, образуют часть полипептида по настоящему изобретению, который содержит по меньшей мере четыре ISVD или состоит из них, так что полипептид может специфично связываться с IL-13 и TSLP.

Соответственно, молекулами-мишенями для по меньшей мере четырех ISVD, используемых в полипептиде по настоящему изобретению, являются IL-13 и TSLP. Примерами являются IL-13 и TSLP млекопитающих. Помимо IL-13 человека (номер доступа в UniProt P35225) и TSLP человека (номер доступа в UniProt Q969D9), версии из других видов также являются подходящими для настоящего изобретения, например, IL-13 и TSLP мышей, крыс, кроликов, кошек, собак, коз, овец, лошадей, свиней, приматов, отличных от человека, таких как яванские макаки (также обозначаемые в данном документе как "cyno"), или верблюдовых, таких как лама или альпака.

Конкретные примеры ISVD, специфично связывающихся с IL-13, которые можно применять в настоящем изобретении, описаны в следующих пунктах A и B.

A. ISVD, который специфично связывается с IL-13 человека и содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 7;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 12; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17.

В одном варианте осуществления ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17.

B. ISVD, который специфично связывается с IL-13 человека и содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 8;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 13; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18.

Примеры такого ISVD, который специфично связывается с IL-13 человека, содержат одну или несколько или все из каркасных областей, указанных для конструкции 4B02 или 4B06 соответственно в таблице A-2 (в дополнение к CDR, определенным в предыдущих пунктах А и B соответственно). В одном варианте осуществления он представляет собой ISVD, содержащий полную аминокислотную последовательность конструкции 4B02 или конструкции 4B06 (SEQ ID NO: 2 и 3 соответственно; см. таблицы A-1 и A-2) или состоящий из нее.

В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность ISVD, специфично связывающихся с IL-13 человека, может характеризоваться более чем 90%, как, например, более чем 95% или более чем 99%, идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или 3 соответственно, где CDR определены в предыдущем пункте А или B соответственно. В одном варианте осуществления ISVD, специфично связывающийся с IL-13, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 или 3 или состоит из нее.

Если такой ISVD, связывающийся с IL-13, имеет 2 или 1 аминокислотное отличие в по меньшей мере одной CDR относительно соответствующей эталонной последовательности CDR (пункт A или B выше), то ISVD характеризуется по меньшей мере половинной аффинностью связывания или по меньшей мере такой же аффинностью связывания с IL-13 человека по сравнению с конструкцией 4B02 или 4B06, представленной под SEQ ID NO: 2 или 3 соответственно, где аффинность связывания измеряется с помощью одного и того же способа, такого как SPR.

Конкретные примеры ISVD, специфично связывающихся с TSLP, которые можно применять в настоящем изобретении, описаны в следующих пунктах C и D.

C. ISVD, который специфично связывается с TSLP человека и содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 9;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 14; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19.

В одном варианте осуществления ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.

D. ISVD, который специфично связывается с TSLP человека и содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 11;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 16; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

Примеры такого ISVD, который специфично связывается с TSLP человека, содержат одну или несколько или все из каркасных областей, указанных для конструкций 501A02 и 529F10 соответственно в таблице A-2 (в дополнение к CDR, определенным в предыдущих пунктах C и D). В одном варианте осуществления он представляет собой ISVD, содержащий полную аминокислотную последовательность конструкции 501A02 или 529F10 (SEQ ID NO: 4 или 6, см. таблицы A-1 и A-2) или состоящий из нее.

В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность ISVD, специфично связывающихся с TSLP человека, может характеризоваться более чем 90%, как, например, более чем 95% или более чем 99%, идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4 или 6 соответственно, где CDR определены в предыдущем пункте C или D. В одном варианте осуществления ISVD, связывающийся с TSLP, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4 или 6 или состоит из нее.

Если такой ISVD, связывающийся с TSLP человека, имеет 2 или 1 аминокислотное отличие в по меньшей мере одной CDR относительно соответствующей эталонной последовательности CDR (пункт C или D выше), то ISVD характеризуется по меньшей мере половинной аффинностью связывания или по меньшей мере такой же аффинностью связывания с TSLP человека по сравнению с конструкцией 501A02 или 529F10, представленной под SEQ ID NO: 4 и 6 соответственно, где аффинность связывания измеряется с помощью одного и того же способа, такого как SPR.

В одном варианте осуществления каждый из ISVD, определенных выше в пунктах A-D, содержится в полипептиде по настоящему изобретению.

Такой полипептид по настоящему изобретению, содержащий каждый из ISVD, определенных выше в пунктах A-D, характеризуется по меньшей мере половинной аффинностью связывания или по меньшей мере такой же аффинностью связывания с IL-13 человека и с TSLP человека по сравнению с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1, где аффинность связывания измеряется с помощью одного и того же способа, такого как SPR.

SEQ ID NO, упомянутые в приведенных выше пунктах A-D и в пункте E ниже (см. раздел 5.4 "Увеличение периода полужизни (in vivo)"), указаны на основании определения CDR в соответствии с определением AbM (см. таблицу A-2). Следует отметить, что SEQ ID NO, определяющие те же CDR в соответствии с определением согласно Kabat (см. таблицу A-2.1), могут аналогичным образом использоваться в приведенных выше пунктах A-D и в пункте E ниже (см. раздел 5.4 "Увеличение периода полужизни (in vivo)").

Соответственно, конкретные примеры ISVD, специфично связывающихся с IL-13 или TSLP, которые можно применять в настоящем изобретении, описаны выше с использованием определения AbM, а также могут быть описаны с использованием определения согласно Kabat, как изложено в пунктах A’-D’ ниже.

A'. ISVD, который специфично связывается с IL-13 человека и содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 37 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 37;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 42 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 42; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 17.

В одном варианте осуществления ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 37, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 42, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17.

B'. ISVD, который специфично связывается с IL-13 человека и содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 38;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 43 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 43; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 18.

В одном варианте осуществления ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 43, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18.

Примеры таких ISVD, которые специфично связываются с IL-13 человека, содержат одну или несколько или все из каркасных областей, указанных для конструкции 4B02 или 4B06 соответственно в таблице A-2-1 (в дополнение к CDR, определенным в предыдущих пунктах А' и B’ соответственно). В одном варианте осуществления он представляет собой ISVD, содержащий полную аминокислотную последовательность конструкции 4B02 или конструкции 4B06 (SEQ ID NO: 2 и 3 соответственно; см. таблицы A-1 и A-2-1) или состоящий из нее.

C'. ISVD, который специфично связывается с TSLP человека и содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 39;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 44 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 44; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 19.

В одном варианте осуществления ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 44, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.

D'. ISVD, который специфично связывается с TSLP человека и содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 41 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 41;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 46; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 41, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21.

Примеры таких ISVD, которые специфично связываются с TSLP человека, содержат одну или несколько или все из каркасных областей, указанных для конструкций 501A02 и 529F10 соответственно в таблице A-2-1 (в дополнение к CDR, определенным в предыдущих пунктах C’ и D’). В одном варианте осуществления он представляет собой ISVD, содержащий полную аминокислотную последовательность конструкции 501A02 или 529F10 (SEQ ID NO: 4 или 6, см. таблицы A-1 и A-2-1) или состоящий из нее.

Процент "идентичности последовательностей" между первой аминокислотной последовательностью и второй аминокислотной последовательностью может быть рассчитан путем деления [количества аминокислотных остатков в первой аминокислотной последовательности, идентичных аминокислотным остаткам в соответствующих положениях во второй аминокислотной последовательности] на [общее количество аминокислотных остатков в первой аминокислотной последовательности] и умножения на [100%], где каждая делеция, вставка, замена или добавление аминокислотного остатка во второй аминокислотной последовательности по сравнению с первой аминокислотной последовательностью считается отличием по одному аминокислотному остатку (т. е. по одному положению).

Обычно для целей определения процента "идентичности последовательностей" между двумя аминокислотными последовательностями в соответствии со способом расчета, изложенным в данном документе выше, аминокислотную последовательность с наибольшим количеством аминокислотных остатков берут в качестве "первой" аминокислотной последовательности, а другую аминокислотную последовательность берут в качестве "второй" аминокислотной последовательности.

Используемое в данном документе выражение "аминокислотное отличие" относится к делеции, вставке или замене одного аминокислотного остатка по сравнению с эталонной последовательностью. В одном варианте осуществления "аминокислотное отличие" представляет собой замену.

В одном варианте осуществления аминокислотные замены являются консервативными заменами. Такие консервативные замены представляют собой замены, при которых одна аминокислота из следующих групп (a) - (е) заменена другим аминокислотным остатком из той же самой группы: (а) небольшие алифатические, неполярные или слабополярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (b) полярные, отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (с) полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (d) крупные алифатические, неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys; и (е) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp.

В одном варианте осуществления консервативные замены являются следующими: Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gln; Ile на Leu или на Val; Leu на Ile или на Val; Lys на Arg, на Gln или на Glu; Met на Leu, на Tyr или на Ile; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp и/или Phe на Val, на Ile или на Leu.

5.3 Специфичность

Термины "специфичность", "специфично связывающийся" или "специфичное связывание" относятся к количеству различных молекул-мишеней, таких как антигены, из одного и того же организма, с которыми конкретная связывающая единица, такая как ISVD, может связываться с достаточно высокой аффинностью (см. ниже). Термины "специфичность", "специфично связывающийся" или "специфичное связывание" используются в данном документе взаимозаменяемо с терминами "селективность", "селективно связывающийся" или "селективное связывание". Связывающие единицы, такие как ISVD, специфично связываются со своими определенными мишенями.

Специфичность/селективность связывающей единицы может быть определена на основании аффинности. Аффинность означает силу или стабильность молекулярного взаимодействия. Аффинность обычно представляют в виде KD, или константы диссоциации, измеряемой в единицах моль/литр (или М). Аффинность можно также выразить в виде константы ассоциации KA, которая равна 1/KD и измеряется в единицах (моль/литр)^-1 (или M^-1).

Аффинность представляет собой показатель силы связывания между фрагментом и связывающим участком в молекуле-мишени: чем ниже значение KD, тем сильнее сила связывания между молекулой-мишенью и нацеливающимся фрагментом.

Обычно связывающие единицы, применяемые в настоящем изобретении, такие как ISVD, будут связываться со своими мишенями с константой диссоциации (KD), составляющей от 10^-5 до 10^-12 моль/литр или меньше, от 10^-7 до 10^-12 моль/литр или меньше или от 10^-8 до 10^-12 моль/литр (т. e. с константой ассоциации (KA), составляющей от 10⁵ до 10¹² литр/моль или больше, от 10⁷ до 10¹² литр/моль или больше или от 10⁸ до 10¹² литр/моль).

Любое значение KD, составляющее более 10^-4 моль/литр (или любое значение KA ниже 10⁴ литр/моль), как правило, считается указывающим на неспецифичное связывание.

KD для биологических взаимодействий, таких как связывание последовательностей иммуноглобулинов с антигеном, которые считаются специфичными, обычно находятся в диапазоне от 10^-5 моль/литр (10000 нM или 10 мкM) до 10^-12 моль/литр (0,001 нM или 1 пM) или меньше.

Соответственно, специфическое/селективное связывание может означать, что при использовании одного и того же способа измерения, например, SPR, связывающая единица (или полипептид, содержащий ее) связывается с IL13 и/или TSLP со значением KD, составляющим от 10^-5 до 10^-12 моль/литр или меньше, и связывается с родственными цитокинами со значением KD, составляющим более 10^-4 моль/литр. Примером мишеней, родственных IL13, является IL4 человека. Примером цитокинов, родственных TSLP, является IL7 человека. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере два ISVD, содержащихся в полипептиде, связываются с IL13 со значением KD, составляющим от 10^-5 до 10^-12 моль/литр или меньше, и связываются с IL4 из того же вида со значением KD, составляющим более 10^-4 моль/литр, и по меньшей мере два ISVD, содержащихся в полипептиде, связываются с TSLP со значением KD, составляющим от 10^-5 до 10^-12 моль/литр или меньше, и связываются с IL7 человека из того же вида со значением KD, составляющим более 10^-4 моль/литр.

Таким образом, полипептид по настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере половинной аффинностью связывания или по меньшей мере такой же аффинностью связывания с IL13 человека и с TSLP человека по сравнению с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1, где аффинность связывания измеряется с помощью одного и того же способа, такого как SPR.

Специфичное связывание с определенной мишенью из определенного вида не исключает того, что связывающая единица также может специфично связываться с аналогичной мишенью из другого вида. Например, специфичное связывание с IL13 человека не исключает того, что связывающая единица (или полипептид, содержащий ее) может также специфично связываться с IL13 яванских макаков. Аналогичным образом, например, специфичное связывание с TSLP человека не исключает того, что связывающая единица (или полипептид, содержащий ее) может также специфично связываться с TSLP яванских макаков ("cyno").

Специфичное связывание связывающей единицы со своей определенной мишенью можно определить любым подходящим широко известным способом, в том числе, например, с помощью анализа по Скэтчарду и/или анализов конкурентного связывания, таких как радиоиммунологические анализы (RIA), иммуноферментные анализы (ЕIA) и конкурентные сэндвич-анализы, и их различных вариантов, широко известных из уровня техники; а также других методик, упомянутых в данном документе.

Константа диссоциации может быть фактической или кажущейся константой диссоциации, как будет понятно специалисту в данной области. Способы определения константы диссоциации будут понятны специалисту в данной области и включают, например, методики, упомянутые ниже. В этом отношении также будет понятно, что может не быть возможным измерение констант диссоциации, составляющих более 10^-4 моль/литр или 10^-3 моль/литр (например, 10^-2 моль/литр). Как также будет понятно специалисту в данной области, (фактическую или кажущуюся) константу диссоциации необязательно можно рассчитать, исходя из (фактической или кажущейся) константы ассоциации (KA), с помощью отношения [KD=1/KA].

Аффинность молекулярного взаимодействия между двумя молекулами можно измерить с помощью различных широко известных методик, таких как хорошо известная биосенсорная методика поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (см., например, Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559). Используемый в данном документе термин "поверхностный плазмонный резонанс" относится к оптическому явлению, которое позволяет анализировать биоспецифические взаимодействия в режиме реального времени посредством выявления изменений концентраций белка в матрице биосенсора, где одна молекула иммобилизована на чипе биосенсора, а другая молекула пропускается над иммобилизованной молекулой в условиях потока, с получением измеряемых показателей k_on, k_off и, следовательно, значений K_D (или K_A). Это может осуществляться, например, с использованием хорошо известной системы BIAcore® (BIAcore International AB, компания GE Healthcare, Уппсала, Швеция, и Пискатауэй, Нью-Джерси). Для дополнительных описаний см. Jonsson et al. (1993, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26), Jonsson et al. (1991 Biotechniques 11: 620-627), Johnsson et al. (1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131), и Johnnson et al. (1991, Anal. Biochem. 198: 268-277).

Другой хорошо известной биосенсорной методикой для определения значений аффинности биомолекулярных взаимодействий является биослойная интерферометрия (BLI) (см., например, Abdiche et al. 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217). Термин "биослойная интерферометрия" или "BLI", используемый в данном документе, относится к безметочной оптической методике, в которой анализируется интерференционная картина света, отраженного от двух поверхностей: внутреннего эталонного слоя (эталонный пучок) и слоя иммобилизованного белка на наконечнике биосенсора (сигнальный пучок). Изменение количества молекул, связанных с наконечником биосенсора, приводит к сдвигу в интерференционной картине, о котором сообщается как о сдвиге длины волны (нм), величина которого является непосредственным показателем количества молекул, связанных с поверхностью наконечника биосенсора. Поскольку взаимодействия можно измерить в режиме реального времени, можно определить значения скорости ассоциации и диссоциации и аффинности. BLI можно, например, осуществлять с использованием хорошо известных систем Octet® (ForteBio, подразделение Pall Life Sciences, Менло-Парк, США).

В качестве альтернативы значения аффинности можно измерить в анализе кинетического исключения (KinExA) (см., например, Drake et al. 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43) с использованием платформы KinExA® (Sapidyne Instruments Inc, Бойсе, США). Используемый в данном документе термин "KinExA" относится к способу с использованием растворов для измерения истинной равновесной аффинности связывания и кинетики немодифицированных молекул. Уравновешенные растворы комплекса антитело/антиген пропускают через колонку с гранулами, предварительно покрытыми антигеном (или антителом), позволяя свободному антителу (или антигену) связаться с покрывающей молекулой. Выявление захваченного таким образом антитела (или антигена) осуществляется с помощью флуоресцентно меченного белка, связывающего антитело (или антиген).

Система иммунологического анализа GYROLAB® представляет собой платформу для автоматизированного биологического анализа и быстрой обработки образцов (Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74).

5.4 Увеличение периода полужизни (in vivo)

Полипептид может дополнительно содержать одну или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, необязательно связанных посредством одного или нескольких пептидных линкеров, при этом указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида (in vivo) по сравнению с соответствующим полипептидом без указанных одной или нескольких других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц. Увеличение периода полужизни in vivo означает, например, что полипептид характеризуется увеличенным периодом полужизни у млекопитающего, такого как субъект-человек, после введения. Период полужизни может быть выражен, например, как t1/2-бета.

Тип групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, как правило, не ограничен и может быть выбран, например, из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, белков сыворотки крови или их фрагментов, связывающих единиц, которые могут связываться с белками сыворотки крови, Fc-части и небольших белков или пептидов, которые могут связываться с белками сыворотки крови.

Более конкретно, указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, которые обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида, могут быть выбраны из группы, состоящей из связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточным альбумином, таким как сывороточный альбумин человека, или сывороточным иммуноглобулином, таким как IgG. В одном варианте осуществления указанные одна или несколько других связывающих единиц, которые обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида, представляют собой связывающую единицу, которая может связываться с сывороточным альбумином человека. В одном варианте осуществления связывающая единица представляет собой ISVD.

Например, в WO 04/041865 описываются Nanobody®, связывающиеся с сывороточным альбумином (и, в частности, с сывороточным альбумином человека), которые могут быть связаны с другими белками (такими как одно или несколько других Nanobody, связывающихся с желаемой мишенью) с целью увеличения периода полужизни указанного белка.

В международной заявке WO 06/122787 описывается ряд Nanobody®, направленных против сывороточного альбумина (человека). Эти Nanobody® включают Nanobody®, называемое Alb-1 (SEQ ID NO: 52 в WO 06/122787), и его гуманизированные варианты, такие как Alb-8 (SEQ ID NO: 62 в WO 06/122787). Опять же, их можно применять для увеличения периода полужизни терапевтических белков и полипептидов и других терапевтических объектов или фрагментов.

Кроме того, в WO2012/175400 описывается дополнительная улучшенная версия Alb-1, называемая Alb-23.

В одном варианте осуществления полипептид содержит фрагмент, связывающий сывороточный альбумин, выбранный из Alb-1, Alb-3, Alb-4, Alb-5, Alb-6, Alb-7, Alb-8, Alb-9, Alb-10 и Alb-23. В одном варианте осуществления фрагмент, связывающий сывороточный альбумин, представляет собой Alb-8 или Alb-23 или их варианты, как показано на страницах 7-9 в WO 2012/175400, и средства, связывающие альбумин, описанные в WO 2012/175741, WO2015/173325, WO2017/080850, WO2017/085172, WO2018/104444, WO2018/134235, WO2018/134234. Некоторые средства, связывающие сывороточный альбумин, также показаны в таблице A-4. В одном варианте осуществления дополнительный компонент полипептида по настоящему изобретению описан в пункте E.

