ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявке США № 62/051885, поданной 17 сентября 2014 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДОСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОЙ ФОРМЕ
[0002] Официальная копия списка последовательностей предоставлена в электронной форме через EFS-Web в качестве списка последовательностей в формате ASCII в файле под названием "3005.WO Gene Sequence Listing.txt", созданном 10 сентября 2015 года и имеющем размер 488 килобайт, и она подана одновременно с описанием. Список последовательностей, содержащийся в этом документе в формате ASCII, является частью описания и включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Настоящее изобретение относится, главным образом, к слитым белкам, содержащим нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus. Также изобретение относится к рекомбинантным представителям семейства Bacillus cereus, экспрессирующим такие слитые белки, к составам, содержащим рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, к семенам, покрытым рекомбинантными представителями семейства Bacillus cereus, и к способам применения рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus (например, для стимуляции роста растения, защиты растения от патогенов, повышения устойчивости растений к стрессовым воздействиям, иммобилизации споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растении, стимуляции прорастания семян растения и доставки нуклеиновых кислот в растения). Кроме того, изобретение относится к рекомбинантным представителям семейства Bacillus cereus, которые сверхэкспрессируют протеазу или нуклеазу, где сверхэкспрессия протеазы или нуклеазы частично или полностью инактивирует споры представителя семейства Bacillus cereus или повышает чувствительность спор к физической или химической инактивации. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным представителям семейства Bacillus cereus, которые сверхэкспрессируют белки экзоспория, к семенам, покрытым такими рекомбинантными представителями семейства Bacillus cereus, и к способам применения таких рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus (например, для стимуляции роста растения, повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям и защиты растений от патогенов).
[0004] Кроме того, изобретение относится к различным модификациям рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитые белки, включающим: (i) сверхэкспрессию белков-модуляторов, которые модулируют экспрессию слитого белка в рекомбинантных представителях Bacillus cereus; (ii) генетическую инактивацию рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus; и (iii) мутации или другие генетические изменения рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые позволяют сбор фрагментов экзоспория, содержащих слитый белок. Также изобретение относится к различным способам применения фрагментов экзоспория.
[0005] Кроме того, изобретение относится к слитым белкам, содержащим белок оболочки споры и представляющий интерес белок или пептид, к рекомбинантным бактериям, которые экспрессируют такие слитые белки, к семенам, покрытым такими рекомбинантными бактериями, и к способам применения таких рекомбинантных бактерий (например, для стимуляции роста растений, защиты растений от патогенов, повышения устойчивости растений к стрессовым воздействиям, иммобилизации рекомбинантной бактериальной споры на растении, стимуляции прорастания семян растений и доставки нуклеиновых кислот в растения).
[0006] Кроме того, настоящее изобретение относится к биологически чистым бактериальным культурам новых штаммов бактерий.
[0007] Кроме того, настоящее изобретение относится к семенам растений, покрытым ферментом, который катализирует образование оксида азота, или супероксиддисмутазой, или рекомбинантной спорообразующей бактерией, которая сверхэкспрессирует фермент, который катализирует образование оксида азота, или супероксиддисмутазу.
[0008] Также изобретение относится к способам доставки полезных бактерий и ферментов или вакцин животным и к другим способам применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0009] В зоне, окружающей корни растения, находится область, называемая ризосферой. В ризосфере бактерии, грибы и другие организмы конкурируют за питательные вещества и за связывание с корневыми структурами растения. Ризосферу могут оккупировать как вредоносные, так и полезные бактерии и грибы. На бактерии, грибы и корневую систему растения может влиять действие пептидов, ферментов и других белков в ризосфере. Дополнение почвы или обработка растений некоторыми из этих пептидов, ферментов или других белков, может оказывать благоприятные эффекты на общую популяцию полезных почвенных бактерий и грибов, создавать в целом более здоровую почвенную среду для роста растений, улучшать рост растений и обеспечивать защиту растений от определенных бактериальных и грибных патогенов. Однако предшествующим попыткам внести пептиды, ферменты и другие белки в почву для индукции таких полезных эффектов на растения препятствовал низкий срок существования ферментов, белков и пептидов в почве. Кроме того, распространенность протеаз, естественным образом присутствующих в почве, приводит к деградации белков в почве. Среда вокруг корней растения (ризосфера) является уникальной смесью бактерий, грибов, питательных веществ и корней, которая имеет качества, отличные от нативной почвы. Симбиотическая взаимосвязь между этими организмами является уникальной и может быть изменена к лучшему путем включения экзогенных белков. Высокая концентрация грибов и бактерий в ризосфере вызывает еще большую деградацию белков вследствие аномально высоких уровней протеаз и других элементов, вредоносных для белков в почве. Кроме того, ферменты и другие белки, внесенные в почву, могут быстро вымываться из корней растений.
[0010] Таким образом, в данной области существует потребность в способе эффективной доставки пептидов, ферментов и других белков в растения (например, в корневые системы растений) и в продлении периода времени, в течение которого такие молекулы остаются активными. Более того, в данной области существует потребность в способе селективного нацеливания таких пептидов, ферментов и белков в ризосферу и, в частности, в листья растений и в корни растений.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Признаки настоящего изобретения определены в прилагаемой формуле изобретения и в перечне вариантов осуществления, предоставленном ниже в разделе под названием "ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ". Другие задачи и признаки станут отчасти очевидными и отчасти описаны ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0012] На фиг.1A и 1B представлено выравнивание аминокислотной последовательности N-концевой части BclA Bacillus anthracis штамма Sterne с соответствующей областью из различных белков экзоспория представителей семейства Bacillus cereus.
[0013] На фиг.2 представлены иллюстративные результаты флуоресцентной микроскопии для экспрессии слитых белков, содержащих различные белки экзоспория, связанные с репортером mCherry, на экзоспории рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[0014] На фиг.3 представлены данные, демонстрирующие споры рекомбинантных Bacillus thuringiensis BT013A, экспрессирующие слитый белок, содержащий ДНК-связывающий белок.
[0015] На фиг.4 представлена фотография, полученная с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, демонстрирующая фрагменты экзоспория и споры представителя семейства Bacillus cereus, которые утратили экзоспорий, полученные с использованием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, имеющего нокаут его гена CotE.
[0016] На фиг.5 представлена фотография геля SDS-PAGE, демонстрирующая стандартный белковый маркер (дорожка 1) и белки фрагментов экзоспория, полученные с использованием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, имеющего мутацию с нокаутом его гена CotE (дорожка 2).
[0017] На фиг.6 представлены данные, иллюстрирующие ферментативную активность кислой фосфатазы во фрагментах экзоспория, полученных из представителя семейства Bacillus cereus, имеющего мутацию с нокаутом его гена CotE.
[0018] На фиг.7 представлены данные, иллюстрирующие, что представитель семейства Bacillus cereus EE349 снижает ингибиторные эффекты гербицида на длину корня чечевицы.
[0019] На фиг.8 представлены данные, иллюстрирующие увеличенную фосфатазную активность представителя семейства Bacillus cereus, модифицированного для сверхэкспрессии кислой фосфатазы (AcpC).
[0020] На фиг.9 представлены данные, демонстрирующие активность эндоклюканазы в рекомбинантных спорах Bacillus thuringiensis, экспрессирующих слитый белок CotC-эндоклюканаза.
[0021] На фиг.10 представлены изображения светлопольной и флуоресцентной микроскопии, демонстрирующие обнаружение РНК на поверхности рекомбинантных спор B. thuringiensis, экспрессирующих слитый белок, содержащий аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1 и SspC, связанный либо с одноцепочечной РНК (оцРНК), либо с двухцепочечной РНК (дцРНК).
[0022] На фиг.11 представлена фотография, демонстрирующая эффекты микроРНК MIR319 на высоту и развитие корней сои после ее доставки в растения сои с использованием рекомбинантных спор B. thuringiensis, экспрессирующих слитый белок, содержащий аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1 и SspC, связанный с MIR319.
[0023] На фиг.12 представлены изображения светлопольной и флуоресцентной микроскопии, демонстрирующие обнаружение GFP и mCherry в кишечнике нематод, которых кормили нормальным бактериальным кормом E. coli OP50 (две правые панели), или нематод, которых кормили спорами B. thuringiensis, экспрессирующими слитый белок, содержащий аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1 и либо GFP, либо или mCherry (три левые панели).
[0024] На фиг.13 представлены изображения флуоресцентной микроскопии, демонстрирующие обнаружение эндофитных бактерий, выделенных из растений кукурузы, обработанных Bacillus thuringiensis EE-B00184, экспрессирующими слитый белок, содержащий аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1 и GFP. Стрелками обозначены отдельные споры.
[0025] На фиг.14 представлена фотография, демонстрирующая флуоресценцию бактериальных колоний, содержащих рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, экспрессирующие слитый белок, содержащий аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1 и GFP, выделенные из растений кукурузы, выращенных из семян, покрытых рекомбинантными бактериями.
[0026] На фиг.15 представлены фотографии, полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, демонстрирующие: (A) интактные споры Bacillus thuringiensis BT013A, окруженные прикрепленным к ним экзоспорием; (B) споры штамма Bacillus thuringiensis BT013A с нокаутом CotE с открепленным экзоспорием; и (C) очищенный препарат фрагментов экзоспория, происходящих из штамма Bacillus thuringiensis BT013A с нокаутом CotE.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0027] Когда в настоящем описании используют форму единственного числа, "один" и "указанный", они означают "по меньшей мере один" или "один или несколько", если нет иных указаний.
[0028] Термины "приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель" и "носитель" используют в настоящем описании взаимозаменяемо.
[0029] Термин "животное" охватывает любое не являющееся человеком животное, а также людей. Например, когда в настоящем описании используют термин "животное", животное может представлять собой млекопитающее (например, человек, овца, коза, корова, свинья, олень, альпака, бизон, верблюд, осел, лошадь, мул, лама, кролик, собака или кошка), птицу (например, курица, индейка, утка, гусь, перепел или фазан), рыбу (например, лосось, форель, тиляпия, тунец, сом или кар) или ракообразное (например, мелкая креветка, крупная креветка, лобстер, краб или рак).
[0030] "Биологически чистая бактериальная культура" относится к культуре бактерий, не содержащей других видов бактерий в количествах, достаточных для препятствования репликации культуры или для обнаружения обычными бактериологическими способами. Иными словами, она представляет собой культуру, где практически все присутствующие бактериальные клетки относятся к определенному штамму.
[0031] Термины "содержащий", "включающий" и "имеющий" являются инклюзивными и означают, что могут присутствовать дополнительные элементы, отличные от перечисленных элементов.
[0032] Термин "биологически активный пептид" относится к любому пептиду, который демонстрирует биологическую активность. "Биологически активные пептиды" можно получать, например, посредством расщепления белка, пептида, пробелка или препробелка протеазой или пептидазой.
[0033] Термин "эффективное количество" относится к количеству, которое является достаточным для статистически значимого увеличения роста, и/или выхода белка, и/или выхода зерна у растения по сравнению с ростом, выходом белка и выходом зерна растения, подвергнутого контрольной обработке.
[0034] "Фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений," включает любой фермент, который катализирует любую стадию биологического пути синтеза соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения, или любой фермент, который катализирует конвертирование неактивного или менее активного производного соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения, в активную или более активную форму соединения. Такие соединения включают, например, но не ограничиваются ими, низкомолекулярные гормоны растений, такие как ауксины и цитокинины, биологически активные пептиды и низкомолекулярные соединения, стимулирующие рост растений, синтезируемые бактериями или грибами в ризосфере (например, 2,3-бутандиол).
[0035] Термин "слитый белок", как используют в рамках изобретения, относится к белку, имеющему полипептидную последовательность, которая содержит последовательности, происходящие из двух или более отдельных белков. Слитый белок можно получать путем связывания молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует весь первый полипептид или его часть, с молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует весь второй полипептид или его часть, с получением последовательности нуклеиновой кислоты, которая при экспрессии обеспечивает один полипептид, имеющий функциональные свойства, происходящие из каждого из исходных белков.
[0036] Термин "уровень прорастания", как используют в рамках изобретения, относится к количеству семян, которые прорастают в течение конкретного периода времени. Например, уровень прорастания 85% указывает на то, что 85 из 100 семян проросли в течение данного периода времени.
[0037] Термин "инактивировать" или "инактивация", как используют в рамках изобретения в отношении инактивации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантной спорообразующей бактерии, означает, что споры неспособны прорастать, или что споры могут прорастать, но являются поврежденными, так что прорастание не приводит к живой бактерии. Термины "частично инактивировать" или "частичная инактивация" означают, что некоторый процент спор является инактивированным, но некоторые споры сохраняют способность к прорастанию и возврату в живое реплицирующееся состояние. Термин "генетическая инактивация" относится к инактиации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантной спорообразующей бактерии посредством мутации ДНК спор, которая приводит к полной или частичной инактивации споры. Термины "физическая инактивация" и "химическая инактивация относятся к инактивации спор с использованием любых физических или химических средств, например, посредством термической обработки, облучения гамма-излучением, облучения рентгеновским излучением, облучения УФ-A, облучения УФ-B или обработки растворителем, таким как глутаральдегид, формальдегид, пероксид водорода, уксусная кислота, отбеливатель, хлороформ или фенол, или любой их комбинации.
[0038] Термины "иммобилизация споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растении" и "иммобилизация споры рекомбинантной спорообразующей бактерии на растении" относится к связыванию споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или споры рекомбинантной спорообразующей бактерии с растением, например, с корнем растения или с надземной частью растения, такой как лист, стебель, цветок или плод, так чтобы спора оставалась в корневой структуре растения или надземной части, а не переходила в среду для роста растения или в среду, окружающую надземные части растения.
[0039] Термин "инокулят", как описано в настоящем описании, определен в нескольких нормах федерального или штатного права как (1) "инокуляты почвы или растений включают любой носитель или культуру конкретного микроорганизма или смесь микроорганизмов, предоставляемые для улучшения почвы или роста, качества или выхода растений, а также включают любое семя или удобрение, предоставляемые для инокуляции с такой культурой" (New York State 10-A Consolidated Law); (2) "вещества, отличные от удобрений, производимые, продаваемые или предоставляемые для применения для улучшения физического состояния почвы или для способствования росту растений или выходу культуры" (Canada Fertilizers Act); (3) "состав, содержащий чистые или заданные смеси живых бактерий, грибов или вирусных частиц, для обработки семян, проростков или другого материала размножения растений для повышения способности к росту или устойчивости к заболеваниям или иного изменения свойств конечных растений или культуры" (Ad hoc European Working Group, 1997) или (4) "любое химическое или биологическое вещество смеси веществ, или устройство, распространяемые в данном штате для нанесения на почву, растения или семена, для целей коррекции почвы; или которые предназначены для улучшения прорастания, роста, качества, выхода, качества продукта, репродукции, вкуса или других желаемых характеристик растений, или которые предназначены для обеспечения какого-либо химического, биохимического, биологического или физического изменения почвы" (Section 14513, California Food and Agriculture Code).
[0040] "Белок-модулятор" включает любой белок, который при сверхэкспрессии в представителе семейства Bacillus cereus, экспрессирующем любой из слитых белков, описанных в настоящем описании, модулирует экспрессию слитого белка, так что экспрессия слитого белка увеличивается или снижается по сравнению с экспрессией слитого белка в представителе семейства Bacillus cereus, который не сверхэкспрессирует белок-модулятор.
[0041] "Среда для роста растений" включает любой материал, который способен поддерживать рост растений.
[0042] "Белок или пептид, усиливающий иммунную систему растений", как используют в рамках изобретения, включает любой белок или пептид, который имеет благоприятный эффект на иммунную систему растений.
[0043] Термин "белок или пептид, стимулирующий рост растений", как используют в рамках изобретения, включает любой белок или пептид, который увеличивает рост растения, подвергнутого воздействию белка или пептида.
[0044] Термин "пробиотик", как используют в рамках изобретения, относится к микроорганизмам (например, бактериям), которые обеспечивают пользу для здоровья при употреблении животным или введении животному.
[0045] Термины "ускорение роста растения" и "стимуляция роста растения" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к способности усиливать или увеличивать по меньшей мере одно из высоты, массы, размера листьев, размера корней или размера стебля растения, повышать выход белка из растения или повышать выход зерна из растения.
[0046] "Белок или пептид, который защищает растение от патогена", как используют в рамках изобретения, включает любой белок или пептид, который делает растение, подвергнутое воздействию белка или пептида, менее чувствительным к инфекции патогеном.
[0047] "Белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям", как используют в рамках изобретения, включает любой белок или пептид, который делает растение, подвергнутое воздействию белка или пептида, более устойчивым к стрессовым воздействиям.
[0048] Термин "связывающийся с растением белок или пептид" относится к любому пептиду или белку, способному специфически или неспецифически связываться с любой частью растения (например, корни или надземные части растения, такие как листья, стебли, цветки или плоды) или с материалом растения.
[0049] Термин "пиретриназа" относится к любому ферменту, который деградирует пиретрин или пиретроид.
[0050] Термин "ризосфера" используют взаимозаменяемо с термином "корневая зона" для обозначения сегмента почвы, который окружает корни растения и подвержен их влиянию.
[0051] Термин "нацеливающая последовательность", как используют в рамках изобретения, относится к полипептидной последовательности, которая, когда она присутствует в качестве части более длинного полипептида или белка, приводит к локализации более длинного полипептида или белка в конкретной субклеточной области. Нацеливающие последовательности, описанные в настоящем описании, приводят к локализации белков в экзоспории представителя семейства Bacillus cereus.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Слитые белки для экспрессии в представителях семейства Bacillus cereus и рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus , экспрессирующие такие слитые белки
[0052] Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus, и по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид. При экспрессии в бактериях представителей семейства Bacillus cereus эти слитые белки нацеливаются на слой экзоспория споры и физически ориентируются так, чтобы представляющий интерес белок или пептид экспонировался снаружи споры.
[0053] Эту систему дисплея в экзоспории Bacillus (BEMD) можно использовать для доставки пептидов, ферментов и других белков в растения (например, в листья, плоды, цветки, стебли или корни растения) или в среду для роста растения, такую как почва. Пептиды, ферменты и белки, доставляемые в почву или другую среду для роста растения таким образом, сохраняются и демонстрируют активность в почве в течение длительных периодов времени. Введение рекомбинантных бактерий-представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих слитые белки, описанные в настоящем описании, в почву или ризосферу растения, приводит к благоприятному усилению роста растения во многих различных условиях почвы. Использование BEMD для получения этих ферментов позволяет им продолжать демонстрировать их благоприятные эффекты на растение и ризосферу на протяжении первых месяцев жизни растения.
A. Нацеливающие последовательности, белки экзоспория и фрагменты белков экзоспория для нацеливания представляющих интерес белков или пептидов в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus
[0054] Для простоты отсылки, описание аминокислотных последовательностей для нацеливающих последовательностей, белков экзоспория и фрагментов белков экзоспория, которые можно использовать для нацеливания представляющих интерес белков или пептидов в экзоспорий представителей семейства Bacillus cereus, представлены в таблице 1 вместе с их SEQ ID NO.
Таблица 1. Пептидные и белковые последовательности, использованные для нацеливания представляющих интерес белков или пептидов в экзоспорий представителей семейства Bacillus cereus
(B. thuringiensis str. Al Hakam)
а.к.=аминокислоты
* BclA штамма B. anthracis Sterne имеет 100% идентичность последовательности с BclA B. thuringiensis. Таким образом, SEQ ID NO: 1, 2 и 95 также соответствуют аминокислотам 1-41 BclA B. thuringiensis, полноразмерному BclA B. thuringiensis и аминокислотам 1-196 BclA B. thuringiensis, соответственно. Аналогично, SEQ ID NO: 96 также соответствует остатку метионина плюс аминокислоты 20-35 BclA B. thuringiensis.
** Гипотетический белок TIGR03720 B. mycoides обладает 100% идентичностью последовательности с гипотетическим белком WP003189234 B. mycoides. Таким образом, SEQ ID NO: 57 и 58 также соответствуют аминокислотам 1-136 гипотетического белка WP003189234 B. mycoides и полноразмерному гипотетическому белку WP003189234 B. mycoides, соответственно.
[0055] Bacillus представляет собой род палочковидных бактерий. Семейство бактерий Bacillus cereus включает любой вид Bacillus, который способен продуцировать экзоспорий. Таким образом, семейство бактерий Bacillus cereus включает вид Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis и Bacillus toyoiensis. В стрессовых условиях внешней среды бактерии семейства Bacillus cereus претерпевают споруляцию и формируют овальные эндоспоры, которые могут оставаться в покоящемся состоянии в течение длительных периодов времени. Наружный слой эндоспор известен как экзоспорий и содержит базальный слой, окруженный внешним пушком из волосоподобных выступов. Нити на волосоподобном пушке в основном образованы коллаген-подобным гликопротеином BclA, в то время как базальный слой состоит из ряда различных белков. Также в экзоспории присутствует другой родственный коллагену белок, BclB, и он экспонируется на эндоспорах представителей семейства Bacillus cereus. Было показано, что BclA, основной компонент поверхностного пушка, связан с экзоспорием его аминоконцом (N-концом), располагающимся в базальном слое, и его карбоксиконец (C-конец) выступает из споры наружу.
[0056] Ранее было открыто, что определенные последовательности N-концевых областей BclA и BclB можно использовать для нацеливания пептида или белка в экзоспорий эндоспорыa Bacillus cereus (см. публикации патентных заявок США № 2010/0233124 и 2011/0281316, и Thompson et al., Targeting of the BclA and BclB proteins to the Bacillus anthracis spore surface, Molecular Microbiology 70(2):421-34 (2008)). Также было обнаружено, что белок BetA/BAS3290 Bacillus anthracis локализуется в экзоспории.
[0057] В частности, было обнаружено, что аминокислоты 20-35 BclA из штамма Bacillus anthracis Sterne являются достаточными для нацеливания в экзоспорий. Выравнивание последовательностей аминокислот 1-41 BclA (SEQ ID NO: 1) с соответствующими N-концевыми областями нескольких других белков экзоспория семейства Bacillus cereus и белков семейства Bacillus cereus, имеющих родственные последовательности, представлено на фиг.1A и 1B. Как можно видеть из фиг.1A и 1B, существует область высокой гомологии среди всех белков в области, соответствующей аминокислотам 20-41 BclA. Однако в этих последовательностях аминокислоты, соответствующие аминокислотам 36-41 BclA, содержат вторичную структуру и не являются необходимыми для локализации слитого белка в экзоспории. Консервативная область нацеливающей последовательности BclA (аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1) представлена полужирным шрифтом на фиг.1A и 1B и соответствует минимальной нацеливающей последовательности, требуемой для локализации в экзоспории. Более высококонсервативная область, охватывающая аминокислоты 25-35 BclA в нацеливающей последовательности, подчеркнута в последовательностях на фиг.1A и 1B, и она представляет собой последовательность распознавания для ExsFA/BxpB/ExsFB и гомологов, которая направляет и собирает описанные белки на поверхности экзоспория. Аминокислотные последовательности SEQ ID NO. 3, 5 и 7 на фиг.1A представляют собой аминокислоты 1-33 BetA/BAS3290 штамма Bacillus anthracis Sterne, метионин с последующими аминокислотами 2-43 BAS4623 штамма Bacillus anthracis Sterne, и аминокислоты 1-34 BclB штамма Bacillus anthracis Sterne, соответственно (для BAS4623 было обнаружено, что замена валина, находящегося в положении 1 нативного белка, на метионин приводит к лучшей экспрессии). Как можно видеть из фиг.1A, каждая из этих последовательностей содержит консервативную область, соответствующую аминокислотам 20-35 BclA (SEQ ID NO: 1; показаны полужирным шрифтом), и более высококонсервативную область, соответствующую аминокислотам 20-35 BclA (подчеркнуты).
[0058] Дополнительные белки представителей семейства Bacillus cereus также содержат консервативную нацеливающую область. В частности, на фиг.1A и 1B SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислоты 1-30 BAS1882 штамма Bacillus anthracis Sterne, SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислоты 1-39 продукта гена 2280 Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислоты 1-39 продукта гена 3572 Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID NO: 15 представляет собой аминокислоты 1-49 лидерного пептида экзоспория Bacillus cereus VD200, SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислоты 1-33 лидерного пептида экзоспория Bacillus cereus VD166, SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислоты 1-39 гипотетического белка IKG_04663 Bacillus cereus VD200, SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислоты 1-39 β-пропеллерного белка YVTN Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID NO: 23 представляет собой аминокислоты 1-30 гипотетического белка bcerkbab4_2363 Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID NO: 25 представляет собой аминокислоты 1-30 гипотетического белка bcerkbab4_2131 Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID NO: 27 представляет собой аминокислоты 1-36 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, Bacillus weihenstephensis KBAB4, SEQ ID NO: 29 представляет собой аминокислоты 1-39 гипотетического белка bmyco0001_21660 Bacillus mycoides 2048, SEQ ID NO: 31 представляет собой аминокислоты 1-30 гипотетического белка bmyc0001_22540 Bacillus mycoides 2048, SEQ ID NO: 33 представляет собой аминокислоты 1-21 гипотетического белка bmyc0001_21510 Bacillus mycoides 2048, SEQ ID NO: 35 представляет собой аминокислоты 1-22 белка коллагена с трехспиральными повторами Bacillus thuringiensis 35646, SEQ ID NO: 43 представляет собой аминокислоты 1-35 гипотетического белка WP_69652 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 45 представляет собой аминокислоты 1-41 лидерной последовательности экзоспория WP016117717 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 47 представляет собой аминокислоты 1-49 пептида экзоспория WP002105192 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 49 представляет собой аминокислоты 1-38 гипотетического белка WP87353 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 51 представляет собой аминокислоты 1-39 пептида экзоспория 02112369 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 53 представляет собой аминокислоты 1-39 белка экзоспория WP016099770 Bacillus cereus, SEQ ID NO: 55 представляет собой аминокислоты 1-36 гипотетического белка YP006612525 Bacillus thuringiensis, SEQ ID NO: 57 представляет собой аминокислоты 1-136 гипотетического белка TIGR03720 Bacillus mycoides, SEQ ID NO: 59 представляет собой аминокислоты 1-36 белка коллагена с доменом трехспиральных повторов B. cereus ATCC 10987, SEQ ID NO: 61 представляет собой аминокислоты 1-39 коллаген-подобного белка B. cereus E33L, SEQ ID NO: 63 представляет собой аминокислоты 1-41 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. weihenstephanensis KBAB4, SEQ ID NO: 65 представляет собой аминокислоты 1-30 гипотетического белка BALH_2230 B. thuringiensis штамма Al Hakam, SEQ ID NO: 67 представляет собой аминокислоты 1-33 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, SEQ ID NO: 69 представляет собой аминокислоты 1-44 трехспирального повтора коллагена B. cereus, SEQ ID NO: 71 представляет собой аминокислоты 1-38 коллагена, содержащего трехспиральные повторы B. cereus ATCC 14579, SEQ ID NO: 73 представляет собой аминокислоты 1-30 гипотетического белка BCZK1835 B. cereus E33L, SEQ ID NO: 75 представляет собой аминокислоты 1-48 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. weihenstephanensis KBAB4, SEQ ID NO: 77 представляет собой аминокислоты 1-30 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, SEQ ID NO: 79 представляет собой аминокислоты 1-39 гипотетического белка BC4725 B. cereus ATCC 14579, SEQ ID NO: 81 представляет собой аминокислоты 1-44 гипотетического белка BCZK4476 B. cereus E33L, SEQ ID NO: 83 представляет собой аминокислоты 1-40 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. anthracis штамма "Ames Ancestor", SEQ ID NO: 85 представляет собой аминокислоты 1-34 белка BclA B. thuringiensis серовара konkukian штамма 97-27, SEQ ID NO: 87 представляет собой аминокислоты 1-34 консервативного гипотетического белка B. cereus ATCC 10987, SEQ ID NO: 89 представляет собой аминокислоты 1-34 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, SEQ ID NO: 91 представляет собой аминокислоты 1-99 неполной последовательности лидерного пептида экзоспория B. cereus, и SEQ ID NO: 93 представляет собой аминокислоты 1-136 гипотетического белка ER45_27600 B. weihenstephanensis. Как показано на фиг.1A и 1B, каждая из N-концевых областей этих белков содержит область, которая является консервативной с аминокислотами 20-35 BclA (SEQ ID NO: 1), и более консервативную область, соответствующую аминокислотам 25-35 BclA.
[0059] Любую часть BclA, которая включает аминокислоты 20-35, можно использовать для нацеливания слитого белка в экзоспорий. Кроме того, для нацеливания слитых белков в экзоспорий можно использовать полноразмерные белки экзоспория или фрагменты белков экзоспория. Таким образом, для нацеливания в экзоспорий можно использовать полноразмерный BclA или фрагмент BclA, который включает аминокислоты 20-35. Например, для нацеливания слитых белков в экзоспорий можно использовать полноразмерный BclA (SEQ ID NO: 2) или фрагмент BclA средних размеров, который лишен С-конца, такой как SEQ ID NO: 95 (аминокислоты 1-196 BclA). Фрагменты среднего размера, такие как фрагмент SEQ ID NO: 95, имеют меньшую вторичную структуру, чем полноразмерный BclA, и было обнаружено, что они пригодны для применения в качестве нацеливающей последовательности. Нацеливающая последовательность также может содержать значительно более короткие части BclA, которые включают аминокислоты 20-35, такие как SEQ ID NO: 1 (аминокислоты 1-41 BclA), аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1, аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 96 (остаток метионина, связанный с аминокислотами 20-35 BclA). Даже более короткие фрагменты BclA, которые включают только некоторые из аминокислот 20-35, также демонстрируют способность к нацеливанию слитых белков в экзоспорий. Например, нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 22-31 SEQ ID NO: 1, аминокислоты 22-33 SEQ ID NO: 1 или аминокислоты 20-31 SEQ ID NO: 1.
[0060] Альтернативно любая часть BetA/BAS3290, BAS4623, BclB, BAS1882, продукта гена 2280 KBAB4, продукта гена 3572 KBAB4, лидерного пептида экзоспория B. cereus VD200, лидерного пептида экзоспория B. cereus VD166, гипотетического белка IKG_04663 B. cereus VD200, β-пропеллерного белка YVTN B. weihenstephensis KBAB4, гипотетического белка bcerkbab4_2363 B. weihenstephensis KBAB4, гипотетического белка bcerkbab4_2131 B. weihenstephensis KBAB4, коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. weihenstephensis KBAB4, гипотетического белка bmyco0001_21660 B. mycoides 2048, гипотетического белка bmyc0001_22540 B. mycoides 2048, гипотетического белка bmyc0001_21510 B. mycoides 2048, белка коллагена с трехспиральными повторами B. thuringiensis 35646, гипотетического белка WP_69652 B. cereus, лидерной последовательности экзоспория WP016117717 B. cereus, пептида экзоспория пептид WP002105192 B. cereus, гипотетического белка WP87353 B. cereus, пептида экзоспория 02112369 B. cereus, белка экзоспория WP016099770 B. cereus, гипотетического белка YP006612525 B. thuringiensis, гипотетического белка TIGR03720 B. mycoides, белка коллагена с доменом трехспиральных повторов B. cereus ATCC 10987, коллаген-подобного белка B. cereus E33L, коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. weihenstephanensis KBAB4, гипотетического белка BALH_2230 B. thuringiensis штамма Al Hakam, коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, трехспиральных повторов коллагена B. cereus, коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, гипотетического белка BCZK1835 B. cereus E33L, коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. weihenstephanensis KBAB4, коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, гипотетического белка BC4725 B. cereus ATCC 14579, гипотетического белка BCZK4476 B. cereus E33L, коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. anthracis штамма "Ames Ancestor", белка BclA B. thuringiensis серовара konkukian штамма 97-27, консервативного гипотетического белка B. cereus ATCC 10987, коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, неполной последовательности лидерного пептида экзоспория B. cereus или гипотетического белка ER45_27600 B. weihenstephanensis, которая включает аминокислоты, соответствующие аминокислотам 20-35 BclA, может служить в качестве нацеливающей последовательности.
[0061] Как можно видеть из фиг.1A, аминокислоты 12-27 BetA/BAS3290, аминокислоты 23-38 BAS4623, аминокислоты 13-28 BclB, аминокислоты 9-24 BAS1882, аминокислоты 18-33 продукта гена 2280 KBAB4, аминокислоты 18-33 продукта гена 3572 KBAB4, аминокислоты 28-43 лидерного пептида экзоспория B. cereus VD200, аминокислоты 12-27 лидерного пептида экзоспория B. cereus VD166, аминокислоты 18-33 гипотетического белка IKG_04663 B. cereus VD200, аминокислоты 18-33 β-пропеллерного белка YVTN B. weihenstephensis KBAB4, аминокислоты 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2363 B. weihenstephensis KBAB4, аминокислоты 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2131 B. weihenstephensis KBAB4, аминокислоты 15-30 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. weihenstephensis KBAB4, аминокислоты 18-33 гипотетического белка bmyco0001_21660 B. mycoides 2048, аминокислоты 9-24 гипотетического белка bmyc0001_22540 B. mycoides 2048, аминокислоты 1-15 гипотетического белка bmyc0001_21510 B. mycoides 2048, аминокислоты 1-16 белка коллагена с трехспиральными повторами B. thuringiensis 35646, аминокислоты 14-29 гипотетического белка WP_69652 B. cereus, аминокислоты 20-35 лидерной последовательности экзоспория WP016117717 B. cereus, аминокислоты 28-43 пептида экзоспория WP002105192 B. cereus, аминокислоты 17-32 гипотетического белка WP87353 B. cereus, аминокислоты 18-33 пептида экзоспория 02112369 B. cereus, аминокислоты 18-33 белка экзоспория WP016099770 B. cereus, аминокислоты 15-30 гипотетического белка YP006612525 B. thuringiensis и аминокислоты 115-130 гипотетического белка TIGR03720 B. mycoides соответствуют аминокислотам 20-35 BclA. Как можно видеть из фиг.1B, аминокислоты 15-30 белка коллагена с доменом трехспиральных повторов B. cereus ATCC 10987, аминокислоты 18-33 коллаген-подобного белка B. cereus E33L, аминокислоты 20-35 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. weihenstephanensis KBAB4, аминокислоты 9-24 гипотетического белка BALH_2230 B. thuringiensis штамма Al Hakam, аминокислоты 12-27 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, аминокислоты 23-38 трехспиральных повторов коллагена B. cereus, аминокислоты 17-32 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, аминокислоты 9-24 гипотетического белка BCZK1835 B. cereus E33L, аминокислоты 27-42 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. weihenstephanensis KBAB4, аминокислоты 9-24 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, аминокислоты 18-33 гипотетического белка BC4725 B. cereus ATCC 14579, аминокислоты 23-38 гипотетического белка BCZK4476 B. cereus E33L, аминокислоты 19-34 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. anthracis штамма "Ames Ancestor", аминокислоты 13-28 белка BclA B. thuringiensis серовара konkukian штамма 97-27, аминокислоты 13-28 консервативного гипотетического белка B. cereus ATCC 10987, аминокислоты 13-28 коллагена, содержащего трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579, аминокислоты 78-93 неполной последовательности лидерного пептида экзоспория B. cereus, и аминокислоты 115-130 гипотетического белка ER45_27600 B. weihenstephanensis соответствуют аминокислотам 20-35 BclA. Таким образом, любая часть этих белков, которая включает приведенные выше соответствующие аминокислоты, может служить в качестве нацеливающей последовательности.
[0062] Более того, любая аминокислотная последовательность, содержащая аминокислоты 20-35 BclA или любые из приведенных выше соответствующих аминокислот могут служить в качестве нацеливающей последовательности.
[0063] Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1, аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, аминокислоты 22-31 SEQ ID NO: 1, аминокислоты 22-33 SEQ ID NO: 1 или аминокислоты 20-31 SEQ ID NO: 1. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислот 1-35 SEQ ID NO: 1, аминокислот 20-35 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 96. Альтернативно нацеливающая последовательность может состоять из аминокислот 22-31 SEQ ID NO: 1, аминокислот 22-33 SEQ ID NO: 1 или аминокислот 20-31 SEQ ID NO: 1. Альтернативно белок экзоспория может содержать полноразмерный BclA (SEQ ID NO: 2), или фрагмент белка экзоспория может содержать фрагмент BclA среднего размера, который лишен С-конца, такой как SEQ ID NO: 59 (аминокислоты 1-196 BclA). Альтернативно фрагмент белка экзоспория может состоять из SEQ ID NO: 59.
[0064] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1; аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1; аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1; аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1 или аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1.
[0065] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 3, аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 3, или белок экзоспория может содержать полноразмерный BetA/BAS3290 (SEQ ID NO: 4). Также было обнаружено, что остаток метионина, связанный с аминокислотами 12-27 BetA/BAS3290, можно использовать в качестве нацеливающей последовательности. Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 97. Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 14-23 SEQ ID NO: 3, аминокислоты 14-25 SEQ ID NO: 3 или аминокислоты 12-23 SEQ ID NO: 3.
[0066] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3; аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3; аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3 или аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3.
[0067] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 5, аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 5, или белок экзоспория может содержать полноразмерный BAS4623 (SEQ ID NO: 6).
[0068] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5; аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5; аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5; аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5; аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5 или аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5.
[0069] Альтернативно нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 7, аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 7, или белок экзоспория может содержать полноразмерный BclB (SEQ ID NO: 8).
[0070] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7; аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7; аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7 или аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7.
[0071] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 9, аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 9, или белок экзоспория может содержать полноразмерный BAS1882 (SEQ ID NO: 10). Также в качестве нацеливающей последовательности можно использовать остаток метионина, связанный с аминокислотами 9-24 BAS1882. Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 105.
[0072] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9 или аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9.
[0073] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 11, аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 11, или белок экзоспория может содержать полноразмерный продукт гена 2280 B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID NO: 12). Также в качестве нацеливающей последовательности можно использовать остаток метионина, связанный с аминокислотами 18-33 продукта гена 2280 B. weihenstephensis KBAB4. Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 98.
[0074] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11 или аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11.
[0075] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 13, аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 13, или белок экзоспория может содержать полноразмерный продукт гена 3572 B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID NO: 14). Также в качестве нацеливающей последовательности можно использовать остаток метионина, связанный с аминокислотами 18-33 продукта гена 3572 B. weihenstephensis KBAB4. Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 99.
[0076] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13 или аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13.
[0077] Альтернативно нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 15, аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 15, или белок экзоспория может содержать полноразмерный лидерный пептид экзоспория B. cereus VD200 (SEQ ID NO: 16).
[0078] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15 или аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15.
[0079] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 17, аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 17, или белок экзоспория может содержать полноразмерный лидерный пептид экзоспория B. cereus VD166 (SEQ ID NO: 18). Также в качестве нацеливающей последовательности можно использовать остаток метионина, связанный с аминокислотами 12-27 B. cereus VD166. Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 100.
[0080] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17 или аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17.
[0081] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 19, аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 19, или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок IKG_04663 B. cereus VD200 (SEQ ID NO: 20).
[0082] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19 или аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19.
[0083] Альтернативно нацеливающая последовательность содержит аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 21, или белок экзоспория может содержать полноразмерный β-пропеллерный белок YVTN B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID NO: 22). Также в качестве нацеливающей последовательности можно использовать остаток метионин, связанный с аминокислотами 18-33 β-пропеллерного белка KBAB4 YVTN B. weihenstephensis. Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 101.
[0084] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21 или аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21.
[0085] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 23, аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 23, или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок bcerkbab4_2363 B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID NO: 24). Также в качестве нацеливающей последовательности можно использовать остаток метионина, связанный с аминокислотами 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2363 B. weihenstephensis KBAB4. Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 102.
[0086] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23 или аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23.
[0087] Нацеливающая последовательность содержит аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 25, аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 25, или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок bcerkbab4_2131 B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID NO: 26). Также в качестве нацеливающей последовательности можно использовать остаток метионина, связанный с аминокислотами 9-24 гипотетического белка bcerkbab4_2131 B. weihenstephensis KBAB4. Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 103.
[0088] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25 или аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25.
[0089] Альтернативно нацеливающая последовательность содержит аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 27, аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 27, или белок экзоспория может содержать полноразмерный коллаген, содержащий трехспиральный повтор, B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID NO: 28).
[0090] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27 или аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27.
[0091] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 29, аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 29, или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок bmyco0001_21660 B. mycoides 2048 (SEQ ID NO: 30).
[0092] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29 или аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29.
[0093] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 31, аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 31, или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок bmyc0001_22540 B. mycoides 2048 (SEQ ID NO: 32). Также в качестве нацеливающей последовательности можно использовать остаток метионина, связанный с аминокислотами 9-24 гипотетического белка bmyc0001_22540 B. mycoides 2048. Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 104.
[0094] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31 или аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31.
[0095] Альтернативно нацеливающая последовательность содержит аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, или белок экзоспория содержит полноразмерный гипотетический белок bmyc0001_21510 B. mycoides 2048 (SEQ ID NO: 34).
[0096] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-16 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 35, или белок экзоспория может содержать полноразмерный белок коллагена с трехспиральными повторами B. thuringiensis 35646 (SEQ ID NO: 36).
[0097] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-29 SEQ ID NO: 43, аминокислоты 14-29 SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 43, или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок WP_69652 B. cereus (SEQ ID NO: 44).
[0098] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43 или аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43.
[0099] Альтернативно нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 45, аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 45, или белок экзоспория может содержать полноразмерную лидерную последовательность экзоспория WP016117717 B. cereus (SEQ ID NO: 46). Также в качестве нацеливающей последовательности можно использовать остаток метионина, связанный с аминокислотами 20-35 лидерной последовательности экзоспория WP016117717 B. cereus. Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 106.
[00100] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45 или аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45.
[00101] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 47, аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 47 или SEQ ID NO: 47, или белок экзоспория может содержать полноразмерный пептид экзоспория WP002105192 B. cereus (SEQ ID NO: 48).
[00102] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47 или аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47.
[00103] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-32 SEQ ID NO: 49, аминокислоты 17-32 SEQ ID NO: 49 или SEQ ID NO: 49, или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок WP87353 B. cereus (SEQ ID NO: 50).
[00104] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49 или аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49.
[00105] Альтернативно нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 51, аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 51, или белок экзоспория может содержать полноразмерный пептид экзоспория 02112369 B. cereus (SEQ ID NO: 52).
[00106] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51 или аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51.
[00107] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 53, аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 53, или белок экзоспория может содержать полноразмерный белок экзоспория WP016099770 B. cereus (SEQ ID NO: 54).
[00108] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53 или аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53.
[00109] Альтернативно нацеливающая последовательность может содержать кислоты 1-30 SEQ ID NO: 55, аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 55, или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок YP006612525 B. thuringiensis (SEQ ID NO: 56).
[00110] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55 или аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55.
[00111] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 57, аминокислоты 115-130 SEQ ID NO: 57 или SEQ ID NO: 57, или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок TIGR03720 B. mycoides (SEQ ID NO: 58).
[00112] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57 или аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57.
[00113] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 59 или SEQ ID NO: 59; или белок экзоспория может содержать полноразмерный белок коллагена с доменом трехспиральных повторов B. cereus ATCC 10987 (SEQ ID NO: 60).
[00114] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 59; аминокислоты 4-30 SEQ ID NO: 59 или аминокислоты 6-30 SEQ ID NO: 59.
[00115] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 61; аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 61 или SEQ ID NO: 61; или белок экзоспория может содержать полноразмерный коллаген-подобный белок B. cereus E33L (SEQ ID NO: 62).
[00116] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 61; аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 61; аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 61 или аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 61.
[00117] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 63; или белок экзоспория может содержать полноразмерный коллаген, содержащий трехспиральные повторы, B. weihenstephanensis KBAB4 (SEQ ID NO: 64).
[00118] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 63; аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 63; аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 63; аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 63 или аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 63.
[00119] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 65; аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 65 или SEQ ID NO: 107; или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок BALH_2230 B. thuringiensis штамма Al Hakam (SEQ ID NO: 66).
[00120] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 65 или аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 65.
[00121] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 67; аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 67 или SEQ ID NO: 67; или белок экзоспория может содержать полноразмерный коллаген, содержащий трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579 (SEQ ID NO: 68).
[00122] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 67; аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 67 или аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 67.
[00123] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 69; аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 69; или белок экзоспория может содержать полноразмерный трехспиральный повтор коллагена B. cereus (SEQ ID NO: 70).
[00124] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 69; аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 69; аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 69 или аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 69.
[00125] Белок экзоспория может содержать полноразмерный коллаген, содержащий трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579 (SEQ ID NO: 72).
[00126] Нацеливающая последовательность может содержать SEQ ID NO: 73 или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок BCZK1835 B. cereus E33L (SEQ ID NO: 74).
[00127] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-42 SEQ ID NO: 75; аминокислоты 27-42 SEQ ID NO: 75 или SEQ ID NO: 75; или белок экзоспория может содержать полноразмерный коллаген, содержащий трехспиральные повторы, B. weihenstephanensis KBAB4 (SEQ ID NO: 76).
[00128] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-42 SEQ ID NO: 75; аминокислоты 5-42 SEQ ID NO: 75; аминокислоты 10-42 SEQ ID NO: 75; аминокислоты 15-42 SEQ ID NO: 75; аминокислоты 20-42 SEQ ID NO: 75 или аминокислоты 25-42 SEQ ID NO: 75.
[00129] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 77; аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 77 или SEQ ID NO: 77; или белок экзоспория может содержать полноразмерный коллаген, содержащий трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579 (SEQ ID NO: 78).
[00130] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 77 или аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 77.
[00131] Белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок BC4725 B. cereus ATCC 14579 (SEQ ID NO: 80).
[00132] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 81; аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 81 или SEQ ID NO: 81; или белок экзоспория может содержать полноразмерный гипотетический белок BCZK4476 B. cereus E33L (SEQ ID NO: 82).
[00133] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 81; аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 81; аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 81; аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 81 или аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 81.
[00134] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-34 SEQ ID NO: 83 или SEQ ID NO: 83; или белок экзоспория может содержать полноразмерный коллаген, содержащий трехспиральные повторы, B. anthracis штамма "Ames Ancestor" (SEQ ID NO: 84).
[00135] Белок экзоспория может содержать полноразмерный белок BclA B. thuringiensis серовара konkukian штамма 97-27 (SEQ ID NO: 86).
[00136] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 87; аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 87 или SEQ ID NO: 87; или белок экзоспория может содержать полноразмерный консервативный гипотетический белок B. cereus ATCC 10987 (SEQ ID NO: 88).
[00137] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 87; аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 87 или аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 87.
[00138] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 89 или SEQ ID NO: 89; или белок экзоспория может содержать полноразмерный коллаген, содержащий трехспиральные повторы, B. cereus ATCC 14579 (SEQ ID NO: 90).
[00139] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 89; аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 89 или аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 89.
[00140] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-93 SEQ ID NO: 91 или SEQ ID NO: 91; или белок экзоспория может содержать неполную последовательность лидерного пептида экзоспория B. cereus (SEQ ID NO: 92).
[00141] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-93 SEQ ID NO: 91; аминокислоты 10-93 SEQ ID NO: 91; аминокислоты 20-93 SEQ ID NO: 91; аминокислоты 30-93 SEQ ID NO: 91; аминокислоты 40-93 SEQ ID NO: 91; аминокислоты 50-93 SEQ ID NO: 91 или аминокислоты 60-93 SEQ ID NO: 91.
[00142] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 93 или SEQ ID NO: 93; или белок экзоспория может содержать неполную последовательность гипотетического белка ER45_27600 B. weihenstephanensis (SEQ ID NO: 94).
[00143] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 93; аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 93; аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 93 или аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 93.
[00144] Более того, как проиллюстрировано в примерах, предоставленных в настоящем описании ниже, было обнаружено, что более короткие последовательности, чем аминокислоты 20-35 BclA, можно использовать для нацеливания слитого белка в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. В частности, для нацеливания слитого белка в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus можно использовать аминокислоты 20-33 BclA, аминокислоты 20-31 BclA, аминокислоты 21-33 BclA или аминокислоты 23-31 BclA. Таким образом, нацеливающая последовательность может состоять из аминокислот 20-33 SEQ ID NO: 1, аминокислот 20-31 SEQ ID NO: 1, аминокислот 21-33 SEQ ID NO: 1 или аминокислот 23-31 SEQ ID NO: 1. Также для нацеливания слитого белка в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus можно использовать соответствующие области любой из SEQ ID NO, показанных на фиг.1A и 1B. Под "соответствующими областями" подразумевают, что, когда последовательности выравнивают с SEQ ID NO: 1, как показано на фиг.1A и 1B, области других аминокислотных последовательностей, которые выравниваются с аминокислотами SEQ ID NO: 1, являются "соответствующими областями" этих последовательностей. Таким образом, например, аминокислоты 12-25 SEQ ID NO: 3, аминокислоты 23-36 SEQ ID NO: 5, аминокислоты 13-26 SEQ ID NO: 7, и т.д. можно использовать для нацеливания слитого белка в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, поскольку эти области выравниваются с аминокислотами 20-33 SEQ ID NO: 1, как показано на фиг.1A.
[00145] Также для нацеливания слитого белка в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus можно использовать даже более короткие области в пределах аминокислот 20-35 BclA. В частности, можно использовать любую аминокислотную последовательность, которая включает аминокислоты 25-30 SEQ ID NO: 1 или соответствующие аминокислоты из любой из последовательностей, показанных на фиг.1A и 1B. Квалифицированному специалисту будет понятно, что, начиная с аминокислот 25-30 SEQ ID NO: 1 или соответствующей области любой из последовательностей, представленных на фиг.1A и 1B, дополнительные аминокислоты можно добавлять на N-конец, С-конец, и как на N-конец, так и на С-конец, для получения нацеливающей последовательности, которая будет эффективной для нацеливания слитого белка в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00146] Кроме того, из выравнивания последовательностей на фиг.1A и 1B, можно без труда увидеть, что, хотя аминокислоты 20-35 BclA являются консервативными и аминокислоты 25-35 являются более консервативными, в этой области может встречаться некоторая степень варьирования без влияния на способность нацеливающей последовательности к нацеливанию белка в экзоспорий. На фиг.1A и 1B приведена процентная идентичность каждой из соответствующих аминокислот каждой последовательности с аминокислотами 20-35 BclA ("% идентичность 20-35") и с аминокислотами 25-35 BclA ("% идентичность 25-35"). Таким образом, например, по сравнению с аминокислотами 20-35 BclA, соответствующие аминокислоты BetA/BAS3290 являются приблизительно на 81,3% идентичными, соответствующие аминокислоты BAS4623 являются приблизительно на 50,0% идентичными, соответствующие аминокислоты BclB являются приблизительно на 43,8% идентичными, соответствующие аминокислоты BAS1882 являются приблизительно на 62,5% идентичными, соответствующие аминокислоты продукта гена 2280 KBAB4 являются приблизительно на 81,3% идентичными, и соответствующие аминокислоты продукта гена 3572 KBAB4 являются приблизительно на 81,3% идентичными. Идентичность последовательностей на протяжении этой области для остальных последовательностей приведена на фиг.1A и 1B.
[00147] Что касается аминокислот 25-35 BclA, соответствующие аминокислоты BetA/BAS3290 являются приблизительно на 90,9% идентичными, соответствующие аминокислоты BAS4623 являются приблизительно на 72,7% идентичными, соответствующие аминокислоты BclB являются приблизительно на 54,5% идентичными, соответствующие аминокислоты BAS1882 являются приблизительно на 72,7% идентичными, соответствующие аминокислоты продукта гена 2280 KBAB4 являются приблизительно на 90,9% идентичными, и соответствующие аминокислоты продукта гена 3572 KBAB4 являются приблизительно на 81,8% идентичными. Идентичность последовательностей на протяжении этой области для остальных последовательностей приведена на фиг.1A и 1B.
[00148] Таким образом, нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность аминокислот 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%.
[00149] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%.
[00150] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.
[00151] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 56% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 56% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%.
[00152] Альтернативно нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 62% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%. Нацеливающая последовательность также может состоять из аминокислотой последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 62% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 SEQ ID NO: 1 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.
[00153] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 68% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере 68% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.
[00154] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 SEQ ID NO: 1 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.
[00155] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 SEQ ID NO: 1 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.
[00156] Нацеливающая последовательность также может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.
[00157] Нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 90%. Альтернативно нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 90%.
[00158] Квалифицированному специалисту будет понятно, что варианты описанных выше последовательностей также можно использовать в качестве нацеливающих последовательностей при условии, что нацеливающая последовательность содержит аминокислоты 20-35 BclA, соответствующие аминокислоты BetA/BAS3290, BAS4263, BclB, BAS1882, продукта гена 2280 KBAB4 или продукта гена 3572 KBAB, или присутствует последовательность, обладающая описанной выше идентичностью последовательности с аминокислотами 20-35 и 25-35 BclA.
[00159] Определенные белки экзоспория семейства Bacillus cereus, которые лишены областей, обладающих гомологией с аминокислотами 25-35 BclA, также можно использовать для нацеливания пептида или белка в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus. В частности, слитые белки могут включать белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 108 (InhA B. mycoides), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 109 (BAS1141 B. anthracis Sterne (ExsY)), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 110 (BAS1144 B. anthracis Sterne (BxpB/ExsFA)), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 111 (BAS1145 B. anthracis Sterne (CotY)), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 112 (BAS1140 B. anthracis Sterne), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 113 (ExsFB B. anthracis H9401), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 114 (InhA1 B. thuringiensis HD74), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 115 (ExsJ B. cereus ATCC 10876), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 116 (ExsH B. cereus), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 117 (YjcA B. anthracis Ames), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 118 (YjcB B. anthracis), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 119 (BclC B. anthracis Sterne), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 120 (кислая фосфатаза Bacillus thuringiensis серовара konkukian штамма 97-27), белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 121 (InhA2 B. thuringiensis HD74), или белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 122 (InhA3 B. mycoides). Включение белка экзоспория, содержащего любую из SEQ ID NO: 108-122 в слитые белки, описанные в настоящем описании, приводит к нацеливанию в экзоспорий представителя семейства B. cereus.
[00160] Более того, белки экзоспория, обладающие высокой степенью идентичности последовательности с любым из полноразмерных белков экзоспория или фрагментов белка экзоспория, описанных выше, также можно использовать для нацеливания пептида или белка в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus. Таким образом, слитый белок может содержать белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122. Альтернативно слитый белок может содержать белок экзоспория, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00161] В ходе споруляции рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего любой из слитых белков, описанных в настоящем описании, нацеливающий, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория распознается аппаратом сборки экзоспория спор и направляется в экзоспорий, что приводит к экспонированию представляющего интерес белка или пептида, являющегося частью слитого белка, снаружи споры.
[00162] Как проиллюстрировано далее с помощью примеров, предоставленных в настоящем описании ниже, применение различных нацеливающих последовательностей позволяет контролировать уровень экспрессии слитого белка на поверхности споры представителя семейства Bacillus cereus. Применение определенных нацеливающих последовательностей, описанных в настоящем описании, приведет к более высокому уровню экспрессии слитого белка, в то время как применение других нацеливающих последовательностей приведет к более низким уровням экспрессии слитого белка на поверхности споры.
[00163] В любом из слитых белков, описанных в настоящем описании, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать аминокислотную последовательность GXT на их C-конце, где X представляет собой любую аминокислоту.
[00164] В любом из слитых белков, описанных в настоящем описании, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать остаток в аланина в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
[00165] В любом из слитых белков, описанных в настоящем описании, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, кроме того, могут содержать остаток метионина, серина или треонина в положении аминокислоты, непосредственно предшествующем первой аминокислоте нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория, или в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
B. Слитые белки для экспрессии в рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus
[00166] Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность или белок экзоспория. Когда представляющий интерес белок или пептид представляет собой любой представляющий интерес белок или пептид, слитый белок может содержать: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 59; (2) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 59; (3) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 60; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 59; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 4-30 SEQ ID NO: 59; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 6-30 SEQ ID NO: 59; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 61; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 61; (9) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 61; (10) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 62; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 61; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 61; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 61; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 61; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 63; (16) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 63; (17) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 64; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 63; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 63; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 63; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 63; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 63; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 65; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 65; (25) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 65; (26) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 66; (27) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 107; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 65; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 65; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 67; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 67; (32) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 67; (33) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 68; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 67; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 67; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 67; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 69; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 69; (39) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 69; (40) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 70; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 69; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 69; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 69; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 69; (45) белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 72; (46) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 73; (47) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 74; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-42 SEQ ID NO: 75; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 27-42 SEQ ID NO: 75; (50) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 75; (51) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 76; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-42 SEQ ID NO: 75; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-42 SEQ ID NO: 75; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-42 SEQ ID NO: 75; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-42 SEQ ID NO: 75; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-42 SEQ ID NO: 75; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-42 SEQ ID NO: 75; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 77; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 77; (60) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 77; (61) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 78; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 77; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 77; (64) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 80; (65) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 81; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 81; (67) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 81; (68) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 82; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 81; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 81; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 81; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 81; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 81; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-34 SEQ ID NO: 83; (75) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 83; (76) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 84; (77) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 86; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 87; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 87; (80) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 87; (81) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 88; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 87; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 87; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 87; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 89; (86) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 89; (87) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 90; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 89; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 89; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 89; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-93 SEQ ID NO: 91; (92) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 91; (93) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 92; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-93 SEQ ID NO: 91; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-93 SEQ ID NO: 91; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-93 SEQ ID NO: 91; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-93 SEQ ID NO: 91; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-93 SEQ ID NO: 91; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-93 SEQ ID NO: 91; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-93 SEQ ID NO: 91; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 93; (102) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 93; (103) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 94; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 93; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 93; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 93; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 93; или (108) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 122.
[00167] Например, когда представляющий интерес белок или пептид представляет собой любой представляющий интерес белок или пептид, слитый белок может содержать: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 59; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 4-30 SEQ ID NO: 59; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 6-30 SEQ ID NO: 59; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 61; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 61; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 61; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 61; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 63; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 63; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 63; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 63; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 63; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 65; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 65; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 67; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 67; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 67; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 69; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 69; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 69; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 69; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-42 SEQ ID NO: 75; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-42 SEQ ID NO: 75; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-42 SEQ ID NO: 75; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-42 SEQ ID NO: 75; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-42 SEQ ID NO: 75; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-42 SEQ ID NO: 75; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 77; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 77; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 81; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 81; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 81; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 81; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 81; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 87; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 87; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 87; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 89; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 89; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 89; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-93 SEQ ID NO: 91; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-93 SEQ ID NO: 91; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-93 SEQ ID NO: 91; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-93 SEQ ID NO: 91; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-93 SEQ ID NO: 91; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-93 SEQ ID NO: 91; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-93 SEQ ID NO: 91; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 93; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 93; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 93; или (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 93.
