КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА СОЕДИНЕНИЯ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕГО СОБОЙ ПРОЛЕКАРСТВО ЛАНОСТЕРИНА, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ В ИЗГОТОВЛЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КАТАРАКТЫ Российский патент 2022 года по МПК C07J9/00 A61K9/08 A61K31/573 A61P27/12 

Область техники

Настоящее изобретение относится к кристаллической форме соединения формулы (I) и ее применению для получения лекарственного средства для лечения катаракты.

Уровень техники

Катаракта представляет собой заболевание глаза, которое возникает в хрусталике глазного яблока, и помутнение хрусталика в совокупности называют катарактой. Старение, наследственность, метаболическое расстройство, травма, облучение, отравление и локальная недостаточность питательных веществ могут вызывать повреждение капсулы хрусталика, что приводит в результате к увеличению проницаемости и потере барьерной функции или вызывает метаболические нарушения в хрусталике, приводя к денатурации белка хрусталика и возникновению помутнения. Если прозрачный хрусталик глазного яблока становится замутненным, а это сказывается на количестве получаемого глазами солнечного света, то это повлияет на остроту зрения. При легкой степени помутнения в глазном яблоке эффект в отношении зрения является менее значительным, однако по мере постепенного усиления степени помутнения острота зрения будет снижаться, и в тяжелых случаях это приведет к слепоте. Катаракта является одним из наиболее распространенных заболеваний глаз, приводящих к слепоте, и она является основной причиной слепоты. Поскольку механизм развития катаракты все еще не установлен, прорыва в лекарственной терапии сделано не было. Поэтому в настоящее время единственным эффективным способом лечения является хирургическое лечение. Несмотря на постоянное совершенствование хирургии катаракты, что оказало существенное содействие в лечении катаракты, уровень излечения в результате хирургического лечения все еще находится значительно ниже уровня заболеваемости, и присутствует вероятность серьезных осложнений. С другой стороны, стоимость хирургического лечения катаракты является крайне высокой, и даже в развитых странах катаракта тяжело обременяет систему медицинского страхования. Таким образом, предупреждение и лечение с помощью лекарственных средств играет решающую роль. В настоящее время терапевтические лекарственные средства, доступные для клинического лечения катаракты, включают: 1) ингибиторы альдозоредуктазы, такие как каталин (каталин, Kary Uni, прифеноксин натрия), факолизин, бендазак L-лизин и т.д.; 2) лекарственные средства против окислительного повреждения, такие как глутатион, таурин, аспирин и т.д.; 3) лекарственные средства на основе необходимых для метаболизма питательных элементов, такие как витамины, каротиноиды и т.д.; 4) соединения растительного происхождения, используемые в традиционной китайской медицине, в том числе таблетка Шиху Егуан, таблетка Ци Цзюй Ди Хуан, таблетка Шицзюэмин Сань и т.п. В ходе продолжительных клинических исследований было подтверждено, что эти лекарственные средства для лечения катаракты могут лишь замедлять разрушение, происходящее при катаракте, но не могут обеспечить регрессию состояния с осуществлением таким образом лечения катаракты. В то же время по мере того, как общество Китая становится стареющим, число пациентов с катарактой возрастает, и потребность в лекарственных средствах против катаракты будет становиться все более острой. Таким образом, в клинической практике необходимы новые группы офтальмологических лекарственных средств местного применения против катаракты, характеризующиеся безопасностью, хорошим лечебным эффектом, высокой интраокулярной проникающей способностью и стабильностью.

Ланостерин представляет собой амфифильную молекулу, в высоких количествах содержащуюся в хрусталике. Она синтезируется ланостеринсинтазой (LSS) в ходе ключевой реакции циклизации в пути синтеза холестерина. Ланостерин может снижать уровень патологической агрегации белков хрусталика и обеспечивает их постоянное перестраивание для восстановления прозрачности хрусталика. Исследования показали, что ланостеринсинтазу можно обнаружить в хрусталике. Кроме того, в исследовании на крысах с катарактой Shumiya было показано, что определенная комбинация гомозиготных мутаций ланостеринсинтазы и фарнезилдифосфатфарнезилтрансферазы 1 (FDFT1) может обеспечивать снижение уровня холестерина в хрусталике и приводить к развитию катаракты. В то же время в ходе последних исследований, проведенных авторами настоящего изобретения, было обнаружено, что ланостерин может обеспечивать значительное снижение содержания ранее сформированных агрегатов белков хрусталика in vitro и на клеточном уровне. Было также подтверждено, что ланостерин может обеспечивать регрессию состояния, представляющего собой катаракту, и приводить к устранению помутнения и восстановлению прозрачности хрусталика in vivo. Данный результат был недавно опубликован в Nature и привлек внимание во всем мире, и ланостерин представляется новой молекулой для предупреждения и лечения катаракты.

