АНТИ-SIRPα АНТИТЕЛА Российский патент 2022 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителам и применению этих антител в лечении рака, необязательно в комбинации с другими противораковыми терапевтическими средствами.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

С конца 1990-х годов терапевтические антитела стали доступны для лечения рака. Эти терапевтические антитела могут воздействовать на злокачественные клетки различными путями. Сигнальные пути, запускаемые связыванием антитела со своей мишенью на злокачественных клетках, приводят к подавлению клеточной пролиферации или апоптозу. Fc-область терапевтического антитела может запускать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и антитело-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP). Однако терапевтические антитела, используемые в качестве монотерапии, часто оказываются недостаточно эффективными. Одним из вариантов улучшения эффективности терапевтических антител является усиление ADCC и/или ADCP. Это было сделано путем улучшения сродства Fc-области к рецепторам Fcγ, например, с помощью аминокислотных замен (Richards et al. Mol. Cancer Ther. 2008, 7(8), 2517-2527) или путем воздействия на гликозилирование Fc-области (Hayes et al. J. Inflamm. Res. 2016, 9, 209-219).

Другим способом усиления ADCC и/или ADCP терапевтического антитела является комбинирование терапевтического антитела с антагонистическим антителом к сигнальному регуляторному белку α (анти-SIRPα) или анти-CD47-антителом (WO2009/131453). Когда CD47 связывается с ингибирующим иммунорецептором SIRPα, экспрессируемым на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках и нейтрофилах, SIRPα передает ингибирующий сигнал, который предотвращает разрушение раковых клеток путем фагоцитоза или посредством других зависимых от Fc-рецепторов механизмов разрушения иммунных эффекторных клеток.

Опухолевые клетки используют активацию CD47 в качестве механизма, позволяющего избежать противоопухолевого иммунного ответа, индуцированного терапевтическими антителами. Анти-CD47 или анти-SIRPα антитела блокируют передачу ингибирующих сигналов, генерируемых через ось CD47-SIRPα, что приводит к усилению ADCC и/или ADCP.

Большинство клинических исследований, имеющих отношение к взаимодействию CD47-SIRPα, было сосредоточено на анти-CD47 антителах, как в качестве монотерапии, так и в качестве терапии в комбинации с терапевтическим антителом (Weiskopf. Eur. J. Cancer 2017, 76, 100-109). Количество исследований, направленных на изучение анти-CD47 антитела в качестве противораковых лекарственных средств, растут, несмотря на то что CD47 также экспрессируется на поверхности клеток большинства нормальных тканей.

Имеется небольшая работа по изучению противораковой монотерапии или комбинированной терапии с помощью анти-SIRPα антител. Большая часть этой работы по изучению анти-SIRPα антител, выполненная с использованием мышиных анти-SIRPα антител, представляет собой механистические исследования, касающиеся взаимодействия CD47-SIRPα; например, мышиные 12C4 и 1.23A увеличивали опосредованную нейтрофилами ADCC трастузумаба в опсонизированных клетках SKBR3 (Zhao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347). В WO 2015/138600 раскрыто мышиное антитело KWAR23 к человеческому SIRPα и его химерный Fab-фрагмент, который усиливал фагоцитоз in vitro, т.е. цетуксимаб. В WO2018/026600 раскрыто гуманизированное KWAR23 с Fc-частью человеческого IgG₁, содержащей мутацию N297A. В WO2013/056352 раскрыты 29AM4-5 IgG₄ и другие человеческие анти-SIRPα антитела класса IgG₄. 29AM4-5 IgG₄, вводимое три раза в неделю в течение четырех недель в дозе 8 мг/кг, уменьшало приживление лейкемических клеток первичной AML человека, инъецированных в правое бедро NOD-scid-gamma мышей (NSG).

SIRPα является членом семейства сигнальных регуляторных белков (SIRP), трансмембранных гликопротеинов с внеклеточными Ig-подобными доменами, присутствующими на иммунных эффекторных клетках. Домен SIRPα, связывающий NH2-терминальный лиганд, является высоко полиморфным (Takenaka et al. Nature Immun. 2007, 8(12), 1313-1323). Однако этот полиморфизм не оказывает значительного влияния на связывание с CD47. SIRPα_BIT (v1) и SIRPα₁ (v2) являются двумя наиболее распространенными и наиболее расходящимися (отличающимися друг от друга 13 остатками) полиморфами (Hatherley et al. J. Biol. Chem. 2014, 289(14), 10024-10028). Другими биохимически охарактеризованными членами человеческого семейства SIRP являются SIRPβ₁ и SIRPγ.

SIRPβ₁ не связывается с CD47 (van Beek et al. J. Immunol. 2005, 175 (12), 7781-7787, 7788-7789), при этом известны по меньшей мере два полиморфных варианта SIRPβ₁: SIRPβ_1v1 (ENSP00000371018) и SIRPβ_1v2 (ENSP00000279477). Хотя природный лиганд SIRPβ₁ пока неизвестен, исследования in vitro с использованием антител, специфических к SIRPβ₁, показывают, что связывание SIRPβ₁ способствует фагоцитозу в макрофагах путем индукции фосфорилирования тирозиновых остатков DAP12, Syk и SLP-76 и последующей активации MEK-MAPK-сигнального каскада киназы легких цепей миозина (Matozaki et al. J. Biol. Chem. 2004, 279(28), 29450-29460).

SIRPγ экспрессируется на Т-клетках и активированных NK-клетках и связывается с CD47 со сродством в 10 раз более низким, чем с SIRPα. Взаимодействие CD47-SIRPγ имеет место во время контакта между антигенпрезентирующими клетками и Т-клетками, костимуляции активации Т-клеток и способствует пролиферации Т-клеток (Piccio et al. Blood 2005, 105, 2421-2427). Кроме того, взаимодействия CD47-SIRPγ играют роль в трансэндотелиальной миграции Т-клеток (Stefanisakis et al. Blood 2008, 112, 1280-1289).

Анти-SIRPα антитела, известные в данной области техники, менее пригодны для использования в моно- или комбинированной терапии, направленной на SIRPα, поскольку они либо не являются специфическими к человеческому SIRPα, либо являются слишком специфическими. Антитела предшествующего уровня техники KWAR23, SE5A5, 29AM4-5 и 12C4 не являются специфическими, так как они также связываются с человеческим SIRPγ. Связывание с SIRPγ, который экспрессируется на Т-клетках, может оказывать негативное влияние на пролиферацию и рекрутирование Т-клеток. Другие анти- SIRPα антитела имеют слишком ограниченную специфичность, например, 1.23A mAb распознает только полиморфный вариант SIRPα₁ человеческого SIRPα, и не распознает вариант SIRPα_BIT, который преобладает по меньшей мере в кавказской популяции (X.W. Zhao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347).

Помимо использования анти-SIRPα антител для усиления ADCC терапевтического антитела, эти антитела также могут быть использованы для нацеливания непосредственно на типы рака, экспрессирующие SIRPα. Анти-SIRPα антитела, содержащие человеческий Fc дикого типа, могут быть пригодны для лечения рака, экспрессирующего SIRPα, такого как почечно-клеточный рак и злокачественная меланома, поскольку мышиные анти-SIRPα антитела, имеющие функциональную Fc-область, замедляли образование опухоли у мышей, которым инъецировали клетки Ренка (Renca) и клетки меланомы B16BL6, экспрессирующие SIRPα (Yanagita et al. JCI Insight 2017, 2(1), e89140).

В заключение следует отметить, что остается потребность в анти-SIRPα антителах, которые имеют низкий уровень связывания с SIRPγ, которые специфически связываются с обоими полиморфными вариантами SIRPα₁ и SIRPα_BIT и которые могли бы использоваться в противораковой терапии либо отдельно, либо в комбинации с терапевтическими антителами.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителам, которые подходят для применения в противораковой терапии. Изобретение также относится к применению антител для лечения солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. Сравнение ADCC, измеренной в % цитотоксичности только трастузумаба (Tmab), трастузумаба в комбинации с мышиным анти-SIRPα антителом 12C4 (mu12C4), трастузумаба в комбинации с антителом, в котором вариабельные области мышиного 12C4 привиты на константную область человеческого IgG₁ (12C4huIgG₁), и трастузумаба в комбинации с антителом, в котором вариабельные области мышиного 12C4 привиты на константную область человеческого IgG₁, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A (12C4huIgG₁LALA), измеренные на HER2-позитивных раковых клетках молочной железы SKBR3 с использованием человеческих нейтрофилов в качестве эффекторных клеток.

Фиг. 2. Сравнение % ADCC, относительно трастузумаба (установленного на 100%), комбинаций трастузумаба с анти-SIRPα антителами 1-9, имеющими константную область человеческого IgG₁, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, анти-SIRPα антителом 12C4huIgG₁LALA (12C4LALA) и анти-CD47 антителом B6H12huIgG₁LALA (B6H12LALA) на клетках SKBR3. Залитые квадраты (■) являются значениями, измеренными с помощью нейтрофилов, полученных от доноров, имеющих вариант SIRPα_BIT, незалитые круги, (○), являются значениями, измеренными с помощью нейтрофилов, полученных от доноров, имеющих вариант SIRPα₁. Столбцы являются средними значениями по всем донорам; планки погрешностей представляют стандартное отклонение.

Фиг.3. Сравнение % ADCC, относительно только трастузумаба, комбинаций трастузумаба с анти-SIRPα антителами 4, 7, 10, 14 в различных концентрациях (кривые доза-ответ), имеющими константную область человеческого IgG₁, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, и анти-SIRPα антителом 12C4huIgG₁LALA (12C4LALA) на клетках SKBR3. Нейтрофилы, полученные от двух доноров (△, ○), имели вариант SIRPα_BIT. Столбцы представляют собой среднее значение для двух доноров.

Фиг.4. Сравнение % ADCC, относительно только трастузумаба, комбинаций трастузумаба с анти-SIRPα антителами 4, 7, 10, 13, 14, 15 и 16, имеющими константную область человеческого IgG₁, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, и анти-SIRPα антителом 12C4huIgG₁LALA (12C4LALA) на клетках SKBR3. Использовали нейтрофилы, полученные от доноров, имеющих вариант SIRPα_BIT (△, ▽, ◇), вариант SIRPα₁ (d, ◓), и нейтрофилы, полученные от донора, вариант которого не был определен (□). Столбцы являются средними значениями для доноров.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Не существует апробированных терапевтических средств, направленных против SIRPα, хотя было показано, что эта мишень играет важную роль в механизмах уклонения опухоли от иммунной системы. Кроме того, SIRPα экспрессируется на различных злокачественных клетках, что делает его потенциальным антигеном, ассоциированным с опухолью.

