Способ определения возбудителей пневмоний масс-спектрометрическим методом MALDI-TOF Российский патент 2025 года по МПК G01N33/48 G01N33/487 

Изобретение относится к протеомным методам исследований микроорганизмов при помощи масс-спектрометрии. Способ может использоваться при анализе результатов исследований микробиологии, генетике, биотехнологии и экологии. Используется для быстрого определения возбудителей внебольничных пневмоний.

Течение вирусных пневмоний осложняется присоединением бактериальной и грибковой микрофлоры. Это увеличивает риск неблагоприятного летального исхода. Доминирующим агентом бактериальных внебольничных пневмоний (БВП) считается Streptococcus pneumoniae (50% - 80%) случаев. Также возбудителями БВП могут быть бактерии рода Staphylococcus, семейства Enterobacteriacae, неферментирующие грамотрицательные бактерии и некоторые другие. Микроскопические грибы не являются типичными возбудителями пневмоний. Их выявление - результат проводимого массивного лечения антибиотиками. Микробиологическое культуральное исследование с идентификацией возбудителей БВП может выполняться более 48 часов, что не позволяет в ранние сроки назначить эффективное лечение.

Классическим методом обнаружения возбудителей пневмоний считается микробиологическое исследование мокроты (См.: СОП 16.2.12 Микробиологические методы исследования мокроты с.3 / 5 http://smk.dzto72.ru/images/Sop/16.2.12_Микробиологические_методы_исследования_мокроты.pdf; См.: Учебное пособие «Медицинская Микробиология Поздеев О.К., Покровскй В.И., М., 2010 г.; См.: МУ 4.2. 2039-05 «Методы контроля. Бактериологические и микробиологические факторы. Техника сбора и транспортировки биоматериала в микробиологической лаборатории; См.: СП 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»).

Указанный метод включает: 1) Подготовку пациента. Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости. 2) Выполнение исследования. Мокроту выливают в чашку Петри, с помощью стерильных металлических толстых игл с утолщенными концами выбирают 2-3 гнойных комочка мокроты. С целью очистки комочков мокроты от наслоившихся обитателей верхних дыхательных путей и ротовой полости их трехкратно отмывают в стерильном физиологическом растворе, после чего засевают на питательные среды. Затем материал рассевают по чашке при помощи петли штрихами, перпендикулярными к «дорожкам». В чашки Петри посев производят стеклянным стерильным шпателем, равномерно растирая материал по поверхности питательной среды. Посевы термостатируют при 37°C в течение 18-24-48 часов. Посевы просматривают, учитывают количество выросших колоний, описывают характер колоний, выделяют чистые культуры микроорганизмов, проводят их идентификацию и определяют чувствительность к антибактериальным препаратам. Возбудителями гнойно-воспалительных процессов дыхательных путей чаще всего являются условно-патогенные микроорганизмы следующих родов и видов: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria, Corynebacterium, Klebsiella, Citrobacter, Proteus, Candida, Actinomyces и др. При направленном исследовании могут быть выделены Mycobacterium tuberculosis и другие микобактерии, Мусоplasma, Bacteroides. Особенностью микробиологического исследования при инфекциях дыхательных путей является почти обязательное наличие в исследуемом материале нескольких видов микроорганизмов. В отделяемом зева, трахеи, бронхов, носа в норме обнаруживаются следующие микроорганизмы: Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, Neisseria, Corynebacterium, Lactobacillus, Candida и некоторые другие. При носительстве могут быть обнаружены S. aureus, S. pneumoniaе, S. pyogenes. Мокрота, проходя через верхние дыхательные пути и полость рта, может контаминироваться вегетирующей в них микрофлорой. Обнаружение микроорганизмов в 1 мл мокроты (до приема антибиотиков) в концентрации 1000000 и выше являются клинически значимыми (10⁶ КОЕ (6lg/ml) в мл и более).

