Способ диагностики криптоспоридиоза по концентрациям молекулярных маркеров микроорганизмов в крови Российский патент 2022 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, и может быть использовано для оценки эффективности лечения криптоспоридиоза.

Криптоспоридиоз - паразитарное заболевание, вызываемое протестами рода Cryptosporidium, и является кратковременным острым заболеванием [1]. Особенную опасность, вплоть до летального исхода, криптоспоридиоз представляет для людей, страдающих иммунодефицитом [2]. Широкое распространение криптоспоридиоза при низкой обращаемости к врачу делает диагностику данного заболевания актуальной задачей [1]. Клинические наблюдения последних лет показали высокую инфицированность населения криптоспоридиями и преобладание в клинической картине латентных форм течения криптоспоридиоза с периодическими обострениями [1].

Для идентификации криптоспоридий в кале могут применяться различные методы.

Наиболее часто применяемым методом в рутинной диагностике криптоспоридиоза является микроскопия мазка фекалий при окраске по Граму. Метод простой, легко и быстро выполнимый и не требует больших финансовых затрат. Недостатком используемого метода является низкая специфичность в связи с трудностями дифференциальной диагностики с дрожжеподобными грибами [2].

При использовании микроскопического метода диагностики ооцист криптоспоридий с использованием модифицированной окраски мазков фекалий по Циль-Нильсену, несмотря на экспрессность и небольшие материальные затраты, недостатком метода является низкая диагностическая ценность, в связи с возможностью диагностировать только ооцисты без учета вегетативных форм паразита [3].

Способ микроскопического определения цист с пробоподготовкой кала методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлюоресцентным мечением (Патент РФ №2638811С1 от 15.12.2017) обладает выраженной точностью, скоростью и специфичностью в лабораторной диагностике криптоспоридиоза, позволяющей выявлять цисты криптоспоридий в биологическом материале. Диагностические возможности метода ограничивает низкая способность идентифицировать разные формы возбудителя в исследуемом материале.

Иммунохроматографический метод верификации криптоспоридий по наличию специфических антигенов паразита в нативном материале (качественное определение антигенов иммунохроматографическим методом RIDA®Quick Cryptosporidium parvum) обладает высокой точностью и специфичностью, но является дорогим и требует специального оборудования и наличия тест-системы. Это обстоятельство ограничивает его применение в клинической практике [4].

Иммунологический метод определения Cryptosporidium Antigen в фекалиях тест системой фирмы ELISA в настоящее время применяется редко. Данный метод является точным, специфичным, но дорогостоящим и требует специального оборудования.

В последнее время большое развитие в диагностике криптоспоридиоза получил гистологический метод исследования биоптата, позволяющий одновременно выявить степень контаминации и выраженность воспалительных изменений в разных отделах ЖКТ (Патент РФ №2229128 от 20.05.2004). Метод является ффективным и специфичным, но из-за инвазивности не может применяться в широкой клинической практике [5].

Традиционный копроцитологический метод диагностики криптоспоридиоза сохраняет свою актуальность и высокую диагностическую значимость, однако не позволяет в полном объеме выявить частоту инвазии [5].

Несмотря на большое количество применяемых методов в верификации криптоспоридиоза, ни один из них не обладает 100% диагностической эффективностью. В связи с этим при подозрении на криптоспоридиоз целесообразно использовать комплекс различных методов с включением иммунохроматографического метода определения антигенов в кале, иммунологического и гистологического исследования биоптатов, позволяющих увеличить процент обнаружения возбудителя, особенно в диагностически сложных случаях [5]. При невозможности применения комплекса методов диагностики, необходимо использовать дифференцированный подход к выбору наиболее эффективного метода верификации возбудителя.

Таким образом, необходимость в дальнейшей разработке ускоренных методов лабораторной диагностики криптоспоридиоза, оценке состояния микробиоты на фоне проводимого лечения и прогнозирования исходов заболевания является актуальной задачей.

Технической проблемой настоящего изобретения является разработка информативного метода диагностики криптоспоридиоза путем идентификации специфического соотношения концентраций молекулярных маркеров микроорганизмов в крови.

Указанная проблема решается путем определения концентраций молекулярных маркеров микроорганизмов, представляющих собой стерины, альдегиды, гидроксикислоты и высшие жирные кислоты в венозной крови пациентов методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) с последующей оценкой полученных результатов по классификационным уравнениям линейного дискриминантного анализа, подтверждающей наличие или отсутствие криптоспоридиоза у пациента.

Известно, что при заражении криптоспоридиями меняется метаболический профиль как макроорганизма, так и микробиоценоза. Впервые идею о том, что вся информация о функциональном состоянии организма отражена в качественном и количественном составе биологических жидкостей организма высказали Linus Pauling с соавторами в 1971 г. (Pauling L., Robinson А.В., Teranishi R., Cary P. Quantitative analysis of urine vapor and breath by gas-liquid partition chromatography // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1971. - Vol. 68, No. 10.-P. 2374-2376.)