Настоящее изобретение относится к антагонистическим анти-SIRPα антителам, которые имеют специфическое связывание с двумя преобладающими полиморфными вариантами SIRPα_BIT и SIRPα₁, которые не связываются с SIRPγ и которые увеличивают ADCC и/или ADCP терапевтических антител.

Термин «антитело», используемый в настоящем описании, относится к моноклональному антителу (mAb), содержащему две тяжелые цепи и две легкие цепи. Антитела могут иметь любой изотип, такой как антитела IgA, IgE, IgG или IgM. Предпочтительно антитело представляет собой антитело IgG, более предпочтительно антитело IgG₁ или IgG₂. Антитела могут быть химерными, гуманизированными или человеческими. Предпочтительно антитела по изобретению являются гуманизированными. Еще более предпочтительно, антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело IgG, наиболее предпочтительно гуманизированное или человеческое mAb IgG₁. Антитело может иметь κ (каппа) или λ (лямбда) легкие цепи, предпочтительно κ (каппа) легкие цепи, т.е. гуманизированное или человеческое антитело IgG₁-к. Антитела могут содержать сконструированную константную область, т.е. могут быть введены одна или более мутаций, например, для увеличения периода полураспада и/или усиления или ослабления эффекторной функции.

Используемый в настоящем описании термин «моноклональное антитело» или «mAb» может относиться к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Антитела могут быть получены путем иммунизации животных смесью пептидов, представляющих желаемый антиген. В-лимфоциты выделяют и сливают с клетками миеломы, или отдельные В-лимфоциты культивируют в течение нескольких дней в присутствии кондиционированной среды и питающих клеток. Супернатанты миеломы или В-лимфоцитов, содержащие продуцированные антитела, тестируют для отбора подходящих В-лимфоцитов или гибридом. Моноклональные антитела могут быть получены из подходящих гибридом методом гибридомы, впервые описанным Köhler et al. Nature 1975, 256, 495-497. Альтернативно, для получения РНК подходящие В-клетки или клетки лимфомы могут быть лизированы, РНК может быть выделена, подвергнута обратной транскрипции и секвенирована. Антитела могут быть получены методами рекомбинантной ДНК в бактериальных, эукариотических клетках животных или растений (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител методами, описанными в данной области техники, например, в Clackson et al. Nature 1919, 352, 624-628 и Marks et al. J. Mol. Biol. 1991, 222, 581-597.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент», используемый в настоящем описании, включает фрагмент Fab, Fab' или F(ab')₂, одноцепочечное (sc) антитело, scFv, однодоменное (sd) антитело, диатело или минитело.

В гуманизированных антителах антигенсвязывающие, определяющие комплементарность области (CDR) в вариабельных областях (VR) тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC), получают из антител не относящегося к человеку вида, обычно мыши, крысы или кролика. Эти не являющиеся человеческими CDR объединяют с человеческими каркасными областями (FR1, FR2, FR3 и FR4) вариабельных областей HC и LC таким образом, чтобы были сохранены функциональные свойства антител, такие как сродство и специфичность связывания. Выбранные аминокислоты в человеческих FR могут быть заменены соответствующими исходными аминокислотами не относящегося к человеку вида для улучшения сродства связывания при сохранении низкой иммуногенности. Альтернативно, выбранные аминокислоты исходных FR не относящегося к человеку вида заменяют соответствующими им человеческими аминокислотами для уменьшения иммуногенности при сохранении сродства связывания антитела. Таким образом, гуманизированные вариабельные области объединяют с человеческими константными областями.

CDR могут быть определены с помощью подхода Кабат (см. Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991)), Чотиа (Chothia et al., Nature 1989, 342, 877-883) или IMGT (Lefranc, The Immunologist 1999, 7, 132-136). В контексте настоящего изобретения для указания положений в константных областях тяжелой цепи и легкой цепи антитела используется нумерация Eu. Выражение «нумерация Eu» относится к индексу Eu, как указано в Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991).

Антагонистические антитела имеют сродство к конкретному антигену, и связывание этого антитела со своим антигеном подавляет функцию агониста или обратного агониста в отношении рецепторов. В данном случае связывание антагонистического анти-SIRPα антитела с SIRPα будет либо предотвращать связывание CD47 с SIRPα, либо нарушать ингибирующий сигнал, который запускается связыванием CD47 с SIRPα.

Антагонистические анти-SIRPα антитела могут связываться с тем же участком, с которым связывается CD47, предотвращая лигирование SIRPα с помощью CD47 и, следовательно, ингибируя сигнальный каскад, который отрицательно регулирует зависимые от Fc-рецепторов функции иммунных эффекторных клеток. Антагонистические анти-SIRPα антитела также могут связываться с участком SIRPα, который отличается от CD47-связывающего участка, т.е. с аллостерическим участком, и подавлять передачу ингибирующих сигналов SIRPα без прямого вмешательства в физическое взаимодействие CD47-SIRPα, например, путем изменения пространственной формы SIRPα. Это изменение пространственной формы предотвращает (ниже расположенную) передачу сигналов при связывании с CD47. Когда SIRPα связывается на аллостерическом участке, CD47 может все еще быть связанным с SIRPα, что может уменьшить доступность CD47 для связывания с тромбоспондином-1 (TSP-1). Лигирование TSP-1 с CD47 является важным, например, при отрицательной регуляции активации Т-клеток (Soto-Pantoja et al. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2015, 50(3), 212-230).

Термин «сродство связывания», используемый в настоящем описании, относится к константе диссоциации (K_D) конкретного взаимодействия антиген-антитело. K_D представляет собой отношение скорости диссоциации (k_off) к скорости ассоциации (k_on). Следовательно, K_D равно k_off/k_on и выражается в виде молярной концентрации (M). Отсюда следует, что чем меньше значение K_D, тем сильнее сродство связывания. Как правило, значения K_D определяют методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR), обычно с помощью биосенсорной системы (например, Biacore®), используя методы, известные в данной области техники (например, ES Day et al. Anal. Biochem. 2013, 440, 96-107). Термин «сродство связывания» также может относиться к концентрации антитела, которая обеспечивает половину максимально достижимого уровня связывания (ЕС₅₀), определенного, например, с помощью анализа ELISA или с помощью проточной цитометрии.

Термин «специфическое связывание», используемый в настоящем описании, относится к связыванию антитела со своим антигеном с K_D обычно менее 10^–7 М, например 10^–8 М, 10^–9 М, 10^–10 М, 10^–11 М или даже менее, определенной методом SPR при 25°C.

Термин «низкое сродство», используемый в настоящем описании, используется взаимозаменяемо с фразами «не связывает» или «не связывается» и относится к сродству связывания между антителом и его антигеном со значением ЕС₅₀, превышающим 1500 нг/мл, определенным с помощью анализа ELISA, или к отсутствию обнаруживаемого специфического связывания между иммобилизованным антигеном и антителом согласно данным SPR.

Термин «высокое сродство», используемый в настоящем описании, относится к сродству связывания между антителом и его антигеном с K_D обычно менее 10^–10 М, 10^–11 М или даже менее, определенной етодом SPR при 25°C.

В частности, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему определяющие комплементарность области (CDR) вариабельных областей (VR) тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC), выбранные из группы, состоящей из:

а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 1, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 2;

b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 4;

c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;

d. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8;

e. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 10;

f. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 11, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 12;

g. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14;

h. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 15, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 16; и

i. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 17, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 18,

причем CDR определены согласно нумерации Кабат.

Предпочтительно, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему определяющие комплементарность области (CDR) вариабельных областей (VR) тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC), выбранные из группы, состоящей из:

а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 4;

b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;

c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8;

d. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 10;

e. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 11, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 12;

f. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14;

g. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 15, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 16; и

h. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 17, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 18,

причем CDR определены согласно нумерации Кабат.

Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:

а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 4;

b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;

c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8;

d. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 10; и

e. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14,

причем CDR определены согласно нумерации Кабат.

Еще более предпочтительно, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:

а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;

b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8; и

c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14,

причем CDR определены согласно нумерации Кабат.

Наиболее предпочтительно, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:

а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8; и

b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14,

причем CDR определены согласно нумерации Кабат.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к определенному выше анти-SIRPα антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, причем антитело демонстрирует специфическое связывание как с SIRPα_BIT, так и с SIRPα₁, но не связывается с SIRPγ.

В более предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с SIRPα_BIT с K_D ниже 10^–9 М и связывается с SIRPα₁ с K_D ниже 10^–7 М, причем K_D измеряют методом SPR при 25°С. Предпочтительно, анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с SIRPα₁ с K_D ниже 10^–8 М.

В другом предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с SIRPα_BIT и SIRPα₁ с K_D ниже 10^–9 М, причем K_D измеряют методом SPR при 25°С.

В еще более предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с SIRPα_BIT и SIRPα₁ с K_D ниже 10^–10 М. Предпочтительно, анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с SIRPα_BIT с K_D ниже 10^–10 М и с SIRPα₁ с K_D ниже 10^–11 М. Как правило, анти-SIRPα антитело, определенное выше, представляет собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело. Предпочтительно, анти-SIRPα антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело. Более предпочтительно, анти-SIRPα антитело представляет собой гуманизированное антитело. В конкретном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:

а. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 30, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 31;

b. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 32, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 33;

c. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 34, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 8;

d. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 35, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 36;

e. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 35, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 37;

f. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 13, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 38; и

g. аминокислотной последовательности HCVR, приведенной в SEQ ID NO: 13, и аминокислотной последовательности LCVR, приведенной в SEQ ID NO: 37.

В предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 30, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 31.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 32, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 33.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 8.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 35, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 36.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 35, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 37.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 38.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 37.

Помимо связывания как с человеческим (hu)SIRPα_BIT, так и человеческим (hu)SIRPα₁, антитела по изобретению также могут связываться с (cy)SIRPα яванского макака (cy), что позволяет проводить исследования in vivo на соответствующей модели на животных.

Антитела по изобретению могут связываться с участком SIRPα, который отличается от CD47-связывающего участка, т.е. с аллостерическим участком, и подавлять передачу ингибирующих сигналов SIRPα без прямого вмешательства в физическое взаимодействие CD47-SIRPα. Альтернативно, антитела могут связываться с тем же участком, с которым связывается CD47, предотвращая лигирование SIRPα с помощью CD47 и, следовательно, ингибируя сигнальный каскад, который отрицательно регулирует зависимые от Fc-рецепторов функции иммунных эффекторных клеток

Анти-SIRPα антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные выше, являются более специфическими, чем известные анти-SIRPα антитела, и демонстрируют высокое сродство как по отношению к SIRPα_BIT, так и по отношению к SIRPα₁. К тому же, анти-SIRPα антитела по изобретению не связываются с SIRPγ.

