Применение спиртового экстракта надземных частей левзеи сафровидной Rhaponticum carthamoides в качестве средства, ингибирующего активность коронавируса SARS-COV-2 и вируса простого герпеса 2 типа in vitro и способ его получения Российский патент 2024 года по МПК A61K36/28 A61P31/14 A61P31/22 

Изобретение относится к биотехнологии, вирусологии и медицине, в частности к применению надземных частей левзеи сафлоровидной, для подавления репликации коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа.

По данным ВОЗ по состоянию на начало января 2023 г. во всем мире было зарегистрировано более 659 миллионов подтвержденных случаев и более 6,6 миллионов смертей от новой коронавирусной болезни COVID-19 [Сайт ВОЗ. URL: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronaviras-2019/situation-reports (дата обращения 12.01.2023)]. Появление новых вариантов SARS-CoV-2 в результате мутаций в структурных и неструктурных белках, создает неизбежные препятствия в программах вакцинации [Harvey W.T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape // Nat Rev Microbiol. 2021. V. 19. N. 7. P. 409-424]. Лечение от этой новой болезни по «золотому стандарту» до сих пор отсутствует [Chuang S.-T., Buchwald P. Broad-Spectrum Small-Molecule Inhibitors of the SARS-CoV-2 Spike-ACE2 Protein-Protein Interaction from a Chemical Space of Privileged Protein Binders. // Pharmaceuticals (Basel). 2022. V. 15. N. 9. P. 1084]. За последние два года было предпринято несколько попыток перепрофилирования ранее одобренных препаратов в качестве возможных противовирусных средств при COVID-19, однако достигнут лишь очень ограниченный успех [LiuH., et al. Scutellaria baicalensis extract and baicalein inhibit replication of SARS-CoV-2 and its 3C-like protease in vitro CoV-2. // J Enzyme Inhib Med Chem. 2021. V. 36. N. LP. 497-503]. До сих пор нет зарегистрированных препаратов прямого анти-SARS-CoV-2 действия, а по одобренным для лечения, например, по ремдесивиру - ингибитору вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, на сегодняшний день результаты клинических испытаний противоречивы [Garcia-Lledo A., et al. Pharmacological treatment of COVID-19: an opinion paper // Rev Esp Quimioter. 2022. V. 35. N. 2. P. 115-130].

Кроме того, по литературным данным, иммуносупрессивная терапия для контроля синдрома «цитокинового шторма» в тяжелых случаях протекания новой коронавирусной инфекции повышает риск проявления разного рода оппортунистических инфекций. Сообщается, в частности, о выделении в клинических образцах госпитализированных пациентов герпесвирусов разных видов, например, Cytomegalovirus (CMV) и Herpes Simplex Virus (HSV) [Franceschini E., et al. Herpes Simplex Virus Re-Activation in Patients with SARS-CoV-2 Pneumonia: A Prospective, Observational Study // Microorganisms. 2021. V. 9. N9. P. 1896].

Ко-инфекция SARS-CoV-2 другими вирусами может привести к непредсказуемым нарушениям в реакциях иммунной системы, которые до конца не изучены. Описан случай ко-инфекции ВИЧ-1 с вирусом простого герпеса-2 (HSV-2) и SARS-CoV-2 у пациента в критическом состоянии при COVID-19 при ложно отрицательном ПЦР-тесте на коронавирус [Alharthy A., et al. Co-infection of human immunodeficiency virus, herpes simplex virus-2 and SARS-CoV-2 in a patient with false-negative real-time polymerase chain reaction results Singapore // Med J. 2022. Vol.63. N. 6. P. 345-347].

Опасность проявления оппортунистических инфекций обусловлена, в частности, и тем, что в настоящее время около полумиллиарда человек во всем в мире инфицированы вирусом простого герпеса 2 типа (Herpes simplex virus type 2, HSV-2), который передается, в основном, половым путем [Stamos J.D., et al. In Vitro and In Silico Analysis of the Inhibitory Activity of EGCG-Stearate against Herpes Simplex Virus-2 // Microorganisms. 2022 Jul 20. V. 10. N. 7:1462]. Несмотря на длительный период изучения HSV-2, до сих пор не существует вакцины для профилактики этой герпесвирусной инфекции ["Huang Y., et al. Receptors and ligands for herpes simplex viruses: Novel insights for drug targeting Drug // Discov Today. 2022. V. 27. N. 1. P. 185-195], которая повышает риск заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV), влияет на мужскую фертильность (вызывает бесплодие) или может способствовать передаче вызванных вирусом мутаций последующим поколениям [de Albuquerque B.H.D.R., et al. Human seminal virome: a panel based on recent literature // Basic Clin Androl. 2022. Vol.32. N. 1. P. 16]. Герпесвирусный патоген при первичной инфекции устанавливает пожизненную инфекцию в тройничных или пояснично-крестцовых ганглиях, его многочисленные наружные гликопротеины способствуют уклонению от факторов иммунного ответа «хозяина» [TognarelliE.I., et al. Herpes Simplex Virus Evasion of Early Host Antiviral Responses // Front Cell Infect Microbiol. 2019. V. 9. P. 127].

He существует средства для полной элиминации HSV-2 из организма. Известно, что широко используемые противогерпесвирусные препараты (ацикловир и родственные ему синтетические нуклеозидные аналоги) обладают долгосрочной токсичностью и вызывают вирусную резистентность [Garber A., et al. Review of Whole Plant Extracts With Activity Against Herpes Simplex Viruses In Vitro and In Vivo // J. Evid. Based Integr Med. 2021. N. 26. P. 2515690X20978394].

В связи с этим остается актуальным не только поиск препаратов, нацеленных на ингибирование проникновения SARS-CoV-2 в клетку, но и предотвращающих реактивацию латентной инфекции HSV-2 и в тоже время не обладающих долгосрочной токсичностью и не вызывающих вирусной резистентности [Garber A.,et al. Review of Whole Plant Extracts With Activity Against Herpes Simplex Viruses In Vitro and In Vivo // J. Evid. Based Integr. Med. 2021. N. 26. P. 2515690X20978394].

Альтернативными или дополнительными средствами лечения вирусных инфекций могут быть растительные препараты, содержащие биологически активные вещества (БАВ), обладающие широким антивирусным действием как против нескольких патогенов, так и направленные на разные вирусные мишени, играющие важные роли в стадиях «жизненного» цикла вирусов. В отличие от химически синтезированных препаратов, направленных на одну мишень (на структурные белки или ферменты) конкретного вируса, БАВ растений могут одновременно и/или сочетано влиять на все важные стадии «жизненного» цикла разных вирусов - на проникновение в клетку, репликацию, транскрипцию, сборку и выход из инфицированной клетки [Owen L. et al. Antiviral plant-derived natural products to combat RNA viruses: Targets throughout the viral life cycle // Lett Appl Microbiol. 2022. V. 75. N. 3. P. 476-499].

В ряде стран разработаны официальные рекомендации по самостоятельной и вспомогательной терапии COVID-19 на основе лекарственных растений.

В 2020 г. Kanjanasirirat с соавт. продемонстрировали, что этанольный экстракт корневища имбиря (Boesenbergia rotunda, Zingiberaceae) (4-х кратная экстракция 95%-м этиловым спиртом в течение семи суток при комнатной температуре) подавляет инфекционность SARS-CoV-2 in vitro на этапе «входа» вируса в клетку [Kanjanasirirat P. et al. High-content screening of Thai medicinal plants reveals Boesenbergia rotunda extract and its component Panduratin A as anti-SARS-CoV-2 agents. // Sci. Rep.2020. V. 10. N. 1. P. 19963]. Данные о способности указанного средства подавлять репликацию вируса HSV-2 отсутствуют.

Mohamed с соавт. в апреле 2022 г. сообщили о том, что метанольный экстракт травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L., Hypericaceae), способен к прямой инактивации SARS-CoV-2 при инфицировании клеток [Mohamed F.F., et al. Hypericum perforatum and Its Ingredients Hypericin and Pseudohypericin Demonstrate an Antiviral Activity against SARS-CoV-2. // Pharmaceuticals (Basel). 2022. V. 15. N. 5. P. 530]. Данные о способности указанного средства подавлять репликацию вируса HSV-2 отсутствуют.