[00168] Альтернативно, когда представляющий интерес белок или пептид представляет собой любой представляющий интерес белок или пептид, слитый белок может содержать: (1) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 20-33 SEQ ID NO: 1; (2) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 21-33 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 23-31 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 96; (5) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 96; (6) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 12-25 SEQ ID NO: 3; (7) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 13-25 SEQ ID NO: 3; (8) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 15-23 SEQ ID NO: 3; (9) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 97; (10) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 98; (11) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 23-36 SEQ ID NO: 5; (12) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 23-34 SEQ ID NO: 5; (13) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 24-36 SEQ ID NO: 5; (14) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 26-34 SEQ ID NO: 5; (15) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 13-26 SEQ ID NO: 7; (16) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 13-24 SEQ ID NO: 7; (17) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 14-26 SEQ ID NO: 7; (18) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 16-24 SEQ ID NO: 7; (19) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-22 SEQ ID NO: 9; (20) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-20 SEQ ID NO: 9; (21) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 10-22 SEQ ID NO: 9; (22) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 12-20 SEQ ID NO: 9; (23) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 105; (24) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 105; (25) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-31 SEQ ID NO: 11; (26) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-29 SEQ ID NO: 11; (27) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 19-31 SEQ ID NO: 11; (28) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 98; (29) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 98; (30) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-31 SEQ ID NO: 13; (31) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-29 SEQ ID NO: 13; (32) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 19-31 SEQ ID NO: 13; (33) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 21-29 SEQ ID NO: 13; (34) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 99; (35) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 99; (36) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 28-41 SEQ ID NO: 15; (37) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 28-39 SEQ ID NO: 15; (38) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 29-41 SEQ ID NO: 15; (39) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 31-39 SEQ ID NO: 15; (40) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 12-25 SEQ ID NO: 17; (41) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 13-25 SEQ ID NO: 17; (42) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 100; (43) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-31 SEQ ID NO: 19; (44) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-29 SEQ ID NO: 19; (45) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 19-31 SEQ ID NO: 19; (46) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 21-29 SEQ ID NO: 19; (47) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-31 SEQ ID NO: 21; (48) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-29 SEQ ID NO: 21; (49) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 19-31 SEQ ID NO: 21; (50) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 21-29 SEQ ID NO: 21; (51) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 101; (52) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 101; (53) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-22 SEQ ID NO: 23; (54) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-20 SEQ ID NO: 23; (55) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 10-22 SEQ ID NO: 23; (56) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 12-20 SEQ ID NO: 23; (57) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 102; (58) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 102; (59) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-22 SEQ ID NO: 25; (60) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-20 SEQ ID NO: 25; (61) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 10-22 SEQ ID NO: 25; (62) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 12-20 SEQ ID NO: 25; (63) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 103; (64) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 103; (65) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 15-28 SEQ ID NO: 27; (66) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 15-26 SEQ ID NO: 27; (67) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 16-28 SEQ ID NO: 27; (68) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-26 SEQ ID NO: 27; (69) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 104; (70) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 104; (71) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 33; (72) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-11 SEQ ID NO: 33; (73) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 3-11 SEQ ID NO: 33; (74) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-14 SEQ ID NO: 35; (75) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-12 SEQ ID NO: 35; (76) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 2-14 SEQ ID NO: 35; (77) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 14-27 SEQ ID NO: 43; (78) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 14-25 SEQ ID NO: 43; (79) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 15-27 SEQ ID NO: 43; (80) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 20-33 SEQ ID NO: 45; (81) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 20-31 SEQ ID NO: 45; (82) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 21-33 SEQ ID NO: 45; (83) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 106; (84) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 106; (85) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 28-41 SEQ ID NO: 47; (86) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 28-39 SEQ ID NO: 47; (87) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-31 SEQ ID NO: 53; (88) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-29 SEQ ID NO: 53; (89) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 19-31 SEQ ID NO: 53; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-31 SEQ ID NO: 61; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-29 SEQ ID NO: 61; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 19-31 SEQ ID NO: 61; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-22 SEQ ID NO: 65; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-20 SEQ ID NO: 65; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-22 SEQ ID NO: 65; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 107; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-13 SEQ ID NO: 107; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-25 SEQ ID NO: 67; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-23 SEQ ID NO: 67; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-25 SEQ ID NO: 67; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-23 SEQ ID NO: 67; (102) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-36 SEQ ID NO: 69; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-34 SEQ ID NO: 69; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 24-36 SEQ ID NO: 69; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 26-34 SEQ ID NO: 69; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 27-40 SEQ ID NO: 75; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 27-38 SEQ ID NO: 75; (108) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-22 SEQ ID NO: 77; (109) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-20 SEQ ID NO: 77; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-22 SEQ ID NO: 77; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-20 SEQ ID NO: 77; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-36 SEQ ID NO: 81; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-34 SEQ ID NO: 81; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 24-36 SEQ ID NO: 81; (115) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 26-34 SEQ ID NO: 81; (116) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-26 SEQ ID NO: 87; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-24 SEQ ID NO: 87; или (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-26 SEQ ID NO: 87. Нацеливающая последовательность также может состоять из любой из этих последовательностей.
[00169] Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория. Представляющий интерес белок или пептид может представлять собой фермент, который катализирует продукцию оксида азота, или связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид. Когда представляющий интерес белок или пептид включает фермент, который катализирует продукцию оксида азота, или связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут представлять собой любую нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Например, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут представлять собой любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, приведенных выше в абзацах [00166]-[00168] для применения с любым представляющим интерес белком или пептидом, или: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 1; (5) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 2; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 3; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 3; (13) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 3; (14) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 4; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 5; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 5; (21) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 5; (22) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 6; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 7; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 7; (31) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 7; (32) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 8; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 9; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 9; (39) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 9; (40) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 10; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 11; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 11; (46) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 11; (47) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 12; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 13; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 13; (55) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 13; (56) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 14; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 15; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 15; (64) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 15; (65) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 16; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 17; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 17; (75) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 17; (76) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 18; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 19; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 19; (83) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 19; (84) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 20; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 21; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 21; (92) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 21; (93) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 22; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 23; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 23; (101) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 23; (102) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 24; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 25; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 25; (108) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 25; (109) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 26; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 27; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 27; (115) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 27; (116) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 28; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (119) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (120) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (121) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 29; (122) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 29; (123) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 29; (124) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 30; (125) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (126) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (127) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (128) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (129) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (130) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 31; (131) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 31; (132) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 31; (133) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 32; (134) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (135) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (136) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (137) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 33; (138) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 33; (139) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 34; (140) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-16 SEQ ID NO: 35; (141) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 35; (142) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 36; (143) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-29 SEQ ID NO: 43; (144) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-29 SEQ ID NO: 43; (145) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 43; (146) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 44; (147) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (148) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (149) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (150) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (151) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 45; (152) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 45; (153) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 45; (154) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 46; (155) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (156) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (157) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (158) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (159) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (160) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 47; (161) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 47; (162) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 47; (163) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 48; (164) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (165) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (166) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (167) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (168) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (169) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (170) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (171) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-32 SEQ ID NO: 49; (172) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 17-32 SEQ ID NO: 49; (173) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 49; (174) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 50; (175) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (176) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (177) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (178) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (179) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (180) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 51; (181) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 51; (182) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 51; (183) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 52; (184) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (185) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (186) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (187) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (188) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (189) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 53; (190) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 53; (191) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 53; (192) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 54; (193) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (194) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (195) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (196) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (197) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (198) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 55; (199) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 55; (200) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 55; (201) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 56; (202) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (203) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (204) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (205) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (206) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 57; (207) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 115-130 SEQ ID NO: 57; (208) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 57; (209) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 58; (210) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (211) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (212) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (213) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (214) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (215) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (216) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (217) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (218) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (219) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (220) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (221) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; (222) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57; (223) фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 95; (224) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 96; (225) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 97; (226) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 98; (227) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 99; (228) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 100; (229) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 101; (230) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 102; (231) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 103; (232) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 104; (233) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 105; (234) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 106; (235) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 108; (236) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 109; (237) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 110; (238) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 111; (239) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 112; (240) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 113; (241) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 114; (242) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 115; (243) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 116; (244) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 117; (245) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 118; (246) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 119; (247) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 120; (248) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 121; (249) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-31 SEQ ID NO: 1; (250) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-33 SEQ ID NO: 1; (251) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-31 SEQ ID NO: 1; (252) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-23 SEQ ID NO: 3; (253) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-25 SEQ ID NO: 3; или (254) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-23 SEQ ID NO: 3.
[00170] Например, когда представляющий интерес белок или пептид включает фермент, который катализирует продукцию оксида азота, или связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут представлять собой: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (64) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (65) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (75) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (76) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (102) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (108) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (109) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (115) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (116) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; или (119) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57.
[00171] Предусматривается слитый белок, который содержит антиген или фермент рекультивации и нацеливающую последовательность или белок экзоспория. Нацеливающая последовательность или белок экзоспория могут содержать любые из нацеливающих последовательностей или белков экзоспория, приведенных выше в абзацах [00166]-[00168], для применения с любым представляющий интерес белком или пептидом или: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-31 SEQ ID NO: 1; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-33 SEQ ID NO: 1; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-31 SEQ ID NO: 1; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-23 SEQ ID NO: 3; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-25 SEQ ID NO: 3; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-23 SEQ ID NO: 3; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 9; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 9; (28) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 9; (29) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 10; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 11; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 11; (35) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 11; (36) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 12; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 13; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 13; (44) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 13; (45) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 14; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 15; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 15; (53) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 15; (54) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 16; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 17; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 17; (64) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 17; (65) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 18; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 19; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 19; (72) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 19; (73) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 20; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (75) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (76) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 21; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 21; (81) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 21; (82) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 22; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 23; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 23; (90) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 23; (91) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 24; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 25; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 25; (97) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 25; (98) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 26; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (102) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 27; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 27; (104) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 27; (105) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 28; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (108) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (109) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 29; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 29; (112) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 29; (113) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 30; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (115) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (116) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (119) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 31; (120) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 31; (121) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 31; (122) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 32; (123) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (124) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (125) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (126) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 33; (127) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 33; (128) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 34; (129) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-16 SEQ ID NO: 35; (130) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 35; (131) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 36; (132) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-29 SEQ ID NO: 43; (133) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-29 SEQ ID NO: 43; (134) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 43; (135) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 44; (136) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (137) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (138) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (139) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (140) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 45; (141) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 45; (142) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 45; (143) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 46; (144) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (145) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (146) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (147) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (148) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (149) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 47; (150) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 47; (151) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 47; (152) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 48; (153) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (154) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (155) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (156) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (157) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (158) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (159) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (160) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-32 SEQ ID NO: 49; (161) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 17-32 SEQ ID NO: 49; (162) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 49; (163) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 50; (164) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (165) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (166) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (167) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (168) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (169) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 51; (170) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 51; (171) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 51; (172) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 52; (173) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (174) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (175) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (176) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (177) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (178) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 53; (179) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 53; (180) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 53; (181) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 54; (182) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (183) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (184) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (185) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (186) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (187) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 55; (188) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 55; (189) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 55; (190) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 56; (191) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (192) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (193) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (194) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (195) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 57; (196) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 115-130 SEQ ID NO: 57; (197) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 57; (198) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 58; (199) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (200) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (201) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (202) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (203) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (204) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (205) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (206) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (207) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (208) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (209) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (210) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; (211) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57; (212) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 97; (213) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 98; (214) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 99; (215) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 100; (216) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 101; (217) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 102; (218) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 103; (219) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 104; (220) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 105; (221) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 106; (222) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 108; (223) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 109; (224) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 110; (225) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 111; (226) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 112; (227) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 113; (228) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 114; (229) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 115; (230) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 116; (231) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 117; (232) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 118; (233) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 119; (234) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 120; или (235) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 121.
[00172] Предусматривается слитый белок, который содержит фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва пласта, или антибактериальный белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория. Нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать любые из нацеливающих последовательностей или белков экзоспория, приведенных выше в абзацах [00166]-[00168] для применения с любым представляющим интерес белком или пептидом, или: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 1; (5) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 2; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 3; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 3; (13) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 3; (14) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 4; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 5; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 5; (21) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 5; (22) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 6; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 7; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 7; (31) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 7; (32) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 8; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 9; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 9; (39) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 9; (40) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 10; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 11; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 11; (46) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 11; (47) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 12; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 13; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 13; (55) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 13; (56) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 14; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 15; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 15; (64) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 15; (65) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 16; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 17; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 17; (75) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 17; (76) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 18; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 19; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 19; (83) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 19; (84) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 20; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 21; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 21; (92) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 21; (93) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 22; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 23; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 23; (101) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 23; (102) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 24; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 25; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 25; (108) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 25; (109) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 26; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 27; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 27; (115) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 27; (116) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 28; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (119) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (120) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (121) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 29; (122) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 29; (123) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 29; (124) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 30; (125) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (126) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (127) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (128) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (129) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (130) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 31; (131) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 31; (132) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 31; (133) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 32; (134) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (135) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (136) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (137) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 33; (138) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 33; (139) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 34; (140) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-16 SEQ ID NO: 35; (141) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 35; (142) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 36; (143) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-29 SEQ ID NO: 43; (144) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-29 SEQ ID NO: 43; (145) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 43; (146) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 44; (147) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (148) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (149) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (150) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (151) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 45; (152) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 45; (153) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 45; (154) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 46; (155) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (156) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (157) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (158) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (159) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (160) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 47; (161) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 47; (162) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 47; (163) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 48; (164) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (165) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (166) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (167) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (168) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (169) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (170) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (171) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-32 SEQ ID NO: 49; (172) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 17-32 SEQ ID NO: 49; (173) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 49; (174) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 50; (175) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (176) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (177) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (178) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (179) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (180) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 51; (181) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 51; (182) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 51; (183) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 52; (184) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (185) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (186) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (187) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (188) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (189) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 53; (190) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 53; (191) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 53; (192) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 54; (193) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (194) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (195) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (196) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (197) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (198) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 55; (199) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 55; (200) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 55; (201) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 56; (202) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (203) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (204) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (205) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (206) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 57; (207) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 115-130 SEQ ID NO: 57; (208) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 57; (209) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 58; (210) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (211) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (212) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (213) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (214) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (215) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (216) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (217) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (218) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (219) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (220) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (221) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; (222) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57; (223) фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 95; (224) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 96; (225) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 97; (226) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 98; (227) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 99; (228) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 100; (229) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 101; (230) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 102; (231) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 103; (232) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 104; (233) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 105; (234) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 106; (235) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 108; (236) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 109; (237) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 110; (238) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 111; (239) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 112; (240) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 113; (241) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 114; (242) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 115; (243) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 116; (244) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 117; (245) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 118; (246) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 119; (247) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 120; (248) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 121; (249) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-31 SEQ ID NO: 1; (250) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-33 SEQ ID NO: 1; (251) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-31 SEQ ID NO: 1; (252) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-23 SEQ ID NO: 3; (253) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-25 SEQ ID NO: 3; или (254) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-23 SEQ ID NO: 3.
[00173] Когда представляющий интерес белок или пептид включает антиген, фермент рекультивации, фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва пласта, или антибактериальный белок или пептид, предпочтительно, нацеливающая последовательность или белок экзоспория содержат любые из нацеливающих последовательностей или белков экзоспория, приведенных выше в абзаце [00167], для применения с любым представляющим интерес белком или пептидом, или: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (64) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (65) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (75) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (76) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (102) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (108) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (109) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (115) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (116) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; (119) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57.
[00174] Когда представляющий интерес белок или пептид включает антиген, фермент рекультивации, фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва пласта, или антибактериальный белок или пептид, более предпочтительно, нацеливающая последовательность или белок экзоспория содержат любые из нацеливающих последовательностей или белков экзоспория, приведенных выше в абзаце [00167], для применения с любым представляющим интерес белком или пептидом, или: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (64) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (65) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (75) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (76) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57.
[00175] Когда представляющий интерес белок или пептид включает антиген, фермент рекультивации, фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва пласта, или антибактериальный белок или пептид, еще более предпочтительно нацеливающая последовательность или белок экзоспория содержат: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (64) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (65) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (75) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (76) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 4-30 SEQ ID NO: 59; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 6-30 SEQ ID NO: 59; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 61; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 61; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 61; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 63; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 63; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 63; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 63; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 65; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 67; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 67; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 69; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 69; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 69; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-42 SEQ ID NO: 75; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-42 SEQ ID NO: 75; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-42 SEQ ID NO: 75; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-42 SEQ ID NO: 75; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-42 SEQ ID NO: 75; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 77; (102) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 81; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 81; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 81; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 81; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 87; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 87; (108) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 89; (109) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 89; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-93 SEQ ID NO: 91; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-93 SEQ ID NO: 91; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-93 SEQ ID NO: 91; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-93 SEQ ID NO: 91; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-93 SEQ ID NO: 91; (115) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-93 SEQ ID NO: 91; (116) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 93; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 93; или (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 93.
[00176] Представляющий интерес белок или пептид слитого белка, описанного выше, может включать антиген.
[00177] Представляющий интерес белок или пептид слитого белка, описанного выше, может включать фермент рекультивации.
[00178] Представляющий интерес белок или пептид слитого белка, описанного выше, может включать фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва пласта.
[00179] Представляющий интерес белок или пептид слитого белка, описанного выше, может включать антибактериальный белок или пептид.
C. Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитые белки
[00180] Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным представителям семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок. Слитый белок может представлять собой любой из слитых белков, описанных выше в разделе I.B.
II. Модулирование экспрессии слитого белка в рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus , которые экспрессируют слитый белок, посредством совместной сверхэкспрессии с белками-модуляторами
[00181] Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитые белки, описанные в настоящем описании, экспонируют представляющий интерес белок или пептид, являющийся частью слитого белка, снаружи их спор. Было обнаружено, что сверхэксрессия определенных белков экзоспория (обозначаемых в настоящем описании как "белки-модуляторы") в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, который также экспрессирует слитый белок, позволяет модулирование (т.е. увеличение или уменьшение) уровня экспрессии слитого белка, тем самым, увеличивая или уменьшая количество представляющего интерес белка или пептида, который экспонируется снаружи споры. Способность контролировать количество представляющего интерес белка или пептида, который экспонируется снаружи споры, является полезной, поскольку в некоторых случаях является желательным увеличение количества экспонируемого представляющего интерес белка или пептида. Например, когда представляющий интерес белок представляет собой фермент, который деградирует источник питательных веществ растений, может быть желательным увеличение количества фермента, экспонируемого на споре, чтобы могла быть достигнута более высокая ферментативная активность и более высокая стимуляция роста растений при внесении спор в среду для роста растений или нанесении спор на растение, или семя растения, или область, окружающую растение или семя растения. В других случаях является желательным уменьшение количества представляющего интерес белка или пептида, который экспонируется. Например, когда представляющий интерес белок или пептид включает усиливающий иммунную систему растений белок или пептид, может быть желательным снижение количества белка или пептида, экспонируемого на споре, поскольку избыточная стимуляция иммунной системы растения может приводить к нежелательным эффектам.
[00182] Как дополнительно описано в настоящем описании ниже, рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют белок-модулятор, можно использовать в любых из различных областей и способов, описанных в настоящем описании, и для любых применений, описанных в настоящем описании. Например, рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют белок-модулятор, можно использовать в способах стимуляции роста растений; способах защиты растений от патогенов; способах повышения устойчивости растений к стрессовым воздействиям; способах иммобилизации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растениях; способах стимуляции прорастания семян растения; способах доставки нуклеиновых кислот в растение; способах доставки нуклеиновых кислот животным, насекомым, червям (например, нематодам), грибам или простейшим; способах доставки ферментов в растение; способах изменения свойств растений; способах доставки белков или пептидов животному; вакцинах и способах достижения иммуногенного ответа у индивидуума; способах уменьшения содержания загрязняющих примесей в окружающей среде; способах фиторекультивации загрязненной почвы; способах обработки жидкости гидроразрыва пласта для разрушения эмульсии или геля в жидкости; способах дезинфекции поверхности; и для таких применений, как обработка или дегуммирование смазки, масла или жира; переработка шкур в кожу; получение биотоплива, биодизеля или биоэтанола; переработка или конверсия сахаров; обработка крахмала; переработка бумаги или льна; обработка побочных продуктов животных или грибов или выделение аминокислот; направленное расщепление технических отходов; добавки в пищу и корма; диетические добавки; корма для животных; промышленная очистка; переработка зерна; косметическое производство; дезодорация; переработка продуктов питания или напитков; оптимизация пивоварения или добавки для пивоварения; детергентные добавки или переработка тканей или пряжи.
[00183] Для многих применений белков (например, ферментов), существует кривая биологического ответа, где оптимальная концентрация белка или фермента приводит к желаемому эффекту, и избыток белка или слишком малое количество белка приводит к нежелательным или уменьшенным эффектам. Одним примером этой биологической кривой является демонстрация того, что биологическое лекарственное средство, такое как белковое лекарственное средство инсулин для лечения диабета, требует оптимальной дозы для снижения уровней сахара в крови у пациентов с диабетом. Слишком малое количество инсулина приводит к недостаточному ответу и поддержанию нежелательных повышенных уровней сахара в крови и потенциальной гиперкалиемии. Слишком большая доза инсулина приводит к низким уровням сахара в крови и потенциальной гипокалиемии и связанной с ней заболеваемостью.
[00184] Сходные кривые биологического ответа существуют для многих представляющих интерес белков и пептидов, содержащихся в слитых белках, описанных в настоящем описании. Таким образом, для различных областей применения и способов для рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в настоящем описании, может быть желательным модулирование уровня экспрессии представляющего интерес белка или пептида на экзоспории. Путем увеличения или снижения уровней экспрессии представляющего интерес белка или пептида на экзоспории рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, уровни экспрессии могут быть оптимизированы для поддержания общего уровня экспрессии представляющего интерес белка или пептида при наиболее эффективной концентрации.
[00185] Например, было бы желательным модулирование уровней экспрессии слитого белка в случаях, когда представляющий интерес белок или пептид включает белок или пептид, вовлеченный в прямую передачу сигнала в растениях, такой как пептид флагеллина flg22, и рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, экспрессирующий слитый белок, наносят на растение для обеспечения благоприятного эффекта на растение. Такое модулирование было бы полезным, чтобы избежать сигнального ответа, который является достаточно высоким, чтобы приводить к вредоносным ответам растения (например, слишком высокий ответ на flg22 может приводить к некрозу), или сигнального ответа, который является достаточно низким, чтобы обеспечить низкий или недостаточный ответ на пептид.
[00186] Кривая биологического ответа также может иметь значение для рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих слитый белок, где представляющий интерес белок или пептид включает антиген. В таких случаях, было бы желательным модулирование уровня экспрессии слитого белка, содержащего антиген, для достижения оптимального диапазона для обеспечения надлежащего иммунного ответа у животного. Слишком высокая доза может приводить к отеку области инъекции и нежелательному воспалению, в то время как слишком низкая доза может приводить к недостаточной вакцинации или иммунному ответу.
[00187] Модулирование уровня экспрессии слитого белка на экзоспории рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus также обеспечивает пользу, например, когда рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus используют для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва пласта. Полисахаридные гели часто используют в гелях гидроразрыва пласта. Эти гели требуют разрушения. Когда раствор геля готов к разрушению, для оператора является желательным, чтобы разрушение, которое представляет собой ферментативную реакцию, происходило с конкретной оптимизированной скоростью. Слишком быстрое разрушение геля может привести к нежелательным побочным эффектам, таким как накопление нерасщепленных фрагментов геля. С другой стороны, слишком медленное разрушение приводит к длительному времени ожидания и увеличению расходов. С использованием способов, описанных в настоящем описании ниже, уровни ферментов на экзоспории рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего слитый белок, содержащий фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва, можно модулировать для обеспечения наличия оптимизированного уровня фермента для разрушения гелей, что приводит к предпочтительным результатам при использовании в полевых условиях.
[00188] Предусматривается рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует: (i) слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus; и (ii) белок-модулятор, где экспрессия белка-модулятора увеличена по сравнению с экспрессией белка-модулятора в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях. Белок-модулятор, когда он совместно экспрессируется со слитым белком в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, приводит к увеличенной или сниженной экспрессии слитого белка по сравнению с уровнем экспрессии слитого белка в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, который не экспрессирует белок-модулятор на увеличенном уровне, по сравнению с экспрессией белка-модулятора в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[00189] Белок-модулятор может включать белок ExsY, белок ExsFA/BxpB, белок CotY, белок CotO, белок ExsFB, белок InhA1, белок InhA2, белок ExsJ, белок ExsH, белок YjcA, белок YjcB, белок BclC, белок AcpC, белок InhA3, аланинрацемазу 1, аланинрацемазу 2, белок BclA, белок BclB, белок BxpA, белок BclE, белок BetA/BAS3290, белок CotE, белок ExsA, белок ExsK, белок ExsB, белок YabG, белок Tgl, белок SODA1, белок SODA2, вариант любого из них или комбинацию любых из них.
[00190] Например, белок-модулятор, когда он совместно экспрессируется в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus со слитым белком, приводит к увеличенной экспрессии слитого белка относительно уровня экспрессии слитого белка в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, который не экспрессирует белок-модулятор на увеличенном уровне, по сравнению с экспрессией белка-модулятора в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях. Когда белок-модулятор, когда он совместно экспрессируется в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus со слитым белком, приводит к увеличенной экспрессии слитого белка, белок-модулятор может включать белок BclB, белок CotE, белок BxpB, белок CotO, белок BclA, вариант любого из них или комбинацию любых из них.
[00191] Альтернативно белок-модулятор, когда он совместно экспрессируется в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus со слитым белком, приводит к сниженной экспрессии слитого белка относительно уровня экспрессии слитого белка в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, который не экспрессирует белок-модулятор на увеличенном уровне, по сравнению с экспрессией белка-модулятора в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях. Когда белок-модулятор, когда он совместно экспрессируется рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus со слитым белком, приводит к такой сниженной экспрессии слитого белка, белок-модулятор может включать белок BclC, белок ApcC, белок YjcB, вариант любого из них или комбинацию любых из них.
[00192] Например, белок-модулятор может включать белок CotO, белок BclB, белок ExsFA/BxpB, белок YjcB, любой их вариант или любую их комбинацию.
[00193] Для простоты отсылки описание белков-модуляторов и их SEQ ID NO приведены в таблице 2 ниже.
Таблица 2. Аминокислотные последовательности белков-модуляторов
[00194] Многие из белков-модуляторов имеют гомологи, паралоги или генетические перестройки. Таким образом, многие белки, которые обладают по меньшей мере 70% гомологией с любой из модулирующих последовательностей, приведенных выше в таблице 2, сохраняют способность выступать в качестве белков-модуляторов при сверхэкспрессии в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, который также экспрессирует любой из слитых белков, описанных в настоящем описании. Кроме того, многие из белков-модуляторов (например, BclA, BclB и BclE) имеют внутренние области повторов, которые могут значительно различаться между штаммами. Добавления или уменьшения количества повторов во внутренней области повторов могут влиять на общую гомологию последовательностей, но ожидается, что если гомология N- и C-концевых областей белка сохраняет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с любой из аминокислотных последовательностей белков-модуляторов, приведенных в таблице выше, гомологи будут сохранять способность выступать в качестве белков-модуляторов.
[00195] Таким образом, например, белок-модулятор может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 123-156.
[00196] Белок-модулятор может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 123-156.
[00197] Белок-модулятор может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 123-156.
[00198] Белок-модулятор может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 123-156.
[00199] Белок-модулятор может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 123-156.
[00200] Белок-модулятор может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 123-156.
[00201] Белок-модулятор может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 123-156.
[00202] Белок-модулятор может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 123-156.
[00203] Например, белок-модулятор может включать SEQ ID NO: 124, 126, 134, 135, 143 или 144.
[00204] Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют белок-модулятор, могут содержать вектор, кодирующий белок-модулятор. Например, вектор может включать многокопийную плазмиду. Многокопийные плазмиды позволяют высокие уровни экспрессии белка-модулятора.
III. Промоторы для экспрессии слитых белков и/или белков-модуляторов в рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus
[00205] Когда слитый белок содержит нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus, ДНК, кодирующая слитый белок, в подходящем случае находится под контролем промотора споруляции, который вызывает экспрессию слитого белка на экзоспории эндоспоры представителя семейства B. cereus (например, нативный промотор bclA из представителя семейства B. cereus).
[00206] Таким образом, любые из слитых белков, описанных выше в разделе 1.B, можно экспрессировать в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus под контролем промотора споруляции, который является нативным для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория слитого белка, или части такого промотора.
[00207] Аналогично, любой из белков-модуляторов, описанных выше в разделе II, можно экспрессировать под контролем их нативного промотора или его части.
[00208] Любой из слитых белков или белков-модуляторов можно экспрессировать под контролем промотора споруляции с высокой экспрессией.
[00209] Промотор споруляции с высокой экспрессией включает промоторную последовательность полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции.
[00210] Для простоты отсылки, иллюстративные нуклеотидные последовательности промоторов, которые можно использовать для экспрессии любого из слитых белков или любого из белков-модуляторов в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, представлены в таблице 3 ниже вместе с их SEQ ID NO. В таблице 3 также предоставлены иллюстративные минимальные промоторные последовательности для многих промоторов. В таблице 3 промоторные последовательности полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции, в промоторах указаны полужирным шрифтом и подчеркнутым текстом. Некоторые из последовательностей имеют множество последовательностей сигма-K, которые перекрываются друг с другом. Перекрывания указаны двойным подчеркиванием в таблице. Промоторные последовательности находятся непосредственно выше инициирующего кодона для каждого из указанных генов. Иными словами, в последовательностях, показанных в таблице 3 ниже, последний нуклеотид промоторной последовательности непосредственно предшествует первому нуклеотиду инициирующего кодона для кодирующей области гена, кодирующего указанный белок.
Таблица 3. Промоторные последовательности для экспрессии слитых белков и белков-модуляторов в рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus
[00211] Промоторные последовательности полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции, среди промоторных последовательностей, представленных в таблице 3, приводят к высоким уровням экспрессии слитого белка или белка-модулятора в ходе поздней споруляции. Консенсусная последовательность для промоторной последовательности полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции, представляет собой CATANNNTN; однако эта последовательность может содержать вплоть до двух мутаций и все еще быть функциональной. Промоторная последовательность полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции, обычно находится выше участка связывания рибосом (RBS).
[00212] Также для экспрессии слитых белков или белков-модуляторов можно использовать промоторы, имеющие высокую степень идентичности последовательности с любой из последовательностей, представленных выше в таблице 3.
[00213] Например, слитый белок или белок-модулятор можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157-231.
[00214] Слитый белок или белок-модулятор можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157-231.
[00215] Слитый белок или белок-модулятор можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157-231.
[00216] Слитый белок или белок-модулятор можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157-231.
[00217] Слитый белок или белок-модулятор можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157-231.
[00218] Слитый белок или белок-модулятор можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую 100% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157-231.
[00219] Например, белок-модулятор или слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора BclA (например, SEQ ID NO: 189, 190, 215, 229 или 230), промотора CotY (например, SEQ ID NO: 161, 162 или 221), промотора ExsY (например, SEQ ID NO: 157, 158 или 220) или индуцируемого рамнозой промотора (например, SEQ ID NO: 225). Например, слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229 или 230.
[00220] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229 или 230.
[00221] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229 или 230.
[00222] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229 или 230.
[00223] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229 или 230.
[00224] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229 или 230.
[00225] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую 100% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229 или 230.
[00226] Слитый белок или белок-модулятор можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего промоторную последовательность полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции, где промоторная последовательность или последовательности полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции, обладают 100% идентичностью с соответствующими нуклеотидами любой из SEQ ID NO: 157-231.
[00227] Слитые белки можно экспрессировать под контролем промотора, который является нативным для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория слитого белка. Таким образом, например, когда нацеливающая последовательность происходит из BclA, слитый белок можно экспрессировать под контролем нативного промотора BclA (например, SEQ ID NO: 189, 190, 215, 229 или 230).
[00228] Белки-модуляторы можно экспрессировать под контролем их нативных промоторов. Таким образом, например, когда белок-модулятор содержит CotO, CotO можно экспрессировать под контролем нативного промотора CotO (например, SEQ ID NO: 163 или 226). Нативные промоторные последовательности для каждого из белков-модуляторов представлены выше в таблице 3.
[00229] В таблице 3 также представлены иллюстративные минимальные промоторные последовательности для каждого белка-модулятора. Белки-модуляторы и слитые белки можно экспрессировать под контролем этих минимальных промоторных последовательностей. Например, белок-модулятор можно экспрессировать под контролем минимального промотора, который содержит часть нативной промоторной последовательности. Например, когда белок-модулятор содержит CotO, CotO можно экспрессировать под контролем минимального промотора CotO (SEQ ID NO: 164).
[00230] Альтернативно белки-модуляторы можно экспрессировать под контролем любого промотора, содержащего промоторную последовательность полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции, независимо от того, является ли промотор нативным промотором для белка-модулятора. Как можно видеть из таблицы 3, каждый из нативных промоторов и минимальных промоторов для белков-модуляторов содержит по меньшей мере одну промоторную последовательность полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции. Таким образом, например, когда белок-модулятор представляет собой BxpB, BxpB можно экспрессировать под контролем промотора BclA (например, SEQ ID NO: 189, 190, 215, 229 или 230) или любого из других промоторов, приведенных в таблице 3.
[00231] Более того, белок-модулятор или слитый белок можно экспрессировать под контролем части любого из промоторов, приведенных выше в таблице 3, при условии, что часть промотора включает промоторную последовательность полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции. Например, белок-модулятор можно экспрессировать под контролем промоторной области, которая содержит первые 25, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 нуклеотидов выше инициирующего кодона, при условии, что эта область содержит промоторную последовательность полимеразы сигма-K, специфичной к споруляции.
IV. Мутации и другие генетические изменения рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus , которые позволяют сбор свободного экзоспория
[00232] Как дополнительно описано в примере ниже, рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитые белки, содержащие представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, можно использовать для доставки представляющих интерес белков или пептидов в растения, семена, среду для роста растений или в область, окружающую семя или растение (например, посредством полива почвы, нанесения на листья или обработки семян). Кроме того, рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus можно использовать для доставки молекул нуклеиновых кислот животным, насекомым, червям (например, нематодам), грибам и простейшим; для доставки белков или пептидов животному; в вакцинах и для достижения иммуногенного ответа; для рекультивации; для обработки жидкости гидроразрыва пласта для разрушения эмульсии или геля в жидкости; для дезинфекции и для различных других применений, описанных в настоящем описании ниже. Однако в некоторых случаях присутствие живых микроорганизмов может быть нежелательным, и вместо этого является желательным отделение живой споры от слитых белков в экзоспории на внешней поверхности споры. Например, в некоторых применениях является желательным увеличение ферментативной активности без нарушения целостности спор. В таких ситуациях фрагменты экзоспория могут быть предпочтительными над живыми микроорганизмами, имеющими фермент в их экзоспории.
[00233] Кроме того, для некоторых применений может быть желательным снижение плотности продукта. В таких случаях является желательным отделение плотных спор от экзоспория (содержащего слитые белки). В области вакцин может быть желательным отделение споры от экзоспория (содержащего слитые белки, которые содержат антиген) для удаления потенциальных антигенов, присутствующих на самой споре, из вакцинного препарата. Более того, в некоторых случаях наличие живых спор может привести к потенциальному росту бактерий в продукте, который может быть нежелательным для некоторых применений (например, дополнение кормов для животных и переработка шкур в кожу).
[00234] В рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus можно вносить мутации и другие генетические изменения (например, сверхэкспрессию белка), которые позволяют отделение свободного экзоспория от спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Процесс отделения обеспечивает фрагменты экзоспория, которые содержат слитые белки, которые по существу свободны от самих спор. Под "по существу свободными от спор" подразумевают, что после отделения экзоспория от спор получают препарат, который содержит менее 5% спор по объему, предпочтительно менее 3% спор по объему, еще более предпочтительно менее 1% спор по объему, и наиболее предпочтительно не содержит спор или, если споры присутствуют, они не поддаются обнаружению. Эти фрагменты экзоспория сами по себе можно использовать вместо рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, и их можно использовать для доставки представляющих интерес белков или пептидов в растения, семена, среду для роста растений или в область, окружающую семя или растение, и для других целей, описанных в настоящем описании.
[00235] Таким образом, предусматривается рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию или экспрессирует белок, где экспрессия белка увеличена по сравнению с экспрессией белка в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях. Мутация и увеличенная экспрессия белка приводит к спорам Bacillus cereus, имеющим экзоспорий, который проще удалить из споры по сравнению с экзоспорием споры дикого типа.
[00236] Кроме того, предусматривается рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus: (i) содержит мутацию в гене CotE; (ii) экспрессирует белок ExsY, где экспрессия белка ExsY увеличена по сравнению с экспрессией белка ExsY в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях, и где белок ExsY содержит С-концевую метку, содержащую глобулярный белок; (iii) экспрессирует белок BclB, где экспрессия белка BclB увеличена по сравнению с экспрессией белка BclB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях; (iv) экспрессирует белок YjcB, где экспрессия белка YjcB увеличена по сравнению с экспрессией белка YjcB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях; (v) содержит мутацию в гене ExsY; (vi) содержит мутацию в гене CotY; (vii) содержит мутацию в гене ExsA или (viii) содержит мутацию в гене CotO.
[00237] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может содержать мутацию в гене CotE, такую как нокаут гена CotE или доминантно-негативная форма гена CotE. Мутация в гене CotE может частично или полностью ингибировать способность CotE связывать экзоспорий со спорой.
[00238] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может экспрессировать белок ExsY. Белок ExsY содержит С-концевую метку, содержащую глобулярный белок (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) или его вариант), и экспрессия белка ExsY увеличена по сравнению с экспрессией белка ExsY в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях. Глобулярный белок может иметь молекулярную массу от 25 кДа до 100 кДа. Экспрессия белка ExsY, содержащего С-концевую метку, содержащую глобулярный белок, также может ингибировать связывание белка ExsY с его мишенями в экзоспории.
[00239] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может экспрессировать белок BclB, который может приводить к образованию непрочного экзоспория. Экспрессия белка BclB может быть увеличена по сравнению с экспрессией белка BclB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[00240] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может экспрессировать белок YjcB, который может приводить к фрагментарному формированию экзоспория, а не в виде полной структуры. Экспрессия белка YjcB может быть увеличена по сравнению с экспрессией белка YjcB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[00241] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может содержать мутацию в гене ExsY, такую как нокаут гена ExsY. Мутация в гене ExsY может частично или полностью ингибировать способность ExsY к завершению образования экзоспория или связыванию экзоспория со спорой.
[00242] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может содержать мутацию в гене CotY, такую как нокаут гена CotY. Мутация в гене CotY может приводить к образованию непрочного экзоспория.
[00243] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может содержать мутацию в гене ExsA, такую как нокаут гена ExsA. Мутация в гене ExsA может приводить к образованию непрочного экзоспория.
[00244] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может содержать мутацию в гене CotO, такую как нокаут гена CotO или доминантно-негативная форма гена CotO. Мутация в гене CotO может приводить к формированию экзоспория полосами.
[00245] Фрагменты экзоспория можно получать из любого из этих рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus и использовать для различных целей, как дополнительно описано в настоящем описании ниже. Фрагменты экзоспория содержат слитые белки. При очистке фрагментов экзоспория, которые содержат слитые белки, от спор, получают бесклеточный белковый препарат, в котором слитые белки стабилизированы и поддерживаются посредством ковалентных связей с фрагментами экзоспория.
[00246] Вследствие прочных ковалентных связей между слитыми белками и фрагментами экзоспория, слитые белки становятся устойчивыми к нагреванию. Устойчивость к нагреванию слитых белков, связанных с фрагментами экзоспория, позволяет их использование для применений, которые требуют устойчивых к нагреванию белков или ферментов (например, в пищевых добавках).
V. Инактивация спор бактерий рода Bacillus , включая споры рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus
[00247] Споры бактерий рода Bacillus можно генетически инактивировать. Генетическая инактивация спор может быть преимущественной, например, поскольку она позволяет доставку спор в растение или среду для роста растений при устранении каких-либо вредоносных эффектов, которые живые бактерии могут оказывать на растение. Кроме того, применение инактивированных спор может обеспечить многие из тех же полезных эффектов (например, предупреждение роста бактерий в продукте), которые рассмотрены выше в разделе IV в отношении применения фрагментов экзоспория.
A. Генетическая инактивация посредством сверхэкспрессии протеазы или нуклеазы
[00248] Предусматривается рекомбинантная бактерия рода Bacillus, которая экспрессирует протеазу или нуклеазу. Экспрессия протеазы или нуклеазы увеличена по сравнению с экспрессией протеазы или нуклеазы в бактерии дикого типа рода Bacillus в тех же условиях. Увеличенная экспрессия протеазы или нуклеазы частично или полностью инактивирует споры рекомбинантной бактерии рода Bacillus или делает споры рекомбинантной бактерии рода Bacillus более чувствительными к физической или химической инактивации.
[00249] Рекомбинантная бактерия рода Bacillus предпочтительно представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus.
[00250] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus также может экспрессировать слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00251] Рекомбинантная бактерия рода Bacillus может экспрессировать как протеазу, так и нуклеазу, где экспрессия протеазы увеличена по сравнению с экспрессией протеазы в бактерии дикого типа рода Bacillus в тех же условиях и экспрессия нуклеазы увеличена по сравнению с экспрессией нуклеазы в бактерии дикого типа рода Bacillus в тех же условиях.
[00252] Протеаза рекомбинантной бактерии может включать неспецифическую протеазу.
[00253] Протеаза рекомбинантной бактерии может включать сериновую протеазу, треониновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспартатную протеазу, протеазу глутаминовой кислоты, щелочную протеазу, субтилизин, гистидиновую протеазу или металлопротеиназу.
[00254] Протеаза рекомбинантной бактерии может содержать протеазу прорастания споры, такую как протеаза прорастания споры Bacillus subtilis, протеаза прорастания споры Bacillus mycoides или протеаза прорастания споры Bacillus thuringiensis.
[00255] Протеаза прорастания споры может включать активную форму протеазы прорастания споры. Эта протеаза в природе неактивна в споре. При прорастании эта протеаза активируется вследствие расщепления протеазы до пробелковой активной формы. Таким образом, рекомбинантная бактерия может содержать активную протеазу, а не неактивную в природе форму. Активная протеаза может расщеплять защитные белки SASP в споре перед прорастанием.
[00256] Нуклеаза рекомбинантной бактерии может содержать эндонуклеазу или экзонуклеазу. Нуклеаза может содержать неспецифическую эндонуклеазу, такую как эндонуклеаза 1 Bacillus subtilis. Например, протеаза прорастания споры и эндонуклеаза 1 могут иметь аминокислотные последовательности, приведенные ниже в таблице 4.
Таблица 4. Аминокислотные последовательности протеазы прорастания споры и эндонуклеазы 1
[00257] Также можно использовать протеазу или нуклеазу, обладающую высокой степенью идентичности аминокислот с последовательностями, приведенными выше в таблице 4.
[00258] Таким образом, например, протеаза прорастания споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 233 или 234.
[00259] Протеаза прорастания споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 233 или 234.
[00260] Протеаза прорастания споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 233 или 234.
[00261] Протеаза прорастания споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 233 или 234.
[00262] Протеаза прорастания споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 233 или 234.
[00263] Протеаза прорастания споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 233 или 234.
[00264] Аналогично, неспецифическая эндонуклеаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 232.
[00265] Неспецифическая эндонуклеаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 232.
[00266] Неспецифическая эндонуклеаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 232.
[00267] Неспецифическая эндонуклеаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 232.
[00268] Неспецифическая эндонуклеаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 232.
[00269] Неспецифическая эндонуклеаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 232.
[00270] Протеазу или нуклеазу можно экспрессировать под контролем промотора, содержащего промоторную последовательность сигма G. Например, промотор может иметь одну из последовательностей, показанных в таблице 5 ниже. Консенсусная последовательность для связывания фактора транскрипции сигма G представляет собой CATNNTA, где N представляет собой любой нуклеотид. Промоторные последовательности сигма G в промоторах, представленных в таблице 5, указаны полужирным шрифтом и подчеркнутым текстом.
Таблица 5. Промоторные последовательности, имеющие последовательности сигма G
(SEQ ID NO: 244)
[00271] Экспрессия нуклеазы или протеазы под контролем промотора сигма-G позволяет сайт-специфическую экспрессию нуклеазы или протеазы в проспоре, где активность фермента направлена на проспору и область, где расположена бактериальная ДНК-мишень. Чрезмерное расщепление ДНК проспоры является летальным для бактериальной споры, когда она начинает прорастать.
[00272] Например, как проиллюстрировано далее в примерах, описанных в настоящем описании ниже, сверхэкспрессия протеазы прорастания споры (GPR) в ее активной форме в проспоре представителя семейства Bacillus cereus в ходе споруляции приводит к протеолитическому расщеплению белков в проспоре и инактивации споры и/или делает спору более чувствительной к инактивации посредством облучения ультрафиолетовым излучением или гамма-излучением. Аналогично, сверхэкспрессия неспецифической эндонуклеазы в проспоре в ходе споруляции разрушает ДНК в споре, что приводит к высокому количеству инактивированных частиц споры. Эти способы инактивации спор представителей семейства Bacillus cereus можно использовать по отдельности или совместно друг с другом и/или с другими способами инактивации спор.
[00273] Экспрессия генов в спорах Bacillus строго регулируется экспрессией специфичных к споруляции сигма-факторов, которые направляют РНК-полимеразу к генам, которые должны экспрессироваться в ходе каждой стадии споруляции. Поздняя экспрессия генов в проспоре, где упакована бактериальная ДНК и необходимые белки, регулируется фактором сигма G. В ходе поздней споруляции бактериальная бактериальный ДНК упаковывается с защитными белками, называемыми малыми растворимыми в кислотах белками (SASP). Эти белки SASP включают, среди прочих, SASPα, SASPβ и SASPγ. Белки SASP защищают бактериальную ДНК от облучения УФ-излучением и других угрожающих факторов. При прорастании пробелок протеазы прорастания споры активируется и расщепляет эти белки SASP.
[00274] Посредством экспрессии GPR под контролем промотора сигма G в проспоре экспрессируется GPR и защитные белки SASP деградируются после начала споруляции, оставляя бактериальную ДНК более чувствительной к деградации. Аналогично, экспрессия неспецифической нуклеазы под контролем промотора сигма G приводит к расщеплению ДНК хозяина. Поскольку спора неспособна репарировать крупномасштабное повреждение ее ДНК, это в конечном итоге приводит к гибели споры. Сверхэкспрессию GPR и неспецифической эндонуклеазы можно использовать вместе для деградации как защитных белков SASP, так и ДНК хозяина.
[00275] Протеазу или нуклеазу можно экспрессировать под контролем любого промотора, содержащего последовательность промотора сигма G.
[00276] Таким образом, протеазу или нуклеазу можно экспрессировать под контролем любого из промоторов, приведенных в таблице 5 выше. Кроме того, протеазу или нуклеазу можно экспрессировать под контролем промотора, имеющего высокую степень идентичности последовательности с любой из промоторных последовательностей, приведенных в таблице 5.
[00277] Например, промотор может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 235-246.
[00278] Промотор может включать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 235-246.
[00279] Промотор может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 235-246.
[00280] Промотор может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую 100% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 235-246.
[00281] В любой из рекомбинантных бактерий рода Bacillus, которые экспрессируют протеазу или нуклеазу, споры рекомбинантной бактерии рода Bacillus могут быть более чувствительными к инактивации, например, посредством облучения ультрафиолетовым излучением, облучения гамма-излучением или посредством обработки отбеливателем, пероксидом водорода, хлороформом, фенолом или уксусной кислотой, по сравнению с теми же спорами, которые не экспрессируют протеазу или нуклеазу на повышенном уровне по сравнению с экспрессией протеазы или нуклеазы в бактерии дикого типа рода Bacillus, обработанной в тех же условиях.
B. Генетическая инактивация посредством мутации гена, кодирующего рецептор прорастания, коровый литический фермент споры, малый растворимый в кислоте белок споры (SASP) или белок оболочки споры
[00282] Споры любого рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок, содержащий нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, также можно генетически инактивировать или можно повышать их чувствительность к физической или химической инактивации посредством модификации представителя семейства Bacillus cereus так, чтобы он содержал мутацию.
[00283] Такие мутации включают нокаут или другие инактивирующие мутации в одном или нескольких генах, кодирующих рецептор прорастания. Гены рецептора прорастания включают, например, GerA, GerB, GerK, GerH, GerI, GerG, GerL, GerQ, GerR, GerS, GerN, GerU или GerX.
[00284] Такие мутации также включают нокаут или другие инактивирующие мутации в литических ферментах коры споры. Например, в литические ферменты коры споры SleB и CwJ можно вносить мутации для инактивации спор. Такие мутации препятствуют росту споры при прорастании и эффективно инактивируют споры.
[00285] Кроме того, такие мутации включают нокаут или другие инактивирующие мутации генов SASP (например, SASPα, SASPβ или SASPγ). Такие мутации устраняют защиту спор от УФ-облучения и делают их более чувствительными к инактивации посредством облучения ультрафиолетовым излучением и другими способами.
[00286] Такие способы также включают нокаут или другие инактивирующие мутации в генах, кодирующих белки оболочки или коры споры (например, CotA, CotB или CotC). Такие мутации делают споры более чувствительными к инактивации физическими или химическими способами, такими как воздействие ультрафиолетового излучения, гамма-излучения или обработка растворителями, такими как отбеливатель, пероксид водорода, хлороформ, фенол или уксусная кислота.
[00287] Таким образом, настоящее изобретение относится к рекомбинантному представителю семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию, которая частично или полностью инактивирует споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или повышает чувствительность спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus к физической или химической инактивации по сравнению с такими же спорами, которые не содержат мутацию. Мутация включает мутацию в гене, кодирующем рецептор прорастания, мутацию в гене, кодирующем литический фермент коры споры, мутацию в гене, кодирующем малый растворимый в кислоте белок споры (SASP), или мутацию в гене, кодирующем белок оболочки или коры споры.
[00288] Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантному представителю семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, как описано в разделе I выше. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию, которая частично или полностью инактивирует споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или повышает чувствительность спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus к физической или химической инактивации по сравнению с такими же спорами, которые не содержат мутацию.
[00289] Любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше в разделе V.A, которые экспрессируют протеазу или нуклеазу, также может содержать мутацию, которая частично или полностью инактивирует споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или делает споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus более чувствительными к физической или химической инактивации по сравнению с такими же спорами, которые не содержат мутацию. Например, мутация может включать мутацию в гене, кодирующем рецептор прорастания, мутацию в гене, кодирующем литический фермент коры споры, мутацию в гене, кодирующем малый растворимый в кислоте белок споры (SASP), или мутацию в гене, кодирующем белок оболочки или коры споры.
[00290] Например, мутация может включать мутацию в гене, кодирующем рецептор прорастания, такую как нокаут гена, кодирующего рецептор прорастания. Рецептор прорастания может включать GerA, GerB, GerK, GerH, GerI, GerG, GerL, GerQ, GerR, GerS, GerN, GerU или GerX.
[00291] Например, мутация может включать мутацию в гене, кодирующем литический фермент коры споры, такую как нокаут гена, кодирующего литический фермент коры споры. Литический фермент коры споры может включать SleB или CwlJ.
[00292] Например, мутация может включать мутацию в гене, кодирующем SASP, такую как мутация в гене SspA, мутация в гене SspB, мутация в гене SspC, мутация в гене SspD, мутация в гене SspE, мутация в гене a SspF, мутация в гене SspG, мутация в гене SspH, мутация в гене SspI, мутация в гене SspJ, мутация в гене SspK, мутация в гене SspL, мутация в гене SspM, мутация в гене SspN, мутация в гене SspO, мутация в гене SspP или их комбинация. SASP может включать SASPα, SASPβ или SASPγ. Споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus могут быть более чувствительными к инактивации посредством облучения ультрафиолетовым излучением или гамма-излучением по сравнению с такими же спорами, которые не содержат мутацию в гене, кодирующем SASP.
[00293] Например, мутация может включать мутацию в гене, кодирующем белок оболочки или коры споры, такую как нокаут гена, кодирующего белок оболочки или коры споры. Белок оболочки или коры споры может включать CotA, CotB или CotC. Споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus могут быть более чувствительными к инактивации посредством облучения ультрафиолетовым излучением, гамма-излучением или посредством обработки отбеливателем, пероксидом водорода, хлороформом, фенолом или уксусной кислотой, по сравнению с такими же спорами, которые не содержат мутацию в белке оболочки или коры споры, обработанными в тех же условиях.
VI. Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus , которые сверхэкспрессируют ферменты экзоспория, которые имеют благоприятные эффекты на растения или замедляют прорастание спор представителя семейства Bacillus cereus
[00294] Также предусматриваются рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, которые сверхэкспрессируют различные белки экзоспория для обеспечения полезных эффектов на растение или замедляют прорастание спор.
[00295] Предусматривается рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует белок экзоспория, где экспрессия белка экзоспория увеличена по сравнению с экспрессией белка экзоспория в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях. Белок экзоспория может содержать фермент экзоспория, где фермент экзоспория включает фермент, вовлеченный в солюбилизацию питательных веществ, инозинуридингидролазу, протеазу, фермент, который катализирует деградацию свободных радикалов, аргиназу или аланинрацемазу. Альтернативно белок экзоспория может включать белок BclA, белок BclB, белок CotE, белок CotO, белок ExsY, белок ExsFA/BxpB, белок CotY, белок ExsFB, белок ExsJ, белок ExsH, белок YjcA, белок YjcB, белок BclC, белок BxpA, белок BclE, белок BetA/BAS3290, белок ExsA, белок ExsK, белок ExsB, белок YabG или белок Tgl.
[00296] Белок экзоспория предпочтительно не является частью слитого белка.
[00297] Иллюстративные аминокислотные последовательности AcpC, InhA1, InhA2, InhA3, SODA1 и SODA2 предоставлены выше в таблицах 1 и 2. Иллюстративные последовательности для аланинрацемазы 1, аланинрацемазы 2, аргиназы, IunH1 и IunH2 соответствуют SEQ ID NO, указанным в таблице ниже.
Таблица 6. Иллюстративные аминокислотные последовательности ферментов экзоспория
[00298] Сверхэкспрессия инозинуридингидролаз и аланинрацемаз препятствует способности спор к прорастанию и, тем самым, поддерживает споры на стадии покоя и повышает стабильность спор.
[00299] Ферменты SODA и аргиназа деградируют свободные радикалы. Споры, которые сверхэкспрессируют эти ферменты, имеют увеличенную устойчивость к стрессовым воздействиям, вызванным свободными радикалами.
[00300] Когда белок экзоспория включает фермент экзоспория, и фермент экзоспория включает фермент, вовлеченный в солюбилизацию питательных веществ, фермент, вовлеченный в солюбилизацию питательных веществ, может включать фермент, вовлеченный в солюбилизацию фосфатов, такой как кислая фосфатаза (например, AcpC). Кислая фосфатаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 137.
[00301] Кислая фосфатаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 137.
[00302] Кислая фосфатаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 137.
[00303] Кислая фосфатаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 137.
[00304] Кислая фосфатаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 137.
[00305] Когда белок экзоспория включает фермент экзоспория, и фермент экзоспория включает инозинуридингидролазу, инозинуридингидролаза может включать IunH1 или IunH2. Инозинуридингидролаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 250 или 251.
[00306] Инозинуридингидролаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 250 или 251.
[00307] Инозинуридингидролаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 250 или 251.
[00308] Инозинуридингидролаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 250 или 251.
[00309] Инозинуридингидролаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 250 или 251.
[00310] Инозинуридингидролаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 250 или 251.
[00311] Когда белок экзоспория включает фермент экзоспория, и фермент экзоспория включает протеазу, протеаза может представлять собой металлопротеиназу (например, InhA1, InhA2 или InhA3). Металлопротеиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130 или 138.
[00312] Металлопротеиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130 или 138.
[00313] Металлопротеиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130 или 138.
[00314] Металлопротеиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130 или 138.
[00315] Металлопротеиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130 или 138.
[00316] Металлопротеиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130 или 138.
[00317] Металлопротеиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130 или 138.
[00318] Когда белок экзоспория включает фермент экзоспория, и фермент экзоспория включает фермент, который катализирует деградацию свободных радикалов, фермент, который катализирует деградацию свободных радикалов, может включать супероксиддисмутазу (например, супероксиддисмутазу 1 (SODA1) или супероксиддисмутазу 2 (SODA2)). Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00319] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00320] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00321] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00322] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00323] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00324] Когда белок экзоспория включает фермент экзоспория, и фермент экзоспория включает аргиназу, аргиназа может включать аргиназу Bacillus thuringiensis. Аргиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 249.
[00325] Аргиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 249.
[00326] Аргиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 249.
[00327] Аргиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 249.
[00328] Аргиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 249.
[00329] Аргиназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 249.
[00330] Когда белок экзоспория включает фермент экзоспория, и фермент экзоспория включает аланинрацемазу, аланинрацемаза может включать аланинрацемазу 1 (ALR1) или аланинрацемазу 2 (ALR2). Аланинрацемаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 247 или 248.
[00331] Аланинрацемаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 247 или 248.
[00332] Аланинрацемаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 247 или 248.
[00333] Аланинрацемаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 247 или 248.
[00334] Аланинрацемаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 247 или 248.
[00335] Аланинрацемаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 247 или 248.
[00336] Белок экзоспория может включать белок BclA, белок BclB, белок CotE, белок CotO, белок ExsY, белок ExsFA/BxpB, белок CotY, белок ExsFB, белок ExsJ, белок ExsH, белок YjcA, белок YjcB, белок BclC, белок BxpA, белок BclE, белок BetA/BAS3290, белок ExsA, белок ExsK, белок ExsB, белок YabG или белок Tgl. Белок экзоспория предпочтительно включает белок BclA, белок BclB, белок CotE или белок CotO. Иллюстративные аминокислотные последовательности для этих белков экзоспория могут быть найдены в таблице 2 выше.
[00337] Белок экзоспория может включать белок BclA. Белок BclA может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 141 или 142.
[00338] Белок BclA может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 141 или 142.
[00339] Белок BclA может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 141 или 142.
[00340] Белок BclA может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 141 или 142.
[00341] Белок BclA может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 141 или 142.
[00342] Белок BclA может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 141 или 142.
[00343] Белок экзоспория может включать белок BclB. Белок BclB может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 143 или 144.
[00344] Белок BclB может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 143 или 144.
[00345] Белок BclB может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 143 или 144.
[00346] Белок BclB может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 143 или 144.
[00347] Белок BclB может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 143 или 144.
[00348] Белок BclB может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 143 или 144.
[00349] Белок экзоспория может включать белок CotE. Белок CotE может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 149.
[00350] Белок CotE может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 149.
[00351] Белок CotE может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 149.
[00352] Белок CotE может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 149.
[00353] Белок CotE может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 149.
[00354] Белок CotE может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 149.
[00355] Белок экзоспория может включать белок CotO. Белок CotO может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 126.
[00356] Белок CotO может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 126.
[00357] Белок CotO может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 126.
[00358] Белок CotO может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 126.
[00359] Белок CotO может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 126.
[00360] Белок CotO может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью с SEQ ID NO: 126.
[00361] Белок экзоспория может включать белок ExsY. Белок ExsY может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 123.
[00362] Белок экзоспория может включать белок ExsFA/BxpB. Белок ExsFA/BxpB может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 124.
[00363] Белок экзоспория может включать белок CotY. Белок CotY может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 125.
[00364] Белок экзоспория может включать белок ExsFB. Белок ExsFB может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 127 или 128.
[00365] Белок экзоспория может включать белок ExsJ. Белок ExJ может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 131.
[00366] Белок экзоспория может включать белок ExsH. Белок ExsH может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 132.
[00367] Белок экзоспория может включать белок YjcA. Белок YjcA может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 133.
[00368] Белок экзоспория может включать белок YjcB. Белок YjcB может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 134 или 135.
[00369] Белок экзоспория может включать белок BclC. Белок BclC может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 136.
[00370] Белок экзоспория может включать белок BxpA. Белок BxpA может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 145.
[00371] Белок экзоспория может включать белок BclE. Белок BclE может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 146 или 147.
[00372] Белок экзоспория может включать белок BetA/BAS3290. Белок BetA/BAS3290 может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 148.
[00373] Белок экзоспория может включать белок ExsA. Белок ExsA может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 150.
[00374] Белок экзоспория может включать белок ExsK. Белок ExsK может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 151.
[00375] Белок экзоспория может включать белок ExsB. Белок ExsB может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 152.
[00376] Белок экзоспория может включать белок YabG. Белок YabG может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 153.
[00377] Белок экзоспория может включать белок Tgl. Белок Tjl белок может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 156.
[00378] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus также может экспрессировать слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
VII. Экспрессия слитых белков в эндофитных представителях семейства Bacillus cereus , в представителях семейства Bacillus cereus, способных деградировать гербициды или пестициды, или в пробиотических представителях семейства Bacillus cereus
[00379] Любой из слитых белков, содержащих представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, может экспрессироваться в эндофитном представителе семейства Bacillus cereus, штамме бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид, или в пробиотическом штамме бактерий.
[00380] Экспрессия слитых белков в эндофитном штамме бактерий обеспечивает способность доставлять представляющий интерес белок или пептид непосредственно в растение. Эндофитные штаммы можно доставлять в растения с использованием различных способов, например, эндофитные штаммы можно доставлять посредством обработки семян, обработки среды для роста растений (например, почвы), полива, нанесения на само растение (например, внекорневое нанесение на надземные части растения). После попадания внутрь растения бактерии увеличиваются в количестве и колонизируют внутренние ткани растения.
[00381] Как дополнительно объяснено в настоящем описании ниже, пробиотические штаммы бактерий, которые экспрессируют слитые белки, и, в частности, штаммы, являющиеся как пробиотическими, так и эндофитными, которые экспрессируют слитые белки, являются пригодными в способах доставки представляющих интерес белков или пептидов (например, ферментов) животным.