E. ISVD, который связывается с сывороточным альбумином человека и содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 10;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 15; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 20.

В одном варианте осуществления ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.

Примеры такого ISVD, который связывается с сывороточным альбумином человека, содержат одну или несколько или все из каркасных областей, указанных для конструкции ALB23002 в таблице A-2 (в дополнение к CDR, определенным в предыдущем пункте Е). В одном варианте осуществления он представляет собой ISVD, содержащий полную аминокислотную последовательность конструкции ALB23002 (SEQ ID NO: 5, см. таблицы A-1 и A-2) или состоящий из нее.

Пункт Е также может быть описан с использованием определения согласно Kabat следующим образом.

E'. ISVD, который связывается с сывороточным альбумином человека и содержит:

i. CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 40;

ii. CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 45; и

iii. CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 20.

В одном варианте осуществления ISVD содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.

Примеры такого ISVD, который связывается с сывороточным альбумином человека, содержат одну или несколько или все из каркасных областей, указанных для конструкции ALB23002 в таблице A-2-1 (в дополнение к CDR, определенным в предыдущем пункте E'). В одном варианте осуществления он представляет собой ISVD, содержащий полную аминокислотную последовательность конструкции ALB23002 (SEQ ID NO: 5, см. таблицы A-1 и A-2-1) или состоящий из нее.

В дополнительном варианте осуществления аминокислотная последовательность ISVD, связывающегося с сывороточным альбумином человека, может характеризоваться более чем 90%, как, например, более чем 95% или более чем 99%, идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5, где CDR определены в предыдущем пункте Е или E'. В одном варианте осуществления ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5.

Если такой ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, имеет 2 или 1 аминокислотное отличие в по меньшей мере одной CDR относительно соответствующей эталонной последовательности CDR (пункт E выше), то ISVD характеризуется по меньшей мере половинной аффинностью связывания или по меньшей мере такой же аффинностью связывания с сывороточным альбумином человека по сравнению с конструкцией ALB23002, представленной под SEQ ID NO: 5, где аффинность связывания измеряется с помощью одного и того же способа, такого как SPR.

В одном варианте осуществления, если такой ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, имеет С-концевое положение, он демонстрирует С-концевое аланиновое (А) или глициновое (G) удлинение. В одном варианте осуществления такой ISVD выбран из SEQ ID NO: 59, 60, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69 и 71 (см. таблицу A-4 ниже). В одном варианте осуществления ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, имеет положение, отличное от С-концевого положения (т. е. не является С-концевым ISVD полипептида по настоящему изобретению). В одном варианте осуществления такой ISVD выбран из SEQ ID NO: 5, 57, 58, 61 и 63 (см. таблицу A-4 ниже).

5.5 Молекулы нуклеиновых кислот

Также предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по настоящему изобретению.

"Молекула нуклеиновой кислоты" (используется взаимозаменяемо с "нуклеиновой кислотой") представляет собой цепь нуклеотидных мономеров, связанных друг с другом посредством фосфатного остова с образованием нуклеотидной последовательности. Нуклеиновую кислоту можно применять для трансформации/трансфекции клетки-хозяина или организма-хозяина, например, для экспрессии и/или продуцирования полипептида. Подходящие хозяева или клетки-хозяева для целей продуцирования будут понятны специалисту в данной области и могут, например, представлять собой любую подходящую грибную, прокариотическую или эукариотическую клетку или линию клеток или любой подходящий грибной, прокариотический или эукариотический организм. Хозяин или клетка-хозяин, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по настоящему изобретению, также охватываются настоящим изобретением.

Нуклеиновая кислота может представлять собой, например, ДНК, РНК или их гибрид и может содержать модифицированные (например, химически) нуклеотиды, такие как PNA. Она может быть одно- или двухнитевой. В одном варианте осуществления она представлена в форме двухнитевой ДНК. Например, нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут представлять собой геномную ДНК, кДНК.

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть приготовлены или получены широко известным способом и/или могут быть выделены из подходящего природного источника. Нуклеотидные последовательности, кодирующие встречающиеся в природе (поли)пептиды, можно, например, подвергнуть сайт-направленному мутагенезу, чтобы получить молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с видоизмененной последовательностью. Кроме того, как будет понятно специалисту в данной области, для получения нуклеиновой кислоты также несколько нуклеотидных последовательностей, таких как по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность, кодирующая нацеливающийся фрагмент, и, например, нуклеиновые кислоты, кодирующие один или несколько линкеров, могут быть связаны друг с другом подходящим образом.

Методики получения нуклеиновых кислот будут понятны специалисту в данной области техники и могут, например, включать без ограничения автоматический синтез ДНК; сайт-направленный мутагенез; объединение двух или более встречающихся в природе и/или синтетических последовательностей (или двух или более их частей), введение мутаций, приводящих к экспрессии усеченного продукта экспрессии; введение одного или нескольких сайтов рестрикции (например, для создания кассет и/или областей, которые можно легко расщепить и/или лигировать с использованием подходящих рестрикционных ферментов) и/или введение мутаций с помощью ПЦР-реакции с использованием одного или нескольких "ошибочно спаривающихся" праймеров.

5.6 Векторы

Также предусмотрен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по настоящему изобретению. Как используется в данном документе, вектор представляет собой носитель, подходящий для переноса генетического материала в клетку. Вектор включает "голые" нуклеиновые кислоты, такие как плазмиды или мРНК, или нуклеиновые кислоты, встроенные в более крупные структуры, такие как липосомы или вирусные векторы.

Векторы обычно содержат по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, которая необязательно связана с одним или несколькими регуляторными элементами, такими как, например, один или несколько подходящих промоторов, энхансеров, терминаторов и т. д. В одном варианте осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии, т. е. вектор, подходящий для экспрессии кодируемого полипептида или конструкции в подходящих условиях, например, при введении вектора в клетку (например, человеческую). В случае векторов на основе ДНК обычно предусматривается наличие элементов для транскрипции (например, промотора и поли(А)-сигнала) и трансляции (например, последовательности Козак).

В одном варианте осуществления в векторе указанная по меньшей мере одна нуклеиновая кислота и указанные регуляторные элементы "функционально связаны" друг с другом, что обычно означает, что они находятся в функциональной взаимосвязи друг с другом. Например, промотор считается "функционально связанным" с кодирующей последовательностью, если указанный промотор способен инициировать или иным образом контролировать/регулировать транскрипцию и/или экспрессию кодирующей последовательности (при этом указанную кодирующую последовательность следует понимать как находящуюся "под контролем" указанного промотора). Как правило, если две нуклеотидные последовательности функционально связаны, они будут представлены в одинаковой ориентации и, как правило, также находиться в одной и той же рамке считывания. Обычно они также будут по существу смежными, хотя это также может и не требоваться.

В одном варианте осуществления любые регуляторные элементы вектора являются таковыми, что они способны обеспечивать свою предполагаемую биологическую функцию в предполагаемых клетке-хозяине или организме-хозяине.

Например, промотор, энхансер или терминатор должны быть "функциональными" в предполагаемых клетке-хозяине или организме-хозяине, что означает, например, что указанный промотор должен быть способен инициировать или иным образом контролировать/регулировать транскрипцию и/или экспрессию нуклеотидной последовательности, например, кодирующей последовательности, с которой он функционально связан.

5.7 Композиции

В настоящем изобретении также предусмотрена композиция, содержащая по меньшей мере один полипептид по настоящему изобретению, по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по настоящему изобретению, или по меньшей мере один вектор, содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты. Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию. Композиция может дополнительно содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель и/или вспомогательное средство и необязательно содержать один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

5.8 Организмы-хозяева

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам или организмам-хозяевам, содержащим полипептид по настоящему изобретению, нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по настоящему изобретению, и/или вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по настоящему изобретению.

Подходящие клетки-хозяева или организмы-хозяева понятны специалисту в данной области и представляют собой, например, любую подходящую грибную, прокариотическую или эукариотическую клетку или линию клеток или любой подходящий грибной, прокариотический или эукариотический организм. Конкретные примеры включают клетки HEK293, клетки CHO, Escherichia coli или Pichia pastoris. В одном варианте осуществления хозяином является Pichia pastoris.

5.9 Способы и пути применения полипептида

В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения полипептида по настоящему изобретению. Способ может включать трансформацию/трансфекцию клетки-хозяина или организма-хозяина нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, обеспечение экспрессии полипептида в организме хозяина, за которыми необязательно следуют одна или несколько стадий выделения и/или очистки. В частности, способ может включать:

a) обеспечение экспрессии в подходящих клетке-хозяине или организме-хозяине или в другой подходящей системе экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид; за которым необязательно следует:

b) выделение и/или очистка полипептида.

Подходящие клетки-хозяева или организмы-хозяева для целей продуцирования будут понятны специалисту в данной области и могут, например, представлять собой любую подходящую грибную, прокариотическую или эукариотическую клетку или линию клеток или любой подходящий грибной, прокариотический или эукариотический организм. Конкретные примеры включают клетки HEK293, клетки CHO, Escherichia coli или Pichia pastoris. В одном варианте осуществления хозяином является Pichia pastoris.

Полипептид по настоящему изобретению, молекула нуклеиновой кислоты или вектор, как описано, или композиция, содержащая полипептид по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, применимы в качестве лекарственного препарата.

Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрены полипептид по настоящему изобретению, молекула нуклеиновой кислоты или вектор, как описано, или композиция, содержащая полипептид по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, для применения в качестве лекарственного препарата.

Также предусмотрены полипептид по настоящему изобретению, молекула нуклеиновой кислоты или вектор, как описано, или композиция, содержащая полипептид по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, для применения в (профилактическом или терапевтическом) лечении воспалительного заболевания.

Кроме того, предусмотрен (профилактический и/или терапевтический) способ лечения воспалительного заболевания, где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества полипептида по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, как описано, или композиции, содержащей полипептид по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор.

Кроме того, предусмотрено применение полипептида по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, как описано, или композиции, содержащей полипептид по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, при получении фармацевтической композиции. В одном варианте осуществления полученная фармацевтическая композиция предназначена для лечения воспалительного заболевания.

Воспалительное заболевание представляет собой воспалительное заболевание 2 типа, такое как атопический дерматит и астма.

"Субъектом", упоминаемым в контексте настоящего изобретения, может являться любое животное и, более конкретно, млекопитающее. Среди млекопитающих можно провести разграничение между людьми и млекопитающими, отличными от человека. Животными, отличными от человека, могут быть, например, животные-компаньоны (например, собаки, кошки), домашний скот (например, крупный рогатый скот, лошади, овцы, козы или свиньи) или животные, обычно используемые в исследовательских целях и/или для продуцирования антител (например, мыши, крысы, кролики, кошки, собаки, козы, овцы, лошади, свиньи, приматы, отличные от человека, такие как яванские макаки, или верблюдовые, такие как лама или альпака).

В контексте профилактических и/или терапевтических целей субъектом может являться любое животное и, более конкретно, любое млекопитающее. В одном варианте осуществления субъектом является субъект-человек.

Вещества (в том числе полипептиды, молекулы нуклеиновых кислот и векторы) или композиции можно вводить субъекту любым подходящим путем введения, например, с помощью энтерального (такого как пероральное или ректальное) или парентерального (такого как накожное, подъязычное, трансбуккальное, назальное, внутрисуставное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, подкожное, чрескожное или чресслизистое) введения. В одном варианте осуществления вещества вводят путем парентерального введения, такого как внутримышечное, подкожное или внутрикожное введение. В одном варианте осуществления используется подкожное введение.

Эффективное количество полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, как описано, или композиции, содержащей полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, можно вводить субъекту для обеспечения предполагаемых результатов лечения.

Может быть введена одна или несколько доз. Если вводится более одной дозы, дозы можно вводить с подходящими интервалами, чтобы довести до максимума эффект полипептида, композиции, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора.

Таблица A-1. Аминокислотные последовательности различных одновалентных структурных элементов V_HH, идентифицированных в составе пятивалентного полипептида F027400161 ("ID" относится к SEQ ID NO, используемому в данном документе)

Название ID Аминокислотная последовательность 4B02 2 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSS 4B06 3 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSS 501A02 4 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAAGIERELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNSENTMYLQMNSLRAEDTGLYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSS ALB23002 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS 529F10 6 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSS

Таблица A-2. Последовательности CDR в соответствии с определением AbM и каркасных областей ("ID" относится к определенному SEQ ID NO)

ID V_HH ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4 2 4B02 22 DVQLVESGGG
VVQPGGSLRL
SCAAS 7 GRTFSS
YRMG 24 WFRQAPGK
EREFVA 12 ALSGD
GYSTY 29 TANSVKGRFTISRDNSK
NTVYLQMNSLRPEDTAL
YYCAA 17 KLQYVSGWS
YDYPY 34 WGQGTL
VTVSS 3 4B06 23 EVQLVESGGGV
VQPGGSLRLSC
AAS 8 GFTFNN
YAMK 25 WVRQAPGK
GLEWVS 13 SITTG
GGSTD 30 YADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRPEDTAL
YYCAN 18 VPFGYYSEH
FSGLSFDY 35 RGQGTLVTVS
S 4 501A02 23 EVQLVESGGGV
VQPGGSLRLSC
AAS 9 GSGFGV
NILY 26 WYRQAAGI
ERELIA 14 SITSG
GITN 31 YVDSVKGRFTISRDNSE
NTMYLQMNSLRAEDTGL
YYCAS 19 RNIFDGTTE 34 WGQGTLV
TVS
S 5 ALB23002 23 EVQLVESGGGV
VQPGGSLRLSC
AAS 10 GFTFRS
FGMS 27 WVRQAPGK
GPEWVS 15 SISGS
GSDTL 32 YADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRPEDTAL
YYCTI 20 GGSLSR 36 SSQGTLV
TVS
S 6 529F10 23 EVQLVESGGGV
VQPGGSLRLSC
AAS 11 GFTFAD
YDYDIG 28 WFRQAPGK
EREGVS 16 CISNR
DGSTY 33 YADSVKGRFTISRDNSK
NTVYLQMNSLRPEDTAL
YYCAV 21 EIHCDDYGVE
NFDFDP 34 WGQGTLV
TVSS

Таблица A-2.1. Последовательности CDR в соответствии с определением согласно Kabat и каркасных областей ("ID" относится к определенному SEQ ID NO)

ID V_HH ID FR1 ID CDR1 ID FR2 ID CDR2 ID FR3 ID CDR3 ID FR4 2 4B02 47 DVQLVESGGG
VVQPGGSLRL
SCAASGRTFS 37 SYRMG 24 WFRQAPGK
EREFVA 42 ALSGDG
YSTYTA
NSVKG 52 RFTISRDNSKNTVYLQ
MNSLRPEDTALYYCAA 17 KLQYVSGWS
YDYPY 34 WGQGTLVT
VSS 3 4B06 48 EVQLVESGGG
VVQPGGSLRL
SCAASGFTFN 38 NYAMK 25 WVRQAPGK
GLEWVS 43 SITTGG
GSTDYA
DSVKG 53 RFTISRDNSKNTLYLQ
MNSLRPEDTALYYCAN 18 VPFGYYSEH
FSGLSFDY 35 RGQGTLVT
VSS 4 501A02 49 EVQLVESGGG
VVQPGGSLRL
SCAASGSGFG 39 VNILY 26 WYRQAAGI
ERELIA 44 SITSGG
ITNYVD
SVKG 54 RFTISRDNSENTMYLQ
MNSLRAEDTGLYYCAS 19 RNIFDGTTE 34 WGQGTLVT
VSS 5 ALB23002 50 EVQLVESGGG
VVQPGGSLRL
SCAASGFTFR 40 SFGMS 27 WVRQAPGK
GPEWVS 45 SISGSG
SDTLYA
DSVKG 55 RFTISRDNSKNTLYLQ
MNSLRPEDTALYYCTI 20 GGSLSR 36 SSQGTLVT
VSS 6 529F10 51 EVQLVESGGG
VVQPGGSLRL
SCAASGFTFA 41 DYDYDI
G 28 WFRQAPGK
EREGVS 46 CISNRD
GSTYYA
DSVKG 56 RFTISRDNSKNTVYLQ
MNSLRPEDTALYYCAV 21 EIHCDDYGV
ENFDFDP 34 WGQGTLVT
VSS

Таблица A-3. Аминокислотные последовательности выбранного поливалентного полипептида ("ID" относится к определенному SEQ ID NO)

Название ID Аминокислотная последовательность F027400161 1 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAAGIERELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNSENTMYLQMNSLRAEDTGLYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSSA

Таблица A-4. Последовательности ISVD, связывающего сывороточный альбумин ("ID" относится к SEQ ID NO, используемому в данном документе)

Название ID Аминокислотная последовательность Alb8 57 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS Alb23 58 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS Alb129 59 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA Alb132 60 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA Alb11 61 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS Alb11 (S110K)-A 62 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA Alb82 63 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS Alb82-A 64 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA Alb82-AA 65 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAA Alb82-AAA 66 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA Alb82-G 67 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSG Alb82-GG 68 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGG Alb82-GGG 69 EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGG Alb23002 5 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS Alb223 71 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA

Таблица A-5. Линкерные последовательности ("ID" относится к SEQ ID NO, используемому в данном документе)

Название ID Аминокислотная последовательность Линкер 3A 72 AAA Линкер 5GS 73 GGGGS Линкер 7GS 74 SGGSGGS Линкер 8GS 75 GGGGSGGS Линкер 9GS 76 GGGGSGGGS Линкер 10GS 77 GGGGSGGGGS Линкер 15GS 78 GGGGSGGGGSGGGGS Линкер 18GS 79 GGGGSGGGGSGGGGSGGS Линкер 20GS 80 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS Линкер 25GS 81 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS Линкер 30GS 82 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS Линкер 35GS 83 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS Линкер 40GS 84 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS Шарнирная область G1 85 EPKSCDKTHTCPPCP Шарнирная область 9GS-G1 86 GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP Верхняя длинная шарнирная область ламы 87 EPKTPKPQPAAA Шарнирная область G3 88 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP

Таблица A-6. Аминокислотные последовательности выбранных моноспецифических поливалентных полипептидов ("ID" относится к определенному SEQ ID NO)

Название ID Аминокислотная последовательность F010700003
[F0107004B06-35GS-F0107004B02]¹ 148 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNRKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVNSRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSS F010700014
[F0107004B02-35GS-F0107004B02]¹ 149 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVNSRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVNSRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSS F010700029
[F0107004B02-35GS-F0107004B06]¹ 150 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVNSRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNRKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSS F010700031
[F0107004B06-35GS-F0107004B06]¹ 151 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNRKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNRKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSS F010703842
[F0107529F10-35GS-F0107501A02]¹ 152 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYTDSVKGRFTISSDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAAGIERELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNAENTMYLQMNSLKAEDTGVYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSS F027400016
[F0107501A02 (E1D, L11V, A14P, E16G, A41P, I43K, E44Q, A74S, E75K, M78L, K83R, A84P, G88A, V89L)*-35GS-529F10)]¹ 153 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAPGKQRELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSS F010700003-SO
[4B06-35GS-4B02(D1E)*]¹ 154 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSS F010700014 -SO
[4B02-35GS-4B02(D1E)*]¹ 155 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSS F010700029-SO
[4B02-35GS-4B06]¹ 156 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSS F010700031-SO
[4B06-35GS-4B06]¹ 157 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSS F010703842-SO
[529F10-35GS-501A02]¹ 158 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAAGIERELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNSENTMYLQMNSLRAEDTGLYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSS F027400016-SO
[501A02-35GS-529F10]¹ 159 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAAGIERELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNSENTMYLQMNSLRAEDTGLYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSS

¹ [] указывает на одновалентные структурные элементы и их связи, которые использовались для двухвалентной конструкции.