В одном конкретном варианте осуществления анти-SIRPα антитело по изобретению содержит Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках. Такое анти-SIRPα антитело является подходящим для монотерапии SIRPα-позитивных солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека, поскольку оно может индуцировать ADCC и/или ADCP. Человеческие иммунные эффекторные клетки имеют множество различных активирующих Fc-рецепторов, которые при лигировании запускают фагоцитоз, высвобождение цитокинов, ADCC и/или ADCP и т.д. Примерами этих рецепторов являются рецепторы Fcγ, например FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b), FcγRIIC и Fcα-рецептор FcαRI (CD89). Различные природные изотипы антител связываются с этими рецепторами. Например, IgG₁ связывается с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB; IgG₂ связывается с FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA; IgG₃ связывается с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB; IgG₄ связывается с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA; и IgA связывается с FcαRI.

В предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело по изобретению содержит Fc-область изотипа IgA или IgG. Более предпочтительным является анти-SIRPα антитело, содержащее Fc-область изотипа IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄; еще более предпочтительным изотип является IgG₁, IgG₂ или IgG₄. Наиболее предпочтительным является анти-SIRPα антитело, содержащее Fc-область изотипа IgG₁.

Хотя анти-SIRPα антитела, содержащие Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках, могут быть пригодными для лечения SIRPα-экспрессирующего рака, химерные анти-SIRPα антитела IgG1 изотипа не показали ожидаемых результатов при тестировании in vitro в комбинации с другими антителами, которые содержат человеческую Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках (т.е. как антитела, которые способны индуцировать ADCC и/или ADCP). Результаты анализов ADCC in vitro показали, что химерное анти-SIRPα антитело IgG₁ изотипа не увеличивает ADCC такого другого антитела в той степени, как это ожидалось, исходя из более ранних результатов с использованием мышиных антител.

Следовательно, изобретение относится к анти-SIRPα антителам, которые демонстрируют пониженное связывание или низкое сродство к активирующим Fc-рецепторам, присутствующим на человеческих иммунных эффекторных клетках. Такие анти-SIRPα антитела содержат модифицированную Fc-область, в которой одна или более аминокислот заменены другой аминокислотой(ами) по сравнению с аналогичной немодифицированной Fc-областью. Пониженное связывание означает, что сродство анти-SIRPα антитела, содержащего модифицированную Fc-область, к активирующим Fc-рецепторам ниже, чем сродство анти-SIRPα антитела с теми же вариабельными областями, содержащими аналогичную немодифицированную Fc-область. Сродство связывания антител к активирующим Fc-рецепторам обычно измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) или проточной цитометрией, используя способы, известные в данной области, например, описанные у Harrison et al. в J. Pharm. Biomed. Anal. 2012, 63, 23-28. Антитела, проявляющие пониженное связывание или низкое сродство к человеческому Fcα- или Fcγ-рецептору в комбинации с терапевтическим антителом, являются особенно эффективными при клеточном разрушении раковых клеток за счет увеличения ADCC и/или ADCP эффекторных иммунных клеток. Как правило, Fc-область анти-SIRPα антитела по изобретению модифицируют для уменьшения связывания с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках.

Следовательно, анти-SIRPα антитело по изобретению содержит модифицированную Fc-область, которая проявляет пониженное связывание или низкое сродство к человеческому Fcα- или Fcγ-рецептору. Например, связывание IgG₁ с рецептором Fcγ может быть уменьшено путем замены одной или более аминокислот в IgG₁, выбранных из группы, состоящей из L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328 и P329 (нумерация Eu); связывание IgG₂ может быть уменьшено путем введения, например, одной или более из следующих аминокислотных замен: V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S; или H268Q, V309L, A330S и P331S (нумерация аналогична нумерации Eu в IgG₁) (Vafa et al. Methods 2014, 65, 114-126); связывание IgG₃ может быть уменьшено путем введения, например, аминокислотных замен L234A и L235A или аминокислотных замен L234A, L235A и P331S (Leoh et al. Mol. Immunol. 2015, 67, 407-415); и связывание IgG₄ может быть уменьшено путем введения, например, аминокислотных замен S228P, F234A и L235A (нумерация аналогична нумерации Eu в IgG₁) (Parekh et al. mAbs 2012, 4(3), 310-318). Связывание IgA с рецептором Fcα может быть уменьшено путем введения, например, одной или более аминокислотных замен L257R, P440A, A442R, F443R и P440R (последовательная нумерация, Pleass et al. J. Biol. Chem. 1999, 271(33), 23508-23514).

Предпочтительно, анти-SIRPα антитело по изобретению содержит модифицированную Fc-область, которая имеет пониженное связывание или низкое сродство к человеческому рецептору Fcγ. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область представляет собой Fc-область изотипа IgG. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область представляет собой Fc-область изотипа IgG₁, IgG₂ или IgG₄.

В предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело по изобретению содержит модифицированную человеческую Fc-область IgG₁, содержащую одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из: L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328 и P329 (нумерация Eu).

Предпочтительно, анти-SIRPα антитело содержит модифицированную Fc-область IgG₁, которая не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Более предпочтительно, анти-SIRPα антитело содержит модифицированную Fc-область IgG₁, которая не содержит аминокислотную замену N297.

В одном из вариантов осуществления модифицированная человеческая Fc-область IgG₁ содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, D270A, D270E, D270N, N297A, N297G, A327Q, P328A, P329A и P329G. Предпочтительно, одну или более аминокислотных замен выбирают из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, N297A, P328A, P329A и P329G.

В одном из вариантов осуществления модифицированная человеческая Fc-область IgG₁ содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, D270A, D270E, D270N, A327Q, P328A, P329A и P329G. Предпочтительно, одну или более аминокислотных замен выбирают из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, P328A, P329A и P329G. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG1 не содержит аминокислотную замену в положении N297.

В предпочтительном варианте осуществления модифицированная человеческая Fc-область IgG₁ содержит аминокислотные замены L234A и L235A, L234E и L235A, L234A, L235A и P329A или L234A, L235A и P329G. Предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG1 не содержит аминокислотную замену в положении N297.

В другом предпочтительном варианте осуществления анти-SIRPα антитело по изобретению содержит модифицированную человеческую Fc-область IgG₁, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A или L234E и L235A, предпочтительно аминокислотные замены L234A и L235A. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит аминокислотную замену в положении N297.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей анти-SIRPα антитело, описанное выше, и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. Типичные фармацевтические составы терапевтических белков, таких как антитела, имеют форму лиофилизированной массы (лиофилизированных порошков), которые перед внутривенной инфузией должны быть растворены (в водной среде) (т.е. восстановлены), или форму замороженных (водных) растворов, которые перед использованием необходимо оттаять.

Как правило, фармацевтическая композиция предоставлена в форме лиофилизированной массы. Фармацевтически приемлемые эксципиенты, подходящие в соответствии с настоящим изобретением для включения в фармацевтическую композицию (перед сублимационной сушкой), включают буферные растворы (например, соли в воде, содержащие цитрат, гистидин или сукцинат), лиопротекторы (например, сахарозу, трегалозу), модификаторы тоничности (например, хлорид натрия), поверхностно-активные вещества (например, полисорбат) и формообразующие агенты (например, маннит, глицин). Эксципиенты, используемые для лиофилизированных белковых композиций, выбирают по их способности предотвращать денатурацию белка в процессе лиофилизации, а также во время хранения.

Настоящее изобретение также относится к анти-SIRPα антителу или фармацевтической композиции, как описано выше, для применения в качестве лекарственного средства.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или фармацевтической композиции, как описано выше, для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека. Анти-SIRPα антитела по изобретению могут быть использованы для лечения солидных опухолей, таких как рак молочной железы, рак почки или меланома, или гематологических злокачественных новообразований, таких как острый миелолейкоз (ОМЛ).

Во втором варианте осуществления изобретение относится к анти-SIRPα антителу, содержащему Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках, для использования при лечении SIRPα-позитивных солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека. Предпочтительно Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на эффекторных иммунных клетках человека, имеет изотип IgA или IgG. Более предпочтительным является анти-SIRPα антитело, содержащее Fc-область изотипа IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄; изотип IgG₁, IgG₂ или IgG₄ является еще более предпочтительным. Наиболее предпочтительным для применения при лечении SIRPα-позитивных солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека является анти-SIRPα антитело, содержащее Fc-область изотипа IgG₁.

В третьем варианте осуществления настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или фармацевтической композиции, как описано выше, для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с одним или более другими видами противораковой терапии. Подходящими видами противораковой терапии являются хирургия, химиотерапия, лучевая терапия, гормональная терапия, таргетная терапия и иммунотерапия. Анти-SIRPα антитело или фармацевтическую композицию, как описано выше, можно использовать для одновременного или последовательного применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в сочетании с одним или более другими видами противораковой терапии. В частности, анти-SIRPα антитело или фармацевтическую композицию, как описано выше, можно использовать для лечения солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека после использования одного или более других видов противораковой терапии.

Предпочтительно, настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу или фармацевтической композиции, как описано выше, для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с одним или более другими противораковыми терапевтическими средствами. В частности, анти-SIRPα антитело или фармацевтическую композицию, как описано выше, можно использовать для лечения солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека после применения одного или более других противораковых терапевтических средств.

Подходящие противораковые терапевтические средства включают химиотерапию, лучевую терапию, гормональную терапию, таргетную терапию и иммунотерапевтические агенты. Подходящие химиотерапевтические средства включают алкилирующие агенты, такие как азотистые иприты, нитрозомочевины, тетразины и азиридины; анти-метаболиты, такие как антифолаты, фторпиримидины, аналоги дезоксинуклеозидов и тиопурины; антимикротрубочковые агенты, такие как алкалоиды барвинка и таксаны; ингибиторы топоизомеразы I и II; и цитотоксические антибиотики, такие как антрациклины и блеомицины.

Подходящие средства лучевой терапии включают радиоизотопы, такие как ¹³¹I-метайодбензилгуанидин (MIBG), ³²P в виде фосфата натрия, хлорид ²²³Ra, хлорид ⁸⁹Sr и тетраметиленфосфонат диамина ¹⁵³Sm (EDTMP).

Подходящие агенты для использования в качестве гормональной терапии включают ингибиторы синтеза гормонов, такие как ингибиторы ароматазы и аналоги GnRH; и антагонисты рецепторов гормонов, такие как селективные модуляторы рецепторов эстрогена и антиандрогены.

