СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КРИПТОСПОРИДИОЗА Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано в комплексной лабораторной диагностике гастроэнтерологических заболеваний.

Криптоспоридии являются облигатными паразитами, инфицирующими микроворсинки слизистых оболочек пищеварительного тракта и дыхательных путей. Инфекции, вызванные криптоспоридиями, диагностируются редко. Гиподиагностика криптоспоридиоза связана с несовершенством диагностических технологий.

Известен способ диагностики криптоспоридиоза с помощью микроскопического исследования мазка испражнений (“Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия”, №3, том 2, 2000, с.51-57), включающий его окраску по Граму. Однако, как указывает А.В. Дехнич (см. там же, с.55), они окрашиваются слабо или таким образом, что невозможно отличить их от дрожжеподобных грибов.

Известен способ определения в испражнениях ооцист криптоспоридий с помощью окраски по методу Циля (Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969, с.301).

Однако данный способ позволяет при микроскопировании определять лишь ооцисты криптоспоридий в популяции. Точность варьирует от 2 до 6%, но в среднем не превышает 4%.

За прототип предлагаемого изобретения выбран способ выявления криптоспоридий в парафиновых срезах тканей окраской по Цилю-Нильсену (Цинзерлинг А.В. Обработка и окраска мазков и срезов для выявления микроорганизмов //“Архив патологии”, №5, том 54, 1992, с.36), включающий морфологическое выявление ооцист криптоспоридий в парафиновых срезах.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Срез покрывают фильтровальной бумагой, на бумагу наливают раствор карболового фуксина (1 часть насыщенного раствора основного фуксина на 10 частей 5% водного фенола), затем срез подогревают до появления паров, оставив краску на срезе еще на 20-30 мин, или без подогревания оставляют в красителе на 15-18 ч.

2. Снимают бумагу, споласкивают срез в воде.

3. Дифференцируют в 1% солянокислом спирте до бледно-розового цвета.

4. Промывают в воде.

5. Окрашивают гематоксилином или метиленовым синим по Леффлеру.

6. Споласкивают в воде.

7. Заключают в бальзам.

При этом способе ооцисты криптоспоридий малиновой окраски выявляются на фоне ткани, окрашенной гематоксилином или метиленовым синим. Существенным недостатком способа является то, что идентифицируются только ооцисты, а промежуточные стадии не выявляются, что снижает точность диагностики на 66%.

Целью предлагаемого изобретения является повышение точности способа и расширение диагностических возможностей.

Поставленная цель достигается тем, что в способе диагностики криптоспоридиоза путем гистологического исследования биоптата дополнительно проводят дофиксацию срезов метанолом. Экспозицию при окраске карболовым фуксином осуществляют в течение от 1 до 5 минут, в качестве деклорайзера применяют 5% серную кислоту. Результаты исследования представлены на фиг.1, 2, 3.

На фиг.1 представлена слизистая оболочка толстой кишки больного Е., 9 лет: а - ооциста в наложениях, на поверхностном эпителии с зоной лизиса и адгезия ее к эпителию крипт. Окраска по Цилю-Нильсену × 400 (пример 1).

На фиг.2 представлена слизистая оболочка антрального отдела желудка больного С., 14 лет: б - адгезия спорозоита на поверхностном эпителии, в - меронты I типа на поверхностном эпителии. Окраска основным фуксином по Цилю-Нильсену × 400 (пример 2).

На фиг.3 представлена слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки больной К., 6 лет: г - адгезия ооцисты на эпителии кишечных ворсинок. Окраска основным фуксином по Цилю-Нильсену × 400 (пример 3).

Способ осуществляют следующим образом:

1. Проводят дофиксацию депарафинированных срезов в абсолютном метаноле в течение 5-10 мин.

2. Высушивают.

3. Окрашивают насыщенным раствором основного фуксина в течение 5 мин.

4. Высушивают над пламенем горелки.

5. Инкубируют в 5% растворе серной кислоты в течение 1 мин.

6. Полоскают в 70% спирте до обесцвечивания (5-10 с).

7. Докрашивают водным раствором метиленовой синьки от 10 с до 1 мин.

8. Ополаскивают в воде.

9. Заключают в канадский бальзам.

Обоснованием работоспособности способа является следующее: использование в качестве дофиксатора метанола повышает элективностъ к красителю тонкостенных ооцист, формирующихся ооцист и микрогамет, а использование 5% серной кислоты в качестве деклорайзера способствует связыванию красителя.

Примеры конкретного исполнения даны в виде выписок из историй болезни.

Пример №1.

Больной Синегуб Евгений, 9 лет. Клинический диагноз: гемоколит неясного генеза.

Анамнез: Ребенок от первой беременности, которая протекала на фоне токсикоза. На грудном вскармливании находился до 3 месяцев.

С рождения страдал запорами, а с 5-летнего возраста стул нормализовался до 1-2 раз в день, оформленный. С марта 2000 г. стул неустойчивый, далее стали беспокоить поносы, периодически появлялась кровь в кале. Неоднократно обследовался в стационаре, в кале возбудители кишечных инфекций не выявлены.

