Способ идентификации и количественного определения 20Е-экдистероидов в пищевом сырье и экстрактах из него Российский патент 2022 года по МПК G01N30/02 G01N30/72 

Область изобретения

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для идентификации и количественного определения экдистероидов в пищевом растительном сырье или экстракте из него по основному экдистероиду 20-гидроксиэкдизону (20Е), данные о котором необходимы для расчета доз при использовании экстракта в качестве биологически активной добавки к пище, сырья для БАД к пище или пищевого ингредиента для обогащения пищевых продуктов.

Предшествующий уровень техники

Наиболее хорошо изученным представителем фитоэкдистероидов является низкотоксичное соединение 20-гидроксиэкдизон. Многочисленные клинические исследования экдистероидов в восстановительной спортивной медицине, при астенических и астенодепрессивных состояниях, при лечении инфекционных заболеваний, неврозов и гипотонии подтвердили их высокую эффективность. Особенно перспективным направлением является использования 20-гидроксиэкдизона в составе БАД к пище и специализированных продуктах для питания спортсменов.

Для детектирования экдистероидов в растительном пищевом сырье и последующей количественной оценке их содержания необходимо использование разнообразных аналитических методик.

Известен способ обнаружения и количественного определения экдистероидов в растительных объектах, раскрытый в патенте RU2082168 [1], опубл. 20.06.1997, включающий проведение тонкослойный высокоэффективной жидкостной или газожидкостной хроматографии семян цветковых растений. Недостатками способа являются: длительность и трудоемкость проведения анализа, большой расход реактивов (особенно в случае тонкослойной хроматографии) и неселективная идентификация полученных результатов УФ-детектированием на длине волны 254 нм, так как множество биологически активных веществ имеют максимум спектра поглощения в данном диапазоне.

Также, достаточно близким к предполагаемому изобретению является способ, описанный в работе «Фитоэкдистероиды надземной части Serratulla Centauroudes, произрастающие в Прибайкалье», Д.Н. Олейников и Н.И. Кащенко // Химия растительного сырья, 2018, №2, с. 37-44 [2]. В результате хроматографического разделения с использованием ВЭЖХ-хроматографии и градиентного элюирования из надземной части S. centauroides, было выделено девять соединений, идентифицированных на основании данных УФ-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Недостатками этого способа являются: длительность проведения хроматографического анализа 45 мин, анализ на ВЭЖХ-МС включает только качественные характеристики, а количественный анализ проводился другим методом: микроколоночной ВЭЖХ-УФ, что так же влияет на время проведения анализа, исследование проводилось только на наличие различных фитоэкдистероидов на различных частях Serratula centauroides L.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ, раскрытый в работе «Методика быстрого анализа 20-гидроксиэкдизона в растениях и папоротниках с применением твердофазной экстракции на полиамиде и микроколоночной ВЭЖХ-УФ», Д.Н. Оленников, Н.И. Кащенко // Химия растительного сырья, 2018, №3, с. 41-52 [3], в которой подробно описан качественный и количественный анализ 20Е методом микроколоночной ВЭЖХ-УФ с применением твердофазной экстракции. Способ включает подготовку проб пищевого растительного сырья: сушку, измельчение сырья, многостадийную ультразвуковую экстракцию с отбором проб. Объединенный экстракт подвергали твердофазной экстракции на полиамидном патроне, элюировали водой, фильтровали через PTFE-фильтр и далее анализировали на ВЭЖХ с УФ-детектированием. Способ имеет следующие недостатки: экстракция не позволяет получить максимальное извлечение 20Е, многостадийное разведение с использованием 3-х мерных колб приведет к неизбежным потерям и большой ошибке анализа, использование дорогостоящего оборудования для очистки пробы (установка для твердофазной экстракции) и дополнительных материалов: патронов для твердофазной экстракции, длительность проведения твердофазной очистки пробы, более высокий предел обнаружения и более низкая достоверность идентификации.

Выбор определяемого вещества обусловлен тем, что из всего многообразия эксидестероидов только 20Е внесен в список разрешенных биологически активных веществ для обогащения пищевых продуктов и как сырье для БАД к пище.

