СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ Российский патент 2024 года по МПК G01N30/06 G01N30/32 G01N30/34 G01N30/72 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области фармации, растениеводства, пищевой промышленности, сельского хозяйства и экологии, а именно к фармацевтической химии, фармакогнозии и аналитической химии. Способ может быть использован для качественного и количественного определения фосфорорганических пестицидов (ФОП) в растительном сырье и продукции растительного происхождения.

Уровень техники

Актуальность разработки данного способа определяется тем фактом, что, несмотря на стратегию минимизации использования пестицидов при выращивании растений, риск заражения сырья ФОП остается. Это подтверждается многочисленными скрининговыми и мониторинговыми исследованиями содержания пестицидов в лекарственных растениях (Klier В., Hafher Е., Albert Н., Binder G., Knodler М., Kiihn М., Schenk A., Steinhoff В. Pesticide residues in herbal drugs: Evaluation of a database. Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants. 2019; 15:100223). Содержание некоторых ФОП, нормируемых в фармакопеях разных стран, превышало предельно допустимый уровень содержания в лекарственном растительном сырье. В пищевой промышленности регламентированы пределы допустимого содержания ФОП в растительной продукции, однако факты обнаружения ФОП в концентрациях выше допустимых пределов, встречаются достаточно часто (Chowdhury M.A.Z., Jahan I., Karim N., Alam M.K., Rahman M.A., Moniruzzaman M, Gan S.H., Fakhruddin A.N.M. Determination of Carbamate and Organophosphorus Pesticides in Vegetable Samples and the Efficiency of Gamma-Radiation in Their Removal // BioMed Research International. 2014. Vol.2014).

ФОП относятся к широко используемым пестицидам. Их патогенный механизм действия на человека заключается в накоплении ацетилхолина, приводящем к нарушению передачи нервных импульсов. Кроме того, ряд ФОП отмечен как вероятно канцерогенные для человека (Some organophosphate insecticides and herbicides. Lyon, France: IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans; 2015. 452 p.).

Современные способы определения ФОП в растительном сырье основаны на использовании газовой или высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с различными способами детектирования.

Известен, патент Китая CN110988211, 30.10.2020, в котором описано определение 200 различных пестицидов и загрязнителей окружающей среды в пищевых продуктах, на примере клубники, способом газовой хромато-масс-спектрометрии с использованием системы подготовки проб QuEChERS.

Однако данный способ не учитывает низкую летучесть и термолабильность некоторых ФОП, которые в значительной степени влияют на потери анализируемых веществ в процессе анализа. Разработка способа проводилась только на клубнике, а степень извлечения ФОП из сухого растительного сырья может существенно отличаться.

Существует способ определения ФОП в листьях падуба парагвайского способом газовой хроматографии в сочетании с фотометрическим детектированием (Pareja L., Niell S., Vryzas Z., Gonzalez J., Cesio M.V., Mourkidou E.P., Heinzen H. Comparison and evaluation of two methods for the pesticide residue analysis of organophosphates in yerba mate // Revista Brasileira de Farmacognosia. 2015. Vol.25. P. 98-104).

Такой способ не позволяет с достаточной точностью определять ФОП. Предел количественного обнаружения для ФОП не удовлетворяет пределу допустимого содержания. В данном способе используется трудоемкий процесс подготовки проб в виде системы подготовки проб QuEChERS, использование которой способно привести к ложноотрицательному результату за счет потерь анализируемых веществ в процессе подготовки проб.

Известен способ определения пестицидов в растениях, используемых в китайской медицине, способом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (Hu Y., Wan L., Zhang J., Yang F., Cao J. Rapid determination of pesticide residues in Chinese materia medica using QuEChERS sample preparation followed by gas chromatography-mass spectrometry // Acta Pharmaceutica Sinica B. 2012. Vol. 2(3). P. 286-293).

Однако расчет содержания ФОП в данном способе проводится без использования внутреннего стандарта, только с помощью построения калибровочных кривых. При таком подходе не учитывается влияние матричного эффекта, что может привести к ложноотрицательному или ложноположительному результату при анализе образцов растительного сырья, в отличии от модельных смесей.