Nie с соавт. в 2021 г. показали результаты по высокой ингибирующей эффективности сухих этанольных экстрактов in vitro после экстракции при 50°С в течение 200 мин листьев двух видов полыней Artemisia afra и Artemisia, annua, растворенных в ДМСО, в отношении штамма SARS-CoV-2/human/Germany/BavPat 1/2020 и [Nie C.,et al. In vitro efficacy of Artemisia extracts against SARS-CoV-2 // Virol J. 2021. V. 18. N. 1. P. 182]. Данные о способности указанных средств подавлять репликацию вируса HSV-2 отсутствуют.

Казачинская с соавт. в 2022 г. показали результаты по прямой инактивации SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 in vitro сухими этанольными экстрактами шести видов произрастающих в Новосибирской области полыни Artemisia spp.(семейство Астровые, полынь), полученными после экстракция 70%-м этанольным спиртом в течение семи суток отдельных частей сухих растений (листьев, стеблей и цветков). Выявлено, что экстракты листьев Artemisia spp.оказались наиболее эффективными. Экстракты стеблей Artemisia spp.также проявили ингибирующую активность [Казачинская Е.И. и др. Ингибирующая активность сухих этанольных экстрактов Artemisia spp.на репликацию SARS-CoV-2 in vitro. //Юг России: экология, развитие. 2022. Т. 17. №4. С.111-129]. Данные о способности указанных средств подавлять репликацию вируса HSV-2 отсутствуют.

Китайскими учеными обнаружено, что некоторые природные вещества, например, полифенольные соединения катехина (Catechins) листьев черного и зеленого чая проявляют высокое сродство к связыванию с рекомбинантной вирусной протеазой PLpro SARS-CoV-2, что предполагает потенциальную полезность этих соединений в лечении COVID-19 [Mhatre S. et al. Antiviral activity of green tea and black tea polyphenols in prophylaxis and treatment of COVID-19: A review // Phytomedicine. 2021. N. 85. Р. 153286].

Известно, что водный экстракт корня куркумы Curcuma longa обладает противовирусным действием против SARS-CoV-2. Клиническое применение куркумина затруднено из-за его плохой биодоступности. Только 1% куркумина усваивается организмом, и после периода полувыведения примерно 8 часов он распадается на несколько неэффективных продуктов [Bormann М. et al. Turmeric Root and Its Bioactive Ingredient Curcumin Effectively Neutralize SARS-CoV-2 In Vitro // Viruses. 2021. Vol.13. N. 10. P. 1914]. Кроме того, куркума произрастает только в Индии, и производство на ее основе средства против SARS-CoV-2 в России зависит от импортных поставок.

Экспериментально показано, что тритерпеновый гликозид глицирризин, производственным способом выделенный из корня солодки, с высокой аффинностью взаимодействует с рецепторно-связывающим доменом RBD (receptor-binding domain) S белка SARS-CoV-2, т.е. блокирует возможность для «входа» вируса в клетку [Li J., et al. Glycyrrhizic Acid Inhibits SARS-CoV-2 Infection by Blocking Spike Protein-Mediated Cell Attachment // Molecules. 2021. Vol.26. N.20. P. 6090].

Известна ингибирующая активность против SARS-CoV-2 in vitro свежеприготовленного водного экстракта корня солодки вида Glycyrrhiza. glabra L. (лакрица или солодка голая), продемонстированная на моделях имитационного лечения вирусной инфекции при одновременном или последовательном нанесении на монослой клеток линии Vero Е6 экстракта корня солодки и SARS-CoV-2 в прямой и обратной последовательности [Tolah A.M. et al. Computational and In Vitro Experimental Investigations Reveal Anti-Viral Activity of Licorice and Glycyrrhizin against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 // Pharmaceuticals (Basel). 2021. Vol.14. N. 12. P. 1216]. Данное растение представляет интерес для отечественной фармацевтической промышленности ввиду его широкого произрастания на территории России в южных районах европейской части, Западной Сибири и Северного Кавказа. Однако способ получения указанного экстракта в источнике не указан. Кроме того, не изучено влияние указанного экстракта на репликацию вируса простого герпеса 2 типа.

Показано, что метанольный экстракт листьев виноградной лозы (Vitis vinifera, Vitaceae), собранных в Италии, был способен ингибировать репликацию как SARS-CoV-2, так и HSV-1 in vitro на ранних стадиях инфекции путем прямой инактивации вирионов при очень низкой концентрации - 10 мкг/мл [Zannella С, et al. Antiviral Activity of Vitis vinifera Leaf Extract against SARS-CoV-2 and HSV-1 // Viruses. 2021. Vol.13. N.7. P. 1263]. Растительное сырье в России доступно, т.к. виноградная лоза Vitis vinifera культивируется на Кавказе и в Крыму. Однако неизвестно, в какой мере противовирусные свойства культивируемого растения в регионах России совпадают с описанными выше противовирусными свойствами листьев V. vinifera сорта Paulsen 1103, собранных в Италии и насколько они эффективны против вируса простого герпеса 2 типа.

Известно противовирусное действие против SARS-CoV-2 водного экстракта Черноголовки обыкновенной Prunella vulgaris. Показано, что при концентрации 50 до 125 мкг/мл указанный указанный экстракт частично или полностью снижает на клетках Vero развитие цитопатического эффекта, индуцированного при их инфицировании SARS-CoV-2 [Ао Z. et al. Identification and evaluation of the inhibitory effect of Prunella vulgaris extract on SARS-coronavirus 2 virus entry // PLoS One. 2021. Vol.16. N.6. P. е0251649]. Ареал вида включает в себя Россию, Белоруссию, охватывает Малую Азию, Иран, Индию, Китай, Монголию, Японию, Северную Америку, Северную Африку, Австралию. P. vulgaris произрастает в административных районах Сибири: Тюменская, Курганская, Омская, Томская, Новосибирская, Кемеровская, Иркутская области, Алтайский и Красноярский край, Республика Алтай, Тува, Бурятия, Якутия. Является лекарственным растением. Недостатком его применения в промышленных масштабах является то, что по статусу это редкое или охраняемое растение. Вид внесен в Красную книгу Республики Саха (Якутия).

Известно средство для лечения инфекций, вызванных вирусом SARS-CoV-2, включающее состав на основе 96,4% этилового спирта, содержащий сухие экстракты полыни (Artemisia vulgaris), дурнишника (Xanthium strumarium), маралиевого корня (левзея, Rhaponticum carthamoides), скорлупы грецкого ореха (Juglans regia), хрена (Armoracia rusticana), любистока (Levisticum officinale), женьшеня (Panax ginseng), таксифолина и порошка астаксантина, в соотношении 1:4-1:5, и воду очищенную до получения 32-35% спиртового раствора [патент MD1541Y, Method for treating infections with SARS-CoV-2 virus of medium form]. Недостатком является отсутствие эффективности против вируса простого герпеса 2 типа HSV-2.

Известно, что водный экстракт ферментированных листьев камелии китайской {Camellia sinensis L., Theaceae} обладает противовирусным действием против SARS-CoV-2, показанным на основе предварительного смешивания экстракта с препаратом инфекционного SARS-CoV-2 (штамм JPN/TY/WK-521), выдерживания смеси при комнатной температуре в течение разного времени с последующим нанесением смеси на культуру клеток линии Vero Е6. Показано значительное снижение вирусного титра SARS-CoV-2 в культуре клеток в сравнении с контролем [Ishimoto К. et al. Tea crude extracts effectively inactivate severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 // Lett Appl Microbiol. 2022. Vol.74. N.l. P. 2-7]. Для получения растительного сырья единственным регионом России, где возможно выращивание камелии китайской в промышленных масштабах, являются влажные субтропики Черноморского побережья России. Это самый северный регион распространения этой культуры, и выращивание его лимитируется климатическими условиями в большей степени, чем в основных чаепроизводящих странах (Китае, Индии, Шри-Ланка и др.), что объясняет низкую урожайность данной культуры [Лошкарева С.В. Биологические и хозяйственные свойства гибридов F1 от свободного опыления чая (Camellia sinensis (L.) Kuntze) во влажных субтропиках России // Автореф дис на соиск уч степ канд сельхоз наук, по спец 06.01.05. ФГБНУ Всероссийский НИИ цветоводства и тропических культур. Сочи. 2019. 24 с.].