Терапевтические средства направленного действия - это терапевтические средства, которые влияют на специфические белки, участвующие в онкогенезе и пролиферации, и могут быть низкомолекулярными лекарственными средствами; белками, такими как терапевтические антитела; пептидами и производными пептидов; или гибридами белка с малыми молекулами, такими как конъюгаты антитело-лекарственное средство. Примеры низкомолекулярных лекарственных средств направленного действия включают ингибиторы mTor, такие как эверолимус, темсиролимус и рапамицин; ингибиторы киназы, такие как иматиниб, дазатиниб и нилотиниб; ингибиторы VEGF, такие как сорафениб и регорафениб; и ингибиторы EGFR/HER2, такие как гефитиниб, лапатиниб и эрлотиниб. Примеры терапевтических средств направленного действия на основе пептидов или производных пептидов включают ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб и карфилзомиб.

Иммунотерапевтические агенты включают агенты, которые индуцируют, усиливают или подавляют иммунный ответ, такие как цитокины (IL-2 и IFN-α); иммуномодулирующие препараты на основе имида, такие как талидомид, леналидомид и помалидомид; терапевтические противораковые вакцины, такие как талимоген лагерпарепвек; иммунотерапевтические агенты на основе клеток, такие как вакцины на основе дендритных клетках, адоптивных Т-клеток и модифицированных Т-клеток с химерными рецепторами антигена); и терапевтические антитела, которые могут запускать ADCC/ADCP или CDC через свою Fc-область при связывании с мембраносвязанными лигандами на раковой клетке.

Предпочтительно, изобретение относится к анти-SIRPα антителу или фармацевтической композиции, как описано выше, для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с одним или более другими противораковыми терапевтическими средствами, причем противораковое терапевтическое средство является терапевтическим агентом направленного действия или иммунотерапевтическим агентом. Предпочтительным терапевтическим агентом направленного действия в соответствии с изобретением является терапевтическое антитело или конъюгат антитело-лекарственное вещество (ADC). Наиболее предпочтительным терапевтическим агентом направленного действия является терапевтическое антитело.

Термин «терапевтическое антитело», используемый в настоящем описании, относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, как определено выше, которое является подходящим для терапии человека. Антитела, подходящие для терапии человека, имеют достаточное качество, безопасны и эффективны для лечения конкретных заболеваний человека. Качество можно оценивать с помощью установленных нормативов надлежащей практики; безопасность и эффективность, как правило, оценивают с помощью установленных нормативов регулирующих органов в сфере обращения лекарственных средств, например, Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) или Управления по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA). Такие нормативы хорошо известны в данной области.

Предпочтительно терапевтическое антитело представляет собой антитело, одобренное регулирующим органом в сфере обращения лекарственных средств, таким как EMA или FDA. Для определения, одобрено ли какое-либо антитело, можно воспользоваться онлайн-базой данных большинства регулирующих органов.

Термин «ADC», используемый в настоящем описании, относится к цитотоксическому лекарственному средству, конъюгированному посредством линкера с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, как определено выше. Как правило, цитотоксические лекарственные вещества являются сильнодействующими, например, дуокармицин, калихеамицин, димер пирролобензодиазепина (ПБД), майтансиноид или производное ауристатина. Линкер может быть расщепляемым, например содержащим расщепляемый дипептид валин-цитруллин (vc) или валин-аланин (va), или нерасщепляемым, например сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилатом (SMCC).

Как правило, терапевтическое антитело для применения в комбинации с анти-SIRPα антителом по изобретению представляет собой моноспецифическое или биспецифическое антитело или фрагмент антитела, содержащий по меньшей мере одну HCVR и LCVR, которая связывается с мишенью, выбранной из группы, состоящей из аннексина A1, B7H3, B7H4, CA6, CA9, CA15-3, CA19-9, CA27-29, CA125, CA242, CCR2, CCR5, CD2, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD56, CD70, CD74, CD79, CD115, CD123, CD138, CD203c, CD303, CD333, CEA, CEACAM, CLCA-1, CLL-1, c-MET, Cripto, CTLA-4, DLL3, EGFL, EGFR, EPCAM, EPh (например, EphA2 или EPhB3), рецептора эндотелина B (ETBR), FAP, FcRL5 (CD307), FGF, FGFR (например, FGFR3), FOLR1, GCC, GPNMB, HER2, HMW-MAA, интегрина α (например, αvβ3 и αvβ5), IGF1R, TM4SF1 (или антигена L6), Lewis A-подобного углевода, Lewis X, Lewis Y, LIV1, мезотелина, MUC1, MUC16, NaPi2b, Nectin-4, PD-1, PD-L1, PSMA, PTK7, SLC44A4, STEAP-1, антигена 5T4 (или TPBG, гликопротеин трофобласта), TF (тканевого фактора), антигена Томсена-Фриденрейха (TF-Ag), Tag72, TNF, TNFR, TROP2, VEGF, VEGFR и VLA.

Предпочтительным является моноспецифическое терапевтическое антитело. Более предпочтительным является антитело к мембраносвязанной мишени на поверхности опухолевых клеток.

Подходящие терапевтические антитела для применения в комбинации с анти-SIRPα антителом по изобретению включают алемтузумаб, бевацизумаб, цетуксимаб, панитумумаб, ритуксимаб и трастузумаб.

Подходящие ADC для применения в комбинации с анти-SIRPα антителом по изобретению включают трастузумаб эмтанзин и брентуксимаб ведотин.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к анти-SIRPα антителу, описанному выше, для указанного выше применения в комбинации с терапевтическим антителом к мембраносвязанной мишени на поверхности опухолевых клеток, которое содержит человеческую Fc-область, которая связывается с активирующим Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках.

Посредством связывания с этими активирующими Fc-рецепторами, описанными выше, терапевтическое антитело, содержащее человеческую Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках, может индуцировать ADCC и/или ADCP. Терапевтические антитела человеческого изотипа IgG, IgE или IgA содержат человеческую Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках.

Предпочтительным терапевтическим антителом для применения по изобретению является терапевтическое антитело изотипа IgG или IgA. Более предпочтительным является терапевтическое антитело изотипа IgG, такое как антитела IgG₁, IgG₂, IgG₃ и IgG₄. Еще более предпочтительным является терапевтическое антитело изотипа IgG₁ или IgG₂. Наиболее предпочтительным является терапевтическое антитело изотипа IgG₁.

Предпочтительно, настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-SIRPα антителу, содержащему CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:

а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 1, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 2;

b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 4;

c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;

d. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8;

e. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 10;

f. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 11, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 12;

g. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14;

h. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 15, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 16; и

i. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 17, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 18

для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с применением терапевтического антитела к мембраносвязанной мишени на поверхности опухолевых клеток, которое содержит человеческую Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках, причем анти-SIRPα антитело содержит модифицированную Fc-область, которая имеет пониженное связывание с человеческим рецептором Fcα или Fcγ по сравнению с тем же анти-SIRPα антителом, содержащим Fc-область дикого типа.

В предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с терапевтическим антителом содержит модифицированную человеческую Fc-область IgG₁, содержащую одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из: L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328 и P329 (нумерация Eu).

Предпочтительно гуманизированное анти-SIRPα антитело для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с терапевтическим антителом содержит модифицированную область Fc IgG₁, которая не содержит аминокислотной замены ни N297A, ни N297G. Более предпочтительно, анти-SIRPα антитело содержит модифицированную Fc-область IgG₁, которая не содержит аминокислотную замену N297.

В одном из вариантов осуществления модифицированная человеческая Fc-область IgG₁ содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, D270A, D270E, D270N, N297A, N297G, A327Q, P328A, P329A и P329G.

В другом варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с терапевтическим антителом содержит модифицированную Fc-область IgG₁, содержащую одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, D270A, D270E, D270N, A327Q, P328A, P329A и P329G. Предпочтительно, одну или более аминокислотных замен выбирают из группы, состоящей из L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, P328A, P329A и P329G. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит аминокислотную замену в положении N297.

В предпочтительном варианте осуществления модифицированная человеческая Fc-область IgG₁ содержит аминокислотные замены L234A и L235A, L234E и L235A, L234A, L235A и P329A или L234A, L235A и P329G. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит аминокислотную замену в положении N297.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с терапевтическим антителом содержит модифицированную человеческую Fc-область IgG₁, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A или L234E и L235A, предпочтительно аминокислотные замены L234A и L235A. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит аминокислотную замену в положении N297.

В предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для применения при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека в комбинации с использованием терапевтического антитела к мембраносвязанной мишени на поверхности опухолевых клеток, которое содержит человеческую Fc-область, которая связывается с активирующими Fc-рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках, включает Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, а также CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:

а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 4;

b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;

c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8;

d. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 10; и

e. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14.

Во втором предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, а также CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:

а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;

b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8; и

c. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14.

В третьем предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, а также CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:

а. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 8; и

b. аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 14.

В четвертом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, и

а. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 30, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 31;

b. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 32, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 33;

c. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 8;

d. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 35, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 36;

e. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 35, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 37;

f. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 38; или

g. аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 37.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 30 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 31. Более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит ни аминокислотную замену N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит аминокислотную замену в положении N297.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 32 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 33.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 34 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 8.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 35 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 36.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 35 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 37.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 13 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 38.

В другом предпочтительном варианте осуществления гуманизированное анти-SIRPα антитело для использования, как определено выше, содержит Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID NO: 13 и аминокислотную последовательность LCVR SEQ ID NO: 37.

Более предпочтительно, определенные выше гуманизированные анти-SIRPα антитела для использования, как определено выше, содержат Fc-область, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, причем модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит аминокислотную замену ни N297A, ни N297G. Еще более предпочтительно, модифицированная Fc-область IgG₁ не содержит аминокислотную замену в положении N297.

Анти-SIRPα антитела, содержащие модифицированную Fc-область, которая демонстрирует пониженное связывание с человеческим рецептором Fcα или Fcγ по сравнению с тем же анти-SIRPα антителом, содержащим Fc-область дикого типа, как описано выше, усиливают ADCC in vitro терапевтического антитела при использовании нейтрофилов в качестве эффекторных клеток от разных доноров, гомозиготных по SIRPα_BIT или SIRPα₁. Все эти антитела усиливают ADCC in vitro при использовании нейтрофилов большинства доноров, а предпочтительные антитела даже усиливают ADCC in vitro при использовании нейтрофилов, полученных от любого донора.

ПРИМЕРЫ

Протокол иммунизации и отбора

Кроликов повторно иммунизировали смесью пептидов, представляющих область внеклеточного домена человеческого (hu)SIRPα_BIT, человеческого (hu)SIRPα₁ и (cy)SIRPα яванского макака (cy). Забор крови осуществляли в разные моменты времени, которую обогащали лимфоцитами. Одиночные В-клетки помещали в отдельные лунки микротитровальных планшетов. Эти В-клетки культивировали в течение нескольких дней в присутствии кондиционированной среды и питающих клеток. В течение этого времени клетки продуцировали и высвобождали моноклональные антитела в среду культивирования (супернатанты B-клеток). Супернатанты этих отдельных B-клеток анализировали на продуцирование IgG; затем определяли специфическое связывание huSIRPα_BIT и huSIRPα₁, и cySIRPα с анти-Fc антителом. Подходящими супернатантами были те, которые связывались с обоими huSIRPα_BIT и huSIRPα₁ и с cySIRPα. После этапа отбора по лункам измеряли связывание с мышиным (mu)SIRPα и huSIRPβ_1v1, huSIRPβ_1v2 и huSIRPγ (в качестве анти-мишеней). Кроме того, определяли связывание с клетками СНО с повышенным уровнем экспрессии SIRPα_BIT и SIRPα₁. Связывание с родительскими клетками СНО использовали в анализе в качестве контроля.