Раскрытие изобретения

В настоящем изобретении представлена кристаллическая форма А соединения формулы (I), где порошковая рентгеновская дифрактограмма (XPRD) кристаллической формы А содержит характеристические дифракционные пики при следующих значениях угла 2θ: 8,60±0,2°, 9,38±0,2°, 10,57±0,2°, 12,54±0,2°, 14,43±0,2°, 15,06±0,2°, 17,22±0,2° и 25,18±0,2°.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения порошковая рентгеновская дифрактограмма кристаллической формы А содержит характеристические дифракционные пики при следующих значениях угла 2θ: 4,350°, 8,598°, 9,383°, 10,566°, 12,542°, 13,448°, 14,428°, 14,591°, 15,063°, 15,453°, 15,820°, 16,803°, 17,216°, 20,985°, 21,181°, 22,225°, 22,601°, 22,856°, 23,726°, 24,039°, 24,534°, 25,185°, 25,514°, 25,935°, 26,570°, 27,867°, 28,125°, 28,416°, 29,114°, 29,445°, 31,914°, 33,710°, 34,297°, 34,329°, 36,014°, 36,108° и 38,196°. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения порошковая рентгеновская дифрактограмма кристаллической формы А показана на фиг.1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аналитические данные порошковой рентгеновской дифрактограммы кристаллической формы А показаны в таблице 1.

Таблица 1. Аналитические данные дифрактограммы XRPD кристаллической формы А

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения термограмма дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) кристаллической формы А содержит эндотермический пик с началом при 151,75±3°С.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения термограмма DSC кристаллической формы А представлена на фиг.2.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения термограмма термогравиметрического анализа (TGA) кристаллической формы А характеризуется потерей веса на 0,04540%, наблюдаемой при 151,57±3°С.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения термограмма

TGA кристаллической формы А представлена на фиг.3.

В настоящем раскрытии также предусмотрено применение кристаллической формы А для производства лекарственного препарата для лечения катаракты.

Технический эффект

В качестве нового пролекарства ланостерина соединение по настоящему изобретению характеризуется хорошей проницаемостью и эффективно преобразуется в ланостерин в организме, что значительно повышает уровень усвоения ланостерина; его кристаллическая форма характеризуется хорошей стабильностью.

Определения и описание

Если не указано иное, предполагается, что следующие термины и выражения, используемые в настоящем документе, имеют следующие значения. Конкретный термин или выражение при отсутствии точного определения не стоит считать неопределенным или неясным, а следует понимать в соответствии с обычным значением. Если в данном документе встречается торговое название, то предполагается, что оно относится к соответствующему продукту или его активному ингредиенту.

Промежуточные соединения по настоящему изобретению могут быть получены с помощью различных способов синтеза, известных специалисту в данной области техники, в том числе вариантов осуществления, описанных ниже, вариантов осуществления, образованных путем объединения вариантов осуществления, описанных ниже, с другими способами химического синтеза, и эквивалентных альтернатив, общеизвестных специалисту в данной области техники. Предпочтительные варианты осуществления включают без ограничения варианты осуществления настоящего изобретения.

Химические реакции в вариантах осуществления настоящего изобретения осуществляют в подходящем растворителе, и растворитель должен быть подходящим для химического превращения и применяемых необходимых реагентов и материалов в соответствии с настоящим изобретением. С целью получения соединения по настоящему изобретению, специалистам в данной области техники иногда необходимо модифицировать или выбирать стадии синтеза или схемы реакций на основе существующих вариантов осуществления. Настоящее изобретение будет конкретно описано ниже с помощью вариантов осуществления, но объем настоящего изобретения ими не ограничивается. Все растворители, применяемые в настоящем изобретении, являются коммерчески доступными и могут непосредственно применяться без дополнительной очистки.

Применяемые в настоящем изобретении растворители являются коммерчески доступными. В настоящем изобретении используются следующие сокращения: DCM означает дихлорметан; DMF означает N,N-диметилформамид; DMSO означает диметилсульфоксид; EtOH означает этанол; МеОН означает метанол; TFA означает трифторуксусную кислоту; TsOH означает n-толуолсульфоновую кислоту; mp означает точку плавления; EtSO₃H означает этансульфоновую кислоту; MeSC₃H означает метансульфоновую кислоту; АТР означает аденозинтрифосфат; HEPES означает 4-гидроксиэтилпиперазинэтансуль-фоновую кислоту; EGTA означает этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир) тетрауксусной кислоты; MgCl₂ означает дихлорид магния; MnCl₂ означает дихлорид марганца; DTT означает дитиотреитол; DCC означает дициклогексилкарбодиимид; DMAP означает 4-диметиламинопиридин; пролекарство 026 ланостерина означает соединение формулы (I) по настоящему изобретению.

