СЕНСИБИЛИЗАТОР ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО РАЗРУШЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2022 года по МПК C07D257/08 A61K31/395 A61K41/00 A61P35/00 

Изобретение относится к фармацевтической химии и онкологии, а именно к соединениям для фотодинамического разрушения злокачественных клеток.

Известен сенсибилизатор для фотодинамического разрушения клеток злокачественных новообразований [RU 2071320 C1, МПК (1995.01) A61K31/40, С09В47/00 (1995.01), опубл. 10.01.1997], который представляет собой сульфированный тетрафенилтетрабензопорфин общей формулы С₆₀Н₃₈N₄O₁₂S₄, оказывающий терапевтический эффект при облучении криптоновым лазером с длиной волны 675 нм в течение 15 минут.

Известен фотосенсибилизатор [RU 2411943 C2, МПК (2006.01) A61K31/409, A61K9/10, A61N5/067, A61P35/00, C07D487/22, B82B1/00, опубл. 20.10.2010], представляющий собой наноструктурированную водную дисперсию на основе производного бактериохлорина p, который представляет собой метиловый эфир O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p C₃₈H₄₆N₆O₆. Наноструктурированная водная дисперсия представляет собой липосомальную дисперсию на основе лецитина и холестерина, а метиловый эфир O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р включен в липидный бислой липосом. Терапевтический эффект реализуется при облучении патологического участка оптическим излучением в спектральном диапазоне 790-810 нм.

Известен фотосенсибилизатор для лечения онкологических заболеваний, который содержит соль хлорин е6, N-метил-D-глюкамином (меглумин) и L-лизин в мольных соотношениях 1:2:1 [RU 2646477 C1, МПК (2006.01) A61K31/40, A61K41/00, A61P35/00, A61P31/04, опубл. 05.03.2018], проявляющий активность под воздействием лазера с длиной волны 662 нм.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для фотодинамического разрушения опухолевых клеток.

В качестве сенсибилизатора для фотодинамического разрушения опухолевых клеток предлагается 1-(1-(4-нитрофенил)этил)-2,4,6-трифенил-1,4-дигидро-1,2,4,5-тетразин-3(2H)-он со структурной формулой:

На фиг. 1 показана жизнеспособность опухолевых клеток после фотодинамического воздействия в присутствии фотосенсибилизатора.

Для получения предложенного сенсибилизатора в двугорлую круглодонную колбу объемом 100 мл внесли 76 мг обескислороженной суспензии порошка меди и 86 мг бромида меди (I) в 30 мл бензола, а затем добавили 125 мкл N,N,N′,N′′,N′′-пентаметилдиэтилентриамина. К полученной смеси добавили обескислороженный раствор, полученный растворением 327 мг 1,3,5-трифенилвердазильного радикала и 276 мг 1-(1-бромоэтил)-4-нитробензола в 20 мл бензола.

Полученную реакционную массу кипятили 8 часов с обратным холодильником Димрота в атмосфере аргона, который подавали из линии Шленка. После охлаждения на воздухе до комнатной температуры полученную реакционную массу пропустили через 3 см слоя силикагеля, а затем силикагель дополнительно промыли 15 мл бензола для полного переноса продукта в маточник. Полученный маточный раствор упарили в вакууме в круглодонной колбе с помощью ротационного испарителя до 3-4 мл итогового раствора. После этого в колбу с концентрированным раствором добавили 50 мл гексана для осаждения продукта. Выпавший продукт отфильтровали на фильтре Шотта, присоединенного к колбе Бунзена под абсолютным давлением 800 мбар, промыли гексаном 100 мл и сушили на воздухе в темноте.

В результате получили продукт массой 382 мг (что составило 80% от теоретического выхода), который представляет собой кристаллическое вещество бледно-желтого цвета с формулой C₂₈H₂₃N₅O_3.

Оценку фотосенсибилизирующих свойств заявляемого соединения проводили по уровню жизнеспособности опухолевой клеточной культуры при световом воздействии с длиной волны 395-410 нм.