Известны средства растительного происхождения, блокирующие in vitro инфекцию, вызываемую HSV-2, путем прямой инактивации вирионов, т.е. нацеленных на структурные гликопротеины этого вируса. Например, эффективное прямое влияние на инактивацию вирионов HSV-2 и блокирование «входа» в чувствительную клетку, описано в следующих работах.

По мнению Cheng с соавт., метанольный экстракт листьев ботанического вида кустарникового молочая педилантуса (Pterocarya stenoptera^ Juglandaceae) оказывает, мощную ингибирующую активность против HSV-2 Индивидуальное химическое соединение лютеолин (Luteolin), выделенное методом хроматографии, также проявило высокую активность с показаниями EC₅₀=22,0 - 27,0 мкг/мл и ЕС₁₀₀=40,0 - 49,0 мкг/мл [Cheng H.-Y. et al. Mechanism of action of the suppression of herpes simplex virus type 2 replication by pterocarnin A. // Microbes Infect. 2004. N. 6. P. 738-744]. Данные о способности указанного средства подавлять репликацию SARS-CoV-2 отсутствуют.

Reichling с соавт.показали, что водный экстракт корня и коры стебля сумаха душистого (Rhus aromatica, Anacardiaceae) при прямой инактивации HSV-2 активней со значениями SI₅₀=628 [Reichling J. et al. Antiviral activity of Rhus aromatica (fragrant sumac) extract against two types of herpes simplex viruses in cell culture // Die Pharm. Int. J. Pharm. Sci. 2009. N. 64. P. 538-541]. Данные о способности указанного средства подавлять репликацию SARS-CoV-2 отсутствуют.

Benzekri с соавт.показали, что метанольный экстракт семян гармалы обыкновенной (Peganum harmala L., Nitrariaceae), произрастающей в Тунисе, на культуре клеток проявил активность против HSV-2 как во время «проникновения» вируса в чувствительные клетки, так и при «выходе» новообразованных вирионов. Тогда как эффекта защиты клеток по «профилактической» схеме эксперимента не наблюдалось. [Benzekri R., et al. Anti HSV-2 activity of Peganum harmala (L.) and isolation of the active compound // Microb Pathog. 2018. N. 114. P. 291-298]. Данные о способности указанного средства подавлять репликацию SARS-CoV-2 отсутствуют.

Эти же авторы показали, что метанольный экстракт смолы фисташкового дерева (Pistacia lentiscus L., Anacardiaceae), растворенный в ДМСО, был активней in vitro в отношении HSV-2 [Benzekri R. et al. Combination effect of three anti-HSV-2 active plant extracts exhibiting different modes of action // Adv. Tradit. Med. 2020. N. 20. P. 223-231]. По результатам молекулярного моделирования (in silico) показано, что метанольный экстракт коры P. lentiscus из-за наличия флавоноидных гликозидов может быть полезным источником новых ингибиторов 3CL-протеазы SARS-CoV-2 [Selim S., et al. Insights into the Antimicrobial, Antioxidant, Anti-SARS-CoV-2 and Cytotoxic Activities of Pistacia lentiscus Bark and Phytochemical Profile; In Silico and In Vitro Study // Antioxidants (Basel). 2022. Vol.11. N.5. Р.930].

Метанольный экстракт свежей коры акации нильской (Vachellia nilotica L., Fabaceae), оказался эффективным непосредственно при прямой инактивации вирусных частиц против HSV-2 in vitro [Donalisio Met al.The traditional use of Vachellia nilotica for sexually transmitted diseases is substantiated by the antiviral activity of its bark extract against sexually transmitted viruses // J. Ethnopharmacol. 2018. N. 213. P. 403-408]. Данные о способности указанного средства подавлять репликацию SARS-CoV-2 отсутствуют.

Известно, что этанольный экстракт корня и стеблей хвоща гиганского (Equisetum giganteum L., Equisetaceae) эффективен на культуре клеток in vitro против HSV-2, 100%-ное ингибирование вирусной репликации наблюдалось при концентрации 100 мкг/мл на стадии прикрепления вируса и его «входа» в клетки. В экспериментах in vivo на мышиной модели генитальной инфекции показано, что у животных линии C57bl/6 при одновременном введении им вируса и экстракта, не было клинических проявлений заболевания и репликации HSV-2 в половых путях и спинном мозге [Churqui М.Р. et al. Extracts of Equisetum giganteum L and Copaifera reticulate Ducke show strong antiviral activity against the sexually transmitted pathogen herpes simplex virus type 2. // J. Ethnopharmacol. 2018. N. 210. P. 192-197]. Данные о способности указанного средства подавлять репликацию SARS-CoV-2 отсутствуют.

Коммерческие препараты очищенного полифенол - галлат эпигаллокатехина (epigallocatechin gallate, EGCG) и его стабильного аналога EGCG-стеарат (EGCG-S), выделенные из листьев чая камелии (Camellia sinensis, Theaceae), в концентрации 75 μМ in vitro проявили ингибирование более чем на 99,9% за счет блокирования прикрепления вирионов HSV-2 к клеткам-хозяевам. Результаты анализа in silico демонстрируют, что EGCG-S имеет высокую аффинность связывания с гликопротеином D и таким образом, может блокировать слияние HSV-2 и клеточной мембраны, предотвращая проникновение вируса в клетку [Stamos J.D., et al. In Vitro and In Silico Analysis of the Inhibitory Activity of EGCG-Stearate against Herpes Simplex Virus-2 // Microorganisms. 2022. V. 10. N. 7. P. 1462]. По результатам молекулярного моделирования (in silico) показано, что EGCG и другие полифенольные соединения с высокой аффинностью взаимодействует с аминокислотными остатками S белка SARS-CoV-2. По мнению авторов, галлат эпигаллокатехина и кверцетин можно считать мощными терапевтическими соединениями [Alavi М., et al. Interaction of Epigallocatechin Gallate and Quercetin with Spike Glycoprotein (S-Glycoprotein) of SARS-CoV-2: In Silico Study. // Biomedicines. 2022. Vol.10. N. 12. P. 3074. Boi: 10.3390/biomedicinesl0123074].

В литературе есть данные, что этанольный экстракт (3-х кратная экстракция 95%-ным этанолом в течение 24 ч) листьев полыни Artemisia argyi, произрастающей в Китае, в дозе 10 мкг/мл разрушает целостность мембраны вирусных частиц HSV-1 и HSV-2, что приводит к нарушению прикрепления и проникновения вирусов в клетки [Liu P., et al. Ethanol extract from Artemisia argyi leaves inhibits HSV-1 infection by destroying the viral envelope // Virol J. 2023. Vol.20. N. LP. 8.]. Данные о способности указанного средства подавлять репликацию SARS-CoV-2 отсутствуют.

Известно, что водный экстракт листьев кипрея узколистного Epilobium angustifolium ингибирует репликацию коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа HSV-2. Способ получения водного экстракта указанного растения, обладающего противовирусной активностью в отношении коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа HSV-2 in vitro, включает завяливание листьев, их гранулирование, ферментацию гранул, которую останавливают путем помещения гранул в конвекционную сушилку на 20 мин при 110°С, затем при 80°С проводят окончательное высушивание гранул до остаточной влажности 4%. Для приготовления экстракта гранулы заливают дистиллированной водой, доведенной до кипения, в соотношении 1:10 массы сухого сырья/объем воды, выдерживают 15 мин при комнатной температуре в режиме покачивания, затем - в течение 2 часов при 37°С в покое, после чего экстракт фильтруют [патент на изобретение РФ №2788172, опубл 17.01.2023. Бюл. №2]. Кипрей узколистный произрастает по всему Северному полушарию, на территории России преимущественно в нечерноземной полосе. Огромные площади занимает на Урале, Алтае, юге Западной Сибири, что делает данный вид растительного сырья перспективным для применения в отечественной фармацевтической промышленности.

Учитывая исчерпаемость на территории России ресурсов для сбора вышеуказанных лекарственных растений, обладающих способностью подавлять одновременно репликацию коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа HSV-2, необходимо продолжать поиск новых лекарственных растений, обладающих этой активностью для расширения арсенала противовирусных средств.