[00382] Хотя любые из слитых белков, содержащих представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, могут экспрессироваться в штамме представителя семейства Bacillus cereus, который способен деградировать гербицид или пестицид, как дополнительно объяснено в настоящем описании ниже, эти штаммы являются особенно пригодными в способах деконтаминации среды, загрязненной гербицидом и/или пестицидом.
[00383] Таким образом, настоящее изобретение относится к рекомбинантному представителю семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает эндофитный штамм бактерий, штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид, или пробиотический штамм бактерий.
[00384] Эндофитный штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444 или Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363.
[00385] Например, эндофитный штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444 или Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363.
[00386] Штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид, может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363.
[00387] Пробиотический штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417 или Bacillus cereus EE444.
[00388] Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантному представителю семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает эндофитный штамм бактерий, и слитый белок включает любой из слитых белков, описанных в разделе I выше.
VIII. Нацеливающие последовательности, белки экзоспория и фрагменты белков экзоспория для применения в: (a) рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus , которые экспрессируют слитый белок и совместно с ним сверхэкспрессируют белок-модулятор; (b) рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus , которые включают мутацию или другое генетическое изменение, которое позволяет сбор свободного экзоспория; (c) рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus , которые сверхэкспрессируют протеазу или нуклеазу; (d) рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus , которые экспрессируют слитый белок и сверхэкспрессируют белок экзоспория, который имеет благоприятные эффекты на растения; или (e) или эндофитных рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus , которые экспрессируют слитые белки
[00389] Любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория, или белков экзоспория, описанных в данном разделе, могут находиться в любом из слитых белков в:
(a) любом из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок и сверхэкспрессируют белок-модулятор, описанный в разделе II выше;
(b) любом из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок и содержат мутацию или другое генетическое изменение, которое позволяет сбор свободного экзоспория, описанные в разделе IV выше;
(c) любом из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок и сверхэкспрессируют протеазу или нуклеазу, описанные в разделе V.A;
(d) любом из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок и сверхэкспрессируют белок экзоспория, который имеет благоприятные эффекты на растения, описанные в разделе VI выше; и
(e) любом из эндофитных рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок, описанный в разделе VII выше.
[00391] Например, нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%.
[00392] Например, нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 56% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%.
[00393] Например, нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.
[00394] Например, нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 62% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.
[00395] Например, нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.
[00396] Например, нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 68% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.
[00397] Например, нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.
[00398] Например, нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.
[00399] Например, нацеливающая последовательность может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 90%.
[00400] Например, нацеливающая последовательность может состоять из: (a) аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%; (b) аминокислот 1-35 SEQ ID NO: 1; (c) аминокислот 20-35 SEQ ID NO: 1; (d) SEQ ID NO: 1; (e) SEQ ID NO: 96 или (f) SEQ ID NO: 120.
[00401] Нацеливающая последовательность может состоять из аминокислотной последовательности, как описано в этих примерах.
[00402] Слитый белок может содержать белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00403] Слитый белок может содержать белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00404] Слитый белок может содержать белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00405] Слитый белок может содержать белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00406] Слитый белок может содержать белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00407] Слитый белок может содержать белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 или 122.
[00408] Слитый белок может содержать белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 или 122.
[00409] Слитый белок может содержать белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 или 122.
[00410] Слитый белок может содержать белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 или 122.
[00411] Слитый белок может содержать белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 или 122.
[00412] Нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория слитого белка могут содержать аминокислотную последовательность GXT на C-конце, где X представляет собой любую аминокислоту.
[00413] Нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать остаток аланина в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
[00414] Нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, кроме того, могут содержать остаток метионина, серина или треонина в аминокислотном положении, непосредственно предшествующем первой аминокислоте нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория или в положении нацеливающей последовательности, которая соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
IX. Слитые белки, содержащие представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, рекомбинантные бактерии, формирующие оболочку споры, и семена, покрытые рекомбинантными бактериями, формирующими оболочку споры
A. Белки оболочки споры, которые можно использовать для нацеливания слитого белка, содержащего белок оболочки споры, на поверхность споры рекомбинантной спорообразующей бактерии
[00415] Для экспонирования представляющих интерес белков или пептидов на поверхности споры рекомбинантной спорообразующей бактерии можно использовать ряд белков оболочки споры. Такие бактерии включают любые спорообразующие бактерии и, в частности, включают бактерии родов Bacillus, Lysinibacillus, Virginibacillus, Clostridia и Paenibacillus. Спорообразующие бактерии рода Bacillus включают представителей семейства Bacillus cereus, а также другие виды Bacillus, которые не являются представителями семейства Bacillus cereus (например, бактерии вида Bacillus, которые лишены экзоспория). Эти белки оболочки споры включают CotB, CotC, CgeA, CotB/H, CotG, белок оболочки споры X и CotY. Для простоты отсылки, описание аминокислотных последовательностей для иллюстративных белков оболочки споры, которые можно использовать для нацеливания представляющих интерес белков или пептидов на поверхность споры рекомбинантной спорообразующей бактерии, представлены в таблице 7 ниже вместе с их SEQ ID NO.
Таблица 7. Последовательности белков оболочки споры, используемые для нацеливания представляющих интерес белков и пептидов на поверхность споры рекомбинантной спорообразующей бактерии
B. Слитые белки, содержащие представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры
[00416] Настоящее изобретение также относится к слитым белкам, содержащим по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, где белок оболочки споры включает белок CotB/H, белок споры X или белок CotY, где белок CotY содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 258 или 259.
[00417] Например, белок оболочки споры может включать белок CotB/H.
[00418] Например, белок оболочки споры может включать белок споры X.
[00419] Например, белок оболочки споры может включать белок CotY, где белок CotY содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 258 или 259.
[00420] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 255, 257, 258 или 259.
[00421] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 255, 257, 258 или 259.
[00422] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 255, 257, 258 или 259.
[00423] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 255, 257, 258 или 259.
[00424] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 255, 257, 258 или 259.
[00425] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью с SEQ ID NO: 255, 257, 258 или 259.
C. Рекомбинантные бактерии, формирующие оболочку споры, которые экспрессируют слитые белки, и семена растений, покрытые рекомбинантными бактериями, формирующими оболочку споры
[00426] Предусматриваются рекомбинантные спорообразующие бактерии, которые экспрессируют любые из слитых белков, описанных в разделе IX.B. Рекомбинантные спорообразующие бактерии могут включать эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений.
[00427] Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантной спорообразующей бактерии, которая экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, где белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок CotG, белок оболочки X или белок CotY; и где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений.
[00428] Экспрессия слитого белка в эндофитном штамме бактерий позволяет доставку представляющего интерес белка или пептида внутрь растения. Эндофитные штаммы можно доставлять в растения с использованием различных способов, например, эндофитные штаммы можно доставлять посредством обработки семян, обработки среды для роста семян (например, почвы), полива, нанесения непосредственно на растение (например, внекорневое нанесение на надземные части растения). После попадания в растение бактерии увеличиваются в количестве и колонизируют внутренние ткани растения.
[00429] Настоящее изобретение также относится к семенам растений, покрытым рекомбинантной спорообразующей бактерией, где рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, где белок оболочки споры включает белок cotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок Cot G, белок споры X или белок cotY.
[00430] Рекомбинантная бактерия, формирующая оболочку споры, может включать бактерию рода Bacillus или Lysinibacillus.
[00431] Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантной бактерии рода Bacillus, где рекомбинантная бактерия включает рекомбинантную спорообразующую бактерию и где рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, где белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок Cot G, белок оболочки X или белок CotY. Рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует протеазу или нуклеазу, где экспрессия протеазы или нуклеазы увеличена по сравнению с экспрессией протеазы или нуклеазы в бактерии дикого типа рода Bacillus в тех же условиях, и где увеличенная экспрессия протеазы или нуклеазы частично или полностью инактивирует споры рекомбинантной бактерии рода Bacillus или повышает чувствительность спор рекомбинантной бактерии рода Bacillus к физической или химической инактивации. Протеаза или нуклеаза может представлять собой любую из протеаз или нуклеаз, описанных выше в разделе V.A, и она может экспрессироваться под контролем любых промоторов, описанных выше в разделе V.A. Кроме того, изобретение относится к семенам растений, покрытым такими спорообразующими бактериями. Рекомбинантная бактерия может содержать эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий, или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений.
[00432] В любых из семян растений, описанных в этом разделе, рекомбинантная спорообразующая бактерия может включать эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий, или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений.
[00433] В любых из рекомбинантных спорообразующих бактерий или семян, эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий, или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений, может включать Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442 или Lysinibacillus sphaericus EE443, Bacillus pumilus EE-B00143, Bacillus subtilis EE148, Bacillus subtilis EE218 или Bacillus megaterium EE281. Например, эндофитный штамм бактерий может включать Bacillus subtilis EE405 или Bacillus megaterium EE385.
[00434] Альтернативно, эндофитный штамм, стимулирующий рост растений штамм бактерий или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений, может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444 или Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, Bacillus mycoides EE-B00363, Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, представитель семейства Bacillus cereus EE128, Bacillus thuringiensis BT013A или представитель семейства Bacillus cereus EE349.
[00435] В любых из рекомбинантных спорообразующих бактерий или семян, белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00436] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00437] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00438] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00439] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00440] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00441] Также предусматривается рекомбинантная спорообразующая бактерия, которая экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии. Рекомбинантная спорообразующая бактерия не является рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus. Белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, включает аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96 или аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 121.
[00442] Белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 121.
[00443] Белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 121.
[00444] Белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 121.
[00445] Белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120, или SEQ ID NO: 121.
[00446] Белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью с SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 121.
[00447] Например, белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, может содержать аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 121.
[00448] Рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий, или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений. Например, эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений, включает Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus sphaericus EE443, Bacillus pumilus EE-B00143, Bacillus subtilis EE148, Bacillus subtilis EE218 или Bacillus megaterium EE281. Эндофитный штамм бактерий предпочтительно включает Bacillus sp. EE387.
X. Способы получения слитых белков
[00449] Любой из слитых белков, описанных в настоящем описании, можно получать с использованием стандартных способов клонирования и молекулярной биологии, известных в данной области. Например, ген, кодирующий представляющий интерес белок или пептид (например, ген, кодирующий белок или пептид, стимулирующий рост растений) можно амплифицировать посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) и лигировать с ДНК, кодирующей любые из описанных выше нацеливающих последовательностей, белков экзоспория, фрагментов белков экзоспория или белков оболочки споры, с получением молекулы ДНК, которая кодирует слитый белок. Молекулу ДНК, кодирующую слитый белок, можно клонировать в любой подходящий вектор, например, плазмидный вектор. Вектор в подходящем случае включает участок множественного клонирования, в который можно без труда встраивать молекулу ДНК, кодирующую слитый белок. В подходящем случае вектор также содержит селективный маркер, такой как ген устойчивости к антибиотику, так чтобы бактерии, трансформированные, трансфицированные или скрещенные с вектором, можно было без труда идентифицировать и выделять. Когда вектор представляет собой плазмиду, плазмида в подходящем случае также содержит ориджин репликации. Альтернативно ДНК, кодирующую слитый белок, можно встраивать в хромосомную ДНК представителя семейства B. cereus или спорообразующей бактерии-хозяина.
XI. Метки, маркеры и линкеры, которые могут быть включены в слитые белки
[00450] Любые из слитых белков, описанных в настоящем описании, также могут включать дополнительные полипептидные последовательности, которые не являются частью нацеливающей последовательности, белка экзоспория, фрагмента белка экзоспория или стимулирующего рост растений белка или пептида, белка или пептида, который защищает растение от патогена, белка или пептида, который повышает устойчивость растения к стрессу или связывающегося с растением белка или пептида. Например, слитый белок может включать метки или маркеры для облегчения очистки или визуализации слитого белка (например, полигистидиновая метка или флуоресцентный белок, такой как GFP или YFP) или визуализации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующих слитый белок.
[00451] Экспрессия слитых белков на экзоспории представителя семейства Bacillus cereus или на поверхности споры спорообразующей бактерии с использованием нацеливающих последовательностей, белков экзоспория, фрагментов белков экзоспория и белков оболочки споры, описанных в настоящем описании, повышается вследствие отсутствия вторичной структуры на N-концах этих последовательностях, которая обеспечивает нативную укладку слитых белков и сохранение активности. Надлежащая укладка, кроме того, может быть улучшена путем включения короткого аминокислотного линкера между нацеливающей последовательностью, белком экзоспория, фрагментом белка экзоспория, белком оболочки споры и представляющим интерес белком или пептидом.
[00452] Таким образом, любой из слитых белков, описанных в настоящем описании, может включать аминокислотный линкер между нацеливающей последовательностью, белком экзоспория, фрагментом белка экзоспория или белком оболочки споры и представляющим интерес белком или пептидом.
[00453] Линкер может включать полиаланиновый линкер или полиглициновый линкер. Также можно использовать линкер, содержащий смесь остатков как аланина, так и глицина.
[00454] Например, в слитом белке, в котором нацеливающая последовательность содержит SEQ ID NO: 1, слитый белок может иметь одну из следующих структур:
Нет линкера: SEQ ID NO: 1-POI
Аланиновый линкер: SEQ ID NO: 1-An-POI
Глициновый линкер: SEQ ID NO: 1-Gn-POI
Смешанный аланиновый и глициновый линкер: SEQ ID NO: 1 - (A/G)n - POI
где An, Gn и (A/G)n представляют собой любое количество остатков аланина, любое количество остатков глицина или любое количество остатков смеси аланина и глицина, соответственно. Например, n может составлять от 1 до 25, и предпочтительно составляет от 6 до 10. Когда линкер содержит смесь остатков аланина и глицина, можно использовать любую комбинацию остатков глицина и аланина. В описанных выше структурах, "POI" представляет собой представляющий интерес белок или пептид.
[00455] Альтернативно или дополнительно, линкер может включать участок распознавания протеазой. Включение участка распознавания протеазой позволяет направленное удаление под воздействием протеазы, которая распознает участок распознавания протеазой, представляющего интерес белка или пептида.
XII. Представляющие интерес белки и пептиды
[00456] Представляющий интерес белок или пептид может включать любой белок или пептид.
[00457] Представляющий интерес белок или пептид в слитых белках, описанных в настоящем описании, может включать, например: (a) стимулирующий рост растений белок или пептид; (b) белок или пептид, который защищает растение от патогена; (c) белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям; (d) связывающийся с растением белок или пептид; (e) фермент, который катализирует продукцию оксида азота; (f) связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид; или (g) сигнальную молекулу растения или белок или пептид, который изменяет состав растения; (h) антиген; (i) фермент рекультивации; (j) фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва пласта; или (k) антибактериальный белок или пептид.
A. Стимулирующие рост растения белки или пептиды
[00458] Представляющий интерес белок или пептид может включать стимулирующий рост растений белок или пептид.
[00459] Стимулирующий рост растений белок или пептид может включать пептидный гормон, негормональный пептид, фермент, вовлеченный в продукцию или активацию соединения, стимулирующего рост растений, или фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений.
[00460] Например, стимулирующий рост растений белок или пептид может включать пептидный гормон.
[00461] Пептидный гормон может включать фитосульфокин (например, фитосульфокин-α), clavata 3 (CLV3), системин, ZmlGF или SCR/SP11.
[00462] Стимулирующий рост растений белок или пептид может включать негормональный пептид.
[00463] Негормональный пептид может включать RKN 16D10, Hg-Syv46, пептид eNOD40, мелиттин, мастопаран, Mas7, RHPP, POLARIS или ингибитор трипсина kunitz (KTI).
[00464] Стимулирующий рост растений белок или пептид может включать фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения. Фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения, может представлять собой любой фермент, который катализирует любую стадию биологического пути синтеза соединения, который стимулирует рост растения или изменяет структуру растения, или любой фермент, который катализирует конвертирование неактивного или менее активного производного соединения, которое стимулирует рост растения или изменяет структуру растения, в активную или более активную форму соединения.
[00465] Соединение, стимулирующее рост растений, может включать соединение, продуцируемое бактериями или грибами в ризосфере, например 2,3-бутандиол.
[00466] Альтернативно стимулирующее рост растений соединение может включать гормон роста растений.
[00467] Гормон роста растений может включать цитокинин или производное цитокинина, этилен, ауксин или производное ауксина, гибберелловую кислоту или производное гибберелловой кислоты, абсцизовую кислоту или производное абсцизовой кислоты, или жасмоновую кислоту или производное жасмоновой кислоты.
[00468] Когда стимулирующее рост растений соединение включает цитокинин или производное цитокинина, цитокинин или производное цитокинина может включать кинетин, цис-зеатин, транс-зеатин, 6-бензиламинопурин, дигидроксизеатин, N6-(D2-изопентенил)аденин, рибозилзеатин, N6-(D2-изопентенил)аденозин, 2-метилтио-цис-рибозилзеатин, цис-рибозилзеатин, транс-рибозилзеатин, 2-метилтио-транс-рибозилзеатин, рибозилзеатин-5-монофосфат, N6-метиламинопурин, N6-диметиламинопурин, 2ʹ-дезоксизеатинрибозид, 4-гидрокси-3-метил-транс-2-бутениламинопурин, орто-тополин, мета-тополин, бензиладенин, орто-метилтополин, мета-метилтополин или их комбинацию.
[00469] Когда стимулирующее рост растений соединение включает ауксин или производное ауксина, ауксин или производное ауксина может включать активный ауксин, неактивный ауксин, конъюгированный ауксин, встречающийся в природе ауксин или синтетический ауксин, или их комбинацию. Например, ауксин или производное ауксина может включать индол-3-уксусную кислоту, индол-3-пировиноградную кислоту, индол-3-ацетальдоксим, индол-3-ацетамид, индол-3-ацетонитрил, индол-3-этанол, индол-3-пируват, индол-3-ацетальдоксим, индол-3-масляную кислоту, фенилуксусную кислоту, 4-хлориндол-3-уксусную кислоту, конъюгированный с глюкозой ауксин или их комбинацию.
[00470] Фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения, может включать ацетоинредуктазу, индол-3-ацетамидгидролазу, триптофанмонооксигеназу, ацетолактатсинтетазу, α-ацетолактатдекарбоксилазу, пируватдекарбоксилазу, диацетилредуктазу, бутандиолдегидрогеназу, аминотрансферазу (например, триптофанаминотрансферазу), триптофандекарбоксилазу, аминоксидазу, индол-3-пируватдекарбоксилазу, индол-3-ацетальдегиддегидрогеназу, оксидазу боковой цепи триптофана, нитрилгидролазу, нитрилазу, пептидазу, протеазу, аденозинфосфатизопентенилтрансферазу, фосфатазу, аденозинкиназу, аденинфосфорибозилтрансферазу, CYP735A, 5ʹ-рибонуклеотидфосфогидролазу, аденозиннуклеозидазу, зеатин-цис-транс-изомеразу, зеатин-O-глюкозилтрансферазу, β-глюкозидазу, цис-гидроксилазу, цис-гидроксилазу CK, N-глюкозилтрансферазу CK, 2,5-рибонуклеотидфосфогидролазу, аденозиннуклеозидазу, пуриннуклеозидфосфорилазу, зеатинредуктазу, гидроксиламинредуктазу, 2-оксоглутаратдиоксигеназу, гибберелловую 2B/3B гидролазу, гиббераллин-3-оксидазу, гиббераллин-20-оксидазу, хитозаназу, хитиназу, β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, дезаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты или фермент, вовлеченный в продукцию фактора nod (например, nodA, nodB или nodI).
[00471] Когда фермент содержит протеазу или пептидазу, протеаза или пептидаза может представлять собой протеазу или пептидазу, которая расщепляет белки, пептиды, пробелки или препробелки с образованием биологически активного пептида. Биологически активный пептид может представлять собой любой пептид, который демонстрирует биологическую активность.
[00472] Примеры биологически активных пептидов включают RKN 16D10 и RHPP.
[00473] Протеаза или пептидаза, которая расщепляет белки, пептиды, пробелки или препробелки с образованием биологически активного пептида, может включать субтилизин, кислую протеазу, щелочную протеазу, протеиназу, эндопептидазу, экзопептидазу, термолизин, папаин, пепсин, трипсин, проназу, карбоксилазу, сериновую протеазу, глутаминовую протеазу, аспартатную протеазу, цистеиновую протеазу, треониновую протеазу или металлопротеиназу.
[00474] Протеаза или пептидаза может расщеплять белки в богатом белком материале (например, соевой муке или дрожжевом экстракте).
[00475] Когда фермент включает хитозаназу, хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00476] Хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00477] Хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00478] Хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00479] Хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00480] Хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00481] Например, слитый белок может содержать аминокислоты 20-35 BclA (аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1) в качестве нацеливающей последовательности и аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 313, в качестве фермента, который является специфичным к клеточному компоненту бактерии или гриба. Кроме того, слитый белок может содержать линкер (например, полиаланиновый линкер) между нацеливающей последовательностью и ферментом.
[00482] Стимулирующий рост растений белок или пептид может включать фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений.
[00483] Фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, может включать целлюлазу, липазу, лигниноксидазу, протеазу, гликозидгидролазу, фосфатазу, нитрогеназу, нуклеазу, амидазу, нитратредуктазу, нитритредуктазу, амилазу, оксидазу аммиака, лигниназу, глюкозидазу, фосфолипазу, фитазу, пектиназу, глюканазу, сульфатазу, уреазу, ксиланазу или сидерофор.
[00484] При добавлении в среду для роста растений или нанесении на растение, семя или область, окружающую растение или семя растения, слитые белки, содержащие ферменты, которые деградируют или модифицируют источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, могут облегчать переработку питательных веществ вблизи растения и приводить к усиленному поглощению питательных веществ растением или полезными бактериями или грибами вблизи растения.
[00485] Фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, может включать целлюлазу.
[00486] Целлюлаза может включать эндоцеллюлазу (например, эндоглюконаза, такая как эндоглюканаза Bacillus subtilis, эндоглюканаза Bacillus thuringiensis, эндоглюконаза Bacillus cereus или эндоглюконаза Bacillus clausii), экзоцеллюлазу (например, экзоцеллюлаза Trichoderma reesei) или β-глюкозидазу (например, β-глюкозидаза Bacillus subtilis, β-глюкозидаза Bacillus thuringiensis, β-глюкозидаза Bacillus cereus или β-глюкозидаза Bacillus clausii). Целлюлаза предпочтительно включает эндоглюканазу Bacillus subtilis.
[00487] Эндоглюканаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
[00488] Эндоглюканаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
[00489] Эндоглюканаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
[00490] Эндоглюканаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
[00491] Эндоглюканаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
[00492] Эндоглюканаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
[00493] Например, слитый белок может содержать аминокислоты 20-35 BclA (аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1) в качестве нацеливающей последовательности и аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 311, в качестве фермента, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений. Кроме того, слитый белок может содержать линкер (например, полиаланиновый линкер) между нацеливающей последовательностью и ферментом.
[00494] Фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, может включать липазу (например, липаза Bacillus subtilis, липаза Bacillus thuringiensis, липаза Bacillus cereus или липаза Bacillus clausii).
[00495] Фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, может включать оксидазу лигнина. Например, оксидаза лигнина может включать пероксидазу лигнина, лакказу, глиоксальоксидазу, лигниназу или марганцевую пероксидазу.
[00496] Фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, может включать протеазу. Например, протеаза может включать субтилизин, кислую протеазу, щелочную протеазу, протеиназу, пептидазу, эндопептидазу, экзопептидазу, термолизин, папаин, пепсин, трипсин, проназу, карбоксилазу, сериновую протеазу, глутаминовую протеазу, аспартатную протеазу, цистеиновую протеазу, треониновую протеазу или металлопротеиназу.
[00497] Фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, может включать фосфатазу. Например, фосфатаза может включать гидролазу сложных моноэфиров фосфорной кислоты, фосфомоноэстеразу (например, PhoA4), гидролазу сложных диэфиров фосфорной кислоты, фосфодиэстеразу, гидролазу сложных моноэфиров трифосфорной кислоты, фосфорилангидридгидролазу, пирофосфатазу, фитазу (например, фитаза Bacillus subtilis EE148 или фитаза Bacillus thuringiensis BT013A), триметафосфатазу или трифосфатазу.
[00498] Фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, может включать нитрогеназу. Например, нитрогеназа может включать нитрогеназу семейства Nif (например, NifBDEHKNXV Paenibacillus massiliensis).
[00499] Фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, может включать фосфолипазу. Например, фосфолипаза может включать фосфолипазу A1, фосфолипазу A2, фосфолипазу C, фосфолипазу D или лизофосфолипазу. Фосфолипаза предпочтительно включает фосфолипазу C.
[00500] Фосфолипаза C может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
[00501] Фосфолипаза C может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
[00502] Фосфолипаза C может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
[00503] Фосфолипаза C может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
[00504] Фосфолипаза C может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
[00505] Фосфолипаза C может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
[00506] Например, слитый белок может содержать аминокислоты 20-35 BclA (аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1) в качестве нацеливающей последовательности и аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 312, в качестве фермента, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений. Кроме того, слитый белок может содержать линкер (например, полиаланиновый линкер) между нацеливающей последовательностью и ферментом.
B. Белки или пептиды, который защищают растения от патогенов
[00507] Представляющий интерес белок или пептид может включать белок или пептид, который защищает растение от патогена.
[00508] Белок или пептид, который защищает растение от патогена, может включать белок или пептид, усиливающий иммунную систему растений.
[00509] Например, белок или пептид, усиливающий иммунную систему растений, может включать гарпин, гарпин-подобный белок, α-эластин, β-эластин, системин, фенилаланинаммиаклиазу, элицитин, дефензин, криптогеин, белок флагеллин или пептид флагеллина (например, flg22).
[00510] Белок или пептид, который защищает растение от патогена, может представлять собой белок или пептид, который обладает антибактериальной активностью, противогрибковой активностью, или как антибактериальной, так и противогрибковой активностью. Примеры таких белков и пептидов включают бактериоцины, лизоцимы, пептиды лизоцима (например, LysM), сидерофоры, авидины, стрептавидины, нерибосомальные активные пептиды, кональбумины, альбумины, лактоферрины, пептиды лактоферрина (например, LfcinB) и TasA.
[00511] Белок или пептид, который защищает растение от патогена, может представлять собой белок или пептид, который обладает инсектицидной активностью, гельминтицидной активностью, подавляет хищничество насекомых или червей, или их комбинацию. Например, белок или пептид, который защищает растение от патогена, может включать инсектицидный бактериальный токсин (например, инсектицидный белок VIP), эндотоксин, токсин Cry (например, токсин Cry из Bacillus thuringiensis), ингибирующий протеазу белок или пептид (например, ингибитор трипсина или ингибитор протеазы arrowhead), цистеиновую протеазу или хитиназу. Когда токсин Cry содержит токсин Cry из Bacillus thuringiensis, токсин Cry может представлять собой белок Cry5B или белок Cry21A. Cry5B и Cry21A имеют инсектицидную и нематоцидную активность.
[00512] Белок, который защищает растение от патогена, может включать фермент. Например, фермент может включать протеазу или лактоназу. Протеазы и лактоназы могут быть специфичными к бактериальной сигнальной молекуле (например, бактериальная сигнальная молекула гомосерин лактона).
[00513] Когда фермент включает лактоназу, лактоназа может включать 1,4-лактоназу, 2-пирон-4,6-дикарбоксилатлактоназу, 3-оксоадипат-енол-лактоназу, актиномицинлактоназу, дезоксилимонат A-кольцевую лактоназу, глюконолактоназу, L-рамноно-1,4-лактоназу, лимонин-D-кольцевую лактоназу, стероид-лактоназу, триацетат-лактоназу или ксилоно-1,4-лактоназу.
[00514] Фермент может включать фермент, который является специфичным к клеточному компоненту бактерии или гриба. Например, фермент может включать β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, хитозаназу, хитиназу, хитозаназа-подобный фермент, литиказу, пептидазу, протеазу, протеазу (например, щелочную протеазу, кислую протеазу или нейтральную протеазу), мутанолизин, стафолизин или лизоцим.
[00515] Когда фермент включает хитозаназу, хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00516] Хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00517] Хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00518] Хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00519] Хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00520] Хитозаназа может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[00521] Например, слитый белок может содержать аминокислоты 20-35 BclA (аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1) в качестве нацеливающей последовательности и аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 313, в качестве фермента, который является специфичным к клеточному компоненту бактерии или гриба. Кроме того, слитый белок может содержать линкер (например, полиаланиновый линкер) между нацеливающей последовательностью и ферментом.
[00522] Для любого из описанных выше белков или пептидов, которые защищают растение от патогена, патоген может включать представляющий интерес белок или пептид, который защищает растение от бактериального патогена, патогена червей или патогена насекомых.
[00523] Например, бактериальный патоген может включать протеобактерию α-класса, протеобактерию β-класса, протеобактерию γ-класса или их комбинацию; или бактериальный патоген включает Agrobacterium tumefaciens, Pantoea stewartii, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas campestris или их комбинацию.
[00524] Белок или пептид, который защищает растение от патогена, может включать белок или пептид, который защищает растение от хищничества патогена червей или насекомых.
[00525] Патоген червей или насекомых может включать гусеницу, совку-ипсилон, мотылька кукурузного, совку травяную, бабочку-совку, хрущика японского, малую кукурузную стеблевую огневку, долгоносика кукурузного, личинку мухи ростковой, гусеницу, выпускающую паутину, огневку кукурузную стеблевую, южного кукурузного корневого червя, южного картофельного проволочника, стеблевого точильщика, жука сахарного тростника, личинку хруща, совку капустную, долгоносика хлопкового, желтую полосатую гусеницу, пьявицу красногрудую, клопа постельного, тлю, совку малую, мексиканскую зерновку бобовую, соевую совку, соевого стеблевого точильщика или их комбинацию.
C. Белки или пептиды, которые повышают устойчивость растений к стрессовым воздействиям
[00526] Представляющий интерес белок или пептид может включать белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
[00527] Например, белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, может включать фермент, который деградирует обуславливающее стресс соединение. Обуславливающие стресс соединения включают, но не ограничиваются ими, аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (ACC), активные формы кислорода, оксид азота, оксилипины и фенолы. Конкретные активные формы кислорода включают гидроксил, пероксид водорода, кислород и супероксид.
[00528] Фермент, который деградирует обуславливающее стресс соединение, может включать супероксиддисмутазу, оксидазу, каталазу, дезаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты, пероксидазу, антиоксидантный фермент или антиоксидантный пептид.
[00529] Когда фермент, который деградирует обуславливающее стресс соединение, включает супероксиддисмутазу, супероксиддисмутаза может включать супероксиддисмутазу 1 (SODA1) или супероксиддисмутазу 2 (SODA2).
[00530] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00531] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00532] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00533] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00534] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00535] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00536] Белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, может включать белок или пептид, который защищает растение от стрессовых воздействий внешней среды. Стрессовые воздействия внешней среды могут включать, например, засуху, наводнение, жару, заморозки, соль, тяжелые металлы, низкие значения pH, высокие значения pH или их комбинацию. Например, белок или пептид, который защищает растение от стрессовых воздействий внешней среды, может включать белок, индуцирующий формирование микрокристаллов льда, пролиназу, фенилаланинаммиаклиазу, изохоризматсинтазу, изохоризматпируватлиазу или холиндегидрогеназу.
D. Связывающиеся с растениями белки или пептиды
[00537] Представляющий интерес белок или пептид может включать связывающийся с растением белок или пептид. Связывающийся с растением белок или пептид может представлять собой любой белок или пептид, который способен специфически или неспецифически связываться с любой частью растения (например, корень растения или надземная часть растения, такая как лист, стебель, цветок или плод) или с растительным материалом. Таким образом, например, связывающийся с растениями белок или пептид может представлять собой связывающийся с корнями белок или пептид, или связывающийся с листьями белок или пептид.
[00538] Подходящие связывающиеся с растениями белки и пептиды включают адгезины (например, рикадгезин), флагеллины, омптины, лектины, экспансины, структурные белки биопленки (например, TasA или YuaB), белки пилуса, белки завитка, интимины, инвазины, агглютинины и афимбриальные белки.
E. Ферменты, которые катализируют продукцию оксида азота
[00539] Многие виды растений по своему существу не обладают высоким уровнем прорастания. Для таких растений является желательным увеличение уровня прорастания. Оксид азота является мощным фактором, способствующим прорастанию, который, когда он находится вблизи семени растения, повышает прорастание.
[00540] Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория, фрагментов белков экзоспория или белков оболочки споры, описанных в настоящем описании, и фермент, который катализирует продукцию синтазы оксида азота. Таким образом, представляющий интерес белок или пептид может включать фермент, который катализирует продукцию оксида азота. Слитые белки, содержащие фермент, который катализирует продукцию оксида азота, можно экспрессировать в рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus или рекомбинантных спорообразующих бактериях для доставки фермента, который катализирует продукцию оксида азота, в семя растения, растение, среду для роста растения или область, окружающую растение или семя растения, и, тем самым, для стимуляции прорастания.
[00541] Например, фермент, который катализирует продукцию оксида азота, может включать синтазу оксида азота (например, синтазу оксида азота Bacillus thuringiensis или синтазу оксида азота Bacillus subtilis, например, синтазу оксида азота из Bacillus thuringiensis BT013A или Bacillus subtilis 168) или аргиназу.
[00542] Например, синтаза оксида азота может включать одну из аминокислотных последовательностей, описанных ниже в таблице 8.
Таблица 8. Иллюстративные последовательности синтазы оксида азота
[00543] Синтаза оксида азота также может содержать последовательность, имеющую высокую степень идентичности последовательности с последовательностями синтазы оксида азота, представленными в таблице 8 выше. Например, синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00544] Синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00545] синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00546] синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00547] синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00548] синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00549] Когда представляющий интерес белок или пептид включает синтазу оксида азота, слитый белок может содержать одну из аминокислотных последовательностей, показанных в таблице 9 ниже. В последовательностях, показанных в таблице 9 ниже, нацеливающая последовательность представлена полужирным шрифтом, линкер из шести аминокислот указан подчеркиванием и последовательность синтазы оксида азота представлена обычным текстом. Таким образом, слитый белок может содержать SEQ ID NO: 262 или 263.
Таблица 9. Иллюстративные слитые белки, содержащие синтазу оксида азота
[00550] В качестве представляющего интерес белка или пептида в слитых белках можно использовать синтазы оксида азота из ряда видов, включая Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis и Bacillus mycoides.
F. Белки и пептиды, связывающие нуклеиновые кислоты
[00551] Является желательной доставка нуклеиновых кислот в растения на поле, однако ей препятствует нестабильность нуклеиновых кислот, которые быстро деградируются во внешней среде (например, в среде для роста растений, такой как почва).
[00552] Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория, фрагментов белка экзоспория или белков оболочки споры, описанных в настоящем описании, и связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид. Такие слитые белки стабилизируют нуклеиновые кислоты, и их можно использовать для доставки нуклеиновых кислот в почву и/или в растения.
[00553] Таким образом, представляющий интерес белок или пептид может включать связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид. Например, связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид может включать РНК-связывающий белок или пептид или ДНК-связывающий белок или пептид.
[00554] РНК-связывающий белок или пептид может включать неспецифический РНК-связывающий белок или пептид или специфический РНК-связывающий белок или пептид.
[00555] Например, РНК-связывающий пептид может включать белок Hfq (например, белок Hqf Bacillus thuringiensis).
[00556] ДНК-связывающий белок или пептид может включать малый растворимый в кислоте белок споры (SASP). Например, SASP может включать SASP, кодируемый геном SspA, геном SspB, геном SspC, геном SspD, геном SspE, геном SspF, геном SspG, геном SspH, геном SspI, геном SspJ, геном SspK, геном SspL, геном SspM, геном SspN, геном SspO или геном SspP. Например, SASP может включать SASPα, SASPβ или SASPγ. SASP может включать SASP Bacillus thuringiensis.
[00557] Связывающий нуклеиновую кислоту белок может содержать одну из аминокислотных последовательностей, описанных ниже в таблице 10.
Таблица 10. Иллюстративные последовательности SASP и Hfq
[00558] Связывающий нуклеиновую кислоту белок также может содержать последовательность, обладающую высокой степенью идентичности последовательности с любой из последовательностей, представленных выше в таблице 10. Например, связывающий нуклеиновую кислоту белок может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264-266.
[00559] Связывающий нуклеиновую кислоту белок может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264-266.
[00560] Связывающий нуклеиновую кислоту белок может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264-266.
[00561] Связывающий нуклеиновую кислоту белок может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264-266.
[00562] Связывающий нуклеиновую кислоту белок может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264-266.
[00563] Связывающий нуклеиновую кислоту белок может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264-266.
[00564] Например, когда представляющий интерес белок или пептид включает связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, слитый белок может содержать одну из аминокислотных последовательностей, представленных в таблице 11 ниже. В последовательностях, представленных в таблице 11 ниже, нацеливающая последовательность показана полужирным шрифтом, аминокислотный линкер из шести остатков аланина указан подчеркиванием, и последовательность связывающего нуклеиновую кислоту белка или пептида (SASPα, SASPβ или Hfq) показана обычным текстом. Таким образом, например, слитый белок может содержать SEQ ID NO: 267, 268 или 269.
Таблица 11. Иллюстративные слитые белки, содержащие связывающий нуклеиновую кислоту белок
[00565] Также можно использовать нуклеазы как для связывания, так и для расщепления молекул нуклеиновой кислоты. Нуклеазы обладают высокой аффинностью в отношении молекул РНК и ДНК и демонстрируют их ферментативную активность посредством расщепления молекул РНК и/или ДНК на меньшие фрагменты РНК и/или ДНК. Нуклеазы могут быть специфическими, распознающими и расщепляющими конкретные последовательности ДНК или РНК, или неспецифическими, расщепляющими любую ДНК и/или РНК, с которой они контактируют. Нуклеазы можно подразделить на экзонуклеазы (нуклеазы, которые отщепляют нуклеотиды с концов молекул РНК и/или ДНК) или эндонуклеазы (нуклеазы, которые расщепляют фосфодиэфирную связь в полинуклеотидной цепи). Каждый нуклеазный фермент имеет активный центр, который содержит конкретные аминокислоты, которые действуют, катализируя расщепление молекулы нуклеиновой кислоты. Мутация этих активных центров может инактивировать активный центр и обеспечить высокоаффинное связывание нуклеазы с ее субстратом-нуклеиновой кислотой без расщепления субстрата. Таким образом, такие мутанты могут связываться и могут стабилизировать молекулу нуклеиновой кислоты без расщепления молекулы нуклеиновой кислоты.
[00566] Таким образом, связывающий нуклеиновую кислоту белок может включать нуклеазу (например, нуклеазу, имеющую инактивированный активный центр).
[00567] Когда представляющий интерес белок или пептид включает связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, со связывающим нуклеиновую кислоту белком или пептидом может быть связана молекула нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота может включать, например, модулирующую молекулу РНК; молекулу РНК-i; микроРНК; аптамер или молекулу ДНК, которая кодирует модулирующую молекулу РНК, молекулу РНК-i, микроРНК или аптамер.
XIII. Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, являющиеся хозяевами
[00568] Как описано выше, представитель семейства Bacillus cereus может служить в качестве хозяина для экспрессии слитых белков, содержащих нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus; служить в качестве хозяина для экспрессии белков-модуляторов, которые модулируют экспрессию слитого белка; служить в качестве хозяина для сверхэкспрессии фермента экзоспория; может быть генетически инактивирован; или может содержать мутацию или другое генетическое изменение, которое позволяет сбор свободного экзоспория.
[00569] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может совместно экспрессировать два или более из любых слитых белков, описанных выше. Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может совместно экспрессировать по меньшей мере один слитый белок, который содержит связывающийся с растением белок или пептид, вместе со слитым белком, содержащим стимулирующий рост растений белок или пептид, слитым белком, содержащим белок или пептид, который защищает растение от патогена, слитым белком, содержащим белок или пептид, который повышает устойчивость растений к стрессовым воздействиям, слитым белком, содержащим фермент, который катализирует продукцию оксида азота, или слитым белком, содержащим связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид.
[00570] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать любой вид Bacillus, который способен продуцировать экзоспорий. Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis или их комбинацию. В частности, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать Bacillus thuringiensis или Bacillus mycoides.
[00571] Для получения рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего слитый белок, любой представитель семейства Bacillus cereus можно конъюгировать с, трансдуцировать или трансформировать вектором, кодирующим слитый белок, с использованием стандартных способов, известных в данной области (например, посредством электропорации). Затем бактерии можно подвергать скринингу для идентификации трансформантов любым способом, известным в данной области. Например, когда вектор включает ген устойчивости к антибиотику, бактерии можно подвергать скринингу по устойчивости к антибиотику. Альтернативно ДНК, кодирующую слитый белок, можно встраивать в хромосомную ДНК представителя семейства B. cereus, являющегося хозяином. Затем рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus можно подвергать воздействию условий, которые индуцируют споруляцию. Подходящие условия для индукции споруляции известны в данной области. Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus можно высевать на чашки с агаром и инкубировать при температуре приблизительно 30°C в течение нескольких суток (например, 3 суток).
[00572] Также в подходящем случае можно использовать инактивированные штаммы, нетоксичные штаммы или подвергнутые генетическому манипулированию штаммы любого из описанных выше видов. Например, можно использовать Bacillus thuringiensis, которые лишены токсина Cry. Альтернативно или дополнительно, после получения спор рекомбинантного представителя семейства B. cereus, экспрессирующих слитый белок, их можно инактивировать для предупреждения дальнейшего прорастания во время применения. Можно использовать любой способ инактивации бактериальных спор, который известен в данной области. Подходящие способы включают, но не ограничиваются ими, обработку нагреванием, облучение гамма-излучением, облучение рентгеновским излучением, облучение УФ-A, облучение УФ-B, химическую обработку (например, обработка глутаральдегидом, формальдегидом, пероксидом водорода, уксусной кислотой, отбеливателем или любой их комбинацией), или их комбинацию. Альтернативно, можно использовать споры, происходящие из нетоксигенных штаммов или генетически или физически инактивированных штаммов.
[00573] Многие штаммы представителей семейства Bacillus cereus имеют присущие им полезные качества. Например, некоторые штаммы имеют эффекты ускорения роста растений. Любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в настоящем описании, может включать штамм бактерий, ускоряющий рост растений.
[00574] Штамм бактерий, стимулирующий рост растений, может включать штамм бактерий, который продуцирует инсектицидный токсин (например, токсин Cry), продуцирует фунгицидное соединение (например, β-1,3-глюканаза, хитозаназа, литиказа или их комбинация), продуцирует нематоцидное соединение (например, токсин Cry), продуцирует бактерицидное соединение, является устойчивым к одному или нескольким антибиотикам, содержит одну или несколько свободно реплицирующихся плазмид, связывается с корнями растений, колонизирует корни растений, образует биопленки, солюбилизирует питательные вещества, секретирует органические кислоты или имеет любую комбинацию этих эффектов.
[00575] Например, когда рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает ускоряющий рост растений штамм бактерий, ускоряющий рост растений штамм бактерий может включать (a) Bacillus mycoides BT155 (NRRL № B-50921), (b) Bacillus mycoides EE118 (NRRL № B-50918), (c) Bacillus mycoides EE141 (NRRL № B-50916), (d) Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL № B-50922), (e) представитель семейства Bacillus cereus EE128 (NRRL № B-50917), (f) Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL № B-50924), (g) представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), (h) представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), (i) Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или (j) Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121). Каждый из штаммов (a)-(g) был депонирован в United States Department of Agriculture (USDA) Agricultural Research Service (ARS), по адресу 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A., 10 марта 2014 года, и идентифицирован с помощью номера депозита NRRL, указанного в скобках. Bacillus thuringiensis BT013A также известен как Bacillus thuringiensis 4Q7. Каждый из штаммов (h)-(j) был депонирован в USDA ARS 19 августа 2015 года, и идентифицирован с помощью номера депозита NRRL, указанного в скобках.
[00576] Эти ускоряющие рост растений штаммы были выделены из ризосфер различных сильных растений и были идентифицированы по их последовательностям 16S рРНК (приведенным в таблице 12) и с помощью биохимических анализов. Штаммы были идентифицированы по меньшей мере до их родового обозначения с помощью общепринятых биохимических и морфологических индикаторов. Биохимические анализы для подтвержденных грамположительных штаммов, таких как Bacillus, включали анализ роста на среде PEA и питательном агаре, микроскопическое исследование, анализ роста на среде с 5% и 7,5% NaCl, анализ роста при pH 5 и pH 9, анализ роста при 42°C и 50°C, определение способности продуцировать кислоту при ферментации с целлобиозой, лактозой, глицерином, глюкозой, сахарозой, d-маннитом и крахмалом; определение продукции флуоресцентного пигмента; определение гидролиза желатина; анализ восстановления нитратов; определение продукции каталазы, гидролиза крахмала; определение оксидазной реакции, продукции уреазы и подвижности. Идентификация этих штаммов и демонстрация их эффектов ускорения роста растений описаны ниже в примерах.
Таблица 12. Частичные последовательности 16S рРНК для ускоряющих рост растений представителей семейства Bacillus cereus
[00577] Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, содержащий ускоряющий рост растений штамм бактерий, может включать Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE141 или Bacillus thuringiensis BT013A.
[00578] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать эндофитный штамм бактерий. Например, эндофитный штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444 или Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377; Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363.
[00579] Представитель семейства Bacillus cereus EE349 также представляет собой ускоряющий рост растений штамм бактерий, и он описан выше. Как дополнительно описано в примерах ниже, было обнаружено, то представитель семейства Bacillus cereus EE349 также является эндофитным.
[00580] Представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377; Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363 описаны дополнительно ниже в разделе XIV.
[00581] Эндофитный штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377; Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363.
[00582] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид. Как дополнительно рассмотрено ниже в примерах, было обнаружено, что представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, и Bacillus mycoides EE-B00363 способны деградировать гербициды и/или пестициды. Таким образом, когда рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает штамм бактерий, который способен деградировать гербицид, штамм бактерий, который способен деградировать гербицид, может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363.
[00583] Штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид, может деградировать гербицид на основе сульфонилмочевины (например, сульфентразон), гербицид на основе арилтриазина, дикамбу, 2,4-D, фенокси-гербицид, пиретрин, пиретроид или их комбинацию.
[00584] Штамм бактерий, который способен деградировать пестицид, может представлять собой штамм бактерий, который способен деградировать пиретрин.
[00585] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать пробиотический штамм бактерий. Например, пробиотический штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417 или Bacillus cereus EE444.
[00586] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать инактивирующую мутацию в его гене BclA, его гене CotE или его гене CotO (например, нокаут гена BclA, гена CotE или гена CotO). Например, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать инактивирующую мутацию в его гене BclA (например, нокаут гена BclA). Было обнаружено, что экспрессия слитых белков в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, имеющем такую мутацию, приводит к увеличенным уровням экспрессии слитого белка.
XIV. Эндофитные бактериальные штаммы
[00587] Кроме того, настоящее изобретение относится к эндофитным бактериальным штаммам. Хотя многие бактерии ризосферы имеют симбиотическое взаимодействие с растением, только небольшая подгруппа этих бактерий способна к интернализации в растение и к эндофитному росту. Как дополнительно описано в примерах ниже, несколько штаммов представителей семейства Bacillus cereus и несколько бактериальных штаммов, не являющихся представителями семейства Bacillus cereus, было выделено из проростков кукурузы и было обнаружено, что они обладают способностью к эндофитному росту в растениях.
A. Эндофитные представители семейства Bacillus cereus
[00588] Настоящее изобретение относится к биологически чистым бактериальным культурам, которые обладают способностью к эндофитному росту. Бактериальный штамм в каждой из этих бактериальных культур может представлять собой: (a) представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979); (b) Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50974); (c) Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977); (d) Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), (e) Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122); (f) представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); (g) Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или (h) Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121). Каждый из штаммов (a)-(c) был депонирован в United States Department of Agriculture (USDA) Agricultural Research Service (ARS), по адресу 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A., 10 сентября 2014 года, и они идентифицированы с помощью номеров NRRL, предоставленных в скобках после названий каждого штамма. Штамм (d) был депонирован в USDA ARS 17 сентября 2014 года, и он идентифицирован с помощью номера NRRL, предоставленного в скобках после названия штамма. Каждый из штаммов (e)-(h) был депонирован в USDA ARS 19 августа 2015 года и идентифицирован с помощью номеров NRRL, предоставленных в скобках, после названий каждого штамма.
[00589] Новые штаммы, описанные в настоящем описании, были идентифицированы посредством секвенирования 16S рибосомальной РНК (рРНК). Таким образом, представитель семейства Bacillus cereus EE439 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 277. Bacillus thuringiensis EE417 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 278. Bacillus cereus EE444 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 279. Bacillus thuringiensis EE319 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 280. Bacillus thuringiensis EE-B00184 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 301. Представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 304. Bacillus pseudomycoides EE-B00366 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 303. Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121) имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 302. Последовательности 16S рРНК приведены ниже в таблице 13.
Таблица 13. Частичные последовательности 16S рРНК для эндофитных штаммов представителей семейства Bacillus cereus
[00590] Кроме того, настоящее изобретение относится к биологически чистой бактериальной культуре, где бактерии в бактериальной культуре являются мутантами представителя семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представителя семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363, содержащими одну или несколько мутаций, где бактерии являются эндофитными.
B. Другие эндофитные бактериальные штаммы
[00591] Настоящее изобретение также относится к другим биологически чистым бактериальным культурам (не представителей семейства Bacillus cereus), которые обладают способностью расти эндофитно. Эти штаммы были выделены из проростков кукурузы, как подробно описано в примерах ниже.
[00592] Бактериальный штамм каждой из этих бактериальных культур может представлять собой (a) Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), (b) Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), (c) Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), (d) Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), (e) Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975), (f) Lysinibcaillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976) или (g) Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123). Каждый из штаммов (a)-(f) был депонирован в United States Department of Agriculture (USDA) Agricultural Research Service (ARS) по адресу 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A., 10 сентября 2014 года, и они идентифицированы с помощью номеров NRRL, предоставленных в скобках после названий каждого штамма. Следующий депозит, Bacillus sp. EE387, был определен как штамм, подобный Bacillus pumilus. Штамм (g) был депонирован в USDA ARS 19 августа 2015, и он идентифицирован с помощью номера NRRL, предоставленного в скобках после названия.
[00593] Новые штаммы, описанные в настоящем описании, были идентифицированы посредством секвенирования 16S рибосомальной РНК (рРНК). Таким образом, Bacillus megaterium EE385 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 281. Bacillus sp. EE387 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 282. Bacillus circulans EE388 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 283. Bacillus subtilis EE405 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 284. Lysinibacillus fusiformis EE442 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 285. Lysinibcaillus sphaericus EE443 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 286. Bacillus pumilus EE-B00143 имеет последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 305. Последовательности 16s рРНК приведены ниже в таблице 14.
Таблица 14. Частичные последовательности 16S рРНК для эндофитных штаммов, не являющихся представителями семейства Bacillus cereus
[00594] Кроме того, настоящее изобретение относится к биологически чистой бактериальной культуре, где бактерии в бактериальной культуре являются мутантами Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442 или Lysinibcaillus sphaericus EE443, содержащими одну или несколько мутаций, где бактерии являются эндофитными.
[00595] Настоящее изобретение также относится к биологически чистой бактериальной культуре, где бактерии в бактериальной культуре являются мутантами Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442 или Lysinibcaillus sphaericus EE443, содержащими одну или несколько мутаций, где бактерии являются пробиотическими.
XV. Инокуляты
[00596] Кроме того, изобретение относится к инокулятам любого из биологически чистых бактериальных штаммов, описанных выше в предыдущем разделе. Инокуляты предназначены для нанесения на растения, семена растений, среду для роста растений или область, окружающую растение или семя растения, где инокулят содержит эффективное количество любой из биологически чистых бактериальных культур и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.
[00597] Инокулят может содержать эффективное количество смеси, содержащей по меньшей мере две из биологически чистых бактериальных культур, описанных выше в предыдущем разделе.
[00598] Кроме того, инокулят может содержать эффективное количество ризобактерий. Ризобактерии могут представлять собой биологически чистую бактериальную культуру штамма ризобактерий. Ризобактерии могут включать бактерии рода Bradyrhizobium (например, Bradyrhizobium japonicum), бактерии рода Rhizobium (например, Rhizobium phaseoli, Rhizobium leguminosarum или их комбинации), или их комбинации.
XVI. Семена растений, покрытые ферментом, который катализирует продукцию оксида азота, или рекомбинантными бактериями, которые сверхэкспрессируют фермент, который катализирует продукцию оксида азота
[00599] Также предусматриваются семена растений, которые покрыты: (i) ферментом, который катализирует продукцию оксида азота; (ii) супероксиддисмутазой или (iii) рекомбинантным микроорганизмом, который экспрессирует фермент, который катализирует продукцию оксида азота, или супероксиддисмутазу, где экспрессия фермента, который катализирует продукцию оксида азота, или супероксиддисмутазы, увеличена по сравнению с экспрессией фермента, который катализирует продукцию оксида азота, или супероксиддисмутазы в микроорганизме дикого типа в тех же условиях.
[00600] Фермент, который катализирует продукцию оксида азота, может включать синтазу оксида азота или аргиназу.
[00601] Фермент, который катализирует продукцию оксида азота, может включать синтазу оксида азота, такую как синтаза оксида азота из Bacillus thuringiensis BT013A или Bacillus subtilis 168.
[00602] Например, синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00603] Синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00604] Синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00605] Синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00606] Синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00607] Синтаза оксида азота может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00608] Супероксиддисмутаза может включать супероксиддисмутазу 1 (SODA1) или супероксиддисмутазу 2 (SODA2).
[00609] Супероксиддисмутаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00610] Супероксиддисмутаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00611] Супероксиддисмутаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00612] Супероксиддисмутаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00613] Супероксиддисмутаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00614] Супероксиддисмутаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00615] Когда семя растения покрывают рекомбинантным микроорганизмом, рекомбинантный микроорганизм может включать вид Bacillus, Escherechia coli, вид Aspergillus, такой как Aspergillus niger, или вид Sacchromyces, такой как Sacchromyces cerevisiae.
[00616] Например, рекомбинантный микроорганизм может включать представитель семейства Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis или Bacillus megaterium.
[00617] Аминокислотные последовательности иллюстративных ферментов-синтаз оксида азота представлены выше в таблице 8. Аминокислотные последовательности иллюстративных супероксиддисмутаз представлены выше в таблице 2.
XVII. Составы
[00618] Предусматриваются составы, которые содержат рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, как описано в настоящем описании, фрагменты экзоспория, происходящие из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, как описано в настоящем описании, или рекомбинантную спорообразующую бактерию, как описано в настоящем описании, и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.
[00619] Приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель может включать добавку, такую как масло, камедь, смола, глина, полиоксиэтиленгликоль, терпен, вязкое органическое соединение, сложный эфир жирной кислоты, сульфатированный спирт, алкилсульфонат, нефтяной сульфонат, сульфат спирта, алкилбутандиамат натрия, полиэфир тиобутандиоата натрия, бензольное производное ацетонитрила, белковый материал или их комбинацию.
[00620] Приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель может включать загуститель, такой как длинноцепочечный алкилсульфонат полиэтиленгликоля, полиоксиэтилен олеат или их комбинация; поверхностно-активное вещество, такое как тяжелое нефтяное масло, тяжелый нефтяной дистиллят, сложный эфир полиола и жирной кислоты, сложный эфир полиэтоксилированной жирной кислоты, арилалкилполиоксиэтиленгликоль, алкиламинацетат, алкиларилсульфонат, многоатомный спирт, алкилфосфат или их комбинация; или средство против слеживания, такое как соль натрия (например, натриевая соль монометилнафталинсульфоната, натриевая соль диметилнафталинсульфоната, сульфит натрия, сульфат натрия или их комбинация), карбонат кальция, диатомитовая земля или их комбинация.
[00621] Добавка может включать белковый материал, такой как молочный продукт, пшеничная мука, соевая мука, кровь, альбумин, желатин, люцерновая мука, дрожжевой экстракт или их комбинация.
[00622] Приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель может включать вермикулит, уголь, фильтрпрессную грязь для карбонизации на производстве сахара, рисовую шелуху, карбоксиметилцеллюлозу, торф, перлит, мелкий песок, карбонат кальция, муку, квасцы, крахмал, тальк, поливинилпирролидон или их комбинацию.
[00623] Состав может включать состав для покрытия семян, жидкий состав для внесение на растения или в среду для роста растений, или твердый состав для внесения на растения или в среду для роста растений. Состав, покрывающий семена, может содержать водный раствор или раствор на масляной основе для нанесения на семена или порошковый или гранульный состав для нанесения на семена. Жидкий состав для внесения на растения или в среду для роста растений может включать концентрированный состав или готовый для применения состав. Твердый состав для внесения на растения или в среду для роста растений может включать гранульный состав или порошковое средство.
[00624] Кроме того, состав может содержать удобрение, материал удобрения с микронутриентами, инсектицид, гербицид, средство для изменения роста растений, фунгицид, инсектицид, моллюскоцид, альгицид, бактериальный инокулят, грибной инокулят или их комбинацию.
[00625] Бактериальный инокулят может включать бактериальный инокулят рода Rhizobium, бактериальный инокулят рода Bradyrhizobium, бактериальный инокулят рода Mesorhizobium, бактериальный инокулят рода Azorhizobium, бактериальный инокулят рода Allorhizobium, бактериальный инокулят рода Sinorhizobium, бактериальный инокулят рода Kluyvera, бактериальный инокулят рода Azotobacter, бактериальный инокулят рода Pseudomonas, бактериальный инокулят рода Azospirillium, бактериальный инокулят рода Bacillus, бактериальный инокулят рода Streptomyces, бактериальный инокулят рода Paenibacillus, бактериальный инокулят рода Paracoccus, бактериальный инокулят рода Enterobacter, бактериальный инокулят рода Alcaligenes, бактериальный инокулят рода Mycobacterium, бактериальный инокулят рода Trichoderma, бактериальный инокулят рода Gliocladium, бактериальный инокулят рода Glomus, бактериальный инокулят рода Klebsiella или их комбинацию.
[00626] Бактериальный инокулят может включать ускоряющий рост растений штамм бактерий. Ускоряющий рост растений штамм
бактерий может продуцировать инсектицидный токсин, продуцировать фунгицидное соединение, продуцировать нематоцидное соединение, продуцировать бактерицидное соединение, может быть устойчивым к одному или несколькими антибиотикам, может содержать одну или несколько свободно реплицирующихся плазмид, может связываться с корнями растений, колонизировать корни растений, образовывать биопленки, солюбилизировать питательные вещества, секретировать органические кислоты, или может осуществлять их комбинацию.
[00627] Например, бактериальный инокулят может содержать Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL № B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL № B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL № B-50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL № B-50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL № B-50921), Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL № B-50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL № NRRL B-50821), Bacillus mycoides EE118 (NRRL № B-50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL № B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL № B-50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL № B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL № B-50922), представитель семейства Bacillus cereus EE128 (NRRL № B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL № B-50924), Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL № B-50923), представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL № B-50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL № B-50925), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123) или Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), или их комбинацию. Каждый из этих штаммов был депонирован в United States Department of Agriculture (USDA) Agricultural Research Service (ARS), по адресу 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A., 7 марта 2013 года (Bacillus aryabhattai CAP53, Bacillus aryabhattai CAP56, Bacillus flexus BT054, Paracoccus kondratievae NC35, Enterobacter cloacae CAP12 и Bacillus nealsonii BOBA57), 10 марта 2014 года (Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus subtilis EE148, Alcaligenes faecalis EE107,
Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, представитель семейства Bacillus cereus EE128, Bacillus thuringiensis BT013A, Paenibacillus massiliensis BT23, Bacillus cereus family member EE349, Bacillus subtilis EE218 и Bacillus megaterium EE281), или 19 августа 2015 года (представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377; Bacillus pseudomycoides EE-B00366, Bacillus mycoides EE-B00363, Bacillus pumilus EE-B00143 или Bacillus thuringiensis EE-B00184), и они идентифицированы с помощью номеров NRRL, предоставленных в скобках.