Позже Nicholson J.K. с соавторами ввел понятие «метабономика», означающее динамический метаболический ответ живых систем на биологические стимулы, в то время как под термином «метаболомика» понималась наука, изучающая метаболические профили на клеточном и органном уровне и связанная преимущественно с нормальным эндогенным метаболизмом [(Nicholson J.K., Lindon J.С., Holmes Е. 'Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data // Xenobiotica. - 1999. - Vol. 29, No. 11. - P. 1181-1189]

Биологический объект - это единая система, проявляющая реакцию на эндогенные и экзогенные факторы воздействия. Большое количество факторов в многоуровневой системе взаимодействия всех компонентов объекта - это множество одновременно происходящих процессов, которые накладываются друг на друга, и дают нечеткий ответ. Для обработки таких данных применяются методы математического моделирования.

Использование концентраций стеринов, альдегидов, гидроксикислот и высших жирных кислот для детекции криптоспоридий с применением проекционных методов многомерной статистики позволяет эффективно детектировать инвазию вне зависимости от биологической формы паразита. Наиболее простым и надежным методом математического моделирования является линейный дискриминантный анализ (ЛДА), который демонстрирует высокие показатели чувствительности и специфичности за счет алгоритма пошагового исключения малоинформативных компонентов и выявления специфического соотношения компонентов, характерного для состояния, заданного обучающей выборкой.

Сущность изобретения заключается в том, что при исследовании образца венозной крови методом газовой хроматографии масс-спектрометрии определяют концентрацию следующих молекулярных маркеров микроорганизмов [6,7,8,9,10].:

Декановая кислота (С _10:0)

изопальмитиновая кислота (С _i16:0)

9,10-тетрадеценовая кислота (С _14:1d9)

изолауриновая кислота (С _i12)

3-гидроксилауриновая кислота (С _3h12)

2-гидроксилауриновая кислота (С _2h12)

изопентадекановая кислота (С _i15)

9,10-пентадеценовая кислота (С _15:1d9)

изо-3-гидрокситридекановая кислота (С _3hi13)

изо 9,10-гексадеценовая кислота (С _i16:1d9)

7,8-гексадеценовая кислота (C_16:1d7)

2-гидроксимиристиновая кислота (С _2h14)

10-метилгексадекановая кислота (C_10Me16)

3-гидроксиизопентадекановая кислота (C_3hi15)

антеизогептадекановая кислота (С _а17)

цис-вакценовая кислота (С _18:1d11)

9,10-гептадеценовая кислота (С _17:1d9)

лауриновая кислота (С _12:0)

Изооктадекановая кислота (С _i18)

3-гидрокси-пальмитиновая кислота (С _3h16)

циклоыонадекановая кислота (С_{19 cyc})

изогептадекановый альдегид (С _i17a)

холестендиол (Cholestendiol)

кампестерол (Campesterol)

9,10-гексадеценовая кислота (С _16:1d9t)

β-ситостерол (b-Sitosterol)

изопентадекановый альдегид (С _i15a)

10-метил-октадекановая кислота (С _10Me18)

7,8-тетрадеценовая кислота (С _14:1d7)

эйкозеновая кислота (С _20:1)

3-гидроксиэйкозановая кислота (C_3h20)

2-гидроксидокозановая кислота (C_2h22)

2-гидроксигексакозиловая кислота (С _2h26)

Для расчета диагностических коэффициентов полученные значения показателей концентраций молекулярных маркеров умножают на коэффициенты классификационных уравнений и суммируют с учетом знаков коэффициентов [11]. Затем, путем сравнения величин диагностических коэффициентов идентифицируют криптоспоридиоз или его отсутствие.

Технический результат предлагаемого метода детекции криптоспоридиоза позволяет учесть наличие или отсутствие инвазии вне зависимости от биологической формы паразита. Метод является универсальным, быстрым, безопасным, неинвазивным, простым в использовании и достаточно легко воспроизводимым, позволяющем выбрать правильную тактику лечения, удешевить процесс исследования и прогнозирования исхода заболевания.

Способ осуществляют следующим образом.

Необходимым условием проведения опыта является использование химически чистой посуды для хроматографии и особо чистых реактивов и газов для хроматографии и соблюдения правил работы с ПБА III-IV групп патоген ности [12].

Для проведения хромато-масс-спектрометрического анализа используют

Проведение биохимического анализа крови осуществляют в специализированной лаборатории специалистами, имеющими опыт работы с исследованием биологического материала хромато-масс-спектрометрическим методом.

Материалом для исследования служат венозная или капиллярная кровь обследуемого, которая собирается, хранится и доставляется в лабораторию согласно Инструкции 2.1.3.007-02 о соблюдении противоэпидемического режима при взятии венозной крови путем венопункции в учреждениях здравоохранения г. Москвы от 10.10.2002 и МУ 4.2.2039-05 Методические указания [12].

Техника сбора и транспортировки биоматериалов в микробиологические лаборатории.