Порошковая рентгеновская дифракция, XRPD

Приблизительно 10-20 мг образца подвергали обнаружению посредством XRPD.

Подробные параметры XRPD указаны ниже:

рентгеновская трубка: Cu, ka, (λ = 1,54056Å);

напряжение на рентгеновской трубке: 40 кВ; сила тока на рентгеновской трубке:

40 мА;

щель расходимости: 0,60 мм;

щель детектора: 10,50 мм;

антирассеивающая щель: 7,10 мм;

диапазон сканирования: 4-40 град.;

размер шага: 0,02 град.;

время шага: 0,12 секунды;

скорость вращения лотка для образцов: 15 об./мин.

Динамическая сорбция пара (DVS)

Способ обнаружения: образцы (от 10 мг до 20 мг) помещали в лоток для образцов DVS для проведения испытания.

Температура: 25°С.

Равновесие: dm/dt: 0,01%/мин.: (наименьшее: 10 мин., наибольшее: 180 мин.).

Высушивание: относительная влажность 0%, 120 мин.

Градиент относительной влажности (%) для проведения испытания: 10%;

Диапазон градиента относительной влажности (%) для проведения испытания:

0%-90%-0%.

Гигроскопичность оценивали с использованием следующей шкалы.

Краткое описание графических материалов

На фиг.1 представлена дифрактограмма XRPD кристаллической формы А, полученная с применением излучения Cu-Ka.

На фиг.2 представлена термограмма DSC кристаллической формы А.

На фиг.3 представлена термограмма TGA кристаллической формы А.

На фиг.4 представлена изотерма DVS кристаллической формы А.

На фиг.5 представлен эффект ланостерина и его пролекарства 026 (соединения формулы (I)) в виде глазных капель в отношении модели индуцированной селенитом натрия катаракты у новорожденных новозеландских кроликов, который наблюдали под щелевой лампой. NC: контрольная группа здоровых животных; МС: группа контроля модели; PC: группа положительного контроля; LT: группа с обработкой глазными каплями, содержащими ланостерин; 026: группа с обработкой глазными каплями, содержащими пролекарство 026 ланостерина.

На фиг.6 представлено сравнение прозрачности хрусталика in vitro для всех групп модели индуцированной селенитом натрия катаракты у новорожденных новозеландских кроликов, после 42 дней введения. NC: контрольная группа здоровых животных; МС: группа контроля модели; PC: группа положительного контроля; LT: группа с обработкой глазными каплями, содержащими ланостерин; 026: группа с обработкой глазными каплями, содержащими пролекарство 026 ланостерина. Размерность сетки составляет 2,12×2,12 мм.

На фиг.7 показано сравнение активности глутатионпероксидазы (GSH-PX) хрусталика в модели индуцированной селенитом натрия катаракты у новорожденных новозеландских кроликов после 42 дней введения. NC: контрольная группа здоровых животных; МС: группа контроля модели; PC: группа положительного контроля; LT: группа с обработкой глазными каплями, содержащими ланостерин; 026: группа с обработкой глазными каплями, содержащими пролекарство 026 ланостерина. При сравнении с NC: ** означает р < 0,01, * означает р < 0,05; при сравнении с МС: ## означает р < 0,01, # означает р < 0,05; при сравнении с PC: ++ означает р < 0,01, + означает р < 0,05. На фиг.8 показан эффект глазных капель, содержащих ланостерин и его пролекарство 026, в отношении модели индуцированной ультрафиолетовым излучением катаракты у новозеландских кроликов, наблюдаемый с помощью щелевой лампы. NC: контрольная группа здоровых животных; МС: группа контроля модели; PC: группа положительного контроля; LT: группа с обработкой глазными каплями, содержащими ланостерин; 026: группа с обработкой глазными каплями, содержащими пролекарство 026 ланостерина. На фиг.9 представлены результаты сравнения in vitro прозрачности хрусталика во всех группах новозеландских кроликов с индуцированной ультрафиолетовым излучением катарактой после 42 дней введения. NC: контрольная группа здоровых животных; МС: группа контроля модели; PC: группа положительного контроля; LT: группа с обработкой глазными каплями, содержащими ланостерин; 026: группа с обработкой глазными каплями, содержащими пролекарство 026 ланостерина. Размерность сетки составляет 2,12×2,12 мм.

На фиг.10 показаны результаты сравнения активности глутатионпероксидазы (GSH-PX) хрусталика во всех группах модели индуцированной ультрафиолетовым излучением катаракты у новорожденных новозеландских кроликов после 42 дней введения. NC: контрольная группа здоровых животных; МС: группа контроля модели; PC: группа положительного контроля; LT: группа с обработкой глазными каплями, содержащими ланостерин; 026: группа с обработкой глазными каплями, содержащими пролекарство 026 ланостерина. При сравнении с NC: ** означает р < 0,01, * означает р < 0,05; при сравнении с МС: ## означает р < 0,01, # означает р < 0,05; при сравнении с PC: ++ означает р < 0,01, + означает р < 0,05.

Подробное описание вариантов осуществления

Для лучшего понимания содержания настоящего изобретения настоящее изобретение подробно описано посредством вариантов осуществления, которые не подразумевают какого-либо ограничения настоящего изобретения.

Иллюстративный пример 1: фрагмент ВВ-1

Путь синтеза:

Стадия 1: синтез соединения ВВ-1.

Смесь ВВ-1-1 подвергали анализу методом сверхкритической жидкостной хроматографии (условия разделения: колонка: Chiralpak AD-3 150 × 4,6 мм, I.D. 3 мкм; подвижная фаза: А: СО₂, В: этанол (0,05% диэтаноламин); градиент: В от 5% до 40% в течение 5 минут, В 40%, поддерживаемый в течение 2,5 минут, затем В 5%, поддерживаемый в течение 2,5 минут; скорость потока: 2,5 мл/мин.; температура колонки: 35°С; длина волны: 220 нм) с получением соединения ВВ-1. ¹Н ЯМР (CDCl₃ 400 МГц): δ = 5,06-5,15 (m, 1Н), 5,10 (br t, J=7,2 Гц, 1Н), 3,20-3,22 (m, 1Н), 3,24 (dd, J=11,5, 4,5 Гц, 1Н), 1,64-2,09 (m, 15Н), 0,77-1,57 (m, 29Н), 0,65-0,72 ppm (m, 3Н).

Пример 1. Получение соединения формулы (I)

Путь синтеза:

Стадия 1: синтез соединения формулы (I).

35,2 г соединения ВВ-1 растворяли в 550 мл безводного дихлорметана, добавляли 22,8 г салициловой кислоты, затем добавляли 39,2 г DCC, и в конце добавляли 23,2 г DMAP с получением белой суспензии, которую нагревали до 35°С и реакцию оставляли для протекания на 96 часов. Реакцию останавливали после определения с помощью TLC того, что остается небольшое количество сырья. Реакционную смесь фильтровали, остаток на фильтре промывали с помощью 150 мл дихлорметана, и фильтраты объединяли и концентрировали до сухости с получением неочищенного остатка. К неочищенному остатку добавляли 500 мл метанола и нагревали с обратным холодильником в течение 16 часов с получением белой суспензии, температуру снижали до 15°С и смесь фильтровали с получением белого твердого вещества, которое представляло собой кристаллическую форму А соединения формулы (I), что подтверждали с помощью испытания методом XRPD.

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 10,89 (s, 1Н), 7,77 (dd, J=1,76, 8,03 Гц, 1Н), 7,38 (ddd, J=1,76, 7,09, 8,47 Гц, 1Н), 6,91 (dd, J=0,88, 8,41 Гц, 1Н), 6,78-6,85 (m, 1Н), 5,00-5,07 (m, 1H), 4,68-4,74 (m, 1H), 1,64-2,04 (m, 12H), 1,62 (s, 3H), 1,57 (br s, 2H), 1,54 (s, 3H), 1,04-1,51 (m, 9H), 0,98 (s, 3H), 0,98 (s, 3H), 0,89 (s, 3H), 0,85 (d, J=6,27 Гц, 3H), 0,82 (s, 3H), 0,63 (s, 3H).

Пример 2. Исследование гигроскопичности кристаллической формы А соединения формулы (I)

Материалы для эксперимента:

система для динамической сорбции пара DVS Advantage от SMS.

Способ проведения эксперимента:

10-15 мг кристаллической формы А соединения формулы (I) помещали в лоток для образцов DVS для проведения испытания.

Результаты эксперимента:

кривая DVS кристаллической формы А соединения формулы (I) показана на фиг.4, ΔW = 0,747%.

Заключение в результате экспериментов:

Обусловленное гигроскопичностью увеличение веса кристаллической формы А соединения формулы (I) при 25°С и относительной влажности 80% составляло 0,747%, что означает незначительную гигроскопичность.

Пример 3. Предварительный эксперимент для определения стабильности кристаллической формы А соединения формулы (I)

Для кристаллической формы А соединения формулы (I) обеспечивали следующие 3 варианта условий и испытывали ее в отношении внешнего вида, XRPD, содержания и сопутствующих веществ в различные моменты времени. Условия исследования и испытуемый параметр приведены в таблице 2.

Таблица 2. Условия исследования и испытуемый параметр

Стадии эксперимента

10 мг кристаллической формы А соединения формулы (I) точно взвешивали и помещали в сосуд для образцов, а затем распределяли с образованием тонкого слоя. Для образцов обеспечивали условия, предусматривающие 60°С, относительную влажность 92,5%, горлышко бутылки непосредственно оборачивали алюминиевой фольгой, которую протыкали с получением нескольких небольших отверстий для обеспечения полного контакта образца с воздухом окружающей среды. Образцы помещали соответственно в сухой контейнер и стеклянный сосуд, содержащий насыщенный раствор нитрата калия. Освещаемый образец (открытый, не покрытый алюминиевой фольгой) и образец контроля воздействия освещения (открытый, флакон с образцом был полностью покрыт алюминиевой фольгой) помещали в контейнер с освещением. Для каждого момента времени взвешивали по 2 экземпляра образца в качестве формального образца для испытания. Кроме того, приблизительно 5 мг кристаллической формы А соединения формулы (I) взвешивали для испытания методом XRPD; флакон с образцом оборачивали алюминиевой фольгой, которую протыкали с получением нескольких небольших отверстий; образцы также помещали в соответствующий контейнер для высушивания и стеклянный сосуд, содержащий насыщенный раствор нитрата калия.

Способ анализа содержания

Модель колонки: Ultimate ХВ-С18 3,0*50 мм, 3 мкм; подвижная фаза: 0,5 мл TFA в 1 л воды (растворитель А) и 0,4 мл TFA в 1 л ацетонитрила (растворитель В), элюирование: градиент элюирования 95% - 100% (растворитель В) в течение более чем 2 минут, а затем 100% в течение 13 минут. Скорость потока составляла 1,5 мл/мин; температура колонки: 30°С.

Результаты эксперимента и выводы: кристаллическая форма не изменялась после эксперимента, и она характеризовалась хорошей стабильностью.

Испытание биологической активности

Экспериментальный пример 1. Исследование уровня проникновения офтальмологических лекарственных средств в организм и превращения лекарственных средств в ланостерин

В данном исследовании в качестве экспериментальных животных использовали новозеландских белых кроликов (вес тела составлял более 2 кг, возраст составлял более 12 недель). Каждое соединение исследовали с использованием двух новозеландских белых кроликов. Каждому кролику закапывали по 50 мкл глазных капель в каждый глаз, причем три глаза использовали для сбора образцов водянистой влаги и один глаз использовали в качестве резервного. В состав глазных капель входило 1,2% гидроксипропилметилцеллюлозы (с размером Е5), 20,5% полоксамера (с размером Р407), 1,6% полоксамера (с размером Р188), концентрация соединения составляла 5 мМ, и глазные капли представляли собой гомогенную суспензию. После закапывания глазных капель в глаза кроликов собирали водянистую влагу из передней камеры через 0,5, 2, 4 и 6 часов после введения. Объем каждого образца составлял не более 50 мкл. Каждое животное получало слабую анестезию перед сбором образцов. В каждый момент времени собирали по три образца. Собранные образцы водянистой влаги помещали на хранение в сухой лед сразу после сбора или на хранение в холодильнике при -80±10°С. После сбора образцов животных умерщвляли. Концентрацию соединения в каждом образце определяли с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра (API 4000). В таблицах 3 и 4 приведены условия определения DMPK in vivo; в таблицах 5 и 6 показана концентрация лекарственного средства в водянистой влаге после закапывания в глаза (250 нМ на каждый глаз) соединения, представляющего собой ланостерин (исходного лекарственного средства), и соединения, представляющего собой пролекарство.

Результаты эксперимента и выводы: как сам ланостерин, так и соединение, представляющее собой его пролекарство, по настоящему изобретению были способны к проникновению в водянистую влагу через роговицу или посредством других путей, и соединение, представляющее собой пролекарство, было способно превращаться в ланостерин, представляющий собой исходное лекарственное средство, в ходе процесса инфильтрации и продемонстрировало более высокие значения концентрации и уровня воздействия, чем ланостерин, в водянистой влаге.

Экспериментальный пример 2. Фармакодинамическое исследование глазных капель, содержащих ланостерин и его пролекарство, на модели индуцированной селенитом натрия катаракты у новорожденных новозеландских кроликов

1. Экспериментальное животное

Новорожденные новозеландские кролики возрастом Р7 дней, общей категории и по 5 крольчат на помет находились на грудном вскармливании матерью- крольчихой.

2. Распределение на группы и обработка

Экспериментальных крольчат произвольным образом разделяли на 5 групп по 5 кроликов на группу.

1) Контрольная группа здоровых животных (NC): в день Р10 крольчатам вводили подкожно 0,25 мл физиологического раствора в шею, и после дня Р15 введение больше не проводили.

2) Группа контроля модели (МС): в день Р10 крольчатам вводили подкожно раствор селенита натрия (в физиологическом растворе) в количестве 20 мкмоль/кг веса тела, и после дня Р15 контрольные не содержащие лекарственного средства глазные капли закапывали в правый глаз по 3 раза каждый день в течение 42 дней.

3) Группа положительного контроля (PC): в день Р10 крольчатам вводили подкожно раствор селенита натрия (в физиологическом растворе) в количестве 20 мкмоль/кг веса тела, и после дня Р15 глазные капли Kary Uni (Santen Pharmaceutical Co., Ltd, Япония) закапывали в правый глаз по 3 раза каждый день в течение 42 дней.

4) Группа с обработкой глазными каплями, содержащими ланостерин (LT): в день Р10 крольчатам вводили подкожно раствор селенита натрия (в физиологическом растворе) в количестве 20 мкмоль/кг веса тела, и после дня Р15 глазные капли, содержащие ланостерин, закапывали в правый глаз по 3 раза каждый день в течение 42 дней.

5) Группа с обработкой глазными каплями, содержащими пролекарство 026 ланостерина (026, соединение формулы (I)): в день Р10 крольчатам вводили подкожно раствор селенита натрия (в физиологическом растворе) в количестве 20 мкмоль/кг веса тела, и после дня Р15 глазные капли, содержащие пролекарство 026 ланостерина, закапывали в правый глаз по 3 раза каждый день в течение 42 дней.

3. Экспериментальное испытание

1) Получение фотографий с использованием щелевой лампы. Обработанных селенитом натрия новорожденных новозеландских кроликов из каждой группы осматривали с помощью щелевой лампы перед осуществлением введения и через 7 дней, 14 дней, 21 день и 42 дня после введения соответственно.

2) Испытание хрусталика на прозрачность in vitro. В последний день глазное яблоко животного препарировали, хрусталик, находящийся в капсуле, полностью отделяли и хрусталик помещали на бумагу с нанесенной сеткой (2,12 × 2,12 мм). На фотографиях показана степень четкости сетки, сфотографированной через хрусталик.

3) Анализ активности глутатионпероксидазы (GSH-PX). Активность GSH-PX в отделенном хрусталике кролика в каждой группе определяли с помощью способа, представленного в инструкции к набору для определения активности GSH-PX (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Экспериментальные данные анализировали с помощью однофакторного ANOVA с использованием программного обеспечения для статистического анализа SPSS. Способ LSD использовали для сравнения групп, а уровень статистически значимого различия составлял р < 0,05.

4. Результаты эксперимента

1) Наблюдение под щелевой лампой. На фиг.5 показано, что селенит натрия может вызывать катаракту в хрусталике новозеландского кролика. Осмотр с помощью щелевой лампы показал, что выраженность симптомов катаракты была значительно сниженной после введения глазных капель, содержащих пролекарство 026 ланостерина, в течение 42 дней (фиг.5-1) по сравнению с выраженностью симптомов до введения (фиг.5-J). Выраженность симптомов катаракты не изменялась в значительной степени до и после введения глазных капель Kary Uni (фиг.5-Е, 5-F) и глазных капель, содержащих ланостерин (фиг.5-G, 5-Н).

2) Испытание хрусталика на прозрачность in vitro. На фиг.6 показана прозрачность хрусталика у новорожденных новозеландских кроликов с индуцированной селенитом натрия катарактой из каждой группы после 42 дней введения. В левой части каждой фотографии показан хрусталик левого глаза (в левый глаз введение не осуществляли, он выступал в качестве индивидуального контроля), а в правой части показан хрусталик правого глаза (введение в правый глаз осуществляли в соответствии с распределением на группы). После 42 дней введения глазных капель, содержащих пролекарство 026 ланостерина, степень прозрачности хрусталика правого глаза была значительно выше, чем таковая для левого глаза, а также значительно выше, чем таковая для МС-группы, но все же она была ниже, чем таковая для NC-группы. Не наблюдалось какого-либо значительного изменения прозрачности хрусталика после введения в правый глаз в LT-группе.

3) Анализ активности GSH-PX. Результаты анализа активности GSH-PX в хрусталике в каждой группе после 42 дней введения показали (см. фиг.7), что после подкожной инъекции селенита натрия активность GSH-PX в хрусталиках глаз кроликов была значительно снижена, и имелось статистически значимое различие (р < 0,01) при сравнении с NC-группой. Глазные капли, содержащие пролекарство 026 ланостерина, и глазные капли, содержащие лекарственное средство Kary Uni в качестве положительного контроля, были способны увеличивать активность GSH-PX в хрусталике, и имелось статистически значимое различие при сравнении с МС-группой (р < 0,01), и положительный эффект 026 являлся более значительным, чем таковой, оказываемый Kary Uni (р < 0,01). Эффект глазных капель, содержащих ланостерин, в отношении активности GSH-PX в хрусталике был значительно ниже, чем таковой для 026 и Kary Uni, и не имелось статистически значимого различия при сравнении с МС-группой (р > 0,05).

5. Заключение

Вышеприведенные результаты указывают на то, что глазные капли, содержащие пролекарство 026 ланостерина, способны ослаблять симптомы индуцированной селенитом натрия катаракты у новорожденных новозеландских кроликов и повышать прозрачность хрусталика и активность GSH-PX хрусталика.

Экспериментальный пример 3. Фармакодинамическое исследование глазных капель, содержащих ланостерин и его пролекарство, на модели индуцированной ультрафиолетовым излучением катаракты у новорожденных новозеландских кроликов

1. Экспериментальное животное

Взрослые новозеландские кролики 2,0-2,5 кг, общей категории, самцы и самки, в общем количестве 25.

Распределение на группы и обработка

Экспериментальных кроликов произвольным образом разделяли на 5 групп по 5 кроликов на группу.

1) Контрольная группа здоровых животных (NC): нормальный режим кормления, без введения лекарственного средства.

2) Группа контроля модели (МС): осуществляли обработку УФ-излучением с длиной волны 313 нм в течение 24 часов для получения модели, затем контрольные, не содержащие лекарственного средства глазные капли закапывали в правый глаз по 3 раза каждый день в течение 42 дней.

3) Группа положительного контроля (PC): осуществляли обработку УФ-излучением с длиной волны 313 нм в течение 24 часов для получения модели, затем глазные капли Kary Uni (Santen Pharmaceutical Co., Ltd, Япония) закапывали в правый глаз по 3 раза каждый день в течение 42 дней.

4) Группа с обработкой глазными каплями, содержащими ланостерин (LT): осуществляли обработку УФ-излучением с длиной волны 313 нм в течение 24 часов для получения модели, затем глазные капли, содержащие ланостерин, закапывали в правый глаз по 3 раза каждый день в течение 42 дней.

5) Группа с обработкой глазными каплями, содержащими пролекарство 026 ланостерина (026): осуществляли обработку УФ-излучением с длиной волны 313 нм в течение 24 часов для получения модели, затем глазные капли, содержащие пролекарство 026 ланостерина, закапывали в правый глаз по 3 раза каждый день в течение 42 дней.

3. Экспериментальное испытание

1) Получение фотографий с использованием щелевой лампы. Животных каждой группы осматривали с помощью щелевой лампы перед введением и через 7 дней, 14 дней, 21 день и 42 дня после введения соответственно.

2) Испытание хрусталика на прозрачность in vitro. В последний день глазное яблоко животного препарировали, хрусталик, находящийся в капсуле, полностью отделяли, и хрусталик помещали на бумагу с нанесенной сеткой (2,12×2,12 мм). На фотографиях показана степень четкости сетки, сфотографированной через хрусталик.

3) Анализ активности глутатионпероксидазы (GSH-PX). Активность GSH-PX в отделенном хрусталике кролика в каждой группе определяли с помощью способа, представленного в инструкции к набору для определения активности GSH-PX (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Экспериментальные данные анализировали с помощью однофакторного ANOVA с использованием программного обеспечения для статистического анализа SPSS. Способ LSD использовали для сравнения групп, а уровень статистически значимого различия составлял р<0,05.

4. Результаты эксперимента

1) Наблюдение под щелевой лампой. На фиг.8 показано, что ультрафиолетовое излучение вызывало развитие катаракты в хрусталике новозеландского кролика. Осмотр с помощью щелевой лампы показал, что выраженность симптомов катаракты была значительно сниженной после введения глазных капель, содержащих пролекарство 026 ланостерина, в течение 42 дней (фиг.8-1) по сравнению с выраженностью симптомов до введения (фиг.8-J). Симптомы катаракты не изменялись в значительной степени до и после введения глазных капель Kary Uni (фиг.8-Е, 8-F) и глазных капель, содержащих ланостерин (фиг.8-G, 8-Н).

2) Испытание хрусталика на прозрачность in vitro. На фиг.9 показана прозрачность хрусталиков новозеландских кроликов с индуцированной ультрафиолетом катарактой в каждой группе после 42 дней введения. В левой части каждой фотографии показан хрусталик левого глаза (в левый глаз введение не осуществляли, он выступал в качестве индивидуального контроля), а в правой части показан хрусталик правого глаза (введение в правый глаз осуществляли в соответствии с распределением на группы). После 42 дней введения глазных капель, содержащих пролекарство 026 ланостерина, степень прозрачности хрусталика правого глаза была значительно выше, чем таковая для левого глаза, а также значительно выше, чем таковая для МС-группы, но все же она была ниже, чем таковая для NC-группы. Не наблюдалось какого-либо значительного изменения прозрачности хрусталика после введения лекарственного средства в правый глаз в LT-rpynne.

3) Анализ активности GSH-PX. После 42 дней введения анализ активности GSH-PX в хрусталике в каждой группе показал (см. фиг.10), что после осуществления обработки УФ-излучением активность GSH-PX в хрусталиках глаз кроликов была значительно снижена, и имелось статистически значимое различие при сравнении с NC-группой (р<0,01 или р<0,05). Глазные капли, содержащие пролекарство 026 ланостерина, и глазные капли, содержащие лекарственное средство Kary Uni, в качестве положительного контроля были способны увеличивать активность GSH-PX в хрусталике, и имелось статистически значимое различие при сравнении с МС-группой (р<0,01), и положительный эффект 026 являлся более значительным, чем таковой, оказываемый Kary Uni (р<0,05). Эффект глазных капель, содержащих ланостерин, в отношении активности GSH-PX хрусталика был значительно ниже, чем таковой для 026 и Kary Uni, и не имелось статистически значимого различия при сравнении с МС-группой (р>0,05).

5. Заключение

Вышеприведенные результаты указывают на то, что глазные капли, содержащие пролекарство 026 ланостерина, способны ослаблять симптомы индуцированной УФ-излучением катаракты у новозеландских кроликов и повышать прозрачность хрусталика и активность GSH-PX хрусталика.

Изобретение относится к кристаллической форме А соединения формулы (I), где порошковая рентгеновская дифрактограмма (XPRD) кристаллической формы А содержит характеристические дифракционные пики при следующих значениях угла 2θ: 8,60±0,2°, 9,38±0,2°, 10,57±0,2°, 12,54±0,2°, 14,43±0,2°, 15,06±0,2°, 17,22±0,2° и 25,18±0,2. Кристаллическая форма соединения формулы (I) предназначена для применения для получения лекарственного средства для лечения катаракты. Технический результат – кристаллическая форма А соединения формулы (I), обладающая хорошей стабильностью. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 10 ил., 6 табл., 3 пр.

1. Кристаллическая форма А соединения формулы (I), где порошковая рентгеновская дифрактограмма (XPRD) кристаллической формы А содержит характеристические дифракционные пики при следующих значениях угла 2θ: 8,60±0,2°, 9,38±0,2°, 10,57±0,2°, 12,54±0,2°, 14,43±0,2°, 15,06±0,2°, 17,22±0,2° и 25,18±0,2,

2. Кристаллическая форма А по п. 1, где порошковая рентгеновская дифрактограмма кристаллической формы А содержит характеристические дифракционные пики при следующих значениях угла 2θ: 4,350°, 8,598°, 9,383°, 10,566°, 12,542°, 13,448°, 14,428°, 14,591°, 15,063°, 15,453°, 15,820°, 16,803°, 17,216°, 20,985°, 21,181°, 22,225°, 22,601°, 22,856°, 23,726°, 24,039°, 24,534°, 25,185°, 25,514°, 25,935°, 26,570°, 27,867°, 28,125°, 28,416°, 29,114°, 29,445°, 31,914°, 33,710°, 34,297°, 34,329°, 36,014°, 36,108° и 38,196°.

3. Кристаллическая форма А по п. 2, где порошковая рентгеновская дифрактограмма кристаллической формы А показана на фиг.1.

4. Кристаллическая форма А по любому из пп. 1-3, где термограмма дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) кристаллической формы А содержит эндотермический пик с началом при 151,75±3°С.

5. Кристаллическая форма А по п. 4, где термограмма DSC кристаллической формы А показана на фиг.2.

6. Кристаллическая форма А по любому из пп. 1-3, где термограмма термогравиметрического анализа (TGA) кристаллической формы А характеризуется потерей веса на 0,04540%, наблюдаемой при 151,57±3°С.

7. Кристаллическая форма А по п. 6, где термограмма TGA кристаллической формы А показана на фиг.3.

8. Применение кристаллической формы А по любому из пп. 1-7 в изготовлении лекарственного препарата для лечения катаракты.