Одним из перспективных лекарственных растений является левзея сафлоровидная Rhaponticum carthamoides (Leuzea carthamoides, сем. Asteraceae, маралий корень). Это многолетнее эндемичное растение произрастает на альпийских и субальпийских лугах и в тундре Западной и Восточной Сибири, на Алтае и в горах Саян, в Монголии и Казахстане, культивируется в Восточной и Центральной Европе [Shikov A.N., Narkevich I.A., Flisyuk E.V., Luzhanin V.G., Pozharitskaya O.N. Medicinal plants from the 14th edition of the Russian Pharmacopoeia, recent updates // J Ethnopharmacol. 2021. 268:113685], культивируется в Белоруссии. Классифицируется как редкий, находящийся под угрозой исчезновения вид из-за массового сбора его корней в естественной среде обитания [Skala Е., et al. Effect of Sucrose Concentration on Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin Transformed Root Biomass, Caffeoylquinic Acid Derivative, and Flavonoid Production. Int J Mol Sci. 2022.23(22): 13848]. Растительным сырьем R. carthamoides являются как корни и корневище, включенные в официальные фармакопеи некоторых восточноевропейских стран и РФ как общеукрепляющее и адаптогенное средство [Shikov A.N. et al. Medicinal plants from the 14th edition of the Russian Pharmacopoeia, recent updates. J. Ethnopharmacol. 2021. Vol.268. P. 113685], так и надземные части растения. Поскольку заготовка корней влияет на возобновление популяций новых растений, согласно санитарно-эпидемиологическим правилам и нормативам РФ [Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 5 марта 2008 г. N17 "Об утверждении СанПиН 2.3.2.2351-08"СанПиН 2.3.2.2351-08], с 1 мая 2008 г. разрешено использовать все частив, carthamoides (корни, корневища, стебли, листья и соцветия), их экстракты и продукты переработки в составе фармпрепаратов, одно- и многокомпонентных биологически активных добавок к пище. Экстракт корня R. carthamoides входит в состав многочисленных пищевых добавок. Его потребление связано не только с адаптогенной активностью, но и с антимикробной, антиоксидантной, нейропротекторной, противодиабетической и анаболической активностью [Todorova V., Ivanov К., Ivanova S. Comparison between the Biological Active Compounds in Plants with Adaptogenic Properties // Plants (Basel). 2021 Dec 26;11(1):64. doi: 10.3390/plantsl 1010064].

Из действующих веществ в лекарственном сырье содержание мажорного, основного на 95-98% по массовой доле, экдистероида 20-гидроксиэкдизона (20Е) должно быть не менее 0,1% в расчете на сухое вещество [Тимофеев Н.П. Накопление и изменчивость содержания эксдистероидов в лекарственном сырье левзеи сафлоровидной. // Сельскохозяйственная биология, 2009, №1, с. 106-117]. Препарат 20Е в виде фармацевтического средства BIO101, полученного из других растений, произрастающих за пределами России, изучается в 30-ти клинических центрах в Бельгии, Франции, Великобритании, США и Бразилии в качестве нового варианта лечения пациентов на тяжелой стадии пневмонии, вызванной инфекцией COVID-19. Предполагается улучшение дыхательной функции в результате активации этим препаратом ренин-ангиотензиновой системы, функции которой нарушаются при заражении SARS-CoV-2 [Dioh W., Chabane M., Tourette С, Azbekyan A., Morelot-Panzini C, Hajjar L.A., bins M., Nair G.B., Whitehouse Т., Mariani J., Latil M., Camelo S., Lafont R., Dilda P.J., Veillet S., Agus S. Testing the efficacy and safety of BIO101, for the prevention of respiratory deterioration, in patients with COVID-19 pneumonia (COVA study): a structured summary of a study protocol for a randomised controlled trial. // Trials. 2021. V. 22. N. 1. P. 42. DOI: 10.1186/s 13063-020-04998-5]. Однако прямое влияние 20E на репликацию SARS-CoV-2 не изучено. Тем не менее, есть данные, что в листьях левзеи, может накапливаться до 40% эксдистероидов по сравнению с 13% в подземных органах [Тимофеев Н.П. Накопление и изменчивость содержания эксдистероидов в лекарственном сырье левзеи сафлоровидной // Сельскохозяйственная биология, 2009, №1, с. 106-117]. Показана возможность достаточно полного выхода экдистероидов из листьев левзеи, культивируемой в Белоруссии, собранных в конце вегетационного периода, однако процесс получения экдистероидов является многоэтапным и дорогостоящим [Карусевич А. А., Бузук Т.Н. Выделение и очистка экдистероидов из листьев левзеи сафлоровидной // Фармация. 2005. С. 87-91].

Исследований по антивирусной активности против SARS-Co V-2 и вируса простого герпеса 2 типа HSV-2 как экдистероидов из листьев левзеи, так и экстрактов левзеи не обнаружено.

Известен наиболее близкий аналог по способу получения спиртового экстракта левзеи сафлоровидной в качестве кормовой добавки для кормления сельскохозяйственных животных и птицы, включающий измельчение корня растения, смачивание в 9 или 20% водоэтанольном растворе в течение 9 или 10 час, последовательное проведение сначала двухстадийной экстракции под вакуумом в 30% или 50% растворе этилового спирта при 25°С под вакуумом, а затем экстракцию дистиллированной водой, объединение и концентрирование под вакуумом полученных экстрактов, высушивание густого экстракта [патент на изобретение РФ №2739625 «Способ получения сухого экстракта левзеи сафроловидной для сельскохозяйственных животных и птицы (варианты)», дата публ. 28.12.2020 Бюл. №1]. Однако применение указанного спиртового экстракта в качестве средства, ингибирующего активность коронавируса SARS-COV-2 и вируса простого герпеса 2 типа in vitro и способ его получения не изучено.

Технической проблемой является расширение арсенала лекарственных растений, обладающих способностью подавлять репликацию одновременно коронавируса SARS-Co V-2 и вируса простого герпеса 2 типа HSV-2, произрастающих на территории России или сопредельных дружественных стран или промышленно выращиваемых в России и разрешенных к применению в составе фармпрепаратов в Российской Федерации.

Техническим результатом является применение спиртового экстракта надземных частей левзеи сафровидной Rhaponticum carthamoides в качестве средства, подавляющего репликацию одновременно коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа HSV-2 in vitro, и способ его получение, обеспечивающий подавление репликации коронавируса SARS-COV-2 и вируса простого герпеса 2 типа in vitro. При этом выход основного биологически активного соединения 20-гидроксиэкдизона от массы сухого спиртового экстракта составляет 1,32 и 1,30% из листьев и стеблей, соответственно.

Указанный технический результат достигается тем, что высушенные измельченные надземные части левзеи сафровидной Rhaponticum carthamoides, собранные в период цветения, подвергают экстракции 70% этиловым спиртом в соотношении 1/10 сухого сырья/экстрагирующего агента по весу в течение семи суток при комнатной температуре при покачивании со скоростью 100 об/мин, полученный экстракт высушивают в асептических условиях при 30±2°С, растворяют в диметилсульфоксиде из расчета 200 мг/мл при покачивании со скоростью 100 об/мин при комнатной температуре в течение суток.

Раскрытие сущности изобретения

Заявлено применение спиртового экстракта надземных частей левзеи сафровидной Rhaponticum carthamoides в качестве средства, ингибирующего активность коронавируса SARS-COV-2 и вируса простого герпеса 2 типа in vitro и способ его получения.

Способ получения спиртового экстракта левзеи сафровидной Rhaponticum carthamoides включает сбор надземных частей растения в период цветения, измельчение и высушивание, экстракции очищенным 70% этиловым спиртом в соотношении сухого сырья/экстрагирующего агента по весу 1/10 в течение 7 суток при комнатной температуре при покачивании со скоростью 100 об/мин в течение 7 суток, полученный экстракт высушивают в асептических условиях при 30±2°С, затем растворяют в диметилсульфоксиде из расчета 200 мг/мл при покачивании со скоростью 100 об/мин при комнатной температуре в течение суток.

Указанный способ обеспечивает выход 1,32 и 1,30% из листьев и стеблей, соответственно, основного биологически активного соединения 20-гидроксиэкдизона от массы сухих экстрактов, а полученный спиртовый экстракт листьев или стеблей левзеи -подавление репликации одновременно коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа in vitro.