Подходящие лизаты В-клеток отбирали для выделения РНК, обратной транскрипции и секвенирования. Уникальные вариабельные области легкой и тяжелой цепей антитела синтезировали и клонировали перед последовательностью константной области антитела (каппа LC с SEQ ID NO: 26 и человеческая HC-LALA IgG₁ в формате SEQ ID NO: 27), соответственно.

Клетки HEK 293 временно трансфицировали плазмидой, содержащей последовательность антитела, с использованием автоматизированной процедуры на платформе Tecan Freedom Evo. Иммуноглобулины очищали от клеточного супернатанта с помощью аффинной очистки (белок A) в системе ВЭЖХ Dionex Ultimate 3000 с автоматическим забором проб из планшета. Полученные антитела тестировали в анализах типа ELISA (ELISA: huSIRPα₁, huSIRPα_BIT, cySIRPα, muSIRPα, huSIRPβ_1v1/β_1v2/γ; анализы связывания клеток: huSIRPα₁, huSIRPα_BIT).

Временная экспрессия антител

а) Получение конструкций кДНК и векторов экспрессии

К каждой аминокислотной последовательности HCVR антител на N-конце присоединяли лидерную последовательность (SEQ ID NO: 28 для антител 1-9, 15, 16; SEQ ID NO: 39 для антител 10-14), а на С-конце присоединяли константный домен человеческого LALA HC IgG₁ с SEQ ID NO: 27. К каждой из аминокислотных последовательностей HCVR антител 12C4huIgG₁LALA, 12C4huIgG₁ и 29AM4-5huIgG₁LALA на N-конце присоединяли лидерную последовательность HAVT20 (SEQ ID NO: 29), а на C-конце присоединяли константный домен человеческой LALA HC IgG₁ с SEQ ID NO: 27 или человеческую HC IgG₁ дикого типа (SEQ ID NO: 25). Полученные химерные аминокислотные последовательности подвергали обратной трансляции в последовательность кДНК, оптимизированную по кодонам, для экспрессии в человеческих клетках (Homo sapiens). Аналогичным образом получали химерную последовательность кДНК для LC данной конструкции путем присоединения лидерной последовательности (SEQ ID NO:28 для антител 1-9, 12; SEQ ID NO:40 для антител 10, 11, 13-16, SEQ ID NO:29 для 12C4huIgG₁LALA, 12C4huIgG₁ и 29AM4-5huIgG₁LALA) к последовательностям LCVR антител 1-16, 12C4huIgG₁LALA и 12C4huIgG₁, и 29AM4-5huIgG₁LALA на N-конце, а на С-конце присоединяли константную область легкой цепи человеческого IgG (SEQ ID NO: 26). Последовательности HCVR и LCVR использовали в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1. Последовательности HCVR и LCVR антител и эталонных антител

Антитело HCVR LCVR 1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 3 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 4 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 5 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 6 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 7 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 8 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 9 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 29AM4-5huIgG₁LALA SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 12C4huIgG₁LALA SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22 12C4huIgG₁ SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22 KWAR23 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24 10 гуманизированное SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31 11 гуманизированное SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 12 гуманизированное SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:8 13 гуманизированное SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 14 гуманизированное SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:37 15 гуманизированное SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:38 16 гуманизированное SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:37

b) векторная конструкция и стратегия клонирования

Для экспрессии цепей антител использовали вектор экспрессии млекопитающих, который содержал экспрессионную кассету CMV:BGHpA. Конечные векторы, содержащие экспрессионную кассету либо HC, либо LC (CMV:HC:BGHpA и CMV:LC-BGHpA, соответственно), трансфицировали и размножали в клетках NEB 5-альфа E.coli. Крупномасштабное производство конечных векторов экспрессии для трансфекции осуществляли с помощью наборов Maxi- или Megaprep (Qiagen).

с) Временная экспрессия в клетках млекопитающих

Коммерчески доступные клетки Expi293F (Thermo Fisher) трансфицировали векторами экспрессии с использованием агента для трансфекции ExpiFectamine в соответствии с инструкциями производителя следующим образом: 75×10⁷ клеток высевали в 300 мл среды FortiCHO, 300 мкг вектора экспрессии объединяли с 800 мкл агента для трансфекции ExpiFectamine и добавляли в клетки. Через день после трансфекции к культуре добавляли 1,5 мл Enhancer 1 и 15 мл Enhancer 2. Через шесть дней после трансфекции супернатант клеточной культуры собирали центрифугированием при 4000 g в течение 15 минут и фильтровали осветленный сбор через фильтры PES bottle/MF 75 (Nalgene).

Связывание антител и специфичность

Эксперимент

ELISA-анализ: Каждый из растворов huSIRPα₁, huSIRPα_BIT, huSIRPβ_1v1, huSIRPβ_1v2, huSIRPγ и cySIRPα в фосфатно-солевом буфере (PBS) добавляли в многолуночный черный полистирольный планшет для ELISA и оставляли на 1 час при комнатной температуре для осуществления адгезии. Несвязанный белок удаляли трехэтапной промывкой стандартным промывочным буфером. Затем в лунки добавляли блокирующий буфер. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре лунки промывали три раза стандартным промывочным буфером. В лунки добавляли антитела в буфере в различных концентрациях и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Несвязанные антитела удаляли с помощью трехэтапной промывки стандартным промывочным буфером. Козий античеловеческий (Fab')₂ IgG, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP), в буфере добавляли в лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) и после развития окраски достаточной интенсивности добавляли HCl. Поглощение считывали при 450 нм/620 нм.

Анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR): Анализ сродства выполняли с помощью одноциклического кинетического анализа на приборе для поверхностного плазмонного резонанса (Biacore T200 system, GE Life Sciences) при 25°C. Биотинилированные антигены SIRP иммобилизовали на поверхность чипа, подходящего для биотинилированных молекул (Sensor Chip CAP, GE Life Sciences) путем инъецирования 5 мкг/мл антигена SIRP в рабочем буфере (10 мМ буфера HEPES при pH 7,4 с 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,005% об./об. полиоксиэтилен (20) сорбитанмонолаурата (сурфактант P20)) в течение 60 сек со скоростью 10 мкл/мин после инъецирования стрептавидинового конъюгата (20-кратный разбавленный реагент биотин-CAPture, GE Life Sciences) в течение 60 сек со скоростью 10 мкл/мин. Стабилизацию базовой линии устанавливали на 1 мин, после чего инъецировали пять увеличивающихся концентраций анти-SIRP антитела в рабочем буфере (10 мМ буфера HEPES при рН 7,4 с 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,005% об./об. полиоксиэтилен (20) сорбитанмонолаурата). Для каждого этапа использовали время ассоциации 150 секунд, а затем время диссоциации 1200 секунд только при самой высокой концентрации, все реакции выполняли при скорости потока 30 мкл/мин. Регенерацию осуществляли с помощью раствора, содержащего 6 М гуанидин-HCl, 0,25 М NaOH (60 сек при скорости потока 30 мкл/мин). Вычитание двойной холостой пробы выполняли на наблюдаемых сенсограммах, используя канал с потоком неиммобилизованного референсного анти-SIRP (холостая проба) и введением подвижного буфера. Сенсограммы подгоняли к модели Ленгмюра 1:1 для всех протестированных анти-SIRP антител. Кинетические параметры (k_a, k_d и KD) вычисляли с помощью программного обеспечения Biacore T200 (v3.1).

Проточная цитометрия: Клетки U937, эндогенно экспрессирующие человеческий антиген SIRPα_BIT, и клетки, полученные из несконструированного субклона, который был подвергнут скринингу и выделен из клеток яичника китайского хомячка CHO-S (ExpiCHO-S), экспрессирующих антиген человеческого SIRPα₁, SIRPα_BIT или cySIRPα (100000 клеток/лунку в 96-луночный планшет) трижды промывали охлажденным на льду буфером FACS (1xPBS (LONZA), содержащим 0,2% мас./об. BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) и 0,02% мас./об. NaN₃ (Sigma-Aldrich), с последующим добавлением каждого первичного mAb (50 мкл/лунку), разведенного в ледяном буфере FACS, в диапазоне концентраций. После инкубации в течение 30 мин при 4°С клетки трижды промывали охлажденным на льду буфером FACS и добавляли 50 мкл/лунку вторичного mAb (AffiniPure F(ab')₂-фрагмент антимышиного человеческого IgG-APC, разбавление 1:6000, Jackson Immuno Research). Через 30 мин при 4°С клетки дважды промывали и ресуспендировали в 150 мкл буфера FACS. Интенсивности флуоресценции определяли с помощью проточной цитометрии (BD FACSVerse, Franklin Lakes, NJ) и указывали в виде медианной интенсивности флуоресценции (MFI-Median) для клеток U937 и клеток ExpiCHO-S. Кривые подгоняли с помощью нелинейного регрессионного анализа, используя сигмоидальное уравнение доза-ответ с разным наклоном (четыре параметра) в GraphPad Prism (версия 7.02 для Windows, GraphPad, San Diego, CA). Значения EC₅₀ вычисляли в виде концентрации в мкг/мл, которая дает половинный ответ между нижней и верхней частями кривой при подгонке к 4-параметрической логистической кривой.

Результаты

Анализ ELISA: Значения ЕС₅₀ для связывания с huSIRPα₁, huSIRPα_BIT, huSIRPβ₁, huSIRPβ_1v2, huSIRPγ, cySIRPα, полученные методом ELISA для антител 1-9 и эталонных антител, суммированы в таблице 2. Все антитела связываются с huSIRPα₁ и huSIRPα_BIT. Антитела 29AM4-5huIgG₁LALA и 12C4huIgG₁LALA связываются с huSIRPβ_1v1, huSIRPβ_1v2 и huSIRPγ. Антитела 2-6, 8 и 9 демонстрируют низкое сродство к huSIRPβ_1v1 и к huSIRPγ. Антитело 7 связывается с huSIRPβ_1v1, но имеет низкое сродство к huSIRPβ_1v2 и huSIRPγ. Антитело 1 связывается с huSIRPβ_1v2 и huSIRPγ.