Наиболее близким аналогом является способ проведения MALDI-TOF-масс-спектрометрии для идентификации возбудителей септических состояний в педиатрической практике, описанный в работе И.В. Чеботарь, О.А. Пономаренко, А.В. Лазарева, О.В. Карасева, А.Л. Горелик, Ю.А. Бочарова, Р.Ф. Тепаев. Использование использования MALDI-TOF-масс-спектрометрии для идентификации возбудителей септических состояний в педиатрической практике // Ж. Клиническая медицина СТМ. 2015, том 7, №2, 69doi: 10.17691/stm2015.7.2.09. В компании Bruker Germany были разработаны наборы компонентов Sepsityper Kit и СОП по их применению. Предложенный метод оказался высокоэффективным и диагностически ценным при оценке возбудителей сепсиса. Однако в случае септицемий возбудители чаще бывают в моноварианте, а при пневмониях - смешанные культуры из нескольких при анализе микроорганизмов. Масс-спектрометрический метод MALDI-TOF MS при анализе показателей Score программе дает несколько вариантов результатов в соответствии с анализом масс-спектров библиотеки MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Germany). Программное обеспечение - FlexControl (BrukerDaltonics). Визуализацию проводили с помощью программного обеспечения Flex analysis3.3 (BrukerDaltonics).

Задача заявленного изобретения состояла в разработке нового способа, позволяющего в короткие сроки определить возбудителей внебольничных пневмоний масс-спектрометрическим методом MALDI-TOF. Техническим результатом заявленного изобретения является расширение функциональных возможностей способа, а также сокращение трудоемкости за счет внесения использования меньшего количества реагентов и сокращения времени определения возбудителей внебольничных пневмоний, а также повышение точности идентификации микроорганизмов.

Сущность изобретения состоит в следующем: способ определения возбудителей пневмоний масс-спектрометрическим методом MALDI-TOF заключается в том, что образец мокроты растворяют в соотношении 1:2 в изотоническом растворе хлорида натрия, затем размешивают на лабораторной мешалке (Vortex) в течение 2-3 минут и центрифугируют в режиме 13000 rtm в течение 2 минут, полученный осадок соединяют в равном объёме с 95% этанолом, затем перемешивают на лабораторной мешалке (Vortex) в течение 2-3 минут и центрифугируют в режиме 13000 rtm в течение 2 минут, полученный осадок размешивают в соотношении 1:1 в смеси 70% муравьинной кислоты и 50% ацетонитрила, затем перемешивают на лабораторной мешалке (Vortex) в течение 2-3 минут и центрифигируют в режиме 13000 rtm в течение 2 минут, полученный осадок наносят на мишень, подсушивают при температуре 22±1°С в течение 5-10 минут, после чего точки с нанесённым биоматериалом покрывают 1 мкл раствора матрицы HCCA и оставляют при температуре 22±1°С, после полного высыхания проводят идентификацию на MALDI-TОF масс-спектрометре.

Способ определения возбудителей пневмоний масс-спектрометрическим методом MALDI-TOF заключается в следующем. Для идентификации видов бактерий методом MALDI-TOF MS использовали настольный масс-спектрометр Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Germany). При реализации способа применяют следующие реактивы:

1. HCCA (α-циано-4-гидроксикоричная кислота), в конкретном примере исполнения применяют HCCA порционную производителя Bruker Daltonics;

2. Стандартный раствор (OS, 50% ацетонитрила, 47,5% воды и 2,5% трифторуксусной кислоты);

3. 95% этанол;

4. 70% муравьинная кислота;

5. 50% ацетонитрил.