Характеристика левзеи сафловидной Rhaponticum carthamoides

Левзея сафлоровидная интродуцирована для культурного выращивания в республике Беларусь [Карусевич А.А. и др. Разработка методики культивирования и изучение особенностей развития левзеи сафлоровидной в Витебской области // Вестник фармации. 2016. №4 (74). С.38-44] и в Архангельской области РФ [Тимофеев Н.П. Продуктивность надземной фитомассы и содержание экдистерона в агропопуляции левзеи сафлоровидной за 27 лет онтогенеза // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования, 2017. № S13. С.167-170]. Разработаны технологии возделывания левзеи сафлоровидной с высоким содержанием экдистерона в листьях - в 7-10 раз выше, чем в корнях. Созданы промышленные плантации левзеи, где обеспечивается биосинтез и концентрирование высокоактивных экдистеронов в отдельных элементах фитомассы, их сохранность во время переработки сырья и длительные сроки хранения. В РФ научно-производственное предприятие "Крестьянское хозяйство БИО" (Архангельская область, г. Коряжма; http://leuzea.ru) производит и реализует сырье листьев левзеи с подтверждением содержания экдистероидов 0,281% и сертификатом соответствия качества для использования в качестве эффективного природного адаптогена для заваривания и применения в виде чайного напитка [https://www.speleo-s.ru/leuzea.html (дата обращения 08.02.2023]. Левзея сафлоровидная Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin (синонимы: Leuzea carthamoides DC, рапонтикум, большеголовник альпийский, маралий корень) и препараты на ее основе официально внесены в Государственную фармакопею СССР IX-XI изданий, Государственную фармакопею Российской Федерации (приказ Министерства здравоохранения №182 от 24.04.2003), а также в Государственный реестр лекарственных средств и Регистр лекарственных средств России. Содержит 65 экдистероидов (0.44%), 18 витаминов, 47 микроэлементов, 27% протеина. Применяется в сухом виде под язык, или совместно с черным чаем, а также в виде водно-спиртовых экстрактов, настоев и отваров [https://leuzea.ru/direct/leuzea_pharmacopeia-59.htm].

Перечень графических материалов

Фигура 1. Внешний вид левзеи сафлоровидной Rhaponticum carthamoides (Maral root, Leuzea carthamoides): сверху - растение, произрастающее в природе Республики Алтай на Семинском перевале (51°2'43''с.ш. 85°36'13''в.д.); снизу - сушка левзеи сафлоровидной при температуре 20-22°С в проветриваемом помещении, защищенном от солнечных лучей. Фото Казачинской Е.И.

Фигура 2. Хроматограмма результатов ВЭЖХ спиртового экстракта листьев левзеи сафлоровидной. Примечание: длины волн (в нм) указаны на хроматограммах в левом верхнем углу: 254 нм для обнаружения экдистероидов, 272 нм - для всех фенольных соединений, включая флавоноиды.

Фигура 3. Хроматограмма результатов ВЭЖХ спиртового экстракта стеблей левзеи сафлоровидной. Примечание: длины волн (в нм) указаны на хроматограммах в левом верхнем углу: 254 нм для обнаружения экдистероидов, 272 нм - для всех фенольных соединений, включая флавоноиды.

Фигура 4. Индексы селективности для исследованных заявленных спиртовых экстрактов надземных частей (листьев, стеблей, а также для сравнения экстракта цветков) левзеи и контрольных образцов, растворенных в ДМСО.

Примечание: номера по вертикальной линии соответствуют нумерации экстрактов в табл.3, 4 и 5; по горизонтальной линии отмечены показатели индексов селективности.

Осуществление изобретения

Применение спиртового экстракта надземных частей левзеи сафровидной Rhaponticum carthamoides в качестве средства, ингибирующего активность коронавируса SARS-COV-2 и вируса простого герпеса 2 типа in vitro осуществляют на основе его получения по заявленному способу.

Способ получения спиртового экстракта левзеи сафровидной Rhaponticum carthamoides включает сбор надземных частей растения в период цветения, сушку в проветриваемом, затемненном помещении при комнатной температуре 20 - 22°С до полного высыхания, измельчение, проведение экстракции очищенным 70% этиловым спиртом в соотношении сухого сырья/объем экстрагирующего агента по весу 1/10 в течение 7 суток при комнатной температуре при постоянном покачивании, например, на механической качалке, со скоростью движения 100 об./мин, фильтрование жидкости, например, через капроновую ткань, высушивание спиртового экстракта в асептических условиях при 30±2°С в открытых емкостях из нейтрального материала, например, в открытых чашках Петри. Затем сухой спиртовый экстракт растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) из расчета 200 мг/мл при покачивании со скоростью 100 об/мин при комнатной температуре в течение суток (24 часа).

До приготовления раствора в ДМСО сухой спиртовый экстракт хранят при комнатной температуре. Указанный способ обеспечивает выход 1,32 и 1,30% из листьев и стеблей, соответственно, основного биологически активного соединения 20-гидроксиэкдизона от массы сухих экстрактов, а полученный спиртовый экстракт листьев или стеблей левзеи - подавление репликации одновременно коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа in vitro.

Осуществление способа получения спиртового экстракта надземных частей левзеи сафлоровидной (Rhaponticum carthamoides) проводили одновременно со сравнительным анализом противовирусной активности против SARS-CoV-2 и HSV-2 сухих этанольных экстрактов отдельных частей сухого растения (листьев, стеблей и цветков) левзеи сафлоровидной, полученных по заявленному способу, с контрольными образцами плодового тела чаги (Inonotus obliquus Ach. Ex Pers. Pil., Basidiomycota), специи гвоздики (Syzygium aromaticum L., Myrtaceae) и черного чая (Camellia sinensis L. Kuntze, Theaceae), антивирусные свойства которых представлены ниже в описании контрольных образцов растений.

Левзея сафлоровидная была собрана в районах произрастания в Республике Алтай, на Семинском перевале (51°2'43''с.ш. 85°36'13''в.д.). Надземные части растения сушили при температуре 20-22°С в проветриваемом помещении, защищенном от солнечных лучей (Фиг. 1). После сушки сырье тщательно разделяли на отдельные части (стебли, цветы, листья) и сохраняли при комнатной температуре. Сухое сырье (отдельно стебли, листья, цветы) в измельченном виде в соотношении 1/10 по весу (1 г/10 г) заливали очищенным 70% этиловым спиртом и выдерживали 7 суток при покачании на механической качалке при комнатной температуре при 100 об./мин. Спиртовые экстракты отдельных надземных частей растения фильтровали через капроновую ткань и высушивали в асептических условиях при 30±2°С в открытых чашках Петри. Сухие осадки этанольных экстрактов хранили при комнатной температуре до использования.

Фитохимический профиль сухих экстрактов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Ингибирующую активность сухих экстрактов, растворенных в ДМСО, проводили методом прямой инактивации (нейтрализации) 10³ ТЦПД₅₀/мл SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 и 10³ БОЕ/мл HSV-2 (штамм MS).

Контрольные образцы спиртовых экстрактов растений против SARS-CoV-2. Этанольный экстракт черного чая (Camellia sinensis L. Kuntze, Theaceae) из Индии и этанольный экстракт зеленого чая из Китая, т.к. описана активность против SARS-Co V-2 как водных вытяжек из листьев этого растения (черного и зеленого чая) [Казачинская Е.И. и др. Ингибирующая активность чайных композиций и их составляющих ингредиентов на репликацию SARS-COV-2 in vitro. II Юг России: экология, развитие, 2022. Т. 17. N. 2. С.76-90. DOI: 10.18470/1992-1098-2022-2-76-90]; [Ishimoto К. et al. Tea crude extracts effectively inactivate severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 // Lett Appl Microbiol. 2022. V. 74. N 1. P. 2-7], так и этанольного экстракта черного чая [Казачинская Е.И. др. Ингибирующая активность сухих этанольных экстрактов Artemisia spp.на репликацию SARS-Co V-2 in vitro. //Юг России: экология, развитие. 2022. Т. 17. N 4. С.111-129].