*() указывает на аминокислотные замены, введенные в (исходный) одновалентный структурный элемент (например: 4B02(D1E) означает, что одновалентный структурный элемент 4B02 (SEQ ID NO: 2) содержит замену D1E).

6 Примеры

6.1 Получение одновалентных ISVD, специфично связывающихся с IL-13 и TSLP соответственно

6.1.1 Пример 1. Процедуры иммунизации

Трех лам иммунизировали рекомбинантным IL-13 человека (PeproTech, номер по каталогу 200-13, полученный из E. coli) в соответствии со стандартными протоколами с целью индукции гуморального иммунного ответа, зависимого от антител из тяжелых цепей. Кроме того, этих лам подвергали бустерной иммунизации с использованием IL-13 человека/яванского макака из другого источника (Sino Biological, номера по каталогу 10369-HNAC и 11057-CNAH, полученные из клеток млекопитающих).

Еще трех лам иммунизировали рекомбинантным hTSLP-Fc. Кроме того, этих лам подвергали бустерной иммунизации с помощью TSLP-Fc яванского макака. Двух дополнительных лам иммунизировали с помощью hTSLP, чередующегося с TSLP-Fc яванского макака.

Образцы иммунной крови (PBL) брали через равные промежутки времени, и из выделенных B-клеток получали общую РНК. Гуморальный иммунный ответ отслеживали в ходе процесса иммунизации путем сравнения антигенспецифических титров в образце сыворотки крови, собранном до начала иммунизации, и образце сыворотки крови, обычно собираемом после многократного введения антигена. Вкратце, 96-луночные планшеты MaxiSorp покрывали IL-13 человека (Sino Biological, номер по каталогу 10369-HNAC) или TSLP человека. Рекомбинантный TSLP человека коммерчески доступен, например, от R&D Systems (номер по каталогу 1398-TS). После блокирования и добавления разбавленных образцов сыворотки крови присутствие ISVD для IL-13 и к TSLP демонстрировали с использованием конъюгированного с HRP (пероксидазой хрена) козьего антитела к иммуноглобулину ламы (Bethyl Laboratories Inc.) и последующей ферментативной реакции в присутствии субстрата TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидина).

6.1.2 Пример 2. Конструирование библиотеки и отбор с помощью фагового дисплея

Мононуклеарные клетки периферической крови получали из образцов крови с использованием градиента фиколл-гипак в соответствии с инструкциями производителя. Общую РНК, экстрагированную из этих клеток и из лимфатических узлов, использовали в качестве исходного материала для RT-PCR для амплификации фрагментов гена, кодирующего ISVD. Эти фрагменты клонировали в фагмидный вектор pAX212. Фаг получали в соответствии со стандартными протоколами (Antibody Phage Display: Methods and Protocols (First Edition, 2002, O'Brian and Aitken eds., Humana Press, Totowa, NJ)) и хранили после стерилизующей фильтрации при 4°C до дальнейшего применения. Для IL13 сконструировали пять фаговых библиотек с размерами библиотек от 6,1 × 10⁸ до 1,3 × 10⁹ и процентом вставок 87-96%. Для TSLP сконструировали пять фаговых библиотек с размерами библиотек от 4,2 × 10⁸ до 9,8 × 10⁸ и процентом вставок 91-100%.

Для идентификации ISVD, распознающих IL-13 человека и яванского макака, фаговые библиотеки инкубировали с 50 нМ растворимого биотинилированного hIL13-Fc в присутствии IgG из сыворотки крови человека (Sigma, I4506). Комплексы hIL-13-Fc и фага захватывали из раствора на магнитных гранулах, покрытых стрептавидином. После тщательной промывки с помощью PBS/0,05% Tween-20 связавшийся фаг элюировали путем добавления трипсина (1 мг/мл). Продукты, полученные в результате этого отбора в цикле 1, инкубировали с 0,05, 0,5 или 5 нМ растворимого биотинилированного hIL-13-Fc или IL-13-Fc яванского макака. Необогащенные продукты, полученные в результате отбора в цикле 2, дополнительно инкубировали с 0,005, 0,05, 0,5 или 5 нМ растворимого биотинилированного IL-13-Fc человека или яванского макака в цикле 3. Отбирали отдельные клоны из обогащенных продуктов отбора в цикле 2 и цикле 3.

Для идентификации ISVD, распознающих TSLP человека и яванского макака, фаговые библиотеки инкубировали с 50 нМ растворимого биотинилированного hTSLP-Fc в присутствии IgG из сыворотки крови человека (Sigma, I4506), или с 500 нМ биотинилированного hTSLP, или с 500 нМ биотинилированного TSLP яванского макака. Последовательности TSLP человека и яванского макака известны (номер доступа в UniProt Q969D9 и RefSeq NCBI XP_005557555.1 соответственно). Для проведения анализа использовали рекомбинантный белок. Комплексы TSLP и фага захватывали из раствора на магнитных гранулах, покрытых стрептавидином. После тщательной промывки с помощью PBS/0,05% Tween-20 связавшийся фаг элюировали путем добавления трипсина (1 мг/мл). Продукты, полученные в результате этого отбора в цикле 1, инкубировали с 5 нМ растворимого биотинилированного hILTSLP-Fc или TSLP-Fc яванского макака или с 0,5 нМ биотинилированного hTSLP. Продукты, полученные в результате этого отбора в цикле 2, инкубировали с 0,05, 0,5 или 5 нМ растворимого биотинилированного TSLP человека, TSLP-Fc человека или TSLP-Fc яванского макака. После каждого цикла отбирали отдельные клоны из обогащенных продуктов.

Все отдельные клоны выращивали в 96-луночных планшетах с глубокими лунками (объем 1 мл). Экспрессию ISVD индуцировали путем добавления IPTG до конечной концентрации 1 мМ. Периплазматические экстракты получали путем замораживания клеточных осадков и растворения их в 100 мкл PBS. Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования.

В качестве контроля выбранные периплазматические экстракты подвергали скринингу в ELISA в отношении связывания с IL13-Fc человека и яванского макака и с TSLP-Fc соответственно. Оценку проводили на SpectraPlate 384-HB (PerkinElmer) в формате 25 мкл. Антигенами покрывали в течение ночи при 1 мкг/мл в PBS при 4°C. Лунки блокировали раствором казеина (1%). После добавления периплазматических экстрактов в 5-кратном разведении связывание ISVD выявляли с помощью мышиного антитела к FLAG, конъюгированного с HRP (Sigma), и последующей ферментативной реакции в присутствии субстрата esTMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидина).

6.1.3 Пример 3. Скрининг в отношении блокирующих ISVD в периплазматических экстрактах с помощью анализов AlphaScreen с использованием IL13 человека и TSLP человека

Чтобы определить блокирующую способность ISVD, неочищенные периплазматические экстракты подвергали скринингу в различных конкурентных анализах с использованием белков с помощью технологии AlphaScreen (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США). Флуоресценцию измеряли с помощью многометочного планшет-ридера EnVision (PerkinElmer), используя длину волны возбуждения 680 нм и длину волны испускания 520 нм.

В AlphaScreen с бинарным комплексом hIL-13:hIL-13Rα1 исследовали, могут ли ISVD блокировать взаимодействие между hIL-13 и внеклеточным доменом hIL-13Rα1. С этой целью разведения периплазматических экстрактов предварительно инкубировали с биотинилированным hIL-13 (PeproTech, номер по каталогу 200-13). К этой смеси добавляли hIL-13Rα1-hFc (R&D Systems; номер по каталогу 146-IR) и связанные с антителом к hFc акцепторные гранулы и дополнительно инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим добавлением связанных со стрептавидином донорных гранул и дополнительной 1-часовой инкубацией. При образовании бинарного комплекса акцепторные и донорные гранулы сближаются, и при лазерном возбуждении генерируется выявляемый сигнал. Уменьшение сигнала AlphaScreen указывает на то, что связывание биотинилированного hIL-13 с hIL-13Rα1 блокируется с помощью ISVD, присутствующего в периплазматическом экстракте. В аналогичных условиях исследовали, могут ли ISVD блокировать взаимодействие между hTSLP (eBioscience, номер по каталогу 10-8499) и внеклеточным доменом hTSLPR (R&D Systems, номер по каталогу 981-TR).

В AlphaScreen с тройным комплексом hIL-13:hIL-13Rα1:hIL4Rα проверяли, могут ли ISVD блокировать привлечение hIL4Rα в бинарный комплекс hIL13:hIL13Rα1. hIL-13 связывается с hIL-13Rα1, и этот бинарный комплекс привлекает hIL4Rα, что приводит к образованию тройного комплекса hIL-13:hIL-13Rα1:hIL4Rα. Разведения периплазматических экстрактов предварительно инкубировали с hIL-13 (PeproTech, номер по каталогу 200-13) и биотинилированным huIL4Rα (R&D Systems; номер по каталогу 230-4R/CF). К этой смеси добавляли hIL-13Rα1-hFc (R&D Systems; номер по каталогу 146-IR) и связанные с антителом к hFc акцепторные гранулы и дополнительно инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим добавлением связанных со стрептавидином донорных гранул и дополнительной 1-часовой инкубацией. При образовании тройного комплекса акцепторные и донорные гранулы сближаются, и при лазерном возбуждении генерируется выявляемый сигнал. Уменьшение сигнала AlphaScreen указывает на то, что образование тройного комплекса блокируется с помощью ISVD, присутствующего в периплазматическом экстракте. Аналогичным образом исследовали, могут ли ISVD блокировать образование комплекса hTSLP:hTSLPR:hIL7Rα (источник hIL7Rα=Sino Biological, номер по каталогу 1095-H08H).

На основании анализа AlphaScreen (таблица 3 и таблица 4) выбрали и секвенировали ряд блокирующих ISVD (таблица 1 и таблица 2).

Таблица 1. Аминокислотные последовательности функциональных ISVD для IL-13

ID ISVD ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ F0107004B02
(SEQ ID NO: 144) EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVNSRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSS F0107004B06
(SEQ ID NO: 145) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNRKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSS

Таблица 2. Аминокислотные последовательности функциональных ISVD для TSLP

ID ISVD ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ F0107501A02
(SEQ ID NO: 146) EVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAAGIERELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNAENTMYLQMNSLKAEDTGVYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSS F0107529F10
(SEQ ID NO: 147) EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYTDSVKGRFTISSDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSS

6.1.4 Пример 4. Анализ периплазматических экстрактов на IL13 и TSLP с помощью поверхностного плазмонного резонанса

Значения скорости диссоциации в периплазматических экстрактах, содержащих ISVD для IL13 или для TSLP, измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием прибора ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), pH 7,4, с добавлением 0,005% Tween-20 использовали в качестве рабочего буфера, и эксперименты проводили при 25°C.

hIL13-Fc, IL13-Fc яванского макака, hTSLP-Fc и TSLP-Fc яванского макака иммобилизовали на сенсорных чипах ProteOn GLC путем иммобилизации по аминогруппе с использованием EDC и NHS при скорости потока 30 мкл/мин для активации. Белки IL13 вводили при 10 мкг/мл в ацетатном буфере ProteOn с pH 5,0. Белки TSLP вводили при 5 мкг/мл в ацетатном буфере ProteOn с pH 5,5. После иммобилизации поверхности деактивировали этаноламином.

Периплазматические экстракты ISVD-кандидатов разбавляли в 10 раз в PBS-Tween 20 (0,1%) и вводили на 2 минуты при 45 мкл/мин с обеспечением возможности диссоциации в течение 900 секунд. Между различными образцами поверхности регенерировали путем 2-минутного ввода фосфорной кислоты (0,425%) при 45 мкл/мин в случае IL13 или путем 1-минутного ввода смеси глицин с pH 3,0 (5 мМ)/SDS (0,25%) при 45 мкл/мин в случае TSLP. По сенсограммам, полученным для различных периплазматических экстрактов, рассчитывали значения скорости диссоциации.

Анализ скорости диссоциации hIL-13-Fc и IL-13-Fc яванского макака показан в таблице 3.

Таблица 3. Краткое изложение результатов скрининга ISVD для IL-13 F0107004B02 и F0107004B06

ID ISVD AlphaScreen IL-13/IL-13Rα1 (% ингибирования) IL13/IL-13Rα1/IL4Rα
AlphaScreen
(% ингибирования) k_off для hIL-13-Fc (1/с) k_off для IL-13-Fc яванского макака (1/с) F0107004B02 37 61 1,7E-03 1,1E-03 F0107004B06 21 66 6,3E-03 8,9E-03

Анализ скорости диссоциации hTSLP-Fc и TSLP-Fc яванского макака показан в таблице 4.

Таблица 4. Краткое изложение результатов скрининга ISVD для TSLP F0107501A02 и F0107529F10

ID ISVD AlphaScreen TSLP-TSLPR
(% ингибирования) AlphaScreen TSLP-TSLPR-IL7Rα
(% ингибирования) k_off для hTSLP-Fc (1/с) k_off для
TSLP-Fc яванского макака (1/с) F0107501A02 92 97 3,6E-05 6,6E-04 F0107529F10 99 99 <5E-05 1,8E-03

6.1.5 Пример 5. Экспрессия и очистка ISVD для IL-13 и для TSLP

ISVD для IL-13 и ISVD для TSLP отбирали для экспрессии и очистки на основании их блокирующей способности в анализах AlphaScreen и значений скорости диссоциации. Последовательности показаны в таблицах 1 и 2.

ISVD экспрессировали в клетках E. coli TG1 в виде белков, меченных c-myc и His6. Экспрессию индуцировали путем добавления 1 мМ IPTG и обеспечивали ее протекание в течение 3 часов при 37°C. После осаждения культур клеток путем центрифугирования периплазматические экстракты получали путем замораживания-размораживания осадков и ресуспендирования в dPBS. Эти экстракты использовали в качестве исходного материала для аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металлов (IMAC) с использованием колонок с никель-сефарозой TM 6 FF (Atoll). ISVD элюировали из колонки с помощью 250 мМ имидазола и затем обессоливали относительно dPBS. Для клеточных анализов, описанных ниже, эндотоксины удаляли путем гель-фильтрации в присутствии 50 мМ октил-β-D-глюкопиранозида (OGP, Sigma). Уровни эндотоксинов определяли с помощью стандартного LAL-анализа.

6.1.6 Пример 6. Блокирующая способность очищенных ISVD для IL13 и для TSLP в анализах AlphaScreen

Анализы AlphaScreen с бинарными и тройными комплексами, описанные в примере 3, использовали для определения значений IC50 ISVD для IL-13 и для TSLP, очищенных, как описано в примере 5. Вместо разведений периплазматических экстрактов серию разведений каждого очищенного ISVD, начиная с 500 нМ и до 1,8 пМ, предварительно инкубировали с IL-13 или TSLP.

Тестируемые ISVD для IL-13 ингибировали образование тройного комплекса и частично блокировали бинарный комплекс со значениями IC50, показанными в таблице 5.

Таблица 5. Значения IC50 для блокирующих ISVD для IL13, определенные в анализах AlphaScreen с бинарными и тройными комплексами

AlphaScreen IL-13/IL-13Rα1 AlphaScreen IL-13/IL-13Rα1/IL4Rα ID ISVD IC50 (M) % ингибирования IC50 (M) % ингибирования F0107004B02 4,0E-09 82 1,7E-09 100 F0107004B06 6,1E-08 55 6,7E-09 100

Тестируемые ISVD для TSLP полностью ингибировали образование тройного комплекса, а также ингибировали образование бинарного комплекса со значениями IC50, показанными в таблице 6.

Таблица 6. Значения IC50 для блокирующих ISVD для TSLP, определенные в анализах AlphaScreen с бинарными и тройными комплексами

AlphaScreen TSLP-TSLPR AlphaScreen TSLP-TSLPR-IL7Rα ID ISVD IC50 (M) % ингибирования IC50 (M) % ингибирования F0107501A02 3,00E-10 97 3,50E-10 100 F0107529F10 1,30E-11 100 1,80E-10 100

6.1.7 Пример 7. Блокирующая способность очищенных ISVD для IL-13 и для TSLP в клеточных анализах

Ингибирующую активность ISVD для IL-13 определяли в клеточном анализе, отслеживая опосредованную IL-13 пролиферацию клеток TF-1. С этой целью клетки TF-1 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 1/5 HEPES, 1/500 Na-пирувата, 1/500 GlutaMAX и 2 нг/мл рекомбинантного GM-CSF человека. Клетки TF-1 высевали по 40000 клеток на лунку в питательную среду без GM-CSF. Добавляли серию разведений очищенных ISVD для IL-13 или эталонных соединений. После 15-минутной инкубации при 37°C добавляли 200 пМ IL-13 (PeproTech, номер по каталогу 200-13). Через 96 часов пролиферацию клеток TF-1 определяли с помощью раствора CellTiter 96 AQueous One (Promega, номер по каталогу G3580) на многометочном ридере EnVision (PerkinElmer).

ISVD, показанные в таблице 7, ингибируют индуцированную IL-13 пролиферацию TF1.

Таблица 7. Обзор значений IC50 одновалентных ISVD для IL-13 в анализе индуцированной с помощью IL-13 пролиферации TF-1

Соединение IC50 (M) F0107004B02 2,7E-08 F0107004B06 1,0E-05 Эталонное mAb2 к hIL-13 4,1E-10 Эталонное mAb3 к hIL-13 9,2E-11 Эталонное mAb1 к hIL-13 2,2E-11

Блокирующую активность ISVD для TSLP определяли в клеточном анализе, отслеживая опосредованную TSLP пролиферацию клеток BaF3, трансфицированных плазмидами, кодирующими hTSLPR и hIL7Ra. Клетки высевали при плотности 20000 клеток/лунка в питательную среду RPMI 1640 в белые 96-луночные планшеты, обработанные для культур клеток. Добавляли серию разведений ISVD для TSLP с последующим добавлением 50 пМ hTSLP-Fc или 50 пМ TSLP-Fc яванского макака для стимуляции клеток. Последовательности TSLP человека и яванского макака известны (номер доступа в UniProt Q969D9 и RefSeq NCBI XP_005557555.1 соответственно). Для проведения анализа использовали рекомбинантный белок.

После инкубации в течение 72 часов плотность и жизнеспособность клеток отслеживали с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, G7571/G7572/G7573) и считывали с помощью многометочного ридера EnVision (PerkinElmer). Результаты показаны в таблице 8.