Бактериологическое исследование образцов мокроты проводили классическим количественным методом с разведением в физиологическом растворе 1:2 и посевом на стандартные дифференциально-диагностические среды. Для выявления Str. pneumoniae, H. Influenzaе и Streptococcus spp. применяли 5% кровяной агар и шоколадный агар с селективной добавкой для выделения пневмококков (СД-П) (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, Россия). Последующую идентификацию выделенных штаммов бактерий осуществляли с помощью времяпролетной масс-спектрометрии на аппарате MALDI-TOF Microflex Biotyper (BrukerDaltonics, Германия). В начале исследуемые культуры высевают в плотную среду Мюллер-Хинтон агар, разлитый в чашки Петри методом истощающего штриха с целью получения одиночных колоний. Затем посевы инкубировали при 36,5-37,5°С в течение 20-24 часов. Далее в пробирку с матрицей HCCA (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid) добавляют 250 мкл стандартного раствора OS (50% ацетонитрила, 47,5% воды и 2,5% трифторуксусной кислоты). Полученную суспензию перемешивают на лабораторной мешалке (Vortex) при комнатной температуре до полного растворения сухого вещества. Далее одиночную колонию бактерий наносят тонким слоем непосредственно на точку мишени, начиная от середины точки. Затем точки с нанесённым биоматериалом покрывают 1 мкл раствора матрицы HCCA и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания матрицы. Уровень идентификации бактерий трактовали по критериям Score, указанным в инструкции: 2.300-3.000 высокая вероятность идентификации вида; 2.000-2.299 надежная идентификация рода, вероятная идентификация вида; 1.700-1.999 вероятная идентификация рода; 0.00-1.699 ненадежная идентификация. Все повторности были определены с высокой вероятностью идентификации вида. Профили микроорганизмов получали с использованием Microflex LT MALDI–TOF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением FlexControl (BrukerDaltonics). Визуализацию проводили с помощью программного обеспечения Flex analysis3.3 (BrukerDaltonics). Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием раздела Statistica Microsoft Excel.

Образец мокроты разводили 1:2 в изотоническом растворе хлорида натрия, размешивали на лабораторной мешалке (Vortex) 2-3 минуты, центрифугирование в режиме 13000 rtm - 2 мин (получали осадок №1):

1) осушение биоматериала: образец соединяли 1v/1v с 95% этанола и проводили центрифугирование в режиме 13000 rtm - 2 мин (получали осадок №2);

2) обработка материала муравьиной кислотой для усиления гидролиза микроорганизмов: готовили смесь 70% муравьинной кислоты +50% ацетонейтрил 1:1; далее осадок № 2 соединяли 1v/1v со смесью муравьинной кислоты и ацетонейтрила; размешивали на лабораторной мешалке (Vortex) 2-3 минуты; далее проводили центрифугирование 3 в режиме 13000 rtm -2 мин - (получали осадок №3);

3) подсушивание: осадок 3 наносили 1 мкл на мишень при 22 ±1°С, подсушивали 5-10 минут;

4) обработка матрицей: точки с нанесённым и подсушенным биоматериалом покрывали 1 мкл раствора матрицы HCCA и оставляли при 22±1°С до полного высыхания матрицы - 5-10 минут;

5) проведение исследования: профили микроорганизмов получали с использованием Microflex LT MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением FlexControl (BrukerDaltonics). Визуализацию проводили с помощью программного обеспечения Flex analysis3.3 (BrukerDaltonics). Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием раздела Statistica Microsoft Excel;

6) учет: Микроорганизмы со Score свыше 1.7 оценивают как идентификация до рода. При Score свыше 1.5, менее 1.69 - вероятное присутствие в мокроте труднокультивируемых и привередливых микробов.

Объектами исследования являлись образцы мокроты больных людей с верифицированной внебольничной пневмонией. Для анализа использовали 104 образца мокроты и 1651 спектр микроорганизмов. Идентификацию возбудителей из мокроты осуществляли двумя способами - классическим микробиологическим на основе выделения культуры возбудителя, идентификация (культуральная, биохимическая, тинкториальная, и масс-спектрометрическим методом MALDI-TOF отдельных колоний), сопоставляли с предлагаемым ускоренным способом масс-спектрометрическим методом MALDI-TOF с муравьинной кислотой.