Таблица 2. Специфичность анти-SIRPα антител и эталонных антител

Антитело huSIRPα₁
EC₅₀ (нг/мл) huSIRPα_BIT
EC₅₀ (нг/мл) huSIRPß_1v1
EC₅₀ (нг/мл) huSIRPß_1v2
EC₅₀ (нг/мл) huSIRPγ
EC₅₀ (нг/мл) cySIRPα
EC₅₀ (нг/мл) 1 39 21 100000 58 43 305 2 33 27 100000 28 100000 38 3 15 24 100000 89 5216 36 4 53 25 100000 92 100000 99 5 31 21 3518 110 100000 123 6 21 20 100000 24 100000 33 7 23 20 14 100000 100000 335 8 19 20 100000 19 100000 26 9 23 26 100000 47 100000 30 29AM4-5* 9 9 13 17 34 11 12C4* 7 5 8 6 6 5

*huIgG₁LALA

Значения EC₅₀> 100000 указаны как 100000.

Анализ SPR: Значения K_D для связывания антител 4, 7, 10-14 с huSIRPα₁, huSIRPα_BIT и huSIRPγ в сравнении с эталонными антителами KWAR23, huIgG₁12C4LALA и SE5A5 (приобретенными у коммерческого поставщика) суммированы в таблице 3. Антитела 4, 7, 10-14 связываются как с huSIRPα₁, так и с huSIRPα_BIT и не связываются с huSIRPγ. Все эталонные антитела связываются с huSIRPγ.

Таблица 3. Данные SPR (кД в М)

Антитело K_D (huSIRPα_BIT) K_D (huSIRPα₁) K_D (huSIRPγ) KWAR23 мышиного IgG2a <1,0E–11¹ <1.0E–11 <1,0E–11 KWAR23 huIgG₁LALA <1,0E–11¹ 1,1E–11 <1,0E–11 12C4huIgG₁LALA 1,5E–11 8,7E–11 1,6E–11 SE5A5 2,6E–9 2,2E–9 4,9E–8 4 <1,0E–11 2,6E–11 N² 7 <1,0E–11 <1,0E–11 N 10 гуманизированное <1,0E–11 3,2E–9 N 11 гуманизированное 1,4E–10 4,1E–8 N 12 гуманизированное <1,0E–11 5,9E–11 N 13 гуманизированное 1,2E–11 <1,0E–11 N 14 гуманизированное 8,9E–11 <1,0E–11 N

¹<1,0E–11: K_D находится за пределами диапазона, что означает высокое сродство.

² N: Специфическое связывание не обнаружено

Проточная цитометрия: Связывание различных антител с huSIRPα₁, huSIRPα_BIT и/или cySIRPα, экспрессируемых клетками, определяли проточной цитометрией. Связывание указано в значениях EC₅₀, которые приведены в таблице 4. Антитела 2, 4, 5, 7, 8, 10-14 связываются с huSIRPα₁, huSIRPα_BIT и cySIRPα. Антитела 2, 4, 5, 7, 8, 10-14 связываются с cySIRPα в диапазоне низких значений, выраженных в мкг/мл.

Таблица 4. Данные проточной цитометрии

Антитело Клетки U937 (SIRPα_BIT)
EC₅₀ (мкг/мл) ExpiCHO–S (huSIRPα₁) EC₅₀ (мкг/мл) ExpiCHO–S (huSIRPα_BIT) EC₅₀ (мкг/мл) ExpiCHO–S (cySIRPα) EC₅₀ (мкг/мл) 1 – – – – 2 0,14 0,19 0,27 0,16 3 0,22 – – – 4 0,12 0,41 0,23 0,18 5 0,16 0,27 0,22 0,26 6 – – – – 7 0,17 0,23 0,21 0,07 8 0,12 0,22 0,18 0,15 9 0,11 – – – 29AM4–5 huIgG₁LALA 0,25 – – – 12C4huIgG₁LALA 0,19 – – – KWAR23 huIgG₁LALA 0,09 – – – 10 0,17 0,38 0,2 0,27 11 0,13 1,05 0,3 0,32 12 0,2 0,1 0,46 0,17 13 0,14 0,36 0,23 0,44 14 0,22 0,37 0,29 0,38 15 0,16 – – – 16 0,23 – – –

«-» - значение не определено

Блокирование антителами связыванием CD47-SIRPα

Эксперимент

Клетки CHO, трансфицированные либо SIRPα₁, либо SIRPα_BIT, либо родительские клетки CHO, использованные в качестве контроля, высевали в 20 мкл клеточной среды в лунки с прозрачным дном и инкубировали в течение ночи. Антитела 1-9, референсные антитела 29AM4-5huIgG₁LALA или 12C4huIgG₁LALA вместе со смесью His tag® CD47 и анти-His tag® антитела для детектирования флуоресценции добавляли в лунки и инкубировали в течение 2 часов. После инкубации клетки промывали буфером для промывки клеток. Флуоресценцию определяли с помощью системы для скрининга (CellInsight®, Thermo Scientific®) и определяли общую флуоресценцию на лунку.

Результаты

Антитела 29AM4-5huIgG₁LALA, 12C4huIgG₁LALA, 3 и 7 полностью блокируют связывание CD47 как с клетками CHO, экспрессирующими huSIRPα₁, так и клетками СНО, экспрессирующими huSIRPα_BIT, антитела 1, 2, 4-6, 8 и 9 не блокируют связывание CD47 ни с клетками CHO, экспрессирующими huSIRPα₁, ни с клетками СНО, экспрессирующим huSIRPα_BIT.

Анализ ADCC

Нейтрофилы доноров, гомозиготных по SIRPα₁ или SIRPα_BIT, выделяли и культивировали в соответствии с методом, описанным в Chao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347. ADCC определяли с помощью анализа высвобождения ⁵¹Cr или анализа цитотоксичности с помощью комплекса нерадиоактивный европий–TDA (EuTDA) (DELFIA, PerkinElmer). Клетки SKBR3 использовали в качестве клеток-мишеней и метили 100 мкКи ⁵¹Cr (Perkin-Elmer) в течение 90 мин при 37°С или бис(ацетоксиметил)2,2': 6',2"-терпиридин-6,6"-дикарбоксилатом (реагент BATDA Delfia) в течение 5 мин при 37°С. После 2 промывок PBS 5×10³ клеток-мишеней на лунку инкубировали в культуральной среде IMDM с добавлением 10% (об./об.) фетальной сыворотки теленка (FCS) в течение 4 часов при 37°C и 5% CO₂ в 96-луночном планшете с U-дном вместе с нейтрофилами в отношении эффектора к клетке-мишени 50:1 в присутствии соответствующих антител. После инкубации супернатант собирали и анализировали на радиоактивность в гамма-счетчике (Wallac) или добавляли к раствору европия (DELFIA, PerkinElmer) и определяли флуоресценцию комплекса европий-2,2':6',2"-терпиридин-6,6"-дикарбоновая кислота (EuTDA) с помощью спектрофлуориметра (Envision, PerkinElmer). Процент цитотоксичности вычисляли следующим образом: [(высвобождение в эксперименте - спонтанное высвобождение)/(общее высвобождение - спонтанное высвобождение)]х100%. Все условия измеряли в двух и/или в трех эксзмплярах.

Данные ADCC для 12C4huIgG₁LALA относительно 12C4IgG₁

На фиг. 1 показаны результаты анализа ADCC в виде цитотоксичности, выраженной в %. % цитотоксичности, измеренный для клеток SKBR3 с помощью нейтрофилов в качестве эффекторных клеток и одного трастузумаба, был меньше, чем % цитотоксичности трастузумаба в комбинации с мышиным антителом 12C4 (mu12C4). Трастузумаб в комбинации с антителом, в котором вариабельные области 12C4 привиты на константную область человеческого IgG₁ (12C4huIgG₁), имеет аналогичный % цитотоксичности по сравнению с одним только трастузумабом при низких концентрациях 12C4huIgG₁. При более высоких концентрациях 12C4huIgG₁ наблюдается снижение % цитотоксичности. Трастузумаб в комбинации с антителом, в котором вариабельные области 12C4 привиты на константную область человеческого IgG₁, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A (12C4huIgG₁LALA), демонстрируют повышенный % цитотоксичности по сравнению с % цитотоксичности одного трастузумаба и повышенный % цитотоксичности по сравнению с комбинацией 12C4huIgG₁ с трастузумабом.

Данные ADCC

На фиг. 2 приведено сравнение % ADCC с использованием человеческих нейтрофилов, относительно трастузумаба (установлен на 100%), в присутствии антитела 1-9, имеющего константную область человеческого IgG₁, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A (LALA), в комбинации с трастузумабом, по сравнению с 12C4huIgG₁LALA. B6H12IgG₁LALA, имеющий VR мышиного анти-CD47 антитела и константную область человеческого IgG₁, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A, и несущую среду (без трастузумаба), использовали в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно. Залитые квадраты, (■), являются значениями, измеренными с помощью нейтрофилов от доноров, имеющих вариант SIRPα_BIT (гомозиготных по SIRPα_BIT), незалитые круги, (○), являются значениями, измеренными с нейтрофилами от доноров, имеющих вариант SIRPα₁) (гомозиготных по SIRPα₁). Для всех антител среднее значение ADCC было выше по сравнению с таковым для одного трастузумаба. Для антител 1, 2, 4, 5, 7 и 8 среднее увеличение ADCC было даже больше, чем увеличение ADCC, вызванное 12C4huIgG₁LALA. При сравнении увеличения ADCC у каждого донора на каждое антитело, антитела 1, 3-6, 8 и 9 показали более низкое изменение в % увеличения ADCC, чем 12C4huIgG₁LALA.

На фиг.3 приведено сравнение % ADCC с использованием человеческих нейтрофилов в присутствии различных концентраций химерных антител 4 и 7 и гуманизированных антител 10 и 14, имеющих константную область человеческого IgG₁, содержащую аминокислотные замены L234A и L235A (LALA), в комбинации с трастузумабом, с одним трастузумабом и с комбинацией трастузумаба с 12C4huIgG₁LALA, взятом в различных концентрациях. Использовали нейтрофилы двух доноров, гомозиготных по SIRPα_BIT. Даже при низких концентрациях антитела 4, 7, 10 и 14 увеличивают ADCC. Увеличение ADCC зависит от концентрации.

На фиг. 4 приведено сравнение % ADCC с использованием человеческих нейтрофилов в присутствии антител 4, 7, 10, 13, 14, 15 и 16 в комбинации с трастузумабом (Tmab) с % ADCC одного трастузумаба и 12C4huIgG₁LALA. Все антитела увеличивают ADCC по сравнению с одним трастузумабом. Увеличение ADCC нейтрофилами большинства доноров в присутствии антител 4, 7, 10, 13, 14, 15 и 16 в комбинации с трастузумабом аналогично или превышает таковое по сравнению с комбинацией 12C4huIgG₁LALA с трастузумабом.