Таблица 8. Активность и эффективность одновалентных ISVD для TSLP в анализе индуцированной с помощью TSLP пролиферации клеток BaF3 ND=не определено

ID ISVD IC50 (M) hTSLP-Fc % ингибирования hTSLP-Fc IC50 (M) TSLP-Fc яванского макака % ингибирования TSLP-Fc яванского макака F0107501A02 >1,0E-06 46 >1,0E-06 10 F0107529F10 ND ND ND ND

6.1.8 Пример 8. Аффинность связывания очищенных ISVD для IL-13 и для TSLP с IL-13 и TSLP человека и яванского макака

Изучение кинетики полного связывания проводили с помощью SPR на приборе BIAcore T100 (GE Healthcare).

Для IL-13 около 2000 RU hIL13-Fc или 4000 RU IL13-Fc яванского макака иммобилизовали непосредственно на сенсорном чипе CM5. Затем вводили ISVD в различных концентрациях (от 3 мкМ до 12 нМ) на 120 секунд с обеспечением возможности диссоциации в течение 900 секунд. Регенерацию поверхностей hIL-13-Fc и IL-13-Fc яванского макака проводили с помощью 47-секундного ввода 0,85% H₃PO₄:MilliQ (1:1).

Для TSLP около 8000 RU антитела к huIgG (GE Healthcare) иммобилизовали непосредственно на сенсорном чипе CM5. hTSLP-Fc (в концентрации 1 мкг/мл) или TSLP-Fc яванского макака (в концентрации 0,75 мкг/мл) выпускали и захватывали на чипе в течение 120 с. Затем вводили ISVD в различных концентрациях (от 0,4 нМ до 3000 нМ) на 120 секунд с обеспечением возможности диссоциации в течение 900 секунд.

Оценивание кривых связывания проводили с использованием программного обеспечения BIAcore T100 Evaluation V2.0.3. Кинетический анализ проводили путем аппроксимации моделью взаимодействия 1:1 (связывание по Лэнгмюру) (Rmax=глобальный; RI=постоянный=0, смещение=0). Взаимодействия, которые не могли соответствовать критериям приемлемости для модели взаимодействия 1:1, аппроксимировали с использованием гетерогенной аппроксимирующей модели связывания лиганда (RI=постоянный=0, смещение=0).

Кинетические данные показаны в таблице 9 для ISVD для IL-13 и в таблице 10 для ISVD для TSLP.

Таблица 9. Определение KD одновалентных ISVD для IL13 с помощью SPR

Образец Поверхность % присутствующих основных взаимодействий k_a (1/M·с) k_d (1/с) K_D (M) Модель, используемая для аппроксимации кривых связывания F0107004B02 hIL13-Fc 80 2,2E+04 2,4E-02 1,1E-06 Гетерогенная аппроксимирующая модель связывания лиганда IL13-Fc яванского макака 81 1,8E+04 3,4E-02 1,9E-06 Гетерогенная аппроксимирующая модель связывания лиганда

Таблица 10. Определение KD одновалентных ISVD для TSLP с помощью SPR

hTSLP-Fc TSLP-Fc яванского макака ID k_a (1/M·с) k_d (1/с) K_D (M) k_a (1/M·с) k_d (1/с) K_D (M) F0107501A02 1,1E+05 5,7E-05 5,1E-10 7,3E+04 1,8E-03 2,5E-08 F0107529F10 1,2E+07 4,2E-04 3,5E-11 8,7E+05 1,5E-03 1,7E-09

6.2 Получение моноспецифических поливалентных полипептидов, связывающихся с IL-13 и TSLP соответственно

6.2.1 Пример 10. Получение и определение характеристик in vitro двухвалентных или бипаратопных конструкций на основе ISVD для IL-13 дикого типа

Отобранные ISVD для IL-13 (F0107004B02 и F0107004B06) преобразовывали в формат бипаратопных и двухвалентных конструкций на основе ISVD. Структурные элементы в конструкциях генетически связывали гибким линкером 35GS (GlySer). ISVD экспрессировали в виде белка, меченного FLAG3-HIS6, в Pichia pastoris (аминокислотные последовательности показаны в таблице 14). Индукция экспрессии конструкции на основе ISVD происходила путем поэтапного добавления метанола. Осветленную среду с секретируемой конструкцией на основе ISVD использовали в качестве исходного материала для аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металлов (IMAC) с последующим обессоливанием, что приводило к 90% чистоте согласно оценке с помощью SDS-PAGE.

Бипаратопные и двухвалентные конструкции для IL-13 характеризовали в анализе AlphaScreen с блокированием бинарных и тройных комплексов (как описано в примере 6), а также в анализе пролиферации TF-1 (как описано в примере 7). Обзор полученных конструкций и их блокирующей активности в анализе AlphaScreen бинарных и тройных комплексов и в анализе пролиферации TF-1 показан в таблице 11. Бипаратопная конструкция демонстрирует превосходную активность в отношении hIL-13 и cyIL-13, сходную с активностью эталонного mAb1 к hIL-13. Двухвалентные конструкции также обладают улучшенной активностью, но не в такой степени, как бипаратопная конструкция F010700029, в анализе пролиферации TF1. Кроме того, двухвалентные конструкции не достигают полного ингибирования в AlphaScreen с IL13-IL13Rα1.

Таблица 11. Обзор активности различных конструкций для IL-13 в анализах AlphaScreen, а также активности и эффективности в анализе пролиферации TF-1 ND=не определено

ID конструкции на основе ISVD Описание конструкции на основе ISVD AlphaScreen IL13-IL13Rα1 AlphaScreen IL13-IL13Rα1-IL4Rα IC50 (M) в анализе пролиферации TF1 IC50 (M) % ингибирования IC50 (M) % ингибирования 200 пM hIL13 200 пM IL13 яванского макака F010700003 F0107004B06-35GS-F0107004B02 1,3E-10 99 3,40E-09 100 1,20E-08 ND F010700014 F0107004B02-35GS-F0107004B02 2,7E-10 84 4,80E-09 98 9,40E-08 ND F010700029 F0107004B02-35GS-F0107004B06 3,1E-10 99 3,00E-09 100 2,00E-11 2,50E-10 F010700031 F0107004B06-35GS-F0107004B06 Без аппроксимации Частичное 6,60E-10 99 1,00E-07 ND Эталонное mAb1 к hIL-13 ND ND ND ND 1,50E-11 1,30E-10

Наиболее активную бипаратопную конструкцию на основе ISVD для IL-13 тестировали в анализе индуцированного IL-13 высвобождения эотаксина из A549. С этой целью суспензию клеток A549 культивировали в среде Хэма F12K с добавлением 10% FCS. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 200000 клеток/лунка. На следующий день добавляли 200 пМ hIL-13 (Sino Biological, номер по каталогу 10369-HNAC) или IL-13 яванского макака (Sino Biological, номер по каталогу 11057-CNAH), а затем серию разведений конструкций на основе ISVD. Через 24 часа в образцах надосадочной жидкости определяли эотаксин-3 с использованием MSD для ELISA (набор для определения эотаксина-3 в культуре ткани (Meso Scale, K151ABB-1)). Результаты показаны в таблице 12.

Таблица 12. Активность F010700029 в анализе опосредованного IL-13 высвобождения эотаксина из A549. Ингибирование составляло 100%.

ID конструкции на основе ISVD Описание конструкции на основе ISVD IC50 (M)
hIL-13 IC50 (M)
IL-13 яванского макака F010700029 F0107004B02-35GS-F0107004B06 2,10E-10 1,50E-10 Эталонное mAb1 к hIL-13 8,00E-11 7,00E-11

Конкурентный ELISA использовали для тестирования того, ингибируют ли моновалентные и бипаратопные конструкции на основе ISVD для IL-13 связывание hIL-13 с IL13Rα2. 384-луночный планшет SpectraPlate (PerkinElmer) покрывали IL13Rα2 (Sino Biological, номер по каталогу 10350-H08H). hIL13-Fc (Sino Biological, номер по каталогу 10369-H01H) смешивали с серийными разведениями конструкций на основе ISVD или соединением положительного контроля IL-13Rα2 и инкубировали в течение 1 часа. После промывки и блокирования покрывающий рецептор инкубировали со смесью ISVD для IL13-Fc/контроль и инкубировали в течение 1 часа. После промывки присутствие связавшегося IL-13-Fc выявляли с помощью антитела к IgG человека, конъюгированного с пероксидазой, и последующей ферментативной реакции в присутствии субстрата esTMB. В случае, когда ISVD ингибирует взаимодействие IL-13/IL-13Rα2, выявление IL-13-Fc утрачивается дозозависимым образом. Результаты показаны в таблице 13.

Таблица 13. Способность одновалентных и бипаратопных конструкций на основе ISVD для IL-13 ингибировать образование комплекса IL-13/IL-13Rα2 в конкурентном ELISA

Соединение Конструкция
Описание % ингибирования образования комплекса IL13/IL13Rα2 IC50 (M) F010704B02 - 37 4,9E-08 F010704B06 - 49 Без аппроксимации F027100271 F0107004B02-9GS-ALB23002-9GS- F0107004B06 53 Без аппроксимации IL-13Rα2 - 100 7,9E-09

Таблица 14. Аминокислотные последовательности бипаратопных и двухвалентных конструкций на основе ISVD для IL13 дикого типа

ID конструкции на основе ISVD Описание конструкции на основе ISVD Последовательность F010700003
(SEQ ID NO: 148) F0107004B06-35GS-F0107004B02 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNRKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVNSRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSS F010700014
(SEQ ID NO: 149) F0107004B02-35GS-F0107004B02 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVNSRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVNSRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSS F010700029
(SEQ ID NO: 150) F0107004B02-35GS-F0107004B06 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVNSRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNRKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSS F010700031
(SEQ ID NO: 151) F0107004B06-35GS-F0107004B06 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNRKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNRKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSS

6.2.2 Пример 11. Получение и определение характеристик бипаратопных конструкций на основе ISVD для TSLP дикого типа

Отобранные средства, блокирующие TSLPR (F0107501A02 и F0107529F10), объединяли в бипаратопные конструкции на основе ISVD. Конструкции экспрессировали в виде белка, меченного FLAG3-HIS6, в Pichia pastoris (аминокислотные последовательности показаны в таблице 16). Индукция экспрессии конструкции на основе ISVD происходила путем поэтапного добавления метанола. Осветленную среду с секретируемой конструкцией на основе ISVD использовали в качестве исходного материала для аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металлов (IMAC) с последующим обессоливанием, что приводило к 90% чистоте согласно оценке с помощью SDS-PAGE.

Бипаратопные конструкции титровали как очищенные белки против 50 или 5 пМ hTSLP и 50 или 5 пМ TSLP яванского макака в анализе пролиферации BaF3 (как описано в примере 7) и сравнивали с различными эталонными соединениями, направленными против TSLP (эталонным mAb2 к hTSLP и эталонным mAb1 к hTSLP). Данные обобщены в таблице 15 (hTSLP и TSLP яванского макака). Бипаратопные конструкции явно превосходят эталонные mAb. Бипаратопная конструкция с F0107501A02 на N-конце демонстрирует улучшенную реактивность в отношении TSLP яванского макака по сравнению с конструкцией с F0107501A02 на С-конце.

Таблица 15. Обзор значений IC50 (M) различных бипаратопных форматов конструкций для TSLP в анализе пролиферации BaF3, опосредованной TSLP человека и яванского макака соответственно

ID конструкции на основе ISVD Описание конструкции на основе ISVD IC50 (M)
hTSLP IC50 (M)
TSLP яванского макака Концентрация TSLP, используемая для стимуляции (пM) F010703842 F0107529F10-35GS-F0107501A02 4,8E-11 3,9E-09 50 F027400016 F0107501A02 (E1D, L11V, A14P, E16G, A41P, I43K, E44Q, A74S, E75K, M78L, K83R, A84P, G88A, V89L)*-35GS-529F10 4,6E-12 6,0E-11 5 Эталонное mAb2 к hTSLP 1,6E-10 >1,0E-07 50 Эталонное mAb1 к hTSLP 5,5E-10 3,8E-09 5

*() указывает на аминокислотные замены, введенные в (исходный) одновалентный структурный элемент.

Таблица 16. Аминокислотные последовательности бипаратопных конструкций на основе ISVD для TSLP F010703842 и F027400016

ID конструкции на основе ISVD Описание конструкции на основе ISVD Последовательность F010703842
(SEQ ID NO: 152) F0107529F10-35GS-F0107501A02 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYTDSVKGRFTISSDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGESLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAAGIERELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNAENTMYLQMNSLKAEDTGVYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSS F027400016
(SEQ ID NO: 153) F0107501A02 (E1D, L11V, A14P, E16G, A41P, I43K, E44Q, A74S, E75K, M78L, K83R, A84P, G88A, V89L)*-35GS-529F10 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAPGKQRELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSS

*() указывает на аминокислотные замены, введенные в (исходный) одновалентный структурный элемент.

6.3 Оптимизация последовательности одновалентных ISVD для IL-13 и для TSLP

6.3.1 Пример 12. Оптимизация последовательности одновалентных ISVD для IL-13 и для TSLP

ISVD для IL-13 F0107004B02 и F0107004B06 и ISVD для TSLP F0107501A02 и F0107529F10 дополнительно подвергали оптимизации последовательности.

Оптимизация последовательности включает замену одного или нескольких определенных аминокислотных остатков в последовательности для улучшения одного или нескольких (желаемых) свойств ISVD.

Некоторые примеры такой оптимизации последовательности упомянуты в дальнейшем описании в данном документе и, например, включают без ограничения следующее.

1) Замены в исходных последовательностях ISVD дикого типа для получения последовательностей ISVD, более идентичных консенсусным последовательностям VH3-JH зародышевого типа человека, в ходе процесса, называемого гуманизацией. С этой целью определенные аминокислоты, за исключением так называемых характерных остатков, в FR, которые различаются между ISVD и консенсусной последовательностью VH3-JH зародышевого типа человека, заменяют человеческими аналогами таким образом, что структура, активность и стабильность белка остаются неизменными.

2) Замены в направлении зародышевого типа ламы для повышения стабильности ISVD, что определяется как камелизация. С этой целью аминокислотную последовательность исходного ISVD дикого типа выравнивают с аминокислотной последовательностью ISVD из IGHV зародышевого типа ламы (идентифицированной как лучший хит в анализе BlastP для ISVD в сравнении с IGHV зародышевого типа ламы).

3) Замены, которые приводят к улучшению долговременной стабильности или свойств при хранении, замены, которые приводят к повышению уровней экспрессии в желаемой клетке-хозяине или организме-хозяине, и/или замены, которые приводят к удалению или уменьшению (нежелательных) посттрансляционных модификаций (таких как гликозилирование или фосфорилирование), опять же в зависимости от желаемых клетки-хозяина или организма-хозяина. Чтобы избежать образования N-концевого пироглутамата, стандартно в N-концевой структурный элемент поливалентного Nb вводят мутацию E1D без влияния на активность или стабильность. Таким образом, в ходе оптимизации последовательностей структурных элементов мутация E1D вводится не всякий раз.

4) Мутации в положении 11 с заменой на Val и в положении 89 с заменой на Leu для сведения к минимуму активности связывания любого встречающегося в природе уже существующего антитела.

F0107004B02 и F0107004B06

В результате оптимизации последовательности ISVD для IL-13 F0107004B02 получали конечный вариант F027100019 с оптимизированной последовательностью, который содержит 8 аминокислотных замен (т. е. E1D, L11V, A14P, N64K, S65G, A74S, K83R, I89L) по сравнению с исходным ISVD F107004B02. В результате оптимизации последовательности ISVD для IL-13 F0107004B06 получали конечный вариант F027100183 с оптимизированной последовательностью, который содержит 4 аминокислотные замены (т. е. L11V, R74S, K83R, V89L) по сравнению с исходным ISVD F107004B06.

Варианты с оптимизированной последовательностью собирали из олигонуклеотидов с использованием способа ПЦР с перекрывающимися праймерами. Варианты экспрессировали в E. coli и очищали с помощью IMAC и обессоливания. F027100019 и F027100183 оценивали в отношении их способности связывать hIL-13 с помощью поверхностного плазмонного резонанса с использованием hIL-13 от PeproTech (номер по каталогу 200-13). Кроме того, F027100019 тестировали в отношении его нейтрализующей активности в анализе высвобождения эотаксина. Мономерное поведение обоих вариантов отслеживали с помощью эксклюзионной HPLC (SE-HPLC). Термостабильность вариантов тестировали в анализе теплового сдвига (TSA) с использованием LightCycler (Roche). В этом анализе исходные ISVD и их варианты инкубируют при различных значениях рН в присутствии Sypro оранжевого, и применяют температурный градиент. Когда ISVD начинают денатурировать, Sypro оранжевый связывается, и измеряемая флуоресценция резко возрастает, и поэтому температура плавления может быть определена для определенного pH. Результаты обобщены в таблице 17 и таблице 18.

Таблица 17. Результаты анализа варианта ISVD для IL-13 F0107004B02, представляющего собой F027100019 с оптимизированной последовательностью. nd=не определено, * измерено в отношении hIL-13-Fc

ID ISVD Мутация(мутации) IC50 (нМ) в анализе высвобождения эотаксина Kon для
hIL-13 (1/M·с) Koff для
hIL-13 (1/с) KD для
hIL-13 (M) Tm (°C) при pH 7 в TSA % главного пика в SE-HPLC F0107004B02 WT nd 2,20E+04* 2,40E-02* 1,10E-06* 67 94 F027100019 E1D, L11V, A14P, N64K, S65G, A74S, K83R, I89L 47 3,50E+04 1,20E-03 3,40E-08 70 100

F027100019 продемонстрировал хорошую активность в анализе высвобождения эотаксина, и в SPR было определено, что его аффинность к hIL-13 составляет 34 нМ. Tm F027100019 на 3°C выше, чем у исходного ISVD F0107004B2. % идентичности каркасных областей в каркасных областях для F027100019 составляет 85% на основании определения AbM (см. Antibody Engineering, Vol2 by Kontermann & Dübel (Eds), Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010) и 86% на основании определения согласно Kabat.

Таблица 18. Результаты анализа варианта ISVD для IL-13 F0107004B06 с оптимизированной последовательностью Nd=не определено

ID ISVD Мутация(мутации) Kon для
hIL-13 (1/M·с) Koff для
hIL-13
(1/с) KD для
hIL-13
(M) Tm (°C) при pH 7 в TSA % главного пика в SE-HPLC F0107004B06 WT 2,50E+05 3,30E-03 2,60E-08 nd nd F027100183 L11V, R74S, K83R, V89L 2,80E+05 7,50E-03 2,70E-08 61 100

Аффинность F027100183 является сходной по сравнению с последовательностью WT, и вариант имеет Tm, составляющую 61°C. Вариант элюируется в виде 100% пика мономера в SE-HPLC. % идентичности каркасных областей в каркасных областях для F027100183 составляет 94,4% на основании определения AbM и 93,1% на основании определения согласно Kabat.