Таблица 1. Сравнение затрат времени двумя способами на 1 исследование возбудителей пневмоний

Сравниваемые способы Классический микробиологический способ исследования возбудителей пневмоний Предлагаемый ускоренный способ исследования возбудителей пневмоний масс-спектрометрическим методом MALDI-TOF Этапы Время исследования Этапы Время исследования Подготовка материала Разведение образца 1:2 Подготовка материала Разведение образца 1:2 Выделение культуры возбудителя Масс-спектрометрия, метод MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) Идентификация (культуральная, биохимическая, тинкториальная Оценка результата Суммарно 48 ч - 3 мес Оценка результата * Суммарно 2 часа

* Оценка результата Score 1.700-1.999 - вероятная идентификация рода; 0.00-1.699 - ненадежная идентификация.

Потенциальные возбудители пневмоний методом MALDI–TOF MS были идентифицированы до рода в течение 2 часов.

Пример 1. Сравнение возможностей диагностики классического культурального (микробиологического) способа и ускоренного ориентировочного способа диагностики на базе масс-спектрометрии

Исследования 104 проб мокроты людей с верифицированной внебольничной пневмонией с использованием параллельно микробиологического классического способа и возможностей способа MALDI-TOF MS показало, что тестируемые роды микроорганизмов определялись при культивировании на питательных средах в диагностически значимых количествах более 5 lgКОЕ/мл, при этом MALDI–TOF MS Score отмечены более 1.7 (1.7-1.9), данные обоих способ совпадали в 99±1%, результаты сопоставления представлены в таблице 2.

Таблица 2. Сопоставление результатов использования 2 способов культивирования MALDI–TOF MS для выявления родов микроорганизмов

Наименование родов микроорганизмов (М = 104*) Сопоставление результатов Культивирование lgКОЕ/мл (идентификация через 48 часов) Масс-спектрометрия MALDI-TOF MS Score (идентификация через 1 час) Streptococcus sp. (30) 7.8 1.8 Staphylococcus sp. (22) 7.5 1.7 Candida sp. (17) 6.2 1.9 Rothia sp. (6) 6 1.7 Neisseria sp. (17) 6.5 1.88 Klebsiella sp. (7) 7.5 1.85 Pseudomonas sp. (5) 7.5 1.8

* Приведены данные 104 проб мокроты людей с верифицированной внебольничной пневмонией.

В результате исследования были выявлены при 100% совпадении данных: Streptococcus sp. в 42,3%; Staphylococcus sp. в 31%; Candida sp. в 23,9%; Rothia sp. в 8,5%; Neisseria sp. в 18%; Klebsiella sp. в 9,8%; Pseudomonas s. в 7%.

Пример 2. Сравнение возможностей дополнительной диагностики ускоренного ориентировочного способа на базе масс-спектрометрии

Для трудно- и длительнокультивируемых и привередливых микроорганизмов, чья идентификация по классическим микробиологическим способам может быть продолжительной 72 часа и более (например, 3 мес) возможности метода MALDI-TOF MS позволяют заподозрить их присутствие в мокроте через 2 часа и сориентировать соответственно лечащих врачей в отношении тактики терапии в ранние сроки заболевания.