В основу настоящего изобретения поставлена задача достоверной идентификации и количественного определения основного 20-гидроксиэкдизона (20Е) в пищевом сырье и/или пищевом растительном экстракте по четырем основным признакам, которые были обнаружены исходя из структуры 20Е.

Раскрытие изобретения

Технический результат, который достигается применением заявляемого способа, заключается в расширении арсенала технических средств для идентификации и количественного определения 20Е-экдистероидов (20Е) в пищевом растительном сырье и экстрактах из него, а так же в сокращении времени анализа, снижении расхода органических растворителей, требуемых для анализа, с одновременным улучшением точности и воспроизводимости результатов анализа.

В результате способа определены основные признаки абсолютной идентификации 20Е: два перехода масс (481,3 m/z ->445,4 m/z и 481,3 m/z ->371,4 m/z), соотношения между ионами (481,3/445,4 m/z и 481,3/371,4 m/z) при выбранных энергиях соударения (8 еВ и 12 еВ) и время выхода основного 20Е. Это позволяет провести точную идентификацию и количественное определение 20Е и стандартизовать по нему полученный экстракт и/или пищевое растительное сырье.

Заявленный технический результат достигается предлагаемым способом идентификации и количественного определения 20Е-экдистероидов в пищевом растительном сырье и экстрактах из него, включающем трехкратную экстракцию 70% раствором этанола на водяной бане при 80°C в течение 4 часов с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией полученного экстракта с элюированием в градиентном режиме смесью 0,1% раствора муравьиной кислоты в воде и ацетонитрила (элюент Б) в следующем режиме: 0 мин - 5% элюента Б, 5 мин - 27% элюента Б, 5,5 мин - 90% элюента Б, 8,5 мин - 90% элюента Б, 9,5 мин - 5% элюента Б, 13,5 мин - 5% элюента Б, при скорости потока 0,4 мл/мин, а идентификацию и количественное определение экдистероидов проводят на тройном квадрупольном масс-детекторе с электроспрейным источником ионизации с переходом масс в МС/МС.

При этом идентификацию и количественное определение 20Е-экдистероидов проводят с переходом масс в МС/МС режиме: 481,3 m/z ->371,4 m/z с энергией соударения 12 еВ и 481,3 m/z ->445,4 m/z с энергией соударения 8 еВ, соответственно.

Осуществление изобретения

Способ осуществляют следующим образом.

Подготовка проб готовых экстрактов.

К 20 мкл водного или спиртового экстракта добавляли 980 мкл 50% раствора метанола в воде. Перемешивали на вортексе в течение 10 секунд и центрифугировали с относительной силой центрифугирования 18407g в течение 10 минут. При исследовании сухих очищенных экстрактов к 10 мг экстракта добавляли 4 мл 50% раствора метанола в воде и перемешивали на вортексе до растворения, далее подготовку пробы проводили как для жидких экстрактов.

Подготовка проб пищевого растительного сырья.

К навеске предварительно измельченного пищевого растительного сырья массой 1 г добавляли 5 мл 70% этанола, перемешивали и помещали на водяную баню с температурой 80°C на 4 часа, затем охлаждали и центрифугировали в течение 5 минут при 2000g, отбирали 4 мл полученного экстракта. Далее экстракцию повторяли еще два раза на орбитальном встряхивателе в течение 10 минут, отбирая по 5 мл экстракта, что позволяло провести полную экстракцию 20Е из сырья. Полученные экстракты объединяли, перемешивали, центрифугировали при 18407g в течение 10 минут. Затем отбирали 1 мл образца в виалу и проводили анализ методом ВЭЖХ-МС/МС в описанных ниже условиях.

Идентификация и количественное определение на ВЭЖХ-МС/МС.

Для идентификации используют хроматографическую систему Agilent Technologies 1100 с масс-детектором Agilent Technologies 6410; колонку Agilent Technologies Poroshell 120 EC-C18 3,0*50 мм, 2,7 мкм, и следующие реактивы и стандартные вещества: вода сверхчистая (удельное сопротивление 18,6 МОм⋅см), ацетонитрил, метанол (квалификации «для ВЭЖХ»), 20-гидроксиэкдизон (≥93%, Sigma).