Списки последовательностей с подчеркнутыми аминокислотными последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3 в аминокислотных последовательностях вариабельных областей (VR) тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC) (определенные по методу Кабата).

SEQ ID NO:1 (HC VR 1)

1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGIDLSS YAMSWVRQAP GKGLEWIGII

51 SSGGITYYAS WAKGRFTISK TSTTVDLKIP SPTTEDTATY FCARSLWAAS

101 NYYMALWGPG TLVTVSS

SEQ ID NO:2 (LC VR 1)

1 AIKMTQTPAS VSAAVGGTVS INCQASEDIE SYLAWYQQKP GQPPKLLIYR

51 ASTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTISDLES ADAATYYCLG DYYSSSGDTG

101 AFGGGTEVVV K

SEQ ID NO:3 (HC VR 2)

1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSN YAMHWVRQAP GKGLEWIGII

51 YTGGATSYAT WAKGQFTISK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARGDRDGY

101 AYFNIWGPGT LVTVSL

SEQ ID NO:4 (LC VR 2)

1 QIVMTQTPFS VSAVVGGTVT IKCQASHNIG SWLAWYQQKP GQRPKLLIYD

51 ASTLASGVSS RFKGSGSGTE FTLTISGVES ADAATYYCQQ GYGISYVHNV

101 FGGGTEVVVK

SEQ ID NO:5 (HC VR 3)

1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLA CTVSGFSLIS YYISWVRQAP EKGLEYIGII

51 NIGGGASYAS WAKGRFTISK TSTTVDLKIT SPTPEDTATY FCAMSYGMDT

101 GAFNIWGPGT LVTVSL

SEQ ID NO:6 (LC VR 3)

1 AQVLTQTPAS VSAAVGGTVT ISCQSSESVY KNNFLSWYQQ KPGKPPKLLI

51 YGASTLASGV PSRFKGSGSG TQFTLTISDL ESDDAATYFC QGGYRTDIYP

101 FGGGTEVVVK

SEQ ID NO:7 (HC VR 4)

1 QSVEESGGRL GTPGTPLTLT CTVSGFSLSS YVMGWFRQAP GKGLEYIGII

51 SSSGSPYYAS WVNGRFTISK TSTTMDLKMN SPTTEDTATY FCARVGPLGV

101 DYFNIWGPGT LVTVSL

SEQ ID NO:8 (LC VR 4)

1 DIVMTQTPSS VEAAVGGTVT IKCQAGQSIN SYLAWYQQKP GQRPKLLIYY

51 ASTLESGVPS RFKGSGSGTD YTLTISDLES ADAATYYCQS WHYISRSYAF

101 GGGTEVVVK

SEQ ID NO:9 (HC VR 5)

1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSS YVMGWFRQAA GKGLEYIGYI

51 NADGSPYYAT WVNGRFTISK TPTTMDLKIN SPTTEDTATY FCARVGPLGV

101 DYFNIWGPGT LVTVSL

SEQ ID NO:10 (LC VR 5)

1 DIVMTQTPAS VEAAVGGTVT IKCQASQSIN RYLTWYQQKP GQRPKLLIYY

51 ASTLESGVPS RFEGSGSGTD YTLTISDLES ADAATYYCQS YYYISRTYAF

101 GGGTEV VVK

SEQ ID NO:11 (HC VR 6)

1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGIDLSS YTMTWVRQAP GKGLEWIGII

51 YAGGSTAYAS WAKGRFTISK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARSSSDGY

101 DYFNIWGPGT LVTVS L

SEQ ID NO:12 (LC VR 6)

1 GVVMTQTPSS VSAAVGGTVT INCQASQSIG SWLAWYQQKP GQPPKLLIYQ

51 ASKLASGVPS RFSGRGSGTH FTLTISDVQS DDAATYYCQQ TVTAASNVDNA

101 FGGGTEVVVK

SEQ ID NO:13 (HC VR 7)

1 RSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSS HGISWVRQAP GKGLEYIGTI

51 GTGVITYFAS WAKGRFTGSK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARGSAWND

101 PFDPWGPGTL VTVSS

SEQ ID NO:14 (LC VR 7)

1 ALVMTQTPAS VSAAVGGTVT TKCQASQSVY GNNDLAWYQH KPGQPPKLLI

51 YLASTLATGV PSRFSGSGSG TQFTLTITGV QSDDAATYYC LGGGDDEADN

101 VFGGGTEVVV K

SEQ ID NO:15 (HC VR 8)

1 QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGVDLSN YAMGWVRQAP GKGLEWIGII

51 YAGGSTSYAT WAKGRFTISK TSTTMDLKMT SPTTEDTATY FCARHRSDGY

101 DYFHLWGPGT LVTVSL

SEQ ID NO:16 (LC VR 8)

1 AIDMTQTPAS VSEPVGGTVT IKCQASQSIS SWLAWYQQKP GQRPKLLIYD

51 ASKLASGVPS RFSGSGSGTE FTLTISGVQS DDAAAYYCQQ GYAVSYVENI

101 FGGGTEVVVK

SEQ ID NO:17 (HC VR 9)

1 QSMEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSN YGVSWVRQAP GKGLEWIGII

51 YGGSDITAYA SWAKGRFTIS KTSTTVDLTI TSPTTEDTAT YFCAKSYTNG

101 MDYYNIWGPG TLVTVSL

SEQ ID NO:18 (LC VR 9)

1 AFDLTQTPSS VEAPVGGTVI IKCQASQSIS SYLAWYQQKP GQPPKLLIYS

51 ASTLASGVSS RFKGSGSETQ FPLTISDLES ADAATYYCQS YYGSRSNVFG

101 GGTEVVVK

SEQ ID NO:19 (HC VR 29AM4-5)

1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIS YYFIHWVRQA PGKGLEWVAS

51 VYSSFGYTYY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCARFT

101 FPGLFDGFFG AYLGSLDYWG QGTLVTVSS

SEQ ID NO:20 (LC VR 29AM4-5)

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSVS SAVAWYQQKP GKAPKLLIYS

51 ASSLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ AVNWVGALVT

101 FGQGTKVEIK

SEQ ID NO:21 (HC VR 12C4)

1 EVKLEESGGG LMQPGGSMKL SCVASGFTFS NYWMNWVRQS PEKGLEWVAE

51 IRLKSNNYAT HYAESVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRA EDTGIYYCIR

101 DYDYDAYFDY WGQGTTLTVS S

SEQ ID NO:22 (LC VR 12C4)

1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSGYNYMYWY QQKPGQPPKL

51 LIYLASNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSGELPY

101 TFGGGTKLEI K

SEQ ID NO:23 (HC VR KWAR23)

1 EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DYYIHWVQQR TEQGLEWIGR

51 IDPEDGETKY APKFQDKATI TADTSSNTAY LHLSSLTSED TAVYYCARWG

101 AYWGQGTLVT VSS

SEQ ID NO:24 (LC VR KWAR23)

1 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT LTCSASSSVS SSYLYWYQQK PGSSPKLWIY

51 STSNLASGVP ARFSGSGSGT SYSLTISSME AEDAASYFCH QWSSYPRTFG

101 AGTKLELK

SEQ ID NO:25 (константная область HC антитела человеческого IgG₁)

1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP

101 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS

151 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK

201 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC

251 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW

301 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO:26 (константная область κ LC антитела человеческого IgG₁)

1 RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG

51 NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK

101 SFNRGEC

SEQ ID NO:27 (мутантный вариант LALA константной области HC антитела человеческого IgG₁) (мутации подчеркнуты underlined)

1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP

101 KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS

151 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK

201 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC

251 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW

301 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO:28 (лидерная последовательность HC 1-9, 15+16, LC 1-9+12)

1 MGWSCIILFL VATATGVHS

SEQ ID NO:29 (лидерная последовательность HAVT20)

MACPGFLWAL VISTCLEFSMA

SEQ ID NO:30 (HC VR 10)

1 KVEESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFSLSSY VMGWVRQAPG KGLEWVSIIS

51 SSGSPYYASW VNGRFTISKD NSEGMVYLQM NSLRAEDTAV YYCARVGPLG

101 VDYFNIWGQG TTVTVSS

SEQ ID NO:31 (LC VR 10)

1 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCQAGQSIN SYLAWYQQKP GQPPKLLIYY

51 ASTLESGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQA EDVAVYYCQS WHYISRSYAF

101 GGGTKLEIK

SEQ ID NO:32 (HC VR 11)

1 EVKVEESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSLS SYVMGWVRQA PGKGLEWVSI

51 ISSSGSPYYA SWVNGRFTIS KTSTTMDLQM NSLRAEDTAV YYCARVGPLG

101 VDYFNIWGQG TTVTVSS

SEQ ID NO:33 (LC VR 11)

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQAGQSIN SYLAWYQQKP GKVPKLLIYY

51 ASTLESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQS WHYISRSYAF

101 GQGTKVEIK

SEQ ID NO:34 (HC VR 12)

1 VQLVESGGRL VQPGTPLTLS CTVSGFSLSS YVMGWFRQAP GKGLEYIGII

51 SSSGSPYYAS WVNGRFTISK TSTTMDLKMN SLRSEDTATY FCARVGPLGV

101 DYFNIWGPGT LVTVSS

SEQ ID NO:35 (HC VR 13+14)

1 RQLVESGGGL VQPGGSLRLS CTASGFSLSS HGISWVRQAP GKGLEYIGTI

51 GTGVITYFAS WAKGRFTGSK TSSTAYMELS SLRSEDTAVY FCARGSAWND

101 PFDPWGQGTL VTVSS

SEQ ID NO:36 (LC VR 13)

1 AIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQSVY GNNDLAWYQQ KPGKAPKLLI

51 YLASTLATGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC LGGGDDEADN

101 VFGGGTKVEI K

SEQ ID NO:37 (LC VR 14+16)

1 DIEMTQSPSS VSASVGDRVT LTCQASQSVY GNNDLAWYQQ KPGQAPKLLI

51 YLASTLATGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC LGGGDDEADN

101 VFGGGTKVEI K

SEQ ID NO:38 (LC VR 15)

1 ELVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQSVY GNNDLAWYQQ KPGEAPKLLI

51 YLASTLATGV PSRFSGSGSG TDFTLTISGL QSEDFATYYC LGGGDDEADN

101 VFGQGTKVEI K

SEQ ID NO:39 (лидерная последовательность тяжелых цепей 10-14)

1 MGWTLVFLFL LSVTAGVHS

SEQ ID NO:40 (лидерная последовательность легких цепей 10, 11, 13-16)

1 MVSSAQFLGL LLLCFQGTRC

--->

СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Synthon Biopharmaceuticals B.V.