F0107529F10

В результате оптимизации последовательности ISVD для TSLP F0107529F10 получали конечный вариант F027400021 с оптимизированной последовательностью, который содержит 8 аминокислотных замен (т. е. L11V, A14P, T60A, S71R, A74S, S79Y, K83R, V89L) по сравнению с исходным ISVD F0107529F10. В результате оптимизации последовательности ISVD для TSLP F0107501A02 получали конечный вариант F027400160 с оптимизированной последовательностью, который содержит 6 аминокислотных замен (т. е. L11V, A14P, E16G, A74S, K83R, V89L) по сравнению с исходным ISVD F0107501A02.

Варианты с оптимизированной последовательностью собирали из олигонуклеотидов с использованием способа ПЦР с перекрывающимися праймерами. Конструкции экспрессировали в E. coli и очищали с помощью IMAC и обессоливания. Варианты оценивали в отношении их способности связывания с TSLP человека и яванского макака с помощью поверхностного плазмонного резонанса. Мономерное поведение всех вариантов отслеживали с помощью эксклюзионной HPLC (SE-HPLC) и по термостабильности в анализе теплового сдвига (TSA). Кроме того, варианты F0107501A02 тестировали в отношении их блокирующей активности относительно hTSLP в AlphaScreen с тройными комплексами. Результаты обобщены в таблице 19 и таблице 20.

Таблица 19. Результаты анализа вариантов ISVD для TSLP F0107529F10 с оптимизированной последовательностью, nd=не определено

ID ISVD Мутации koff для hTSLP
(с-1) koff для
TSLP яванского макака
(с-1) K_D для
hTSLP-hFc
(M) K_D для TSLP яванского макака-hFc (M) Tm (°C) при pH 7 в TSA % главного пика в SE-HPLC F0107529F10 WT 6,60E-05 1,80E-03 3,50E-11 1,70E-09 64,0 nd F010704099 A14P, T60A, S71R, A74S, S79Y, K83R 7,70E-05 1,80E-03 3,80E-11 3,30E-09 75,4 100 F027400021 L11V, A14P, T60A, S71R, A74S, S79Y, K83R, V89L nd nd nd nd 74,0 100

Промежуточный вариант F010704099 с мутациями A14P, T60A, S71R, A74S, S79Y, K83R демонстрировал сходную аффинность в отношении hTSLP и в 2 раза более низкую аффинность в отношении TSLP яванского макака по сравнению с исходным ISVD F0107529F10. Tm демонстрировала общее увеличение на 11,4°C по сравнению с исходным ISVD. Две дополнительные мутации, т. е. L11V и V89L, вводили в вариант F010704099, чтобы свести к минимуму связывание уже существующих антител, в результате чего получали конечный вариант F027400021. % идентичности каркасных областей в каркасных областях для F027400021 составляет 89,9% на основании определения AbM и 88,5% на основании определения согласно Kabat.

Таблица 20. Результаты анализа вариантов ISVD для TSLP F0107501A02 с оптимизированной последовательностью (SO)

ID ISVD Мутация(мутации) Koff для
hTSLP
(с-1) koff для
TSLP яванского макака
(с-1) AlphaScreen с
тройными комплексами,
IC50 (M) Tm (°C) при pH 7 в TSA % главного пика в SE-HPLC F0107501A02 WT 5,4E-05 1,5E-03 2,8E-10 68,5 100 F010704076 A14P, E16G, A74S, K83R 6,2E-05 1,6E-03 2,7E-10 70,8 99,3 F027400160 L11V, A14P, E16G, A74S, K83R, V89L 1,2E-04 4,3e-03 nd 70,0 100

Промежуточный вариант F010704076 с мутациями A14P, E16G, A74S, K83R демонстрировал сходную скорость диссоциации от hTSLP и от TSLP яванского макака по сравнению с исходным ISVD F0107501A02 и сходную активность в AlphaScreen с тройными комплексами. Tm демонстрировала общее увеличение на 12,3°C по сравнению с исходным ISVD. Две дополнительные мутации, т. е. L11V и V89L, вводили в вариант F010704076, чтобы свести к минимуму связывание уже существующих антител, в результате чего получали конечный вариант F027400160.

% идентичности каркасных областей в каркасных областях для F027400160 составляет 83,1% на основании определения AbM и 80,5% на основании определения согласно Kabat.

Таблица 21. Аминокислотные последовательности SO-версий ISVD F0107004B02, F0107004B06, F0107501A02 и F107529F10

ID ISVD Описание ISVD Последовательность F010704076
(SEQ ID NO: 160) F0107501A02 (A14P, E16G, A74S, K83R)* EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAAGIERELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNSENTMYLQMNSLRAEDTGVYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSS F010704099
(SEQ ID NO: 161) F0107529F10 (A14P, T60A, S71R, A74S, S79Y, K83R)* EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSS F027100019
(SEQ ID NO: 162) F0107004B02 (E1D, L11V, A14P, N64K, S65G, A74S, K83R, I89L)* DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYRMGWFRQAPGKEREFVAALSGDGYSTYTANSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAKLQYVSGWSYDYPYWGQGTLVTVSSAAA F027100183
(SEQ ID NO: 163) F0107004B06 (L11V, R74S, K83R, V89L)* EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMKWVRQAPGKGLEWVSSITTGGGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCANVPFGYYSEHFSGLSFDYRGQGTLVTVSS F027400021
(SEQ ID NO: 164) F0107529F10 (L11V, A14P, T60A, S71R, A74S, S79Y, K83R, V89L)* EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFADYDYDIGWFRQAPGKEREGVSCISNRDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAVEIHCDDYGVENFDFDPWGQGTLVTVSS F027400160
(SEQ ID NO: 165) F0107501A02 (L11V, A14P, E16G, A74S, K83R, V89L)* EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSGFGVNILYWYRQAAGIERELIASITSGGITNYVDSVKGRFTISRDNSENTMYLQMNSLRAEDTGLYYCASRNIFDGTTEWGQGTLVTVSS

*() указывает на аминокислотные замены, введенные в (исходный) одновалентный структурный элемент.

6.4 Полиспецифическая конструкция на основе ISVD F027400161

Идентифицированные выше оптимизированные ISVD F027100019 (оптимизированный вариант F0107004B02), F027100183 (оптимизированный вариант F0107004B06), F027400021 (оптимизированный вариант F0107529F10) и F027400160 (оптимизированная версия F0107501A02) использовали для получения полиспецифической конструкции на основе ISVD F027400161. Оптимизированные одновалентные структурные элементы, используемые в F027400161, обозначены в дальнейшем в сокращенной форме в соответствии с ISVD, являющегося их источником, как 04B02, 04B06, 529F10 и 501A02 соответственно.

6.4.1 Пример 15. Получение полиспецифических конструкций на основе ISVD

Идентификация содержащего ISVD полипептида F027400161 (SEQ ID NO: 1), связывающегося с IL-13 и TSLP, стала результатом управляемой данными кампании по конструированию и форматированию в биспецифическом формате, в которую были включены несколько структурных элементов, связывающихся с TLSP, несколько структурных элементов, связывающихся с IL13, и структурный элемент ALB23002, связывающийся с HSA. Использовали разные положения/ориентации структурных элементов и разные длины линкеров (9GS в сравнении с 35GS), которые оказались критически важными для различных параметров (активности, перекрестной реактивности, выхода экспрессии и т. д.).

Большую панель различных конструкций на основе ISVD вводили путем трансформации в Pichia pastoris для мелкомасштабного получения. Индукция экспрессии ISVD происходила путем поэтапного добавления метанола. Осветленную среду с секретируемым ISVD использовали в качестве исходного материала для очистки посредством хроматографии с белком А с последующим обессоливанием. Очищенные образцы использовали для определения функциональных характеристик и оценивания экспрессии.

Некоторые конструкции демонстрировали показатели, соответствующие ослабленной активности, в зависимости от длины линкера и относительного расположения структурных элементов ISVD. Например: активность бипаратопных комбинаций 501A02-529F10 для TSLP в отношении TSLP яванского макака была сильно ослаблена при связывании с помощью короткого линкера 9GS. Некоторые конструкции демонстрировали низкие уровни экспрессии в зависимости от комбинации и порядка расположения структурных элементов. Для биспецифических конструкций, содержащих 4B02-4B06, экспрессия была наилучшей в комбинации с 501A02-529F10.

Таблица 22. Отбор различных оцениваемых полиспецифических форматов ISVD BB=структурный элемент, ALB=ALB23002

ID ISVD BB1 Линкер 1 BB2 Линкер 2 BB3 Линкер 3 BB4 Линкер 4 BB5 F027400161 4B02 35GS 4B06 9GS 501A02 9GS ALB 9GS 529F10 F027400162 4B02 9GS 501A02 9GS 4B06 9GS 529F10 9GS ALB F027400163 501A02 9GS ALB 9GS 529F10 9GS 4B02 35GS 4B06 F027400183 501A02 35GS 529F10 9GS 4B02 9GS ALB 9GS 4B06 F027400189 4B02 9GS ALB 9GS 4B06 9GS 501A02 35GS 529F10 F027400283 501A02 9GS 4B02 9GS 529F10 9GS 4B06 35GS ALB F027400284 501A02 35GS 4B02 35GS 529F10 35GS 4B06 35GS ALB F027400296 4B02 9GS 501A02 (N73Q)* 9GS 4B06 9GS 529F10 9GS ALB F027400298 501A02 (N73Q)* 9GS 4B02 9GS 529F10 9GS 4B06 9GS ALB

*() указывает на аминокислотные замены, введенные в (исходный) одновалентный структурный элемент.

В таблице 23 проиллюстрировано, что различные выходы в диапазоне от низкого до высокого титра были получены для шести конструкций, содержащих одни и те же структурные элементы, но расположенные в разном порядке и соединенные линкерами разной длины. Наиболее высокие титры экспрессии получены для конструкций, содержащих ISVD для IL-13 4B02 и 4B06, связанные посредством линкера 35GS (F027400161 и F027400163). Кроме того, растворимость F027400161 и F027400163 была намного выше, чем у их соответствующих аналогов F027400296 и 298, в которых структурные элементы связаны четырьмя линкерами 9GS, а ALB расположен на С-конце.

Затем большую биспецифическую панель сокращали до панели из 2 биспецифических конструкций, состоящей из конструкций на основе ISVD F027400161 и F027400163, которые оказались активными в отношении обеих мишеней (человека и яванского макака) и обладают потенциалом высоких уровней экспрессии, определенным на основании предварительных оценок выхода.

Более крупномасштабное получение в объеме 2 л и 5 л в Pichia pastoris выполняли для определения выхода экспрессии и оценки биофизических свойств и реактивности в отношении уже существующих антител.

В таблице 24 и примере 22 демонстрируется, что реактивность в отношении уже существующих антител обусловлена ориентацией структурных элементов и длинами линкеров.

Таблица 23. Уровни экспрессии и растворимость 6 конструкций на основе ISVD со структурными элементами 4B02, 4B06, 501A02 и 529F10 в разной ориентации и/или с разными длинами линкеров

ID конструкции на основе ISVD BB1 Линкер 1 BB2 Линкер 2 BB3 Линкер 3 BB4 Линкер 4 BB5 Выход экспрессии в объеме 5 мл (мкг/мл) Выход при ферментации в объеме 5 л (г/л) Растворимость (мг/
мл) F027400161 4B02 35GS 4B06 9GS 501A02 9GS ALB 9GS 529F10 124 4,7 145 F027400163 501A02 9GS ALB 9GS 529F10 9GS 4B02 35GS 4B06 114 4,4 >150 F027400189 4B02 9GS ALB 9GS 4B06 9GS 501A02 35GS 529F10 77 F027400183 501A02 35GS 529F10 9GS 4B02 9GS ALB 9GS 4B06 55 F027400296 4B02 9GS 501A02 (N73Q)* 9GS 4B06 9GS 529F10 9GS ALB 80 2,4 Очень низкая F027400298 501A02 (N73Q)* 9GS 4B02 9GS 529F10 9GS 4B06 9GS ALB 80 2,4 25

*() указывает на аминокислотные замены, введенные в (исходный) одновалентный структурный элемент.

Таблица 24. Связывание уже существующих антител, присутствующих в 96 образцах сыворотки крови человека, с F027400161, F027400163 и F027400164 по сравнению с контрольной конструкцией на основе ISVD F027301186

ID конструкции BB1 Линкер 1 BB2 Линкер 2 BB3 Линкер 3 BB4 Линкер 4 BB5 25% процентиль Медианные
уровни RU 75% процентиль F027301186 1E07 35GS 1E07 35GS 1C02 9GS ALB 9GS 1C02 61 135 622 F027400161 4B02 35GS 4B06 9GS 501A02 9GS ALB 9GS 529F10-A 8 22 34 F027400163 501A02 9GS ALB 9GS 529F10 9GS 4B02 35GS 4B06-A 19 34 63 F027400164 501A02 9GS 4B02 9GS 529F10 9GS 4B06 9GS ALB-A 4 13 24

В конечном счете была выбрана конструкция на основе ISVD F027400161 на основании активности, сниженного связывания с уже существующими антителами и более высоких уровней экспрессии и характеристик CMC.

6.4.2 Пример 16. Аффинность связывания полиспецифической конструкции на основе ISVD с TSLP, IL13 и сывороточным альбумином

Аффинность выражена в виде равновесной константы диссоциации (K_D), для F027400161 в отношении TSLP человека и яванского макака (последовательности TSLP человека и яванского макака известны (номер доступа в UniProt Q969D9 и RefSeq NCBI XP_005557555.1 соответственно). Для проведения анализа использовали рекомбинантный белок, IL-13 человека (Sino Biological, номер по каталогу 10369-HNAC), IL-13 яванского макака (Sino Biological, номер по каталогу 11057-CNAH) и IL-13 макака-резуса (R&D Systems, номер по каталогу 2674-RM), а также сывороточный альбумин человека (Sigma Aldrich, номер по каталогу A8763), яванского макака и мыши (Albumin Bioscience, номер по каталогу N1204H1CM) количественно определяли посредством измерений аффинности в растворе на рабочей станции Gyrolab xP (Gyros).

При измерениях в режиме, контролируемом по K_D, серийные разведения TSLP или IL-13 (в диапазоне от 1 мкМ до 0,25 фМ) или сывороточного альбумина (в диапазоне от 100 мкМ до 320 пМ) и фиксированное количество F027400161 (5 пM или 10 пM в случае TSLP и IL13 и 20 нM в случае сывороточного альбумина) смешивали для обеспечения взаимодействия и инкубировали в течение 48 или 72 часов (в случае TSLP и IL13) или 2 часов (в случае сывороточного альбумина) для достижения равновесия.

При измерениях в режиме, контролируемом по рецепторам, серийные разведения TSLP или IL-13 (в диапазоне от 1 мкМ до 0,25 фМ) или сывороточного альбумина (в диапазоне от 100 мкМ до 320 пМ) и фиксированное количество F027400161 (250 пM в случае TSLP, 10 нM в случае IL-13 и 1 мкM в случае сывороточного альбумина) смешивали для обеспечения взаимодействия и инкубировали в течение 48 или 72 часов (в случае TSLP и IL-13) или 2 часов (в случае сывороточного альбумина) для достижения равновесия.

Биотинилированный TSLP/IL-13/сывороточный альбумин человека захватывали в микроструктурах Gyrolab Bioaffy 1000 CD, которая содержит колонки с гранулами и используется в качестве молекулярного зонда для захвата свободного F027400161 из уравновешенного раствора. Смеси TLSP/IL-13/сывороточного альбумина и F027400161 (содержащей свободный TLSP/IL-13/сывороточный альбумин, свободный F027400161 и комплексы TLSP/IL-13/сывороточный альбумин-F027400161) позволяли протечь через гранулы, и небольшая процентная доля свободного F027400161 захватывалась, что было пропорциональным концентрации свободного ISVD. Затем вводили флуоресцентно меченное антитело к V_HH ABH0086-Alexa647 для мечения любого захваченного F027400161, и после вымывания избытка флуоресцентного зонда определяли изменение флуоресценции. Аппроксимацию серии разведений проводили с использованием программного обеспечения Gyrolab Analysis, где для определения значения K_D анализировали кривые, полученные в режиме, контролируемом по K_D и по рецепторам.

Результаты (таблица 25) демонстрируют, что полиспецифическая конструкция на основе ISVD связывает TSLP человека/яванского макака и IL13 человека/яванского макака/макака-резуса с высокой аффинностью.

Таблица 25. Значения аффинности связывания F027400161 с TSLP и IL13 человека, макака-резуса и яванского макака и сывороточным альбумином человека, яванского макака и мыши (последовательности TSLP яванского макака и макака-резуса и альбумина яванского макака и макака-резуса являются идентичными)

Человек Яванский макак Макак-резус Антиген K_D (пM) 95% CI (пM) K_D (пM) 95% CI (пM) K_D (пM) 95% CI (пM) Время инкубации (ч) TSLP 1,8 1,2-2,3 55,9 51-61 48 2,3 1,4-3,3 44,0 26-62 48 1,0 0,65-1,4 59,0 35-83 72 IL13 4,2 3,6-4,8 3,8 2,8-4,9 6,4 5,3-7,4 48 6,3 5,3-7,3 1,5 0,7-2,3 1,9 0,6-3,1 48 4,7 3,8-5,7 3,5 2,7-4,2 1,5 0,5-2,4 72 Человек Яванский макак Мышь Антиген K_D (нM) 95% CI (нM) K_D (нM) 95% CI (нM) K_D (нM) 95% CI (нM) Время инкубации (ч) SA 119 99,4-139 198 185-211 1800 1700-1900 2 110 56-162 133 70-196 2 145 69-222 145 78-213 2

6.4.3 Пример 17. Полиспецифическая конструкция на основе ISVD селективно связывается с TSLP и IL13

Отсутствие связывания F027400161 с IL-4 и IL-7 в качестве цитокинов, родственных IL13 и TSLP, оценивали с помощью SPR (ProteOn XPR36) соответственно.

Цитокины иммобилизовали на сенсорном чипе ProteOn GLC при 25 мкг/мл в течение 600 секунд с использованием иммобилизации по аминогруппе с вводом EDC/NHS на 80 секунд для активации и вводом 1 М этаноламина-HCl на 150 секунд для инактивации (набор для иммобилизации по аминогруппе ProteOn, номер по каталогу 176-2410). Скорость потока во время активации и инактивации была установлена на 30 мкл/мин, а во время ввода лиганда на 25 мкл/мин. Значение pH 10 мМ ацетатного буфера для иммобилизации составляло 6,0 для IL13 и IL4 (PeproTech, номер по каталогу 200-07) и 5,5 для TSLP и IL7 (R&D Systems, номер по каталогу 204-IL/CF).

Затем вводили 1 мкМ F027400161 на 2 минуты с обеспечением возможности диссоциации в течение 600 секунд при скорости потока 45 мкл/мин. В качестве рабочего буфера использовали PBS (pH 7,4) + 0,005% Tween 20. В качестве положительных контролей вводили 100 нМ Ab к hIL4 и 100 нМ Ab к IL7. Взаимодействие между F027400161 и положительными контролями с иммобилизованными мишенями измеряли путем выявления увеличения коэффициента преломления, которое происходит в результате изменений массы на чипе при связывании.

Все положительные контроли действительно связывались с их соответствующей мишенью. Не было выявлено связывания F027400161 с IL4 и IL7 человека.