[00628] Эти ускоряющие рост растений штаммы были выделены из ризосфер различных сильных растений и были идентифицированы по их последовательностям 16S рРНК и с помощью биохимических анализов. Штаммы были идентифицированы по меньшей мере до их родового обозначения с помощью общепринятых биохимических и морфологических индикаторов. Биохимические анализы для подтвержденных грамотрицательных штаммов, таких как Paracoccus kondratievae, Alcaligenes faecalis и Enterobacter cloacae, включали анализ роста на среде MacConkey и питательном агаре, микроскопическое исследование, анализ роста на среде с 5% и 7,5% NaCl, анализ роста при pH 5 и pH 9, анализ роста при 42°C и 50°C, определение способности продуцировать кислоту при ферментации с целлобиозой, лактозой, глицерином, глюкозой, сахарозой, d-маннитом и крахмалом; определение продукции флуоресцентного пигмента; определение гидролиза желатина; анализ восстановления нитратов; определение продукции каталазы, гидролиза крахмала; определение оксидазной реакции, продукции уреазы и подвижности. Аналогично, биохимические анализы для подтвержденных грамположительных штаммов, таких как Bacillus и Paenibacillus, включали определение роста на среде PEA и питательном агаре, микроскопическое исследование, анализ роста на среде с 5% и 7,5% NaCl, анализ роста при pH 5 и pH 9, анализ роста при 42°C и 50°C, определение способности продуцировать кислоту при ферментации с целлобиозой, лактозой, глицерином, глюкозой, сахарозой, d-маннитом и крахмалом; определение продукции флуоресцентного пигмента; определение гидролиза желатина; анализ восстановления нитратов; определение продукции каталазы, гидролиза крахмала; определение оксидазной реакции, продукции уреазы и подвижности.. Идентификация этих штаммов и демонстрация их эффектов ускорения роста растений описаны ниже в примерах. Частичные последовательности 16S рРНК для штаммов Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, представителя семейства Bacillus cereus EE128, Bacillus thuringiensis BT013A и представителя семейства Bacillus cereus EE349 представлены в таблице 12 выше. Частичные последовательности 16S рРНК для штаммов Bacillus aryabhattai CAP53, Bacillus aryabhattai CAP56, Bacillus flexus BT054, Paracoccus kondratievae NC35, Enterobacter cloacae CAP12, Bacillus nealsonii BOBA57, Bacillus subtilis EE148, Alcaligenes faecalis EE107, Paenibacillus massiliensis BT23, Bacillus subtilis EE218 и Bacillus megaterium EE281 приведены в таблице 15 ниже.
Таблица 15. Частичные последовательности 16S рРНК для дополнительных ускоряющих рост растений штаммов бактерий
[00629] Например, состав может содержать ускоряющий рост растений штамм бактерий, содержащий Paracoccus kondratievae NC35, Bacillus aryabhattai CAP53 или Bacillus megaterium EE281, где состав дополнительно включает любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в настоящем описании, включая любые рекомбинантные ускоряющие рост растений штаммы представителей семейства Bacillus cereus, описанные в настоящем описании (например, рекомбинантные Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE141 или Bacillus thuringiensis BT013A).
[00630] Грибоной инокулят может включать грибной инокулят семейства Glomeraceae, грибной инокулят семейства Claroidoglomeraceae, грибной инокулят семейства Gigasporaceae, грибной инокулят семейства Acaulosporaceae, грибной инокулят семейства Sacculosporaceae, грибной инокулят семейства Entrophosporaceae, грибной инокулят семейства Pacidsporaceae, грибной инокулят семейства Diversisporaceae, грибной инокулят семейства Paraglomeraceae, грибной инокулят семейства Archaeosporaceae, грибной инокулят семейства Geosiphonaceae, грибной инокулят семейства Ambisporaceae, грибной инокулят семейства Scutellosporaceae, грибной инокулят семейства Dentiscultataceae, грибной инокулят семейства Racocetraceae, грибной инокулят отдела Basidiomycota, грибной инокулят отдела Ascomycota, грибной инокулят отдела Zygomycota или их комбинацию.
[00631] Кроме того, спорообразующая бактерия, отдельно или в комбинации с инсектицидом, может содержать эффективное количество по меньшей мере одного фунгицида.
[00632] Типичные фунгицидные ингредиенты также включают каптан (N-трихлорметил)тио-4-циклогексан-1,2-дикарбоксимид), флудиоксони 1 (4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-1-H-пиррол-3-карбонитрил; карбендазим ипродион (коммерчески доступный под торговым названием Rovral.RTM.), тебуконазол, тиабендазол, азоксистробин, прохлораз и оксадиксил (N-(2,6-диметилфенил)-2-метокси-N-(2-оксо-3-оксазолидинил)ацетамид).
[00633] Если состав, семя растения или инокулят содержит фунгицид, фунгицид может включать алдиморф, ампропилфос, ампропилфос калий, андоприм, анилазин, азоконазол, азоксистробин, беналаксил, беноданил, беномил, бензамакрил, бензамакрил-изобутил, биалафос, бинапакрил, бифенил, битертанол, бластицидин-S, боскалид, бромуконазол, бупиримат, бутиобат, полисульфид кальция, капсимицин, каптафол, каптан, карбендазим, карвон, хинометионат, хлобентиазон, хлорфеназол, хлоронеб, хлорпикрин, хлороталонил, хлозолинат, клозилакон, куфранеб, цимоксанил, ципроконазол, ципродинил, ципрофурам, дебакарб, дихлорофен, диклобутразол, диклофлуанид, дикломезин, диклоран, диэтофенкарб, диметиримол, диметоморф, димоксистробин, диниконазол, диниконазол-M, динокап, дифениламин, дипиритион, диталимфос, дитианон, додеморф, додин, дразоксолон, эдифенфос, эпоксиконазол, этаконазол, этиримол, этридиазол, фамоксадон, фенапанил, фенаримол, фенбуконазол, фенфурам, фенитропан, фенпиклонил, фенпропидин, фенпропиморф, фентин ацетат, фентин гидроксид, фербам, феримзон, флуазинам, флеметовер, фторомид, флухинконазол, флурпримидол, флусилазол, флусульфамид, флутоланил, флутриафол, фолпет, фосетил-алюминий, фосетил-натрий, фталид, фуберидазол, фуралаксил, фураметпир, фуркарбонил, фурконазол, фурконазол-цис, фурмeциклокс, гуазатин, гексахлорбензол, гексаконазол, гимексазол, имазалил, имибенконазол, иминоктадин, иминоктадин албесилат, иминоктадин триацетат, йодокарб, ипробенфос (IBP), ипродион, ирумамицин, изопротиолан, изоваледион, касугамицин, крезоксим-метил, препараты меди, такие как: гидроксид меди, нафтенат меди, оксихлорид меди, сульфат меди, оксид меди, оксин-медь и бордосская жидкость, манкупрум, манкозеб, манеб, меферимзон, мепанипирим, мепронил, металаксил, метконазол, метасульфокарб, метфуроксам, метирам, метомеклам, метсульфовакс, милдиомицин, миклобутанил, миклозолин, диметилдитиокарбамат никеля, нитротал-изопропил, нуаримол, офурас, оксадиксил, оксамокарб, оксолиновую кислоту, оксикарбоксим, оксифентиин, паклобутразол, пефуразоат, пенконазол, пенцикурон, фосдифен, пимарицин, пипералин, полиоксин, полиоксорим, пробеназол, прохлораз, процимидон, пропамокарб, пропанозин-натрий, пропиконазол, пропинеб, протиоциназол, пиразофос, пирифенокс, пириметанил, пироквилон, пироксифур, хиноконазол, квинтозен (PCNB), серу и препараты серы, тебуконазол, теклофталам, текназен, тетцикласис, тетраконазол, тиабендазол, тициофен, тифлузамид, тиофанат-метил, тиоксимид, толклофос-метил, толилфлуанид, триадимефон, триадименол, триазбутил, триазоксид, трихламид, трициклазол, тридеморф, трифлоксистробин, трифлумизол, трифорин, униконазол, валидамицин A, винкозолин, виниконазол, зариламид, зинеб, зирам, а также Dagger G, OK-8705, OK-8801, a-(1,1-диметилэтил)-(3-(2-феноксиэтил)-1H-1,2,4-триазол-1-этанол, a-(2,4-дихлорфенил)-[3-фтор-3-пропил-1H-1,2,4-триазол-1-этанол, a-(2,4-дихлорфенил)-[3-метокси-a-метил-1H-1,2,4-триазол-1-этанол, a-(5-метил-1,3-диоксан-5-ил)-[3-[[4-(трифторметил)фенил]метилен]-1H-1,2,4-триазол-1-этанол, (5RS,6RS)-6-гидрокси-2,2,7,7-тетраметил-5-(1 H-1,2,4-триазол-1-ил)-3-октанон, (E)-a-(метоксиимино)-N-метил-2-феноксифенилацетамид, 1-изопропил{2-метил-1-[[[1-(4-метилфенил)этил]амино]карбонил]пропил}карбамат, 1-(2,4-дихлорфенил)-2-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)этанон-O-(фенилметил)оксим, 1-(2-метил-1-нафталенил)-1H-пиррол-2,5-дион, 1-(3,5-дихлорфенил)-3-(2-пропенил)-2,5-пирролидиндион, 1-[(дийодометил)сульфонил]-4-метилбензол, 1-[[2-(2,4-дихлорфенил)-1,3-диоксолан-2-ил]метил]-1H-имидазол, 1-[[2-(4-хлорфенил)-3-фенилоксиранил]метил]-1H-1,2,4-триазол, 1-[1-[2-[(2,4-дихлорфенил)-метокси]фенил]этенил]-1H-имидазол, 1-метил-5-нонил-2-(фенилметил)-3-пирролидинол, 2',6'-дибром-2-метил-4'-трифторметокси-4'-трифторметил-1, 3-тиазолкарбоксанилид, 2,2-дихлор-N-[1-(4-хлорфенил)этил]-1-этил-3-метилциклопропанкарбоксамид, 2,6-дихлор-5-(метилтио)-4-пиримидинилтиоцианат, 2,6-дихлор-N-(4-трифторметилбензил)бензамид, 2,6-дихлор-N-[[4-(трифторметил)фенил]метил]бензамид, 2-(2,3,3-трийод-2-пропенил)-2H-тетразол, 2-[(1-метилэтил)-сульфонил]-5-(трихлорметил)-1,3,4-тиадиазол, 2-[[6-дезокси-4-O-(4-O-метил-(3-D-гликопиранозил)-a-D-глюкопиранозил]амино]-4-метокси-1H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбонитрил, 2-аминобутан, 2-бром-2-(бромметил)пентандинитрил, 2-хлор-N-(2,3-дигидро-1,1,3-триметил-1H-инден-4-ил)-3-пиридинкарбоксамид, 2-хлор-N-(2,6-диметилфенил)-N-(изотиоцианатметил)ацетамид, 2-фенилфенол (OPP), 3,4-дихлор-1-[4-(дифторметокси)фенил]пиррол-2,5-дион, 3,5-дихлор-N-[циано[(1-метил-2-пропинил)окси]метил]бензамид, 3-(1,1-диметилпропил-1-оксо-1H-инден-2-карбонитрил, 3-[2-(4-хлорфенил)-5-этокси-3-изоксазолидинил]пиридин, 4-хлор-2-циано-N,N-диметил-5-(4-метилфенил)-1H-имидазол-1-сульфонамид, 4-метилтетразолo[1,5-a]хиназолин-5(4H)-он, 8-(1,1-диметилэтил)-N-этил-N-пропил-1,4-диоксаспиро[4,5]декан-2-метанамин, сульфат 8-гидроксихинолина, 9H-ксантен-2-[(фениламино)карбонил]-9-карбоновый гидразид, бис-(1-метилэтил)-3-метил-4-[(3-метилбензоил)окси]-2,5-тиофендикарбоксилат, цис-1-(4-хлорфенил)-2-(1 H-1,2,4-триазол-1-ил)циклогептанол, цис-4-[3-[4-(1,1-диметилпропил)фенил-2-метилпропил]-2,6-диметилморфолина гидрохлорид, этил-[(4-хлорфенил)-азо]цианоацетат, бикарбонат калия, метантетратиол-натриевую соль, метил 1-(2,3-дигидро-2,2-диметилинден-1-ил)-1H-имидазол-5-карбоксилат, метил N-(2,6-диметилфенил)-N-(5-изоксазолилкарбонил)-DL-аланинат, метил-N-(хлорацетил)-N-(2,6-диметилфенил)-DL-аланинат, N-(2,3-дихлор-4-гидроксифенил)-1-метилциклогексанкарбоксамид, N-(2,6-диметилфенил)-2-метокси-N-(тетрагидро-2-оксо-3-фуранил)ацетамид, N-(2,6-диметилфенил)-2-метокси-N-(тетрагидро-2-оксо-3-тиенил)ацетамид, N-(2-хлор-4-нитрофенил)-4-метил-3-нитробензолсульфонамид, N-(4-циклогексилфенил)-1,4,5,6-тетрагидро-2-пиримидинамин, N-(4-гексилфенил)-1,4,5,6-тетрагидро-2-пиримидинамин, N-(5-хлор-2-метилфенил)-2-метокси-N-(2-оксо-3-оксазолидинил)ацетамид, N-(6-метокси)-3-пиридинил)циклопропанкарбоксамид, N-[2,2,2-трихлор-1-[(хлорацетил)амино]этил]бензамид, N-[3-хлор-4,5-бис(2-пропинилокси)фенил]-N'-метоксиметанимидамид, N-формил-N-гидрокси-DL-аланин-натриевую соль, O,O-диэтил [2-(дипропиламино)-2-оксоэтил]этилфосфорамидотиоат, O-метил S-фенилфенилпропилфосфорамидотиоат, S-метил-1,2,3-бензотиадиазол-7-карботиоат и спиро[2H]-1-бензопиран-2,1'(3'H)-изобензофуран]-3'-он, N-трихлорметил)тио-4-циклогексан-1,2-дикарбоксимид, тетраметилтиопероксидикарбоновый диамид, метил-N-(2,6-диметилфенил)-N-(метоксиацетил)-DL-аланинат, 4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-1-H-пиррол-3-карбонитрил или их комбинацию.
[00634] Кроме того, подходящие фунгициды включают следующие: (1) соединение, способное ингибировать синтез нуклеиновых кислот, такое как беналаксил, беналаксил-M, бупиримат, хиралаксил, клозилакон, диметиримол, этиримол, фуралаксил, гимексазол, металаксил, металаксил-M, офурас, оксадиксил, оксолиновая кислота; (2) соединение, способное ингибировать митоз и деление клеток, такое как беномил, карбендазим, диэтофенкарб, этабоксам, фуберидазол, пенцикурон, тиабендазол тиофанат-метил, зоксамид; (3) соединение, способное ингибировать дыхание, например, ингибитор дыхания CI, такой как дифлуметорим; ингибитор дыхания CII, такой как боскалид, фенфурам, флутоланил, фураметпир, фурмециклокс, мепронил, оксикарбоксин, пентиопирад, тифлузамид; ингибитор дыхания CIII, такой как амисульбром, азоксистробин, циазофамид, димоксистробин, энестробин, фамоксадон, фенамидон, флуоксастробин, крезоксим-метил, метоминостробин, орисастробин, пикоксистробин, трифлоксистробин; (4) соединение, способное действовать в качестве разобщителя, такое как динокап, флуазинам, мептилдинокап; (5) соединение, способное ингибировать продукцию ATP, такое как фентин ацетат, фентин хлорид, фентин гидроксид; (6) соединение, способное ингибировать биосинтез а.к. и белков, такое как андоприм, бластицидин-S, ципродинил, касугамицин, касугамицин гидрохлорид гидрат, мепанипирим, пириметанил; (7) соединение, способное ингибировать передачу сигнала, такое как фенпиклонил, хиноксифен; (8) соединение, способное ингибировать синтез липидов и мембран, такое как бифенил, клозолинат, эдифенфос, этридиазол, йодокарб, ипробенфос, ипродион, изопротиолан, процимидон, пропамокарб, пропамокарб гидрохлорид, пиразофос, толклофос-метил, винклозолин; (9) соединение, способное ингибировать биосинтез эргостерина, такое как алдиморф, азаконазол, битертанол, бромуконазол, ципроконазол, диклобутразол, диниконазол, диниконазол-M, додеморф, додеморф ацетат, эпоксиконазол, этаконазол, фенаримол, фенбуконазол, фенгексамид, фенпропидин, фенпропиморф, флуквинконазол, флурпримидол, флусилазол, флутриафол, фурконазол, фурконазол-цис, гексаконазол, имазалил, имазалил сульфат, имибенконазол, метконазол, миклобутанил, нафтифин, нуаримол, окспоконазол, паклобутразол, пефуразоат, пенконазол, прохлораз, пропиконазол, протиоконазол, пирибутикарб, пирифенокс, симэконазол, спироксамин, тебуконазол, тербинафин, тетраконазол, триадимефон, триадименол, тридеморф, трифлумизол, трифорин, униконазол, винконазол, вориконазол; (10) соединение, способное ингибировать синтез клеточной стенки, такое как бентиаваликарб, биалафос, диметоморф, флуморф, ипроваликарб, мандипропамид, полиоксины, полиоксорим, валидамицин A; (11) соединение, способное ингибировать биосинтез меланина, такое как карпропамид, диклоцимет, феноксанил, фталид, пироквилон, трициклазол; (12) соединение, способное индуцировать защиту хозяина, такое как ацибензолар-S-метил, пробеназол, тиадинил; (13) соединение, способное иметь множественное действие, такое как бордосская жидкость, каптафол, каптан, хлороталонил, нафтенат меди, оксид меди, оксихлорид меди, препараты меди, такие как гидроксид меди, сульфат меди, дихлофлуанид, дитианон, додин, свободное основание додина, фербам, фторофолпет, фолпет, гуазатин, гуазатина ацетат, иминоктадин, иминоктадин абесилат, иминоктадин триацетат, манкупрум, манкозеб, манеб, метирам, метирам цинк, оксин-медь, пропинеб, сера и препараты серы, включая полисульфид кальция, толилфлуанид, зинеб, зирам; (14) соединение, выбранное из следующего перечня: (2E)-2-(2-{[6-(3-хлор-2-метилфенокси)-5-фторпиримидин-4-ил]окси}фенил)-2-(метоксиимино)-N-метилацетамид, (2E)-2-{2-[({[(1E)-1-(3-{[(E)-1-фтор-2-фенилвинил]окси}фенил)этилиден]амино}окси)метил]фенил}-2-(метоксиимино)-N-метилацетамид, 1-(4-хлорфенил)-2-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)циклогептанол, 1-[(4-метоксифенокси)метил]-2,2-диметилпропил-1H-имидазол-1-карбоксилат, 2,3,5,6-тетрахлор-4-(метилсульфонил)пиридин, 2-бутокси-6-йод-3-пропил-4H-хромен-4-он, 2-хлор-N-(1,1,3-триметил-2,3-дигидро-1H-инден-4-ил)никотинамид, 2-фенилфенол и соли, 3,4,5-трихлорпиридин-2,6-дикарбонитрил, 3,4-дихлор-N-(2-цианофенил)изотиазол-5-карбоксамид, 3-[5-(4-хлорфенил)-2,3-диметилизоксазолидин-3-ил]пиридин, 5-хлор-6-(2,4,6-трифторфенил)-N-[(1R)-1,2,2-триметилпропил][1,2,4]триазоло[1,5-a]пиримидин-7-амин, 5-хлор-7-(4-метилпиперидин-1-ил)-6-(2,4,6-трифторфенил)[1,2,4]триазолo[1,5-a]пиримидин, 5-хлор-N-[(1R)-1,2-диметилпропил]-6-(2,4,6-трифторфенил)[1,2,4]триазолo[1,5-a]пиримидин-7-амин, 8-гидроксихинолина сульфат, бентиазол, бетоксазин, капсимицин, карвон, хинометионат, куфранеб, цифлуфенамид, цимоксанил, дазомет, дебакарб, дихлорофен, дикломезин, диклоран, дифензокват, дифензокват метилсульфат, дифениламин, феримзон, флуметовер, флуопиколид, фторимид, флусульфамид, фосетил-алюминий, фосетил-кальций, фосетил-натрий, гексахлорбензол, ирумамицин, изотианил, метасульфокарб, метил-(2E)-2-{2-[({циклопропил[(4-метоксифенил)имино]метил}тио)метил]фенил}-3-метоксиакрилат, метил 1-(2,2-диметил-2,3-дигидро-1H-инден-1-ил)-1H-имидазол-5-карбоксилат, метилизотиоцианат, метрафенон, милдиомицин, N-[2-(1,3-диметилбутил)фенил]-5-фтор-1,3-диметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дихлор-5-фторбифенил-2-ил)-3-(дифторметил)-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3-этил-3,5,5-триметилциклогексил)-3-(формиламино)-2-гидроксибензамид, N-(4-хлор-2-нитрофенил)-N-этил-4-метилбензолсульфонамид, N-(4-хлорбензил)-3-[3-метокси-4-(проп-2-ин-1-илокси)фенил]пропанамид, N-[(4-хлорфенил)(циано)метил]-3-[3-метокси-4-(проп-2-ин-1-илокси)фенил]пропанамид, N-[(5-бром-3-хлорпиридин-2-ил)метил]-2,4-дихлорникотинамид, N-[1-(5-бром-3-хлорпиридин-2-ил)этил]-2,4-дихлорникотинамид, N-[1-(5-бром-3-хлорпиридин-2-ил)этил]-2-фтор-4-йодоникотинамид, N-[2-(4-{[3-(4-хлорфенил)проп-2-ин-1-ил]окси}-3-метоксифенил)этил]-N&-lt;-(метилсульфонил)валинамид, N-{(Z)-[(циклопропилметокси)имино][6-(дифторметокси)-2,3-дифторфенил]метил}-2-фенилацетамид, N-{2-[1,1'-би(циклопропил)-2-ил]фенил}-3-(дифторметил)-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-{2-[3-хлор-5-(трифторметил)пиридин-2-ил]этил}-2-(трифторметил) бензамид, натамицин, N-этил-N-метил-N'-{2-метил-5-(трифторметил)-4-[3-(триметилсилил)пропокси]фенил}имидоформамид, N-этил-N-метил-N'-{2-метил-5-(дифторметил)-4-[3-(триметилсилил)пропокси]фенил}имидоформамид, никель диметилдитиокарбамат, нитротал-изопропил, O-{1-[(4-метоксифенокси)метил]-2,2-диметилпропил}1H-имидазол-1-карботиоат, октилинон, оксамокарб, оксифентиин, пентахлорфенол и соли, фосфорная кислота и ее соли, пипералин, пропамокарб фосетилат, пропанозин-натрий, проквиназид, пирибенкарб, пирролнитрин, хинтозин, теклофталам, текназин, триазоксид, трихламид, валифенал, зариламид.
[00635] Фунгицид может включать замещенный бензол, тиокарбамат, этилен бис-дитиокарбамат, тиофталидамид, соединение меди, ртутьорганическое соединение, оловоорганическое соединение, соединение кадмия, анилазин, беномил, циклогексамид, додин, этридиазаол, ипродион, метлаксил, тиамимефон, трифорин или их комбинацию.
[00636] Если состав, семя растения или инокулят содержит фунгицид, фунгицид может представлять собой некорневой фунгицид. Некорневой фунгицид включает медь, манкозеб, пентиопирад, триазолы, ципроконазол, метконазол, пропикназол, протиоконазол, тебуконазол, азоксистробин, пиракластобин, флуоксастробин, пикоксистробин, трифлоксистробин, серу, боскалид, тиофанат метил, хлоротанонил, пентиопирад, дифенконазол, флутриафол, ципродинил, флузинам, ипродион, пенфлуфен, циазофамид, флутоланил, цимоксанил, диметоморф, пириметанил, зоксамид, мандипропамид, метринам, пропамокарб, фенамидон, тетраконазол, хлоронаб, гимексазол, толклофос и фенбуконазол.
[00637] Если состав, семя растения или инокулят включает бактериальный инокулят рода Bacillus, бактериальный инокулят может включать Bacillus argri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus, Bacillus endorhythmos, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus lentimorbus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus medusa, Bacillus metiens, Bacillus natto, Bacillus nigrificans, Bacillus popillae, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus sphearicus, Bacillus spp., Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatu или их комбнацию, плюс инокуляты, приведенные в категории Bacillus Genus в Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, First Ed. (1986), включенном в настоящее описание в качестве ссылки в побном объеме.
[00638] Если состав, семя растения или инокулят содержит инсектицид, инсектицид может представлять собой нематицид. Подходящие нематициды включают антибиотические нематициды, такие как абамектин; карбаматные нематициды, такие как ацетопрол, Bacillus chitonosporus, хлорпикрин, бенклотиаз, беномил, Burholderia cepacia, карбофуран, карбосульфан и клеотокард; дазомет, DBCP, DCIP, аланикарб, алдикарб, алдоксикарб, оксамил, диамидафос, фенамифос, фостиэтан, фосфмидон, кадусафос, хлорпирифос, диклофентион, диметоат, этопрофос, фенсуольфотион, фостиазат, гарпины, гетерофос, имициафос, изамидофос, исазофос, метомил, мекарфон, Myrothecium verrucaria, Paecilomyces lilacinus, форат, фосфокарб, тербуфос, тионазин, тиазофос, дазомет, 1,2-диклоропропан, 1,3-дихлорпропен, фурфарал, йодометан, метам, метилбромид, метилизотиоцианат и ксиленолы.
[00639] Например, но не ограничиваясь этим, нематицид и инсектицид может быть предоставлен в форме коммерческого продукта Avicta Duo, который представляет собой смесь абамектина и тиаметоксама, коммерчески доступную от Syngenta.
[00640] Если состав, семя растения или инокулят содержит бактериоцид, он может включать стрептомицин, пенициллины, тетрациклины, ампициллин и оксолиновую кислоту.
[00641] Удобрение может включать жидкое удобрение. Материал микроудобрения может содержать борную кислоту, борат, борную фритту, сульфат меди, медную фритту, хелат меди, натрия тетраборат декагидрат, сульфат железа, оксид железа, сульфат железа аммония, железную фритту, хелат железа, сульфат марганца, оксид марганца, хелат марганца, хлорид марганца, марганцевую фритту, молибдат натрия, молибденовую кислоту, сульфат цинка, оксид цинка, карбонат цинка, цинковую фритту, фосфат цинка, хелат цинка или их комбинацию.
[00642] Удобрение может содержать сульфат аммония, нитрат аммония, сульфат нитрат аммония, хлорид аммония, бисульфат аммония, полисульфид аммония, тиосульфат аммония, водный аммиак, безводный аммиак, полифосфат аммония, сульфат алюминия, нитрат кальция, нитрат кальция аммония, сульфат кальция, кальцинированный магнезит, кальцинированный известняк, оксид кальция, нитрат кальция, доломитовый известняк, гашеную известь, карбонат кальция, фосфат диаммония, фосфат моноаммония, нитрат магния, сульфат магния, нитрат калия, хлорид калия, сульфат калия магния, сульфат калия, нитраты натрия, магнезиальный известняк, магнезию, мочевину, мочевину-формальдегиды, мочевины аммония нитрат, покрытую серой мочевину, покрытую полимером мочевину, изобутилиден димочевину, K2SO4-2MgSO4, каинит, сильвинит, кизерит, английскую соль, элементарную серу, известковую глину, измельченные ракушки устриц, рыбную муку, жмыхи, рыбный ток, кровяную муку, фосфатную руду, суперфосфаты, шлак, костную муку, древесный пепел, навоз, гуано летучих мышей, торфяной мох, компост, глауконитовый песок, муку из семян хлопчатника, муку из перьев, крабовую кормовую муку, рыбную эмульсию, гуминовую кислоту или их комбинацию.
[00643] Состав, семя растения или инокулят также может включать по меньшей мере одно средство биологического контроля, выбранное из (1) бактерий, в частности, спорообразующих бактерий, (2) грибов или дрожжей, и (3) изофлавонов. Предпочтительными являются комбинации, содержащие в качестве средства биологического контроля, в частности, спорообразующую колонизирующую корни бактерию или бактерию, пригодную в качестве биофунгицида, выбранную из группы, состоящей из [группа (1)]: ((1.1) Bacillus agri, (1.2) Bacillus aizawai, (1.3) Bacillus albolactis, (1.4) Bacillus amyloliquefaciens, (1.5) Bacillus cereus, (1.6) Bacillus coagulans, (1.7) Bacillus endoparasiticus, (1.8) Bacillus endorhythmos, (1.9), (1.10) Bacillus kurstaki, (1.11) Bacillus lacticola, (1.12) Bacillus lactimorbus, (1.13) Bacillus lactis, (1.14) Bacillus laterosporus, (1.15) Bacillus lentimorbus, (1.16) Bacillus licheniformis, (1.17) Bacillus medusa, (1.18) Bacillus megaterium, (1.19) Bacillus metiens, (1.20) Bacillus natto, (1.21) Bacillus nigrificans, (1.22) Bacillus popillae, (1.23) Bacillus pumilus, (1.24) Bacillus siamensis, (1.25) Bacillus sphaericus (продукты, известные как VectoLex.sup.S), (1.26) Bacillus subtilis или B. subtilis вариант amyloliquefaciens, (1.27) Bacillus thuringiensis, в частности, B. thuringiensis вариант israelensis (продукты, известные как VectoBac.RTM.) или B. thuringiensis подвид aizawai штамм ABTS-1857 (продукты, известные как XenTari) или B. thuringiensis подвид kurstaki штамм HD-1 (продукты, известные как Dipel ES), (1.28) Bacillus uniflagellatus, (1.29) Delftia acidovorans, в частности, штамм RAY209 (продукты, известные как BioBoost), (1.30) Lysobacter antibioticus, в частности, штамм 13-1 (Biological Control 2008, 45, 288-296), (1.31) Lysobacter enzymogenes, в частности, штамм 3.1T8, (1.32) Pseudomonas chlororaphis, в частности, штамм MA 342 (продукты, известные как Cedomon), (1.33) Pseudomonas proradix (продукты, известные как Proradix.RTM.), (1.34) Streptomyces galbus, в частности, штамм K61 (продукты, известные как Mycostop.RTM., см. Crop Protection 2006, 25, 468-475), (1.35) Streptomyces griseoviridis (продукты, известные как Mycostop.RTM.).
[00644] Кроме того, предпочтительными являются комбинации, содержащие в качестве средства биологического контроля гриб или дрожжи, выбранные из группы, состоящей из [группа (2)]: (2.1) Ampelomyces quisqualis, в частности, штамм AQ 10 (продукт, известный как AQ 10.RTM.), (2.2) Aureobasidium pullulans, в частности, бластоспоры штамма DSM14940 или бластоспоры штамма DSM 14941 или их смеси (продукт, известный как Blossom Protect.RTM.), (2.3) Beauveria bassiana, в частности, штамм ATCC 74040 (продукты, известные как Naturalis.RTM.), (2.4) Candida oleophila, в частности, штамм O (продукты, известные как Nexy), (2.5) Cladosporium cladosporioides H39 (см. Eur. J. Plant Pathol. 2009, 123, 401-414), (2.6), (2.7) Dilophosphora alopecuri (продукты, известные как Twist Fungus), (2.8) Gliocladium catenulatum, в частности, штамм J1446 (продукты, известные как Prestop), (2.9) Lecanicillium lecanii (ранее известные как Verticillium lecanii), в частности, конидии штамма KV01 (продукты, известные как Mycotal.RTM., Vertalec.RTM.), (2.10) Metarhizium anisopliea (продукты, известные как BIO 1020), (2.11) Metschnikovia fructicola, в частности, штамм NRRL Y-30752 (продукты, известные как Shemer.TM.), (2.12) Microsphaeropsis ochracea (продукты, известные как Microx), (2.13), (2.14) Nomuraea rileyi, (2.15), (2.16) Penicillium bilaii, в частности, штамм ATCC22348 (продукты, известные как JumpStart.RTM., PB-50, Provide), (2.17) Pichia anomala, в частности, штамм WRL-076, (2.18) Pseudozyma flocculosa, в частности, штамм PF-A22 UL (продукты, известные как Sporodex L), (2.19) Pythium oligandrum DV74 (продукты, известные как Polyversum), (2.20) Trichoderma asperellum, в частности, штамм ICC 012 (продукты, известные как Bioten), (2.21) Trichoderma harzianum, в частности, T. harzianum T39 (продукты, известные, например, как Trichodex).
[00645] Кроме того, предпочтительными являются комбинации, включающие в качестве средства биологического контроля изофлавон, выбранный из группы, состоящей из [группа (3)]: (3.1) генистеина, (3.2) биоханина A10, (3.3) формононетина, (3.4) даидзеина, (3.5) глицитеина, (3.6) гесперетина, (3.7) нарингенина, (3.8) халькона, (3.9) кумарина, (3.10) амбиол-(2-метил-4-диметиламинометил-5-гидроксибензимидазолдигидрохлорида), (3.11) аскорбата и (3.12) пратенсеина и их солей и сложных эфиров.
[00646] Если состав, семя растения или инокулят содержит инсектицид, инсектицид может включать пиретроиды, фосфороорганические соединения, карамоилоксимы, пиразолы, амидины, галогенированные углеводороды, неоникотинoиды и карбаматы и их производные. В частности, подходящие классы инсектицидов включают фосфорорганические соединения, фенилпиразолы и пиретроиды. Предпочтительными инсектицидами являются инсектициды, известные как тербуфос, хлорпирифос, хлортоксифос, тефлутрин, карбофуран и тебупиримфос. Коммерчески доступные инсектициды включают тиометоксам (коммерчески доступный от Syngenta под торновым названием Cruiser).
[00647] Инсектицид может включать фосфороорганическое соединение, карбамат, пиретроид, акарицид, алкилфталат, борную кислоту, борат, фторид, серу, галогенароматическую замещенную мочевину, сложный эфир углеводорода, инсектицид на биологической основе, или их комбинацию.
[00648] Подходящие инсектициды для применения в рамках настоящего изобретения включают следующие: (1) агонисты/антагонисты ацетилхолиновых рецепторов, такие как хлорникотинилы/неоникотиноиды, никотин, бенсултап или картап. Подходящие примеры хлорникотинилов/неоникотиноидов включают ацетамиприд, динотефуран, нитенпирам, нитиазин, тиаклоприд, тиаметоксам, имидаклотиз и (2E)-1-[(2-хлор-1,3-тиазол-5-ил)метил]-3,5-диметил-N-нитро-1,3,5-триазинан-2-имин; (2) ингибиторы ацетилхолинэстеразы (ACNE), такие как карбаматы и фосфороорганические соединения. Подходящие примеры карбаматов включают аланикарб, алдикарб, алдоксикарб, алликсикарб, аминокарб, бендиокарб, бенфуракарб, буфенкарб, бутакарб, бутокарбоксим, бутоксикарбоксим, карбарил, карбофуран, карбосульфан, хлоэтокарб, диметилан, этиофенкарб, фенобукарб, фенотиокарб, форметанат, фуртиокарб, изопрокарб, метам-натрий, метомил, метолкарб, оксамил, фосфокарб, пиримикарб, промекарб, пропоксур, тиофанокс, триазамат, триметакарб, XMC и ксиликарб. Подходящие примеры фосфороорганических соединений включают ацефат, азаметифос, азинфос (-метил, -этил), бромофос-этил, бромфенвинфос (-метил), бутатиофос, кадусафос, карбофенотион, хлорэтоксифос, хлорфенвинфос, хлормефос, хлорпирифос (-метил/-этил), кумафос, цианофенфос, цианофос, деметон-S-метил, деметон-S-метилсульфон, диалифос, диазинон, дихлофентион, дихлорфос/DDVP, дикротофос, диметоат, диметилвинфос, диоксабензофос, дисульфотон, EPN, этион, этопрофос, этримфос, фамфур, фенамифос, фенитротион, фенсульфотион, фентион, флупиразофос, фонофос, формотион, фосметилан, фостиазат, гептенофос, фодофенфос, ипробенфос, исзофос, изофенфос, изопропил-O-салицилат, изоксатион, малатион, мекарбам, метакрифос, метамидофос, метидатион, мевинфос, монокротофос, налед, ометоат, оксидеметон-метил, паратион (-метил/-этил), фентоат, форат, фозалон, фосмет, фосфамидон, фосфокарб, фоксим, пиримфос (-метил/-этил), профенофос, пропафос, пропетамфос, протиофос, протоат, пираклофос, пиридафентион, пиридатион, квиналфос, себуфос, сульфотеп, сульпрофос, тебупиримфос, темефос, тербуфос, тетрахлорвинфос, тиометон, триазофос, триклорфон и вамидотион; (3) модуляторы натриевых каналов/блокаторы потенциалзависимых натриевых каналов, такие как пиретроиды и оксадиазины. Подходящие примеры пиретроидов включают акринатрин, аллетрин (d-цис-транс, d-транс), бета-цифлутрин, бифентрин, биоаллетрин, биоаллетрин-S-циклопентил-изомер, биоэтанометрин, биоперметрин, биоресметрин, хловапортрин, цис-резметрин, цис-перметрин, клоцитрин, циклопротрин, цифлутрин, цигалотрин, цифенотрин, DDT, дельтаметрин, эмпентрин (1R-изомер), эсфенвалерат, этофенпрокс, фенфлутрин, фенпропатрин, фенпиритрин, фенвалерат, флуброцитринат, флуцитринат, флуфенпрокс, флуметрин, флувалинат, фубфенпрокс, гамма-цигалотрин, имипротрин, кадетрин, лямбда-цигалотрин, метофлутрин, перметрин (цис-, транс-), фенотрин (1R-транс-изомер), праллетрин, профлутрин, протрифенбут, пиресметрин, ресметрин, RU 15525, силафлуофен, тау-флувалинат, тефлутрин, тераллетрин, тетраметрин (1R-изомер), тралоцитрин, тралометрин, трансфлутрин, ZXI 8901 и пиретрины (пиретрум). Подходящий пример оксадиазинов включает индоксакарб; (4) модуляторы ацетилхолиновых рецепторов, такие как спинозины. Подходящий пример спинозинов включают спиносад; (5) антагонисты GABA-зависимых хлоридных каналов, такие как циклодиеновые хлорорганические соединения и фипролы. Подходящие примеры циклодиеновых хлорорганических соединений включают камфехлор, хлордан, эндосульфан, гамма-HCH, HCH, гептахлор, линдан и метоксихлор. Подходящие примеры фипролов включают ацетопрол и ванилипрол; (6) активаторы хлоридных каналов, такие как мектины. Подходящие примеры мектинов включают абамектин, авермектин, эмамектин, эмамектин-бензоат, ивермектин, лепимектин, милбемектин и милбемицин; (7) миметики ювенильных гормонов, такие как диофенолан, эпофеннонан, феноксикарб, гидропрен, кинопрен, метопрен, пирипроксифен, трипрен; (8) агонисты/деструкторы экдизона, такие как диацилгидразины. Подходящие примеры диацилгидразинов включают хромафенозид, галофенозид, метоксифенозид и тебуфенозид; (9) ингибиторы биосинтеза хитина, такие как соединения бензоилмочевины, бупрофезин и циромазин. Подходящие примеры соединений бензоилмочевины включают бистрифлуорон, хлофлуазурон, дифлубензурон, флуазурон, флуциклоксурон, флуфеноксурон, гексафлумурон, луфенурон, новалурон, новифлумурон, пенфлурон, тефлубензурон и трифлумурон; (10) ингибиторы окислительного фосфорилирования, деструкторы ATP, такие как оловоорганические соединения и диафентиурон. Подходящие примеры оловоорганических соединений включают азоциклотин, цигексатин и фенбутатина оксид; (11) средства, разобщающие окислительное фосфорилирование путем нарушения градиента протонов H, такие как пирролы и динитрофенолы. Подходящий пример пирролов включает хлорфенапир. Подходящие примеры динитрофенолов включают бинапакрил, динобутон, динокап и DNOC; (12) ингибиторы транспорта электронов участка I, такие как METI, гидраметилнон и дикофол. Подходящие примеры METI включают феназаквин, фенпироксимат, пиримидифен, пиридабен, тебуфенпирад, толфенпирад; (13) ингибиторы транспорта электроов участка II, такие как ротенон; (14) ингибиторы транспорта электронов участка III, такие как ацеквиноцил и флуакрипирим; (15) микробные деструкторы кишечной оболочки насекомых, такие как штаммы Bacillus thuringiensis; (16) ингибиторы синтеза липидов, такие как тетроновые кислоты и тетрамовые кислоты. Подходящие примеры тетроновых кислот включают спиродиклофен, спиромезифен и спиротетрамат. Подходящий пример тетраминовых кислот включает цис-3-(2,5-диметилфенил)-8-метокси-2-оксо-1-азаспиро[4.5]дец-3-ен-4-илэтилкарбонат (он же: 3-(2,5-диметилфенил)-8-метокси-2-оксо-1-азаспиро[4.5]дец-3-ен-4-илэтиловый эфир угольной кислоты (регистрационный № CAS 382608-10-8); (17) карбоксамиды, такие как флоникамид; (18) октопаминергические агонисты, такие как амитраз; (19) ингибиторы магний-стимулируемой ATP-азы, такик как пропаргит; (20) агонисты рианодиновых рецепторов, такие как фталамиды и ринаксапир. Подходящий пример фталамидов включает N2-[1,1-диметил-2-(метилсульфонил)этил]-3-йодо-N1-[2-метил-4-[1,2,2,2-тетрафтор-1-(трифторметил)этил]фенил]-1,2-бензолдикарбоксамид (т.е. флубендиамид, регистрационный № CAS 272451-65-7); (21) аналоги нереистоксина, такие как тиоциклам водород оксалат и тиосультап-натрий; (22) бологические средства, гормоны или феромоны, такие как азадирактин, Bacillus spec., Beauveria spec., кодлемон, Metarrhizium spec., Paecilomyces spec., thuringiensis и Verticillium spec.; (23) активные соединения, имеющие неизвестные или неуточненные механизмы действия, такие как фумиганты, селективные ингибиторы кормления, ингибиторы роста клещей, амидофлумет; бенклотиаз, бензоксимат, бифеназат, бромпропилат, бупрофезин, хинометиоат, хлордимеформ, хлорбензилат, хлорпикрин, клотиазобен, циклопрен, цифлуметофен, дицикланил, феноксакрим, фентрифанил, флубензимин, флуфенерим, флутензин, госсиплур, гидраметилонон, японилур, метоксадиазон, нефтепродукты, пиперонилбутоксид, олеат калия, пирафлупрол, пиридалил, пирипрол, сульфурамид, тетрадифон, тетрасул, триаратен, вербутин, более того, соединение 3-метилфенилпропилкарбамат (Tsumacide Z), соединение 3-(5-хлор-3-пиридинил)-8-(2,2,2-трифторэтил)-8-азабицикло[3.2.1]октан-3-карбонитрил (регистрационный № CAS 185982-80-3) и соответствующий изомер 3-эндо (регистрационный номер № CAS 185984-60-5) (см. WO 96/37494, WO 98/25923), а также препараты, содержащие эффективные экстракты растений, нематоды, грибы или вирусы. Подходящие примеры фумигантов включают фосфид алюминия, метилбромид и сульфурилфторид. Подходящие примеры селективных ингибиторов кормления включают криолит, флоникамид и пиметрозин. Подхоящие примеры ингибиторов роста клещей включают клофентезин, этоксазол и гекситиазокс.
[00649] Коммерчески доступные нематицидные ингредиенты включают абамектин (коммерчески доступный от Syngenta под торговым названием Avicta).
[00650] Если состав, семя растения или инокулят содержит гербицид, гербицид может включать 2,4-D, 2,4-DB, ацетохлор, ацифлуорфен, алахлор, аметрин, атразин, аминопиралид, бенефин, бенсульфурон, бенсулид, бентазон, бромацил, бромксинил, бутилат, карфентразон, хлоримурон, хлорсульфурон, клетодим, кломазон, клопиралид, клорансулам, циклоат, DCPA, десмедифам, дикамбу, дихлобенил, диклофоп, диклосулам, дифлуфензопир, диметенамид, дикват, диурон, DSMA, эндотал, EPTC, эталфлуралин, этофумесат, феноксапроп, флуазифоп-P, флукарбазон, флуфанецет, флуметсулам, флумиклорак, флумиоксазин, флуометурон, флуроксипир, фомесафен, форамсульфурон, глюфосинат, глифосат, галосульфурон, гексазинон, имазаметабенц, имазамокс, имазапик, имазаквин, имазетапир, изоксабен, изоксафлутол, лактофен, линурон, MCPA, MCPB, мезотрион, метолахлор-с, метрибузин, метсульфурон, молинат, MSMA, напропамид, напталам, никосульфурон, норфлуразон, оризалин, оксидиазон, оксифлуорфен, паракват, пеларгоновую кислоту, пендиметалин, фенмедифам, пиклорам, примисульфурон, продиамин, прометрин, пронамид, пропанил, просульфурон, пиразон, пиритиобак, квинклорак, квизалофоп, римсульфурон, сетоксидим, сидурон, симазин, сульфентразон, сульфометурон, сульфосульфурон, тебутиурон, тебацил, тиазопир, тифенсульфурон, тиобенкарб, тралкоксидим, триаллат, триасульфурон, трибенурон, триклопир, трифлуралин, трифлусульфурон или их комбинацию.
[00651] Гербицид может включать хлорфеноксисоединение, нитрофенольное соединение, нитрокрезольное соединение, дипиридильное соединение, ацетамид, алифатическую кислоту, анилид, бензамид, бензойную кислоту, производное бензойной кислоты, анисовую кислоту, производное анисовой кислоты, бензонитрил, бензотиадиазинона диоксид, тиокарбамат, карбамат, карбанилат, хлорпиридинил, производное циклогексенона, производное динитроаминобензола, соединение фтординитротолуидина, изоксазолидинон, никотиновую кислоту, изопропиламин, производное изопропиламина, оксадиазолинона, фосфат, фталат, соединение пиколиновой кислоты, триазин, триазол, урацил, производное мочевины, эндоталл, хлорат натрия, сульфонилмочевину, арилтриазин или их комбинацию.
[00652] Состав может содержать гербицид и штамм бактерий, который способен деградировать гербицид.
[00653] Штамм бактерий, который способен деградировать гербицид, может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121) или их комбинацию.
[00654] Гербицид, подлежащий деградации, может включать сульфонилмочевину, такую как сульфентразон, арилтриазин, дикамбу, феноксигербицид, 2,4-D, пиретрин, пиретроид или их комбинацию.
[00655] В составы могут быть включены связующие вещества, такие как карбоксиметилцеллюлоза, и природные и синтетические полимеры в форме порошков, гранул или латексов, такие как гуммиарабик, хитин, поливиниловый спирт и поливинилацетат, а также природные фосфолипиды, такие как цефалины и лецитины, и синтетические фосфолипиды. Связующие вещества включают связующие вещества, состоящие предпочтительно из адгезивного полимера, который может быть природным или синтетическим, без фитотоксического эффекта на семена, подлежащие покрытию. Дополнительные связующие вещества, которые могут быть включены, либо отдельно, либо в комбинации, включают, например, простые полиэфиры, сложные эфиры простых полиэфиров, полиангидриды, полиэфируретаны, полиэфирамиды; поливинилацетаты; сополимеры поливинилацетата; поливиниловые спирты и тилозу; сополимеры поливиниловых спиртов; поливинилпирролидоны; полисахариды, включая крахмалы, модифицированные крахмалы и производные крахмалов, декстрины, мальтодекстрины, альгинаты, хитозаны и целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы, простые эфиры целлюлозы и сложные эфиры простых эфиров целлюлозы, включая этилцеллюлозы, метилцеллюлозы, гидроксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозу; жиры; масла; белки, включая казеин, желатин и зеины; гуммиарабики; шеллаки; винилиденхлорид и сополимеры винилиденхлорида; лигносульфонаты, в частности, лигносульфонаты кальция; полиакрилаты, полиметакрилаты и акриловые сополимеры; поливинилакрилаты; полиэтиленоксид; полибутены, полиизобутены, полистирол, полибутадиен, полиэтиленамины, полиэтиленамиды; акриламидные полимеры и сополимеры; полигидроксиэтилакрилат, мономеры метилакриламида и полихлорпрен.
[00656] Можно использовать различные красители, включая органические хромофоры, подразделяемые на нитрозо, нитро, азо, в том числе моноазо, биазо и полиазо, дифенилметан, триарилметан, ксантен, метан, акридин, тиазол, тиазин, индамин, индофенол, азин, оксазин, антрахинон и фталоцианин.
[00657] Другие добавки, которые можно добавлять, включают микронутриенты, такие как соли железа, марганца, бора, меди, кобальта, молибдена и цинка.
[00658] Также можно включать один или несколько консервантов (например, противомикробные средства или другие биоцидные средства) для сохранения и стабилизации состава. Примеры подходящих бактерицидных средств включают бактерицидные средства на основе дихлорофена и полуформаля бензилового спирта (Proxel® от ICI или Acticide® RS от Thor Chemie и Kathon® MK от Dow Chemical) и производные изотиазолинона, такие как алкилизотиазолиноны и бензизотиазолиноны (Acticide® MBS от Thor Chemie). В качестве следующих примеров, подходящие консерванты включают MIT (2-метил-4-изотиазолин-3-он), BIT (l,2-бензизотиазолин-3-он, который может быть приобретен от Avecia, Inc. в виде Proxel GXL в качестве раствора в гидроксиде натрия и дипропиленгликоле), 5-хлор-2-(4-хлорбензил)-3(2H)-изотиазолон, 5-хлор-2-метил-2H-изотиазол-3-он, 5-хлор-2-метил-2H-изотиазол-3-он, 5-хлор-2-метил-2H-изотиазол-3-она гидрохлорид, 4,5-дихлор-2-циклогексил-4-изотиазолин-3-он, 4,5-дихлор-2-октил-2H-изотиазол-3-он, 2-метил-2H-изотиазол-3-он, комплекс 2-метил-2H-изотиазол-3-он-хлорид кальция, 2-октил-2H-изотиазол-3-он и гемиформаль бензилового спирта.
[00659] Примеры подходящих загустителей для составов включают полисахариды, органические глины или растворимый в воде полимер, который демонстрирует псевдопластические свойства в водной среде, например, такой как гуммиарабик, камедь карайи, трагакантовая камедь, гуаровая камедь, камедь бобов рожкового дерева, ксантановая смола, каррагенан, альгинатная соль, казеин, декстран, пектин, агар, 2-гидроксиэтилкрахмал, 2-аминоэтилкрахмал, 2-гидроксиэтилцеллюлоза, метилцеллюлоза, соль карбоксиметилцеллюлозы, сульфатная соль целлюлозы, полиакриламид, соли щелочных металлов сополмеров малеинового ангидрида, соли щелочных металлов поли(мет)акрилата.
[00660] Подходящие противозамерзающие ингредиенты для состава включают, например, но не ограничиваясь ими, этиленгликоль, 1,2-пропиленгликоль, 1,3-пропиленгликоль, 1,2-бутандиол, 1,3-бутандиол, 1,4-бутандиол, 1,4-пентандиол, 3-метил-l,5-пентандиол, 2,3-диметил-2,3-бутандиол, триметилолпропан, маннит, сорбит, глицерин, пентаэритрит, 1,4-циклогександиметанол, ксиленол, бисфенолы, такие как бисфенол A или сходные с ними. Кроме того, предусматриваются эфирные спирты, такие как диэтиленгликоль, триэтиленгликоль, тетраэтиленгликоль, полиоксиэтилен или полиоксипропиленгликоли с молекулярной массой вплоть до 4000, монометиловый эфир диэтиленгликоля, моноэтиловый эфир диэтиленгликоля, монометиловый эфир триэтиленгликоля, бутоксиэтанол, бутиленгликоль монобутиловый эфир, дипентаэритрит, трипентаэритрит, тетрапентаэритрит, диглицерин, триглицерин, тетраглицерин, пентаглицерин, гексаглицерин, гептаглицерин, октаглицерин и их комбинации.
XVIII. Семена растений
[00661] Кроме того, настоящее изобретение относится к семенам растений, покрытым любым из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в настоящем описании, любыми из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных в настоящем описании, любыми из биологически чистых бактериальных культур, описанных в настоящем описании, любыми из инокулятов, описанных в настоящем описании, любым ферментом, который катализирует продукцию оксида азота, любым рекомбинантным микроорганизмом, который экспрессирует фермент, который катализирует продукцию оксида азота, или любыми из составов, отличных от вакцин, как описано в настоящем описании.
XIX. Способы, касающиеся растений и семян растений, способы замедления прорастания спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus и способы получения и применения фрагментов экзоспория
[00662] Кроме того, настоящее изобретение относится к способам стимуляции роста растений, способам защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, способам иммобилизации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантных спорообразующих бактерий на растении, способам стимуляции прорастания семени растения, способам доставки нуклеиновых кислот в растения, способам замедления прорастания спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, способам получения и применения фрагментов экзоспория и к способам доставки полезных бактерий животным.
A. Способы стимуляции роста растений
[00663] Настоящее изобретение относится к способам стимуляции роста растений.
[00664] Один способ стимуляции роста растений по настоящему изобретению включает внесение в среду для роста растений любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше, или любого из составов, содержащих рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный выше. Альтернативно любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше, или любой из составов, содержащих рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный выше, можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. В таких способах рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий стимулирующий рост растений белок или пептид. Стимулирующий рост растений белок или пептид может быть физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00665] Другой способ стимуляции роста растений включает внесение в среду для роста растений любой из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных выше, или любого из составов, содержащих рекомбинантную спорообразующую бактерию, описанную выше. Альтернативно любая из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных выше, или любой из составов, содержащих рекомбинантную спорообразующую бактерию, описанную выше, можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. В таких способах рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий стимулирующий рост растений белок или пептид. Стимулирующий рост растений белок или пептид может быть физически связан с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[00666] Другой способ стимуляции роста растений включает внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus. Альтернативно рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или состав можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует фермент, вовлеченный в солюбилизацию питательных веществ, протеазу, белок BclA, белок BclB, белок CotE, белок CotO, белок ExsY, белок ExsFA/BxpB, белок CotY, белок ExsFB, белок ExsJ, белок ExsH, белок YjcA, белок YjcB, белок BclC, белок BxpA, белок BclE, белок BetA/BAS3290, белок ExsA, белок ExsK, белок ExsB, белок YabG или белок Tgl, где экспрессия фермента, вовлеченного в солюбилизацию питательных веществ, протеазы, белка BclA, белка BclB, белка CotE, белка CotO, белка ExsY, белка ExsFA/BxpB, белка CotY, белка ExsFB, белка ExsJ, белка ExsH, белка YjcA, белка YjcB, белка BclC, белка BxpA, белка BclE, белка BetA/BAS3290, белка ExsA, белка ExsK, белка ExsB, белка YabG или белка Tgl увеличена по сравнению с экспрессией фермента, вовлеченного в солюбилизацию питательных веществ, протеазы, белка BclA, белка BclB, белка CotE, белка CotO, белка ExsY, белка ExsFA/BxpB, белка CotY, белка ExsFB, белка ExsJ, белка ExsH, белка YjcA, белка YjcB, белка BclC, белка BxpA, белка BclE, белка BetA/BAS3290, белка ExsA, белка ExsK, белка ExsB, белка YabG или белка Tgl в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[00667] Дополнительные способы стимуляции роста растений, вовлекающие применение фрагментов экзоспория, происходящих из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описаны ниже.
B. Способы защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям
[00668] Настоящее изобретение также относится к способам защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям.
[00669] Один из способов защиты растения от патогенов или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям включает внесение в среду роста растения любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше, или любого из составов, содержащих рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный выше. Альтернативно любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше, и любой из составов, содержащих рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный выше, можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. В таких способах рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий белок или пептид, который защищает растение от патогена, или белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям. Белок или пептид, который защищает растение от патогена, или белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, может быть физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00670] Другой способ защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям включает внесение в среду для роста растения любых из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных выше, или любого из составов, содержащих рекомбинантные спорообразующие бактерии, описанные выше. Альтернативно любые из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных выше, или любой из составов, содержащих рекомбинантные спорообразующие бактерии, описанные выше, можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. В таких способах рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий белок или пептид, который защищает растение от патогена, или белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям. Белок или пептид, который защищает растение от патогена, или белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, может быть физически связан с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[00671] В любом из способов защиты растения от патогена растения, выращенные в среде для роста растений, содержащей рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, или рекомбинантные спорообразующие бактерии, предпочтительно являются менее чувствительными к инфекции патогеном по сравнению с растениями, выращенными в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию.
[00672] В любом из способов повышения устойчивости растений к стрессовым воздействиям растения, выращенные в среде для роста растений, содержащей рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию, являются менее чувствительными к стрессовым воздействиям по сравнению с растениями, выращенными в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию.
[00673] Другой способ повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям включает внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus. Альтернативно рекомбинантные Bacillus cereus или состав можно наносить на растение, семя растение или на область, окружающую растение или семя растения. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует супероксиддисмутазу или аргиназу, где экспрессия супероксиддисмутазы или аргиназы увеличена по сравнению с экспрессией супероксиддисмутазы или аргиназы в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[00674] Другой способ защиты растения от патогена включает внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus. Альтернативно рекомбинантный Bacillus cereus или состав можно наносить на растение, семя растения или в область, окружающую растение или семя растения. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует протеазу, где экспрессия протеазы увеличена по сравнению с экспрессией протеазы в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[00675] Дополнительные способы защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, вовлекающие применение фрагментов экзоспория, происходящих из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описаны ниже.
C. Способы иммобилизации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантных спорообразующих бактерий на растении
[00676] Кроме того, настоящее изобретение относится к способам иммобилизации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантных спорообразующих бактерий на растении.
[00677] Один из способов иммобилизации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растении включает внесение в среду для роста растений любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше, или любого из составов, содержащих рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный выше. Альтернативно любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше, или любой из составов, содержащих рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный выше, можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. В таких способах рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий связывающийся с растением белок или пептид. Связывающийся с растением белок или пептид может быть физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00678] Другой способ иммобилизации спор рекомбинантной спорообразующей бактерии на растении включает внесение в среду для роста растений любой из рекомбинантных спорообразующий бактерий, описанных выше, или любого из составов, содержащих рекомбинантную спорообразующую бактерию, описанную выше. Альтернативно любую из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных выше, или любой из составов, содержащих рекомбинантную спорообразующую бактерию, описанную выше, можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. В таких способах рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий связывающийся с растением пептид, и связывающийся с растением белок или пептид может быть физически связан с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[00679] Связывающийся с растением белок или пептид предпочтительно селективно нацеливает и удерживает рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию на растении. Например, связывающийся с растением белок или пептид может селективно нацеливать и удерживать рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus на корнях растений, субструктурах корней, надземной части растения или подструктуре надземной части растения.
D. Способы стимуляции прорастания семени растения
1. Способы стимуляции прорастания, вовлекающие применение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантной спорообразующей бактерии
[00680] Настоящее изобретение также относится к способам стимуляции прорастания семени растения.
[00681] Один из способов стимуляции прорастания семени растения включает внесение в среду для роста растений любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше, или любого из составов, содержащих рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный выше. Альтернативно любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше, или любой из составов, содержащих рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный выше, можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. В таких способах рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий фермент, который катализирует продукцию оксида азота. Фермент, который катализирует продукцию оксида азота, может быть физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00682] Другой способ стимуляции прорастания семени растения включает внесение в среду для роста растений любых из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных выше, или любых из составов, содержащих рекомбинантную спорообразующую бактерию, описанную выше. Альтернативно любые из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных выше, или любые из составов, содержащих рекомбинантную спорообразующую бактерию, описанную выше, можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. В таких способах рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий фермент, который катализирует продукцию оксида азота, и фермент, который катализирует продукцию оксида азота, может быть физически связан с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[00683] Описанные выше способы стимуляции прорастания семени растения предпочтительно включают нанесение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, рекомбинантной спорообразующей бактерии и состава на семя растения.
[00684] Кроме того, любой из способов стимуляции прорастания семени растения может включать включение субстрата для фермента, который катализирует продукцию оксида азота, в среду для роста растений, на семя растения, растение или область, окружающую растение или семя растения. Например, в подходящем случае способ дополнительно включает добавление L-аргинина в среду для роста растения, на семя растения, растение или область, окружающую растение или семя растения. Например, L-аргинин можно наносить на надземную часть растения. Предпочтительно L-аргинин наносят на семя растения.