Для анализа образцы крови обрабатывают сразу или замораживают и хранят при - 5°-18°С в случае, когда немедленный анализ невозможен в течение 10 дней. Допускается транспортировка проб при нормальной температуре в течение пяти часов, в переносках или укладках с раздельными гнездами. Допускается длительное хранение в высушенном виде при необходимости дальней транспортировки или пересылки пробы по почте (каплю в количестве 40 мкл, нанесенную на чистую обеззоленную фильтровальную бумагу, высушивать при температуре 70-85°С).

Суть анализа состоит в прямом извлечении с помощью химической процедуры высших жирных кислот, альдегидов, стеринов и других липидных соединений из подлежащего исследованию образца, их разделения на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения с неподвижной фазой НР-5 ms., анализа состава в динамическом режиме на масс-спектрометре, и математической обработке с использованием прилагаемых программ.

Пробоподготовка: Кровь из пальца (или из вены) в количестве не менее 100 мкл отбирают в пробирку с гепарином или ЭДТА (цитрат не рекомендуется). Для анализа цельную кровь в количестве 40 мкл пипеткой переносят в виал, емкостью 1,5 мл, с завинчивающейся крышкой с тефлонированной прокладкой, подсушивают (при снятой крышке) в термостате при 80°С с добавлением 40 мкл метанола для ускорения сушки. Метанолиз проводят в 0,4 мл 1М HCl в метаноле в течение 1 часа при 80°С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот и альдегидов из сложных липидов микроорганизмов и других клеток жидкости в виде метиловых эфиров и диметилацеталей. В пробу вводят 300 нг внутреннего стандарта -дейтерометилового эфира тридекановой кислоты, растворенного в гексане. Компоненты реакционной смеси экстрагируют гексаном (400 мкл) в течение 5 мин, гексановый экстракт аккуратно собирают не задев нижний слой, высушивают, в течение 5-7 минут при температуре 80°С, а сухой остаток обрабатывают 20 мкл N,O-бис(триметил-силил)-трифторацетамида (BSTFA) в течение 15 мин при 80°С для получения триметилсилильных эфиров окси-кислот и стеролов. К реакционной смеси эфиров добавляют 80 мкл гексана.

Сканирование пробы: Для проведения анализа смесь эфиров в количестве 2 мкл вводят в инжектор ГХ-МС системы АТ-5973 Аджилент Технолоджис (Agilent Technologies Inc.) (США) вручную или посредством автоматической системы ввода проб (автосэмплер), которая обеспечивает воспроизводимость времен удерживания хроматографических пиков и повышает точность автоматической обработки данных.

Хроматографическое разделение пробы осуществляют на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Аджилент технолоджис длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм, газ-носитель - гелий. Режим анализа - программированный, скорость нагрева термостата колонки 7°С/мин в диапазоне 135-320°С. Выдержка при начальной температуре 1,5 мин. Температура испарителя - 250°С, интерфейса - 250-300°С. Масс-спектрометр - квадрупольный, с ионизацией электронами (70 эв) используют в режиме селективных ионов, или масс-фрагментографии (МФ), при периодическом сканировании до тридцати ионов в пяти интервалах времени. Интервалы и ионы выбирают таким образом, чтобы селективно детектировать маркеры определяемых видов микроорганизмов. В том числе используют сильный ион m/z=87 в спектрах жирных кислот для детектирования малых количеств микробных кислот С12-С15, С17, С19. Ион 175 включают в каждый интервал, кроме пятого для детектирования (3-оксикислот, для которых он специфичен и интенсивен в спектре. Ионы 301, 315 и далее через 14 единиц массы включают в программу для подтверждения молекулярного иона оксикислот тридекановой, тетрадекановой и следующих в гомологическом ряду. Ион 312, как молекулярный, используют для выявления изомеров нонадекановой кислоты. Интерпретация данных масс-фрагментограмм состоит в соотнесении пиков к определенным веществам на основании их массы, соотношения интенсивности (площадей) и времени хроматографического удерживания.

Для получения диагностических коэффициентов значения полученных концентраций молекулярных маркеров в наномоль/г подставляют в классификационные уравнения линейного дискриминантного анализа [11].

F1 = 10.93×С_10:0 + 49,409×C_i16:0 - 17.048×С_14:1d9 - 1513,552×C_i12 + 4284,755×C_3h12 -9189,772×C_2h12 + 108,027×C_i15 + 579,488×С_15:1d9 - 164371,836×C_3hi13 + 1543,531×C_i16:1d9 + 8,101×C_16:1d7 + 4375,831×C_2h14 - 135,819×C_10Me16 + 541,596×C_3hi15- 5,91×C_a17 + 6,106×С_18:1d11 - 194,092×C_17:1d - 4.384×C_12:0 - 924,077×C_i18 - 613,338×C_3h16 + 1422,211×C_19cyc - 20,754×C_i17a - 34,869×Cholestendiol + 70.87×Campesterol - 5.334×C _16:1d9t + 127,543×β-Sitosterol + 37,608×C_i15a - 22926,95×C_10Me18 - 971,95×C_14:1d7 - 9,786×C_20:1 - 282,462×C_3h20 - 370,965×C_2h22 + 560,827×C_2h26 - 111,435