Таблица 3. Труднокультивируемые, привередливые микроорганизмы

Группы труднокультивируемых и привередливых микроорганизмов (М=1547) Наименование* Масс-спектромерическое исследование Score Коринеформные бактерии (72 час) Arothbacter polychromogenes
Arthrobacter roseus
Arthrobacter bergerei
Arthrobacter mysorens
Arthrobacter polychromogen
Arthrobacter oxydans
Arthrobacter oxydans 1.55-1.65 Неферментирующие грамотрицательные бактерии (72 час) Pseudomonas mendocina
Pseudomonas posae
Photobacterium iliopiscarium
Acinetobacter junii 1.6-1.620 Клостридии (72 час) Clostridium cochlearium 1.588-1.600 Дрожжеподобные грибы, актиномицеты, плесневые грибы (14 дней) Candida tropicalis
Thauera mechernichensis
Streptomyces phaeochromogenes
Thauera phenylacetica
Streptomyces phaeochromogenes
Nocardiopsis alba 1.568-1.633 Микобактерии (до 3 мес) Mycobacterium gordonae
Mycobacterium pseudoshottsii
Mycobacterium avium
Mycobacterium mucogenicum
Mycobacterium pseudoshottsii 1.578-1.611 Листерии (72 час) Listeria grayi 1.500-1.611 Кампилобактерии (72 час) Campylobacter lari 1.531-1.600

⃰ Приведены данные 104 проб мокроты людей с верифицированной внебольничной пневмонией.

Изобретение относится к области микробиологии. Описан способ определения возбудителей пневмоний масс-спектрометрическим методом MALDI-TOF, заключающийся в том, что образец мокроты растворяют в соотношении 1:2 в изотоническом растворе хлорида натрия, затем размешивают на лабораторной мешалке Vortex в течение 2-3 минут и центрифугируют в режиме 13000 оборотов в минуту в течение 2 минут. Полученный осадок соединяют в равном объёме с 95% этанолом, затем перемешивают на лабораторной мешалке Vortex в течение 2-3 минут и центрифугируют в режиме 13000 оборотов в минуту в течение 2 минут. Полученный осадок размешивают в соотношении 1:1 в смеси 70% муравьиной кислоты и 50% ацетонитрила, затем перемешивают на лабораторной мешалке Vortex в течение 2-3 минут и центрифугируют в режиме 13000 оборотов в минуту в течение 2 минут. Полученный осадок наносят на мишень, подсушивают при температуре 22±1°С в течение 5-10 минут, после чего точки с нанесённым биоматериалом покрывают 1 мкл раствора матрицы HCCA и оставляют при температуре 22±1°С, после полного высыхания проводят идентификацию на MALDI-TОF масс-спектрометре. Техническим результатом заявленного изобретения является расширение функциональных возможностей способа, а также сокращение трудоемкости за счет внесения использования меньшего количества реагентов и сокращения времени определения возбудителей внебольничных пневмоний, а также повышение точности идентификации микроорганизмов. 3 табл., 2 пр.

Способ определения возбудителей пневмоний масс-спектрометрическим методом MALDI-TOF, заключающийся в том, что образец мокроты растворяют в соотношении 1:2 в изотоническом растворе хлорида натрия, затем размешивают на лабораторной мешалке Vortex в течение 2-3 минут и центрифугируют в режиме 13000 оборотов в минуту в течение 2 минут, полученный осадок соединяют в равном объёме с 95% этанолом, затем перемешивают на лабораторной мешалке Vortex в течение 2-3 минут и центрифугируют в режиме 13000 оборотов в минуту в течение 2 минут, полученный осадок размешивают в соотношении 1:1 в смеси 70% муравьиной кислоты и 50% ацетонитрила, затем перемешивают на лабораторной мешалке Vortex в течение 2-3 минут и центрифугируют в режиме 13000 оборотов в минуту в течение 2 минут, полученный осадок наносят на мишень, подсушивают при температуре 22±1°С в течение 5-10 минут, после чего точки с нанесённым биоматериалом покрывают 1 мкл раствора матрицы HCCA и оставляют при температуре 22±1°С, после полного высыхания проводят идентификацию на MALDI-TОF масс-спектрометре, причем визуализацию проводят с помощью программного обеспечения Flex analysis3.3, микроорганизмы со Score свыше 1.7 оценивают как идентификация до рода, при Score свыше 1.5, менее 1.69 - вероятное присутствие в мокроте труднокультивируемых микробов.