Известен способ определения 14 полярных пестицидов в напитках (Lopez S.H., Dias J., Mol H., Kok A. Selective multiresidue determination of highly polar anionic pesticides in plant-based milk, wine and beer using hydrophilic interaction liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry // Journal of Chromatography A. 2020. Vol. 1625. P. 1-8). Он заключается в быстром определении пестицидов с использованием жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Авторы предлагают исключить процедуру очистки при анализе жидких матриц и непосредственно вводить образцы в хроматограф после разбавления и центрифугирования.

Данный способ не позволяет определять ФОП в сухом растительном сырье из-за отсутствия этапа экстракции пестицидов на стадии подготовки проб. Кроме того, из изученных условий определения 14 полярных пестицидов, только 3 относятся к ФОП.

Проблема, которая не решена, заключается в отсутствии объективного валидированного способа качественного и количественного одновременного определения различных ФОП в растительном сырье, обладающего высокой чувствительностью и селективностью. Необходимо оптимизировать все этапы способа определения ФОП, включающие в себя: а) выбор условий подготовки проб; б) оптимизацию условий хроматографического разделения (выбор элюента, сорбента, колонки, градиентного режима), в) выбор условий масс-спектрометрического детектирования (способа и типа ионизации, оптимального режима фрагментации для выбранных ионных реакций). Для разработанного способа определения ФОП проводят оценку метрологических характеристик и валидацию способа на растительном сырье.

Техническим результатом является способ определения ФОП в растительном сырье, обеспечивающий высокую чувствительность и сокращение времени анализа.

Технический результат достигается за счет того, что способ определения ФОП в растительном сырье характеризуется тем, что выделение пестицидов из измельченного и просеянного сквозь сито с диаметром 0,5 мм растительного сырья осуществляют путем экстракции ацетонитрилом с дейтерированными внутренними стандартами, образовавшуюся смесь встряхивают, центифугируют, после чего надосадочную жидкость пропускают через шприцевой фильтр для микрофильтрации РТЕЕ с размером пор 0,2 мкм, затем отфильтрованный экстракт переносят в хроматографическую виалу, которую помещают в автосамплер хроматографа для дальнейшего масс-спектрометрического детектирования, а содержание ФОП определяют способом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием на жидкостном хромато-масс спектрометре с детектором типа орбитрэп, анализируемые вещества разделяют на колонке Agilent Zorbax 300SB-C18, 100 мм × 2.1 мм с диаметром зерна сорбента 3.5 μм с подвижной фазой - 0,1% муравьиной кислотой в воде - элюентом А и ацетонитрилом - элюентом Б - при скорости потока подвижной фазы 0,35 мл/мин и скорости потока газа-небулайзера азота 10 усл.ед. в режиме электрораспылительной ионизации врежиме регистрации положительно заряженных ионов, при этом градиентное элюирование смеси проводят по следующей схеме: исходное соотношение растворов с 0,00 по 2,00 мин - 95% элюент А:5% элюент Б; с 2,01 по 10,00 мин - с 95% элюент А:5% элюент Б до 5% элюент А:95% элюент Б; с 10,01 по 11,00 мин - 5% элюент А:95% элюент Б; с 11,01 по 15,00 мин - 95% элюент А:5% элюент Б, а для определения содержания готовят рабочие растворы ФОП и рассчитывают содержание анализируемых ФОП по формуле:

где S_p - площадь пика определяемого пестицида,

S_is - площадь внутреннего дейтерированного стандарта,

k - значение коэффициента пересчета наклона калибровочного графика к оси абсцисс.

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 приведен калибровочный график одного из определяемых пестицидов, на фиг. 2 - хроматограмма пробы растительного сырья корневищ с корнями валерианы со внесенными 0,4 нг/г ФОП. Кроме того, приведены таблицы: таблица 1 содержит сведения об условиях масс-спектрометрического детектирования выбранных пестицидов и их дейтерированных аналогов, таблица 2 содержит сведения об оптимальных условиях одновременного детектирования с использованием электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительных ионов, таблица 3 содержит условия хроматографического разделения.

Осуществление изобретения

Измельченное растительное сырье просеивают сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм, экстрагируют ацетонитрилом с дейтерированными внутренними стандартами (малатион-d6, дихлофос-d6). Использование дейтерированных внутренних стандартов наиболее подходит для определения ФОП в растительном сырье, так как при анализе потери дейтерированных аналогов ФОП полностью сопоставимы с потерями определяемых ФОП. Смесь перемешивают, затем центрифугируют и надосадочную жидкость пропускают через шприцевой фильтр для микрофильтрации PTFE с размером пор 0,2 мкм. Отфильтрованный экстракт переносят в стеклянную хроматографическую виалу и анализируют способом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием на жидкостном хромато-масс спектрометре с детектором типа орбитрэп.