Этанольный экстракт плодового тела чаги (Inonotus obliquus Ach. Ex Pers. Pil., Basidiomycota), т.к. описана активность против SARS-CoV-2 водной вытяжки [Казачинская Е.И. и др. Ингибирующая активность чайных композиций и их составляющих ингредиентов на репликацию SARS-COV-2 in vitro. II Юг России: экология, развитие, 2022. Т. 17. N. 2. С.76-90. DOI: 10.18470/1992-1098-2022-2-76-90]; сухого водного экстракта [Теплякова Т.В. и др. Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе водного экстракта гриба Inonotus obliquus. II Пат. РФ №2741714 С1; опубл. 28.01.2021 в Бюл. №4] и этанольного экстракта [Казачинская Е.И. и др. Ингибирующая активность сухих этанольных экстрактов Artemisia spp. на репликацию SARS-Co V-2 in vitro. //Юг России: экология, развитие. 2022. Т. 17. N 4. С.111-129].

Этанольный экстракт специи гвоздики (Syzygium aromaticum L., Myrtaceae), т.к. описана активность против SARS-CoV-2 как водной вытяжки [Казачинская Е.И. и др. Ингибирующая активность чайных композиций и их составляющих ингредиентов на репликацию SARS-COV-2 in vitro. II Юг России: экология, развитие. 2022. Т. 17. N. 2. С.76-90] и этанольного экстракта [Казачинская Е.И. и др. Ингибирующая активность сухих этанольных экстрактов Artemisia spp.на репликацию SARS-CoV-2 in vitro. // Юг России: экология, развитие. 2022. Т. 17. N 4. С.111-129].

Контрольные образцы этанольных экстрактов против HSV-2

Этанольный экстракт черного чая (Camellia sinensis L. Kuntze, Theaceae) из Индии, этанольный экстракт зеленого чая из Китая, этанольный экстракт плодового тела чаги (Inonotus obliquus Ach. Ex Pers. Pil., Basidiomycota) и этанольный экстракт специи гвоздики (Syzygium aromaticum L., Myrtaceae), т.к. описана активность против HSV-2 водных вытяжек этого растительного сырья [Казачинская Е.И. и др. Ингибирующая активность водных экстрактов чайных композиций, индивидуальных ингредиентов для их составления и некоторых растений на репликацию вируса простого герпеса 2 типа in vitro. II Юг России: экология, развитие. 2022. Т. 17. N3. С.135-152].

Сырье (чага с Салаирского кряжа Маслянинского района НСО, специя гвоздика из Вьетнама, черный чай из Индии, зеленый чай из Китая), предоставлено ООО НПФ «Золотая долина», г. Новосибирск.

Отрицательные контроля: поддерживающая питательная среда для клеток Vero и ДМСО в объемах, соответствующих содержанию этого растворителя в исследуемых растительных препаратах.

Подготовка растительных препаратов для исследования цитотоксичности и ингибирующей активности на вирусную репликацию: растворение сухих экстрактов проводили в диметилсульфоксиде (ДМСО) из расчета 200 мг/мл на механической качалке при комнатной температуре и 100 об./мин. в течение суток.

Вирусы

Коронавирус SARS-CoV-2. Вирусный изолят SARS-Co V-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 был выделен в 2020 г. на культуре клеток Vero из образца мазка носоглотки больного человека, позитивного на наличие вирусной РНК при анализе в лаборатории по диагностике COVID-19 при ФИЦ ФТМ [Чепурнов А.А. и др. Антигенные свойства изолята коронавируса SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020, выделенного от пациента в Новосибирске // Журнал инфектологии. 2020;12(3):42-50]. Лабораторный штамм нарабатывали на культуре клеток Vero в культуральных флаконах объемом 175 см² (Corning, США) питательной среды (с 2% прогретой сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС). Титр инфекционного SARS-Co V-2 в супернатанте от «слепого пассажа» выражали в ТЦПД50/МЛ (тканевых цитопатических дозах вируса, вызывающего 50% цитопатическое действие на инфицированные клетки, выращенные до монослоя в лунках 96-луночных стерильных культуральных планшетах (Corning, США), как показано [Казачинская Е.И. и др. Ингибирующая активность чайных композиций и их составляющих ингредиентов на репликацию SARS-COV-2 in vitro. II Юг России: экология, развитие. 2022. Т. 17. N. 2. С.76-90]. Также проводили фиксацию инфицированных клеток, заранее выращенных в 96-луночных стерильных культуральных планшетах, в течение 30 мин раствором формальдегидом и 0,05%-ным раствором кристаллического фиалетового с 20% спирта, как описано [Case J.B. et al. Growth, detection, quantification, and inactivation of SARS-CoV-2. Virology. 2020. 548:39-48].

Вирус простого герпеса 2 типа (штамм MS HSV-2). Штамм MS HSV-2, полученный из Американской коллекции и описанный в работе [Суслопаров М.А. и др. Изучение эффективности лечебно-профилактического действия сверхмалых доз антител к гамма интерферону на экспериментальной мышиной модели герпес-вирусной инфекции // Антибиотики и химиотерапия. 2004. 49(10): 3-6], ранее был любезно предоставлен авторам д.-ром М.А. Суслопаровым для исследования ингибирующей активности растительных и химически синтезированных препаратов. HSV-2 хранился в виде мозговой суспензии инфицированных мышей-сосунков линии Balb/c при минус 80°С. Вирусный препарат нарабатывали «слепым» пассажем на перевиваемой культуре клеток Vero, выращенных до монослоя в полистироловых культуральных флаконах объемом 175 см² на питательной среде с 2% прогретой сыворотки крови КРС. «Урожай» HSV-2 от «слепого пассажа» собирали при 100%-ном цитопатическом действии вируса на чувствительные клетки, когда они округляются и/или сливаются в синцитии, но еще прикреплены к поверхности ростового флакона. Инфекционный титр HSV-2 в супернатанте питательной среды от разрушенных 3-х кратным замораживанием/оттаиванием инфицированных клеток Vero выражали в бляшко-образующих единицах (БОЕ)/мл, которые легко подсчитываются при наблюдении в световой микроскоп, как показано [Казачинская Е.И. и др. Ингибирующая активность водных экстрактов чайных композиций, индивидуальных ингредиентов для их составления и некоторых растений на репликацию вируса простого герпеса 2 типа in vitro. II Юг России: экология, развитие. 2022. Т. 17. N3. С.135-152].

Культура клеток.

Перевиваемую культуру клеток линий Vero Е6 (клетки почки африканской зеленой мартышки) из собственной коллекции ФИЦ ФТМ СО РАН культивировали на питательной среде Игла MEM с L-глутамином (Биолот, Россия) с добавлением 1% Antibiotic Antimycotic Solution (SIGMA Life Science, Израиль) и 10% эмбриональной сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) (Capricorn Scientific, ФРГ). Использовали данную культуру клеток, т.к. она чувствительна in vitro как к HSV-2 [Tolo F.M. et al. Antiviral activity of the extracts of a Kenyan medicinal plant Carissa edulis against herpes simplex virus // J Ethnopharmacol., 2006. V. 104. N. 1-2. P. 92-99], так и к SARS-CoV-2 [Зайковская A.B. и др. Изучение в условиях in vitro биологических свойств штаммов коронавируса SARS-CoV-2, относящихся к различным генетическим вариантам // Проблемы особо опасных инфекций. 2022. N1. С.94-100].

Статистическую обработку результатов по определению цитотоксичности и эффективным концентрациям проводили с применением метода Спирмена-Кербера в программе Excel при 95%-ном уровне надежности (р<0.05). Для статистической обработки все анализы in vitro проводили и фиксировали в четырех повторах в двух независимых экспериментах.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1. Получение спиртовых экстрактов надземных частей (листьев, стеблей, цветов) левзеи сафлоровидной и контрольных образцов

Сухое измельченное сырье в соотношении 1/10 по весу (1 г/10 г) заливали очищенным 70%-м этиловым спиртом и выдерживали семь суток на механической качалке при комнатной температуре и 100 об./мин. Жидкости (этанольные экстракты) фильтровали через капроновую ткань и высушивали в асептических условиях при 30±2°С в открытых ч. Петри. Сухой осадок спиртовых экстрактов хранили при комнатной температуре. Подготовка растительных препаратов для исследования цитотоксичности и ингибирующей активности на вирусную репликацию: растворение сухих экстрактов проводили в диметилсульфоксиде (ДМСО) из расчета 200 мг/мл на механической качалке при комнатной температуре и 100 об./мин. в течение суток.