[00685] Присутствие L-аргинина усиливает реакцию и приводит к большей продукции NO синтазой оксида азота. Более того, L-аргинин на семенах растения, в среде для роста растений или в области, окружающей растение, может служить в качестве субстрата для продукции оксида азота нативными бактериальными ферментами.
[00686] В любом из описанных выше способов стимуляции прорастания семени растения семена в среде для роста растений, содержащей рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию, или семена на которые нанесен рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантная спорообразующая бактерия, предпочтительно имеют увеличенный уровень прорастания по сравнению с семенами, проращиваемыми в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию, или семенами, на которые на нанесен рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантная спорообразующая бактерия, проращиваемыми в тех же условиях.
[00687] В любом из описанных выше способов стимуляции прорастания семян растений, семена в среде для роста растений, содержащей рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию, или семена, на которые нанесен рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантная спорообразующая бактерия, предпочтительно имеют более длинный главный корень после прорастания по сравнению с семенами, проращиваемыми в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию, или семенами, на которые не нанесен рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантная спорообразующая бактерия, в тех же условиях.
[00688] Дополнительные способы стимуляции прорастания семян растений, вовлекающие применение фрагментов экзоспория, происходящих из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описаны ниже.
2. Способы стимуляции прорастания посредством доставки в растения ферментов, которые катализируют продукцию оксида азота, или рекомбинантных микроорганизмов, которые сверхэкспрессируют такие ферменты
[00689] Другой способ стимуляции прорастания семян растений включает внесение в среду для роста растений или нанесение на растение, семя растения или в область, окружающую растение или семя растения: (i) фермента, который катализирует продукцию оксида азота; (ii) супероксиддисмутазы; или (iii) рекомбинантного микроорганизма, который экспрессирует фермент, который катализирует продукцию оксида азота или супероксиддисмутазу, где экспрессия фермента, который катализирует продукцию оксида азота или супероксиддисмутазы, увеличена по сравнению с экспрессией фермента, который катализирует продукцию оксида азота или супероксиддисмутазы, в микроорганизме дикого типа в тех же условиях.
[00690] Предпочтительно способ включает нанесение фермента или микроорганизма на семя растения.
[00691] Кроме того, способ может включать внесение субстрата фермента, который катализирует продукцию оксида азота, в среду для роста растения, на семя растения, растение или на область, окружающую растение или семя растения. Например, в подходящем случае способ, кроме того, включает добавление L-аргинина в среду для роста растения, к семени растения, растению или области, окружающей растение или семя растения. Например, L-аргинин можно наносить на надземную часть растения. Предпочтительно L-аргинин наносят на семя растения.
[00692] Семена в среде для роста растений, содержащей фермент или микроорганизм, или семена, на которые нанесен фермент или микроорганизм, предпочтительно имеют увеличенный уровень прорастания по сравнению с семенами, проращиваемыми в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит фермент или микроорганизм, или семенами, на которые не нанесен фермент или микроорганизм, проращиваемыми в тех же условиях.
[00693] Семена в среде для роста растений, содержащие фермент или микроорганизм, или семена, на которые нанесен фермент или микроорганизм, предпочтительно имеют более длинный главный корень после прорастания по сравнению с семенами, проращиваемыми в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит фермент или микроорганизм, или семенами, на которые не нанесен фермент или микроорганизм, в тех же условиях.
[00694] Фермент, который катализирует продукцию синтазы оксида азота, может включать синтазу оксида азота или аргиназу. Когда фермент, который катализирует продукцию оксида азота, включает синтазу оксида азота, синтаза оксида азота может включать, например, синтазу оксида азота из Bacillus thuringiensis BT013A или Bacillus subtilis 168. Например, синтаза оксида азота может обладать по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00695] Синтаза оксида азота может обладать по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00696] Синтаза оксида азота может обладать по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00697] Синтаза оксида азота может обладать по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00698] Синтаза оксида азота может обладать по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00699] Синтаза оксида азота может обладать 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[00700] Супероксиддисмутаза может включать супероксиддисмутазу 1 (SODA1) или супероксиддисмутазу 2 (SODA2). Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00701] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00702] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00703] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00704] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00705] Супероксиддисмутаза может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[00706] Рекомбинантный микроорганизм, который экспрессирует фермент, который катализирует продукцию оксида азота, может включать вид Bacillus (например, представитель семейства Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis или Bacillus megaterium), Escherechia coli, вид Aspergillus (например, Aspergillus niger) или вид Sacchromyces (например, Sacchromyces cerevisiae).
[00707] В любом из описанных выше способов фермент или рекомбинантный микроорганизм можно вносить в среду для роста растений или можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение, в составе, содержащем фермент или рекомбинантный микроорганизм и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель. Состав может содержать любой из приемлемых с точки зрения сельского хозяйства носителей и другие компоненты, описанные в настоящем описании.
[00708] Фермент, который катализирует продукцию оксида азота, можно доставлять очищенным или неочищенным и можно доставлять отдельно или в комбинации с другими полезными белками, инокулятами или химическими реагентами на семя растения, среду для роста растений или в область, окружающую растение или семя растения.
E. Способы доставки нуклеиновых кислот в растения
[00709] Также настоящее изобретение предусматривает способы доставки нуклеиновых кислот в растения.
[00710] Один из способов доставки нуклеиновых кислот в растение включает внесение в среду для роста растения любого из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше, или любого из составов, содержащих рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный выше. Альтернативно любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше, или любой из составов, содержащих рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный выше, можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. В таких способах рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий связывающий нуклеиновую кислоту белок. Связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты. Связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид может быть физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00711] В таких способах рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать эндофитный штамм бактерий. Эндофитный штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363. Например, эндофитный штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363.
[00712] Другой способ доставки нуклеиновых кислот в растение включает внесение в среду для роста растений любых из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных выше, или любых из составов, содержащих рекомбинантную спорообразующую бактерию, описанную выше. Альтернативно любые из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных выше, или любые из составов, содержащих рекомбинантные спорообразующие бактерии, описанные выше, можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. В таких способах рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий связывающий нуклеиновую кислоту белок. Связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты. Связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид может быть физически связан с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[00713] Рекомбинантная спорообразующая бактерия может включать эндофитный штамм бактерий. Например, эндофитный штамм бактерий может включать Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus sphericus EE443 или Bacillus pumilus EE-B00143.
[00714] В любом из описанных выше способов доставки нуклеиновых кислот в растение молекула нуклеиновой кислоты может включать модулирующую молекулу РНК; молекулу РНК-i; микроРНК; аптамер; или молекулу ДНК, которая кодирует модулирующую молекулу РНК, молекулу РНК-i, микроРНК или аптамер.
[00715] Молекулы нуклеиновых кислот, подлежащие доставке в растение, можно получать любыми способами, известными в данной области (например, химический синтез, рекомбинантная продукция микроорганизмом и т.д.). Со связывающим нуклеиновую кислоту белком или пептидом, являющимся частью слитых белков, описанных в настоящем описании, могут быть связаны молекулы нуклеиновых кислот в препарате для доставки таких нуклеиновых кислот в растение или растения. Связывающие нуклеиновую кислоту белки и пептиды иммобилизуют и стабилизируют нуклеиновые кислоты и позволяют их доставку в растение интактными. Молекулы нуклеиновых кислот, подлежащие доставке в растение, могут быть в активной форме или в неактивной форме, которая может быть процессирована в активную форму растением.
[00716] Для осуществления связывания молекул нуклеиновых кислот со связывающим нуклеиновую кислоту белком или пептидом молекулы нуклеиновых кислот можно инкубировать с любыми из рекомбинантных представителей Bacillus cereus или рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных в настоящем описании, которые экспрессируют слитый белок, содержащий связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид.
[00717] Дополнительные способы доставки нуклеиновых кислот в растение, вовлекающие применение фрагментов экзоспория, происходящих из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описаны ниже.
F. Способы замедления прорастания споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus
[00718] Кроме того, настоящее изобретение относится к способу замедления прорастания споры представителя семейства Bacillus cereus. Способ включает модификацию представителя семейства Bacillus cereus для экспрессии инозинуридингидролазы или аланинрацемазы, где экспрессия инозинуридингидролазы или аланинрацемазы увеличена по сравнению с экспрессией инозинуридингидролазы или аланинрацемазы в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
G. Инактивация представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантной спорообразующей бактерии перед применением
[00719] В любом из описанных выше способов, в которых используется рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантная спорообразующая бактерия, способ, кроме того, может включать инактивацию рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантной спорообразующей бактерией перед внесением в среду для роста растений или нанесением на растение, семя растение или область, окружающую растение или семя растения.
[00720] Например, инактивация может включать воздействие на рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантной спорообразующей бактерии термообработки; облучения гамма-излучением; облучения рентгеновским излучением; облучения УФ-A излучением; облучения UV-B излучением; обработки глутаральдегидом, формальдегидом, пероксидом водорода, уксусной кислотой, отбеливателем, хлороформом или фенолом, или их комбинации.
[00721] Альтернативно или дополнительно, инактивация может включать модификацию рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантной спорообразующей бактерии для экспрессии протеазы прорастания споры или неспецифической эндонуклеазы, где экспрессия протеазы прорастания споры или неспецифической эндонуклеазы увеличена по сравнению с экспрессией протеазы прорастания споры или неспецифической эндонуклеазы в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях, и где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает рекомбинантную бактерию рода Bacillus.
H. Способы получения и применения фрагментов экзоспория
[00722] Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения и применения фрагментов экзоспория. Эти способы касаются рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в разделе IV настоящего описания выше, т.е. рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые содержат мутацию или другое генетическое изменение, которое позволяет сбор свободного экзоспория.
[00723] Таким образом, настоящее изобретение относится к способу удаления экзоспория из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Способ включает воздействие на суспензию, содержащую любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в разделе IV настоящего описания выше, центрифугирования или фильтрации с получением фрагментов экзоспория, которые отделены от спор. Фрагменты экзоспория содержат слитый белок.
[00724] Способ удаления экзоспория из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus может включать воздействие на суспензию, содержащую споры, центрифугирования и сбор супернатанта, где супернатант содержит фрагменты экзоспория и по существу свободен от спор.
[00725] Альтернативно способ удаления экзоспория из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus может включать проведение фильтрации суспензии, содержащей споры, и сбор фильтрата, где фильтрат содержит фрагменты экзоспория и по существу свободен от спор.
[00726] Перед центрифугированием или фильтрацией суспензию спор можно встряхивать или механически разрушать.
[00727] Фрагменты экзоспория также можно отделять от спор посредством градиентного центрифугирования, аффинной очистки, или позволяя спорам выпасть в осадок из суспензии.
[00728] Кроме того, настоящее изобретение относится к способам применения фрагментов экзоспория.
[00729] Предусматривается способ стимуляции роста растений. Способ включает внесение фрагментов экзоспория или состава, содержащего фрагменты экзоспория и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель, в среду для роста растений. Альтернативно фрагменты экзоспория или состав можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанных в разделе IV настоящего описания выше, и содержат слитый белок. Слитый белок содержит стимулирующий рост растений белок или пептид.
[00730] Также предусматривается способ защиты растения от патогенов или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям. Способ включает внесение фрагментов экзоспория или состава, содержащего фрагменты экзоспория и приемлемого с точки зрения сельского хозяйства носителя в среду для роста растений. Альтернативно фрагменты экзоспория или состав можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного выше в разделе IV, и содержат слитый белок. Слитый белок содержит белок или пептид, который защищает растение от патогена, или белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
[00731] Когда способ представляет собой способ защиты растения от патогена, слитый белок содержит белок или пептид, который защищает растение от патогена.
[00732] В способах защиты растения от патогена растения, выращенные в среде для роста растений, содержащей фрагменты экзоспория, предпочтительно являются менее чувствительными к инфекции патогеном по сравнению с растениями, выращенными в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит фрагменты экзоспория.
[00733] Когда способ представляет собой способ повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, слитый белок содержит белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
[00734] В способах повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, растения, выращенные в среде для роста растений, содержащей фрагменты экзоспория, предпочтительно являются менее чувствительными к стрессовым воздействиям по сравнению с растениями, выращенными в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит фрагменты экзоспория.
[00735] Также предусматривается способ иммобилизации фрагментов экзоспория на растении. Способ включает внесение фрагментов экзоспория или состава, содержащего фрагменты экзоспория и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель, в среду для роста растений. Альтернативно фрагменты экзоспория или состав можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанных в разделе IV настоящего описания выше, и содержат слитый белок. Слитый белок содержит связывающийся с растением белок или пептид.
[00736] Связывающийся с растением белок или пептид предпочтительно селективно нацеливает и удерживает фрагменты экзоспория на растении. Например, связывающийся с растениями белок или пептид может селективно нацеливать и удерживать фрагменты экзоспория на корнях растений, субструктурах корней, на надземной части растения или в субструктуре надземной части растения.
[00737] Также предусматривается способ стимуляции прорастания семени растения. Способ включает внесение фрагментов экзоспория или состава, содержащего фрагменты экзоспория и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель, в среду для роста растений. Альтернативно фрагменты экзоспория или состав можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания выше и содержат слитый белок. Слитый белок содержит супероксиддисмутазу или фермент, который катализирует продукцию оксида азота.
[00738] В способах стимуляции прорастания способ предпочтительно включает нанесение фрагментов экзоспория на семя растения.
[00739] Кроме того, способы стимуляции прорастания могут включать внесение субстрата для фермента, который катализирует продукцию оксида азота, в среду для роста растения, на семя растения, растение или на область, окружающую растение или семя растения. Например, в подходящем случае способ, кроме того, включает добавление L-аргинина в среду для роста растений, на семя растения, растение или область, окружающую растение или семя растения. Например, L-аргинин можно наносить на надземную часть растения. Предпочтительно L-аргинин наносят на семя растения.
[00740] Присутствие L-аргинина усиливает реакцию и приводит к большей продукции NO синтазой оксида азота. Более того, L-аргинин на семени растения, среде для роста растения или области, окружающей растение, может служить в качестве субстрата для продукции оксида азота нативными бактериальными ферментами.
[00741] В способах стимуляции прорастания семени растения, семена в среде для роста растений, содержащей фрагменты экзоспория, или семена, на которые нанесены фрагменты экзоспория, предпочтительно имеют увеличенный уровень прорастания по сравнению с теми же семенами, проращиваемыми в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит фрагменты экзоспория, или теми же семенами, проращиваемыми в тех же условиях, на которые фрагменты экзоспория не наносили.
[00742] В способах стимуляции прорастания семени растения, семена в среде для роста растений, содержащей фрагменты экзоспория или семена, на которые нанесены фрагменты экзоспория, предпочтительно имеют более длинный главный корень после прорастания по сравнению с теми же семенами, проращиваемыми в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит фрагменты экзоспория, или с теми же семенами, проращиваемыми в тех же условиях, на которые фрагменты экзоспория не были нанесены.
[00743] Также предусматривается способ доставки нуклеиновых кислот в растение. Способ включает внесение фрагментов экзоспория или состава, содержащего фрагменты экзоспория, в среду для роста растений. Альтернативно фрагменты экзоспория или состав можно наносить на растение, семя растения или на область, окружающую растение или семя растения. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания, и содержат слитый белок. Слитый белок содержит связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид. Связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты.
[00744] В способе доставки нуклеиновых кислот в растение молекула нуклеиновой кислоты может содержать модулирующую молекулу РНК; молекулу РНК-i; микроРНК; аптамер или молекулу ДНК, которая кодирует модулирующую молекулу РНК, молекулу РНК-i, микроРНК или аптамер.
[00745] Молекулы нуклеиновых кислот, подлежащие доставке в растение, можно получать любыми способами, известными в данной области (например, химический синтез, рекомбинантная продукция микроорганизмом и т.д.). Затем молекулы нуклеиновых кислот могут связываться со связывающим нуклеиновую кислоту белком или пептидом, являющимся частью слитых белков, описанных в настоящем описании, в препарате для доставки таких нуклеиновых кислот в растение или растения. Связывающие нуклеиновую кислоту белки и пептиды иммобилизуют и стабилизируют нуклеиновые кислоты и позволяют их доставку в растение интактными. Молекула нуклеиновой кислоты, подлежащая доставке в растение, может быть в активной форме или в неактивной форме, которая может процессироваться растением в активную форму.
[00746] Для проведения связывания молекул нуклеиновой кислоты со связывающим нуклеиновую кислоту белком или пептидом молекулы нуклеиновых кислот можно инкубировать с фрагментами экзоспория, содержащими слитый белок, содержащий связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид.
I. Среда для роста растений
[00747] В любом из способов, описанных в настоящем описании, вовлекающих применение среды для роста растений, среда для роста растений может содержать почву, воду, водный раствор, песок, гравий, полисахарид, мульчу, компост, торфяной мох, солому, бревна, глину, соевую муку, дрожжевой экстракт или их комбинацию.
[00748] Более того, среду для роста растений можно дополнять субстратом или кофактором фермента. Например, субстрат или кофактор может включать триптофан, аденозинмонофосфат, аденозиндифосфат, аденозинтрифосфат (например, аденозин-3-трифосфат), индол, триметафосфат, ферродоксин, ацетоин, диацетил, пируват, ацетолактат, пектин, целлюлозу, метилцеллюлозу, крахмал, хитин, пектин, муку, производное целлюлозы, фосфат, ацетоин, хитозан, неактивное производное индол-3-уксусной кислоты, неактивное производное гибберелловой кислоты, ксилан, арабиноксилан, жир, воск, масло, фитиновую кислоту, лигнин, гуминовую кислоту, холин, производное холина, пролин, полипролин, пролин-богатый белок, пролин-богатую муку, фенилаланин, хоризмат, L-аргинин, NADH, NADPH, ATP, GTP, цитохром C, цитохром p450 или их комбинацию.
J. Способы применения
[00749] Способы, описанные в настоящем описании, могут включать покрытие семян рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, рекомбинантной спорообразующей бактерией или фрагментами экзоспория, или составом, содержащим рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или фрагменты экзоспория, перед посевом.
[00750] Способы, описанные в настоящем описании, могут включать нанесение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, рекомбинантной спорообразующей бактерии или фрагментов экзоспория, или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или фрагменты экзоспория, на надземную часть растения.
[00751] В способах, описанных в настоящем описании, внесение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, рекомбинантной спорообразующей бактерии или фрагментов экзоспория, в среду для роста растений, может включать внесение жидкого или твердого состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или фрагменты экзоспория, в среду. Среда для роста растений может включать почву (например, горшечная смесь), компост, торфяной мох, песок, начальную смесь для семян или их комбинацию. Способ может включать внесение состава в среду для роста растений до, одновременно с или после посева семян, проростков, черенков, луковиц или растений в среду для роста растений.
K. Агрохимикаты
[00752] В способах, описанных в настоящем описании, способ, кроме того, может включать внесение по меньшей мере одного агрохимиката в среду для роста растений или нанесение по меньшей мере одного агрохимиката на растения или семена растений.
[00753] Агрохимикат может включать удобрение (например, жидкое удобрение), материал микроудобрения (например, борную кислоту, борат, борную фритту, сульфат меди, медную фритту, хелат меди, натрия тетраборат декагидрат, сульфат железа, оксид железа, сульфат железа аммония, железную фритту, хелат железа, сульфат марганца, оксид марганца, хелат марганца, хлорид марганца, марганцевую фритту, молибдат натрия, молибденовую кислоту, сульфат цинка, оксид цинка, карбонат цинка, цинковую фритту, фосфат цинка, хелат цинка или их комбинацию), инсектицид (например, фосфороорганическое соединение, карбамат, пиретроид, акарицид, алкилфталат, борную кислоту, борат, фторид, серу, галогенароматическую замещенную мочевину, сложный эфир углеводорода, инсектицид на биологической основе, или их комбинацию), гербицид (например, хлорфеноксисоединение, нитрофенольное соединение, нитрокрезольное соединение, дипиридильное соединение, ацетамид, алифатическую кислоту, анилид, бензамид, бензойную кислоту, производное бензойной кислоты, анисовую кислоту, производное анисовой кислоты, бензонитрил, бензотиадиазинона диоксид, тиокарбамат, карбамат, карбанилат, хлорпиридинил, производное циклогексенона, производное динитроаминобензола, соединение фтординитротолуидина, изоксазолидинон, никотиновую кислоту, изопропиламин, производное изопропиламина, оксадиазолинона, фосфат, фталат, соединение пиколиновой кислоты, триазин, триазол, урацил, производное мочевины, эндоталл, хлорат натрия или их комбинацию), фунгицид (например, замещенный бензол, тиокарбамат, этилен бис-дитиокарбамат, тиофталидамид, соединение меди, ртутьорганическое соединение, оловоорганическое соединение, соединение кадмия, анилазин, беномил, циклогексамид, додин, этридиазол, ипродион, метлаксил, тиамимефон, трифорин или их комбинацию), моллюскоцид, альгицид, модификатор роста растений, бактериальный инокулят (например, бактериальный инокулят рода Rhizobium, бактериальный инокулят рода Bradyrhizobium, бактериальный инокулят рода Mesorhizobium, бактериальный инокулят рода Azorhizobium, бактериальный инокулят рода Allorhizobium, бактериальный инокулят рода Sinorhizobium, бактериальный инокулят рода Kluyvera, бактериальный инокулят рода Azotobacter, бактериальный инокулят рода Pseudomonas, бактериальный инокулят рода Azospirillium, бактериальный инокулят рода Bacillus, бактериальный инокулят рода Streptomyces, бактериальный инокулят рода Paenibacillus, бактериальный инокулят рода Paracoccus, бактериальный инокулят рода Enterobacter, бактериальный инокулят рода Alcaligenes, бактериальный инокулят рода Mycobacterium, бактериальный инокулят рода Trichoderma, бактериальный инокулят рода Gliocladium, бактериальный инокулят рода Glomus, бактериальный инокулят рода Klebsiella или их комбинацию), грибной инокулят (например, грибной инокулят семейства Glomeraceae, грибной инокулят семейства Claroidoglomeraceae, грибной инокулят семейства Gigasporaceae, грибной инокулят семейства Acaulosporaceae, грибной инокулят семейства Sacculosporaceae, грибной инокулят семейства Entrophosporaceae, грибной инокулят семейства Pacidsporaceae, грибной инокулят семейства Diversisporaceae, грибной инокулят семейства Paraglomeraceae, грибной инокулят семейства Archaeosporaceae, грибной инокулят семейства Geosiphonaceae, грибной инокулят семейства Ambisporaceae, грибной инокулят семейства Scutellosporaceae, грибной инокулят семейства Dentiscultataceae, грибной инокулят семейства Racocetraceae, грибной инокулят отдела Basidiomycota, грибной инокулят отдела Ascomycota, грибной инокулят отдела Zygomycota или их комбинацию), или их комбинацию.
[00754] Удобрение может включать сульфат аммония, нитрат аммония, сульфат нитрат аммония, хлорид аммония, бисульфат аммония, полисульфид аммония, тиосульфат аммония, водный аммиак, безводный аммиак, полифосфат аммония, сульфат алюминия, нитрат кальция, нитрат кальция аммония, сульфат кальция, кальцинированный магнезит, кальцинированный известняк, оксид кальция, нитрат кальция, доломитовый известняк, гашеную известь, карбонат кальция, фосфат диаммония, фосфат моноаммония, нитрат магния, сульфат магния, нитрат калия, хлорид калия, сульфат калия магния, сульфат калия, нитраты натрия, магнезиальный известняк, магнезию, мочевину, мочевину-формальдегиды, мочевины аммония нитрат, покрытую серой мочевину, покрытую полимером мочевину, изобутилиден димочевину, K2SO4-2MgSO4, каинит, сильвинит, кизерит, английскую соль, элементарную серу, известковую глину, измельченные ракушки устриц, рыбную муку, жмыхи, рыбный ток, кровяную муку, фосфатную руду, суперфосфаты, шлак, костную муку, древесный пепел, навоз, гуано летучих мышей, торфяной мох, компост, глауконитовый песок, муку из семян хлопчатника, муку из перьев, крабовую кормовую муку, рыбную эмульсию, гуминовую кислоту или их комбинацию.
[00755] Агрохимикат может содержать любой из фунгицидов, бактериальных инокулятов или гербицидов, описанных выше в разделе XVII.
L. Растения и семена
[00756] В любом из описанных выше способов, касающихся растений, растение может представлять собой двудольное растение, однодольное растение или голосеменное растение.
[00757] Например, когда растение представляет собой двудольное растение, двудольное растение может быть выбрано из группы, состоящей из боба, гороха, томата, перца, тыквы крупноплодной, люцерны, миндаля, аниса, яблока, абрикоса, аракачи, артишока, авокадо, земляных бобов, свеклы, бергамота, черного перца, черной акации, ежевики, голубики, горького апельсина, бок-чоя, бразильского ореха, хлебного дерева, брокколи, кормовых бобов, брюссельской капусты, гречихи, капусты, рыжика, китайской капусты, какао, канталупы, тмина, артишока испанского, рожкового дерева, моркови, ореха кешью, маниока, клещевины обыкновенной, цветной капусты, сельдерея душистого, сельдерея салатного, вишни, каштана, нута, цикория, чилийского перца, хризантемы, коричного дерева, цитрона, климентина, гвоздики, клевера, кофе, ореха колы, кользы, кукурузы, хлопчатника, семян хлопчатника, вигны китайской, крамбе, клюквы, кресса, огурца, смородины, кремовой яблони, кассии пучковатой, чины клубеньковой, баклажана, эндивия, фенхеля, пажитника, инжира, лещины, льна, герани, крыжовника, горлянки, винограда, грейпфрута, гуавы, конопли, конопляного семени, хны, хмеля, конского боба, хрена, индигоноски, жасмина, артишока иерусалимского, джута, капусты кормовой, капока, кенафа, кольраби, кумквата, лаванды, лимона, чечевицы, леспедецы, салата-латука, лайма, лакричника, личи, локвы, люпина, ореха макадамия, мускатного ореха, мандарина, свеклы кормовой, манго, мушмулы, дыни, мяты, шелковицы, горчицы, нектарина, масличного нуга, торреи, окры, оливы, опия, апельсина, папайи, пастернака, гороха, персика, арахиса, груши, ореха пекан, хурмы, гороха голубиного, фисташки, подорожника, сливы, граната, помело, мака, картофеля, сладкого картофеля, сливы домашней, тыквы, квебрахо, айвы, деревьев рода Cinchona, квиноа, редиска, рами, рапса, малины, китайской крапивы, ревеня, розы, каучукового дерева, репы, сафлора, эспарцета, козлобородника, саподиллы, мандарина уншиу, козельца, кунжута, масляного дерева, сои, шпината, тыквы крупноплодной, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, брюквы, сладкого перца, танжерина, чая, метлички абиссинской, табака, томата, трилистника, тунгового дерева, турнепса, урены, вики, грецкого ореха, арбуза, парагвайского чайного дерева, сурепицы, пастушьей сумки, кресс-салата, клоповника, жерухи, ярутки, бадьяна, лавра, лавра благородного, кассии, джамана, укропа, тамаринда, маты перечной, орегано, розмарина, шалфея, саусепа, щитолистника, калофилла, момордики харантской, лакового дерева, таитянского каштана, базилика, черники, гибискуса, маракуйи, каймита, сассафраса, кактуса, зверобоя, дербенника, боярышника, кориандра, бессмертника песчаного, киви, тимьяна, цукини, уллюки, хикамы, гидрофиллума, стрихноса колючего, желтого момбина, карамболы, амаранта, васаби, японского перца, желтой сливы, мадуки, китайского красного дерева, новозеландского шпината, ломоноса, темеды, пижмы, песчанки, момбина, малайского яблока, бразильского кресса, осота, диоскореи бататовой, конской петрушки, гулявника лекарственного, смолевки, агата, сиамца александрийского, чертополоха, кривохлебки, антильского крыжовника, поташника, солероса, щавеля, птериса мечевидного, капусты листовой, примулы, первоцвета, портулака, буркуна, терпентинного дерева, пизонии белой, дикого бетеля, африканского перца, эриодиктиона клейкого, эстрагона, петрушки, кервеля, сурепицы весенней, бедренца камнеломкового, липпии сладкой, белокопытника, периллы, перечной травы, периллы, горького боба, кислицы клубненосной, кампонга, китайского сельдерея, лимонного базилика, тайского базилика, водной мимозы, кокорыша, капустного дерева, моринги, мирабилиса широкого, оноклеи, лимнофилы ароматной, лимнохариса желтого, любистока, перечной травы, маки, горлянки обыкновенной, боба гиацинтового, батата водяного, пазника, хауттюйнии, шпината Окинавы, глинуса лядвенецевидного, галинсоги мелкоцветковой, синеголовника пахучего, рукколы, артишока испанского, циклантеры съедобной, мицубы, чипилина, критмума, мампата, эболо, кокцинии индийской, осота полевого, красной водоросли, книдосколуса аконитолистного, хуазонтла, эфиопской горчицы, мари гигантской, мари цельнолистной, мексиканского чая, мари белой, центеллы, целозии серебристой, каперсового куста, капусты полевой, пекинской капусты, мизуны, китайской репы, кай-лана, листовой горчицы, малабарского шпината, мангольда, алтея, вьющейся акации, китайского джута, паприки, семян аннатто, мяты перечной, савойской капусты, майорана, тмина, ромашки, мелиссы лимонной, перца гвоздичного, черники, черимойи, морошки, тернослива, питайи, дуриана, бузины, фейхоа, хлебного дерева, джамбула, ююбы, физалиса, пурпурного мангустана, рамбутана, красной смородины, черной смородины, ягод салал, мандарина, агли, адзуки, черного боба, спаржевой фасоли, фасоли кранберри, фасоли обыкновенной, зеленой фасоли, фасоли многоцветной, лимской фасоли, фасоли золотистой, турецких бобов, фасоли пинто, фасоли огненно-красной, стручкового гороха, гороха мангетот, зеленой цветной капусты, спаржевой капусты, крапивы, болгарского перца, красного эндивия, дайкона, редьки, поручейника сахарного, тат-соя, брокколини, черной редьки, корня лопуха, садового боба, итальянской брокколи, лобии, люпина, стеркулии, бобов бархатных, квадратного гороха, пахиризуса, малги, вернонии, акации язычковой, акации Мюррея, акации колючей, кустарника витчетти, акации кориацея, чиа, букового ореха, свечного дерева, колоквинта, меликокки, ореха Майя, монгонго, ореха огбоно, райского ореха и чемпедака.
[00758] Когда растение представляет собой однодольное растение, однодольное растение может быть выбрано из группы, состоящей из кукурузы, пшеницы, ржи, риса, ячменя, проса, банана, лука, чеснока, спаржи, плевела, проса, фонио, райшана, травы Палмера, куркумы, шафрана, калгана, шнитт-лука, кардамона, финиковой пальмы, ананаса, лука-шаллота, лука-поррея, лука-перо, водяного ореха, черемши, кукушкиных слезок, бамбука, дагуссы, вольфии бескорневой, маланги, таитянского шпината, абаки, ареки, африканского проса, ореха катеху, проса метельчатого, сорго метельчатого, цитронеллы, кокоса, колоказии съедобной, маиса, колоказии, дурры, твердой пшеницы, эдо, фуркреа, формио, имбиря, ежи сборной, ковыля тянущегося, суданской травы, сорго гвинейского, банана текстильного, генекена, гибридной кукурузы, иовара, сорго лимонного, агавы мексиканской, проса тростникового, проса пальчатого, проса итальянского, проса японского, проса обыкновенного, новозеландского льна, ржи, масличной пальмы, пальмировой пальмы, саговой пальмы, полевицы белой, сизаля, сорго, спельты, сладкой кукурузы, сладкого сорго, таро, метлички абиссинской, тимофеевки луговой, тритикале, ванили, пшеницы и ямса.
[00759] Когда растение представляет собой голосеменное растение, голосеменное растение может быть из семейства, выбранного из группы, состоящей из Araucariaceae, Boweniaceae, Cephalotaxaceae, Cupressaceae, Cycadaceae, Ephedraceae, Ginkgoaceae, Gnetaceae, Pinaceae, Podocarpaceae, Taxaceae, Taxodiaceae, Welwitschiaceae и Zamiaceae.
[00760] Растения и семена растений, описанные в настоящем описании, могут включать трансгенные растения или семена растений, такие как трансгенные злаки (пшеница, риса), маис, соя, картофель, хлопчатник, табак, масличный рапс и плодовые растения (плоды яблонь, груш, цитрусовые плоды и виноград) Предпочтительные трансгенные растения включают кукурузу, сою, картофель, хлопок, табак и масличный рапс.
[00761] Подходящие трансгенные растения и семена могут быть характеризоваться образованием в растении токсинов, особенно из генетического материала Bacillus thuringiensis (например, вследствие гена CryIA (a), CryIA (b), CryIA (c), CryIIA, CryIIIA, CryIIIB2, Cry9c, Cry2Ab, Cry3Bb, CryIF или их комбинации). Образование токсинов в растениях повышает устойчивость растений к насекомым, паукообразным, нематодам, и личинкам и улиткам (далее называемые "растениями Bt"). Растения Bt, например, сорта кукурузы, сорта хлопчатника, сорта сои и сорта картофеля, являются коммерчески доступными под торговым названием YIELD GARD® (например, кукуруза, хлопчатник, соя), Knock0ut® (например, маис), StarLink ® (например, маис), Bollgard® (хлопчатник), Nucotn® (хлопчатник) и NewLeaf® (картофель). Толерантные к гербицидам растения включают растения под торговыми названиями Roundup Ready® (толерантность к глифосату, например, кукуруза, хлопчатник, соя), Clearfield ® (например, кукуруза), Liberty Link® (толерантность к глюфосинату, например, масличный рапс), IMI® (с толерантностью к имидазолинонам) и STS® (толерантность к сульфонилмочевине, например, кукуруза).
[00762] Семена растений, как описано в настоящем описании, могут быть генетически модифицированными (например, любые семена, которые приводят к генетически модифицированному растению или части растения, которые демонстрируют толерантность к гербициду, толерантность к факторам внешней среды, таким как недостаток воды, засуха, вирусы и продукция азота, или резистентность к токсинам бактерий, грибов или насекомых). Подходящие генетически модифицированные семена включают семена капустных культур, овощей, фруктов, деревьев, волокнистых культур, масличных культур, клубнеплодных культур, кофе, цветов, бобовых растений, злаков, а также других однодольных и двудольных видов растений. Предпочтительно, генетически модифицированные семена включают арахис, табак, травы, пшеницу, ячмень, рожь, сорго, рис, рапс, сахарную свеклу, подсолнечник, томат, перец, бобы, салат-латук, картофель и морковь. Наиболее предпочтительно, генетически модифицированные семена включают семена хлопчатника, сои и кукурузы (сладкой, полевой, посевной или лопающейся).
[00763] Особенно пригодные трансгенные растения, которые можно обрабатывать согласно изобретению, представляют собой растения, включающие события трансформации или комбинацию событий трансформации, которые приведены, например, в базах данных различных национальных или региональных контролирующих органов (см., например, http://gmoinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx и http://www.agbios.com/dbase.php).
XX. Способы доставки полезных бактерий и белков или пептидов животным
[00764] Кроме того, настоящее изобретение относится к способам доставки полезных бактерий и/или белков или пептидов животным.
[00765] Введение бактериальных штаммов, которые являются как пробиотическими, так и эндофитными, в растение, позволяет вхождение бактерий в растение, где они делятся и увеличиваются в количестве. Эндофитные и пробиотические штаммы можно доставлять в растения с использованием различных способов, например, эндофитные и пробиотические штаммы можно доставлять посредством обработки семян, обработки среды для роста растений (например, почвы), полива, нанесения непосредственно на растение (например, внекорневое нанесение на надземные части растения). После попадания в растение бактерии увеличиваются в количестве и колонизируют внутренние ткани растения. Затем растением можно кормить животное, что позволяет доставку пробиотических бактерий животному. Снижается стоимость по сравнению с традиционными способами доставки пробиотических бактерий животным, поскольку эндофитный характер бактерий позволяет им делиться и увеличиваться в количестве в растении. Посредством первоначальной доставки небольшого количество пробиотического и эндофитного штамма бактерий в растение и позволения бактериям увеличиться в количестве в растении, доза возрастает. Кроме того, пробиотический и эндофитный штамм может распространяться в целевой культуре перед сбором и употреблением.
[00766] Также для этих целей можно использовать бактериальные штаммы, которые способны колонизировать филлоплану растения и также являются пробиотическими. Штаммы, которые способны клонизировать филлоплану растения, первоначально можно доставлять в растения небольшими дозами, а затем они делятся и колонизируют наружные поверхности растений.
[00767] Подходящие штаммы бактерий, которые являются как эндофитными или колонизирующими филлоплану, так и пробиотическими, включают штаммы, которые могут как реплицироваться в полевых условиях в или на растении, так и обеспечивают пользу для животных при употреблении. Польза пробиотических бактерий у животных включает, но не ограничиваются этим, регуляцию микробиома пищеварительного тракта животного, секрецию ферментов, которые способствуют перевариванию растительного материала, и стимуляцию иммунной системы животных. Примеры усиливающих пищеварение ферментов, которые могут обеспечить пользу, включают, но не ограничиваются ими, целлюлазы, эндоглюканазы, экзоглюканазы, β-глюкозидазы, амилазы, протеазы, пектиназы, ксиланазы, ксилозидазы, липазы, фосфолипазы и лигназы.
[00768] Роды Bacillus и Lysinibacillus являются уникальными тем, что они содержат большое количество видов, которые являются как эндофитными и, так образом, колонизируют растения, так действуют как пробиотики у позвоночных. Таким образом, виды Bacillus и Lysinibacillus являются в высокой степени пригодными для доставки пробиотиков животным путем пассирования и выращивания в растениях. Распространенные виды Bacillus, которые могут быть как эндофитными, так и пробиотическими, включают Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus toyocerin, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus и Bacillus licheniformis. Также можно использовать виды Lysinibacillus, которые являются как эндофитными, так и пробиотическими.
[00769] Также предусматривается способ доставки полезных бактерий животному. Способ включает кормление животного растением, модифицированным так, чтобы оно содержало уровень эндофитного и пробиотического штамма бактерий, который превышает уровень эндофитного и пробиотического штамма бактерий в том же растении, которое не было модифицировано, выращенном в тех же условиях.
[00770] Растение, которым кормят животное, может включать растение, выращенное в среде для роста растений, содержащей эндофитный и пробиотический штамм бактерий или состав, содержащий эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, на которое нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, выросшее из семени растения, на которое был нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, выросшее в области, на которую был нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, или семя, выросшее в области, на которую был нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий.
[00771] Эндофитный и пробиотический штамм бактерий может включать виды Bacillus или Lysinibacillus. Например, вид Bacillus может включать Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus toyocerin, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, или их комбинацию.
[00772] Эндофитный и пробиотический штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus sphericus EE443, Bacillus pumilus EE-B00143 или их комбинацию.
[00773] Кроме того, белки или пептиды (например, ферменты) можно доставлять животным путем кормления животных рекомбинантными представителями семейства Bacillus cereus, экспрессирующими слитый белок, содержащий белок или пептид, фрагментами экзоспория, содержащими такие слитые белки, или рекомбинантными спорообразующими бактериями, экспрессирующими такие слитые белки. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантные спорообразующие бактерии могут представлять собой эндофитный штамм бактерий или штамм бактерий, который способный колонизировать филлоплану растения, который позволяет доставку белка или пептида животному посредством проглатывания растения, которое колонизировано бактериями. Также можно использовать пробиотические рекомбинантные штаммы представителей семейства Bacillus cereus или штаммы рекомбинантных спороообразующих бактерий, так что животное, которое проглатывает рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантные спорообразующие бактерии, получает пользу как от пробиотических бактерий, так и пользу от белка или пептида. Также для доставки белков или пептидов животным можно использовать рекомбинантные штаммы представителей семейства Bacillus cereus и рекомбинантные штаммы спорообразующих бактерий, которые являются как эндофитными, так и колонизирующими филлоплану.
[00774] Таким образом, также предусматривается способ доставки белков или пептидов животному. Способ включает кормление животного рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, экспрессирующим слитый белок, содержащий представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Альтернативно способ включает кормление животного фрагментами экзоспория, происходящими из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего слитый белок, содержащий представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00775] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, описанных в настоящем описании, которые экспрессируют слитый белок.
[00776] Фрагменты экзоспория могут включать фрагменты экзоспория, происходящие из любого из представителей семейства Bacillus cereus, описанных выше в разделе IV.
[00777] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать эндофитный штамм бактерий. Эндофитный штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366, или Bacillus mycoides EE-B00363. Например, эндофитный штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363.
[00778] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать пробиотический штамм бактерий. Пробиотический штамм бактерий может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL № B-50924), или их комбинацию.
[00779] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может находиться в растении, которым кормят животного.
[00780] Альтернативно рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать штамм бактерий, который способен колонизировать филлоплану растения. Например, штамм бактерий, который способен колонизировать филлоплану растения, может включать Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, представитель семейства Bacillus cereus EE218, Bacillus thuringiensis BT013A, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363.
[00781] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может присутствовать на филлоплане растения, которым кормят животное.
[00783] Например, нацеливающая последовательность может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%.
[00784] Нацеливающая последовательность может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.
[00785] Нацеливающая последовательность может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 56% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%.
[00786] Нацеливающая последовательность может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 62% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.
[00787] Нацеливающая последовательность может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 68% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.
[00788] Нацеливающая последовательность может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.
[00789] Нацеливающая последовательность может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.
[00790] Нацеливающая последовательность может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%.
[00791] Нацеливающая последовательность может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 90%.
[00792] Нацеливающая последовательность может состоять из: (a) аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%; (b) аминокислот 1-35 SEQ ID NO: 1; (c) аминокислот 20-35 SEQ ID NO: 1; (d) SEQ ID NO: 1; (e) SEQ ID NO: 96 или (f) SEQ ID NO: 120.
[00793] Белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00794] Белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00795] Белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00796] Белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00797] Белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 100% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[00798] Нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать аминокислотную последовательность GXT на их C-конце, где X представляет собой любую аминокислоту.
[00799] Нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать остаток аланина в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
[00800] Нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, кроме того, могут содержать остаток метионина, серина или треонина в аминокислотном положении, непосредственно предшествующем первой аминокислоте нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория, или в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
[00801] Кроме того, слитый белок может содержать аминокислотный линкер между нацеливающей последовательностью, белком экзоспория или фрагментом белка экзоспория и представляющим интерес белком или пептидом. Линкер может представлять собой любой из линкеров, описанных выше в разделе XI.
[00802] Слитый белок может экспрессироваться под контролем промотора споруляции, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория слитого белка или его части, и/или под контролем промотора споруляции с высокой экспрессией. Промотор может представлять собой любой из промоторов, описанных выше в разделе III.
[00803] Также предусматривается способ доставки белков или пептидов животному. Способ включает кормление животного рекомбинантной спорообразующей бактерией. Рекомбинантная спорообразующая бактерия может представлять собой любую из рекомбинантных спорообразующих бактерий, описанных выше в разделе IX.
[00804] Рекомбинантная спорообразующая бактерия может находиться в растении, которым кормят животного.
[00805] Рекомбинантная спорообразующая бактерия может включать эндофитный и пробиотический штамм бактерий. Например, эндофитный и пробиотический штамм бактерий может включать Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975) или Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), или их комбинацию.
[00806] В любом из способов растение можно обрабатывать перед кормлением животного.
[00807] В любом из описанных выше способов, вовлекающих кормление растением животного, способ, кроме того, может включать внесение эндофитного штамма бактерий или состава, содержащего эндофитный штамм бактерий, в среду для роста растений. Альтернативно способ может включать нанесение эндофитного штамма бактерий или состава, содержащего эндофитный штамм бактерий, на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения. Растение, которым кормят животное, включает растение, выращенное в среде для роста растений, содержащей эндофитный и пробиотический штамм бактерий или состав, содержащий эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, на которое нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, выращенное из семени растения, на которое был нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, выращенное в области, на которую был нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, или семя, выращенное в области, на которую бал нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий.
[00808] В любом из описанных выше способов доставки белков или пептидов животному представляющий интерес белок или пептид включает фермент. Например, фермент может включать ксиланазу, ксилозидазу, фитазу, фосфатазу, протеазу, целлюлазу, эндоглюканазу, экзоглюконазу, глюканазу, амилазу (например, α-амилаза или β-амилаза), липазу, фосфолипазу, гликозилазу, галактаназу, α-галактозидазу, β-глюкозидазу, амилазу, пектиназу, биотиназу, полигалактуроназу, лигниназу или их комбинацию. Липаза может включать фосфолипазу A1, фосфолипазу A2, фосфолипазу C, фосфолипазу D, лизофосфолипазу или их комбинацию. Предпочтительно фермент включает ксиланазу или фитазу.
[00809] В любом из способов, включающих кормление животного растением, растение можно обрабатывать перед кормлением животного.
[00810] В любом из описанных выше способов, включающих доставку бактерий, белков или пептидов животному, животное может представлять собой млекопитающее (например, овца, коза, корова, свинья, олень, альпака, бизон, верблюд, осел, лошадь, мул, лама, кролик, собака или кошка), птицу (например, курица, индейка, утка, гусь, перепел или фазан), рыбу (например, лосось, форель, тиляпия, тунец, сом или карп) или ракообразное (например, мелкая креветка, крупная креветка, лобстер, краб или рак).
XXI. Способы доставки полезных нуклеиновых кислот животным, насекомым, червям, грибам и простейшим
[00811] Кроме того, изобретение относится к способам доставки молекулы нуклеиновой кислоты животному, насекомому, червю, грибу или простейшему.
[00812] Способ может включать кормление животного, насекомого или червя растением, модифицированным там, чтобы оно содержало уровень молекулы нуклеиновой кислоты, превышающий уровень молекулы нуклеиновой кислоты в том же растении, которое не было модифицировано, выращенном в тех же условиях.
[00813] Кроме того, предусматривается способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты животному, насекомому или червю. Способ может включать кормление животного, насекомого или червя рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, экспрессирующим слитый белок, содержащий представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Альтернативно способ может включать кормление животного, насекомого или червя рекомбинантной спорообразующей бактерией, которая экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии. Представляющий интерес белок или пептид включает связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, и со связывающим ДНК или РНК белком или пептидом связана молекула нуклеиновой кислоты. Связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид может быть физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[00814] Предусматривается другой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты животному, насекомому или червю. Способ включает кормление животного, насекомого или червя фрагментами экзоспория, происходящими из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания выше, и содержат слитый белок. Слитый белок содержит связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, и где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты.
[00815] Предпочтительно червь представляет собой нематоду
[00816] Предусматривается способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты в гриб или простейшее. Способ включает приведение в контакт гриба или простейшего с рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, экспрессирующим слитый белок, содержащий представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Альтернативно способ включает приведение в контакт гриба или простейшего с рекомбинантной спорообразующей бактерией, которая экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии. Представляющий интерес белок или пептид включает связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид и молекула нуклеиновой кислоты связана со связывающим нуклеиновую кислоту белком или пептидом.
[00817] Коме того, предусматривается способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты в гриб или простейшее. Способ включает приведение в контакт гриба или простейшего с фрагментами экзоспория. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания выше и содержат слитый белок. Слитый белок содержит связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, и связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты.
[00818] Молекула нуклеиновой кислоты может включать модулирующую молекулу РНК; молекулу РНК-i; микро-РНК; аптамер; или молекулу ДНК, которая кодирует модулирующую молекулу РНК, молекулу РНК-i, микроРНК или аптамер.
[00819] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать любой из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок.
[00820] Слитый белок может содержать любой из слитых белков, описанных в настоящем описании, который включает связывающий нуклеиновую кислоту белок.
[00821] Белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок CotG, белок оболочки споры X или белок CotY.
[00822] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00823] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00824] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00825] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 98% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00826] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 99% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00827] Белок оболочки споры может содержать аминокислотную последовательность, обладающую 100% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[00828] Описанные выше способы можно использовать для многочисленных целей. Например, эти способы можно использовать для доставки РНК или ДНК животным для снижения предрасположенности животного к заболеванию или лечения заболевания у животного (например, органическое заболевание, такое как инсульт, диабет, болезнь сердца и дегенеративные заболевания). Также было продемонстрировано, что РНК и ДНК являются эффективными для устранения или лечения заболевания, вызванного патогенами животных, такими как бактерии, вирусы, черви (например, нематоды) и грибы. РНК и ДНК могут действовать непосредственно на патоген или могут действовать с иммунной системой животного, активируя или повышая иммунный ответ.
[00829] Кроме того, описанные выше способы можно использовать для устранения паразитов, в том числе насекомых, червей (например, нематод), грибов и простейших. Доставка конкретных РНК или ДНК паразиту может приводить к снижению способности паразита инфицировать хозяина (например, растение-хозяина), снижению кормления на целевых хозяевах или растениях, прямому уничтожению посредством блокирования ключевых генов или различных других эффектов.
XXII. Вакцины и способ обеспечения иммуногенного ответа
[00830] Предусматривается вакцина, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок как описано выше в абзацах [00171], [00173]-[00176] раздела I, где представляющий интерес белок или пептид представляет собой антиген или иммуноген.
[00831] Кроме того, предусматривается вакцина, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и фрагменты экзоспория. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанных в разделе IV настоящего описания выше и содержат слитый белок. Слитый белок содержит антиген.
[00832] Предусматривается другая вакцина, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, как описано выше в разделе II.
[00833] В вакцинах, которые содержат фрагменты экзоспория или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, как описано выше в разделе II, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящем описании. В частности, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных выше в абзацах [00782]-[00801].
[00834] Cлитый белок может экспрессироваться под контролем промотора споруляции, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория слитого белка или его части, и/или под контролем промотора споруляции с высокой экспрессией. Промотор может представлять собой любой из промоторов, описанных выше в разделе III.
[00835] Когда представляющий интерес белок или пептид представляет собой антиген, экспонирование антигена на внешней стороне споры или на фрагменте экзоспория обеспечивает ответ иммунной системы для обеспечения вакцинации против различных патогенов или заболеваний. Подходящими антигенами или низкомолекулярными соединениями являются те, о которых известно или ожидается, что они будут индуцировать желаемый иммунный ответ, который является достаточным для обеспечения терапевтического или защитного эффекта при экспрессии снаружи споры Bacillus или экспонировании на фрагменте экзоспория. Пригодность по большей части определяется укладкой трехмерной структуры после включения рекомбинантного антигена в экзоспорий, т.е. антигенная часть(и) рекомбинантной молекулы должна быть доступной для обнаружения иммунной системой.
[00836] Патогены или заболевания, из которых может происходить антиген, включают, но не ограничиваются ими, инфекции акинетобактериями, вызываемые Acinetobacter baumannii; актиномикоз, вызываемый Actinomyces israelii, Actinomyces gerencseriae и Propionibacterium propionicus; африканский трипаносомоз, вызываемый Trypanosoma brucei; синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемый вирусом иммунодефицита человека; амебиаз, вызываемый Entamoeba histolytica; анаплазмоз, вызываемый Anaplasma genus, сибирскую язву, вызываемую Bacillus anthracis; инфекцию Arcanobacterium haemolyticum, вызываемую Arcanobacterium haemolyticum; аргентинскую геморрагическую лихорадку, вызываемую вирусом Хунин; аскариоз, вызываемый Ascaris lumbricoides, инфекцию астровирусом, вызываемую семейством Astroviradae; бабезиоз, род Babesia; инфекцию Bacillus cereus, вызываемую Bacillus cereus; бактериальную пневмонию; бактериальный вагиноз; инфекцию Bacteroides, вызываемую родом Bacteriodes; балантидиаз, вызываемый Balantidium coli; инфекцию Baylisascaris, вызываемую родом Baylisascaris; инфекцию вирусом BK, вызываемую вирусом BK; черную пьедру, вызываемую Piedraia hortae; инфекцию Blastocystis hominis, вызываемую Blastocystis hominis; бластомикоз, вызываемый Blastomyces dermatitidis; боливийскую геморрагическую лихорадку, вызываемую вирусом Мачупо; инфекцию Borrelia, вызываемую родом Borrelia; ботулизм (и младенческий ботулизм), вызываемый употреблением токсина Clostridium botulinum; бразильскую геморрагическую лихорадку, вызываемую Sabia; бруцеллез, вызываемый родом Brucella; инфекцию Burkholderia, обычно вызываемую Burkholderia cepacia и другими видами Burkholderia; язву Buruli, вызываемую Mycobacterium ulcerans; инфекцию калицивирусом (норовирусом и саповирусом), вызываемую семейством Caliciviridae; кампилобактериоз, вызываемый родом Campylobacter; кандидоз (монилиаз; молочница), обычно вызываемый Candida albicans и другими видами Candida; болезнь кошачьих царапин, вызываемую Bartonella henselae; целлюлит, обычно вызываемой Streptococcus и Staphylococcus группы A; болезнь Шагаса (американский трипанозомоз), вызываемый Trypanosoma cruzi; шанкроид, вызываемый Haemophilus ducreyi; ветрянку, вызываемую вирусом Varicella zoster (VZV); хламидиоз, вызываемый Chlamydia trachomatis; инфекцию Chlamydophila pneumoniae, вызываемую Chlamydophila pneumoniae; холеру, вызываемую Vibrio Cholerae; хромобластомикоз, обычно вызываемый Fonsecaea pedrosoi; клонорхоз, вызываемый Clonorchis sinensis; инфекцию Clostridium difficile, вызываемую Clostridium difficile; кокцидиоидомикоз, вызываемый Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii; колорадскую клещевую лихорадку (CTF), вызываемую вирусом колорадской клещевой лихорадки (CTFV); обычную простуду (острый вирусный ринофарингит; вирусную инфекцию верхних дыхательных путей), обычно вызываемую риновирусами и коронавирусами; болезнь Крейтцфельда-Якоба (CJD), вызываемую прионом CJD; конго-крымскую геморрагическую лихорадку (CCHF), вызываемую вирусом конго-крымской геморрагической лихорадки; криптококкоз, вызываемый Cryptococcus neoformans; криптоспоридиоз, вызываемый родом Cryptosporidium; синдром larva migrans, кожная форма (CLM), обычно вызываемый Ancylostoma braziliense и множеством других паразитов; циклоспориаз, вызываемый Cyclospora cayetanensis; цистицеркоз, вызываемый Taenia solium; инфекцию цитомегаловирусом, вызываемая цитомегаловирусом; лихорадку Денге, вызываемую вирусами Денге (DEN-1, DEN-2, DEN-3 и DEN-4) - флавивирусы; диэнтамебиаз, вызываемый Dientamoeba fragilis; дифтерию, вызываемую Corynebacterium diphtheriae; дифиллоботриоз, вызываемый Diphyllobothrium; дракункулез, вызываемый Dracunculus medinensis; геморрагическую лихорадку Эбола, вызываемую Ebolavirus (EBOV); эхинококкоз, вызываемый родом Echinococcus; эрлихиоз, вызываемый родом Ehrlichia; энтеробиоз (оксиуроз), вызываемый Enterobius vermicularis; инфекцию Enterococcus, вызываемую родом Enterococcus; инфекцию энтеровирусом, вызываемую родом Enterovirus; сыпной тиф, вызываемый Rickettsia prowazekii; инфекционную эритему (пятую болезнь), вызываемую парвовирусом B19; внезапную экзантему, вызываемую вирусом герпеса 6 человека (HHV-6) и вирусом герпеса 7 человека (HHV-7); фасцилопсидоз, вызываемый Fasciolopsis buski; фасциолез, вызваемый Fasciola hepatica и Fasciola gigantica; фатальную семейную бессонницу (FFI), вызываемую прионом FFI; филяриоз, вызываемый надсемейством Filarioidea; пищевое отравление, вызываемое Clostridium perfringens; инфекцию свободно живущими амебами; инфекцию Fusobacterium, вызываемую родом Fusobacterium; газовую гангрену (Clostridial myonecrosis), обычно вызываемую Clostridium perfringens или другими видами Clostridium; геотрихоз, вызываемый Geotrichum candidum; синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера (GSS), вызываемый прионом GSS; гиардиоз, вызываемый Giardia intestinalis; сап, вызываемый Burkholderia mallei; гнатостомоз, вызываемый Gnathostoma spinigerum и Gnathostoma hispidum; гонорею, вызываемую Neisseria gonorrhoeae; паховую гранулему (донованоз), вызываемую Klebsiella granulomatis; стрептококковую инфекцию группы A, вызываемую Streptococcus pyogenes; стрептококковую инфекцию группы B, вызываемую Streptococcus agalactiae; инфекцию гемофильной палочкой, вызываемую Haemophilus influenzae; вирусную пузырчатку полости рта и конечностей (HFMD), вызываемую энтеровирусами, в основном вирусом Коксаки A и энтеровирусом 71 (EV71); хантавирусный легочный синдром (HPS), вызываемый вирусом Син Номбре; инфекцию Helicobacter pylori, вызываемую Helicobacter pylori; гемолитический-уремический синдром (HUS), вызываемый Escherichia coli O157:H7; геморрагическую лихорадку с ренальным синдромом (HFRS), вызываемую семейством Bunyaviridae; гепатит A, вызываемый вирусом гепатита A; гепатит B, вызываемй вирусом гепатита B; гепатит C, вызываемый вирусом гепатита C; гепатит D, вызываемый вирусом гепатита D; гепатит E, вызываемый вирусом гепатита E; простой герпес, вызываемый вирусом простого герпеса 1 и 2 (HSV-1 и HSV-2); гистоплазмоз, вызываемый Histoplasma capsulatum; анкилостомоз, вызываемый Ancylostoma duodenale и Necator americanus; инфекцию бокавирусом человека, вызываемую бокавирусом человека (HBoV); эрлихоз человека, вызываемый Ehrlichia ewingii; гранулоцитарный анаплазмоз человека (HGA), вызываемый Anaplasma phagocytophilum; инфекцию метапневмовирусом человека, вызываемую метапневмовирусом человека (hMPV); моноцитарный эрлихоз человека, вызываемый Ehrlichia chaffeensis; инфекцию вирусом папилломы человека (HPV), вызываемую вирусом папилломы человека (HPV); инфекцию вирусом парагриппа человека, вызываемую вирусами парагриппа человека (HPIV); гименолепидоз, вызываемый Hymenolepis nana и Hymenolepis diminuta; инфекционный мононуклеоз Эпштейна-Барр (Mono), вызываемый вирусом Эпштейна-Барр (EBV); грипп (flu), вызываемый семейством Orthomyxoviridae; изоспориаз, вызываемый Isospora Belli; болезнь Кавасаки (причина неизвестна, однако данные показывают, что она является инфекционной); кератит; инфекцию Kingella kingae, вызываемую Kingella kingae; куру, вызываемую прионом Куру; лихорадку Ласса, вызваемую вирусом Ласса; легионеллез (болезнь легионеров), вызываемый Legionella pneumophila; легионеллез (понтиакская лихорадка), вызываемый Legionella pneumophila; лейшманиоз, вызываемый родом Leishmania; лепру, вызываемую Mycobacterium leprae и Mycobacterium lepromatosis; лептоспироз, вызываемый родом Leptospira; листериоз, вызываемый Listeria monocytogenes; болезнь Лайма (боррелиоз Лайма), обычно вызываемую Borrelia burgdorferi и другими видами Borrelia; лимфатический филяриатоз (элефантиаз), вызываемый Wuchereria bancrofti и Brugia malayi; лимфоцитарный хориоменингит, вызываемый вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV); малярию, вызываемую родом Plasmodium; марбургскую геморрагическую лихорадку (MHF), вызываемую вирусом марбургской болезни; корь, вызываемую вирусом кори; мелиоидоз (болезнь Уитмора), вызываемый Burkholderia pseudomallei; менингит; менингококковое заболевание, вызываемое Neisseria meningitidis; метагонимоз, обычно вызываемый Metagonimus yokagawai; микроспоридиоз, вызываемый типом Microsporidia; контагиозный моллюск (MC), вызываемый вирусом Molluscum contagiosum (MCV); свинку, вызываемую вирусом свинки; крысиный сыпной тиф (эндемический тиф), вызываемый Rickettsia typhi; инфекцию Mycoplasma pneumonia, вызываемую Mycoplasma pneumoniae; мицетому, вызываемую многочисленными видами бактерий (Actinomycetoma) и грибов (Eumycetoma); миаз, вызываемый паразитическими личинками двукрылых мух; неонатальный конъюнктивит (ophthalmia neonatorum), наиболее часто вызываемый Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae; (новый) вариант болезни Крейтцфельда-Якоба (vCJD, nvCJD), вызываемый прионом vCJD; нокардиоз, обычно вызываемый Nocardia asteroides и другими видами Nocardia; онхоцеркоз (речную слепоту), вызываемый Onchocerca volvulus; паракокцидиоидомикоз (южно-американский бластомикоз), вызываемый Paracoccidioides brasiliensis; парагонимоз, обычно вызываемый Paragonimus westermani и другими видами Paragonimus; пастереллез, вызываемый родом Pasteurella; головной педикулез (головные вши), вызываемый Pediculus humanus capitis; нательный педикулез (нательные вши), вызываемый Pediculus humanus corporis; лобковый педикулез (лобковые вши, площицы), вызываемый Phthirus pubis; воспалительное заболевание таза (PID); коклюш (судорожный кашель), вызываемый Bordetella pertussis; чуму, вызываемую Yersinia pestis; пневмококковую инфекцию, вызываемую Streptococcus pneumoniae; пневмоцистную пневмонию (PCP), вызываемую Pneumocystis jirovecii; пневмонию; полиомиелит, вызываемый полиовирусом; инфекцию Prevotella, вызываемую родом Prevotella; первичный амебный менингоэнцефалит (PAM), обычно вызываемый Naegleria fowleri; прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию, вызываемую вирусом JC; пситтакоз, вызываемый Chlamydophila psittaci; лихорадку Q, вызываемую Coxiella burnetii; бешенство, вызываемое вирусом бешенства; лихорадку укуса крыс, вызываемую Streptobacillus moniliformis и Spirillum minus; инфекцию респираторно-синцитиальным вирусом, вызываемая респираторно-синцитиальным вирусом (RSV); риноспоридиоз, вызываемый Rhinosporidium seeberi; инфекцию риновирусом, вызываемую риновирусом; риккетсиозную инфекцию, вызываемую родом Rickettsia; осповидный риккетсиоз, вызываемый Rickettsia akari; лихорадку долины Рифт (RVF), вызываемую вирусом лихорадки долины Рифт; пятнистую лихорадку Скалистых гор (RMSF), вызываемую Rickettsia rickettsii; ротавирусную инфекцию, вызываемый ротавирусом; краснуху, вызываемую вирусом краснухи; сальмонеллез, вызываемый родом Salmonella; SARS (тяжелый острый респираторный синдром), вызываемый коронавирусом SARS; чесотку, вызываемую Sarcoptes scabiei; шистозоматоз, вызываемый родом Schistosoma; сепсис; шигеллез (бациллярная дизентерия), вызываемый Shigella genus; опоясывающий лишай (опоясывающий герпес), вызываемый вирусом Varicella zoster (VZV); натуральную оспу (оспу), вызываемую Variola major или Variola minor; споротрихоз, вызываемый Sporothrix schenckii; стафилококковое пищевое отравление, вызываемое родом Staphylococcus; стафилококковую инфекцию, вызываемую родом Staphylococcus; стронгилоидоз, вызываемый Strongyloides stercoralis; сифилис, вызываемый Treponema pallidum; тениоз, вызываемый родом Taenia; столбняк (тризм челюсти), вызываемый Clostridium tetani; дерматофитию бороды и усов (паразитарный сикоз), обычно вызываемый родом Trichophyton; микоз головы (стригущий лишай скальпа), обычно вызываемый Trichophyton tonsurans; микоз гладкой кожи туловища (стригущий лишай туловища), обычно вызываемый родом Trichophyton; дерматомикоз паховый (паховую эпидермофитию), обычно вызываемый Epidermophyton floccosum, Trichophyton rubrum и Trichophyton mentagrophytes; дерматомикоз рук (стригущий лишай рук), вызываемый Trichophyton rubrum; черный лишай, обычно вызываемый Hortaea werneckii; дерматомикоз стоп (стопу атлета), обычно вызываемый родом Trichophyton; микоз ногтя (онихомикоз), обычно вызываемый родом Trichophyton; разноцветный лишай (разноцветный питириаз), вызываемый родом Malassezia; токсокариаз (синдром larva migrans, глазная форма (OLM)), вызываемый Toxocara canis или Toxocara cati; токсокариаз (синдром larva migrans, висцеральная форма (VLM)), вызываемый Toxocara canis или Toxocara cati; токсоплазмоз, вызываемый Toxoplasma gondii; трихинеллез, вызываемый Trichinella spiralis; трихомоноз, вызываемый Trichomonas vaginalis; трихиуриаз (инфекция власоглавом), вызываемый Trichuris trichiura; туберкулез, обычно вызываемый Mycobacterium tuberculosis; туляремию, вызываемую Francisella tularensis; инфекцию Ureaplasma urealyticum, вызываемую Ureaplasma urealyticum; венесуэльский энцефалит лошадей, вызываемый вирусом венесуэльского энцефалита лошадей; венесуэльскую геморрагическую лихорадку, вызываемую вирусом Гуанарито; вирусную пневмонию; лихорадку западного Нила, вызываемую вирусом лихорадки западного Нила; белую пьедру (белый лишай), вызываемый Trichosporon beigelii; инфекцию Yersinia pseudotuberculosis, вызываемую Yersinia pseudotuberculosis; иерсиниоз, вызываемый Yersinia enterocolitica; желтую лихорадку, вызываемую вирусом желтой лихорадки; зигомикоз, вызываемый отрядом Mucorales (мукормикоз) и отрядом Entomophthorales (энтомофторамикоз).