В качестве тестовой клеточной линии использовали опухолевую культуру клеток MCF-7 (адгезивная линия рака молочной железы человека). Клетки засевали в 96-луночный планшет в концентрации 5000 клеток в лунке в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и смеси антибиотиков (пенициллин 50 ед/мл и стрептомицин 50 мкг/мл). Далее клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°С в среде 5% углекислого газа. После адгезии клеток и микроскопического подтверждения жизнеспособности культуры, клетки использовали для оценки фотосенсибилизирующих свойств. Для этого готовили серию из 6 полных питательных сред DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, смеси антибиотиков (пенициллин 50 ед/мл и стрептомицин 50 мкг/мл) и предложенного сенсибилизатора. Концентрация сенсибилизатора в среде была 50, 25, 12, 6, 3 и 1,5 мкг/мл.

Питательную среду в лунках заменили на приготовленные среды, содержащие сенсибилизатор в соответствующих концентрациях. В качестве контрольной группы использовали лунки с опухолевыми клетками, в которых среду меняли на среду, не содержащую сенсибилизатор. После этого планшет подвергали световому воздействию в течение 20 минут. Источник излучения: светодиодная матрица, состоящая из 5 столбцов по 7 светодиодов в столбце с расстояниями между диодами 18 мм в рядах и столбцах, сила света каждого диода 1 Кд, диапазон излучения 395-410 нм. Расстояние от светодиода до лунки с опухолевыми клетками – 2 см. После облучения планшеты помещали в СО₂ инкубатор при 37°С в среде 5% углекислого газа на 48 часов. Далее проводили оценку жизнеспособности опухолевых клеток с помощью МТТ-теста.

Для МТТ-теста из каждой лунки удаляли питательную среду и вносили 100 мкл раствора MTT-реагента (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) в питательной среде, затем планшеты помещали в СО₂ инкубатор при 37°С на 4 часа. После этого из планшетов снова удаляли среду, и в каждую лунку для растворения образовавшихся кристаллов формазана было добавлено по 100 мкл диметилсульфоксида. После этого проводили оценку оптической плотности образцов с помощью микропланшетного ридера (MULTISCAN FC) при длине волны 570 нм.

Жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле:

жизнеспособность, % = ((ОП_обр – ОП_пуст)/(ОП_контр – ОП_пуст)) ⋅ 100,

где ОП_обр – средняя оптическая плотность образцов с внесенным сенсибилизатором;

ОП_пуст – средняя оптическая плотность среды без опухолевых клеток;

ОП_контр – средняя оптическая плотность опухолевых клеток, не подвергавшихся воздействию сенсибилизатора.

Результаты определения уровня жизнеспособности культуры клеток MCF-7 после фотодинамического воздействия с использованием предложенного сенсибилизатора и контрольной группы представлены на фиг. 1.

Наблюдается дозозависимое снижение жизнеспособности опухолевых клеток при воздействии облучения в присутствии сенсибилизатора. Процент жизнеспособных клеток после фотодинамического воздействия с сенсибилизатором в концентрациях 50-1,5 мкг/мл статистически значимо ниже уровня контроля (p<0,001).

Изобретение относится к фармацевтической химии и онкологии, а именно к соединению для фотодинамического разрушения злокачественных опухолевых клеток. Предложен сенсибилизатор для фотодинамического разрушения опухолевых клеток, который представляет собой 1-(1-(4-нитрофенил)этил)-2,4,6-трифенил-1,4-дигидро-1,2,4,5-тетразин-3(2H)-он со структурной формулой:

Технический результат заключается в расширении арсенала средств для фотодинамического разрушения злокачественных опухолевых клеток. 1 ил.

Сенсибилизатор для фотодинамического разрушения опухолевых клеток, отличающийся тем, что он представляет собой 1-(1-(4-нитрофенил)этил)-2,4,6-трифенил-1,4-дигидро-1,2,4,5-тетразин-3(2H)-он со структурной формулой: