СПОСОБ ПРОБОПОДГОТОВКИ ДЛЯ УСКОРЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ КУЛЬТУР Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/04 G01N33/48 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, медицинской микробиологии, бактериологии, и может быть использовано для пробоподготовки положительных гематологических культур для ускоренной идентификации микроорганизмов методом MALDI ToF масс-спектрометрии.

Уровень техники

Проблема выделения гемокультуры при подозрении на инфекции кровотока в настоящее время остается довольно актуальной. [Каргальцева Н.М., Кочеровец В.И., Миронов А.Ю., Борисова О.Ю. Метод получения гемокультуры при диагностике инфекции кровотока. Клиническая лабораторная диагностика. 2020; 65 (3): 185-190]. При этом микробиологическая диагностика септических состояний складывается из нескольких этапов. Так, современная диагностика инфекций кровотока, основана на использовании коммерческих питательных сред для культивирования микроорганизмов, которые инкубируются в течение 2-7 дней, при положительном результате, происходит пересев жидкой питательной среды на плотные питательные среды для последующей видовой идентификации и определения антибиотикочувствительности патогена. Таким образом, время, затрачиваемое от взятия крови до выдачи результата может варьировать и составляет от 3 до 10 дней. Безусловно, такая продолжительность исследования является неприемлемой, а учитывая высокую частоту коморбидных пациентов с сепсисом, высокую летальность при данном состоянии, значительные экономические затраты при выхаживании пациентов, существует потребность в ускорении процедур выделения, идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам в данной группе пациентов.

Известен способ диагностики инфекции кровотока, при котором предлагается проводить взятие крови для посева не из периферического катетера, а из центрального [Мержвинский И.А., Нагродский С.Л., Басанов Р.В., Феодасиади Л.А. Способ выявления бактериемии при подозрении на сепсис.№RU 2217499 С2].

Недостатками данного способа является длительность инкубации, трудоемкость при постановке катетера, отсутствие данных об объеме крови, необходимого для исследования.

Известен способ ускоренной идентификации микроорганизмов с использованием MALDI-ToF масс-спектрометрии, основанный на применении методики Sepsityper, суть которого заключается во взятии 1,0 мл содержимого флакона из положительной гемокультуры, последующих процедур очистки, которые включают использование ряда реагентов для и серий центрифугирования в разных режимах ускорения.

Недостатками метода являются высокая трудоемкость, необходимость использования дополнительных дорогостоящих реактивов [Полищук А.Г. MALDI-TOF Масс-спектрометрическая идентификация медицински значимых микромицетов (обзор). Проблемы медицинской микологии, 2011, Т. 13, №4].

Известен способ диагностики бактериемии, основанный на взятии 4,5 мл цельной крови пациента с лихорадкой, центрифугировании, изолировании лейкоцитарной взвеси и последующего посева на кровяной агар взвеси лейкоцитов [Каргальцева Н.М. Способ диагностики бактериемии. №RU 2098486 С1]. Существенным недостатком данного способа является ограничение использования данного изобретения у пациентов с лейкопениями, онкологических больных, пациентов с гемоцитопенией.

Известен способ ускоренной идентификации микроорганизмов, основанный на исследовании положительных образцов гемокультуры [Аминева П.Г., Руднов В.А., Кармацких О.Г., Невская Н.Н., Вельский Д.В., Иванова Н.А. Результаты идентификации бактерий из положительных гемокультур пациентов многопрофильного стационара с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2018 г. Т. 20 №4]. Данный способ принят за прототип.

Недостатком данного способа является методика, которая подразумевает использование сапонинов и центрифугирование на высоких значениях ускорения, что связано с избыточным осаждением бактерий наряду с клетками крови и клеточным детритом, что может снижать эффективность идентификации.

Раскрытие изобретения

Целью предлагаемого изобретения является разработка способа ускоренной идентификации возбудителя инфекций кровотока из положительного образца гематологической культуры, без этапов выделения микроорганизма на плотных питательных средах для этиологической диагностики заболеваний, сопровождающихся бактериемией или сепсисом.

Это достигается тем что, в отличие от известных способов подготовки проб для ускоренной идентификации микроорганизмов из положительных гематологических культур, 5 мл питательной среды с кровью переносятся из флакона с положительной гемокультурой в вакуумную пробирку с разделительным гелем, далее пробирка центрифугируется в течение 12 минут при 1000 g, из пробирки сливается надосадок, не затрагивая слой клеточного детрита с микроорганизмами, который остается на поверхности геля. Затем добавляется 1,5 мл стерильного физиологического раствора, осадок ресуспендируется. Далее материал центрифугируется при 100 g в течение 3 минут, после этого отбирается 700 мкл надосадка, который переносится в пробирку типа «Эппендорф», далее взвесь центрифугируется при 10000 g в течение 2 минут. Надосадок удаляется, к полученному осадку добавляется 15-25 мкл 70% муравьиной кислоты, с последующим перемешиванием, далее добавляется 15-25 мкл ацетонитрила, с последующим перемешиванием, повторно центрифугируется при 10000 g в течение 2 минут. Далее на мишень для масс-спектрометра наносится 1 мкл надосадка на 2 точки, далее надосадок удаляется, одноразовой микробиологической петлей на 2 дополнительные точки наносится осадок, высушивается при комнатной температуре и покрывается матрицей СНСА (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid), остается при комнатной температуре до полного высыхания; далее следует идентификация на MALDI ToF масс-спектрометре.

Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ пробоподготовки положительных гематологических культур для ускоренной идентификации микроорганизмов методом MALDI ToF масс-спектрометрии позволяет получить достаточное количество биологической массы микроорганизмов, очищенных от компонентов питательной среды и крови.

Осуществление изобретения

Сущность предложенного способа заключается в следующем: 5 мл питательной среды с кровью переносятся из флакона с положительной гемокультурой в вакуумную пробирку с разделительным гелем, далее пробирка центрифугируется в течение 12 минут при 1000 g, из пробирки сливается надосадок, не затрагивая слой клеточного детрита с микроорганизмами, который остается на поверхности геля. Затем добавляется 1,5 мл стерильного физиологического раствора, осадок ресуспендируется. Далее материал центрифугируется при 100 g в течение 3 минут, после этого отбирается 700 мкл надосадка, который переносится в пробирку типа «Эппендорф», далее взвесь центрифугируется при 10000 g в течение 2 минут. Надосадок удаляется, к полученному осадку добавляется 15-25 мкл 70% муравьиной кислоты, с последующим перемешиванием, далее добавляется 15-25 мкл ацетонитрила, с последующим перемешиванием, повторно центрифугируется при 10000 g в течение 2 минут. Далее на мишень для масс-спектрометра наносится 1 мкл надосадка на 2 точки, далее надосадок удаляется, одноразовой микробиологической петлей на 2 дополнительные точки наносится осадок, высушивается при комнатной температуре и покрывается матрицей СНСА (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid), остается при комнатной температуре до полного высыхания; далее следует идентификация на MALDI ToF масс-спектрометре.

Предлагаемый способ позволяет проводить идентификацию микроорганизмов, выросших в положительных гематологических культурах без необходимости выделения их чистой культуры.

Предлагаемый способ характеризуется простотой, отсутствием необходимости в использовании специальных реагентов (муравьиная кислота, ацетонитрил, гидроксикоричная кислота являются реагентами, используемыми при стандартной процедуре идентификации микроорганизмов методом MALDI-ToF масс-спектрометрии), оборудования, надежностью и эффективностью.

Осуществление предлагаемого способа можно продемонстрировать на следующих примерах:

Пример 1.

Пациентка К., 56 лет поступила в стационар для проведения планового курса полихимиотерапии по поводу системного опухолевого заболевания крови. После проведения курса у пациентки на фоне агранулоцитоза, стала отмечаться высокая лихорадка, озноб, потливость, тахикардия. Для исключения сепсиса было проведен посев крови во флаконы для культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов. Рост был зарегистрирован в аэробном флаконе через 26 часов 34 минуты, после этого производили пересев 200-400 мкл образца из положительного флакона на плотные питательные среды для выделения чистой культуры возбудителя; параллельно с этим проводилось исследование положительного образца гемокультуры предлагаемым способом. Результат идентификации микроорганизма предлагаемым способом - Staphylococcus aureus. Рост колоний на плотных питательных средах был зарегистрирован через 19 часов, идентификация методом MALDI-ToF масс-спектрометрией, результат подтвердился - был выделен S.aureus.

Пример 2.

В клинику поступил пациент С, с клинической картиной флегмоны бедра слева. В анамнезе аллотрансплантация трупной почки по поводу хронического заболевания почек, иммуносупрессивная терапия. Было проведено вскрытие, дренирование флегмоны, назначены антибиотики широкого спектра с целью профилактики послеоперационных осложнений. В течение нескольких дней отмечалась положительная динамика, однако на 4 день у пациента поднялась температура до 38-39°С, отмечалась жар, озноб, тахикардия. Лабораторно обнаружены лейкоцитоз с токсической зернистостью, увеличение содержания С-реактивного белка. Для исключения сепсиса было проведен посев крови во флаконы для культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов. Рост был зарегистрирован в аэробном флаконе через 16 часов, после этого производили пересев 200-400 мкл образца из положительного флакона на плотные питательные среды для выделения чистой культуры возбудителя; параллельно с этим проводилось исследование гемокультуры предлагаемым способом. Результат идентификации микроорганизма предлагаемым способом - Klebsiella pneumonia. Рост колоний на плотных питательных средах был зарегистрирован через 15 часов, идентификация методом MALDI-ToFMacc-спектрометрией, результат подтвердился - была выделена Klebsiella pneumonia.

Таким образом, было проведено обследование у 49 пациентов терапевтического и хирургического профилей, при диагностике сепсиса. Совпадение результатов идентификации произошло в 94% случаев. Результаты идентификации представлены в таблице 1.

Изобретение относится к микробиологии. Предложен способ пробоподготовки для ускоренной идентификации микроорганизмов из положительных гематологических культур, включающий отбор 5 мл питательной среды с кровью из флакона с положительной гемокультурой в вакуумную пробирку с разделительным гелем, центрифугирование 12 мин при 1000 g, удаление надосадка, не затрагивая слой клеточного детрита с микроорганизмами на поверхности геля. Добавляют 1,5 мл стерильного физиологического раствора, ресуспендируют осадок, центрифугируют 3 мин при 100 g; 700 мкл надосадка переносят в пробирку «Эппендорф», центрифугируют 2 мин при 10000 g; надосадок удаляют, к осадку добавляют 15-25 мкл 70% муравьиной кислоты, перемешивают и добавляют 15-25 мкл ацетонитрила, перемешивают, центрифугируют 2 мин при 10000 g. На мишень для масс-спектрометра наносят 1 мкл надосадка на 2 точки и на 2 дополнительные точки наносят осадок, высушивают при комнатной температуре и покрывают матрицей α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid; по высыханию матрицы проводят идентификацию на MALDI ToF масс-спектрометре. Изобретение обеспечивает осуществление идентификации микроорганизмов без выделения их чистой культуры. 1 табл., 1 пр.

Способ пробоподготовки для ускоренной идентификации микроорганизмов из положительных гематологических культур, отличающийся тем, что 5 мл питательной среды с кровью переносят из флакона с положительной гемокультурой в вакуумную пробирку с разделительным гелем, далее пробирку центрифугируют в течение 12 мин при 1000 g, из пробирки сливают надосадок, не затрагивая слой клеточного детрита с микроорганизмами, который остается на поверхности геля; затем добавляют 1,5 мл стерильного физиологического раствора, осадок ресуспендируют, далее материал центрифугируют при 100 g в течение 3 мин, после этого отбирают 700 мкл надосадка, который переносят в пробирку типа «Эппендорф», далее взвесь центрифугируют при 10000 g в течение 2 мин; надосадок удаляют, к полученному осадку добавляют 15-25 мкл 70% муравьиной кислоты, с последующим перемешиванием, далее добавляют 15-25 мкл ацетонитрила, с последующим перемешиванием, повторно центрифугируют при 10000 g в течение 2 мин, далее на мишень для масс-спектрометра наносят 1 мкл надосадка на 2 точки, далее надосадок удаляют, одноразовой микробиологической петлей на 2 дополнительные точки наносят осадок, высушивают при комнатной температуре и покрывают матрицей СНСА (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid); далее после полного высыхания матрицы проводят идентификацию на MALDI ToF масс-спектрометре.