[00837] Когда представляющий интерес белок или пептид представляет собой антиген, для экспрессии слитого белка можно использовать любой представитель семейства Bacillus cereus. Предпочтительными являются Bacillus thuringiensis или Bacillus mycoides.
[00838] Для получения вакцины представляющий интерес антиген включают в слитый белок известными способами, такими как ПЦР-сплайсинг посредством перекрывающегося удлинения, расщепление эндонуклеазой рестрикции и лигирование или синтез гена de novo. Затем слитый белок вводят в рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus посредством трансфекции, трансформации, конъюгации, электропорации или других известных способов. Затем рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus выращивают в культуральной среде (например, минимальная жидкая среда), и ему позволяют спорулировать. Предпочтительно, споруляция продолжается до завершения, а затем споры собирают и хранят. Споры можно собирать либо посредством центрифугирования, либо посредством снятия спор с планшетов для выращивания и внесения в жидкую среду (например, PBS или вода), а затем центрифугирования и промывания полученного осадка со спорами в жидкой среде. Перед применением осадок со спорами можно ресуспендировать в жидкой среде до желаемой концентрации для применения или инъекции. Когда вакцина содержит фрагменты экзоспория, фрагменты экзоспория можно получать с использованием любого из способов, описанных в разделе XIX.H выше.
[00839] Желаемая концентрация спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или фрагментов экзоспория в вакцине основана на размере индивидуума, количестве активного антигена на поверхности спор и присутствия и концентрации в вакцинном составе адъювантов. Вакцина по изобретению может содержать общепринятые адъюванты, включая фармацевтически приемлемые носители.
[00840] Предусматривается способ индукции иммуногенного ответа у индивидуума. Способ включает введение вакцины, содержащей споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующие слитые белки, или фрагменты экзоспория, содержащие слитые белки, как описано в настоящем описании, индивидууму.
[00841] Вакцина, как описано в настоящем описании, является пригодной для внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, внутримышечного, подкожного, внутриплеврального, местного, перорального, интраназального, внутрикожного, трансэпителиального введения или введения посредством ингаляции.
[00842] Вакцину можно вводить индивидууму, которым может является человек, мышь, птица, свинья, жвачное животное, овца, кошка, собака, лошадь, коза, пресмыкающееся или не являющийся человеком примат. Предпочтительно индивидуумом является млекопитающее и наиболее предпочтительно человек.
XXIII. Рекультивация
[00843] Когда представляющий интерес белок или пептид представляет собой белок или пептид для рекультивации, токсическое вещество каталитически конвертируется белком или пептидом для рекультивации в нетоксичное или менее токсичное вещество.
[00844] Когда белок или пептид для рекультивации включает фермент, фермент экспонируется и стабилизируется на наружной области споры и может быть доставлен в загрязненную почву или загрязненную воду в форме, которая является активной против целевого загрязнителя или химического соединения.
[00845] Подходящие ферменты зависят от загрязнителя или химического вещества, на которые нацелена рекультивация.
[00846] Для получения композиции для рекультивации представляющий интерес фермент включают в слитый белок известными способами, такими как ПЦР-сплайсинг посредством перекрывающего удлинения, расщепление эндонуклеазой рестрикции и лигирование, или синтез гена de novo. Затем ген слитого белка вводят в рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus посредством трансфекции, трансформации, конъюгации, электропорации или других известных способов. Затем рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus выращивают в культуральной среде (например, минимальная жидкая среда) и позволяют ему спорулировать. Предпочтительно, споруляция продолжается до завершения, а затем споры собирают и хранят. Споры можно собирать либо посредством центрифугирования, либо посредством снятия спор с планшетов для выращивания и внесения в жидкую среду (например, PBS или вода), а затем центрифугирования и промывания полученного осадка со спорами в жидкой среде. Перед применением осадок со спорами можно ресуспендировать в жидкой среде до желаемой концентрации для применения. Альтернативно осадок состава со спорами можно составлять в гранулы в желаемой концентрации для применения и внесения в загрязненную среду. Когда фрагменты экзоспория используют для рекультивации, фрагменты экзоспория можно получать с использованием любого из способов, описанных в разделе XIX.H выше.
[00847] Предусматривается способ уменьшения количества загрязнителей в окружающей среде. Способ включает воздействие на загрязненную среду спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок, как описано выше в абзацах [00171], [00173]-[00175] и [00177] раздела I, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент рекультивации.
[00848] Предусматривается другой способ уменьшения количества загрязнителей в окружающей среде. Способ включает воздействие на загрязненную внешнюю среду фрагментов экзоспория. Фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания выше и содержат слитый белок. Слитый белок содержит фермент рекультивации.
[00849] Предусматривается другой способ уменьшения количества примесей в окружающей среде. Способ включает воздействие на загрязненную окружающую среду спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, как описано выше в разделе II.
[00850] В способах уменьшения количества примесей, которые включают воздействие на загрязненную окружающую среду фрагментов экзоспория или рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, как описано выше в разделе II, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут представлять собой любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящем описании. В частности, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных выше в абзацах [00782]-[00801].
[00851] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора споруляции, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория, или фрагмента белка экзоспория слитого белка или его части, и/или под контролем промотора споруляции с высокой экспрессией. Промотор может представлять собой любой из промоторов, описанных выше в разделе III.
[00852] Когда представляющий интерес белок или пептид представляет собой фермент рекультивации, для экспрессии слитого белка можно использовать любой представитель семейства Bacillus cereus. Предпочтительными являются Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus или Bacillus mycoides.
[00853] Споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus могут включать эндофитный штамм бактерий для фиторекультивации, такой как представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444 или Bacillus thuringiensis EE319.
[00854] Загрязненная окружающая среда, подлежащая обработке, может представлять собой газ, жидкость, полужидкость, гель, пленку, полутвердое вещество или твердое вещество. Твердая окружающая среда может представлять собой почву, такую как поверхностная почва и подпахотный слой почвы, компост, пожнивные остатки, листья, мульчу, срубленные деревья, биопленку, слой грязи, гумус, отстой, песок, шлак, осадочное отложение, сточные воды, пустую породу, ядерные отходы, боеприпасы и снаряды, больничные отходы, части автомобилей под пресс, металлическую обрез, изоляционные отходы, пищевые отходы, асбест, элементы питания, лом металлообработки, полигонные отходы, отходы деревообработки, отходы текстильного производства, стекольный бой, кожевенные отходы, резиновые отходы, пластмассовые отходы, отходы электронных компонентов, сельскохозяйственные отходы, фотографические отходы, керамические отходы, фармацевтические отходы, воск, израсходованные катализаторы или их комбинации. Жидкая окружающая среда может представлять собой питьевую воду, подземные воды, поверхностную воду, солевые растворы, резервуары, отстойники, водные экосистемы, промышленные сточные воды, кислые шахтные воды, израсходованную автомобильную жидкость, израсходованные электролитические ванны, растворы для обезжиривания, растворы для сухой очистки, машинные охлаждающие жидкости, отходы буровых жидкостей, отходы смазочно-охлаждающих жидкостей, отходы жидкостей гидроразрыва пласта, отходы смазывающих веществ, краску, бытовую сточную воду, нефтезагрязненные стоки, стоки целлюлозных заводов, системы подготовки воды, систему очистки стоков, канализацию, отстойник для осаждения, накопитель сточных вод, озеро, реку или их комбинацию. Газообразная окружающая среда может представлять собой воздух, выхлопной газ, такой как выбросы энергостанций, мусоросжигательных заводов, крематориев или нефтеперегонных заводов, технологический выходящий поток, свалочный газ, природный газ, пропан или их комбинацию.
[00855] Загрязненная окружающая среда может быть загрязнена различными загрязнителями, включая, но не ограничиваясь ими, химическое боевое средство, включая зарин (GB; o-изопропилметилфосфонофлуоридат); зоман (GD; o-пинаколилметилфосфонофлуоридат); циклозарин (GF; o-циклогексилметилфосфонофлуоридат); VX (O-этил-S-[2-(диизопропиламино)этил]метилфосфонотиоат); табун (GA; N,N-диметилэтилфосфороамидоцианидат), DFP (диизопропилфосфорофлуоридат) или иприт; неорганическое соединение, содержащее мышьяк, сурьму, барий, бериллий, кадмий, хром, медь, железо, свинец, марганец, ртуть, никель, селен, серебро, олово, таллий, уран, цинк или их комбинацию; органическое соединение, содержащее полициклический ароматический углеводород (PAH), хлорированное ароматическое соединение, хлорированное алифатическое соединение, нитроароматическое соединение (NAC), фенольное соединение, цианосоединение, диоксин или их комбинацию; неочищенную нефть, очищенную нефть, топливную нефть, дизельное топливо, бензин, масло для гидросистем и керосин или их летучий компонент, такой как бензол, толуол, этилбензол, ксилол или нафталин; взрывчатое вещество, удобрение, пестицид, инсектицид или гербицид.
[00856] Концентрация рекомбинантных спор или фрагментов экзоспория, необходимая для обработки загрязненной окружающей среды, основана на факторах, включающих объем или площадь, подлежащие обработке, распространенность присутствующего заданного химического вещества, загрязнителя или органического материала, количество времени, доступное для обработки, и количество активного фермента на поверхности спор.
[00857] Споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или фрагменты экзоспория можно приводить в контакт с загрязненной окружающей средой путем включения спор или фрагментов экзоспория в поток, содержащий загрязнитель, приведения в контакт потока, содержащего загрязнитель, с иммобилизующим материалом, содержащим споры или фрагменты экзоспория (например, фильтр, мембрана, губка или кассета), включения спор или фрагментов экзоспория в гранулы, подлежащие смешению с загрязненной окружающей средой, распыление спор или фрагментов экзоспория на или в загрязненную окружающую среду, инжектирование спор или фрагментов экзоспория в загрязненную окружающую среду или орошение загрязненной окружающей среды спорами или фрагментами экзоспория.
[00858] Споры можно комбинировать с бактериальными инокулятами, химическими соединениями, растворителями и другими продуктами, которые могут ускорять процесс разложения.
[00859] Фермент рекультивации включает, но не ограничивается ими, фосфатсвязывающий белок, протеазу, гидролиазу углеводов, липазу, фосфолипазу, нуклеазу, связывающий питательные вещества белок, целлюлазу, оксидоредуктазу, монооксигеназу, диоксигеназу, лакказу, лигнинпероксидазу, марганцевую пероксидазу, пероксидазу, дегалогеназу, каталазу, амилазу, редуктазу, оксидазу, амидазу, лигниназу, ксиланазу, пектиназу, ксилозидазу, эндоглюканазу, экзоглюканазу, глюкозидазу, ингибирующий биопленку пептид, деградирующий гербицид фермент, деградирующий пестицид фермент (например, пиретриназу) или их комбинацию.
[00860] Когда фермент включает деградирующий гербицид фермент или деградирующий пестицид фермент, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus в подходящем случае включает штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид. Например, штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид, может включать представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[00861] Также предусматривается способ фиторекультивации почвы. Способ включает внесение спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus в загрязненную почву; или нанесение спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растение, посаженное в загрязненную почву, или семя растения для посадки в загрязненную почву, или на область загрязненной почвы, окружающую растение или семя растения; где споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus экспрессируют слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, где слитый белок представляет собой слитый белок, как описано выше, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент рекультивации, и где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает эндофитный штамм бактерий или колонизирующий корни штамм бактерий. Например, рекомбинантная спорообразующая бактерия может включать эндофитный штамм бактерий.
[00862] Также предусматривается другой способ фиторекультивации загрязненной почвы. Способ включает экспрессию фермента рекультивации в споре представителя семейства Bacillus cereus, где экспрессия фермента рекультивации в споре рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus увеличена по сравнению с экспрессией фермента рекультивации в споре представителя семейства Bacillus cereus дикого типа.
[00863] Также предусматривается другой способ фиторекультивации загрязненной почвы. Способ включает внесение рекомбинантной спорообразующей бактерии в загрязненную почву, или нанесение рекомбинантной спорообразующей бактерии на растение, посаженное в загрязненную почву, или семя растения для посадки в загрязненную почву, или на область загрязненной почвы, окружающую растение или семя растения. Рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии. Белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок CotG, белок оболочки споры X или белок CotY. Рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий или колонизирующий корни штамм бактерий. Представляющий интерес белок или пептид включает фермент рекультивации.
[00864] Также предусматривается другой способ фиторекультивации загрязненной почвы. Способ включает внесение фрагментов экзоспория в загрязненную почву или нанесение фрагментов экзоспория на растение, посаженное в загрязненную почву, или семя растения для посадки в загрязненную почву, или на область загрязненной почвы, окружающую растение или семя растения. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания выше и содержат слитый белок. Слитый белок содержит фермент рекультивации.
[00865] Предусматривается другой способ фиторекультивации загрязненной почвы. Способ включает внесение спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus в загрязненную почву. Альтернативно способ включает нанесение спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растение, посаженное в загрязненную почву, или семя растения для посадки в загрязненную почву, или на область загрязненной почвы, окружающую растение или семя растения. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, как описано выше в разделе II, и слитый белок включает фермент рекультивации.
[00866] В способах фиторекультивации загрязненной почвы, которые вовлекают применение фрагментов экзоспория или рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, как описано выше в разделе II, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящем описании. В частности, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут включать любую из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных выше в абзацах [00782]-[00801].
[00867] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора споруляции, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория слитого белка или его части и/или под контролем промотора споруляции с высокой экспрессией. Промотор может представлять собой любой из промоторов, описанных выше в разделе III.
[00868] Фермент рекультивации экспонируется на наружной области спор и в растении, так что как растение, так и споры, могут конвертировать загрязнитель-мишень. Растение может захватывать загрязнитель-мишень, в то время как споры конвертируют загрязнитель в нетоксичную или менее токсичную форму в растении или корневой системе.
[00869] Споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus могут включать эндофитный штамм бактерий, такой как представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, или Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или Bacillus mycoides EE-B00363.
[00870] Споры или фрагменты экзоспория можно наносить на растение или семя растения, и растение или растение, выращенное из семени растения, является толерантным к загрязнителю-мишени, подлежащему устранению из загрязненной почвы.
[00871] В способе фиторекультивации рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus претерпевают споруляцию в растении.
[00872] Споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus можно вносить в среду для роста растений различными способами, такими как орошение почвы во время посева. Также споры можно наносить на семя растения посредством обработки семени.
[00873] Предпочтительно, растение, подлежащее обработке ферментом рекультивации, является толерантным к загрязнителю-мишени, так что растение не повреждается загрязнителем-мишенью.
[00874] Концентрация рекомбинантных спор, требуемая для способа фиторекультивации, основана на факторах, включающих объем или площадь, подлежащие обработке, способность эндофитных штаммов колонизировать корни растений, степень, в которой присутствует загрязнитель-мишень, и количество активного фермента на поверхности спор.
[00875] Предусматривается другой способ уменьшения количества примесей в окружающей среде. Способ включает воздействие на загрязненную среду спор штамма представителя семейства Bacillus cereus, который способен деградировать гербицид или пестицид. Загрязнители в окружающей среде включают гербицид, пестицид или их комбинацию. Штамм представителя семейства Bacillus cereus, который способен деградировать гербицид или пестицид, включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121) или их комбинацию.
[00876] Штамм представителя семейства Bacillus cereus, который способен деградировать гербицид или пестицид, может включать рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Представляющий интерес белок или пептид предпочтительно включает деградирующий гербицид фермент, деградирующий пестицид фермент или их комбинацию.
[00877] Таким образом, можно достигать двойной деградирующей пестицид или гербицид активности, поскольку как штаммы представителей семейства Bacillus cereus, так и деградирующие гербицид или деградирующие пестицид ферменты в слитом белке демонстрируют активность деградации пестицида и/или гербицида. Гербициды и/или пестициды, которые деградируются штаммом семейства Bacillus cereus, который способен деградировать гербицид или пестицид, могут быть такими же или могут отличаться от гербицидов и/или пестицидов, которые деградируются деградирующим гербицид ферментом или деградирующим пестицид ферментом. Таким образом, когда окружающая среда загрязнена одним типом гербицида или пестицида, можно достигать двойного деградирующего действия против этого одного гербицида или пестицида. Альтернативно, когда окружающая среда загрязнена более чем одним типом гербицида или пестицида, можно достигать двойного деградирующего действия против двух или более различных гербицидов или пестицидов.
[00878] В способах уменьшения количества примесей, вовлекающих применение одного из штаммов представителей семейства Bacillus cereus, описанных в настоящем описании, которые способны деградировать гербицид или пестицид, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут содержать любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящем описании. В частности, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут включать любую из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных выше в абзацах [00782]-[00801].
XXIV. Разрушение эмульсий или гелей в жидкости гидроразрыва пласта
[00879] Предусматривается способ обработки жидкости гидроразрыва пласта для разрушения эмульсии или геля в жидкости. Способ включает добавление спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus в жидкость гидроразрыва пласта. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Такой слитый белок описан выше, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля.
[00880] Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus может включать любой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, описанный в настоящем описании, который экспрессирует слитый белок.
[00881] Предусматривается другой способ обработки жидкости гидроразрыва пласта для разрушения эмульсии или геля в жидкости. Способ включает добавление фрагментов экзоспория в жидкость гидроразрыва пласта. Фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания выше, и содержат слитый белок. Слитый белок содержит фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля.
[00882] Фермент выбирают, исходя из целевой эмульсии или геля, подлежащих обработке, и pH жидкости гидроразрыва пласта. Ферменты включают, но не ограничиваются ими, гемицеллюлазу, амилазу, пектиназу, гидролиазу углеводов, целлюлазу, агаразу, полигалактуроназу, эндоглюканазу или их комбинацию.
[00883] Эмульсия или гель содержит полимер или другой компонент, который фермент может расщепить. Эмульсия или гель может содержать полимер, аравийскую камедь, агар, ксантановую смолу, целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлозу, гидроксиэтилметилцеллюлозу, гуар, производное гуара или их комбинацию.
[00884] Когда представляющий интерес белок или пептид представляет собой фермент для разрушения эмульсии или геля, для экспрессии слитого белка можно использовать любой представитель семейства Bacillus cereus. Предпочтительными являются Bacillus thuringiensis или Bacillus mycoides.
[00885] Споры или фрагменты экзоспория можно инжектировать в скважину, которая находится в контакте с подземным содержащим углеводороды пластом, таким как песчаный продуктивный пласт или карбонатный продуктивный пласт.
[00886] Требуемая концентрация спор или фрагментов экзоспория основана на факторах, включающих размер скважины, подлежащей обработке, тип эмульсии или геля, количество активного фермента на поверхности спор или фрагментов экзоспория, и присутствие и концентрацию адъювантов, доставляемых ферментами.
[00887] Ферменты могут расщеплять полимеры или другие компоненты в эмульсии или геле или могут растворять такие компоненты, так что жидкость гидроразрыва пласта может выкачиваться из скважины.
[00888] В способах обработки жидкости гидроразрыва пласта для разрушения эмульсии или геля в жидкости можно использовать любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных выше. В частности, нацеливающая последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория могут включать любую из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных выше в абзацах [00759]-[00778].
[00889] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора споруляции, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория в слитом белке или его части, и/или под контролем промотора споруляции с высокой экспрессией. Промотор может представлять собой любой из промоторов, описанных выше в разделе III.
XXV. Переработка сырья
[00890] Сырье получают из растений, которые собирают для их биомассы, и обрабатывают в корм (осушение, силосование, экструзия, пеллетирование и т.д.). Растительную биомассу, которая составляет сырье, часто трудно расщепить вследствие волокнистой природы материала. Присутствие ферментов может значительно облегчить деградацию этого волокнистого материала, что приводит к более поддающемуся расщеплению и легче перерабатываемому материалу. Традиционно ферменты добавляют после переработки сырья и при доставке в организм, который употребляет сырье. Ферменты, доставляемые в сырье, могут улучшить здоровье и набор массы целевых животных, а также снизить влияние на окружающую среду продуктов жизнедеятельности животных, которых кормят таким дополненным ферментами кормом.
[00891] Эти же системы можно использовать для предварительной обработки сырья, предназначенного для продукции биотоплива, включая переработку в биоэтанол, биодизель или другие биотоплива.
[00892] Многие виды спор обладают способностью персистировать на надземных поверхностях растений, таких как листья, стебли и плоды, в течение длительного периода времени. С использованием технологий дисплея на спорах, как описано в настоящем описании, для экспонирования ферментов на этих спорах, в сырье доставляется активный фермент, который будет присутствовать, когда сырье собирают. Эти целевые ферменты также можно доставлять в сырьевое растение при посеве, либо посредством доставки рекомбинантных спор на семена растений, либо посредством доставки рекомбинантных спор в среду для роста растений или в область вокруг растения.
[00893] Предусматривается способ доставки ферментов в растение. Способ включает внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, который экпрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, как описано в настоящем описании; или нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus. Представляющий интерес белок или пептид включает фермент. Фермент может быть физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00894] Предусматривается другой способ доставки ферментов в растение. Способ включает внесение в среду для роста растений рекомбинантной спорообразующей бактерии или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию; или нанесение на растение, семя растения область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантной спорообразующей бактерии или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию. Рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии. Белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок CotG, белок оболочки споры X или белок CotY. Рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий. Представляющий интерес белок или пептид включает фермент, и фермент физически связан с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[00895] Предусматривается другой способ доставки ферментов в растение. Способ включает внесение фрагментов экзоспория или состава, содержащего фрагменты экзоспория, в среду для роста растений; или нанесение фрагментов экзоспория или состава, содержащего фрагменты экзоспория, на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания выше, и содержат слитый белок. Представляющий интерес белок или пептид включает фермент.
[00896] Когда способ доставки ферментов в растение включает применение фрагментов экзоспория, способ, кроме того, может включать обработку растения усиливающим проникновение веществом, поверхностно-активным веществом, детергентом, маслом или их комбинацией.
[00897] Оптимальные штаммы бактерий для этих способов включают, но не ограничиваются ими, представители семейства Bacillus cereus, включая Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis и Bacillus pseudomycoides, а также другие спорообразующие Bacillus, включая Bacillus megaterium, Bacillus firmus, Bacillus flexus, представители клада Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis и Bacilllus subtilis.
[00898] Нанесение можно проводить непосредственно на растительный материал, необязательно совместно с адъювантами, такими как неионные или другие поверхностно-активные вещества. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus можно наносить на надземную часть растения перед сбором, например, путем распыления на надземную часть растения.
[00899] Нанесение на семя растения обычно проводят в форме жидкости для погружения семян, взвеси или покрытия для семян на полимерной основе. Необязательно, нанесение можно проводить совместно с наносимыми на семена инокулятами, фунгицидами, инсектицидами или нематоцидами.
[00900] Внесение в среду для роста растений или нанесение на область вокруг растения можно проводить перед посевом, при посеве или после посева семян, необязательно совместно с удобрениями, фунгицидами, гербицидами или инсектицидами.
[00901] Фермент является пригодным для деградации биомассы, расщепления целлюлозного материала, облегчения переваривания в пищеварительной системе целевого животного, которого можно кормить растением, или для продукции биотоплива (например, для продукции биоэтанола или биодизеля).
[00902] Фермент включает, но не ограничивается ими, неспецифическую протеазу, металлопротеиназу, целлюлазу, ксиланазу, фосфатазу, эндоглюканазу, экзоглюканазу, β-глюкозидазу, амилазу, пектиназу, ксилозидазу, липазу, фосфолипазу или их комбинацию.
[00903] Выбор фермента может зависеть от сырья и предполагаемого использования сырья. Предпочтительно ферменты представляют собой деградирующие ферменты.
[00904] Представляющие интерес ферменты семейства протеаз включают неспецифические протеазы, такие как сериновые протеазы, гистидиновые протеазы, аспартатные протеазы, а также металлопротеазы.
[00905] Представляющие интерес ферменты семейства целлюлаз включают экзоглюканазы, эндоглюканазы, β-1,3-глюкозидазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, a-глюкозидазы.
[00906] Представляющие интерес ферменты семейства ксиланаз включают ксилозидазы, эндоксиланазы, экзоксиланазы, пектиназы, метилпектиназы, полигалактуроназу.
[00907] Представляющие интерес ферменты-фосфатазы включают кислые фосфатазы, щелочные фосфатазы, полифосфатазы, фитазы, монофосфатазы и дифосфатазы.
[00908] Многие из этих ферментов также полезны для роста растений.
[00909] Эти ферменты могут не только "предварительно расщеплять" часть сырья для увеличения всасывания ключевых питательных веществ целевым животным, которого кормят сырьем, но также способствуют пищеварению в пищеварительной системе целевого животного.
[00910] "Предварительное расщепление" целлюлозного материала при сборе может высвобождать свободную целлюлозу в ходе переработки для продукции биоэтанола и биотоплива, а также предварительной обработки масел, предназначенных для продукции биотоплива.
[00911] Бактерия может представлять собой эндофитную бактерию. Выбор эндофитных рекомбинантных бактерий позволяет бактериям входить в растение, а также колонизировать и расти внутри тканей растения. Это приведет к установлению растущего количества рекомбинантных спорообразующих организмов внутри растения по мере того, как оно растет после нанесения относительно небольшого количества рекомбинантных спор на семена или применения с семенами при посадке. При сборе материала растительной биомассы, бактерии будут претерпевать споруляцию, создавая новые ферменты в растениях, которые будут активными на сырье, когда его собирают, транспортируют и используют, например, либо в качестве корма для животных, либо для продукции биотоплива. Это может значительно снизить производственную стоимость деградирующих ферментов по сравнению с существующими технологиями. Это является уникальным способом доставки расщепляющих ферментов в биомассу перед промышленной переработкой.
[00912] Хотя оптимальные бактериальные штаммы являются такими, как описано выше, выбор эндофитных штаммов будет увеличивать эффективность. Предпочтительно, эндофитные бактерии включают представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus 439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus sphaericus EE443 или их комбинацию.
[00913] Растение может представлять собой культуру, выбранную из кукурузы, люцерны, пшеницы, пастбищной культуры, фуражной культуры, сои, проса, хикамы, сорго сахарного, сахарного тростника или их комбинации, и другого сырья биотоплива и биоэтанола.
[00914] Для способов доставки ферментов в растение можно использовать любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящем описании.
XXVI. Применение спор для изменения свойств растений-мишеней
[00915] Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus и рекомбинантные спорообразующие бактерии, как описано в настоящем описании, позволяют взаимодействие экспонированных на поверхности сигнальных молекул, влияющих на биохимические каскады, и ряда других белков, которые полезны для здоровья растений. Присутствие экспонированных на спорах белков или пептидов может приводить к изменению метаболизма растения-мишени, что приводит к изменению состава растения, его плодов или других свойств или характеристик.
[00916] Экспрессию слитых белков можно прямо использовать для изменения состава растения-мишени. Выбор различных ферментов приводит к различным эффектам на растение-мишень.
[00917] Предусматривается способ изменения свойства растения. Способ включает внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, как описано в настоящем описании; или нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus. Представляющий интерес белок или пептид включает сигнальную молекулу растения или фермент, который влияет на состав растения, и представляющий интерес белок или пептид может быть физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[00918] Предусматривается другой способ изменения свойств растения. Способ включает внесение в среду для роста растений рекомбинантной спорообразующей бактерии или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию; или нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантной спорообразующей бактерии или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию. Рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии. Белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок CotG, белок оболочки споры X или белок CotY. Рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий. Представляющий интерес белок или пептид включает сигнальную молекулу растений или фермент, который влияет на состав растений, и представляющий интерес белок или пептид может быть физически связан с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[00919] Предусматривается другой способ изменения свойств растения. Способ включает внесение фрагментов экзоспория или состава, содержащего фрагменты экзоспория, в среду для роста растений; или нанесение фрагментов экзоспория или состава, содержащего фрагменты экзоспория, на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения. Фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания выше, и содержат слитый белок. Представляющий интерес белок или пептид включает сигнальную молекулу растений или фермент, который влияет на состав растения.
[00920] Когда способ изменения свойства растения включает применение фрагментов экзоспория, способ, кроме того, может включать обработку растения усиливающим проникновение веществом, поверхностно-активным веществом, детергентом, маслом или их комбинацией.
[00921] Бактерия-мишень предпочтительно выживает или активно растет в окружающей среде и на корнях растения-мишени. Оптимальные штаммы бактерий для этих способов включают, но не ограничиваются ими, представитель семейства Bacillus cereus EE349, представитель семейства Bacillus cereus 439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442 или Lysinibacillus sphaericus EE443.
[00922] Сигнальные молекулы растений или ферменты также можно доставлять в растение при посеве либо посредством доставки рекомбинантных спор на семена растений, либо посредством доставки рекомбинантных спор в среду для роста растений или в область, окружающую растение.
[00923] Нанесение можно проводить непосредственно на растительный материал, необязательно совместно с адъювантами, такими как неионные или другие поверхностно-активные вещества. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию, или фрагменты экзоспория можно наносить на надземную часть растения перед сбором, например, путем распыления на надземную часть растения.
[00924] Нанесение на семя растения обычно проводят в форме жидкости для погружения семян, взвеси или покрытия для семян на полимерной основе. Необязательно, нанесение можно проводить совместно с наносимыми на семена инокулятами, фунгицидами, инсектицидами или нематоцидами.
[00925] Внесение в среду для роста растений или нанесение на область вокруг растения можно проводить перед посевом, при посеве или после посева семян, необязательно совместно с удобрениями, фунгицидами, гербицидами или инсектицидами.
[00926] Фермент включает, но не ограничивается ими, эндоглюканазы, протеазы, фосфолипазы, аминокарбокси-1-пропандезаминазу, дезаминазы аминоциклопропан-1-карбоновых кислот, липазы или их комбинацию.
[00927] Сигнальные молекулы растений включают, но не ограничиваются ими, flg22 и пептиды флагеллина, криптогеин, гарпины, гарпин-подобные белки, ферменты, которые деградируют или модифицируют источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, или их комбинацию.
[00928] Ферменты или сигнальные молекулы растений могут вызывать желаемые метаболические изменения в растении-хозяине, включая увеличение захвата макронутриентов и микронутриентов или изменение состава тканей растений путем увеличения корневых систем, увеличения содержания белков в растениях, таких как зерновые, злаковые и плодовые растения, путем модификации метаболизма и увеличения захвата азота, и модификации содержания масла в рапсе, каноле, сое и подсолнечнике, содержания сахара (сахарозы) в винограде, сахарном тростнике, просе, сорго сахарном и другом сырье биотоплива, содержания медицинских соединений и содержания каннабиноидов в марихуане. Эти изменения не только повышают ценность представляющих интерес растений, но также увеличивают пригодность этих растений в различных областях промышленности, таких как получение биотоплива, продукция сахара и продукция сырья.
[00929] Для способов изменения свойства растения можно использовать любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных выше.
XXVII. Дезинфекция
[00930] Предусматривается способ дезинфекции поверхности. Способ включает воздействие на поверхность рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, как описано выше в абзацах [00170]-[00173] и [00177] раздела I, где представляющий интерес белок или пептид включает антибактериальный белок или пептид.
[00931] Предусматривается другой способ дезинфекции поверхности. Способ включает воздействие на поверхность фрагментов экзоспория. Фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания выше, и содержат слитый белок. Слитый белок содержит антибактериальный белок или пептид.
[00932] Предусматривается другой способ дезинфекции поверхности. Способ включает воздействие на поверхность рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, как описано выше разделе II.
[00933] В способах дезинфекции поверхности, которые включают воздействие на поверхность фрагментов экзоспория или рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, как описано выше в разделе II, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут представлять собой любую из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящем описании. В частности, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут включать любую из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных выше в абзацах [00759]-[00778].
[00934] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора споруляции, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория слитого белка или его части и/или под контролем промотора споруляции с высокой экспрессией. Промотор может представлять собой любой из промоторов, описанных выше в разделе III.
[00935] Антибактериальный белок или пептид минимизирует или предупреждает формирование на поверхности или связывание с поверхностью вирусных агентов, бактерий, амеб, паразитов или плесени.
[00936] Антибактериальный белок или пептид включает, но не ограничивается ими, протеазы, нуклеазы, противомикробные пептиды, LysM, LfcinB, лизостафин, альбумин, дефензины, бактериоцины, липопептиды, пептиды врожденной иммунной системы, лизоцим, литиказу или их комбинацию.
[00937] Споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus можно использовать совместно с другими противомикробными средствами, включая дезинфицирующие средства, очищающие средства, антибиотики, противогрибковые средства и противовирусные средства.
[00938] Хотя для экспрессии слитых белков можно использовать любые из представителей семейства Bacillus cereus, предпочтительными являются либо Bacillus thuringiensis, либо Bacillus mycoides.
[00939] Для этих способов можно использовать любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящем описании.
[00940]
XXVIII. Другие применения
[00941] Слитые белки, где представляющий интерес белок или пептид представляет собой фермент, или рекомбинантный представитель Bacillus cereus, где представляющий интерес белок или пептид представляет собой фермент, можно использовать для обработки или дегуммирования смазки, масла или жира; переработки шкур в кожу; получения биотоплива, биодизеля или биоэтанола; переработки или конверсии сахаров; обработки крахмала; переработки бумаги или льна; обработки побочных продуктов животных или грибов или выделения аминокислот; направленного расщепления технических отходов; добавок в пищу и корма; диетических добавок; кормов для животных; промышленной очистки; переработки зерна; косметического производства; дезодорации; переработки продуктов питания или напитков; оптимизации пивоварения или добавок для пивоварения; детергентных добавок или переработки тканей или пряжи.
[00942] Посредством экспонирования фермента на наружной стороне споры или на фрагментах экзоспория, фермент может быть стабилизирован, иммобилизован или подвергнут повторному применению.
[00943] Промышленные процессы, как правило, вовлекают жесткие условия, включающие высокие температуры, присутствие растворителей и большие количества органического материала. Эти условия препятствуют традиционным ферментам. Экспрессия фермента-мишени на поверхности спор или фрагментов экзоспория обеспечивает устойчивость к высоким температурам и жестким условиям и позволяет повторное выделение и повторное использование ферментов.
[00944] Ключевые представляющие интерес ферменты для таких применений включают: β-лактамазы, протеазы, липазы, фосфолипазы, целлюлазы, эндоглюканазы, экзоглюканазы, пектиназы, лигниназы, амилазы (например, α-амилазы, β-амилазы или глюкоамилазы), полигалактуроназы, глюкозидазы, галактозидазы, гидролазы углеводов, гидролазы клеточной стенки, нуклеазы, гемицеллюлазы, ксиланазы, манназы, лакказы, лактазы, эстеразы (например, пектинметилэстеразы), фитазы, фосфатазы, инвертазы, глюкозаоксидазы, каталазы, литиказы, ацетолактатдекарбоксилазы и уреазы.
[00945] Предпочтительные ферменты для обработки или дегуммирования смазки, масла или жира, или для косметического производства включают липазы, фосфолипазы, эстеразы и протеазы.
[00946] Предпочтительные ферменты для переработки шкур в кожу включают липазы, протеазы, пептидазы, коллагеназы и фосфолипазы.
[00947] Предпочтительные ферменты получения биотоплива, биодизеля или биоэтанола могут включать, но не ограничиваются ими, липазы и эстеразы.
[00948] Предпочтительные ферменты для переработки или конверсии сахаров, для переработки зерна и для переработки текстиля и пряжи включают гидролазы углеводов, амилазы, манназы, глюкоамилазы, инвертазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы, пектинметилэстеразы, ксиланазы, эндоглюканазы, экзоглюканазы, глюкозидазы, галактозидазы, лакказы, лактазы, каталазы и глюкозаоксидазы.
[00949] Предпочтительные ферменты для обработки крахмала включают амилазы и глюкоамилазы.
[00950] Предпочтительные ферменты для переработки бумаги и льна включают целлюлазы, гемицеллюлазы, ксиланазы, эндоглюканазы, лакказы, лигниназы, экзоглюканазы, фитазы, каталазы и глюкозидазы.
[00951] Предпочтительные ферменты для обработки побочных продуктов животных или грибов или выделения аминокислот включают протеазы, пептидазы, липазы, литиказы, гидролазы клеточной стенки, фосфолипазы, эндоглюканазы, целлюлазы, глюканазы и гидролазы углеводов.
[00952] Предпочтительные ферменты для направленного расщепления технических отходов, промышленной очистки, детергентных добавок и дезодорации включают липазы, фосфолипазы, протеазы, пептидазы, амилазы, литиказы, гидролазы клеточной стенки, глюкоамилазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, ксиланазы, эстеразы, глюкозидазы, галактозидазы, лакказы, лактазы, уреазы, фосфатазы и гидролазы углеводов.
[00953] Предпочтительные ферменты добавок в пищу и корма, диетических добавок, кормов для животных, добавок для пивоварения, добавок в напитки или переработки вина включают манназы, лакказы, литиказы, протеазы, пептидазы, гидролазы углеводов, пектиназы, пектинметилэстеразы, эстеразы, липазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, ксиланазы, фитазы, фосфатазы, инвертазы, глюкозидазы, галактозидазы, лактазы, каталазы, глюканазы, эндоглюканазы, ацетолактатдекарбоксилазу и глюкозаоксидазы.
[00954] Хотя для экспрессии слитых белков для этих применений можно использовать любой из представителей семейства Bacillus cereus, предпочтительными являются либо Bacillus thuringiensis, либо Bacillus mycoides.
[00955] Предусматривается применение слитых белков, содержащих фермент в качестве представляющего интерес белка или пептида, или рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего слитый белок, содержащий фермент в качестве представляющего интерес белка или пептида. Слитый белок может представлять собой любой из слитых белков, описанных выше в абзацах [00169]-[00173], [00175] и [00177] раздела I. Применение может представлять собой применение для обработки или дегуммирования смазки, масла или жира; переработки шкур в кожу; получения биотоплива, биодизеля или биоэтанола; переработки или конверсии сахаров; обработки крахмала; переработки бумаги или льна; обработки побочных продуктов животных или грибов или выделения аминокислот; направленного расщепления технических отходов; добавок в пищу и корма; диетических добавок; кормов для животных; промышленной очистки; переработки зерна; косметического производства; дезодорации; переработки продуктов питания или напитков; оптимизации пивоварения или добавок для пивоварения; детергентных добавок или переработки тканей или пряжи.
[00956] Также предусматривается применение фрагментов экзоспория. Применение может представлять собой применение для обработки или дегуммирования смазки, масла или жира; переработки шкур в кожу; получения биотоплива, биодизеля или биоэтанола; переработки или конверсии сахаров; обработки крахмала; переработки бумаги или льна; обработки побочных продуктов животных или грибов или выделения аминокислот; направленного расщепления технических отходов; добавок в пищу и корма; диетических добавок; кормов для животных; промышленной очистки; переработки зерна; косметического производства; дезодорации; переработки продуктов питания или напитков; оптимизации пивоварения или добавок для пивоварения; детергентных добавок или переработки тканей или пряжи. Фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, описанного в разделе IV настоящего описания выше, и содержат слитый белок. Слитый белок содержит фермент.
[00957] Кроме того, предусматривается применение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, как описано выше в разделе II. Применение может представлять собой применение для обработки или дегуммирования смазки, масла или жира; переработки шкур в кожу; получения биотоплива, биодизеля или биоэтанола; переработки или конверсии сахаров; обработки крахмала; переработки бумаги или льна; обработки побочных продуктов животных или грибов или выделения аминокислот; направленного расщепления технических отходов; добавок в пищу и корма; диетических добавок; кормов для животных; промышленной очистки; переработки зерна; косметического производства; дезодорации; переработки продуктов питания или напитков; оптимизации пивоварения или добавок для пивоварения; детергентных добавок или переработки тканей или пряжи.
[00958] В применениях фрагментов экзоспория или рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, как описано выше в разделе II, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут представлять собой любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных в настоящем описании. В частности, нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория могут включать любые из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория или фрагментов белков экзоспория, описанных выше в абзацах [00759]-[00778].
[00959] Слитый белок можно экспрессировать под контролем промотора споруляции, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория слитого белка или его части, и/или под контролем промотора споруляции с высокой экспрессией. Промотор может представлять собой любой из промоторов, описанных выше в разделе III.
[00960] После подробного описания изобретения будет очевидно, что возможны модификации и варьирование без отклонения от объема изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.
ПРИМЕРЫ
[00961] Следующие неограничивающие примеры предоставлены для дальнейшей иллюстрации настоящего изобретения.
Пример 1. Применение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспонирующего липазу или эндоглюканазу, для стимуляции роста растений сои
[00962] Гены липазы и эндоглюканазы Bacillus subtilis амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием следующих праймеров, показанных в таблице 16:
ТАБЛИЦА 16
[00963] Для создания слитых конструкций гены подвергали слиянию с нативным промотором bclA из ДНК Bacillus thuringiensis, кодирующей первые 35 аминокислот BclA (аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1), с использованием способа сплайсинга посредством перекрывающегося удлинения (SOE). Правильные ампликоны клонировали в челночный вектор E. coli/Bacillus pHP13, и правильные клоны подвергали скринингу посредством секвенирования ДНК. Правильные клоны вводили посредством электропорации в Bacillus thuringiensis (Cry-, плазмида-) и подвергали скринингу в отношении резистентности к хлорамфениколу. Правильные трансформанты выращивали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой в течение ночи при 30°C, высевали на чашки с питательным агаром, и инкубировали при 30°C в течение 3 суток. Споры, экспрессирующие слитую конструкцию (споры BEMD) собирали с чашек посредством промывания в фосфатно-солевом буфере (PBS) и очищали центрифугированием и дополнительными промываниями в PBS. Нетрансформированные контрольные споры Bacillus thuringiensis (B.t.) получали идентичным образом.
[00964] Сою (линия Jake 011-28-04) высевали на глубину 2,54 см в горшки глубиной 10 см, заполненные стандартной глинистой почвой верхнего слоя. Споры разбавляли до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и наносили на каждое семя при посеве. Растения выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватт, и их подвергали воздействию света в течение 11 часов в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток на протяжении испытания в течение двух недель. В конце двух недель измеряли высоту каждого растения и результаты измерений нормализовывали к результатам для контрольных спор Bacillus thuringiensis. Проводили два независимых испытания.
[00965] Результаты представлены в таблице 17 вместе со стандартной ошибкой среднего значения. В обоих испытаниях растения сои, выращенные в присутствии спор BEMD, экспонирующих либо липазу, либо эндоглюканазу, вырастали значимо более высокими, чем растения сои, обработанные контрольными спорами B.t. (статистический анализ проводили с использованием t-критерия).
ТАБЛИЦА 17
Пример 2. Применение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспонирующего эндоглюканазу, для стимуляции роста растений кукурузы.
[00966] Споры BEMD, экспрессирующие эндоглюканазу, получали идентично тому, как описано в примере 1. Полевую кукурузу высевали на глубину 3,8 см в горшки глубиной 10 см, заполненные стандартной глинистой почвой верхнего слоя. Контрольные споры и споры BEMD, экспрессирующие эндоглюканазу, разбавляли до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и наносили на каждое растение при посеве. Также включали контроль, содержавший только воду. Растения выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватт, и их подвергали воздействию света в течение 11 часов в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток на протяжении испытания в течение одной недели. В конце одной недели измеряли рост каждого растения, и результаты измерений нормализовывали к результатам для контрольных спор Bacillus thuringiensis.
[00967] Результаты представлены в таблице 18 вместе со стандартной ошибкой среднего значения. Растения кукурузы, выросшие в присутствии спор BEMD, экспонирующих эндоглюканазу, вырастали значительно более высокими, чем как растения сои, обработанные контрольными спорами B.t., так и контрольные растения, обработанные только водой (статистический анализ проводили с использованием t-критерия).
ТАБЛИЦА 18
Пример 3. Применение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспонирующего эндоглюканазу или протеазу, для стимуляции роста растений пшеницы.
[00968] Споры BEMD, экспрессирующие эндоглюканазу, получали идентично тому, как описано в примере 1. Споры BEMD, экспрессирующие протеазу PtrB E. coli, получали с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1, и следующих праймеров: ggatccatgctaccaaaagcc (прямой, SEQ ID NO: 41) и ggatccttagtccgcaggcgtagc (обратный, SEQ ID NO: 42).
[00969] Зимнюю твердую пшеницу высевали на глубину 2,54 см в горшки глубиной 10 см, заполненные стандартной глинистой почвой верхнего слоя. Контрольные споры и споры BEMD, экспрессирующие эндоглюканазу или протеазу, разбавляли до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и наносили на каждое растение при посеве. Также включали контроль, содержавший только воду. Растения выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватт, и их подвергали воздействию света в течение 11 часов в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток на протяжении испытания в течение одной недели. В конце одной недели измеряли рост каждого растения, и результаты измерения нормализовывали к результатам для контрольных растений, обработанных только водой.
[00970] Результаты представлены в таблице 19 вместе со стандартной ошибкой среднего значения. Растения пшеницы, выросшие в присутствии спор BEMD, экспонирующих эндоглюканазу или протеазу, вырастали значительно более высокими, чем растения сои, обработанные контрольными спорами B.t. или контрольные растения, обработанные только водой (статистический анализ проводили с использованием t-критерия).
ТАБЛИЦА 19
Пример 4. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих эндоглюканазу, для стимуляции роста растений плевела
[00971] Споры BEMD, экспрессирующие эндоглюканазу, получали идентично тому, как описано в примере 1. Плевел многолетний высевали на глубину 6,4 мм в горшки глубиной 10 см, заполненные стандартной глинистой почвой верхнего слоя. Контрольные споры и споры BEMD, экспрессирующие эндоглюканазу, разбавляли до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и наносили на каждое растение при посеве. Также включали контроль, содержавший только воду. Растения выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватт, и их подвергали воздействию света в течение 11 часов в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток на протяжении испытания в течение двух недель. В конце двух недель измеряли рост каждого растения, и результаты измерения нормализовывали к результатам для контрольных растений, обработанных только водой.
[00972] Результаты представлены в таблице 20 вместе со стандартной ошибкой среднего значения. Растения плевела, выросшие в присутствии спор BEMD, экспонирующих эндоцеллюлазу, вырастали значительно более высокими, чем растения плевела, обработанные контрольными спорами B.t. или контрольные растения, обработанные только водой (статистический анализ проводили с использованием t-критерия).
ТАБЛИЦА 20
Пример 5. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих ферменты, вовлеченные в синтез или активацию гормонов растений, для стимуляции роста растений
[00973] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования ферментов, вовлеченных в синтез гормонов растений. Например, гормон растений индол-3-уксусная кислота является мощным стимулятором роста растений. Индол-3-уксусная кислота синтезируется in vivo из триптофана ферментами триптофанмонооксигеназой и индол-3-ацетамидгидролазой. Индол-3-уксусная кислота и другие ауксиновые гормоны также могут синтезироваться in vivo из триптофана и/или индола с помощью ферментов нитрилазы, триптофанаминотрансферазы, индол-3-ацетальдегиддегидрогеназы, индол-3-пируватдекарбоксилазы, оксидазы аминов, триптофандекарбоксилазы и оксидаз боковых цепей триптофана.
[00974] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования ферментов, вовлеченных в модификацию гормонов роста растений в биологически активные или неактивные формы. Например, нитрилазу можно экспрессировать на системе BEMD для катализа конверсии индол-3-ацетонитрила в биологически активную индол-3-уксусную кислоту. Кроме того, в среду для роста растений с экспрессируемыой BEMD нитрилазой можно добавлять неактивные формы гормонов растений, такие как индол-3-ацетонитрил, для обеспечения постепенного высвобождения активного гормона в среду для роста растений. С использованием соответствующих ферментов можно модифицировать многие другие неактивные или менее активные формы гормонов растений.
[00975] Соответствующие гормоны роста растений (ауксины) включают индол-3-пировиноградную кислоту, индол-3-ацетальдоксим, индол-3-ацетамид, индол-3-ацетонитрил, индол-3-этанол, индол-3-пируват, индол-3-масляную кислоту, фенилуксусные кислоты, 4-хлориндол-3-уксусную кислоту и индол-3-ацетальдоксим. Эти гормоны синтезируются из триптофана и/или индола in vivo с помощью ферментов триптофанмонооксигеназы, индол-3-ацетамидгидролазы, нитрилазы, нитрилгидролазы, ацетолактатсинтетазы, альфа-ацетолактатдекарбоксилазы, триптофанаминотрансферазы, индол-3-ацетальдегиддегидрогеназы, индол-3-пируватдекарбоксилазы, оксидазы аминов, триптофандекарбоксилазы и оксидаз боковых цепей триптофана.
[00976] Также с помощью ферментов, экспрессируемых в системе BEMD, можно синтезировать гормоны роста семейства цитокинов. Примеры цитокинов включают кинетин, зеатин (цис и транс), 6-бензиламинопурин, дигидроксизеатин, N6-(D2-изопентенил)аденин, рибозилзеатин, N6-(D2-изопентенил)аденозин, 2-метилтио-цис-рибозилзеатин, цис-рибозилзеатин, рибозилзеатин-5-монофосфат, N6-метиламинопурин, N6-диметиламинопурин, 2ʹ-дезоксизеатинрибозид, 4-гидрокси-3-метил-транс-2-бутениламинопурин, орто-тополин, мета-тополин, бензиладенин, опрто-метилтополин и мета-метилтополин. Эти соединения, стимулирующие рост растений, синтезируются in vivo из мевалоната или аденозинмоно/ди/трифосфата с помощью ферментов, включающих аденозинфосфатизопентенилтрансферазы, фосфатазы, аденозинкиназы, аденинфосфорибозилтрансферазу, CYP735A, 5ʹ-рибонуклеотидфосфогидролазу, аденозиннуклеозидазы, зеатин-цис-трансизомеразу, зеатин-O-глюкозилтрансферазы, β-глюкозидазы, цис-гидроксилазы, цис-гидроксилазы CK, N-глюкозилтрансферазы CK, 2,5-рибонуклеотидфосфогидролазы, аденозиннуклеозидазы, пуриновые нуклеозидфосфорилазы и зеатинредуктазы.
[00977] С использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1, любой из этих ферментов можно включать в систему BEMD для экспонирования спор BEMD путем создания слитой конструкции, содержащей фермент и нацеливающую последовательность, которая нацеливает экспрессируемый фермент в экзоспорий, когда слитая конструкция экспресируется в представителе семейства Bacillus cereus. Затем рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, экспрессирующий такую конструкцию, можно добавлять в почву или другую среду для роста растений или наносить непосредственно на внекорневую часть растения с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1, для стимуляции роста растений.
[00978] Среду для роста растений можно дополнять предшественниками или субстратами ферментов. Например, среду для роста растений можно дополнять триптофаном, аденозинмонофосфатами, аденозиндифосфатами, аденозинтрифосфатами или индолом. Подходящие концентрации этих субстратов составляют от 100 нМ до 100 мкМ.
Пример 6. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих протеазы или пептидазы, которые расщепляют белки, пептиды, пробелки или препробелки на биологически активные пептиды для стимуляции роста растений
[00979] Протеазы и пептидазы можно экспрессировать в системе BEMD, которая может ферментативно расщеплять доступные белки в среде для роста растений на биологически активные пептиды, которые могут действовать на растение прямо или непрямо. Примеры включают ферментативное расщепление соевой муки, дрожжевого экстракта или другого богатого белком материала, добавляемого в среду для роста растений, на активные пептиды, которые могут прямо стимулировать рост растений. Биологически активные пептиды, полученные ферментативным расщеплением белкового материала, включают RHPP и RKN 16D10, мощные стимуляторы развития корней растений. Кроме того, пробелки или препробелки можно расщеплять на активные формы с помощью экспрессируемых BEMD протеаз и пептидаз на их биологически активные формы. Неактивные пробелки или препробелки можно добавлять в среду для роста растений для облегчения их постепенного расщепления протеазами BEMD и медленного высвобождения биологически активных белков.
[00980] С использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1, любую из этих протеаз или пептидаз можно включать в систему BEMD для экспонирования на спорах BEMD путем создания слитой конструкции, содержащей протеазу или пептидазу и нацеливающую последовательность, которая нацеливает экспрессированный фермент в экзоспорий, когда слитая конструкция экспрессируются в представителе семейства Bacillus cereus. Затем рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, экспрессирующий такую конструкцию, можно добавлять в почву или другую среду для роста растений, дополненную соевой мукой, дрожжевым экстрактом или другим богатым белком материалом для стимуляции роста растений. В подходящем случае, соевую муку, дрожжевой экстракт или другой богатый белком материал добавляют в среду для роста растений в форме жидкой композиции, содержащей от приблизительно 10 мкг/л до приблизительно 100 мг/л белковой муки, дрожжевого экстракта или другого богатого белком материала.
Пример 7. Применение спор BEMD, экспрессирующих протеазу PtrB, для стимуляции роста растений.
[00981] Споры BEMD, экспрессирующие протеазу PtrB E. coli, получали, как описано выше в примере 3. Семена сои высевали на глубину 2,54 см в горшки глубиной 10 см, заполненные стандартной глинистой почвой верхнего слоя. Контрольные споры и споры BEMD, экспрессирующие протеазу, разбавляли до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и наносили на каждое растение при посеве. Также включали контроль, содержавший только воду. Растения выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватт, и их подвергали воздействию света в течение 13 часов в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток на протяжении испытания в течение одной недели. В конце одной недели измеряли рост каждого растения, и результаты измерения нормализовывали к результатам для контрольных растений, обработанных только водой.
[00982] Результаты представлены в таблице 21 вместе со стандартной ошибкой среднего значения в качестве процента от контроля, обработанного только водой. Растения сои, выросшие в присутствии спор BEMD, экспонирующих протеазу, вырастали значительно более высокими, чем растения сои, обработанные контрольными спорами B.t., или контрольные растения, обработанные только водой (статистический анализ проводили с использованием t-критерия). Добавление соевой муки к контрольным растениям, обработанным водой или B. thuringiensis, имело незначительный эффект. Напротив, в присутствии соевой муки и системы BEMD с протеазой, растения сои отвечали в значительной степени относительно всех других обработок.
ТАБЛИЦА 21
Пример 8. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих белки или пептиды, вовлеченные в стимуляцию роста растений
[00983] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования белков или пептидов, которые прямо вовлечены в стимуляцию роста растений. Например, в системе BEMD можно экспрессировать пептидные гормоны растений и негормональные пептиды, которые стимулируют рост растений. Например, негормональные пептиды, которые прямо связывают и активируют рецепторы растений, можно экспрессировать в системе BEMD для непосредственного воздействия на рецепторы в растении и корнях растений-мишеней. Такие пептидные гормоны и негормональные пептиды включают фитосульфокин, calcalva 3 (CLV3), системин, RKN 16D10, Hg-Syv46, eNOD40, белки семейства NOD, ZmlGF, белки и пептиды семейства SCR/SP11, RHPP, POLARIS и KTI. Эти пептиды и родственные пептиды можно экспрессировать в системе BEMD и доставлять в среду для роста растений или непосредственно наносить на внекорневую часть для стимуляции роста растений.