Данные инструментальных методов исследования:

Ирригография кишечника - толстая кишка расположена обычно, умеренно удлинена в сигмовидной кишке.

Эзофагогастродуоденоскопия - патология не выявлена.

Колонофиброскопия - эндоскоп введен в подвздошную кишку, слизистая оболочка (СО) ее розовая, бархатистая с единичными фолликулами, илеоцекальный клапан губовидной формы, сомкнут, ориентирован в восходящую кишку. СО толстой кишки со слабовыраженной пятнистостью, отечная, сосудистый рисунок неравномерный, смазан на многих участках. Складки обычных размеров, просвет не деформирован. Выполнена поэтажная биопсия СО подвздошной, ободочной и прямой кишок.

Заключение - колит.

При микроскопировании срезов слизистой оболочки толстой кишки определяется ооциста в наложениях на поверхности эпителия с зоной лизиса и адгезия к эпителию крипт. Окраска по Цилю-Нильсену × 400 (фиг.1).

Лечение: назначена диета с исключением лактозы и жиров, регидратационная терапия полиионными кристаллоидными растворами, сорбенты, вяжущие средства и симптоматические препараты.

Трихопол по 500 мг 3 раза в день в течение 2 недель. После проведенного курса лечения стул нормализовался. Выписан домой в удовлетворительном состоянии.

Пример №2.

Больной Ицков Саша, 14 лет. Находился в клинике с клиническим диагнозом хронический гастродуоденит в стадии обострения.

При проведении эзофагогастродуоденоскопии выявлены признаки терминального эзофагита, хронического гастродуоденита. Взята биопсия. Морфологическое заключение: хронический диффузный антральный гастрит, обострение. Препарат окрашен предлагаемым методом: при микроскопировании срезов слизистой оболочки антрального отдела желудка определяется адгезия спорозоита на поверхности эпителия и меронта I типа на поверхности эпителия. Окраска основным фуксином по Цилю-Нильсену × 400 (фиг.2).

После проведения курсового лечения трихополом выписан практически здоровым.

Пример №3.

Больная Иванова Екатерина - 6 лет. Клинический диагноз: хронический гастродуоденит в стадии обострения.

При проведении эзофагогастродуоденоскопии выявлены признаки хронического гастродуоденита. Взята биопсия. Морфологическое заключение - хронический диффузный антральный гастрит, дуоденит - обострение. При микроскопировании срезов слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки определяется адгезия ооцисты на эпителии кишечных ворсинок. Окраска основным фуксином по Цилю-Нильссну × 400 (фиг.3).

Проведено лечение трихополом в течение 2 недель. Выписана через три недели в удовлетворительном состоянии.

Данным способом обследовано 43 ребенка (клинические диагнозы: диарейный синдром неясной этиологии, гемоколит неясной этиологии, хронический рецидивирующий гастродуоденит) - всего препаратов 71 (таблица).

Поиск этиологических механизмов показал, что у 25 больных причиной диареи является наличие криптоспоридий в слизистой ободочке того или иного отдела пищеварительного тракта. Криптоспоридии выявлены у 50% больных в исследованных срезах слизистой оболочки желудка, 50% - тонкой кишки, 39% - толстой кишки. Точность способа составляет 45%.

Преимущества способа по сравнению с известным:

1. Повышение информативности и точности, так как позволяет получить интегративную оценку криптоспоридийной инвазии слизистой оболочки любого отдела пищеварительного тракта.

2. Способ надежен в исполнении, так как дофиксация в метаноле и дифференцировка в 5% растворе серной кислоты позволяет выявлять криптоспоридии на всех стадиях развития - от меронта до ооцисты.

3. Способ не требует дорогостоящей аппаратуры, использования импортных или дефицитных отечественных реактивов, технически доступен для внедрения в патологоанатомических лабораториях медицинских учреждений.

4. Способ обладает экономической эффективностью, так как сокращается срок проведения анализа, параллельно исследуется структура ткани, что в 2 раза уменьшает расход рабочего времени, красителей, предметных и покровных стекол.

Способ может быть осуществлен непосредственно по данному описанию.

Изобретение относится к области медицины. Способ диагностики криптоспоридиоза включает гистологическое исследование биоптата, дофиксацию срезов метанолом, экспозицию при окраске карболовым фуксином осуществляют в течение 5-10 мин, в качестве деклорайзера применяют 5% серную кислоту. Способ обеспечивает положительный эффект в виде выявления объективных критериев диагностики криптоспоридиоза, обеспечивающих тактику лечения. 1 табл., 3 ил.

Способ диагностики криптоспоридиоза, включающий гистологическое исследование биоптата из слизистой оболочки желудка, 12-перстной, тощей, подвздошной и толстой кишок и фиксацию в 10% нейтральном забуференном формалине, отличающийся тем, что дополнительно проводят дофиксацию срезов метанолом, экспозицию при окраске карболовым фуксином осуществляют в течение 5-10 мин, в качестве деклорайзера применяют 5% серную кислоту.