Кроме того, исследовали, может ли F027400161 связываться с короткой формой TSLP. С этой целью TSLP и короткую форму TSLP (как описано в Fornasa, 2015) иммобилизовали на сенсорном чипе ProteOn GLC при 10 мкг/мл и 5 мкг/мл соответственно в течение 150 секунд с использованием иммобилизации по аминогруппе, как описано выше. Значение рН для 10 мМ ацетатного буфера для иммобилизации составляло 5,5 для TSLP и 4,0 для короткой формы TSLP.

Затем вводили 500 нМ F027400161 на 2 минуты с обеспечением возможности диссоциации в течение 600 секунд при скорости потока 45 мкл/мин. В качестве рабочего буфера использовали PBS (pH 7,4) + 0,005% Tween 20. В качестве эталонного соединения вводили 500 нМ эталонного mAb1 к hTSLP, а в качестве положительного контроля - 500 нМ pAb к hTSLP (Abcam ab47943).

Хотя положительный контроль действительно связывался как с длинной (нормальной), так и с короткой формой TSLP, не было выявлено связывания F027400161 и эталонного mAb1 к hTSLP с короткой формой TSLP.

6.4.4 Пример 18. Одновременное связывание полиспецифической конструкции на основе ISVD с IL13, TSLP и HSA

Установку Biacore T200 использовали для определения того, может ли F027400161 одновременно связываться с hTSLP и hIL13. С этой целью hTSLP (рекомбинантный TSLP человека коммерчески доступен, например, от R&D Systems (номер по каталогу 1398-TS)) иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 путем иммобилизации по аминогруппе. 100 нМ F027400161 вводили на 2 минуты со скоростью 10 мкл/мин на поверхность TSLP для захвата конструкции на основе ISVD посредством структурных элементов 501A02-529F10, связывающихся с TSLP. Затем вводили 100 нМ hIL13 (PeproTech, номер по каталогу 200-13), HSA или hOX40L или 1000 нМ HSA либо смеси 100 нМ IL13+100 нМ HSA, 100 нМ IL13+1000 нМ HSA, 100 нМ OX40L+100 нМ HSA, 100 нМ OX40L+1000 нМ HSA или 100 нМ IL13+100 нМ OX40L при скорости потока 10 мкл/мин на 2 минуты с последующей за этим 300-секундной стадией диссоциации. Поверхности TSLP регенерировали путем ввода 0,5% SDS+10 мМ глицина, pH=3, на 1 минуту со скоростью 45 мкл/мин. На сенсограмме (фигура 1) продемонстрировано, что F027400161 может одновременно связывать IL13 человека, TSLP человека и HSA, о чем свидетельствует увеличение количества единиц ответа после захвата на TSLP: увеличение на ~ 130 RU относительно IL13 в отдельности, увеличение на ~ 60 RU относительно 100 нМ HSA в отдельности и ~ 350 RU относительно 1000 нМ HSA в отдельности, увеличение на ~ 180 RU для смеси IL13 и 100 нМ HSA и ~ 500 RU для смеси IL13 и 1000 нМ HSA. Требовались более высокие концентрации HSA, чтобы увидеть достаточные уровни увеличения RU, вследствие более низкой аффинности F027400161 к HSA (см. пример 16).

Пример 19. Ингибирование индуцированного IL13 высвобождения эотаксина in vitro с помощью полиспецифической конструкции на основе ISVD

Функциональную активность растворимого IL13 из различных представляющих интерес видов (человека, макака-резуса и яванского макака) и его ингибирование с помощью F027400161 изучали с использованием клеточного анализа, в котором исследуется высвобождение эотаксина клетками карциномы легкого человека A549.

С этой целью суспензию клеток A549 культивировали в среде Хэма F12K с добавлением 10% FCS и высевали в 96-луночный планшет при 400000 клеток/лунка. После инкубации в течение 24 часов добавляли серию разведений F027100161 или эталонных соединений (эталонного mAb1 к hIL-13 и эталонного mAb2 к hIL-13). После 20-минутной инкубации добавляли IL13 человека (Sino Biological, номер по каталогу 10369-HNAC), IL13 яванского макака (Sino Biological, номер по каталогу 11057-CNAH) или IL13 макака-резуса (R&D Systems, номер по каталогу 2674-RM-025) до конечной концентрации 160 пM. После дополнительной инкубации в течение 24 часов в присутствии 30 мкМ HSA добавляли гепарин в конечной концентрации 50 мкг/мл для усиления экспрессии эотаксина. После дополнительных 4 часов инкубации эотаксин-3, секретируемый в надосадочную жидкость культуры клеток, количественно определяли с использованием набора DuoSet для ELISA CCL26/эотаксина-3 человека (R&D Systems, DY346).

F027400161 ингибировал индуцированное IL13 человека, яванского макака и макака-резуса высвобождение эотаксина-3 зависимым от концентрации образом с IC50, составляющей 194 пМ (для IL13 человека), 1040 пМ (для IL13 яванского макака) и 713 пМ (для IL13 макака-резуса), что было сопоставимым с эталонным соединением, представляющим собой эталонное mAb1 к hIL-13, и лучше, чем для эталонного соединения, представляющего собой эталонное mAb2 к hIL-13 (таблица 26, фигура 2).

Таблица 26. Значения IC50 для опосредованной F027400161 нейтрализации IL13 человека, яванского макака и макака-резуса в анализе высвобождения эотаксина по сравнению с эталонными соединениями, представляющими собой эталонное mAb1 к hIL-13 и эталонное mAb2 к hIL-13. nd=не определено

F027400161 Эталонное mAb1 к hIL-13 Эталонное mAb2 к hIL-13 Антиген IL13 человека IL13 яванского макака IL13 макака-резуса IL13 человека IL13 яванского макака IL13 макака-резуса IL13 человека IL13 яванского макака IL13 макака-резуса Анализ высвобождения эотаксина (IC50, пM) 194 1040 713 45 160 99 668 nd 3560

6.4.5 Пример 20. Ингибирование индуцированной IL13 активации STAT-6 в клетках HEK-Blue IL4/IL13 с помощью полиспецифической конструкции на основе ISVD

Клетки HEK-Blue™ IL-4/IL-13 получали путем стабильной трансфекции клеток HEK293 человеческим геном STAT6 и STAT6-индуцируемым репортерным геном SEAP. При стимуляции с помощью IL-4 и IL-13 клетки продуцируют STAT6-индуцированный SEAP, секретируемый в надосадочную жидкость, количественно определяемый с помощью QUANTI-Blue™.

Клетки HEK-Blue™ культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS и высевали в 96-луночный планшет при 50000 клеток/лунка. Серию разведений F027100161 или эталонных соединений (эталонного mAb1 к hIL-13 и эталонного mAb2 к hIL-13) предварительно инкубировали с 10 пМ hIL13 (Sino Biological, номер по каталогу 10369-HNAC) или IL-13 яванского макака (Sino Biological, номер по каталогу 11057-CNAH) в течение 1 часа при комнатной температуре и добавляли к клеткам. После инкубации в течение 22-24 часов в присутствии 30 мкМ HSA 40 мкл надосадочной жидкости культуры клеток смешивали со 160 мкл QUANTI-Blue™. Секретируемый SEAP количественно определяли путем измерения оптического поглощения при 620 нм на приборе CLARIOstar.

F027400161 ингибировал индуцированную IL-13 человека и яванского макака секрецию SEAP зависимым от концентрации образом с IC50, составляющей 32,8 пМ (для IL-13 человека) и 53,4 пМ (для IL-13 яванского макака), что было лучше, чем для эталонного соединения, представляющего собой эталонное mAb2 к hIL-13 (таблица 27, фигура 3).

Таблица 27. Значения IC50 для опосредованной F027400161 нейтрализации IL-13 человека и яванского макака в анализе по репортерному белку SEAP в сравнении с эталонными соединениями, представляющими собой эталонное mAb1 к hIL-13 и эталонное mAb2 к hIL-13

ID конструкции IC50 для hIL13 (M) IC50 для IL13 яванского макака (M) F027400161 3,28E-11 5,34E-11 Эталонное mAb2 к hIL-13 1,10E-10 4,26E-10 Эталонное mAb1 к hIL-13 3,45E-12 5,85E-12

6.4.6 Пример 21. Ингибирование индуцированной TSLP пролиферации клеток Ba/F3 in vitro с помощью полиспецифической конструкции на основе ISVD

Функциональную активность растворимого TSLP из различных представляющих интерес видов (человека, макака-резуса и яванского макака) и его ингибирование с помощью F027400161 изучали с использованием клеточного анализа, в котором исследуется пролиферация клеток BaF3, трансфицированных плазмидами, кодирующими hTSLPR и hIL7Ra.

Клетки высевали при плотности 15000 клеток/лунка в питательную среду RPMI 1640 в белые 96-луночные планшеты, обработанные для культур клеток. Добавляли серию разведений F027100161 или эталонных соединений (эталонного mAb1 к hTSLP) с последующим добавлением 5 пМ TLSP человека или яванского макака для стимуляции клеток. Последовательности TSLP человека и яванского макака известны (номер доступа в UniProt Q969D9 и RefSeq NCBI XP_005557555.1 соответственно). Для проведения анализа использовали рекомбинантный белок. После инкубации в течение 48 часов в присутствии 30 мкМ HSA плотность и жизнеспособность клеток отслеживали с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, G7571/G7572/G7573) и считывали с помощью многометочного ридера EnVision (PerkinElmer).

F027400161 ингибировал зависимую от TSLP человека и яванского макака пролиферацию клеток Ba/F3 зависимым от концентрации образом с IC50, составляющей 7,8 пM (для TSP человека) и 24 пM (для TSLP яванского макака), и, таким образом, его эффективность была намного лучше, чем у эталонного соединения, представляющего собой эталонное mAb1 к hTSLP (таблица 28, фигура 4).

Таблица 28. Значения IC50 для опосредованной F027400161 нейтрализации индуцированной с помощью TSLP человека и яванского макака пролиферации BaF3 в сравнении с эталонным соединением, представляющим собой эталонный mAb1 к hTSLP

F027400161 Эталонное mAb1 к hTSLP Антиген TSLP
человека TSLP
яванского макака TSLP
человека TSLP
яванского макака Анализ пролиферации BaF3 (IC50, пM) 7,8 24 356 3180

6.4.7 Пример 22. Связывание полиспецифической конструкции на основе ISVD с уже существующими антителами

Реактивность конструкции на основе ISVD F027400161 в отношении уже существующих антител оценивали в нормальной сыворотке крови человека (n=96) с использованием ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). PBS/Tween (фосфатно-солевой буфер, pH 7,4, 0,005% Tween 20) использовали в качестве рабочего буфера, и эксперименты проводили при 25°C.

ISVD захватывали на чипе путем связывания структурного элемента ALB23002 с HSA, который был иммобилизован на чипе. Для иммобилизации HSA лигандные дорожки сенсорного чипа ProteOn GLC активировали с помощью EDC/NHS (скорость потока 30 мкл/мин), и HSA вводили при 100 мкл/мл в ацетатном буфере ProteOn с pH 4,5 для достижения уровней иммобилизации, составляющих примерно 2900 RU. После иммобилизации поверхности деактивировали этаноламином-HCl (скорость потока 30 мкл/мин).

Затем конструкции на основе ISVD вводили на 2 мин при 45 мкл/мин на поверхность HSA для достижения уровня захвата ISVD, составляющего примерно 800 RU. Образцы, содержащие уже существующие антитела, центрифугировали в течение 2 минут при 14000 об./мин, и надосадочную жидкость разбавляли 1:10 в PBS-Tween 20 (0,005%) перед вводом на 2 минуты при 45 мкл/мин с последующей за этим 400-секундной стадией диссоциации. После каждого цикла (т. е. перед новой стадией захвата ISVD и ввода образца крови) поверхности HSA регенерировали путем ввода HCl (100 мМ) на 2 минуты при 45 мкл/мин. Сенсограммы, демонстрирующие связывание уже существующих антител, получали после двойного сопоставления с эталоном путем вычитания 1) диссоциации ISVD-HSA и 2) неспецифичного связывания с дорожкой эталонного лиганда. Уровни связывания уже существующих антител определяли путем установления отчетных точек на 125 секунд (через 5 секунд после окончания ассоциации). Процентное снижение связывания уже существующих антител рассчитывали относительно уровней связывания для эталонного ISVD через 125 секунд.

Пятивалентная конструкция на основе ISVD F027400161, оптимизированная для снижения связывания уже существующих антител путем введения мутаций L11V и V89L в каждый структурный элемент и С-концевого аланина, демонстрировала существенно меньшее связывание с уже существующими антителами по сравнению с контрольной неоптимизированной пятивалентной конструкцией на основе ISVD F027301186 (таблица 24 и фигура 5).

Связывание с уже существующими антителами зависит от ориентации структурных элементов и длин линкеров, присутствующих в полиспецифических конструкциях. В таблице 24 и на фигуре 5 продемонстрировано, что конструкция F027400161 демонстрирует более низкую реактивность в отношении уже существующих антител, чем конструкция F027400163, вследствие ее специфической ориентации, но что F027400164 демонстрирует более низкую реактивность, чем F027400161, вследствие наличия коротких линкеров по всей длине.

6.4.8 Пример 23. F027400161 блокирует индуцированный TSLP CCL17 в дендритных клетках человека in vitro

Каскад воспаления 2 типа инициируется и распространяется при совместном действии эпителиальных клеток, дендритных клеток, хелперных Т-клеток 2 типа (клеток Th2), тучных клеток и лимфоидных клеток врожденного иммунитета в зависимости от окружения. Было установлено, что цитокин тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP) участвует в инициировании и распространении аллергического воспаления благодаря своей способности активировать дендритные клетки (DC). При активации с помощью TSLP человеческие DC продуцируют CCL17, Th2-ассоциированный хемокин, и управляют дифференцировкой Th2-клеток из необученных CD4⁺ T-клеток. F027400161 нацеливается как на TSLP, так и на IL-13, может блокировать взаимодействие между TSLP и DC и, таким образом, снижать продуцирование CCL-17 и согласно предположениям обеспечивает эффективность при воспалительных заболеваниях 2 типа и помимо них.

Способность F027400161 ингибировать индуцированное TSLP продуцирование CCL17 оценивали в человеческих DC, выделенных от 8 отдельных здоровых доноров, по сравнению с эталонным моноспецифическим антителом, представляющим собой эталонное mAb1 к hTSLP. Человеческие DC (CD3^-CD14^-CD11c⁺HLA-DR^{высокий}) выделяли и обогащали из PBMC здоровых людей в образцах лейкоцитарной пленки (человеческой лейкоцитарной массы). В общей сложности 0,5-0,8×10⁶ DC/лунка инкубировали с восемью концентрациями F027400161 в 3-кратном серийном разведении (наивысшая концентрация 400 нг/мл или 5,714 нМ) или с восемью концентрациями эталонного mAb1 к hTSLP в 4-кратном серийном разведении (наивысшая концентрация 4000 нг/мл или 27 нМ) перед стимуляцией с помощью 4 нг/мл рекомбинантного человеческого TSLP в течение 36 часов в инкубаторе для культур клеток при 37^oC. Рекомбинантный TSLP человека коммерчески доступен, например, от R&D Systems (номер по каталогу 1398-TS). Продуцирование CCL17 в надосадочной жидкости свежесобранной культуры клеток измеряли с помощью ELISA, а значения IC₅₀ для конструкции на основе ISVD и референтного антитела рассчитывали в GraphPad Prism.

Совокупные результаты для ответов в виде дозозависимого ингибирования у F027400161 и эталонного mAb1 к hTSLP в человеческих DC показаны на фигуре 6. Эталонное моноспецифическое антитело, представляющее собой эталонное mAb1 к hTSLP, ингибировало индуцированное TSLP продуцирование CCL17 при среднем значении концентрации IC₅₀, составляющем 793,4 пМ, тогда как F027400161 ингибировал индуцированное TSLP продуцирование CCL17 со средней IC₅₀, составляющей 53,26 пМ.

В заключение, эти результаты демонстрируют, что конструкция на основе ISVD F027400161 более активно ингибирует индуцированный TSLP ответ с образованием CCL17 в человеческих DC по сравнению с эталонным mAb1 к hTSLP.

6.4.9 Пример 24. F027400161 блокирует индуцированное с помощью 0,5 нг/мл [IL-13+TSLP] синергическое продуцирование CCL17 в человеческих PBMC in vitro

Цитокины 2 типа, такие как тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP) и интерлейкин-13 (IL-13), осуществляют уникальный аддитивный и синергический ответ, управляющий патофизиологическим процессом при астме и атопическом дерматите (AD). Роль TSLP в качестве происходящего из эпителиальных клеток инициатора каскада иммунных реакций 2 типа и IL-13 в качестве нижележащего эффекторного цитокина была всесторонне подтверждена. F027400161 нацеливается как на TSLP, так и на IL-13 и, таким образом, согласно предположениям обеспечивает эффективность при опосредованных воспалительных заболеваниях 2 типа и помимо них.

Способность F027400161 ингибировать индуцированное с помощью 0,5 нг/мл IL-13 и TSLP синергическое продуцирование CCL17 (TARC) оценивали в человеческих PBMC от 8 отдельных здоровых доноров. Исследование было разработано для оценивания не меньшей эффективности конструкции на основе ISVD в сравнении с моноспецифическими биологическими препаратами - эталонным mAb1 к hTSLP и эталонным mAb1 к hIL-13. Один миллион человеческих клеток PBMC на лунку стимулировали с помощью 0,5 нг/мл рекомбинантного TSLP человека (рекомбинантный TSLP человека коммерчески доступен, например, от R&D Systems (номер по каталогу 1398-TS) вместе с IL-13 (R&D Systems, номер по каталогу 213-ILB-005/CF) и инкубировали с десятью концентрациями в 3-кратном серийном разведении конструкции на основе ISVD (наивысшая концентрация 10 нМ), эталонного mAb1 к hIL-13 (наивысшая концентрация 10 нМ) и эталонного mAb1 к hTSLP (наивысшая концентрация 100 нМ) в 96-луночном планшете в течение 20 часов в инкубаторе для культивирования клеток при 37^oC. Анализы выполняли в трех технических повторностях для F027400161 для каждого донора. Концентрации используемых цитокинов находились в пределах 2-кратной стандартной ошибки значений, о которых сообщалось в литературе для сыворотки крови, жидкости BAL, мокроты и кожи здоровых людей, астматиков и пациентов с атопическим дерматитом (Berraïes A et al., Immunol Letter 178: 85-91, 2016; Bellini A et al., Mucosal Immunology 5(2):140-9, 2012; Davoodi P et al., Cytokine 60(2):431-7, 2012; Szegedi K et al., J Eur Acad Dermatol Venereol 29(11):2136-44, 2015). Продуцирование CCL17 в свежесобранной надосадочной жидкости культуры клеток измеряли с помощью набора Meso Scale Diagnostics (MSD) V-PLEX для TARC человека.