[00984] С использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1, любой из этих белков или пептидов можно включать в систему BEMD для экспонирования на спорах BEMD путем создания слитой конструкции, содержащей фермент и нацеливающую последовательность, которая нацеливает экспрессированный фермент в экзоспорий, когда слитая конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Затем рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, экспрессирующий такую конструкцию, можно добавлять в почву или другую среду для роста растений, или наносить непосредственно на внекорневую часть растения с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1, для стимуляции роста растений.
Пример 9. Применение спор BEMD, экспрессирующих POLARIS или KTI, для стимуляции роста растений
[00985] Споры BEMD, экспрессирующие пептид растений POLARIS и пептид сои KTI, создавали путем синтеза генов, кодирующих пептиды POLARIS или KIT, связанные с нацеливающей последовательностью SEQ ID NO: 96. Затем гены вводили в Bacillus thuringiensis и получали споры, как описано в примере 1. Семена сои высевали на глубину 2,54 см в горшки глубиной 10 см, заполненные стандартной глинистой почвой верхнего слоя. Споры, BEMD, экспрессирующие POLARIS или KTI, разбавляли до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и наносили на каждое растение при посадке. Также включали контроль, обработанный только водой. Чистые пептиды POLARIS и KTI также исследовали в отношении их эффектов на сою в количестве 0,05 мг/горшок. Растения выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватт, и их подвергали воздействию света в течение 13 часов в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток на протяжении испытания в течение двух недель. В конце двух недель измеряли высоту каждого растения, измеряли корни и результаты измерения нормализовывали к результатам для контрольных растений, обработанных только водой.
[00986] Результаты представлены в таблице 22 вместе со стандартной ошибкой среднего значения в качестве процента от результата для контроля, обработанного только водой. Растения сои, выращенные в присутствии спор BEMD, экспонирующих POLARIS, вырастали более высокими и имели небольшое увеличение развития корней, относительно контрольных растений сои, обработанных водой. Присутствие свободного пептида KTI привело к значительному замедлению роста растений с утратой 6-8% их высоты, но увеличению на 15% длины корней. Экспрессия KTI на системе BEMD привела к пользе для роста растений, но без эффекта замедления роста растений. Важно, что присутствие контрольных спор Bacillus thuringiensis со свободным пептидом KTI не препятствовало эффекту KTI в отношении замедления роста, в то время как BEMD с KTI не проявляли такого замедления роста.
ТАБЛИЦА 22
Пример 10. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих ферменты, которые деградируют или модифицируют источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, для стимуляции роста растений и/или утилизации питательных веществ
[00987] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования ферментов, которые деградируют или модифицируют положительным образом источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, находящийся в почве или другой среде для роста растений. Такие ферменты деградируют продукты, присутствующие в почве или другой среде для роста растений, в формы, которые могут легко захватываться растениями, и/или полезными бактериями, и/или грибами ризосферы. Такие ферменты включают, например, глюкозидгидролазы для деградации сложных углеводов, целлюлазы для деградации целлюлозы; липазы для деградации липидов, в том числе масел, жиров и восков; лигниноксидазы для деградации лигнина и гуминовых кислот; протеазы для деградации полипептидов; фосфолипазы для деградации мембраны; амидазы и нитрогеназы для восполнения азота; амилазы для переработки крахмалов; нуклеазы для восполнения нуклеотидов, пектиназы для разрушения пектина, сульфатазы для восполнения серы и ксиланазы для разрушения ксиланов и арабиноксиланов. Полученные продукты, включая простые сахара, аминокислоты, жирные кислоты и другие питательные вещества, будут более доступными для прямого поглощения растениями и/или для стимуляции полезных бактерий и/или грибов к росту и развитию в ризосферах растений.
[00988] Кроме того, ферменты и другие биологические молекулы можно использовать для высвобождения или депонирования фосфата, азота и других ключевых элементарных питательных веществ для поглощения растением из их различных органических и неорганических форм в почве. Например, фосфатазы можно использовать для деградации фосфатов в окружающей среде на пригодные неорганические фосфаты для утилизации растением. Фосфаты могут представлять собой встречающиеся в природе фосфаты, присутствующие в среде для роста растений. Альтернативно или дополнительно, среду для роста растений можно дополнять фосфатами, такими как триметафосфат, распространенная сельскохозяйственная добавка. Примеры пригодных фосфатаз включают гидролазы сложных моноэфиров фосфорной кислоты, фосфомоноэстеразы, гидролазы сложных диэфиров фосфорной кислоты, фосфодиэстеразы, гидролазы сложных моноэфиров трифосфорной кислоты, фосфорилангидридгидролазы, пирофосфатазы, фитазу, триметафосфатазы и трифосфатазы. Например, ферменты триметафосфатаза, трифосфатаза и пирофосфатаза последовательно разрушают триметафосфат до полезного неорганического фосфата.
[00989] Семейство ферментов нитрогеназ конвертирует атомсферный азот (N2) в аммиак, тем самым, конвертируя азот, который в ином случае был бы недоступным для растений, в полезную форму. Пригодные ферменты относятся к семейству нитрогеназ Nif.
[00990] Также в среду для роста растений можно добавлять химическую энергию, такую как аденозин-3-трифосфат, ферродоксин или дополнительные ферменты, которые создают такую энергию в системе BEMD. Они представляют собой кофакторы для нитрогеназ и ограничены в почве. Таким образом, такие кофакторы можно добавлять в почву для усиления реакций, описанных выше.
[00991] Другие добавки, которые можно добавлять в среду для роста растений, включают крахмалы, целлюлозу и производные целлюлозы, пектины, ксиланы и арабиноксиланы, жиры, воски, масла, фитиновые кислоты, лигнины, гуминовые кислоты и другие источники питательных веществ, в отношении которых описанные выше ферменты проявляют активность.
[00992] С использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1, любой из этих ферментов можно включать в систему BEMD для экспонирования на спорах BEMD путем создания слитой конструкции, содержащей фермент и нацеливающую последовательность для нацеливания слитой конструкции в экзоспорий представителя семейства Bacillus cereus. Затем слитую конструкцию можно экспрессировать в представителе семейства Bacillus cereus, и этот рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus можно добавлять в почву или в другую среду для роста растений с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1, для стимуляции роста растений.
Пример 11. Применение спор BEMD, экспрессирующих фосфатазу, для стимуляции роста растений
[00993] Споры BEMD, экспрессирующие фосфатазу A4 (PhoA4) Bacillus subtilis, получали путем синтеза гена, кодирующего PhoA4, связанного с нацеливающей последовательностью SEQ ID NO: 96. Затем этот ген вводили в Bacillus thuringiensis и получали споры, как описано в примере 1. Кукурузу высевали на глубину 2,54 см в горшки глубиной 10 см, заполненные стандартной глинистой почвой верхнего слоя. Споры BEMD, экспрессирующие PhoA4, разбавляли до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и наносили на каждое растение при посеве. Также включали контроль, обработанный только водой. В горшки добавляли полифосфат в жидкой форме в количестве 0,5 мг/горшок. Растения выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватт, и их подвергали воздействию света в течение 13 часов в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток на протяжении испытания в течение двух недель. В конце двух недель высоту каждого растения измеряли и результаты измерений нормализовывали к результатам для контрольных растений, обработанных только водой.
[00994] Результаты представлены в таблице 23. Кукуруза, выращенная в присутствии спор BEMD, экспонирующих PhoA4, демонстрирует усиленный рост, особенно в присутствии добавленного полифосфата. Этот эффект был более высоким, чем эффект полифосфата отдельно.
ТАБЛИЦА 23
Пример 12. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих ферменты, вовлеченные в синтез 2,3-бутандиола или синтез или активацию гибберелловой кислоты, для стимуляции роста растений
[00995] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования ферментов, вовлеченных в синтез стимулирующего рост растений соединения 2,3-бутандиола. In vivo, 2,3-бутандиол синтезируется полезными бактериями и грибами в ризосфере из ацетоина, диацетила, ацетолактата или пирувата ферментами ацетолактатсинтетазой, α-ацетолактаздекарбоксилазой, пируватдекарбоксилазой, диацетилредуктазой, бутандиолдегидрогеназами и ацетоинредуктазой.
[00996] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования ферментов, вовлеченных в синтез или активацию стимулирующего рост растений соединения гибберелловой кислоты. Гибберелловая кислота может продуцироваться из неактивных или менее активных форм под действием ферментов, включая, но не ограничиваясь ими, гидроксиламинредуктазы, 2-оксоглутаратдиоксигеназы, гибберелин-2B/3B-гидролазы, гибберелин-3-оксидазы и гибберелин-20-оксидазы.
[00997] Любые из этих ферментов можно включать в систему BEMD для экспонирования на спорах BEMD с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1. Можно получать слитую конструкцию, которая содержит фермент и нацеливающую последовательность, которая нацеливает фермент в экзоспорий, когда слитая конструкция экспрессируются в представителе семейства Bacillus cereus. Затем слитую конструкцию экспрессируют в представителе семейства Bacillus cereus, и представитель семейства Bacillus cereus добавляют в почву или другую среду для роста растений для стимуляции роста растений.
[00998] Для усиления эффекта ферментов, экспонированных на BEMD, почву можно дополнять субстратами ферментов. Например, почву или другую среду для роста растений можно дополнять ацетоином, который является субстратом для ацетоинредуктазы; пируватом, который является субстратом для пируватдекарбоксилазы; диацетилом, который является субстратом диацетилредуктазы, и/или ацетолактатом, который является субстратом для ацетолактатдекарбоксилазы. Альтернативно или дополнительно, почву или другую среду для роста растений можно дополнять менее сильнодействующими или неактивными формами гибберелловой кислоты, которая конвертируется в более активные формы ферментами, описанными выше, в почве или другой среде для роста растений.
Пример 13. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих протеазы, для защиты растений от патогенов
[00999] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования протеаз, которые защищают растения от одного или нескольких патогенов. Например, отдельные представители определенных бактериальных патогенов могут взаимодействовать посредством секреции бактериальных лактонов гомосерина или родственных сигнальных молекул. Таким образом, протеазы, специфичные к бактериальным сигнальным молекулам лактонам гомосерина, могут защищать растения от таких бактериальных патогенов путем нарушения взаимодействия между бактериями, стадии, необходимой для секреции бактериями токсинов и активации факторов вирулентности. Подходящие протеазы, специфичные к бактериальным сигнальным молекулам лактонов гомосерина включают эндопептидазы и экзопептидазы.
[001000] Протеазы, специфичные к бактериальным молекулам передачи сигнала лактонам гомосерина, можно включать в систему BEMD с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1. Можно получать слитую конструкцию, которая содержит протеазу и нацеливающую последовательность, которая нацеливает протеазу в экзоспорий, когда слитая конструкция экспрессируются в представителе семейства Bacillus cereus. Затем слитую конструкцию экспрессируют в представителе семейства Bacillus cereus и представитель семейства Bacillus cereus добавляют в почву или другую среду для роста растений. Затем протеаза может деградировать бактериальные сигнальные молекулы лактоны гомосерина, блокируя ключевую стадию в вирулентности этих организмов, и, тем самым, помогая защитить растение от этих патогенов. На систему BEMD эффективно действуют другие протеазы и пептидазы с этой способностью, как продемонстрировано выше в примере 6 и 7.
Пример 14. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих противомикробные белки и пептиды, для защиты растений от патогенов
[001001] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования ферментов, которые проявляют антибактериальную и/или противогрибковую активность, которая может помочь защитить растения от одного или нескольких патогенов. Например, противогрибковые белки и пептиды, такие как бактериоцины, лизоцимы (например, LysM), сидерофоры, авидины, стрептавидины, кональбумин, альбумин, лактоферрины (например, LfcinB) или TasA, можно экспрессировать в системе BEMD для достижения их эффекта на бактериальные и грибные патогены растений. Бактериоцины, альбумин, кональбумин, лизоцимы и лактоферрин демонстрируют прямое противомикробное действие на их мишени, в то время как сидерофоры, авидины и стрептавидины связывают необходимые питательные вещества, которые требуются патогенам для вирулентности. Например, пептид LfcinB лактоферрина, когда он экспрессируется на поверхности системы BEMD, будет лизировать клетки бактерий, которые являются чувствительными к пептидам лактоферрина, в среде для роста растений. Эти белки и пептиды обладают специфическим действием на отдельные микроорганизмы и могут селективно нацеливаться на группу патогенов без уничтожения всех микроорганизмов в среде для роста растений.
[001002] Любой из этих белков или пептидов можно включать в систему BEMD для экспонирования на спорах BEMD с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1. Можно получать слитую конструкцию, которая содержит фермент и нацеливающую последовательность, которая нацеливает фермент в экзоспорий, когда слитая конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Затем слитую конструкцию экспрессируют в представителе семейства Bacillus cereus, и представитель семейства Bacillus cereus добавляют в почву или другую среду для роста растений для защиты растений от одного или нескольких патогенов.
Пример 15. Применение спор BEMD, экспрессирующих противомикробные пептиды, для защиты растений от бактерий
[001003] Синтезировали гены, которые кодируют любой из двух противомикробных пептидов: LfcinB (происходящий из бычьего лактоферрина) и LysM (происходящий из лизоцима курицы), связанные с нацеливающей последовательностью BclA (SEQ ID NO: 96), под контролем промотора BclA (SEQ ID NO: 215). Гены вводили в Bacillus thuringiensis BT013A и споры получали путем выращивания ночной культуры трансформированных Bacillus в бульон с сердечно-мозговой вытяжкой, посева на чашки с питательным агаром при 30°C и позволения расти в течение 3 суток. Споры смывали с планшетов и ополаскивали 3X PBS. Культуры Staphylococcus epidermidis выращивали в течение ночи в бульоне TSB при 37°C. Затем ночную культуру осаждали, промывали PBS и ресуспендировали в PBS при Abs595=0,2. 1×104 BEMD, экспрессирующих пептиды LysM или LfcinB, инкубировали в PBS с S. epidermidis в течение 3 часов при 37°C, при встряхивании. Контрольный образец S. epidermidis оставляли необработанным (без спор BEMD). После инкубации в течение 3 часов получали планшеты с разведением S. epidermidis и инкубировали при 37°C в течение ночи. Культуры S. epidermidis посчитывали на следующие сутки и количественно определяли процентное уничтожение. В таблице 24 ниже показаны данные активности уничтожения. Пептиды, экспрессированные BEMD, уничтожали значительное количество клеток S. epidermidis. Таким же образом будет происходить уничтожение бактерий в ризосфере, на семенах или другом растительном материале. Выбор пептидов, специфичных к определенным классам бактерий, также может обеспечить смещение популяции микроорганизмов вблизи растения благоприятным образом или селективное нацеливание на ключевые патогены.
Таблица 24
Пример 16. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих ферменты для защиты растений от патогенов
[001004] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования ферментов, которые защищают растения от одного или нескольких патогенов. Например, клеточные стенки дрожжей и плесени деградируются ферментами, такими как β-1,3-глюканазы, β-1,4-глюканазы, β-1,6-глюканазы, хитозаназы, хитиназы, подобные хитозаназам белки и литиказы. Клеточные стенки бактерий деградируются ферментами, выбранными из протеиназ, протеаз, мутанолизина, стафолизина и лизоцимов. Каждый из этих ферментов, деградирующих клеточную стенку, можно экспрессировать в системе BEMD и добавлять в среду для роста растений для селективного ингибирования патогенных микроорганизмов в ризосфере.
[001005] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования ферментов или белков, которые защищают растения от патогенных насекомых или червей, например, путем подавления хищничества насекомых и/или червей на желаемых растениях. Примеры таких представляющих интерес белков и ферментов включают эндотоксины, токсины Cry, другие инсектицидные белковые токсины, ингибиторы протеаз, цистеиновые протеазы, белок Cry5B, белок Cry 21A, хитиназу, белки-ингибиторы протеаз, пептиды-ингибиторы протеаз, ингибиторы трипсина ингибиторы протеаз arrowhead.
[001006] Любые из этих белков или пептидов можно включать в систему BEMD для экспонирования на спорах BEMD с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1. Можно получать слитую конструкцию, которая содержит фермент и нацеливающую последовательность, которая нацеливает фермент в экзоспорий, когда слитая конструкция экспрессируются в представителе семейства Bacillus cereus. Затем слитую конструкцию экспрессируют в представителе семейства Bacillus cereus и представитель семейства Bacillus cereus добавляют в почву или другую среду для роста растений для защиты растений от патогенов.
Пример 17. Применение спор BEMD, экспрессирующих противогрибковый фермент, для защиты растений, и демонстрация эффективности против Sacchromyces.
[001007] Синтезировали ген, который кодирует противогрибковый фермент β-1,3-глюканазу из Bacillus subtilis, связанный с нацеливающей последовательностью BclA (SEQ ID NO: 96) под контролем промотора BclA (SEQ ID NO: 215). Ген вводили в Bacillus thuringiensis BT013A и поры в них обеспечивали путем выращивания ночной культуры трансформированных Bacillus в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой, посева на агар с питательными веществами при 30°C и позволения расти в течение 3 суток. Споры смывали с планшетов и ополаскивали 3X PBS. Культуры Saccharomyces cerevisiae выращивали в течение ночи в бульоне YZ при 37°C. Затем ночную культуру осаждали, промывали PBS и ресуспендировали в PBS при Abs595=0,2. 1×104 BEMD, экспрессирующих β-1,3-глюканазу, инкубировали в PBS с Saccharomyces в течение 1 часа при 37°C, при встряхивании. Контрольный образец Saccharomyces оставляли необработанным (без спор BEMD). После инкубации в течение 3 часов получали планшеты с разведением Saccharomyces и инкубировали при 37°C в течение ночи. Культуры Saccharomyces посчитывали на следующие сутки и количественно определяли процентное уничтожение. В таблице 25 ниже показана активность спор BEMD, экспрессирующих β-1,3-глюканазу, в отношении уничтожения. Фермент, экспрессированный BEMD, уничтожал значительное количество клеток Saccharomyces. Таким же образом будет происходить уничтожение грибных микроорганизмов в ризосфере, на семенах или другом растительном материале. Выбор пептидов, специфичных к определенным классам грибов, также может обеспечить смещение популяции микроорганизмов вблизи растения благоприятным образом или селективное нацеливание на ключевые грибные патогены.
Таблица 25
Пример 18. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих стимулирующие иммунную систему растений пептиды или белки, для защиты растений от патогенов
[001008] Систему BEMD также можно использовать для экспонирования пептидов и белков, усиливающих иммунную систему растений. Эти белки можно экспрессировать на наружной поверхности споры BEMD и доставлять в среду для роста растений для стимуляции иммунной системы растений, чтобы позволить растению защитить себя от патогенов растений. Иллюстративные белки и пептиды включают гарпин, α-эластины, β-эластины, системины, фенилаланинаммиаклиазу, элицитины, дефензины, криптогеин и белки и пептиды флагеллина. Воздействие на растения этих белков или пептидов будет стимулировать устойчивость растений ко многим патогенам растений.
[001009] Любой из этих белков или пептидов можно включать в систему BEMD для экспонирования на спорах BEMD с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1. Можно получать слитую конструкцию, которая содержит фермент и нацеливающую последовательность, которая нацеливает фермент в экзоспорий, когда слитая конструкция экспрессируются в представителе семейства Bacillus cereus. Затем слитую конструкцию экспрессируют в представителе семейства Bacillus cereus и представитель семейства Bacillus cereus добавляют в почву или другую среду для роста растений для защиты растений от патогенов.
Пример 19. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих белок или пептид, связывающийся с корнями или листьями, для иммобилизации рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на корневой системе растения или на листьях растений.
[001010] Связывающиеся с корнями и листьями белки и пептиды также можно включать в систему BEMD, чтобы обеспечить иммобилизацию спор BEMD на корневой системе или на листьях растения. Экспонирование таких связывающихся с корнями или листьями лигандов на спорах BEMD позволяет нацеливание спор на корневую систему растения, или на субструктуры корневой системы, или на листья, или на субструктуры листьев, для поддержания сор BEMD в оптимальном положении, чтобы другие экспонируемые биологические молекулы и ферменты были эффективными.
[001011] Например, рикадгезин представляет собой связывающийся с корнями лиганд, который связывается с корневыми волосками. Таким образом, экспонирование рикадгезина на спорах BEMD нацеливает споры на корневые волоски. Дополнительные белки, которые можно использовать для селективного связывания с корнями или листьями растений, включают адгезины, флагеллин, омптины, лектины, белки пилуса, белки завитка, интимины, инвазины, агглютинин, афимбриальные белки, TasA или YuaB.
[001012] Такие связывающиеся с корнями или листьями белки или пептиды можно включать в систему BEMD с использованием способов, сходных со способами, описанных выше в примере 1. Можно получать слитую конструкцию, которая содержит связывающийся с корнями или листьями белок или пептид и нацеливающую последовательность, которая нацеливает белок или пептид в экзоспорий, когда конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Затем слитую конструкцию, содержащую связывающийся с корнями или листьями лиганд, экспрессируют в представителе семейства Bacillus cereus. Такие слитые конструкции можно совместно экспрессировать с одной или несколькими дополнительными слитыми конструкциями, содержащими любой из полезных ферментов, описанных в настоящем описании (например, фермент, вовлеченный в синтез гормонов растений, фермент, который деградирует источник питательных веществ, или протеазы, которые защищают растение от патогена). Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus добавляют в почву или другую среду для роста растений или наносят на листья растения. Связывающийся с корнями или листьями лиганд нацеливает представитель семейства Bacillus cereus на корневую систему растения или на листья растения и иммобилизует его на них, таким образом, позволяя совместно экспрессированной слитой конструкции проявлять ее эффекты вблизи системы корней или листьев.
Пример 20. Применение рекомбинантых представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих белки или ферменты, для повышения устойчивости растений к стрессовым воздействиям
[001013] Белки, пептиды и ферменты, которые повышают устойчивость растения к стрессовым воздействиям, можно включать в систему BEMD и доставлять в растения-мишени путем нанесения на корни, листья или добавления в среду для роста растений. В период действия стрессовых факторов растения высвобождают связанные с воздействием стрессовых факторов соединения, включая аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (ACC), активные формы кислорода и другие, что приводит к отрицательному влиянию на рост растения. Систему BEMD можно использовать для экспонирования ферментов, которые деградируют такие связанные с воздействием стрессовых факторов соединения, такие как дезаминаза аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты, супероксиддисмутазы, оксидазы, каталазы и другие ферменты, которые воздействуют на активные формы кислорода. Такие ферменты уменьшают количество этих соединений, связанных с воздействием стрессовых факторов, и позволяют растениям продолжать расти и даже успешно развиваться в стрессовых условиях.
[001014] Любой из этих белков или пептидов можно включать в систему BEMD для экспонирования на спорах BEMD с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1. Можно получать слитую конструкцию, которая содержит фермент и нацеливающую последовательность, которая нацеливает фермент в экзоспорий, когда слитая конструкция экспрессируется в представителе семейства Bacillus cereus. Затем слитую конструкцию экспрессируют в представителе семейства Bacillus cereus и представитель семейства Bacillus cereus добавляют в почву или в другую среду для роста растений или наносят на листья растения для повышения устойчивости растения-мишени к воздействию стрессовых факторов.
Пример 21. Получение спор BEMD, экспрессирующих защитный фермент каталазу
[001015] Синтезировали ген, который кодирует защитный фермент каталазу из Bacillus cereus, связанный с нацеливающей последовательностью BetA (SEQ ID NO: 97), под контролем промотора BetA (SEQ ID NO: 197). Этот ген вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры получали путем выращивания ночной культуры трансформированных Bacillus и штамма дикого типа в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой, посева на агар с питательными веществами при 30°C и позволения расти в течение 3 суток. Споры смывали с планшетов и ополаскивали 3X PBS. К каждому осадку со спорами добавляли 3 капли пероксида водорода. Фермент каталаза конвертирует пероксид водорода в воду и газообразный O2. Контрольные споры не имели пузырьков, в то время как споры BEMD с каталазой имели пузырьки, демонстрируя активность фермента на поверхности спор. Другие защитные ферменты можно экспонировать аналогичным образом и доставлять в растение для действия на свободные радикалы, продуцируемые растениями при воздействии стрессовых факторов.
Пример 22. Применение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспонирующих белки или ферменты, которые защищают семена или растения от стрессовых факторов внешней среды
[001016] Белки, пептиды и ферменты, которые защищают растение от стрессовых факторов внешней среды, можно включать в систему BEMD и доставлять растениям-мишеням путем нанесения на корни, листья, плоды или добавления в среду для роста растений. В периоды заморозков растения могут повреждаться под действием льда. Систему BEMD можно использовать для экспонирования пептидов, белков или ферментов, которые защищают растения от таких эффектов. Например, систему BEMD можно использовать для экспонирования холиндегидрогеназ, которые действуют, продуцируя защитные продукты, которые защищают растения или семена от заморозков. Субстраты этих ферментов (например, холин и/или производные холина) также можно добавлять в среду для роста растений. Добавление таких субстратов может повышать количество защитного агента (бетаин и родственные химические соединения), продуцированного во окружающей растение среде ферментами, экспрессированными BEMD. Известно, что производные бетаина защищают семена от холодового стресса.
[001017] Любой из этих белков или пептидов можно включать в систему BEMD для экспонирования на спорах BEMD с использованием способов, сходных со способами, описанными выше в примере 1. Можно получать слитую конструкцию, которая содержит фермент и нацеливающую последовательность, которая нацеливает фермент в экзоспорий, когда слитая конструкция экспрессируются в представителе семейства Bacillus cereus. Затем слитую конструкцию экспрессируют в представителе семейства Bacillus cereus, и представитель семейства Bacillus cereus добавляют в почву или в другую среду для роста растений или наносят на листья растения для защиты растения от стрессовых воздействий и факторов внешней среды.
Пример 23. Повышенная экспрессия слитых конструкций на системе BEMD с использованием усиленных или альтернативных промоторных элементов
[001018] Система BEMD может экспонировать широкий диапазон белков, пептидов и ферментов с использованием одной или нескольких нацеливающих последовательностей, описанных в настоящем описании. Некоторые из этих нацеливающих последовательностей обладают высокой аффинностью в отношении экзоспория, что может быть полезным для экспрессии слитого белка, однако их низкий уровень экспрессии слитого белка ограничивает их применение на системе BEMD. Для таких слитых белков и последовательностей можно вместо нативных промоторов можно использовать альтернативные промоторы споруляции с высокой экспрессией.
[001019] Например, SEQ ID NO: 13 (аминокислоты 1-39 продукта гена 3572 B. weihenstephensis KBAB4) обеспечивает высокоэффективную N-концевую последовательность для доставки белков в экзоспорий представителей семейства Bacillus cereus, как показано в таблице 26 ниже. Все гены синтезировали в их полной форме (включая промоторные области и области, кодирующие слитые белки), как описано в настоящем описании. Когда элементы нативного промотора для гена 3572 B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID NO: 217) использовали для экспрессии слитого белка, содержащего нацеливающую последовательность SEQ ID NO: 13, слитую с ферментом β-галактозидазой (из E. coli), экспрессировался низкий уровень слитого белка, что приводило к снижению активности фермента на поверхности споры. Активность фермента измеряли по конвертированию 0,5 M o-нитрофенилгалактозида в растворе в течение 10 минут. Конвертирование фермента измеряли с помощью спектрофотометра при ABS540. Замена нативных промоторных элементов гена 3572 B. weihenstephensis KBAB4 промоторами с высокой экспрессией SEQ ID NO: 197 (BetA/BAS3290 B. anthracis) или SEQ ID NO: 218 (β-пропеллерный белок YVTN B. weihenstephensis KBAB4) приводила к значительному увеличению ферментативной активности спор. С другой стороны, замена нативных промоторых элементов гена 3572 B. weihenstephensis KBAB4 промотором, нативным для B. anthracis Sterne BAS1882 (SEQ ID NO: 216), приводила к снижению ферментативной активности спор. Уровень экспрессии нацеливающей последовательности SEQ ID NO: 13, слитой с β-галактозидазой, был значительно более низким (0,38X) под контролем промотора BAS1882 (SEQ ID NO: 216), и значительно увеличивался под контролем промотора BetA (SEQ ID NO: 197) или промотора белка YVTN (SEQ ID NO: 218).
ТАБЛИЦА 26
Пример 24. Выделение и идентификация бактериальных штаммов, стимулирующих рост растений
[001020] Образцы почвы из ризосфер наиболее здоровых и наиболее устойчивых растений картофеля (Solanum tuberosum), патиссона (Cucurbita pepo), томата (Solanum lycopersicum) и вьющейся фасоли (Phaseolus coccineus) собирали, разбавляли стерильной водой и наносили на чашки с питательным агаром. Бактериальные изоляты, которые демонстрировали наиболее высокие скорости роста и были способны к пассированию и увеличению в количестве, отбирали для дальнейшего исследования. Выбранные штаммы выращивали в минимальной среде (KH2PO4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г, на л сухой массы). Ночные культуры (30°C) выбранных штаммов осаждали центрифугированием, среду декантировали и их ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Проводили посев десяти семян салата-латука на обработку на глубину 1 см в глинистую почву верхнего слоя (Columbia, MO), которая была просеяна для удаления крупных остатков. Семена инокулировали при посеве в 4-см горшки посредством 0,5 мкл ресуспендированных бактерий в воде, примешанных к 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для доставки бактерий в 3 дюйма3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) с 11 часов света/сутки, и поливом 5 мл воды каждые 3 суток. Через одну неделю собирали данные о росте растений и диаметре листьев, а также об общем состоянии здоровья растений. Первоначальный скрининг изолятов ризосферы привел к получению более чем 200 различных видов бактерий и грибов из ризосферы четырех растений. Некоторые из бактериальных видов описаны в таблице 27. Идентифицированные штаммы указаны посредством их надлежащих обозначений для бактерий. Другие штаммы указаны посредством их неизвестного идентификационного номера. Инокуляты, давшие результаты, близкие к контролю (+/- 2%), в таблицу не включены.
ТАБЛИЦА 27
[001021] Бактериальный штаммы, которые вызывали наибольший эффект на общее состояние здоровья растения и высоту растения в первоначальном испытании с салатом-латуком, подвергали дальнейшей идентификации. Бактериальные штаммы выращивали в течение ночи в бульоне Луриа-Бертани при 37°C, и ночные культуры осаждали в центрифуге. Среду декантировали и оставшийся бактериальный осадок подвергали выделению хромосомной ДНК с использованием набора для выделения бактериальной хромосомной ДНК Qiagen. Хромосомную ДНК подвергали амплификации способом ПЦР областей, кодирующих 16S рРНК, с использованием праймеров E338F 5ʹ-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3ʹ (SEQ ID NO: 298), E1099R A 5ʹ-GGG TTG CGC TCG TTG C-3ʹ (SEQ ID NO: 299) и E1099R B 5ʹ-GGG TTG CGC TCG TTA C-3ʹ (SEQ ID NO: 300). ПЦР-ампликоны очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР Promega и полученные ампликоны разбавляли отправляли в University of Missouri DNA Core для секвенирования ДНК. Последовательности ДНК сравнивали с базой данных бактериальных изолятов NCBI BLAST, и род и вид идентифицировали посредством прямого сравнения с известными штаммами. Наилучшие идентифицированные виды представлены в таблице 27. Во многих случаях последовательности 16S рРНК были способны только указать на род выбранного бактериального штамма. В случаях, когда прямая идентификация не подходила, проводили дополнительные биохимические анализы с использованием способов, стандартных в данной области, для различения штаммов на уровне видов и штаммов, и они приведены в таблице 28.
ТАБЛИЦА 28
Пример 25. Выделение и идентификация дополнительных бактериальных штаммов, стимулирующих рост растений
[001022] Образцы почвы сельскохозяйственных полей вблизи Gas, Kansas, собирали, разбавляли стерильной водой и наносили на чашки с питательным агаром. Бактериальные изоляты, которые демонстрировали наиболее высокие скорости роста и были способны к пассированию и увеличению в количестве, отбирали для дальнейшего исследования. Выбранные штаммы выращивали в минимальных средах (KH2PO4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г, на л сухой массы). Ночные культуры (30°C) выбранных штаммов осаждали центрифугированием, среду декантировали и их ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Семена кукурузы покрывали коммерческим полимером для семян, смешанным только с водой (всего 1,6 мкл на семя), или коммерческим полимером, содержащим выбранные бактериальные штаммы (всего 1,6 мкл на семя). Покрытые семена высевали в горшки диаметром (3 дюйма) 7,62 см на глубину 1 дюйм (2,54 см) в глинистую почву верхнего слоя (Columbia, MO), которая была просеяна для удаления крупных остатков. Растения выращивали при температуре 18-24°C (65-75°F) с 11 часов света/сутки, и поливом 50 мл воды при посеве и каждые 3 суток. Через две недели собирали данные о росте растений и диаметре листьев, а также об общем состоянии здоровья растений. Для анализов прорастания и определения длины корня через 3 суток семена покрывали, как описано выше, и равномерно распределяли по 10 семян на бумажное полотенце. Бумажные полотенца смачивали 10 мл воды, заворачивали, помещали в небольшой пластиковый мешок и инкубировали при 30°C или помещали на подогреваемый коврик для проращивания при 27-30°C (80-85°F). Размеры корней регистрировали через 3 суток. Первоначальный скрининг изолятов ризосферы привел к получению более чем 100 различных видов бактерий и грибов из ризосферы. Некоторые из бактериальных видов описаны в таблице 29. Идентифицированные штаммы указаны посредством их надлежащих обозначений для бактерий.
ТАБЛИЦА 29
[001023] Бактериальные штаммы, которые вызывали наибольший эффект на общее состояние здоровья растения, описаны в таблице 29. Бактериальные штаммы выращивали в течение ночи в бульоне Луриа-Бертани при 37°C, и ночные культуры осаждали в центрифуге. Среду декантировали и оставшийся бактериальный осадок подвергали выделению хромосомной ДНК с использованием набора для выделения бактериальной хромосомной ДНК Qiagen. Хромосомную ДНК подвергали амплификации способом ПЦР областей, кодирующих 16S рРНК, с использованием праймеров E338F 5ʹ-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3ʹ (SEQ ID NO: 298), E1099R A 5ʹ-GGG TTG CGC TCG TTG C-3ʹ (SEQ ID NO: 299) и E1099R B 5ʹ-GGG TTG CGC TCG TTA C-3ʹ (SEQ ID NO: 300). ПЦР-ампликоны очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР Promega и полученные ампликоны разбавляли отправляли в University of Missouri DNA Core для секвенирования ДНК. Последовательности ДНК сравнивали с базой данных бактериальных изолятов NCBI BLAST, и род и вид идентифицировали посредством прямого сравнения с известными штаммами. Наилучшие идентифицированные виды представлены в таблице 16. Во многих случаях последовательности 16S рРНК были способны только указать на род выбранного бактериального штамма. В случаях, когда прямая идентификация не подходила, проводили дополнительные биохимические анализы с использованием способов, стандартных в данной области, для различения штаммов на уровне видов и штаммов, и установленные штаммы приведены в таблице 30.
ТАБЛИЦА 30
wk=рост в течение недели или низкий рост
Пример 26. Исследование стимулирующих рост растений бактериальных штаммов на люцерне
[001024] Выбранные штаммы выращивали в минимальной среде (KH2PO4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г, на л сухой массы). Ночные культуры (30°C) выбранных штаммов осаждали центрифугированием, среду декантировали и бактерии ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Десять покрытых Zeba семян люцерны высевали на каждую обработку на глубину 0,6 см в глинистую почву верхнего слоя (Columbia, MO), которая была просеяна для удаления крупных остатков. Семена инокулировали при посеве посредством 0,5 мкл ресуспендированных бактерий в воде, примешанных к 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для доставки бактерий в 3 дюйма3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) с 11 часами света/сутки и поливом 5 мл воды каждые 3 суток. Люцерне позволяли расти в течение 1 недели для анализа появления и первоначального прорастания растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные их надлежащими обозначениями для бактерий, и конечные данные о высоте приведены в таблице 31.
ТАБЛИЦА 31
Пример 27. Исследование штаммов, стимулирующих рост растений, на огурцах
[001025] Выбранные штаммы выращивали в минимальной среде (KH2PO4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г и глюкоза 1 г, на л сухой массы). Ночные культуры (30°C) выбранных штаммов осаждали центрифугированием, среду декантировали и ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Десять семян огурца высевали на каждую обработку на глубину 1 см в глинистую почву верхнего слоя (Columbia, MO), которая была просеяна для удаления крупных остатков. Семена инокулировали при посеве посредством 0,5 мкл ресуспендированных бактерий в воде, примешанных к 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для доставки бактерий в 3 дюйма3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) с 11 часами света/сутки, и поливом 5 мл воды каждые 3 суток. Огурцам позволяли расти в течение 2 недель для анализа появления и первоначального прорастания растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные их надлежащими обозначениями для бактерий, и конечные данные о высоте приведены в таблице 32.
ТАБЛИЦА 32
Пример 28. Исследование бактериальных штаммов, ускоряющих рост растений, на патиссонах
[001026] Выбранные штаммы выращивали в минимальной среде (KH2PO4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г, и глюкоза 1 г, на л сухой массы). Ночные культуры (30°C) выбранных штаммов осаждали центрифугированием, среду декантировали, и их ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Семена патиссона высевали на каждую обработку на глубину 1 см в глинистую почву верхнего слоя (Columbia, MO), которая была просеяна для удаления крупных остатков. Семена инокулировали при посеве посредством 0,5 мкл ресуспендированных бактерий в воде, примешанных к 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для доставки бактерий в 3 дюймах3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) с 11 часами света/сутки, и поливом 5 мл воды каждые 3 суток. Патиссонам позволяли расти в течение 2 недель для анализа появления и первоначального прорастания растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные их надлежащими обозначениями для бактерий, данные о конечной высоте и данные о конечном диаметре листьев (по ширине двух листьев) приведены в таблице 33.
ТАБЛИЦА 33
Пример 29. Исследование бактериальных штаммов, стимулирующих рост растений, на плевеле.
[001027] Выбранные штаммы выращивали в минимальной среде (KH2PO4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г, и глюкоза 1 г, на л сухой массы). Ночные культуры (30°C) выбранных штаммов осаждали центрифугированием, среду декантировали, и их ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Тридцать семян плевела высевали на каждую обработку на глубину 0,3 см в глинистую почву верхнего слоя (Columbia, MO), которая была просеяна для удаления крупных остатков. Семена инокулировали при посеве посредством 0,5 мкл ресуспендированных бактерий в воде, примешанных к 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для доставки бактерий в 3 дюймах3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) с 11 часами света/сутки, и поливом 5 мл воды каждые 3 суток. Плевелу позволяли расти в течение 1,5 недели для анализа появления и первоначального прорастания растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные их надлежащими обозначениями для бактерий, и данные о высоте приведены в таблице 34.
ТАБЛИЦА 34
Пример 30. Исследование бактериальных штаммов, стимулирующих рост растений, на кукурузе
[001028] Выбранные штаммы выращивали в минимальной среде (KH2PO4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г, и глюкоза 1 г, на л сухой массы). Ночные культуры (30°C) выбранных штаммов осаждали центрифугированием, среду декантировали, и их ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Десять семян кукурузы высевали на каждую обработку на глубину 2,5 см в глинистую почву верхнего слоя (Columbia, MO), которая была просеяна для удаления крупных остатков. Семена инокулировали при посеве посредством 0,5 мкл ресуспендированных бактерий в воде, примешанных к 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для доставки бактерий в 3 дюйма3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) с 11 часами света/сутки, и поливом 5 мл воды каждые 3 суток. Кукурузе позволяли расти в течение 2 недель для анализа появления и первоначального прорастания растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные их надлежащими обозначениями для бактерий, и конечные данные о высоте приведены в таблице 35.
ТАБЛИЦА 35
Пример 31. Исследование бактериальных штаммов, стимулирующих рост растений, на сое
[001029] Выбранные штаммы выращивали в минимальной среде (KH2PO4 3 г, Na2HPO4 6 г, NH4Cl 1 г, NaCl 0,50 г, MgSO4 7H2O 0,15 г, CaCl2 2H2O 0,013 г, и глюкоза 1 г, на л сухой массы, или для Bradyrhizobium или Rhizobium на дрожжевой среде с маннитом). Ночные культуры (30°C) выбранных штаммов осаждали центрифугированием, среду декантировали, и их ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. Десять семян сои высевали на каждую обработку на глубину 2,5 см в глинистую почву верхнего слоя (Columbia, MO), которая была просеяна для удаления крупных остатков. Семена инокулировали при посеве посредством 0,5 мкл ресуспендированных бактерий в воде, примешанных к 10 мл H2O. При исследовании двух бактериальных штаммов 0,5 мкл каждых ресуспендированных бактерий примешивали к 10 мл H2O. Десять мл H2O было достаточно для доставки бактерий в 3 дюйма3 (7,62 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-75°F (18-24°C) с 11 часами света/сутки, и поливом 5 мл воды каждые 3 суток. Сое позволяли расти в течение 2 недель для анализа появления и первоначального прорастания растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные их надлежащими обозначениями для бактерий, и конечные данные о высоте приведены в таблице 36. Совестная инокуляция бактериальных штаммов в рамках настоящего изобретения с представителями Bradyrhizobium sp. или Rhizobium sp. приводила к увеличению роста растения по сравнению в каждым инокулятом отдельно.
ТАБЛИЦА 36
Пример 32. Представители семейства Bacillus cereus с признаками стимуляции роста растений
[001030] Bacillus mycoides штамма BT155, Bacillus mycoides штамма EE118, Bacillus mycoides штамма EE141, Bacillus mycoides штамма BT46-3, представитель семейства Bacillus cereus штамма EE349, Bacillus thuringiensis штамма BT013A и Bacillus megaterium штамма EE281 выращивали в бульоне Луриа-Бертани при 37°C и ночные культуры осаждали центрифугированием, среду декантировали, и их ресуспендировали в равном количестве дистиллированной воды. 20 семян кукурузы высевали на каждую обработку на глубину 2,5 см в глинистую почву верхнего слоя (Columbia, MO), которая была просеяна для удаления крупных остатков. Семена инокулировали при посеве посредством 0,5 мкл ресуспендированных бактерий в воде, примешанных к 50 мл H2O. Пятьдесят мл H2O было достаточно для доставки бактерий в 29 дюймов3 (442,5 см3) почвы, а также для насыщения почвы для надлежащего прорастания семян. Растения выращивали при температуре 65-72°F с 13 часами света/сутки, и поливом 5 мл воды каждые 3 суток. Проросткам позволяли расти в течение 2 недель для анализа появления и первоначального прорастания растений в описанных условиях. Идентифицированные штаммы, указанные их надлежащими обозначениями для бактерий, и конечные данные о высоте приведены в таблице 37.
ТАБЛИЦА 37
[001031] Все исследованные бактерии, стимулирующие рост растений, имели благоприятный эффект на высоту кукурузы через две недели в описанных условиях. Представитель семейства Bacillus cereus штамма EE128 имел наилучший эффект в этом испытании, обеспечивая увеличение высоты кукурузы более чем на 14%.
Пример 33. Усиленная селекция представителей семейства Bacillus cereus в качестве хозяев BEMD для экспрессии в целях скрининга стимулирующей рост растений активности и других полезных видов активности
[001032] Систему BEMD можно использовать для экспонирования широкого диапазона белков, пептидов и ферментов с использованием любых из нацеливающих последовательностей, описанных в настоящем описании, для обеспечения полезных сельскохозяйственных эффектов. Дополнительные полезные эффекты могут быть достигнуты путем выбора экспрессирующего хозяина (представитель семейства Bacillus cereus), имеющего присущие ему полезные свойства. Многие штаммы представителей семейства Bacillus cereus имеют пользу ускорения роста растений. Кроме того, многие штаммы представителей семейства Bacillus cereus имеют защитные эффекты посредством прямой фунгицидной, инсектицидной, нематоцидной или другой защитной активности. При использовании таких штаммов в качестве экспрессирующих хозяев для системы BEMD конечный продукт в виде спор будет иметь комбинацию положительных в сельском хозяйстве признаков.
[001033] В таблице 38 представлены результаты эксперимента, где слитый белок экспрессировали в различных штаммах представителей семейства Bacillus cereus. Все штаммы экспрессировали слитый белок, содержащий аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1 и фосфатазу PhoA4 из Bacillus subtilis, полезный фермент для усиления поглощения фосфатов в кукурузе. Ген синтезировали, клонировали в вектор pMK4 и вводили в каждый из Bacillus spp., указанных в таблице 38. Штаммы подвергали споруляции путем инкубации при 30°C на чашках с питательным агаром, содержавшим 10 мкг/мл хлорамфеникола, в течение трех суток. Споры собирали, промывали и наносили на кукурузу при посеве в количестве 1×105 к.о.е./мл в 50 мл воды на горшок диаметром 7,62 см с 5 мг полифосфата на горшок. Кукурузу выращивали в илисто-глинистой почве в течение двух недель. Растения выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватта, и подвергали воздействию 13 часов света в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток на протяжении испытания в течение двух недель. В конце двух недель высоту каждого растения измеряли и результаты измерений нормализовывали к результатам для контрольных спор Bacillus thuringiensis. Экспрессия слитого белка SEQ ID NO: 1-фосфатаза приводила к увеличению высоты кукурузы через 2 недели независимо от выбранного экспрессирующего штамма-хозяина. Как показано в таблице 38, использование стимулирующего рост растений представителя семейства Bacillus cereus далее увеличивало высоту кукурузы.
ТАБЛИЦА 38
Пример 34. Применение различных нацеливающих последовательностей для экспрессии β-галактозидазы на поверхности Bacillus thuringiensis
[001034] Для экспонирования ферментов, белков и пептидов на поверхности представителей семейства Bacillus cereus можно использовать широкое множество нацеливающих последовательностей, которые имеют высокую степень гомологии с аминокислотами 20-35 BclA (аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1). Проводили сравнение нескольких нацеливающих последовательностей путем получения слитых белков, содержащих нацеливающие последовательности, связанные с липазой Bacillus subtilis. Слитые конструкции синтезировали с использованием промоторов, нативных для нацеливающей последовательности, клонировали в реплицирующуюся плазмиду pMK4 и вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Штаммы подвергали споруляции посредством инкубации при 30°C на чашках с питательным агаром, содержавшим 10 мкг/мл хлорамфеникола, в течение 3 суток. Споры собирали, промывали и ресуспендировали в PBS в количестве 1×108/мл. 1×105 каждых спор спор со слитой конструкцией суспендировали в 400 мкл dH2O. Реакционные смеси нагревали с реакционными компонентами до желаемой температуры реакции (40°C). Добавляли 200 мкл рабочего буфера (9:1 раствор A:раствор B). Раствор A представлял собой 50 мМ Tris pH 10 и 13,6 мМ дезоксихолевую кислоту, и раствор B представлял собой 3 мг/мл п-нитрофенилпальмитата в изопропаноле. Реакционную смесь инкубировали при 40°C в течение 10 минут и помещали на лед, центрифугировали для удаления спор и регистрировали поглощение при 420 нм. Результаты представлены в таблице 39 ниже. Активность нормализовывали к активности контрольного слитого белка, содержащего аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1, слитые с липазой Bacillus subtilis.
ТАБЛИЦА 39
[001035] Несколько нацеливающих последовательностей, связанных с липазой, приводят к более высоким уровням экспрессии и активности фермента на поверхности спор. В частности, каждая из SEQ ID NO: 96, 98 и 100, содержащих более короткую нацеливающую последовательность, приводила к усиленной экспрессии слитой конструкции на поверхности спор BEMD. Все слитые белки, содержащие исследованные нацеливающие последовательности, приводили к экспонированию липазы на поверхности.
Пример 35. Применение различных последовательностей экзоспория для экспрессии липазы на поверхности Bacillus thuringiensis и демонстрация локализации слитого белка на поверхности экзоспория
[001036] Для экспонирования ферментов, белков и пептидов на поверхности представителей семейства Bacillus cereus можно использовать широкое множество белков экзоспория. Несколько различных белков экзоспория сравнивали путем получения слитых белков, содержащих белки экзоспория, связанные с липазой Bacillus subtilis, как описано в примере 34. Слитые конструкции синтезировали с использованием промотора, нативного для белка экзоспория, указанного в таблице 40 ниже, клонировали в реплицирующуюся плазмиду pMK4 и вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры, экспонирующие различные слитые конструкции белка экзоспория-липазы Bacillus subtilis 168, получали путем выращивания трансформированных бактерий в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой с давлением селекции, обеспечиваемым 10 мкг/мл хлорамфеникола, посева на планшет с питательным агаром и инкубации при 30°C в течение 3 суток. Через 3 суток споры смывали с планшетов, очищали центрифугированием и ресуспендировали в PBS в количестве 1×108 к.о.е./мл.
[001037] 1×105 спор для каждой слитой конструкции ресуспендировали в 400 мкл dH2O. Реакционные смеси нагревали с компонентами реакции до желаемой температуры реакции (40°C). Добавляли 200 мкл рабочего буфера (9:1 раствор A: раствор B). Раствор A представлял собой 50 мМ Tris pH 10 и 13,6 мМ дезоксихолевую кислоту и раствор B представлял собой 3 мг/мл п-нитрофенилпальмитата в изопропаноле. Реакционную смесь инкубировали при 40°C в течение 10 минут и помещали на лед, центрифугировали для удаления спор и регистрировали поглощение при 420 нм. Результаты представлены в таблице 40 ниже. Активность нормализовывали к активности SEQ ID NO: 109, связанной с липазой.
ТАБЛИЦА 40
[001038] Использование белков экзоспория SEQ ID NO: 109 и 110 приводило к наиболее высокой активности фермента на спорах. Все слитые белки, содержащие белки экзоспория, приводили к экспонированию на поверхности активной липазы Bacillus subtilis 168, хотя и на различных уровнях.
[001039] C использованием флуоресцентного репортера mCherry было продемонстрировано, что дополнительные белки экзоспория приводят к нацеливанию слитых белков в экзоспорий. Получали слитые конструкции, которые содержали белки экзоспория SEQ ID NO: 111, 120 и 110, связанные с репортером mCherry. Споры выращивали в течение 1,5 суток, собирали и ресуспендировали, как описано выше. 7 мкл флуоресцентных спор помещали под микроскоп Nikon E1000 и визуализировали в ходе поздней споруляции. Круговая локализация в виде кольца указывает на локализацию на наружном слое споры, и его признаки соответствует признакам белка экзоспория. Результаты флуоресцентной микроскопии представлены на фиг.2. На панелях A, B и C фиг.2 представлены изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, для спор, экспрессирующих слитые белки, содержащие белки экзоспория SEQ ID NO: 111, 120 и 110, соответственно, и репортер mCherry. Все три слитых конструкции продемонстрировали высокие уровни флуоресценции и локализации в экзоспории, демонстрируя их потенциальную применимость для экспрессии чужеродных белков на поверхности экзоспория.
Пример 36. Применение различных нацеливающих последовательностей и белков экзоспория для экспрессии фосфатазы в спорах Bacillus subtilis и эффекты экспрессирующих фосфатазу спор в сое
[001040] Споры BEMD, экспрессирующие фосфатазу A4 (PhoA4) Bacillus subtilis EE148, получали посредством синтеза генов, кодирующих различные нацеливающие последовательности и белки экзоспория, под контролем их нативных промоторов, связанных с PhoA4. Синтезированные гены клонировали в pMK4 и вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры, экспонирующие различные слитые конструкции белок экзоспория-PhoA4 Bacillus subtilis EE148, получали путем выращивания трансформированных бактерий в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой c селективным давлением, обеспечиваемым 10 мкг/мл хлорамфеникола, посева на чашках с питательным агаром, и инкубации при 30°C в течение трех суток. Через трое суток споры смывали с планшетов, очищали центрифугированием и ресуспендировали в PBS в количестве 1×108 к.о.е./мл.
[001041] Растения сои высевали на глубину 2,54 см в горшки глубиной 10 см, заполненные стандартной глинистой почвой верхнего слоя. Споры BEMD, экспрессировавшие PhoA4, разбавляли до концентрации 1×104/мл в 50 мл воды и наносили на каждое растение при посеве. Также включали контроль в виде только воды. Полифосфат добавляли в горшки в жидкости в количестве 0,5 мг/горшок. Растения выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватта, и подвергали воздействию 13 часов света в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток на протяжении испытания в течение двух недель. В конце двух недель измеряли высоту каждого растения и результаты измерения нормализовывали к результатам для контрольных растений, обработанных только водой.
[001042] Результаты представлены в таблице 41. Все растения сои, выращенные в присутствии спор BEMD, экспрессирующих слитые белки, содержащие PhoA4, связанную с различными нацеливающими последовательностями, и белки экзоспория с различными партнерами по слиянию с PhoA4, демонстрировали усиленный рост, однако степень этого эффекта варьировалась, в зависимости от используемой нацеливающей последовательности или белка экзоспория.
ТАБЛИЦА 41
Пример 37. Совместное применение спор BEMD и обработки семян, жидких удобрений и других добавок
[001043] Споры BEMD, экспрессирующие слитые белки, исследовали в отношении совместимости с различными обработками семян. Споры BEMD экспрессировали слитые белки, содержащие нацеливающую последовательность из аминокислот 1-35 SEQ ID NO: 1, связанную с фосфатазой (PhoA4) из Bacillus subtilis EE148 или пептидом POLARIS. Синтезированные гены клонировали в pMK4 и вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры, экспонирующие различные слитые конструкции белок экзоспория-PhoA4 Bacillus subtilis EE148 или POLARIS, получали путем выращивания трансформированных бактерий в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой с селективнвым давлением, обеспечиваемым 10 мкг/мл хлорамфеникола, посева на чашки с питательным агаром и инкубации при 30°C в течение трех суток. Через трое суток споры смывали с планшетов, очищали центрифугированием и ресуспендировали в PBS в количестве 1×108 к.о.е./мл.
[001044] Растения выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватта, и подвергали воздействию 13 часов света в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток на протяжении испытания в течение двух недель. В конце двух недель измеряли высоту каждого растения и результаты измерений нормализовывали к результатам для контрольных растений, обработанных только водой. Результаты представлены в таблице 42 ниже. Полив=внесение в почву в количестве 50 мл на горшок. Полимер=только полимер для покрытия семян ACCELERON. Для применения во время полива cпоры BEMD добавляли в количестве 1×104 клеток/50 мл. Для применения для покрытия семян споры BEMD добавляли в количестве 1,3×104/клеток/семя. 10-34-0 и 6-24-6 представляют собой стандартные коммерческие композиции стартового удобрения. 10-34-0 представляет собой жидкий фосфат аммония. 6-24-6 является жидким фосфатным удобрением с низким содержанием соли с составом орто/поли. Краситель=красный краситель для покрытия семян Becker Underwood. MACHO, APRON и CRUISER представляют собой коммерческие фунгициды, используемые на семенах. MACHO содержит активный ингредиент имидаклоприд, APRON содержит активный ингредиент мефеноксам и CRUISER содержит смесь активных ингредиентов тиаметоксама, мефеноксама и флудиоксонила. Было обнаружено, что споры являются совместимыми со многими обработками семян, и они сохраняли способность стимулировать рост растений в кукурузе.
ТАБЛИЦА 42
[001045] Было обнаружено, что споры BEMD являются совместимыми со всеми исследованными изменениями покрытия семян. Когда споры BEMD PhA4 комбинировали с красителем и полимером отдельно, происходило небольшое снижение активности, однако споры восстанавливали полную активность в случае красителя в комбинации с другими фунгицидами. Споры BEMD также хорошо действовали с жидкими удобрениями. Стартовое удобрение вносило вклад в рост растений, вероятно, посредством прямого дополнения питательными веществами. Споры BEMD действовали с обоими стартовыми удобрениями, что указывает на то, что активность фосфатазы все еще может приводить к увеличенному росту растений в присутствии избытка питательных веществ. Комбинации спор BEMD с фунгицидами демонстрировали более высокое увеличение роста растения, чем отдельно споры BEMD, вероятно вследствие защиты, обеспечиваемой молодым растениям кукурузы в процессе раннего роста.
Пример 38. Применение спор BEMD в качестве добавки для надземной части растений для снижения ингибирования стрессовыми факторами роста кукурузы
[001046] Споры BEMD экспонируют систему, которую можно использовать для доставки ферментов, которые могут смягчать действие некоторых стрессовых факторов в отношении растущих растений в полевых условиях или в теплице. Для этого выбирали ферменты, которые селективно действуют на активные формы кислорода в почве. Активные формы кислорода являются ключевыми маркерами стрессового воздействия в растениях.
[001047] Получали споры BEMD, экспрессирующие слитые белки, содержащие нацеливающую последовательность из аминокислот 1-35 SEQ ID NO: 1, связанную с хитозаназой, супероксиддисмутазой, каталазой или β1,3-глюканaзой из Bacillus thuringiensis BT013A. Синтезированные гены клонировали в pMK4 и вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры, экспонирующие различные белковые слитые конструкции, получали путем выращивания трансформированных бактерий в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой с селективным давлением 10 мкг/мл хлорамфеникола, посева на чашки с питательным агаром и инкубации при 30°C в течение трех суток. Через трое суток споры смывали с чашек, очищали центрифугированием и ресуспендировали в PBS в количестве 1×108 к.о.е./мл.
[001048] Растения кукурузы, выращиваемые в течение трех недель, на стадии V5 выращивали при идеальном освещении с использованием ламп T5, 54 ватта, и подвергали воздействию 13 часов света в сутки в условиях контролируемой температуры 15,5-25,5°C. Растения поливали до насыщения каждые трое суток в ходе испытания. По мере достижения растениями V5 споры BEMD или положительные контрольные химические вещества распыляли на листья либо в количестве 1×105 спор BEMD/мл, либо в рекомендованных количествах для химических реагентов. Всего 1 мл спрея наносили на каждое растение индивидуально. Высоту растений измеряли непосредственно перед нанесением внекорневых спреев. Затем растения кукурузы подвергали стрессовому воздействию путем нагревания до 32,2°C и уменьшения частоты полива до одного раза в неделю. Растения держали в стрессовых условиях в течение двух недель. В конце двух недель высоту растений вновь измеряли и оценивали внешний вид. В этих стрессовых условиях рост растений был минимальным в случае контрольной обработки. Способность продолжать рост в стрессовых условиях определяли по увеличению высоты растений в течение двух недель по сравнению с контролем, обработанным только водой. Результаты представлены в таблице 43 ниже.
ТАБЛИЦА 43
[001049] Несколько уменьшающих стрессовое воздействие ферментов вносили на кукурузу с использованием системы BEMD, как показано в таблице 43 выше. Контрольные споры не имели выраженного эффекта (снижение высоты растения -1,6%). Фермент хитозаназа из BEMD имел положительный эффект, когда его комбинировали с субстратом хитозаном. Двумя ферментами с наилучшей эффективностью были β-1,3-глюканаза из BEMD и супероксиддисмутаза из BEMD. β-1,3-глюканаз из BEMD имела в основном противогрибковую активность, но также могла иметь прямой эффект на растения. Салициловая кислота и BTH представляли собой положительные контроли для внекорневого анализа и положительный ответ наблюдали для обоих из них. Этот способ внекорневой доставки можно использовать для доставки ферментов, уменьшающих стрессовое воздействие, на растение в различные периоды сезона.
Пример 39. Уровни экспрессии слитых белков с использованием различных промоторов, содержащих сигма-K
[001050] Как показано в примере 23 выше, замена нативного промотора нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория может значительно влиять на уровень слитого белка, экспрессируемого на экзоспории спор представителя семейства Bacillus cereus. Например, замена нативного промотора BclA промотором BclB значительно снижает уровень слитого белка на поверхности спор представителя семейства Bacillus cereus. Альтернативно замена нативного промотора BclB промотором BclA значительно увеличивает уровни слитого белка на экзоспории.
[001051] Относительные уровни экспрессии различных белков экзоспория под контролем их нативных промоторов споруляции получали из данных микроматриц от Bergman et al., 2008. Относительные уровни экспрессии определяли во время поздней споруляции (300 минут после начала эксперимента), когда промоторы сигма-K являются наиболее активными. Промоторы сигма-K являются ключевыми промоторами для экспрессии генов, локализованных в экзоспории, и ассоциированных с ними белков. Относительная экспрессия представляет собой увеличение уровня экспрессии гена по сравнению со средним значением для всех других генов хромосомы во все данные моменты времени. В таблице 44 ниже показаны относительные уровни экспрессии различных генов, контролируемых сигма K, в представителях семейства Bacillus cereus.