Пример 2. Анализ высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) биологически активных веществ спиртовых экстрактов надземных частей (листьев и стеблей) левзеи сафлоровидной и контрольных образцов

Анализ БАВ выполнен методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «Shimadzu LC-20AD» (Япония), диодно-матричный детектор, хроматографическая колонка Perfect Sil Target ODS - 3; 4.6 × 250 мм, размер зерна сорбента - 5 мкМ. Элюент А: смесь ацетонитрила, изопропилового спирта (5:2 по объему), элюент В: 0,1% трифторуксусная кислота. Время анализа 60 мин. Скорость элюирования 1 мл/мин. Режим элюирования: градиент низкого давления; программа градиента: 0-40 мин 15-35% элюент А, 40-60 мин 35% элюент А. Объем пробы 5 мкл. ВЭЖХ образцов снимали при 2-3 длинах волн: 254 нм (для обнаружения экдистероидов), 272 нм - всех фенольных соединений (включая флавоноиды), 344-350 нм для выявления флавоноидов. Идентификацию сигналов на хроматограммах осуществляли сопоставлением времен удерживания и максимумов поглощения компонентов экстрактов и стандартных образцов Sigma- Aldrich, чистота ≥95% (табл.1). Содержание БАВ рассчитывалось по площадям пиков образца и соответствующих стандартов с помощью калибровочной кривой, построенной с использованием программного обеспечения LC Postrun Calibration Curve. Анализ проводили в трех повторах, статистические расчеты осуществляли в программе Microsoft Excel, 2007.

В результате, по данным хроматограммы ВЭЖХ, в образцах левзеи сафлоровидной как в листьях (Фиг. 2), так и в стеблях (Фиг. 3) обнаружен экдистероид - 20-гидроксиэкдизон, примерно с одинаковым содержанием - 1,32-1,30% (табл.2). Из фенольных соединений обнаружены хлорогеновая кислота, содержание которой значительно больше в листьях 15,64%, тогда как в стеблях 1,26%. На основании сравнения времен удерживания и УФ-спектров со стандартами идентифицированы флавоноиды: рутин и изокверцетрин с временами удерживания 17.824 и 18.261 мин и максимумами поглощения 258/356 нм.

Кроме того, обнаружен ряд неидентифицированных флавоноидов в листьях, имеющих максимумы поглощения в области 254/367; 257/356; 268/339 (флавон) и в стеблях один флавоноид с поглощением 261/349 нм (табл.2).

Примечание: Экдистероиды рассчитаны по 20Е; флавоноиды по рутину или по шафтозиду, галловая к-та по стандарту галловой к-ты. Жирным шрифтом в первом столбце выделены строки для отражения присутствия одних и тех же соединений в родственных образцах (разные части одного растения). Неидент.флав. - неидентифицированный флавоноид. Экстракт цветов левзеи сафлоровидной методом ВЭЖХ не исследовали в связи с низкой антивирусной эффективностью этого препарата.

В экстракте специи гвоздики (S. aromaticum L., Myrtaceae) выявлено 4 флавоноида, один из которых идентифицирован как кверцетрин гидрат, другой - предположительно, рутин или изокверцетрин, которые имеют одинаковые максимумы поглощения 255/355 нм и близкие времена удерживания. В экстракте чаги при детектировании 272 нм обнаружено фенольное соединение с характеристиками tr = 8.033 и поглощением при 274 нм, свойственными галловой кислоте, содержание которой составило 0,56%. По данным хроматограммы, мажорным компонентом в экстрактах черного чая (17,64%) и зеленого чая (24,14%) вероятно, является комплекс соединений с пиком по времени удерживания 51.386-52.109 мин (366/272/251 и 366/272/250 нм). В экстракте зеленого чая обнаружены свободная галловая кислота, производное галловой кислоты, масса простых фенолов и ряд флавонов - производных апигенина и лютеолина. В экстрактах черного чая тоже содержится галловая кислота (6,70%), причем содержание ее выше, чем в зеленом (3,04%). Возможно, что это общий пик галловой кислоты с кофеном, т.к. их характеристики очень близки - галловая кислота (7.623 мин; 272 нм); кофеин (7.803 мин; 273 нм). Катехин, катехин гидрат и эпикатехин в этанольных экстрактах чая не обнаружены.

Пример 3. Анализ цитотоксичности спиртовых экстрактов надземных частей (листьев, стеблей и цветков) левзеи сафлоровидной и контрольных образцов

Цитотоксичность определяли по 50%-ной токсичной концентрации в мл (50% cytotoxic concentration, CC₅₀/ml) как описано [Hassan S.T.S. et al. In Vitro Study of Multi-Therapeutic Properties of Thymus bovei Benth. Essential Oil and Its Main Component for Promoting Their Use in Clinical Practice. J. Clin. Med., 2018, N. 7. P.283.] при нанесении растительных препаратов на клеточную культуру Vero Е6, выращенную до монослоя в лунках 96-луночных планшетов (Corning, США), в поддерживающей питательной среде (с 2% прогретой сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) в разведениях для титрования двойным шагом и выдерживали в течение 1 часа при 37°С. Затем монослой клеток отмывали и оставляли в поддерживающей питательной среде. Контроли: поддерживающая питательная среда для клеток Vero Е6 и ДМСО в объемах, соответствующих содержанию этого растворителя в исследуемых растительных препаратах. Данные по наблюдению в световой микроскоп фиксировали каждые сутки (срок наблюдения 5 суток) и затем обрабатывали с учетом проявления ЦПД на 2-е и 4-е сутки для 10³ БОЕ/мл HSV-2 и 10³ ТЦПД₅₀/мл SARS-CoV-2, соответственно. В результате, цитотоксичность исследуемых растительных препаратов, растворенных в ДМСО, повышалась с течением времени, приблизительно в два раза (табл.3). Так, например, показатели СС₅₀ для контрольных образцов повысились - экстракт чаги с 875,0±160,39 до 406,25±89,66 мкг/мл, специи гвоздики с 750,0±185,20 до 343,75±89,65 мкг/мл, черного чая с 1500±370,4 до 687,5±179,32 мкг/мл и зеленого чая с 1125±224,99 до 625±160,39 мкг/мл, соответственно. Из спиртовых экстрактов надземных частей левзеи наименее токсичными оказались цветы (1750±320,77 мкг/мл на вторые сутки и 1125±224,99 мкг/мл на 4-е сутки, соответственно). Токсичность экстракта стеблей левзеи на 2-е сутки соответствовала таковой для экстракта черного чая (1500±370,4 мкг/мл). Наиболее цитотоксичным был экстракт листьев левзеи - 750,0±185,20 мкг/мл на 2-е сутки и 312,5±80,19 мкг/мл на 4-е сутки, что было похоже на показатели СС₅₀ экстракта специи гвоздики.

Пример 4. Анализ ингибирующей активности спиртовых экстрактов надземных частей (листьев, стеблей, цветков) левзеи сафлоровидной и контрольных образцов на репликацию SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-l/2020

Анализ ингибирующей активности спиртовых экстрактов надземных частей (листьев, стеблей и цветков) левзеи сафлоровидной и контрольных образцов этанольных экстрактов чаги, специи гвоздики и черного чая из Индии проводили методом классической реакции нейтрализации (инактивации) вируса в четырех повторах в двух независимых экспериментах по классической схеме нейтрализации (инактивации) вируса, как нами описано недавно для исследования антител пациентов, переболевших COVID-19 [Kazachinskaia E.I. et al. IgG Study of Blood Sera of Patients with COVID-19. Patogens 2021. N. 10. P. 1421]. Спиртовые экстракты, растворенные в ДМСО (200 мг/мл), титровали в лунках 96-луночных планшетов двойным шагом в питательной среде для клеток Vero Е6 с разведения, содержащего 2000 мкг/мл. Затем в лунки добавляли вирусный препарат SARS-CoV-2 с инфекционным титром 10³ ТЦПД₅₀/МЛ и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После инкубации смеси экстрактов с вирусным препаратом переносили на монослой клеток Vero Е6 и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем монослои клеток отмывали и оставляли в поддерживающей питательной среде, содержащей 2% прогретой сыворотки крови КРС, до проявления ЦПД вируса в контрольных лунках, содержащих инфицированные клетки, как показано [Казачинская Е.И. и др. Ингибирующая активность чайных композиций и их составляющих ингредиентов на репликацию SARS-COV-2 in vitro II Юг России: экология, развитие. 2022. Т. 17. N. 2. С. 76-90]. Отрицательные контроли: поддерживающая питательная среда для клеток Vero Е6 и ДМСО в объемах, соответствующих содержанию этого растворителя в исследуемых растительных препаратах. Учет результатов по ингибированию вирусной репликации сначала проводили визуально при наблюдении в инвертированный микроскоп (Микромед, Россия) при 10-кратном увеличении, а затем после фиксации клеток в течение 30 мин раствором формальдегидом и 0,05%-ным раствором кристаллического фиалетового с 20% спирта, как описано [Case J.B. et al. Growth, detection, quantification, and inactivation of SARS-CoV-2. Virology. 2020 548:39-48]. Результат оценивали в соответствии с «Руководством....» [Фисенко В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Минздрав РФ, ЗАО «ИИА «Ремедиум, Москва. 2000. 398 с.].