Совокупные результаты для ответов в виде дозозависимого ингибирования у F027400161 и референтных антител - эталонного mAb1 к hIL-13 и эталонного mAb1 к hTSLP - показаны на фигуре 7. F027400161 демонстрировал 100% ингибирование индуцированного с помощью 0,5 нг/мл IL-13+TSLP синергического продуцирования CCL17 со средней IC₅₀, составляющей 0,0061 нM. Эталонное антитело mAb1 к hIL-13, несмотря на то, что оно характеризуется более низкой средней IC₅₀, составляющей 0,0028 нМ, было неспособно полностью блокировать синергический ответ с образованием CCL17 при эквимолярных дозах F027400161 и выходило на плато при примерно 80% ингибировании. С другой стороны, эталонное mAb1 к hTSLP было способно блокировать продуцирование CCL17 лишь на примерно 50% со средней IC₅₀, составляющей 2,932 нМ.

В заключение, эти результаты демонстрируют, что F027400161 является более активным, чем эталонное mAb1 к hTSLP, и превосходит эталонное mAb1 к hIL-13 в блокировании патофизиологически значимых концентраций при индуцированном IL-13 и TSLP синергическом ответе в человеческих PBMC, что подчеркивает его терапевтический потенциал для лечения воспалительных заболеваний 2 типа, таких как астма и атопический дерматит.

6.4.10 Пример 25. F027400161 блокирует индуцированное с помощью 5 нг/мл [IL-13+TSLP] синергическое продуцирование CCL17 в человеческих PBMC in vitro

Способность F027400161 ингибировать индуцированное с помощью 5 нг/мл IL-13+TSLP продуцирование CCL17 оценивали в человеческих PBMC от 8 отдельных здоровых доноров. Исследование было разработано для оценивания не меньшей эффективности конструкции на основе ISVD в сравнении с моноспецифическими биологическими препаратами - эталонным mAb1 к hTSLP и эталонным mAb1 к hIL-13. Концентрации используемых цитокинов в ~ 10 раз превышали верхнюю границу патофизиологических диапазонов для TSLP и IL-13, о которых сообщалось в литературе у нормальных людей, астматиков и пациентов с атопическим дерматитом (Berraïes A et al., Immunol Letter 178: 85-91, 2016; Bellini A et al., Mucosal Immunology 5(2):140-9, 2012; Davoodi P et al., Cytokine 60(2):431-7, 2012; Szegedi K et al., J Eur Acad Dermatol Venereol 29(11):2136-44, 2015) в качестве гипотетических концентраций во время транзиторного воспалительного состояния. Один миллион человеческих клеток PBMC на лунку стимулировали с помощью 5 нг/мл рекомбинантного TSLP человека вместе с IL-13 (R&D Systems, номер по каталогу 213-ILB-005/CF) и инкубировали с десятью концентрациями в 3-кратном серийном разведении F-27400161 (наивысшая концентрация 10 нМ), эталонного mAb1 к hIL-13 (наивысшая концентрация 10 нМ) и эталонного mAb1 к hTSLP (наивысшая концентрация 100 нM) в 96-луночном планшете в течение 20 часов в инкубаторе для культивирования клеток при 37^oC. Анализы выполняли в трех технических повторностях для F027400161 для каждого донора. Продуцирование CCL17 в свежесобранной надосадочной жидкости культуры клеток измеряли с помощью набора Meso Scale Diagnostics (MSD) V-PLEX для TARC человека.

Совокупные результаты для ответов в виде дозозависимого ингибирования у F027400161 и референтных антител - эталонного mAb1 к hIL-13 и эталонного mAb1 к hTSLP - показаны на фигуре 8. F027400161 демонстрировал 100% ингибирование индуцированного с помощью 5 нг/мл IL-13+TSLP синергического продуцирования CCL17 со средней IC₅₀, составляющей 0,0387 нM. Хотя РВМС, обработанные эквимолярными дозами антитела сравнения, представляющего собой эталонное mAb1 к hIL-13, демонстрировали более низкую среднюю IC₅₀, составляющую 0,01339 нМ, ответ в виде ингибирования никогда не достигал 100% и выходил на плато при примерно 90% ингибировании. С другой стороны, эталонное mAb1 к hTSLP лишь частично блокировало продуцирование CCL17 на примерно 40% со средней IC₅₀, составляющей 19 нМ.

В заключение, эти результаты демонстрируют, что F027400161 превосходит как эталонное mAb1 к hTSLP, так и эталонное mAb1 к hIL-13 в блокировании индуцированного IL-13 и TSLP синергического ответа с образованием CCL17 в человеческих PBMC при концентрациях [TSLP+IL-13], в 10 раз превышающих патофизиологические диапазоны для цитокинов, что подчеркивает его терапевтический потенциал для лечения астмы и атопического дерматита во время острой или воспалительной фазы.

6.4.11 Эксперимент 27. T027400161 блокирует индуцированное аллергеном Der P продуцирование IL-5, CCL17 и CCL26 в системе анализа с тремя культурами

TSLP управляет иммунным ответом 2 типа, индуцируя продуцирование CCL17, IL-5 и IL-13. Затем IL-13 запускает продуцирование CCL26 местными эпителиальными клетками, что приводит к развитию воспалительных заболеваний, опосредованных иммунным ответом 2 типа, и помимо них.

Способность F027400161 ингибировать индуцированное TSLP продуцирование IL-5 и CCL17, а также индуцированное IL-13 продуцирование CCL26 оценивали в системе анализа с тремя культурами с использованием фибробластов MRC5 и эпителиальных клеток A549, совместно культивируемых со стимулированными с помощью Der P человеческими PBMC от 6 отдельных нормальных доноров в течение 6 дней. Исследование было разработано для оценивания не меньшей эффективности ISVD в сравнении с моноспецифическими биологическими препаратами - эталонным mAb1 к hTSLP и эталонным mAb1 к hIL-13. Фибробласты MRC5 конститутивно продуцировали ~ 100 пг/мл эндогенного TSLP, а эпителиальные клетки A549 продуцировали CCL26 в ответ на IL-13, продуцируемый РВМС при стимуляции с помощью Der P и эндогенного TSLP. За день до совместного культивирования с человеческими PBMC высевали по семьдесят пять тысяч фибробластов MRC5 и эпителиальных клеток A549 на лунку. Один миллион человеческих клеток PBMC на лунку добавляли к высеянным фибробластам MRC5 и эпителиальным клеткам A549, стимулировали с помощью 3 мкг/мл Der P и инкубировали с 11,1 нМ ISVD, эталонного mAb1 к hIL-13 или эталонного mAb1 к hTSLP в 24-луночном планшете в течение 6 дней в инкубаторе для культивирования клеток при 37^oC. Анализы выполняли в трех технических повторностях для F027400161 для каждого донора. Продуцирование IL-5, CCL17 и CCL26 в свежесобранной надосадочной жидкости культуры клеток измеряли с помощью анализов Magnetic Luminex для человека от R&D Systems.

Совокупные результаты для ответов в виде ингибирования у F027400161 и референтных антител - эталонного mAb1 к hIL-13 и эталонного mAb1 к hTSLP - показаны на фигуре 9. F027400161 демонстрировал ингибирование CCL17 на 60%, ингибирование IL-5 на 50% и ингибирование продуцирования CCL26 на 95%. Эталонное антитело, представляющее собой эталонное mAb1 к hTSLP, демонстрировало ингибирование CCL17 на 50%, ингибирование IL-5 на 50% и ингибирование продуцирования CCL26 на примерно 55%. Хотя эталонное mAb1 к hIL-13 демонстрирует сопоставимое 95% ингибирование продуцирования CCL26, это эталонное антитело было способно блокировать продуцирование CCL17 лишь на примерно 35% и продуцирование IL-5 менее чем на 10% (фигура 9). Отсутствие полного ингибирования IL-5 и CCL17 этими тестируемыми молекулами может свидетельствовать о том, что стимуляция с помощью Der P активирует проявление в PBMC путей управления продуцированием IL-5 и CCL17, отличных от TSLP и IL-13.

В заключение, эти результаты демонстрируют, что ISVD для TSLP/IL-13 F027400161 превосходит эталонное mAb1 к hTSLP и эталонное mAb1 к hIL-13 по своей способности блокировать три цитокина и хемокина (CCL17, IL-5 и CCL26) в комплексной системе анализа, включающей человеческие PBMC, совместно культивируемые со структурными клетками тканей, что подчеркивает его терапевтический потенциал для лечения воспалительных заболеваний 2 типа, таких как астма и атопический дерматит, а также широкого спектра показаний при иммунологических заболеваниях.

6.4.12 Пример 26. Мышиная модель NSG-SGM3 для оценивания опосредованной F027400161 занятости мишеней и фармакодинамики in vivo

F027400161 нацеливается как на TSLP, так и на IL-13 человека и не реагирует перекрестно с мышиными ортологами. Следовательно, для оценивания форм биологической активности F027400161 использовали ксенотрансплантатную гуманизированную модельную систему. Самок NSG-SGM3 (NOD/SCID-IL2Rγ-/-, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rγtm1Wjl/SzJ) получали из Jackson Labs, Бар-Харбор, Мэн, США. Эти мыши экспрессируют гемопоэтические цитокины человека: фактор стволовых клеток (SCF), гранулоцитарно-макрофагальный стимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин-3 (IL-3), все из которых находятся под управлением промоторной/энхансерной последовательности цитомегаловируса человека. Трижды трансгенная мышь конститутивно продуцирует вышеуказанные цитокины, обеспечивающие сигналы пролиферации и выживания клеток, поддерживающие стабильное приживление CD33+ клеток миелоидной линии дифференцировки и нескольких типов лимфоидных клеток. Вкратце, протокол, которому следуют при трансплантации, выглядит следующим образом.

В день 0 исследования мышей облучали дозой 150 сантигрей со скоростью 120 рад/мин в течение 1 минуты 15 секунд. Мышам трансплантировали 1 × 10⁵ CD34+ стволовых клеток/клеток-предшественников пуповинной крови внутривенным (IV) путем в 200 мкл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) через примерно 6 часов после облучения. Одну группу мышей облучали таким же образом, но клетки им не трансплантировали. Эти мыши считаются облученными мышами, не подвергавшимися воздействию. В день 88 после трансплантации мыши получали i.v. гидродинамическую (HDD) инъекцию физиологического раствора (контрольные мыши, которым трансплантировали клетки) либо 50 мкг миникольцевой ДНК IL-4 в комбинации с 50 мкг миникольцевой ДНК TSLP. В день 91 производили забор крови из поднижнечелюстной вены, и у каждой мыши собирали от 100 до 150 мкл крови и помещали в пробирки с литий-гепарином. Проверку приживления проводили с помощью проточной цитометрии, и оценивали уровни IL-4 и TSLP в плазме крови. Информацию о проверке приживления и/или определении цитокинов использовали для отбора (распределения или исключения) мышей в исследовании. Мышей из контрольной группы, которой трансплантировали клетки, с менее чем 25% человеческих CD45+ клеток исключали из исследования. Аналогичным образом, мышей, которым трансплантировали клетки, получивших миникольцевую ДНК и продемонстрировавших уровни TSLP в плазме крови на 1 стандартное отклонение ниже среднего значения, также исключали из исследования. Мыши, получившие миникольцевую ДНК с помощью i.v. HDD-инъекции, получали подкожные дозы среды-носителя (20 мМ фосфата, 125 мМ L-аргинина-HCL и 0,01% Tween 20, pH 7,0) либо F027400161 (0,01, 0,05, 0,1 или 10 мг/кг) в дни 95, 97, 99 и 101. В день 103 мышей анестезировали путем анестезии изофлураном. Во время анестезии изофлураном кровь собирали путем забора крови из ретроорбитального синуса. После забора крови мышей, которые все еще находились под анестезией изофлураном, умерщвляли путем цервикальной дислокации. Часть легкого собирали и помещали в RNAlater для оценивания экспрессии генов. Уровни TSLP человека в плазме крови из образцов плазмы крови в день 103 определяли путем оценивания с помощью набора MSD (номер по каталогу K15067-L-2, Meso Scale Diagnostics, Роквилл, Мэриленд, США). Уровни IL-13 человека в плазме крови из образцов плазмы крови в день 103 определяли с помощью ELISA (номер по каталогу 88-7439-88, набор для ELISA IL-13 человека, Invitrogen/Thermo-Fischer, Уолтем, Массачусетс, США). Эксперименты по внутренней валидации анализа демонстрировали, что оба из наборов для выявления TSLP человека и IL-13 человека не были способны выявлять связавшиеся с F027400161 hTSLP и hIL-13.

Совокупные результаты этих экспериментов, показанные на фигуре 10 и фигуре 11, демонстрируют, что F027400161 был способен значительно ингибировать выявляемые уровни TSLP и IL-13 человека в плазме крови гуманизированных мышей NSG-SGM3, демонстрируя занятость мишеней как для TSLP человека, так и для IL-13 человека.

В мышиной модели NSG-SGM3 гидродинамическая доставка кДНК TSLP и IL-4 приводит к активации экспрессии IL-13 человека (фигура 11). Фармакодинамические эффекты F027400161 изучали с использованием образцов, полученных в ходе исследования NSG-SGM3, используя способность IL-13 человека передавать сигналы через рецептор IL-13 мыши (Hershey GK. 2003, J Allergy Clin Immunol.;111(4):677-90). В этих исследованиях изучалось влияние обработки с помощью F027400161 на транскрипты мышиных генов, регулируемых IL-13 человека. В этом анализе использовали ткани легкого мыши из вышеуказанного исследования.

Легкие обработанных и контрольных мышей NSG-SGM3 собирали и обрабатывали для получения РНК, как подробно описано в прилагаемом протоколе. РНК обрабатывали для количественного определения с помощью TaqMan, а данные анализировали, как описано в протоколах. Вкратце, легкие, собранные у мышей, хранили в RNAlater, обрабатывали и очищали в соответствии со стандартными протоколами для получения РНК высокого качества. Затем очищенную РНК из легкого подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием 5X мастер-микса Quanta qScript в соответствии с протоколом производителя. Полученную кДНК из легкого использовали для количественного определения уровней экспрессии транскриптов мышиных генов-мишеней, отвечающих на IL-13 человека (Retnla мыши и Clca1 мыши), и эндогенного контроля (Rpl37a) с использованием анализа TaqMan в соответствии с протоколами производителя. Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения QuantStudio 6&7 Flex. Для каждого зонда значения C_T и значения дельта-C_T (относительно Rpl37a) экспортировали в Excel, и значения относительной экспрессии для каждого гена рассчитывали по следующей формуле:

нормализованная относительная экспрессия=(Мощность(2, -(дельта-CT)))*1000

Двумя оцениваемыми мышиными генами, регулируемыми IL-13 человека, являлись Retnla (резистин-подобная молекула альфа), который играет роль в ремоделировании легочных сосудов, и Clca1 (вспомогательный хлоридный канал 1) (Lewis CC, 2009, J Allergy Clin Immunol.;123(4):795-804).

Совокупные результаты этих экспериментов, показанные на фигурах 12 и 13, демонстрируют, что F027400161 был способен значительно ингибировать экспрессию транскриптов Retnla мыши и Clca1 мыши, демонстрируя фармакодинамический эффект F027400161 in vivo в отношении управляемых IL-13 человека ответов мышиных транскриптов.

Способы

Получение гомогената образца

Легкие собирали у мышей и хранили в RNAlater. Затем доли легких высушивали и переносили в пробирки с лизирующей матрицей FastPrep A (для гомогенизации легких), содержащие 1 мл RLT+2-ME. Образцы гомогенизировали в гомогенизаторе MP-Bio с использованием программы 1 (два 40-секундных цикла, разделенных 5 минутами во избежание нагревания образца). Затем образцы осаждали путем центрифугирования при 10000 g в течение 3 минут. Собирали 350 мкл лизата [в RLT+2ME (1% об./об.)]. Пипетировали с использованием многоканального устройства несколько раз (~ 20x), чтобы лизировать клетки.

Получение РНК

Для очистки РНК использовали 350 мкл гомогената. Добавляли 1X объем (350 мкл) 70% этанола, и гомогенат тщательно перемешивали и переносили в 96-луночный микроцентрифужный планшет RNeasy, помещенный в планшет для элюирования, и РНК получали с использованием протокола экстракции РНК из тканей Qiagen RNA mini со следующими модификациями. 96-луночный планшет покрывали герметичной алюминиевой фольгой и центрифугировали в течение 2 минут при 4000 x g. Для промывки колонки в микроцентрифужные колонки RNeasy добавляли 400 мкл буфера RWT, и планшет с микроцентрифужными колонками центрифугировали в течение 2 минут при к. т. при 4000 x g. Расщепление с помощью ДНКазы I осуществляли путем добавления 80 мкл 1X смеси ДНКазы I и инкубации при к. т. в течение 15 минут. ДНКазу I смывали путем добавления 400 мкл буфера RWT и центрифугирования планшета при 4000 x g в течение 2 минут. После этого следовала промывка микроцентрифужного планшета с помощью 500 мкл каждого из буфера RPE и 80% этанола. После этого следовало высушивание мембран колонки путем центрифугирования при 4000 x g в течение 4 минут. Затем РНК элюировали в 40 мкл Трис-HCl (10 мМ, рН 8,0). РНК количественно определяли с помощью NanoDrop, а 500 нг РНК использовали для получения кДНК.

Синтез первой нити

Использовали 5X мастер-микс Quanta qScript, и кДНК синтезировали с использованием протокола производителя. Конечная концентрация кДНК составляла 25 нг/мкл. кДНК хранили при -20 градусах Цельсия до проведения анализа TaqMan.

Анализ TaqMan

Мастер-микс TaqMan для мультиплексной ПЦР получали в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл путем добавления компонентов в следующем порядке. Три отдельных мастер-микса готовили для каждого набора зондов вместе с внутренним контролем Rpl37a. Каждая мультиплексная qPCR-реакция проводилась в реакционном объеме 10 мкл.

Компонент Одна реакция (мкл) Для 40 реакций (мкл) 50X набор праймеров и зондов для RPL37A 0,3 10 20X набор праймеров и зондов для гена-мишени 0,6 24 Вода 2,8 4 Мастер-микс TaqMan Fast Advanced; 2X 5,0 200 Всего 8,7 238

В общей сложности 8,8 мкл мастер-микса добавляли для каждого образца в соответствующие лунки 384-луночного оптического планшета. В каждую лунку добавляли 30 нг (1,2 мкл) образцов кДНК. Анализ TaqMan организовывали на QuantStudio 7K. Условия в термоциклере были следующими: предварительная денатурация при 95°С в течение 3 мин, 40 циклов денатурации при 95°С в течение 2 с, отжиг и удлинение при 60°С в течение 5 с. Измерения флуоресценции проводили на стадии удлинения.

Анализ данных

Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения QuantStudio 6&7 Flex.

Для каждого зонда значения CT и значения дельта-CT (относительно Rpl37a) экспортировали в Excel, и значения относительной экспрессии для каждого гена рассчитывали по следующей формуле:

нормализованная относительная экспрессия=(мощность(2, -(дельта CT)))*1000

Литературные источники

Liu, Y.J. 2006, J Exp Med.;203(2):269-73. Thymic stromal lymphopoietin: master switch for allergic inflammation.

Hershey GK. 2003, J Allergy Clin Immunol.;111(4):677-90. IL-13 receptors and signaling pathways: an evolving web.