F2 = 0,615×C_10:0 + 15,781×C_i16:0 + 4,877×C_14:1d9 - 80,014×C_i12 + 182,971×C_3h12 - 1177,674×C_2h12 - 0,573×C_i15 + 32,366×C_15:1d9 - 32984,236×C_3hi13 + 275,138×C_i16:1d9 + 1,945×C_16:1d7 + 669,448×C_2h14 - 34,693×C_10Me16 - 263,26×C_3hi15 + 2,893×C_a17 + 1,511×C_18:1d11 - 58,287×С_17:1d9 - 0,648×C_12:0 - 174,338×C_i18 + 0,114×C_3h16 + 196,233×C_19cyc - 5,693×C_i17a + 2,127×Cholestendiol - 0,06×Campesterol - 1,987×C_16:1d9t + 22,444×Sitosterol - 6,506×C_i15a + 4099,613×C_10Me18 - 150,342×C_14:1d7 - 0,627×С_20:1 - 428,972×C_3h20 - 49,664×C_2h22 + 69,296×C_2h26 - 33,955

где:

F1 - диагностический коэффициент, указывающий на отсутствие признаков криптоспоридиоза, при условии F1>F2;

F2 - диагностический коэффициент указывающий на наличие криптоспоридиоза, при условии F1<F2;

Концентрации молекулярных маркеров микроорганизмов в венозной крови, наномоль/г:

C_10:0 - Декановая кислота

C_i16:0 - изопальмитиновая кислота

C_14:1d9 - 9,10-тетрадеценовая кислота

С _i12 - изолауриновая кислота

С _3h12 - 3-гидроксилауриновая кислота

С _2h12 - 2-гидроксилауриновая кислота

С _i15 - изопентадекановая кислота

С _15:1d9 - 9,10-пентадеценовая кислота

С _3hi13- изо-3- гидрокситридекановая кислота

С _i16:1d9 - изо 9,10-гексадеценовая кислота

С _16:1d7 - 7,8-гексадеценовая кислота

С _2h14 - 2-гидроксимиристиновая кислота

С _10Me16 - 10-метилгексадекановая кислота

С _3hi15 - 3-гидроксиизопентадекановая кислота

С _а17 - антеизогептадекановая кислота

С _18:1d11 - цис-вакценовая кислота

С _17:1d9 - 9,10-гептадеценовая кислота

С _12:0 - лауриновая кислота

С _i18 - Изооктадекановая кислота

С _3h16 - 3-гидрокси-пальмитиновая кислота

С _19cyc - циклононадекановая кислота

C_i17a - изогептадекановый альдегид

Cholestendiol - холестендиол

Campesterol - кампестерол

С _16:1d9t - 9,10-гексадеценовая кислота

b-Sitosterol - β-ситостерол

C_i15a - изопентадекановый альдегид

С _10Me18 - 10-метил-октадекановая кислота

С_14:1d7 - 7,8- тетрадеценовая кислота

С _20:1 - Эйкозеновая кислота

С _3h20 - 3-гидроксиэйкозановая кислота

С _2h22 - 2-гидроксидокозановая кислота

С _2h26 - 2-гидроксигексакозиловая кислота

В результате совместной работы лаборатории диагностики кишечных инфекционных заболеваний и клинического отдела института было обследовано 157 пациентов с 2017 года. Эффективность диагностики заявленного способа изобретения составила 95,4%_ по сравнению с микроскопическим методом исследования.

Изобретение иллюстрируют следующими примерами.

Пример 1. Пациентка Р., 27 лет. Клинический диагноз: криптоспоридиоз кишечная форма. Легкое течение. Жалобы на жидкий водянистый стул до 3-х раз в день, умеренную слабость, урчание в животе, лихорадку до 37,5°С, ноющие боли в нижних отделах кишечника в течение длительного времени. Из анамнеза заболевания известно, что у мужа отмечается жидкий водянистый, частый стул до 5-7 раз в сутки. Объективно: состояние удовлетоврительное. Правильного телосложения, удовлетворительного питания. Кожные покровы и видимые слизистые чистые. Язык влажный, обложен у корня белым налетом. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны сердца слегка приглушены, ритмичные, пульс 76 в минуту, АД 120/70. Живот при пальпации умеренно вздут, отмечается выраженное урчание в правой подвздошной области и нисходящего отдела толстой кишки. Печень и селезенка не увеличены. Стул жидкий, водянистый, с умеренным количеством слизи. Мочеиспускание не нарушено. Симптом Пастернацкого отрицательный с обеих сторон. В неврологическом статусе без патологии. Обследование: Клинический анализ крови - выявлен умеренный лейкоцитоз с небольшим сдвигом формулы влево. Клинический анализ мочи без патологии. Бактериологические исследования на патогенную микрофлору, ротавирусную и норовирусную инфекции - отрицательные. Мазок фекалий микроскопическим методом (окраска Циль-Нильсена) - идентифицированы Cryptosporidium parvum. Исследования микрофлоры кишечника бактериологическим методом выявили значительное снижение показателей нормофлоры и превышение значений условно-патогенных микроорганизмов в диагностически значимых концентрациях (ДКII). Анализ венозной крови на определение концентраций молекулярных маркеров микроорганизмов после проведения курсов комплексного лечения показал следующие значения концентраций молекулярных маркеров:

Для расчета значений диагностических коэффициентов полученные значения концентраций молекулярных маркеров умножены на коэффициенты классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа и сложены с учетом знака. Полученные значения диагностических коэффициентов сравнивали между собой.

F1=10,93×0,544+49,409×3,78-17,048×0,024-1513,552×0,011+4284,755×0,016-9189,772×0,013+108,027×0,938+579,488×0,035-164371,836×0+1543,531×0,172+8,101×1,745+4375,831×0,03-135,819×1,024+541,596×0-5,91×7,684+6,106×34,27-194,092×0,19-4,384×3,842-924,077×0,038-613,338×0,372+1422,211×0,03-20,754×6,852-34,869×0,089+70,87×0,231-75,334×0,992+127,543×0,03+37,608×0,934-22926,95×0-971,95×0,052-9,786×4,85-2282,462×0-370,965×0,173+560,827×0,012-111,435=-25,974

F2=0,615×0,544+15,781×3,78+4,877×0,024-80,014×0,011+182,971×0,016-1177,674×0,013-0,573×0,938+32,366×0,035-32984,236×0+275,138×0,172+1,945×1,745+669,448×0,03-34,693×1,024-263,26×0+2,893×7,684+1,511×34,27-58,287×0,19-0,648×3,842-174,338×0,038+0,114×0,372+196,233×0,03-5,693×6,852+2,127×0,089-0,06×0,231-1,987×0,992+22,444×0,03-6,506×0,934+4099,613×0-150,342×0,052-0,627×4,85-428,972×0-49,664×0,173+69,296×0,012-33,955=43,476

Максимальное значение диагностического коэффициента F2=43,476 указывает на наличие криптоспоридиоза.

Лечение: споробактерин в дозе 2 мл 2 раза в день перед едой в течение 20 дней; с последующим приемом - максилак по 1 капсуле 1 раз в день перед едой 20 дней. На фоне проводимой терапии отмечалась выраженная клинико-лабораторная динамика основных клинических проявлений: симптомов интоксикации, болевого синдрома и диспептических явлений. В бактериологическом посеве кала отмечался рост представителей индигенной микрофлоры и элиминация условно-патогенных бактерий. В контрольном мазке фекалий - криптоспоридий не выявлялись.

Пример 2. Пациент Г., 37 лет. Клинический диагноз: ОРВИ, трахеобронхит. Поступил в инфекционный стационар с направительным диагнозом ОРВИ с кишечным синдромом. Жалобы при поступлении на общую выраженную слабость, лихорадку до 39°С, першение в горле, сухой кашль, боль в животе периодического характера, урчание в кишечнике, частый жидкий водянистый стул до 5-7 раз со слизью.

Объективно: состояние средней тяжести. Заторможен, вялый. Умеренно выражена интоксикация и катаральный синдром. Кожные покровы и видимые слизистые чистые, сухие, горячие наощупь. Язык влажный, обильно обложен у корня белым налетом. В легких дыхание жесткое, выслушиватся сухие рассеянные. Явлений дыхательной недостаточности нет. ЧД 20 в минуту. Тоны сердца слегка приглушены, ритмичные, пульс 96 в минуту, АД 100/60. Живот при пальпации умеренно вздут, отмечается болезненность и урчание в правой подвздошной области и около пупка. Печень и селезенка не увеличены. Стул жидкий, водянистый, со слизью. Мочеиспускание не нарушено. Симптом Пастернацкого отрицательный с обеих сторон. В неврологическом статусе без патологии. При рентгенологическом исследовании грудной клетки - усиление бронхолегочного рисунка. Очаговых и инфильтративных изменений в легких не выявлено. В клиническом анализе крови - лейкоцитоз, нейтрофиллез, ускоренное СОЭ. Бактериологический посев кала на патогенную флору и вирусы - отрицательный. В мазке фекалий при окраске по Циль-Нильсену не были выявлены вегетативные формы и цисты Cryptosporidium parvum. В микрофлоре кишечника отмечались значительные нарушения (ДК III).

Анализ венозной крови на определение концентраций молекулярных маркеров микроорганизмов после проведения курсов комплексного лечения показал следующие значения концентраций:

Для расчета значений диагностических коэффициентов полученные значения концентраций молекулярных маркеров умножены на коэффициенты классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа и сложены с учетом знака. Полученные значения диагностических коэффициентов сравнивали между собой.