Таблица 1 содержит сведения об условиях масс-спектрометрического детектирования выбранных пестицидов и их дейтерированных аналогов. Для достижения высокой чувствительности масс-спектрометрического детектирования выбран режим регистрации положительно заряженных ионов, так как ФОП проявляют как кислотные, так и основные свойства. За счет наличия в структуре атомов фосфора и серы молекулы легко протонируются, образуя положительно заряженные ионы в слабокислой среде. Выбор электрораспылительной ионизации (ЭРИ) в режиме регистрации положительно заряженных ионов обусловлен наличием атомов фосфора и азота в составе ФОП.

Таблица 2 содержит сведения об оптимальных условиях одновременного детектирования с использованием электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительных ионов

Для уменьшения размывания пиков выбран градиентный режим хроматографического разделения с увеличением в процессе разделения элюирующей силы подвижной фазы. Данный режим позволяет добиться оптимального разделения компонентов пробы за короткое время.

Таблица 3 содержит условия хроматографического разделения на колонке Agilent Zorbax 300SB-C18, 100 мм × 2.1 мм с диаметром зерна сорбента 3.5 μм. Выбор обращенно-фазового варианта ВЭЖХ обусловлен амфотерными и гидрофильными свойствами ФОП. Использование обращено-фазовых колонок позволяет значительно снизить внутриколоночное размывание пиков за счет снижения мертвого объема системы и повысить эффективность разделения. Подвижная фаза - 0,1% муравьиной кислотой в воде - элюент А и ацетонитрил - элюент Б - при скорости потока подвижной фазы 0,35 мл/мин и скорости потока газа-небулайзера азота 10 усл.ед. в режиме электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительно заряженных ионов, при этом градиентное элюирование смеси проводят по следующей схеме: исходное соотношение растворов с 0,00 по 2,00 мин - 95% элюент А:5% элюент Б; с 2,01 по 10,00 мин - с 95% элюент А:5% элюент Б до 5% элюент А:95% элюент Б; с 10,01 по 11,00 мин - 5% элюент А:95% элюент Б; с 11,01 по 15,00 мин - 95% элюент А:5% элюент Б

Для определения содержания ФОП изготавливаются рабочие растворы. Взвешивают 1 грамм стандартного образца фософорорганического пестицида, добавляют 1 мл ацетонитрила с дейтерированными внутренними стандартами, интенсивно перемешивают.Затем готовят стандартные растворы путем разбавления исходных растворов ацетонитрилом. Схема приготовления модельных образцов приведена в таблице 4. На фиг. 1 приведен калибровочный график отношения площади пика пестицида к площади пика внутреннего дейтерированного стандарта к содержанию ФОП и определяют значение коэффициента пересчета наклона калибровочного графика к оси абсцисс.

Определение содержания для каждого из ФОП осуществляют по формуле:

где S_p - площади пика определяемого пестицида,

S_is - площадь внутреннего дейтерированного стандарта,

k - значение коэффициента пересчета наклона калибровочного графика к оси абсцисс.

Изобретение поясняется примером.

Пример 1. Определение содержания ФОП в корневищах с корнями валерианы лекарственной

В измельченные пробы корневищ с корнями валерианы лекарственной вносили точно известные концентрации ФОП: 0,04 нг/г, 0,4 нг/г, 4 нг/г, 40 нг/г, 400 нг/г, 4000 нг/г (малатион, малаоксон, диазинон, ометоат, диметоат, примифос-метил, пиримифос-этил, хлорпирифос-метил и фозалон). Затем пробы экстрагировали ацетонитрилом с добавлением внутренних стандартов (малатион-d6, дихлофос-d6), перемешивали и центрифугировали. Супернатант пропустили через шприцевой фильтр для микрофильтрации PTFE. Отфильтрованный экстракт перенесли в стеклянную виалу и анализировали способом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием на жидкостном хромато-масс спектрометре с детектором типа орбитрэп в описанных выше условиях. На фиг.2 представлена хроматограмма пробы растительного сырья корневищ с корнями валерианы со внесенными 0,4 нг/г ФОП. Расчет содержания для малатиона, малаоксона, диазинона, ометоата, диметоата, примифос-метила, пиримифос-этила, хлорпирифос-метила и фозалона осуществлен по формуле:

где S_p - площади пика определяемого пестицида,

S_is - площадь внутреннего дейтерированного стандарта,

k - значение коэффициента пересчета наклона калибровочного графика к оси абсцисс.