По результатам, представленным в таблице 4, видно, что при прямой инактивации (нейтрализации) SARS-Co V-2 с инфекционным титром 10 ТЦПДбо/мл для контрольных образцов выявлены показатели ЕС50: для экстрактов черного чая, зеленого чая и специи гвоздики - 1,09±0,24 мкг/мл, для экстракта чаги - 6,34±1,39 мкг/мл. Инактивирующая эффективность экстракта листьев левзеи на SARS-CoV-2 оказалась аналогична трем контрольным образцам - экстрактов черного чая, зеленого чая и специи гвоздики с ЕС₅₀=1,09±0,24 мкг/мл. Инактивирующую эффективность экстракта стеблей левзеи (9,76±2,50 мкг/мл) на SARS-Co V-2 можно сравнить с эффективностью экстракта чаги (6,34±1,39 мкг/мл). Экстракт цветков левзеи оказался наименее активен против коронавируса - в концентрации 93,75±23,15 мкг/мл.

Пример 5. Анализ ингибирующей активности заявленных спиртовых экстрактов надземных частей (листьев, стеблей, цветков) левзеи сафлоровидной и контрольных образцов на репликацию HSV-2

Анализ ингибирующей активности исследуемых растительных препаратов и контрольных образцов проводили методом классической реакции нейтрализации (инактивации) 10³ БОЕ/мл HSV-2 в четырех повторах в двух независимых экспериментах по классической схеме нейтрализации (инактивации) как описано в примере 4. Учет результатов по ингибированию вирусной репликации проводили визуально при наблюдении в инвертированный микроскоп (Микромед, Россия) при 10-кратном увеличении. Результат оценивали в соответствии с «Руководством....» [Фисенко В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Минздрав РФ, ЗАО «ИИА «Ремедиум, Москва. 2000. 398 с.].

В результате при показателях ЕС₅₀ препаратов сравнения по убывающей активности: для черного чая - 1,22±0,31 мкг/мл, специи гвоздики - 1,59±0,70 мкг/мл, чаги -3,17±0,69 мкг/мл и зеленого чая - 3,42±0,63 мкг/мл, для препаратов исследуемых частей левзеи были выявлены следующие 50%-ные эффективные концентрации (по убывающей активности): листья - 4,39±0,96 мкг/мл, стебли - 14,65±1,91 мкг/мл и цветы - 101,56±22,41 мкг/мл (табл.5). Таким образом, инактивирующая эффективность спиртовых экстрактов листьев и стеблей левзеи на HSV-2 (4,39±0,96 мкг/мл и 14,65±1,91 мкг/мл, соответственно) сопоставима с эффективностью экстракта чаги (3,17±0,69 мкг/мл), а спиртовый экстракт цветков левзеи оказался наименее активен против HSV-2 (101,56±22,41 мкг/мл).

Пример 6. Определение индексов селективности для спиртовых экстрактов левзеи сафлоровидной и контрольных образцов.

На основании полученных данных по цитотоксичности, выявленной на вторые и четвертые сутки наблюдения (пример 3, табл.3), совпадающей со временем фиксации результатов по ЦПД 10³ БОЕ/мл HSV-2 и 10³ ТЦПД₅₀/мл SARS-CoV-2, а также по эффективным концентрациям (ЕС₅₀) исследуемых растительных препаратов (примеры 4 и 5, табл.4, 5) для них рассчитаны индексы селективности по формуле SI₅₀=CC₅₀/EC₅₀ как описано [Hassan S.T.S. et al. In Vitro Study of Multi-Therapeutic Properties of Thymus bovei Benth. Essential Oil and Its Main Component for Promoting Their Use in Clinical Practice // J. Clin. Med., 2018. N. 7:283].

В результате, выявлены следующие значения SI50 контрольных образцов: для спиртового экстракта черного чая - 1229,5 (против HSV-2) и 630,73 (против SARS-CoV-2), для спиртового экстракта зеленого чая - 328,95 и 573,39, для спиртового экстракта специи гвоздики - 471,69 и 315,36, для спиртового экстракта чаги 276,02 и 292,26, соответственно. Показатели SI₅₀ спиртового экстракта листьев левзеи сафлоровидной -170, 84 против HSV-2 и 286,7 против SARS-Co V-2 сопоставимы с SI₅₀ спиртового экстракта чаги - 276,02 и 292,26 (Фиг. 4). Для спиртового экстракта стеблей левзеи показатели SI₅₀ - 102,39 против HSV-2 и 89,65 против SARS-CoV-2. Самые низкие показатели выявлены для спиртового экстракта цветков левзеи - 17,23 и 12,0, соответственно, что коррелирует с показателями ЕС₅₀ этого образца.

Вывод: Полученные результаты по применению и по способу получения спиртового экстракта из сухих надземных частей (листьев, стеблей) левзеи сафлоровидной (Rhaponticum carthamoides) с высоким выходом 20-гидроксиэкдизона (1,32 - 1,30% от массы сухих экстрактов) и обладающих ингибирующей активностью in vitro на коронавирус SARS-COV-2 и вирус простого герпеса 2 типа могут стать основой для разработки недорогих отечественных препаратов для снижения рецидивов хронического герпеса и лечения/профилактики COVID-19. Экстракт цветков левзеи сафлоровидной оказался наименее активен против SARS-COV-2 и HSV-2.

Работы выполнены с использованием оборудования ЦКП ФИЦ ФТМ «Протеомный анализ», поддержанного финансированием Минобрнауки России (соглашение №075-15-2021-691).

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу получения спиртового экстракта левзеи сафровидной Rhaponticum carthamoides. Способ получения спиртового экстракта левзеи сафровидной Rhaponticum carthamoides, включающий сбор, измельчение и высушивание растения, экстракцию в водном растворе этилового спирта, высушивание спиртового экстракта, при этом для получения спиртового экстракта, обладающего противовирусной активностью в отношении коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа HSV-2 in vitro, используют надземные части растения в период цветения, экстракцию проводят в 70% этиловом спирте в соотношении сухого сырья/экстрагирующего агента по весу 1/10 в течение 7 суток при комнатной температуре при покачивании со скоростью 100 об/мин в течение 7 суток, полученный экстракт высушивают в асептических условиях при 30±2°С, затем растворяют в диметилсульфоксиде из расчета 200 мг/мл при покачивании со скоростью 100 об/мин при комнатной температуре в течение суток. Использование заявленного изобретения обеспечивает получение спиртового экстракта указанного растения для эффективного подавления репликации коронавируса SARS-COV-2 и вируса простого герпеса 2 типа in vitro, при этом выход основного биологически активного соединения 20-гидроксиэкдизона от массы сухого спиртового экстракта составляет 1,32 и 1,30% из листьев и стеблей, соответственно. 4 ил., 5 табл., 6 пр.

Способ получения спиртового экстракта левзеи сафровидной Rhaponticum carthamoides, включающий сбор, измельчение и высушивание растения, экстракцию в водном растворе этилового спирта, высушивание спиртового экстракта, отличающийся тем, что для получения спиртового экстракта, обладающего противовирусной активностью в отношении коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа HSV-2 in vitro, используют надземные части растения в период цветения, экстракцию проводят в 70% этиловом спирте в соотношении сухого сырья/экстрагирующего агента по весу 1/10 в течение 7 суток при комнатной температуре при покачивании со скоростью 100 об/мин в течение 7 суток, полученный экстракт высушивают в асептических условиях при 30±2°С, затем растворяют в диметилсульфоксиде из расчета 200 мг/мл при покачивании со скоростью 100 об/мин при комнатной температуре в течение суток.