F1=10,93×1,317+49,409×1,785-17,048×0,063-1513,552×0,016+4284,755×0,012-9189,772×0,012+108,027×1,586+579,488×0,033-164371,836×0+1543,531×0,039+8,101×2,428+4375,831×0,055-135,819×0,33+541,596×0-5,91×5,631+6,106×29,534-194,092×0,536-4,384×18,789-924,077×0,113-613,338×0,215+1422,211×0,052-20,754×0,354-34,869×1,317+70,87×0,722-75,334×0,863+127,543×0,381+37,608×0,034-22926,95×0-971,95×0,022-9,786×3,779-2282,462×0-370,965×0+560,827×0,024-111,435=109,539

F2=0,615×1,317+15,781×1,785+4,877×0,063-80,014×0,016+182,971×0,012-1177,674×0,012-0,573×1,586+32,366×0,033-32984,236×0+275,138×0,039+1,945×2,428+669,448×0,055-34,693×0,33-263,26×0+2,893×5,631+1,511×29,534-58,287×0,536-0,648×18,789-174,338×0,113+0,114×0,215+196,233×0,052-5,693×0,354+2,127×1,317-0,06×0,722-1,987×0,863+22,444×0,381-6,506×0,034+4099,613×0-150,342×0,022-0,627×3,779-428,972×0-49,664×0+69,296×0,024-33,955=34,591

Максимальное значение диагностического коэффициента F1=109,539 указывает на отсутствие признаков криптоспоридиоза.

Пациенту проведено комплексное лечение: дезинтоксикационная и патогенетическая терапия, антибактериальные средства, пробиотики. На фоне проводимой терапии отмечалась положительная клинико-лабораторная дианамика: исчезли признаки интоксикации, диспептический синдром. В мазке фекалий - Cryptosporidium parvum не были выявлены. Посев фекалий на микрофлору выявлил значительную положительную динамику кишечной микрофлоры (ДКII).

Пример 3. Пациент Ф., 22 года. Клинический диагноз: криптоспоридиоз генерализованная форма тяжелое течение. Наблюдался в условиях инфекционного стационара, куда поступил с диагнозом лихорадка неустановленной этиологии. Жалобы при поступлении на лихорадку в течение 10 дней, общую выраженную слабость, лихорадку до 39-40°С, плохой аппетит, вздутие и ноющие боли в животе, жидкий водянистый стул с примесью слизи. До госпитализации дома принимал антибактериальные препараты без эффекта. При обследовании фекалий при микроскопии в кале выявлены Cryptosporidium parvum. Проведено комплексное лечение: дезинтоксикационная и патогенетическая терапия, антибактериальные средства с включение пробиотиков. На фоне проводимой терапии быстро исчезли симптомы интоксикации, диспептические явления. Микроскопия мазка на криптоспоридий после лечения - отрицательная.

Анализ венозной крови на определение концентраций молекулярных маркеров микроорганизмов после проведения курсов комплексного лечения показал следующие значения концентраций:

Для расчета значений диагностических коэффициентов полученные значения концентраций молекулярных маркеров умножены на коэффициенты классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа и сложены с учетом знака. Полученные значения диагностических коэффициентов сравнивали между собой.

F1=10,93×1,533+49,409×1,414-17,048×0,029-1513,552×0,011+4284,755×0,007-9189,772×0,009+108,027×0,811+579,488×0,03-164371,836×0+1543,531×0,024+8,101×2,359+4375,831×0,048-135,819×0,322+541,596×0-5,91×4,548+6,106×28,265-194,092×0,365-4,384×15,675-924,077×0,092-613,338×0,221+1422,211×0,063-20,754×2,589-34,869×0,647+70,87×0,543-75,334×0,516+127,543×0,352+37,608×0,278-22926,95×0-971,95×0,045-9,786×3,483-2282,462×0-370,965×0,221+560,827×0,025-111,435=-59,635

F2=0,615×1,533+15,781×1,414+4,877×0,029-80,014×0,011+182,971×0,007-1177,674×0,009-0,573×0,811+32,366×0,03-32984,236×0+275,138×0,024+1,945×2,359+669,448×0,048-34,693×0,322-263,26×0+2,893×4,548+1,511×28,265-58,287×0,365-0,648×15,675-174,338×0,092+0,114×0,221+196,233×0,063-5,693×2,589+2,127×0,647-0,06×0,543-1,987×0,516+22,444×0,352-6,506×0,278+4099,613×0-150,342×0,045-0,627×3,483-428,972×0-49,664×0,221+69,296×0,025-33,955=5,997

Максимальное значение F2=5,997 указывает на наличие криптоспоридиоза. Пациент был выписан из стационара по настоятельной просьбе. В катемнезе при появлении симптомов диспепсии пациент в амбулаторных условиях был повторно обследован на криптоспоридиоз. При микроскопии мазка фекалий были выявлены Cryptosporidium parvum.