В таблице 5 приведены полученные результаты оценки точности и воспроизводимости заявляемого способа определения ФОП в растительном сырье

Таким образом, заявляемый способ позволяет одновременно определять 9 ФОП (малатион, малаоксон, диазинон, ометоат, диметоат, примифос-метил, пиримифос-этил, хлорпирифос-метил, фозалон) с удовлетворительным пределом обнаружения.

Изобретение относится к аналитической химии. Раскрыт способ определения фосфорорганических пестицидов в растительном сырье, где выделение пестицидов из измельченного и просеянного растительного сырья осуществляют путем экстракции ацетонитрилом с дейтерированными внутренними стандартами, образовавшуюся смесь встряхивают, центифугируют, после чего надосадочную жидкость пропускают через шприцевой фильтр для микрофильтрации, затем отфильтрованный экстракт помещают в автосамплер хроматографа для масс-спектрометрического детектирования, а содержание фосфорорганических пестицидов определяют способом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием на жидкостном хромато-масс-спектрометре с детектором типа орбитрэп, анализируемые вещества разделяют на колонке с подвижной фазой - 0,1% муравьиной кислотой в воде - элюентом А и ацетонитрилом - элюентом Б - при скорости потока 0,35 мл/мин и газом-небулайзером азотом, при градиентном элюировании, а для определения содержания готовят рабочие растворы фосфорорганических пестицидов, строят калибровочный график, рассчитывают содержание анализируемых фосфорорганических пестицидов. Изобретение обеспечивает высокую чувствительность и сокращение времени анализа. 2 ил., 5 табл., 1 пр.

Способ определения фосфорорганических пестицидов в растительном сырье, характеризующийся тем, что выделение пестицидов из измельченного и просеянного сквозь сито с диаметром 0,5 мм растительного сырья осуществляют путем экстракции ацетонитрилом с дейтерированными внутренними стандартами, образовавшуюся смесь встряхивают, центрифугируют, после чего надосадочную жидкость пропускают через шприцевой фильтр для микрофильтрации РТЕЕ с размером пор 0,2 мкм, затем отфильтрованный экстракт переносят в хроматографическую виалу, которую помещают в автосамплер хроматографа для дальнейшего масс-спектрометрического детектирования, а содержание фосфорорганических пестицидов определяют способом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием на жидкостном хромато-масс-спектрометре с детектором типа орбитрэп, анализируемые вещества разделяют на колонке Agilent Zorbax 300SB-C18, 100 мм × 2,1 мм с диаметром зерна сорбента 3,5 μм с подвижной фазой - 0,1% муравьиной кислотой в воде - элюентом А и ацетонитрилом - элюентом Б - при скорости потока подвижной фазы 0,35 мл/мин и скорости потока газа-небулайзера азота 10 условных единиц в режиме электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительно заряженных ионов, при этом градиентное элюирование смеси проводят по следующей схеме: исходное соотношение растворов с 0,00 по 2,00 мин - 95% элюент А:5% элюент Б; с 2,01 по 10,00 мин - с 95% элюент А:5% элюент Б до 5% элюент А:95% элюент Б; с 10,01 по 11,00 мин - 5% элюент А:95% элюент Б; с 11,01 по 15,00 мин - 95% элюент А:5% элюент Б, а для определения содержания готовят рабочие растворы фосфорорганических пестицидов, строят калибровочный график отношения площади пика пестицида к площади пика внутреннего дейтерированного стандарта к содержанию фосфорорганических пестицидов и определяют значение коэффициента пересчета наклона калибровочного графика к оси абсцисс, рассчитывают содержание анализируемых фосфорорганических пестицидов по формуле:

где S_p - площадь пика определяемого пестицида,

S_is - площадь внутреннего дейтерированного стандарта,

k - значение коэффициента пересчета наклона калибровочного графика к оси абсцисс.