Градиентное элюирование проводят смесью 0,1% раствора муравьиной кислоты в воде (элюент А) и ацетонитрила (элюент Б): 0 мин - 5% элюента Б, 5 мин - 27% элюента Б, 5,5 мин - 90% элюента Б, 8,5 мин. - 90% элюента Б, 9,5 мин. - 5% элюента Б, 13,5 мин. - 5% элюента Б. Скорость потока составляла 0,4 мл/мин.

Тройной квадрупольный масс-селективный детектор с электроспрейным источником ионизации со следующими параметрами: давление распыляющего газа: 2,8 бар, температура осушающего газа: 350°C, скорость потока осушающего газа: 10 л/мин, полярность положительная. Напряжение на фрагменторе составляло 98 В. Проводилась регистрация следующих переходов масс в МС/МС режиме: 481,3 m/z ->445,4 m/z с энергией соударения 8 еВ (использовался для количественного анализа), 481,3 m/z ->371,4 m/z с энергией соударения 12 еВ (использовался для качественного подтверждения).

Диапазон линейности для определения методом ВЭЖХ-МС/МС составил 0,01 - 5 мкг/мл. В таблице 1 приведен сравнительный анализ аналогов с данным изобретением.

В описанных выше условиях были исследованы пищевое сырье и экстракт из шпината и киноа. Получены следующие результаты: содержание 20Е в высушенных листьях шпината составило 70 мкг/г, в зернах киноа: 255 мкг/г. На рис. 1 показана хроматограмма экстракта шпината (пик - 20Е). Содержание 20Е в зернах киноа составило 37,2±1,9 мг/г.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для идентификации и количественного определения экдистероидов в пищевом растительном сырье или экстракте из него по основному экдистероиду 20-гидроксиэкдизону (20Е). Способ идентификации и количественного определения 20Е-экдистероидов в пищевом растительном сырье и экстрактах из него включает многократную экстракцию сырья с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией полученного экстракта с элюированием в градиентном режиме, идентификацию и количественное определение с помощью детектора, при этом пищевое сырье трехкратно экстрагируют 70% раствором этанола на водяной бане при 80°C в течение 4 часов, затем проводят хроматографию с элюированием в градиентном режиме смесью 0,1% раствора муравьиной кислоты в воде и ацетонитрила – элюент Б в следующем режиме: 0 мин - 5% элюента Б, 5 мин - 27% элюента Б, 5,5 мин - 90% элюента Б, 8,5 мин - 90% элюента Б, 9,5 мин - 5% элюента Б, 13,5 мин - 5% элюента Б, при скорости потока 0,4 мл/мин, а идентификацию и количественное определение экдистероидов проводят на тройном квадрупольном масс-детекторе с электроспрейным источником ионизации с переходом масс в МС/МС. Техническим результатом является расширение арсенала технических средств для идентификации и количественного определения 20Е-экдистероидов в пищевом растительном сырье и экстрактах из него, сокращение времени анализа, увеличение точности и воспроизводимости результатов анализа. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Способ идентификации и количественного определения 20Е-экдистероидов в пищевом растительном сырье и экстрактах из него, включающий многократную экстракцию сырья с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией полученного экстракта с элюированием в градиентном режиме, идентификацию и количественное определение с помощью детектора, отличающийся тем, что пищевое сырье трехкратно экстрагируют 70% раствором этанола на водяной бане при 80°C в течение 4 часов, затем проводят хроматографию с элюированием в градиентном режиме смесью 0,1% раствора муравьиной кислоты в воде и ацетонитрила – элюент Б в следующем режиме: 0 мин - 5% элюента Б, 5 мин - 27% элюента Б, 5,5 мин - 90% элюента Б, 8,5 мин - 90% элюента Б, 9,5 мин - 5% элюента Б, 13,5 мин - 5% элюента Б, при скорости потока 0,4 мл/мин, а идентификацию и количественное определение экдистероидов проводят на тройном квадрупольном масс-детекторе с электроспрейным источником ионизации с переходом масс в МС/МС.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что идентификацию и количественное определение 20Е-экдистероидов проводят с переходом масс в МС/МС режиме: 481,3 m/z - >371,4 m/z с энергией соударения 12 еВ и 481,3 m/z - >445,4 m/z с энергией соударения 8 еВ, соответственно.