VERHEIJDEN Gijsbertus Franciscus Maria

ROUWENDAL Gerard Johan Adolph

ARENDS Roland Jan

BERG, VAN DEN Timo Kars

MATLUNG Hanke Lottie

SZILAGYI Katarina

<120> АНТИ-SIRPальфа АНТИТЕЛА С МУТАЦИЕЙ LALA

<130> P1703PC00/PB-078

<140> PCT/EP2018/062473

<141> 2018-05-15

<160> 40

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:1 (HC VR 1)

<400> 1

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Pro

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu

85 90 95

Trp Ala Ala Ser Asn Tyr Tyr Met Ala Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:2 (LC VR 1)

<400> 2

Ala Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Ser Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Asp Tyr Tyr Ser Ser Ser

85 90 95

Gly Asp Thr Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:3 (HC VR 2)

<400> 3

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala

20 25 30

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Tyr Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Gln Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp

85 90 95

Arg Asp Gly Tyr Ala Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Leu

115

<210> 4

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:4 (LC VR 2)

<400> 4

Gln Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Val Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser His Asn Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ser

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ile Ser Tyr

85 90 95

Val His Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:5 (HC VR 3)

<400> 5

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Ala Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Asn Ile Gly Gly Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Met Ser Tyr

85 90 95

Gly Met Asp Thr Gly Ala Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Leu

115

<210> 6

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:6 (LC VR 3)

<400> 6

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Lys Asn

20 25 30

Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu

65 70 75 80

Glu Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gly Gly Tyr Arg Thr

85 90 95

Asp Ile Tyr Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:7 (HC VR 4)

<400> 7

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Gly Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val

20 25 30

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met Asn

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly

85 90 95

Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Leu

115

<210> 8

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:8 (LC VR 4)

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Gly Gln Ser Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp His Tyr Ile Ser Arg

85 90 95

Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105

<210> 9

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:9 (HC VR 5)

<400> 9

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val

20 25 30

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Ala Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Asn Ala Asp Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Pro Thr Thr Met Asp Leu Lys Ile Asn

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly

85 90 95

Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Leu

115

<210> 10

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:10 (LC VR 5)

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Arg Tyr

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Glu Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ile Ser Arg

85 90 95

Thr Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105

<210> 11

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:11 (HC VR 6)

<400> 11

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Ser Tyr Thr

20 25 30

Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ser

85 90 95

Ser Asp Gly Tyr Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Leu

115

<210> 12

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:12 (LC VR 6)

<400> 12

Gly Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Ser

65 70 75 80

Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Val Thr Ala Ala Ser

85 90 95

Asn Val Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:13 (HC VR 7)

<400> 13

Arg Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Gly

20 25 30

Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Thr Ile Gly Thr Gly Val Ile Thr Tyr Phe Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ser

85 90 95

Ala Trp Asn Asp Pro Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:14 (LC VR 7)

<400> 14

Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Thr Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn

20 25 30

Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val

65 70 75 80

Gln Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Gly Asp Asp

85 90 95

Glu Ala Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:15 (HC VR 8)

<400> 15

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Val Asp Leu Ser Asn Tyr Ala

20 25 30

Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg His Arg

85 90 95

Ser Asp Gly Tyr Asp Tyr Phe His Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Leu

115

<210> 16

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:16 (LC VR 8)

<400> 16

Ala Ile Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ser

65 70 75 80

Asp Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ala Val Ser Tyr

85 90 95

Val Glu Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:17 (HC VR 9)

<400> 17

Gln Ser Met Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Gly

20 25 30

Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Tyr Gly Gly Ser Asp Ile Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Thr Ile

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Lys Ser

85 90 95

Tyr Thr Asn Gly Met Asp Tyr Tyr Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Leu

115

<210> 18

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:18 (LC VR 9)

<400> 18

Ala Phe Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Pro Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Ile Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Glu Thr Gln Phe Pro Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Gly Ser Arg Ser

85 90 95

Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105

<210> 19

<211> 129

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:19 (HC VR 29AM4-5))

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Val Tyr Ser Ser Phe Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Thr Phe Pro Gly Leu Phe Asp Gly Phe Phe Gly Ala Tyr

100 105 110

Leu Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 20

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:20 (LC VR 29AM4-5)

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Val Asn Trp Val Gly

85 90 95

Ala Leu Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:21 (HC VR 12C4)

<400> 21

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ile Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:22 (LC VR 12C4)

<400> 22

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gly

85 90 95

Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 23

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:23 (HC KWAR23 )

<400> 23

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 24

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:24 (LC VR KWAR23)

<400> 24

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 25

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO 25: (константная область HC человеческого антитела IgG1)

<400> 25

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 26

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO 26: (константная область LC человеческого антитела IgG)

<400> 26

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 27

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO 27: (мутантный вариант LALA константной области HC

человеческого антитела IgG1

(мутации подчеркнуты)

<400> 27

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 28

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:28 (лидерная последовательность антител 1-9)

<400> 28

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 29

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:29 (HAVT20 лидерная последовательность)

<400> 29

Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu

1 5 10 15

Glu Phe Ser Met Ala

20

<210> 30

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:30 (HC10

<400> 30

Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

1 5 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val Met

20 25 30

Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ile

35 40 45

Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly Arg

50 55 60

Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Glu Gly Met Val Tyr Leu Gln Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val

85 90 95

Gly Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:31 (LC 10)

<400> 31

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Gln Ala Gly Gln Ser Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp His Tyr Ile Ser Arg

85 90 95

Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 32

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:32 (HC VR 11)

<400> 32

Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Gln Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val

85 90 95

Gly Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:33 (LC VR 11)

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Gly Gln Ser Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp His Tyr Ile Ser Arg

85 90 95

Ser Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 34

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:34 (HC VR 12)

<400> 34

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val

20 25 30

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly

85 90 95

Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:34 (HC VR 12)

<400> 35

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val

20 25 30

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly

85 90 95

Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:36 (LC VR 13)

<400> 36

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn

20 25 30

Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Gly Asp Asp

85 90 95

Glu Ala Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 37

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:37 (LC VR 14 +16)

<400> 37

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn

20 25 30

Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Gly Asp Asp

85 90 95

Glu Ala Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 38

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:38 (LC VR 15)

<400> 38

Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn

20 25 30

Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Gly Asp Asp

85 90 95

Glu Ala Asp Asn Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 39

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:39 (лидерная последовательность тяжелых цепей 10-14)

<400> 39

Met Gly Trp Thr Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 40

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:40 (лидерная последовательность легких цепей 10, 11, 13-16)

<400> 40

Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln

1 5 10 15

Gly Thr Arg Cys

20

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты анти–SIRPα антитела, которые подходят для применения в противораковой терапии. Изобретение также относится к применению анти–SIRPα антител при лечении солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований у человека, необязательно в комбинации с другими противораковыми терапевтическими агентами. Предложенные анти–SIRPα антитела проявляют высокое сродство к SIRPα₁ и SIRPα_BIT и при этом не связываются с SIRPγ, что обеспечивает преимущества при применении антител в противораковой терапии. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл.

1. Анти–SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее определяющие комплементарность области (CDR) вариабельных областей (VR) тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC), выбранные из группы, состоящей из:

а) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области HC, приведенных в SEQ ID NO: 3, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области LC, приведенных в SEQ ID NO: 4;

b) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области HC, приведенных в SEQ ID NO: 5, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, приведенных в SEQ ID NO: 6;

c) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области HC, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области LC, приведенных в SEQ ID NO: 8;

d) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области HC, приведенных в SEQ ID NO: 9, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области LC, приведенных в SEQ ID NO: 10;

e) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области HC, приведенных в SEQ ID NO: 11, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области LC, приведенных в SEQ ID NO: 12;

f) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области HC, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области LC, приведенных в SEQ ID NO: 14;

g) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области HC, приведенных в SEQ ID NO: 15, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области LC, приведенных в SEQ ID NO: 16; и

h) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области HC, приведенных в SEQ ID NO: 17, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области LC, приведенных в SEQ ID NO: 18;

причем CDR определены согласно нумерации Кабат.

2. Анти–SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, которое является химерным, гуманизированным или человеческим.

3. Анти–SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, содержащее CDR HCVR и LCVR, выбранные из группы, состоящей из:

а) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области HC, приведенных в SEQ ID NO: 7, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области LC, приведенных в SEQ ID NO: 8; и

b) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области HC, приведенных в SEQ ID NO: 13, и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области LC, приведенных в SEQ ID NO: 14;

причем антитело является гуманизированным.

4. Анти–SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, содержащее:

а) аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 30, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 31;

b) аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 32, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 33;

c) аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 34, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 8;

d) аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 35, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 36;

e) аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO: 35, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO: 37;

f) аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO:13, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO:38; или

g) аминокислотную последовательность HCVR, приведенную в SEQ ID NO:13, и аминокислотную последовательность LCVR, приведенную в SEQ ID NO:37.

5. Анти–SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1–4, содержащее модифицированную Fc–область, которая имеет пониженное связывание с человеческим рецептором Fcα или Fcγ по сравнению с тем же анти–SIRPα антителом, содержащим Fc–область дикого типа.

6. Анти–SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 5, содержащее модифицированную человеческую Fc–область IgG₁, содержащую одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из: L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328 и P329 согласно нумерации Eu.

7. Анти–SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 6, содержащее аминокислотные замены L234A и L235A, L234E и L235A, L234A, L235A и P329A или L234A, L235A и P329G.

8. Анти–SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, содержащее аминокислотные замены L234A и L235A или L234E и L235A.

9. Фармацевтическая композиция для лечения солидных опухолей или гематологических злокачественных новообразований у человека, содержащая анти–SIRPα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1–8 и один или более фармацевтически приемлемых наполнителей.

10. Применение анти–SIRPα антитела по любому из пп. 1–8 или фармацевтической композиции по п. 9 для лечения рака.

11. Применение анти–SIRPα антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8 или фармацевтической композиции по п. 9 для получения лекарственного средства для лечения солидных опухолей или гематологических злокачественных новообразований у человека.

12. Применение комбинации анти–SIRPα антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8 или фармацевтической композиции по п. 9 с одним или более другими противораковыми терапевтическими средствами для получения лекарственного средства для лечения солидных опухолей или гематологических злокачественных новообразований у человека.

13. Применение по п. 12, в котором одно или более из других противораковых терапевтических средств представляют собой терапевтические средства направленного действия или иммунотерапевтические агенты.

14. Применение по п. 13, в котором терапевтическое средство направленного действия представляет собой терапевтическое антитело или конъюгат антитело–лекарственное вещество.

15. Применение по п. 14, в котором терапевтическое антитело представляет собой терапевтическое антитело к мембраносвязанной мишени на поверхности опухолевых клеток, которое содержит человеческую Fc–область, которая связывается с активирующими Fc–рецепторами, присутствующими на человеческих иммунных эффекторных клетках.