Литература:

1. Щербаков И.Т., Виноградов Н.А., Леонтьева Н.И., Грачева Н.М., Филиппов B.C., Филиппова О.А. Морфология слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки у пациентов с синдромом раздраженного кишечника при контаминации кампилобактером, криптоспоридиями и грибами рода Candida // Морфологические ведомости. - 2017. -№3. - С. 32-36.

2. Дехнич А.В. Клинические и микробиологические аспекты криптоспоридиоза // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. -№3. - С. 51-57.

3. Цинзерлинг А.В. Обработка и окраска мазков и срезов для выявления микроорганизмов // Архив патологии. - 1992. - №5, том 54. - С..36.

4. Михайлова Д.О., Бобылева З.Д., Базарный В.В., Амон Е.П., Бейкин Я.Б., Беседина Л.Т., Мельникова О.В., Шилова В.П., Розанова С.М., Перевалова Е.Ю. Диагностическое значение различных иммунологических методов лабораторной диагностики легионеллеза. // Журн. микробиол., эпидемиол. иммунобиол.. - 2008. - №2. - С. 51-53.

5. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969, с. 301

6. Persing D.H. Polymerase chain reaction: trenches to benches. // J. Clin. Microbiol., 1991, Vol. 29, №7, p. 1281-1285.

7. White D.C. Validation of quantitative analysis for microbial biomass, community structure, and metabolic activity. // Adv. Limnol., 1988, №31, p. 1-18.

8. Stead D.E., Sellwood J.E., Wilson J., Viney J. Evaluation of a commercial microbial identification system based on fatty acid profiles for rapid, accurate identification of plant pathogenic bacteria. // J. Appl.Bacteriol., 1992, №72, p. 315-321.

9. Турова E.C., Осипов Г.А. Изучение структуры микробного сообщества, активного в биотрансформации минералов железа в каолине. // Микробиология. - 1996. - Т. 65, №5. - С. 682-689.

10. Osipov G.A., Turova E.S. Studying species composition of microbial communities with the use of gas chromatography-mass spectrometry. Microbial community of kaolin. // FEMS Microbiol. Rev., 1997, Vol. 20, №3-4, p. 437-446.

11. Михалевич И.М. Основы прикладной статистики: методические рекомендации / И.М. Михалевич, Н.Ю. Рожкова. ИГИУВ. Иркутск, 2006. 90 с.

12. Осипов Г.А. Демина A.M. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах. // Вестник РАМН - 1996. - Т. 13, №2. - С. 52-59.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, и может быть использовано для диагностики криптоспоридиоза. В венозной крови пациента методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии - определяют концентрации следующих молекулярных маркеров микроорганизмов в нмоль/г: декановой кислоты, изопальмитиновой кислоты, 9,10-тетрадеценовой кислоты, изолауриновой кислоты, 3-гидроксилауриновой кислоты, 2-гидроксилауриновой кислоты, изопентадекановой кислоты, 9,10-пентадеценовой кислоты, изо-3-гидрокситридекановой кислоты, изо 9,10-гексадеценовой кислоты, 7,8-гексадеценовой кислоты, 2-гидроксимиристиновой кислоты, 10-метилгексадекановой кислоты, 3-гидроксиизопентадекановой кислоты, антеизогептадекановой кислоты, цис-вакценовой кислоты, 9,10-гептадеценовой кислоты, лауриновой кислоты, изооктадекановой кислоты, 3-гидрокси-пальмитиновой кислоты, циклононадекановой кислоты, изогептадеканового альдегида, холестендиола, кампестерола, 9,10-гексадеценовой кислоты, b-ситостерола, изопентадеканового альдегида, 10-метил-октадекановой кислоты, 7,8-тетрадеценовой кислоты, эйкозеновой кислоты, 3-гидроксиэйкозановой кислоты, 2-гидроксидокозановой кислоты, 2-гидроксигексакозиловой кислоты. Затем с использованием классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа рассчитывают значения диагностических коэффициентов F1 и F2, подтверждающих наличие или отсутствие криптоспоридиоза. Если F1 больше F2, диагностируют отсутствие криптоспоридиоза, а если F2 больше F1, диагностируют криптоспоридиоз. Способ обеспечивает возможность диагностики криптоспоридиоза, которая позволяет учесть наличие или отсутствие инвазии вне зависимости от биологической формы паразита, за счет неинвазивного определения концентрации молекулярных маркеров микроорганизмов в крови методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии - и проведения диагностики с использованием классификационных уравнений. 1 табл., 3 пр.