Lewis CC, Aronow B, Hutton J, Santeliz J, Dienger K, Herman N, Finkelman FD, Wills-Karp M. 2009, J Allergy Clin Immunol.;123(4):795-804. Unique and overlapping gene expression patterns driven by IL-4 and IL-13 in the mouse lung.

7 Промышленная применимость

Полипептиды, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие их, векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, и композиции, описанные в данном документе, можно применять, например, для лечения субъектов, страдающих воспалительными заболеваниями.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ablynx NV

<110> Sanofi

<120> ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ОДИНОЧНЫЕ ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ, НАЦЕЛИВАЮЩИЕСЯ НА IL-13 И TSLP

<130> 228533

<150> US 62/945,391

<151> 2019-12-09

<150> EP 20 305 064.6

<151> 2020-01-27

<160> 177

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 671

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F027400161

<400> 1

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

145 150 155 160

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

165 170 175

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met

180 185 190

Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser

195 200 205

Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

210 215 220

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

225 230 235 240

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Asn

245 250 255

Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser Phe Asp

260 265 270

Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val

290 295 300

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser

305 310 315 320

Gly Phe Gly Val Asn Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile

325 330 335

Glu Arg Glu Leu Ile Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr

340 345 350

Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu

355 360 365

Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly

370 375 380

Leu Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp

385 390 395 400

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

405 410 415

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

420 425 430

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

435 440 445

Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro

450 455 460

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala

465 470 475 480

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

485 490 495

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu

500 505 510

Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr

515 520 525

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu

530 535 540

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser

545 550 555 560

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Asp

565 570 575

Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly

580 585 590

Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

595 600 605

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val

610 615 620

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

625 630 635 640

Cys Ala Val Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe Asp

645 650 655

Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

660 665 670

<210> 2

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 4B02

<400> 2

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 126

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 4B06

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser

100 105 110

Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 501A02

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn

20 25 30

Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ALB23002

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 529F10

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

20 25 30

Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe

100 105 110

Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1

<400> 7

Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Arg Met Gly

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1

<400> 8

Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Lys

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1

<400> 9

Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn Ile Leu Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1

<400> 10

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1

<400> 11

Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Asp Tyr Asp Ile Gly

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2

<400> 12

Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2

<400> 13

Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp

1 5 10

<210> 14

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2

<400> 14

Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2

<400> 15

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2

<400> 16

Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3

<400> 17

Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3

<400> 18

Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 19

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3

<400> 19

Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu

1 5

<210> 20

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3

<400> 20

Gly Gly Ser Leu Ser Arg

1 5

<210> 21

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3

<400> 21

Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe Asp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 22

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR1

<400> 22

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 23

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR1

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 24

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR2

<400> 24

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR2

<400> 25

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR2

<400> 26

Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu Leu Ile Ala

1 5 10

<210> 27

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR2

<400> 27

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 28

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR2

<400> 28

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser

1 5 10

<210> 29

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR3

<400> 29

Thr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 30

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR3

<400> 30

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Asn

35

<210> 31

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR3

<400> 31

Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Glu Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

20 25 30

Gly Leu Tyr Tyr Cys Ala Ser

35

<210> 32

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR3

<400> 32

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile

35

<210> 33

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR3

<400> 33

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Val

35

<210> 34

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR4

<400> 34

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR4

<400> 35

Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 36

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR4

<400> 36

Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 37

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1

<400> 37

Ser Tyr Arg Met Gly

1 5

<210> 38

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1

<400> 38

Asn Tyr Ala Met Lys

1 5

<210> 39

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1

<400> 39

Val Asn Ile Leu Tyr

1 5

<210> 40

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1

<400> 40

Ser Phe Gly Met Ser

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1

<400> 41

Asp Tyr Asp Tyr Asp Ile Gly

1 5

<210> 42

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2

<400> 42

Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2

<400> 43

Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 44

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2

<400> 44

Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 45

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2

<400> 45

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 46

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2

<400> 46

Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 47

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR1

<400> 47

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 48

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR1

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

20 25 30

<210> 49

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR1

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly

20 25 30

<210> 50

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR1

<400> 50

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg

20 25 30

<210> 51

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR1

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala

20 25 30

<210> 52

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR3

<400> 52

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 53

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR3

<400> 53

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Asn

20 25 30

<210> 54

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR3

<400> 54

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Met Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Ala Ser

20 25 30

<210> 55

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR3

<400> 55

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile

20 25 30

<210> 56

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR3

<400> 56

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Val

20 25 30

<210> 57

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb8

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb23

<400> 58

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb129

<400> 59

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 60

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb132

<400> 60

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 61

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb11

<400> 61

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb11 (S112K)-A

<400> 62

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 63

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb82

<400> 63

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 64

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb82-A

<400> 64

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 65

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb82-AA

<400> 65

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala

115

<210> 66

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb82-AAA

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala Ala

115

<210> 67

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb82-G

<400> 67

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly

115

<210> 68

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb82-GG

<400> 68

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly

115

<210> 69

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb82-GGG

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly

115

<210> 70

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb23002

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 71

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Alb223

<400> 71

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 72

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 3A

<400> 72

Ala Ala Ala

1

<210> 73

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 5GS

<400> 73

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 74

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 7GS

<400> 74

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 75

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 8GS

<400> 75

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 76

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 9GS

<400> 76

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 77

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 10GS

<400> 77

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 78

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 15GS

<400> 78

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 79

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 18GS

<400> 79

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 80

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 20GS

<400> 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 81

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 25GS

<400> 81

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 82

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 30GS

<400> 82

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 83

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 35GS

<400> 83

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser

35

<210> 84

<211> 40

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер 40GS

<400> 84

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40

<210> 85

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирный участок G1

<400> 85

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 86

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирный участок 9GS-G1

<400> 86

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

1 5 10 15

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

20

<210> 87

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Llama upper long hinge region

<400> 87

Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 88

<211> 62

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Шарнирный участок G3

<400> 88

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys

1 5 10 15

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

20 25 30

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

35 40 45

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

50 55 60

<210> 89

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 89

Lys Glu Arg Glu

1

<210> 90

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 90

Lys Gln Arg Glu

1

<210> 91

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 91

Gly Leu Glu Trp

1

<210> 92

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 92

Lys Glu Arg Glu Leu

1 5

<210> 93

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 93

Lys Glu Arg Glu Phe

1 5

<210> 94

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 94

Lys Gln Arg Glu Leu

1 5

<210> 95

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 95

Lys Gln Arg Glu Phe

1 5

<210> 96

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 96

Lys Glu Arg Glu Gly

1 5

<210> 97

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 97

Lys Gln Arg Glu Trp

1 5

<210> 98

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 98

Lys Gln Arg Glu Gly

1 5

<210> 99

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 99

Thr Glu Arg Glu

1

<210> 100

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 100

Thr Glu Arg Glu Leu

1 5

<210> 101

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 101

Thr Gln Arg Glu

1

<210> 102

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 102

Thr Gln Arg Glu Leu

1 5

<210> 103

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 103

Lys Glu Cys Glu

1

<210> 104

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 104

Lys Glu Cys Glu Leu

1 5

<210> 105

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 105

Lys Glu Cys Glu Arg

1 5

<210> 106

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 106

Lys Gln Cys Glu

1

<210> 107

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 107

Lys Gln Cys Glu Leu

1 5

<210> 108

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 108

Arg Glu Arg Glu

1

<210> 109

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 109

Arg Glu Arg Glu Gly

1 5

<210> 110

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 110

Arg Gln Arg Glu

1

<210> 111

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 111

Arg Gln Arg Glu Leu

1 5

<210> 112

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 112

Arg Gln Arg Glu Phe

1 5

<210> 113

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 113

Arg Gln Arg Glu Trp

1 5

<210> 114

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 114

Gln Glu Arg Glu

1

<210> 115

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 115

Gln Glu Arg Glu Gly

1 5

<210> 116

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 116

Gln Gln Arg Glu

1

<210> 117

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 117

Gln Gln Arg Glu Trp

1 5

<210> 118

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 118

Gln Gln Arg Glu Leu

1 5

<210> 119

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 119

Gln Gln Arg Glu Phe

1 5

<210> 120

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 120

Lys Gly Arg Glu

1

<210> 121

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 121

Lys Gly Arg Glu Gly

1 5

<210> 122

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 122

Lys Asp Arg Glu

1

<210> 123

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 123

Lys Asp Arg Glu Val

1 5

<210> 124

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 124

Asp Glu Cys Lys Leu

1 5

<210> 125

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 125

Asn Val Cys Glu Leu

1 5

<210> 126

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 126

Gly Val Glu Trp

1

<210> 127

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 127

Glu Pro Glu Trp

1

<210> 128

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 128

Gly Leu Glu Arg

1

<210> 129

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 129

Asp Gln Glu Trp

1

<210> 130

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 130

Asp Leu Glu Trp

1

<210> 131

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 131

Gly Ile Glu Trp

1

<210> 132

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 132

Glu Leu Glu Trp

1

<210> 133

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 133

Gly Pro Glu Trp

1

<210> 134

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 134

Glu Trp Leu Pro

1

<210> 135

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 135

Gly Pro Glu Arg

1

<210> 136

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 136

Gly Leu Glu Arg

1

<210> 137

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 137

Glu Leu Glu Trp

1

<210> 138

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 138

Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210> 139

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 139

Val Lys Val Ser Ser

1 5

<210> 140

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 140

Val Gln Val Ser Ser

1 5

<210> 141

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 141

Val Thr Val Ser Ser Ala

1 5

<210> 142

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 142

Val Lys Val Ser Ser Ala

1 5

<210> 143

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 143

Val Gln Val Ser Ser Ala

1 5

<210> 144

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F0107004B02

<400> 144

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Asn Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 145

<211> 126

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F0107004B06

<400> 145

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Arg Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser

100 105 110

Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 146

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F0107501A02

<400> 146

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn

20 25 30

Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 147

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F0107529F10

<400> 147

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

20 25 30

Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe

100 105 110

Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 148

<211> 284

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010700003

<400> 148

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Arg Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser

100 105 110

Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser

180 185 190

Tyr Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe

195 200 205

Val Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser

210 215 220

Val Asn Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro

260 265 270

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275 280

<210> 149

<211> 281

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010700014

<400> 149

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Asn Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

145 150 155 160

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu

165 170 175

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Arg Met

180 185 190

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala

195 200 205

Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val Asn Ser

210 215 220

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

225 230 235 240

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala

245 250 255

Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr Trp Gly

260 265 270

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275 280

<210> 150

<211> 284

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010700029

<400> 150

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Asn Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

145 150 155 160

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

165 170 175

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met

180 185 190

Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser

195 200 205

Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

210 215 220

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Arg Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

225 230 235 240

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asn

245 250 255

Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser Phe Asp

260 265 270

Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275 280

<210> 151

<211> 287

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010700031

<400> 151

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Arg Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser

100 105 110

Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn

180 185 190

Tyr Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

195 200 205

Val Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser

210 215 220

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Arg Lys Asn Thr Leu

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

245 250 255

Cys Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu

260 265 270

Ser Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275 280 285

<210> 152

<211> 279

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010703842

<400> 152

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

20 25 30

Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe

100 105 110

Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

165 170 175

Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly

180 185 190

Val Asn Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu

195 200 205

Leu Ile Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser

210 215 220

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Met

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr

245 250 255

Cys Ala Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly

260 265 270

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275

<210> 153

<211> 279

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F027400016

<400> 153

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn

20 25 30

Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

145 150 155 160

Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

165 170 175

Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg

180 185 190

Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg

195 200 205

Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

210 215 220

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

225 230 235 240

Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys

245 250 255

Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly

260 265 270

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275

<210> 154

<211> 284

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010700003-SO

<400> 154

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser

100 105 110

Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser

180 185 190

Tyr Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe

195 200 205

Val Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser

210 215 220

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

245 250 255

Cys Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro

260 265 270

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275 280

<210> 155

<211> 281

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010700014-SO

<400> 155

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

145 150 155 160

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

165 170 175

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Arg Met

180 185 190

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala

195 200 205

Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val Lys Gly

210 215 220

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

225 230 235 240

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala

245 250 255

Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr Trp Gly

260 265 270

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275 280

<210> 156

<211> 284

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010700029-SO

<400> 156

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

145 150 155 160

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

165 170 175

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met

180 185 190

Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser

195 200 205

Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

210 215 220

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

225 230 235 240

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Asn

245 250 255

Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser Phe Asp

260 265 270

Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275 280

<210> 157

<211> 287

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010700031-SO

<400> 157

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser

100 105 110

Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn

180 185 190

Tyr Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

195 200 205

Val Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser

210 215 220

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

245 250 255

Cys Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu

260 265 270

Ser Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275 280 285

<210> 158

<211> 279

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010703842-SO

<400> 158

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

20 25 30

Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe

100 105 110

Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro

165 170 175

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly

180 185 190

Val Asn Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu

195 200 205

Leu Ile Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser

210 215 220

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Met

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr

245 250 255

Cys Ala Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly

260 265 270

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275

<210> 159

<211> 279

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F027400016-SO

<400> 159

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn

20 25 30

Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

145 150 155 160

Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

165 170 175

Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg

180 185 190

Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg

195 200 205

Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

210 215 220

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

225 230 235 240

Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys

245 250 255

Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly

260 265 270

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

275

<210> 160

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010704076

<400> 160

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn

20 25 30

Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 161

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F010704099

<400> 161

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

20 25 30

Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe

100 105 110

Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 162

<211> 126

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F027100019

<400> 162

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Leu Ser Gly Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Thr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Leu Gln Tyr Val Ser Gly Trp Ser Tyr Asp Tyr Pro Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<210> 163

<211> 126

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F027100183

<400> 163

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Val Pro Phe Gly Tyr Tyr Ser Glu His Phe Ser Gly Leu Ser

100 105 110

Phe Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 164

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F027400021

<400> 164

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

20 25 30

Asp Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Val Ser Cys Ile Ser Asn Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Val Glu Ile His Cys Asp Asp Tyr Gly Val Glu Asn Phe

100 105 110

Asp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 165

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> F027400160

<400> 165

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Gly Val Asn

20 25 30

Ile Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Ile Glu Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Arg Asn Ile Phe Asp Gly Thr Thr Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 166

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 166

Val Thr Val Lys Ser

1 5

<210> 167

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 167

Val Thr Val Gln Ser

1 5

<210> 168

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 168

Val Lys Val Lys Ser

1 5

<210> 169

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 169

Val Lys Val Gln Ser

1 5

<210> 170

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 170

Val Gln Val Lys Ser

1 5

<210> 171

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 171

Val Gln Val Gln Ser

1 5

<210> 172

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 172

Val Thr Val Lys Ser Ala

1 5

<210> 173

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 173

Val Thr Val Gln Ser Ala

1 5

<210> 174

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 174

Val Lys Val Lys Ser Ala

1 5

<210> 175

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 175

Val Lys Val Gln Ser Ala

1 5

<210> 176

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 176

Val Gln Val Lys Ser Ala

1 5

<210> 177

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> C-конец

<400> 177

Val Gln Val Gln Ser Ala

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к полипептиду для специфического связывания с IL-13 и TSLP, который содержит или состоит из пяти одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (ISVD), причем два ISVD связываются с IL-13 и два ISVD связываются с TSLP. Также раскрыта нуклеиновая кислота для экспрессии полипептида, композиция для лечения воспалительного заболевания 2 типа, предпочтительно, где воспалительное заболевание 2 типа выбрано из астмы и атопического дерматита. Изобретение также относится к применению полипептида или композиции для лечения воспалительного заболевания 2 типа. Изобретение обеспечивает получение нового типа лекарственного средства для лечения субъекта, страдающего воспалительным заболеванием. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 14 ил., 37 табл., 26 пр.

1. Полипептид для специфического связывания с IL-13 и TSLP, который содержит или состоит из пяти одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина (ISVD), где каждый из указанных ISVD содержит три определяющие комплементарность области от CDR1 до CDR3 соответственно, где ISVD необязательно связаны посредством одного или нескольких пептидных линкеров и где:

a) первый ISVD специфично связывается с IL-13 и содержит:

i) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7;

ii) CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12; и

iii) CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17;

b) второй ISVD специфично связывается с IL-13 и содержит:

iv) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8;

v) CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13; и

vi) CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18;

c) третий ISVD специфично связывается с TSLP и содержит:

vii) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9;

viii) CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14; и

ix) CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19; и

d) четвертый ISVD специфично связывается с TSLP и содержит:

x) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11;

xi) CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16; и

xii) CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21,

где порядок ISVD указывает на их относительное расположение друг с другом, рассматриваемое от N-конца до C-конца указанного полипептида.

2. Полипептид по п. 1, где:

a) аминокислотная последовательность указанного первого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2;

b) аминокислотная последовательность указанного второго ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3;

c) аминокислотная последовательность указанного третьего ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4; и

d) аминокислотная последовательность указанного четвертого ISVD характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6.

3. Полипептид по п. 1 или 2, где:

a) указанный первый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2;

b) указанный второй ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

c) указанный третий ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

d) указанный четвертый ISVD содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6.

4. Полипептид по любому из пп. 1-3, где указанный полипептид содержит одну или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, необязательно связанных посредством одного или нескольких пептидных линкеров, при этом указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида по сравнению с соответствующим полипептидом без указанных одной или нескольких других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц.

5. Полипептид по п. 4, в котором указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, которые обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида, выбраны из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, белков сыворотки крови или их фрагментов, связывающих единиц, которые могут связываться с белками сыворотки крови, Fc-части и небольших белков или пептидов, которые могут связываться с белками сыворотки крови.

6. Полипептид по п. 4 или 5, в котором указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, которые обеспечивают увеличенный период полужизни полипептида, выбраны из группы, состоящей из связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточным альбумином или сывороточным иммуноглобулином.

7. Полипептид по п. 6, в котором указанная связывающая единица, которая обеспечивает увеличенный период полужизни полипептида, представляет собой сывороточный альбумин человека или IgG; предпочтительно ISVD, который может связываться с сывороточным альбумином человека.

8. Полипептид по п. 7, где ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит:

i) CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 10;

ii) CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 15; и

iii) CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20 или аминокислотную последовательность, имеющую 2 или 1 аминокислотное отличие от SEQ ID NO: 20.

9. Полипептид по п. 7 или 8, где ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит CDR1, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, CDR2, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15, и CDR3, которая представляет собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.

10. Полипептид по любому из пп. 7-9, где аминокислотная последовательность указанного ISVD, связывающегося с сывороточным альбумином человека, характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5; предпочтительно, где указанный ISVD, связывающийся с сывороточным альбумином человека, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5.

11. Полипептид по любому из пп. 1-10, где аминокислотная последовательность полипептида характеризуется более чем 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1.

12. Полипептид по любому из пп. 1-11, где полипептид содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1.

13. Нуклеиновая кислота для экспрессии полипептида по любому из пп. 1-12, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по любому из пп. 1-12.

14. Композиция для лечения воспалительного заболевания 2 типа, предпочтительно, где воспалительное заболевание 2 типа выбрано из астмы и атопического дерматита, содержащая по меньшей мере один полипептид по любому из пп. 1-12 или нуклеиновую кислоту по п. 13, представляющая собой фармацевтическую композицию, которая дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель и/или вспомогательное средство и необязательно содержит один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

15. Применение полипептида по любому из пп. 1-12 или композиции по п. 14 для лечения воспалительного заболевания 2 типа; предпочтительно, где воспалительное заболевание 2 типа выбрано из астмы и атопического дерматита.