Способ диагностики криптоспоридиоза, отличающийся тем, что в венозной крови пациента методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии - определяют концентрации следующих молекулярных маркеров микроорганизмов в нмоль/г: декановой кислоты, изопальмитиновой кислоты, 9,10-тетрадеценовой кислоты, изолауриновой кислоты, 3-гидроксилауриновой кислоты, 2-гидроксилауриновой кислоты, изопентадекановой кислоты, 9,10-пентадеценовой кислоты, изо-3-гидрокситридекановой кислоты, изо 9,10-гексадеценовой кислоты, 7,8-гексадеценовой кислоты, 2-гидроксимиристиновой кислоты, 10-метилгексадекановой кислоты, 3-гидроксиизопентадекановой кислоты, антеизогептадекановой кислоты, цис-вакценовой кислоты, 9,10-гептадеценовой кислоты, лауриновой кислоты, изооктадекановой кислоты, 3-гидрокси-пальмитиновой кислоты, циклононадекановой кислоты, изогептадеканового альдегида, холестендиола, кампестерола, 9,10-гексадеценовой кислоты, b-ситостерола, изопентадеканового альдегида, 10-метил-октадекановой кислоты, 7,8-тетрадеценовой кислоты, эйкозеновой кислоты, 3-гидроксиэйкозановой кислоты, 2-гидроксидокозановой кислоты, 2-гидроксигексакозиловой кислоты; затем с использованием классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа рассчитывают значения диагностических коэффициентов, подтверждающих наличие или отсутствие криптоспоридиоза, по формулам:

F1=10,93×С_10:0+49,409×C_i16:0-17,048×С_14:1d9-1513,552×C_i12+4284,755×C_3h12-9189,772×C_2h12+108,027×C_i15+579,488×С_15:1d9-164371,836×C_3hi13+1543,531×C_i16:1d9+8,101×C_16:1d7+4375,831×C_2h14-135,819×C_10Me16+541,596×C_3hi15-5,91×C_a17+6,106×С_18:1d11-194,092×C_17:1d-4.384×C_12:0-924,077×C_i18-613,338×C_3h16+1422,211×C_19cyc-20,754×C_i17a-34,869×Cholestendiol+70,87×Campesterol-5,334×C_16:1d9t+127,543×β-Sitosterol+37,608×C_i15a-22926,95×C_10Me18-971,95×C_14:1d7-9,786×C_20:1-282,462×C_3h20-370,965×C_2h22+560,827×C_2h26111,435;

F2=0,615×C_10:0+15,781×C_i16:0+4,877×C_14:1d9-80,014×C_i12+182,971×C_3h12-1177,674×C_2h12-0,573×C_i15+32,366×C_15:1d9-32984,236×C_3hi13+275,138×C_i16:1d9+1,945×C_16:1d7+669,448×C_2h14-34,693×C_10Me16-263,26×C_3hi15+2,893×C_a17+1,511×C_18:1d11-58,287×С_17:1d9-0,648×C_12:0-174,338×C_i18+0,114×C_3h16+196,233×C_19cyc-5,693×C_i17a+2,127×Cholestendiol-0,06×Campesterol-1,987×C_16:1d9t+22,444×Sitosterol-6,506×C_15a+4099,613×C_10Me18-150,342×C_14:1d7-0,627×С_20:1-428,972×C_3h20-49,664×C_2h22+69,296×C_2h26-33,955,

где F1 - диагностический коэффициент, максимальное значение которого указывает на отсутствие криптоспоридиоза,

F2 - диагностический коэффициент, максимальное значение которого указывает на наличие криптоспоридиоза,

C_10:0 - декановая кислота,

C_i16:0 - изопальмитиновая кислота

C_14:1d9 - 9,10-тетрадеценовая кислота

С_i12 - изолауриновая кислота,

С_3h12 - 3-гидроксилауриновая кислота,

С_2h12 - 2-гидроксилауриновая кислота,

С_i15 - изопентадекановая кислота,

С_15:1d9 - 9,10-пентадеценовая кислота,

С_3hi13 - изо-3- гидрокситридекановая кислота,

С_i16:1d9 - изо 9,10-гексадеценовая кислота,

С_16:1d7 - 7,8-гексадеценовая кислота,

С_2h14 - 2-гидроксимиристиновая кислота,

С_10Me16 - 10-метилгексадекановая кислота,

С_3hi15 - 3-гидроксиизопентадекановая кислота,

С_а17 - антеизогептадекановая кислота,

С_18:1d11 - цис-вакценовая кислота,

С_17:1d9 - 9,10-гептадеценовая кислота,

С_12:0 - лауриновая кислота,

С_i18 - изооктадекановая кислота,

С_3h16 - 3-гидрокси-пальмитиновая кислота,

С_19cyc - циклононадекановая кислота,

C_i17a - изогептадекановый альдегид,

Cholestendiol - холестендиол,

Campesterol - кампестерол,

С_16:1d9t - 9,10-гексадеценовая кислота,

b-Sitosterol - β-ситостерол,

C_i15a - изопентадекановый альдегид,

С_10Me18 - 10-метил-октадекановая кислота.

С_14:1d7 - 7,8- тетрадеценовая кислота,

С_20:1 - эйкозеновая кислота,

С _3h20 - 3-гидроксиэйкозановая кислота,

С_2h22 - 2-гидроксидокозановая кислота,

С_2h26 - 2-гидроксигексакозиловая кислота,

и, если F1 больше F2, диагностируют отсутствие криптоспоридиоза,

а если F2 больше F1, диагностируют криптоспоридиоз.