ТАБЛИЦА 44
Пример 40. Получение и исследование спор BEMD, экспрессирующих слитый белок, содержащий синтазу оксида азота, и применение таких спор для стимуляции прорастания семян растений
[001052] Получали споры BEMD, экспрессирующие слитый белок, содержащий аминокислоты 20-35 BclA, линкер из 6 остатков аланина и фермент синтазу оксида азота из Bacillus subtilis 168. Ген фермент синтаза оксида азота (NOS) из Bacillus subtilis 168 синтезировали в слитой конструкции с промотором BclA, участком связывания рибосом (RBS), инициирующим кодоном и аминокислотами 20-35 BclA. Линкерную область из шести остатков аланина включали для отделения нацеливающей последовательности BclA от фрагментов NOS. Аминокислотные последовательности этих слитых белков, включая метионин, кодируемый инициирующим кодоном BclA, аминокислоты 20-35 BclA, линкер из шести аминокислот и фермент NOS, представлены выше в таблице 9. Эти клоны субклонировали в челночный вектор pHP13 посредством расщепления XhoI и лигирования в участок SalI pHP13. Правильные конструкции, которые были отсеквенированы и подтверждены, трансформировали в клетки E. coli. Полученные плазмиды трансформировали в Bacillus thuringiensis BT013A и Bacillus mycoides EE155.
[001053] Затем рекомбинантные Bacillus thuringiensis BT013A и Bacillus mycoides EE155, трансформированные плазмидами, кодирующими слитые белки NOS, индуцировали к споруляции путем снятия бактерий на чашки с питательным агаром и инкубации чашек при 30°C в течение 72 часов. Через 72 часа бактериальные споры собирали с чашки путем снятия в стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) и очищали посредством центрифугирования в градиенте плотности три раза.
[001054] Затем споры наносили на коммерческие гибридные семена кукурузы и семена сои в количестве 1×105 спор/семя. Гибридный сорт сои представлял собой BECK 335NR, который содержит ген защиты от цистообразующих нематод, ген резистентности к глифосату ROUNDUP READY и K-ген для резистентности к Phytophthora. Гибридный сорт кукурузы представлял собой BECK 5540RR, который содержит ген резистентности к глифосату ROUNDUP READY. Затем семена слегка обсыпали L-аргинином. Контрольный набор семян обсыпали L-аргинином, но без спор. Затем семена помещали между двумя бумажными полотенцами, которые затем смачивали 25 мл H2O. Затем бумажные полотенца скручивали, помещали в небольшой мешок для сэндвичей и плотно закрывали. Затем эти мешки помещали в инкубатор при 30°C, и им позволяли прорастать в течение 24 или 48 часов. Количество семян, проросших в каждый момент времени, измеряли и результаты сравнивали с необработанными и контрольными семенами. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 45 и 46 ниже.
Таблица 45. Увеличение уровня прорастания гибридных семян сои, обработанных спорами рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующих слитый белок, содержащий синтазу оксида азота
Таблица 46. Увеличение уровня прорастания гибридных семян кукурузы, обработанных спорами рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, экспрессирующими слитый белок, содержащий синтазу оксида азота
[001055] Как можно видеть из таблиц 45 и 46, обработка семян L-аргинином и рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, экспрессирующим слитый белок, содержащий фермент синтазу оксида азота, приводила к увеличению количества проросших семян как сои, так и кукурузы.
Пример 41. Получение и исследование спор BEMD, экспрессирующих слитый белок, содержащий связывающие нуклеиновую кислоту белки
[001056] Получали споры BEMD, экспрессирующие слитый белок, содержащий аминокислоты 20-35 BclA, линкер из восьми остатков аланина и неспецифический ДНК-связывающий белок SASPα из Bacillus subtilis 168 или неспецифический ДНК-связывающий белок SASPγ из Bacillus subtilis 168. ДНК, кодирующую ген SASPα и SASPγ, синтезировали в рамке считывания с промотором BclA, RBS, инициирующим кодоном BclA и аминокислотами 20-35 BclA. Между нацеливающей последовательностью BclA и РНК/ДНК-связывающими белками включали линкерную область из восьми остатков аланина. Линкер обеспечивает более высокую подвижность и укладку слитых белков. Аминокислотные последовательности этих слитых белков, включая метионин, кодируемый инициирующим кодоном BclA, аминокислоты 20-35 BclA, линкер из восьми аминокислот и белок SASPα или SASPγ, представлены выше в таблице 11. Синтезированные гены расщепляли XhoI и лигировали в участок SalI pHP13 с получением плазмид pHP13-BclA20-35-SASPα и pHP13-BclA20-25-SASPγ. pHP13 представляет собой хорошо охарактеризованную челночную векторную плазмиду размером 5,5 т.п.н., имеющую кассеты резистентности к хлорамфениколу и эритромицину. Ее конструировали путем лигирования плазмид pE194, pC194 и pUC9.
[001057] Правильные клоны подвергали секвенированию ДНК и трансформировали в штамм SCS110 E. coli. Затем плазмидную ДНК очищали и трансформировали в Bacillus thuringiensis BT013A. Затем эти бактерии индуцировали к споруляции путем снятия на чашки с питательным агаром на 72 часов при 30°C. Споры собирали и очищали, как описано выше в непосредственно предшествующем примере.
[001058] Затем для оценки способности рекомбинантных спор связывать нуклеиновые кислоты, рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, трансформированные плазмидами, кодирующими слитые белки SASPα и SASPγ, инкубировали в PBS со случайными ДНК-праймерами, которые содержали флуоресцеиновую метку на 5ʹ-конце. Также в эксперимент включали контроль с использованием нерекомбинантных спор. Споры инкубировали в течение десяти минут с 50 мМ меченной ДНК, а затем промывали центрифугированием в течение одной минуты при 10000 об./мин. Супернатант удаляли и споры ресуспендировали в 1 мл PBS. Споры вновь осаждали и супернатант удаляли после центрифугирования, а затем их подвергали анализу. Споры, обработанные меченной флуоресцеином ДНК, исследовали под флуоресцентным микроскопом E600 Nikon и связывание ДНК определяли по изменению общей флуоресценции по сравнению с контрольными спорами, которые не содержали ДНК-связывающие слитые белки. Результаты этого анализа представлены в таблице 47 ниже.
Таблица 47. Связывание ДНК со спорами рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующими слитый белок, содержащий ДНК-связывающий белок
[001059] Кроме того, на фиг.3 представлено связывание ДНК со спорами при измерении по связыванию меченной флуоресцеином ДНК. На фиг.3, "контроль" относится к нерекомбинантным спорам B. thuringiensis BT013A (нерекомбинантные), "SASPa" относится к спорам B. thuringiensis BT013A, экспрессирующим слитый белок BclA-SASPα, и SASPc относится к спорам B. thuringiensis BT013A, экспрессирующим слитый белок BclA-SASPγ.
[001060] Как видно из данных, показанных в таблице 47 и на фиг.3, споры, экспрессирующие слитые белки SASPα или SASPγ, связывали значительно более высокое количество ДНК, чем нерекомбинантные споры, демонстрируя высокую аффинность этих спор к ДНК.
Пример 42. Получение и исследование спор BEMD, экспрессирующих слитый белок, содержащий нуклеазу
[001061] В дополнение к неспецифическим ДНК- и РНК-связывающим белкам, описанным выше непосредственно в предшествующем примере, также для связывания и расщепления молекул нуклеиновых кислот можно использовать нуклеазы. Споры BEMD, экспрессирующие слитый белок, содержащий аминокислоты 20-35 BclA и фермент эндонуклеазу, получали и анализировали в отношении их способности связывать и расщеплять ДНК.
[001062] Эндонуклеазу 1 Bacillus subtilis подвергали ПЦР-амплификации и слиянию в рамке считывания с промотором BclA, RBS, инициирующим кодоном и аминокислотами 20-35 BclA. Затем эту конструкцию клонировали в плазмиду pHP13 с получением плазмиды pHP13-BclA20-35-эндонуклеаза. Эту конструкцию секвенировали, и ее трансформировали и увеличивали в количестве в E. coli. Затем из E. coli выделяли плазмидную ДНК и вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры получали и очищали, как описано в примере 40 выше.
[001063] Эндонуклеазную активность анализировали посредством инкубации рекомбинантных спор, экспрессирующих слитый белок эндонуклеазы, и нерекомбинантных контрольных спор в PBS в концентрации 1×108 спор/мл в PBS с 300 нг ДНК спермы лосося и 1 мкг/мл красителя для ДНК DAPI (4ʹ,6-диамидино-2-фенилиндол). Реакции позволяли протекать в течение 10 минут при 37°C. Через 10 минут супернатант анализировали в отношении расщепленной ДНК с использованием флуориметра. По мере расщепления ДНК краситель DAPI высвобождается из индивидуальных высвободившихся нуклеотидов, и, таким образом, расщепление можно определять по снижению окрашивания DAPI с течением времени. Результаты этого анализа представлены в таблице 48 ниже.
Таблица 48. Нуклеазная активность и связывание ДНК спорами BEMD, экспрессирующими слитый белок эндонуклеазы
[001064] Данные, предоставленные выше в таблице 48, демонстрируют, что слитый белок эндонуклеазы экспрессировался на экзоспории спор Bacillus thuringiensis BT013A и был способен расщеплять ДНК спермы лосося, о чем свидетельствует снижение сигнала DAPI в супернатанте. Неожиданно часть эндонуклеазы прочно связывала ДНК без ее расщепления, сохраняя флуоресцентный сигнал DAPI на спорах, даже после промывания спор для удаления избытка ДНК. Это демонстрирует, что не вся ДНК процессировалась, и что нуклеазы, экспрессированные снаружи споры, могут прочно связывать ДНК. Для увеличения этого эффекта в слитом белке можно использовать нуклеазу, имеющую инактивированный активный центр, которая может привести к меньшему расщеплению ДНК и еще большему связыванию ДНК на спорах.
Пример 43. Сельскохозяйственное применение спор, экспрессирующих слитые белки, содержащие связывающие нуклеиновую кислоту белки или пептиды
[001065] Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus или рекомбинантные спорообразующие бактерии, экспрессирующие слитые белки, содержащие связывающие нуклеиновую кислоту белки или пептиды, можно использовать в сельском хозяйстве для доставки нуклеиновых кислот в среду для роста растений (например, почву) и/или в растения. Например, рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus или рекомбинантные спорообразующие бактерии можно доставлять в растения посредством обработки семян, при поливе борозды/почвы или внекорневой обработки. Более того, слитые белки, содержащие связывающие нуклеиновую кислоту белки или пептиды, можно экспрессировать в любом из эндофитных представителей семейства Bacillus cereus или любом из других эндофитных видов Bacillus, описанных в настоящем описании, позволяя доставку нуклеиновых кислот, связанных со связывающими нуклеиновых кислоту белками, внутрь растения где они являются более эффективными в отношении достижения их клеток-мишеней. Например, слитые белки, содержащие связывающие нуклеиновую кислоту белки, можно экспрессировать в эндофитном штамме представителя семейства Bacillus cereus EE349. Экспрессия другого слитого белка (содержащего эндоглюканазу в качестве представляющего интерес белка) в этом штамме описана в примере 51 настоящего описания ниже, демонстрирующем, что слитые белки, экспрессируемые в этом эндофитном штамме, доставляются внутрь растений. Таким образом, экспрессия слитых белков, содержащих SASPα, SASPγ, Hfq или нуклеазу, имеющую инактивированный активный центр, в эндофитных штаммах представителей семейства Bacillus cereus, таких как представитель семейства Bacillus cereus EE349, может обеспечить средство для доставки РНК и ДНК (например, РНК-i или рДНК) внутрь растения. Также для этой цели в слитых белках можно использовать другие неспецифические связывающие нуклеиновую кислоту белки.
Пример 44. Получение спор BEMD, которые экспрессируют слитый белок, а также сверхэкспрессируют белок, который модулирует экспрессию слитых белков
[001066] Сверхэкспрессия различных белков экзоспория (обозначаемых в настоящем описании как "белки-модуляторы") в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, экспрессирующем любой из слитых белков, описанных в настоящем описании, может модулировать (повышать или снижать) уровень экспрессии слитого белка. Эти белки-модуляторы включают ExsY, ExsFA/BxpB, CotY, CotO, ExsFB, InhA1, InhA2, ExsJ, ExsH, YjcA, YjcB, BclC, AcpC, InhA3, аланинрацемазу 1, аланинрацемазу 2, BclA, BclB, BxpB, BclE, BetA/BAS3290, CotE, ExsA, ExsK, ExsB, YabG, Tgl, супероксиддисмутазу 1 (SODA1) и супероксиддисмутазу 2 (SODA2).
[001067] Способность контролировать уровень экспрессии слитого белка позволяет контролировать количество представляющего интерес белка или пептида в слитом белке, которое экспонируется снаружи споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Например, когда представляющий интерес белок или пептид в слитом белке включает стимулирующий рост растений белок или пептид (например, фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений), рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, экспрессирующий слитый белок, продуцирует спору, которая при нанесении на семя, растение или добавлении в среду для роста растений имеет благоприятный эффект на растение вследствие действия стимулирующего рост растений белка или пептида. Модулирование уровня экспрессии слитого белка приводит к модулированию уровня представляющего интерес пептида белка, который экспонируется снаружи споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. В некоторых случаях является полезным увеличение уровня экспрессии слитого белка (например, когда является желательным увеличение экспрессии фермента и, тем самым, увеличение количества фермента на спору, которое может доставляться растению). В других случаях является полезным снижение уровня экспрессии слитого белка (например, когда является желательным снижение экспрессии белка и, тем самым, уменьшение количества белка на спору, которое доставляется в растение, например, когда высокие уровни белка имеют вредоносные эффекты на растение).
[001068] Для получения плазмид для экспрессии слитых белков в представителях семейства Bacillus cereus получали фрагменты ПЦР, которые содержали промотор BclA (SEQ ID NO: 85), инициирующий кодон и аминокислоты 20-35 BclA, слитые в рамке считывания либо с геном эндоглюканазы Bacillus subtilis 168, либо с геном β-галактозидазы из DH5α E. coli. Эти фрагменты ПЦР расщепляли XhoI и лигировали в участок SalI плазмиды pSUPER с получением плазмид pSUPER-BclA 20-35-эндоглюканаза и pSUPER-BclA 20-35-βgal, соответственно. Плазмиду pSUPER получали путем слияния плазмиды pUC57 (содержащей кассету резистентности к ампициллину) с плазмидой pBC16-1 из Bacillus (содержащей кассету резистентности к тетрациклинe). Эта плазмида размером 5,5 т.п.н. может реплицироваться как в E. coli, так и в Bacillus spp.
[001069] Плазмиды pSUPER-BclA 20-35-эндоглюканаза и pSUPER-BclA 20-35-βgal трансформировали и увеличивали в количестве в отрицательных по метилазе dam штаммах E. coli. Последовательности плазмид pSUPER-BclA 20-35-эндоглюканаза и pSUPER-BclA 20-35-βgal подтверждали секвенированием ДНК.
[001070] Плазмиды pSUPER-BclA 20-35-эндоглюканаза и pSUPER-BclA 20-35-βgal трансформировали в штаммы-хозяева Bacillus thuringiensis BT013A (для pSUPER-BclA 20-35-Endo) или Bacillus mycoides BT155 (pSUPER-BclA 20-35-βgal). Эти трансформированные штаммы экспрессировали либо фермент β-галактозидазу, либо фермент эндоглюканазу снаружи споры.
[001071] Для получения плазмид для сверхэкспрессии белков-модуляторов получали фрагменты ПЦР, содержавшие нативные промоторные области и гены, кодирующие ExsFA/BxpB, CotO, ExsFB, YjcB, BclC, AcpC, BclA, BclB, BxpB и CotE, расщепляли их SalI и лигировали в плазмиду pHP13. Нуклеотидные последовательности для нативных промоторных областей представлены выше в таблице 3. Плазмида pHP13 представляет собой многокопийную плазмиду и, таким образом, она приводит к высоким уровням экспрессии кодируемых белков-модуляторов, когда плазмиды трансформируют в клетку-хозяина, являющуюся представителем семейства Bacillus cereus. Плазмиды pHP13, содержащие промоторые области и гены, кодирующие ExsFA/BxpB, CotO, ExsFB, YjcB, BclC, AcpC, BclA, BclB, BxpB, BclE, BetA/BAS3290 и CotE, обозначают в настоящем описании как pHP13-ExsFA/BxpB, pHP13-CotO, pHP13-ExsFB, pHP13-YjcB, pHP13-BclC, pHP13-AcpC, pHP13-BclA, pHP13-BclB, pHP13-BxpB и pHP13-CotE, соответственно.
[001072] Плазмиды pHP13, содержащие промоторные области и гены, кодирующие белки-модуляторы, трансформировали и увеличивали в количестве в штаммах E. coli. Последовательности этих плазмид подтверждали секвенированием ДНК.
[001073] Плазмиды pHP13, кодирующие белки-модуляторы, трансформировали в Bacillus thuringiensis BT013A, содержащие pSUPER-BclA 20-35-эндоглюканазу, или Bacillus mycoides BT155, содержащие pSUPER-BclA 20-35-βgal. Полученные рекомбинантные бактерии высевали на чашки с питательным агаром, содержавшие 10 мкг/мл хлорамфеникола, для селекции плазмиды pHP13 и 10 мкг/мл тетрациклина для селекции плазмид pSUPER. Затем бактерии, содержавшие обе плазмиды, выращивали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой в течение ночи как с тетрациклином, так и с хлорамфениколом. Затем ночные культуры снимали на питательный агар и бактериям позволяли спорулировать при 30°C в течение 72 часов. Через 72 часа бактериальные споры собирали с чашки путем снятия в стерильный PBS и их очищали центрифугированием в градиенте плотности три раза. Затем чистые споры разбавляли до 1×108 к.о.е./мл и анализировали в отношении ферментативной активности с использованием популяции из 1×108 колониеобразующих единиц (к.о.е.).
Пример 45. Увеличенная или уменьшенная экспрессия слитых белков на системе BEMD посредством сверхэкспрессии белка, который модулирует экспрессию слитой конструкции
[001074] Рекомбинантные споры Bacillus mycoides EE155, полученные, как описано выше в предыдущем примере, анализировали в отношении активности β-галактозидазы, и рекомбинантные споры Bacillus thuringiensis BT013A, полученные, как как описано выше в предыдущем примере, анализировали в отношении активности эндоглюканазы.
[001075] Активность β-галактозидазы анализировали путем измерения гидролиза хромогенного субстрата орто-нитрофенил-β-галактозида (ONPG). Для получения стандартов использовали коммерческий источник β-галактозидазы (0,2 мкг, 0,4 мкг и 0,8 мкг из исходного раствора 100 мкг/мл). 250 мкл препарата спор осаждали и споры ресуспендировали в 50 мкл буфера для разбавления фермента (10 мМ TRIS, pH 7,6, 0,2 M NaCl2, 5% глицерин). К каждому образцу и к стандарту добавляли 600 мкл предварительно нагретой до 37°C смеси субстратов (10 мМ KCl,1 мМ MgSO4×7 H2O, 100 мМ NaH2PO4, pH 7,5), содержавшей 1,14 мг/мл ONPG. Каждую реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 минут. Для остановки реакции добавляли 250 мкл 1 M карбоната натрия. Раствор центрифугировали в течение 5 мин при 14000×g для удаления спор для считывания поглощения. Поглощение определяли при 420 нм с использованием наноспектрофотометра IMPLEN модели P330. Образцы анализировали в трех экземплярах с пустым образцом для каждой реакции. Результаты этого анализа представлены ниже в таблице 49.
Таблица 49. Эффекты сверхэкспрессии белков экзоспория на уровни экспрессии BclA 20-35-βgal
[001076] Как можно видеть из результатов, представленных в таблице 49, сверхэкспрессия CotO, CotE, BclA, BclB и BxpB увеличивала экспрессию слитого белка, содержащего β-галактозидазу, что приводило к увеличенной активности фермента на спорах. Напротив, сверхэкспрессия YjcB или AcpC снижала экспрессию слитого белка, содержащего β-галактозидазу, что приводило к сниженной активности фермента на спорах.
[001077] Анализ активности эндоглюканазы проводили путем определения целлюлазной активности с использованием субстрата карбоксиметилцеллюлозы (CMC) и динитросалициловой кислоты (реагент DNS). Коммерческий источник фермента целлюлазы использовали для получения стандартов в 50 мМ цитратном буфере, pH 4,8. 1% CMC (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы) получали в 50 мМ цитратном буфере, pH 4,8, чтобы она служила в качестве субстрата для реакции. 250 мкл препарата спор осаждали и споры ресуспендировали в 150 мл 50 мМ цитратного буфера, pH 4,8. Реакцию проводили с помощью реагента, состоявшего из 1% DNS, 1% NaOH, 0,05% Na2SO4, 0,2% фенола и 18,2% сегнетовой соли. 150 мкл образца смешивали с 250 мкл субстрата 1% CMC и инкубировали на водяной бане при 50°C в течение 15 минут. Добавляли 300 мкл реагента DNS и образцы кипятили при 100°C в течение 10 минут, а затем охлаждали на льду. Раствор центрифугировали в течение 5 минут при 14000×g для удаления спор для считывания поглощения. Поглощение определяли при 540 нм с использованием наноспектрофотометра IMPLEN модели P330. Образцы анализировали в трех экземплярах с пустым образцом для каждой реакции. Результаты этого анализа представлены в таблице 50 ниже.
Таблица 50. Эффекты сверхэкспрессии белков экзоспория на уровни экспрессии BclA 20-35-эндоглюканазы
[001078] Как показано в таблице 50, сверхэкспрессия CotO, CotE, BclB и BxpB увеличивала экспрессию слитого белка, содержащего эндоглюканазу, что приводило к увеличенной активности фермента на спорах. Сверхэкспрессия YjcB, AcpC или BclC, с другой стороны, снижала экспрессию слитого белка, что приводило к сниженной активности фермента на спорах.
[001079] В совокупности, сверхэкспрессия CotO, CotE, BclB или BxpB увеличивала экспрессию обоих слитых белков, что приводило к увеличенной активности как β-галактозидазы, так и эндоглюканазы, на спорах, экспрессирующих слитые белки BclA 20-35-βgal или BclA 20-35-эндоглюканаза, соответственно. Сверхэкспрессия YjcB или AcpC, с другой стороны, снижала экспрессию обоих слитых белков, что приводило к сниженной активности β-галактозидазы и эндоглюканазы на спорах, экспрессирующих слитые белки BclA 20-35-βgal или BclA 20-35-эндоглюканаза, соответственно. Сверхэкспрессия BclC и BclA20-35, меченных eGFP, также снижала экспрессию слитого белка BclA 20-35-эндоглюканаза, в то время как сверхэкспресcия BclA повышала экспрессию слитого белка BclA 20-35-βgal.
Пример 46. Эффекты спор BEMD, экспрессирующих слитый белок и сверхэкспрессирующих белок-модулятор, на рост кукурузы
[001080] Нанесение рекомбинантных спор Bacillus thuringiensis BT103A и Bacillus mycoides BT155, экспрессирующих слитый белок, содержащий эндоглюканазу Bacillus subtilis 168, на кукурузу приводит к увеличению мощности проростков и ростового ответа в течение двух недель. Изменение уровня экспрессии слитого белка, содержащего эндоглюканазу, индуцированное сверхэкспрессией белка-модулятора в таких спорах, как описано выше в предыдущем примере, приводит к соответствующим изменениям эффектов спор BEMD на рост кукурузы.
[001081] Для демонстрации этого pSUPER-BclA 20-35-эндоглюканазу и pHP13-CotO или pHP13-BclB совместно экспрессировали в Bacillus thuringiensis BT013A. Споры получали на питательном агаре, как описано выше в примере 40. Споры разбавляли до концентрации 1×104 спор/50 мл воды, и 50 мл воды добавляли к коммерческому гибридному семени кукурузы в горшечной смеси при посеве. Гибридный сорт кукурузы представлял собой BECK 5540RR, который содержит ген резистентности к глифосату ROUNDUP READY. Семена кукурузы покрывали фунгицидом и биологическим инокулятом.
[001082] Растения выращивали под искусственным освещением в течение 14 часов в сутки и определяли рост растения в течение периода, составлявшего десять суток. В ходе эксперимента растения поливали каждые трое суток. Через десять суток измеряли высоту растений и ее нормализовывали к высоте необработанных растений кукурузы. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 51 ниже.
Таблица 51. Эффекты спор BEMD, экспрессирующих слитый белок, содержащий эндоглюканазу, и сверхэкспрессирующих белок-модулятор, на рост гибридной кукурузы
[001083] Как показано в таблице 51, сверхэкспресия белков экзоспория CotO и BclB усиливала эффекты слитого белка BclA 20-35-эндоглюканаза на рост и мощность проростков кукурузы через 10 суток. Эти эффекты коррелируют с уровнями экспрессии слитого белка в спорах BEMD, экспрессирующих BclA 20-35-эндоглюканазу и pHP13-CotO или pHP13-BclB, что указывает на то, что изменение уровней экспрессии слитых белов белками-модуляторами обуславливает эффекты на рост и мощность проростков.
Пример 47. Генетическая инактивация представителей семейства Bacillus cereus и применение таких инактивированных представителей семейства Bacillus cereus для экспрессии слитых белков
[001084] Как описано выше, сверхэкспрессия протеазы прорастания споры (GPR) в ее активной форме в проспоре представителя семейства Bacillus cereus в ходе споруляции приводит к протеолитическому расщеплению белков в проспоре и инактивации споры. Аналогично, сверхэкспрессия неспецифической эндонуклеазы в проспоре в ходе споруляции разрушает ДНК в споре, что приводит к доле инактивированных частиц спор в популяции спор.
[001085] Получали плазмиду, кодирующую неспецифическую эндонуклеазу под контролем промотора сигма G. Ген неспецифической эндонуклеазы 1 из Bacillus subtilis 168 и промотор сигма G (SEQ ID NO: 235) синтезировали и лигировали в плазмиду pHP13 с использованием участка SalI с получением плазмиды pHP13-SigG-нуклеаза. Правильные клоны секвенировали и трансформировали и увеличивали в количестве в клетках E. coli. Плазмидную ДНК выделяли из клеток E. coli и трансформировали в Bacillus thuringiensis BT013A. Правильные клоны подтверждали с помощью ПЦР. Аминокислотная последовательность для эндонуклеазы 1 Bacillus subtilis 168 представлена выше в таблице 4.
[001086] Клетки Bacillus thuringiensis BT013A, экспрессирующие эндонуклеазу сигма G, получали и очищали на чашках с питательным агаром, как описано выше в примере 40. Споры визуально подсчитывали с использованием гемоцитометра, разбавляли и высевали разбавленными на чашки с питательным агаром. Соотношение живых спор к убитым спорам вычисляли путем определения изменения от визуально подсчитанного количества к количеству на чашке. В каждый анализ включали контрольные споры (необработанные). Кроме того, 1×108 спор обрабатывали УФ-излучением в течение 10 минут с использованием ручной УФ-лампы, и анализ повторяли. Подсчитанное визуально количество и количество на чашке вновь сравнивали для оценки гибели спор. Результаты этих анализов представлены в таблице 52 ниже.
Таблица 52. Жизнеспособность спор представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего неспецифическую нуклеазу под контролем промотора сигма G
[001087] Как можно видеть из таблицы 52, экспрессия эндонуклеазы 1 под контролем промотора сигма G снижала жизнеспособность клеток приблизительно на 30% в спорах, которые не были подвергнуты облучению УФ-излучением, и приблизительно на 75% в спорах, которые были подвергнуты облучению УФ-излучением.
[001088] Можно ожидать, что совместная экспрессия как протеазы прорастания спор, так и неспецифической эндонуклеазы, под контролем промоторов сигма G, далее снизит жизнеспособность спор.
Пример 48. Получение фрагментов экзоспория из рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, имеющих нокаут гена CotE
[001089] Конструировали плазмиду pUCpE, которая содержала остов плазмиды pUC19, способной реплицироваться в E. coli, а также ориджин репликации кассеты устойчивости к эритромицину из pE194. Эта конструкция способна реплицироваться как в E. coli, так и в Bacillus spp. Область ДНК размером 1 т.п.н., которая соответствовала вышележащей области гена CotE, и область размером 1 т.п.н., которая соответствовала нижележащей области гена CotE, амплифицировали способом ПЦР из Bacillus anthracis ΔSterne. Затем две области размером 1 т.п.н. сплайсировали с использованием сплайсинга путем перекрывающегося удлинения посредством гомологичных выступающих концов размером 15 п.н., которые соответствовали противоположным ПЦР-ампликонам. Этот фрагмент размером 2 т.п.н. расщепляли XhoI (во внешних праймерах) и лигировали в участок SalI pUCpE. Плазмидную конструкцию подтверждали посредством расщепления и секвенирования ДНК. Ген омега резистентности грамположительных бактерий к канамицину расщепляли BamHI и помещали между двумя областями размером 1 т.п.н. Конечную конструкцию вновь подтверждали способом ПЦР и секвенировали, и конечную плазмиду вводили в Bacillus anthracis ΔSterne. Правильные клоны подвергали скринингу на резистентность как эритромицину, так и к канамицину.
[001090] Клоны пассировали при высокой температуре (40°C) в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой в присутствии канамицина (25 мкг/мл) и стандартным образом отбирали для выделения на чашки с агаром LB, содержавшим канамицин, и выращивали при 30°C. Индивидуальные колонии отбирали зубочисткой на чашки с агаром LB, содержавшим 5 мкг/мл эритромицина, и выращивали при 30°C. Клоны, которые сохраняли резистентность к канамицину, но утрачивали резистентность к эритромицину (что означало утрату плазмиды, но рекомбинацию и удаление гена CotE), выращивали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой плюс канамицин, и выделяли хромосомную ДНК с использованием набора для выделения хромосомной ДНК Qiagen. Надлежащее удаление гена CotE определяли амплификацией способом ПЦР области гена CotE и по утрате CotE и приобретению кассеты резистентности к канамицину.
[001091] Получали конструкцию (pHP13-AcpC-eGFP), которая кодировала белок экзоспория ApcC (кислая фосфатаза), слитый в рамке считывания с флуоресцентным репортерным белком eGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок). Конструкция pHP13-ApcC-eGFP включала нативный промотор ApcC, участок связывания рибосомы и кодирующую последовательность для ApcC (из B. anthracis ΔSterne), слитую в рамке считывания с eGFP (из pGFPuv). Эту конструкцию получали амплификацией способом ПЦР индивидуальных генов AcpC и eGFP с соответствующими праймерами, которые содержали перекрывающую область размером 15 п.н., соответствующую последовательным ампликонам. Затем два ПЦР-ампликона очищали и комбинировали во второй реакции ПЦР с использованием внешних праймеров, которые содержали участки XhoI. Два ампликона служили затравками друг для друга посредством их совместимых концов и образовывали слитые ампликоны ПЦР, которые очищали и расщепляли XhoI в течение 1 часа при 37°C. Сплайсированный продукт ПЦР клонировали в участок SalI pHP13, и для правильных клонов подтверждали последовательности и их трансформировали в SCS110 E. coli. Затем плазмидную ДНК выделяли из E. coli и вводили в B. anthracis ΔSterne CotE::Kan, полученные, как описано выше, которые выращивали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой, содержавшем 10 мкг/мл хлорамфеникола, в течение ночи при 30°C. Один миллилитр этой культуры инокулировали в питательный бульон (50 мл) в колбе с дефлектором и выращивали при 30°C в течение 3 суток. Споры собирали центрифугированием при 10000×g в течение 5 минут, и супернатант (содержавший разрушенные фрагменты экзоспория) фильтровали через мембранный фильтр с пороговым значением 100000 Да с получением очищенных фрагментов экзоспория, содержавших слитые белки.
[001092] Фотография, полученная с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, демонстрирующая споры с нокаутом CotE, представлена на фиг.4. Закрашенными стрелками указаны фрагменты экзоспория, которые отделены от спор, и незакрашенными стрелками указаны споры, из которых был удален экзоспорий.
[001093] Очистку фрагментов экзоспория проводили следующим образом: споры CotE::kan выращивали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой в течение ночи при 30°C и снимали на чашки с питательным агаром и выращивали при 30°C в течение 3 суток. Через 3 суток споры собирали путем снятия с чашек хлопковыми валиками, смоченными PBS, и ресуспендировали в 1 мл PBS в микроцентрифужной пробирке. Споры отделяли от культуры посредством центрифугирования и супернатант, содержавший фрагменты экзоспория, фильтровали через 0,22-мкм фильтр для удаления каких-либо остаточных спор. Затем фильтрат фильтровали через фильтр c пороговым значением 100 кДа для сбора фрагментов экзоспория, однако позволяли свободным белкам проходить через фильтр. Фильтр с пороговым значением 100 кДа промывали и собранные фрагменты экзоспория кипятили в буфере SDS в течение 5 минут и разделяли посредством SDS-PAGE электрофореза. На фиг.5 представлена фотография геля SDS-PAGE, демонстрирующая очищенные фрагменты экзоспория (дорожка 2) и стандартный белковый маркер (дорожка 1). Фрагменты экзоспория, показанные на дорожке 2, соответствуют индивидуальным белкам, которые составляют фрагменты экзоспория. Является видимой только подгруппа полос, которые обычно наблюдали в препарате SDS-PAGE с целыми спорами.
[001094] Десять микролитров препарата фрагмента экзоспория, содержавшего слитый белок AcpC-eGFP, исследовали в анализе фосфатазы в отношении активности против pNPP (п-нитрофенилполифосфат). Активность кислой фосфатазы выявляли с помощью спектрофотометрии на основе высвобождения п-нитрофенола из фосфата посредством фосфатазной активности. В кратком изложении, 1 мл 10 мМ pNPP в фосфатном буфере при pH 6,0 инкубировали с фргаментами экзоспория в 1-мл микроцентрифужной пробирке и позволяли им инкубироваться при 37°C в течение 10 минут. Через 10 минут пробирку центрифугировали в течение 1 минуты для удаления избытка спор, и проводили считывание супернатанта на спектрофотометре при 420 нм в отношении свободного п-нитрофенола. Было обнаружено, что очищенные фрагменты экзоспория были способны эффективно высвобождать фосфатные группы из pNPP, демонстрируя, что ApcC присутствовала на фрагментах экзоспория. Результаты этого анализа представлены на фиг.6. На фиг.6, "контрольные споры CotE" относятся к спорам с нокаутам CotE отдельно (не экспрессирующие слитый белок AcpC-eGFP), "CotE Acp-eGFP" относится к спорам с нокаутом CotE, экспрессирующим слитый белок AcpC-eGFP, и "фрагменты CotE AcpC-eGFP" относятся к фрагментам экзоспория, полученным, как описано выше, из спор с нокаутом CotE, экспрессирующих слитый белок AcpC-eGFP.
[001095] Эти результаты демонстрируют, что разрушение экзоспория, такое как мутация с нокатом гена CotE, можно использовать для получения фрагментов экзоспория, которые по существу свободны от спор, и демонстрируют, что этих фрагменты экзоспория содержат слитые белки, которые нацелены на экзоспорий.
Пример 49. Экспрессия слитых белков в рекомбинантных представителях семейства Bacillus cereus, которые способны деградировать гербициды, и применение таких рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus для стимуляции роста растений
[001096] Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, экспрессирующие слитые белки, могут иметь выраженные эффекты на здоровье и рост растений, как проиллюстрировано, например, в примерах 1-4, 7, 9, 11, 33, 36, 37 и 38 выше. Слитые белки, содержащие нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, описанные в настоящем описании, можно использовать в ряде различных видов и штаммов семейства Bacillus cereus, которое включает Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis и Bacillus toyoiensis. Многие представители семейства Bacillus cereus мощно деградируют органический и неорганический материал в окружающей среде, и некоторые представители семейства Bacillus cereus обладают способностью деградировать гербициды. Экспрессия слитых белков в таких штаммах является преимущественной, поскольку это может обеспечить активность деградации гербицида, тем самым, смягчая стрессовое воздействие на растения, которое может быть вызвано применением гербицидов, в дополнение к способности стимулировать рост растений и обеспечивать другую пользу для здоровья растений, в зависимости от представляющего интерес пептида или белка, выбранного для включения в слитый белок.
[001097] Представитель семейства Bacillus cereus EE349 выделяли, идентифицировали и охарактеризовывали, как описано выше в примере 25, и было обнаружено, что он обладает способностью стимулировать рост растений. Кроме того, было обнаружено, что этот штамм обладает способностью деградировать множество гербицидов, включая соединения сульфонилмочевины и арилтриазины.
[001098] Для демонстрации способности представителя семейства Bacillus cereus EE349 деградировать гербициды, 1×105 спор представителя семейства Bacillus cereus EE349 наносили на чечевицу, посеянную в почву, содержавшую различные концентрации сульфентразона. Семенам позволяли расти при 24°C в течение 3 недель с циклом 13 часов день/ночь с поливом каждые 3 сутки. Через 3 недели проводили измерение растений в отношении роста корней. Контрольный набор семян без представителя семейства Bacillus cereus EE349 высевали в идентичных условиях.
[001099] Результаты этого эксперимента можно видеть на фиг.7. На фиг.7, "защищенные" относится к семенам, обработанным представителем семейства Bacillus cereus EE349, и "незащищенные" относится к необработанным семенам. На оси y представлена длина корня, нормализованная к длине корня контроля, обработанного только водой. На фиг.7 показано, что по мере увеличения концентрации гербицида ингибирование роста корней также увеличивалось. Однако нанесение представителя семейства Bacillus cereus EE349 на семена смягчало значительную часть этого ингибирования, даже при полной концентрации гербицида в почве. Таким образом, как можно видеть из фиг.7, представитель семейства Bacillus cereus EE349 может действовать как антидот.
[001100] Более того, способность представителя семейства Bacillus cereus EE349 экспрессировать слитые белки продемонстрирована в примере 51 ниже. Таким образом, представителя семейства Bacillus cereus EE349 можно использовать в качестве антидота двойного назначения и хозяина для экспрессии слитых белков, содержащих нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий.
Пример 50. Получение рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus, которые сверхэкспрессируют ферменты экзоспория, и эффекты таких рекомбинантных представителей семейства Bacillus cereus на растения
[001101] Экзоспорий представителей семейства Bacillus cereus естественным образом содержит различные природные ферменты, которые могут иметь полезные эффекты на растения. Например, экзоспорий представителей семейства Bacillus cereus содержит ферменты, вовлеченные в солюбилизацию питательных веществ (например, кислые фосфатазы, такие как AcpC), инозинуридингидролазы, протеазы (например, метталопротеиназы, такие как InhA1, InhA2 и InhA3), ферменты, которые катализируют деградацию свободных радикалов (например, супероксиддисмутазы, такие как SODA1 и SODA2), аргиназы и аланинрацемазы. Сверхэкспрессия таких ферментов в представителях семейства Bacillus cereus может обеспечить рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который будет иметь полезные эффекты при внесении на семена, растения, в среду для роста растений или в область, окружающую растение или семя растения.
[001102] Металлопротеиназы InhA2 и InhA3, кислую фосфатазу (AcpC) и супероксиддисмутазу 1 и 2 амплифицировали способом ПЦР с их нативными промоторами с помощью праймеров, которые содержали участки XhoI (аминокислотные последовательности для InhA2, InhA3, AcpC, SODA1 и SODA 2 представлены выше в таблицах 1 и 2, и нуклеотидные последовательности для нативных промоторов для этих белков представлены в таблице 3). Продукты ПЦР расщепляли XhoI и клонировали в челночный вектор E. coli/Bacillus pHP13 через их участок SalI. Правильные клоны подтверждали способом ПЦР и секвенированием ДНК. Плазмиды вводили в Bacillus thuringiensis BT013A и Bacillus mycoides EE155. Правильные клоны подвергали скринингу путем посева на чашки с агаром LB, содержавшим хлорамфеникол. Ночные культуры правильных клонов выращивали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой, содержавшем хлорамфеникол, и 1 мл этой ночной культуры инокулировали в 50 мл питательного бульона и культивировали в течение 3 суток при 30°C. Споруляцию подтверждали посредством световой микроскопии. Затем споры подвергали ферментативным анализам.
[001103] Споры Bacillus mycoides EE155, сверхэкспрессирующие AcpC (т.е. споры, содержащие плазмиду pHP13-AcpC (кислая фосфатаза)) анализировали в отношении активности фосфатазы. Один миллилитр культуры для споруляции осаждали и осадок ресуспендировали в 1 мл PBS, и исследовали в анализе фосфатазы в отношении активности против pNPP (п-нитрофенилполифосфат), как описано выше в примере 48. Сверхэкспрессирующие AcpC споры имели значительно более высокую активность фосфатазы, как проиллюстрировано на фиг.8. На фиг.8, на оси y показаны единицы фосфатазной активности, определенные по высвобождению п-нитрофенола.
[001104] Увеличенная активность кислой фосфатазы, наблюдаемая для спор Bacillus mycoides EE155, модифицированных для сверхэкспрессии AcpC, может солюбилизировать питательные вещества при добавлении таких спор в среду для роста растений или нанесении таких спор на семя растения, растение или на область, окружающую растение или семя растения. Поскольку фосфат является очень важным питательным веществом для роста и развития растений, это может усилить рост растения и обеспечить полезные эффекты на здоровье растения.
[001105] Аналогично, супероксиддисмутаза является очень мощным антиоксидантным белком. Сверхэкспрессия супероксиддисмутазы в представителе семейства Bacillus cereus может обеспечить споры, имеющие способность деградировать свободные радикалы, которые оказывают стрессовое воздействие на растения. Удаление свободных радикалов может смягчить до некоторой степени это стрессовое воздействие и привести к увеличенной мощности растений в стрессовых условиях. Споры Bacillus thuringiensis BT013A, сверхэкспрессирующие SODA1 и SODA2 (т.е. споры, трансформированные плазмидами pHP13-SODA1 и pHP13-SODA2, соответственно), можно подвергать ферментативному анализу. Один миллилитр культуры для споруляции можно осаждать и осадок можно ресуспендировать в 1 мл dH2O, содержащей ксантин. Затем в реакционную смесь можно добавлять ксантиноксидазу, а также цитохром C. Ингибирование деградации цитохрома C в этом анализе указывает на активность супероксиддисмутазы.
[001106] Споры Bacillus mycoides EE155, сверхэкспрессирующие цинковую металлопротеиназу (т.е. споры, трансформированные плазмидой pHP13-InhA2), подвергали ферментативному анализу. Один миллилитр культуры для споруляции осаждали и осадок ресуспендировали в 1 мл PBS. Затем споры подвергали реакции с 0,5% азоказеином, субстратом протеазы, в течение 5 минут. Эти реакционные смеси осаждали с помощью TCA (трихлоруксусная кислота) для удаления нерасщепленного казеина и проводили считывание поглощения оставшегося свободного азокрасителя при ABS595. Споры, сверхэкспрессирующие InhA2, имели на 211% более высокую протеазную активность по сравнению с нерекомбинантными спорами Bacillus mycoides EE155.
[001107] Примеры 3 и 7, выше, иллюстрируют, что экспрессия протеазы на экзоспории представителя семейства Bacillus cereus может обеспечить полезные эффекты на растения. Споры Bacillus thuringiensis BT013A с InhA1, InhA2 или InhA3 могут иметь сходные эффекты при внесении в среду для роста растений или нанесении на семена растений, растения или область, окружающую растение или семя растения.
Пример 51. Экспрессия слитых белков в эндофитном штамме семейства Bacillus cereus
[001108] Было обнаружено, что представитель семейства Bacillus cereus EE349 обладает способностью к эндофитному росту и способен служить в качестве штамма-хозяина для системы BEMD. Для демонстрации способности представителя семейства Bacillus cereus EE349 к эндофитному росту и способности служить в качестве штамма-хозяина для системы BEMD, представитель семейства Bacillus cereus EE349 трансформировали плазмидой pSUPER-BclA 20-35-эндоглюканазы (описанной выше в примере 44). Споры получали и очищали, как описано выше пример 40.
[001109] Эти споры разбавляли до концентрации 1×105 спор/50 мл воды, а затем 50 мл воды добавляли к коммерческим гибридным семенам кукурузы в горшечную почву при посеве. Семена кукурузы покрывали фунгицидом и биологическим инокулятом. Гибридный сорт кукурузы представлял собой BECK 5475RR, который содержит ген резистентности к глифосату ROUNDUP READY и ген резистентности к засухе AQUAMAX. Растения выращивали при искусственном освещении в течение 14 часов в сутки и определяли рост растений в течение десяти суток. Растения поливали каждые трое суток в ходе эксперимента. Через десять суток измеряли высоту растений и ее нормализовывали к высоте необработанных растений кукурузы. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 53.
Таблица 53. Эффекты эндофитного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего слитый белок BclA 20-35-эндоглюканаза, на рост проростков кукурузы
[001110] Как можно видеть из данных, показанных в таблице 53, экспрессия конструкции pSUPER-BclA 20-35-эндоглюканаза в эндофитном штамме представителя семейства Bacillus cereus EE349 приводила к увеличенному росту кукурузы по сравнению с необработанными растениями или растениями, обработанными только представителем семейства Bacillus cereus EE349.
[001111] Затем представитель семейства Bacillus cereus 349, экспрессирующий BclA 20-35-эндоглюканазу, выделяли из растений кукурузы. Растения, росшие в течение десяти суток, извлекали из почвы и промывали для удаления избыточного дебриса. Затем растения переворачивали, подвергали воздействию отбеливателя 5% в течение десяти минут, промывали водой, подвергали воздействию пероксида водорода (10%) в течение десяти минут, вновь промывали водой и стебли разрезали стерильным лезвием бритвы. Разделенные половины стеблей помещали лицевой стороной вниз на чашки с питательным агаром на два часа. Через два часа стебли удаляли и чашки с агаром инкубировали при 30°C в течение 48 часов. Через 48 часов чашки исследовали в отношении морфологии колоний, и колонии представителей семейства Bacillus cereus, обнаруженные внутри растения, отбирали зубочисткой на чашки с питательным агаром и чашки с питательным агаром плюс тетрациклин (для селекции бактерий, содержащих плазмиду pSUPER-20-35 BclA-эндоглюканаза). Полученное увеличение количества колоний представителя семейства Bacillus cereus 349 представлено в таблице 54. Эти результаты демонстрируют способность к внесению системы BEMD в растение-мишень в эндофитном штамме представителя Bacillus cereus.
Таблица 54: Эндофитный анализ представителя семейства Bacillus cereus EE349
[001112] Резистентные к тетрациклину клоны Bacillus выращивали в течение ночи при 30°C в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой плюс тетрациклин и осаждали центрифугированием при 10000×g в течение 5 минут. Супернатант удаляли и осадок замораживали в течение ночи при -20°C. Затем хромосомную ДНК экстрагироавли из каждого клона и определяли присутствие плазмиды pSUPER-20-35 BclA-эндоглюканаза посредством трансформации хромосомной ДНК (содержащей плазмиду) в клетки DH5α E. coli и посева на чашки с LB плюс ампициллин. Правильные клоны подвергали анализу последовательности ДНК, который подтверждал, что представитель семейства Bacillus cereus 349 находится внутри растения (был эндофитным) и содержал плазмиду.
[001113] Многие эндофитные бактерии были обнаружены в проростках кукурузы, причем ряд различных штаммов и видов семейства Bacillus cereus обнаруживался внутри как контрольных растений, так и растений, обработанных EE349. Резистентные к тетрациклину представители семейства Bacillus cereus (что указывает на присутствие плазмиды pSUPER-20-35 BclA-эндоглюканаза) обнаруживались только в обработанных проростках кукурузы, и все из них имели ту же морфологию колоний, что и исходный эксерессирующий хозяин, представитель семейства Bacillus cereus EE349. Присутствие плазмиды pSUPER 20-35 BclA-эндоглюканаза подтверждали амплификацией способом ПЦР с использованием уникальных праймеров.
Пример 52. Выделение, идентификация и охарактеризация эндофитных бактериальных штаммов семейства Bacillus cereus
[001114] В дополнение к эндофитному штамму представителя семейства Bacillus cereus 349, описанного выше в предыдущем примере, также было идентифицировано несколько других представителей семейства Bacillus cereus, которые обладают способностью к эндофитному росту: представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus thuringiensis EE-B00184, Bacillus mycoides EE-B00363, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 и представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377.
[001115] Для получения этих дополнительных представителей семейства Bacillus cereus проводили посев коммерческих гибридных семян кукурузы в горшечную почву и позволяли им расти. Семена кукурузы покрывали фунгицидом и биологическим инокулятом. Растения выращивали при искусственном освещении в течение 14 часов в сутки и определяли рост растений в течение 14 суток. Растения поливали каждые трое суток в ходе эксперимента. Через 14 суток растения извлекали из почвы и отмывали для удаления избыточных остатков почвы. Затем растения переворачивали, подвергали воздействию 5% отбеливателя в течение десяти минут, промывали водой, подвергали воздействию пероксида водорода (10%) в течение десяти минут, вновь промывали водой, и стебли разделяли стерильным лезвием бритвы. Разделенные половины стеблей помещали лицевой стороной вниз на чашки с питательным агаром на два часа. Через два часа стебли удаляли и чашки с агаром инкубировали при 30°C в течение 48 часов. Через 48 часов чашки исследовали в отношении морфологии колоний, и колонии представителей семейства Bacillus cereus, обнаруженные внутри растения, отбирали зубочисткой на питательный агар. Затем их выращивали в течение ночи при 30°C в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой и осаждали центрифугированием при 10000×g в течение 5 минут. Супернатант удаляли и осадок замораживали в течение ночи при -20°C. Затем хромосомную ДНК каждого клона экстрагировали и подтверждали идентичность каждой колонии способом ПЦР с использованием праймеров для 16S рРНК и ампликоны отправляли на секвенирование ДНК и идентификацию. Последовательности 16S рРНК для этих штаммов представлены выше в таблице 13.
Пример 53. Выделение, идентификация и охарактеризация дополнительных эндофитных бактериальных штаммов (не представители семейства Bacillus cereus)
[001116] Из проростков кукурузы выделяли эндофитные бактериальнеы штаммы Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus spp. EE443 и Bacillus pumilus EE-B00143. Проростки кукурузы, выращиваемые в течение двух недель, сначала стерилизовали. Растения экстрагировали из почвы и промывали для удаления избытков остатков почвы. Затем растения переворачивали, подвергали воздействию 5% отбеливателя в течение десяти минут, промывали водой, подвергали воздействию пероксида водорода (10%) в течение десяти минут и вновь промывали водой. Стебли разрезали стерильным лезвием бритвы. Разделенные половины стеблей помещали лицевой стороной вниз на чашки с питательным агаром на два часа. Через два часа стебли растений удаляли из чашек, а затем чашки инкубировали при 30°C в течение 48 часов. Колонии Bacilli, которые были эндофитными, отбирали для дальнейшего анализа. Эти штаммы выращивали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой в течение ночи при 30°C, и культуры подвергали экстракции ДНК с использованием набора для хромосомной ДНК Qiagen. ДНК амплифицировали способом ПЦР для получения гена 16S рРНК, который отправляли на секвенирование ДНК. Для полученных последовательности проводили поиск в BLAST с использованием баз данных NCBI для установления идентичности вида Bacilli. Последовательности 16S рРНК представлены выше в таблице 14.
Пример 54. Экспрессия слитых белков, содержащих белок оболочки споры, в эндофитных штаммах бактерий Bacillus
[001117] Эндофитные бактериальные штаммы Bacillus thuringiensis EE319, Bacillus firmus A30 и Bacillus lichenformis A4 трансформировали, чтобы они содержали плазмиды, кодирующие различные белки оболочки споры, слитые с эндоглюканазой. Получали плазмиды pHP13-CotC-эндоглюканаза и pHP13-CgeA-эндоглюканаза. Каждая из этих плазмид кодировала белок оболочки споры (CotC или CgeA), слитый в рамке считывания с полиаланиновым линкером, содержащим восемь остатков аланина, и эндоглюканазой. Полиаланиновый линкер и эдоглюканазу подвергали слиянию с С-концом белков оболочки споры.
[001118] Для получения плазмид, кодирующих слитые белки, ген эндоглюканазы из Bacillus subtilis 168 амплифицировали способом ПЦР. Гены, кодирующие белки оболочки споры CotC и CgeA, также амплифицировали способом ПЦР с хромосомной ДНК Bacillus subtilis 168 (CotC) или Bacillus amyloliquefaciens (CgeA). Затем правильные ампликоны подвергали сплайсингу способом перекрывающейся ПЦР с получением фрагмента ДНК слитого белка посредством отжига гомологичных выступающих концов размером 15 п.н. Каждый из наружных праймеров конструировали так, чтобы они содержали участки XhoI. Ампликоны очищали набором для очистки продуктов ПЦР Promega, и ДНК расщепляли XhoI и лигировали в участок SalI pHP13. Затем плазмидную ДНК секвенировали, трансформировали в клетки E. coli и ДНК вводили в различные эндофитные штаммы Bacillus.
[001119] Споры каждого из рекомбинантных видов Bacillus, экспрессирующих слитые белки, получали путем снятия ночных культур на чашки с питательным агаром, которые затем инкубировали при 30°C в течение 72 часов. Через 72 часов бактериальные споры собирали с растений путем снятия в стерильный PBS. Споры очищали центрифугированием в градиенте плотности три раза, разбавляли до 1×108 к.о.е./мл, и анализировали в отношении активности эндоглюканазы, как описано выше в примере 45. Результаты этого анализа представлены в таблице 55 ниже и на фиг.9.
Таблица 55. Активность эндоглюканазы в спорах Bacillus, экспрессирующих слитые белки CotC-эндоглюканаза или CgeA-эндоглюканаза
[001120] На фиг.9, CotC1, CotC2 и CotC3 представляют собой три отдельных экспериментальных культуры для споруляции Bacillus thuringiensis EE319 с pHP13-CotC-Endo.
Пример 55. Эффекты спор Bacillus, экспрессирующих слитые белки CotC-эндоглюканаза, CotB-эндоглюканаза или CgeA-эндоглюканаза, на рост семян кукурузы и сои
[001121] Споры рекомбинантного вида Bacillus, экспрессирующие слитые белки, содержащие белок оболочки споры и эндоглюканазу (например, слитые белки CotC-эндоглюканаза, CotB-эндоглюканаза или CgeA-эндоглюканаза, описанные выше в предыдущем примере) можно исследовать в отношении их эффектов на рост растений (например, кукуруза и соя) следующим образом. Споры можно получать, как описано выше в предыдущем примере, промывать, разбавлять до 1×108 к.о.е./мл в воде и наносить на семена растений (например, семена кукурузы и сои) в количестве 1×105-7 спор/семя. Затем споры можно наносить либо в качестве обработки семян, либо в качестве полива почвы. Растения можно сажать на глубину 1" (2,54 см) в 4" (10,16 см) горшки, и выращивать 18,3°C с циклом 13 часов на свету/в темноте. Через двое суток можно определять высоту растений и длину корней.
Пример 56. Доставка пробиотических бактерий животным путем кормления животных растениями, содержащими такие бактерии
[001122] Пробиотические бактерии можно доставлять животным (например, домашний скот, рыбы или другие животные) путем внесения пробиотических бактерий на семя растения, в среду для роста растений (например, посредством внесение в борозду почвы), на растение (например, путем внекорневого нанесения) или на область, окружающую растение или семя растение, а затем кормления такими растениями или растениями, выращенными из семян растений, животного. Бактерии можно наносить на листья или стебли растений пока растения растут, и они будут колонизировать филлоплану (поверхность листьев и стебля). Растения перед кормлением животного можно подвергать переработке в корм для животных.
[001123] Использование эндофитных штаммов бактерий в таких способах позволяет бактериям выжить и оставаться в ткани растения, так что они будут в значительных количествах проглатываться животным при употреблении растительного материала из растения. Например, полагают, что штаммы представителя семейства Bacillus cereus EE349, представителя семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444, Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus spp. EE443 и Bacillus pumilus EE-B00143 являются пробиотическими и эндофитными, и их можно использовать в этих способах.
[001124] Любой из этих штаммов или других пробиотических и эндофитных штаммов можно выращивать и получать споры, как описано выше в примере 40. Затем споры можно вносить в среду для роста растений, наносить на семя растения, растение или на область, окружающую растение или семя растения. Растения, выращенные в среде для роста растения, растения, выращенные из семян растений, растения, на которые нанесены бактерии, или семена растений, выращенные в области, на которую нанесены бактерии, можно выращивать, а затем ими можно кормить животное. Эндофитные бактерии могут колонизировать внутреннюю ткань растения и могут реплицироваться в значительных количествах внутри растения. Бактерии будут спорулировать при использовании традиционных способов сбора урожая, обеспечивая длительное хранение растительного материала (например, в качестве сена или силоса), которым позднее можно кормить целевое животное.
[001125] В этих способах необходимо использовать только небольшое количество бактерий, поскольку эндофитные бактерии естественным образом колонизируют растения и пролиферируют на и в растениях.
Пример 57. Доставка полезных ферментов животным путем кормления животных растениями, содержащими рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или другие рекомбинантные бактерии, экспрессирующие слитый белок, содержащий полезный фермент
[001126] Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, экспрессирущие слитый белок, содержащий представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий, которые описаны в настоящем описании, также можно использовать для доставки полезных ферментов животным. Рекомбинантными представителями семейства Bacillus cereus можно кормить непосредственно животных (например, путем примешивания рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus в корм для животных, которым впоследствии кормят животного). Альтернативно способы доставки бактерий животным, описанные выше в предыдущем примере, можно использовать совместно с рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, экспрессирующим слитый белок, который содержит белок или пептид, имеющий полезные эффекты у животного (например, фермент, который способствует перевариванию растительного материала).
[001127] Ферменты, присутствующие в корме для домашнего скота, рыб и других животных, могут влиять на усвоение питательных веществ, количество продукции и здоровье животного, которое употребляет ферменты. Ферменты, которые являются полезными для здоровья животного, включают, например, ксиланазы, фитазы, фосфатазы, протеазы, целлюлазы, эндоглюканазы, глюканазы, амилазы, липазы, фосфолипазы, гликозилазы, галактаназы, α-галактозидазы, амилазы, пектиназы, биотиназы и полигалактуроназы, среди прочих. Систему BEMD можно использовать для экспрессии таких ферментов на поверхности экзоспория. Рекомбинантные представители семейства Bacillus cereus, экспрессирующие слитый белок, содержащий один из этих ферментов, можно вносить в среду для роста растений, на семена растений, растение или на область, окружающую растение или семя растения. Аналогично, в этих способах можно использовать рекомбинантные бактерии, которые экспрессируют слитый белок, содержащий один из этих ферментов, и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии. Рекомбинантные бактерии можно вносить в среду для роста растений, на семя растения или растение, или на область, окружающую растение или семя растения. Растения, выращенные в среде для роста растений, растения, выращенные из семян растений, растения, на которые нанесены бактерии, или растения или семена растений, выращенные в области, на которую нанесены бактерии, можно выращивать, и затем кормить ими животное, и, таким образом, животному доставлять полезный фермент. Бактерии будут спорулировать при применении традиционных способов сбора, позволяющих длительное хранение растительного материала (например, такого как сено или силос), которым впоследствии можно кормить целевое животное.
[001128] Эндофитные штаммы представителей семейства Bacillus cereus можно использовать в качестве хозяев для экспрессии слитых белков, содержащих представляющий интерес белок или пептид (например, фермент, обладающий полезными эффектами у животных) и нацеливающую последовательность, белок экзоспория, или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий. Например, в качестве хозяев можно использовать эндофитные штаммы представителя семейства Bacillus cereus EE349, представителя семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus cereus EE444 и Bacillus thuringiensis EE319, описанные в настоящем описании.
[001129] Дополнительные представители семейства Bacillus cereus можно выбирать для нанесения на надземную часть растения, поскольку эти бактерии не должны быть эндофитными для колонизации филлопланы. Например, для этой цели можно использовать Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, представитель семейства Bacillus cereus EE218, Bacillus thuringiensis BT013A, Bacillus thuringiensis EE-B00184, Bacillus mycoides EE-B00363, Bacillus pseudomycoides EE-B00366 или представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377.
[001130] Аналогично, эндофитные штаммы рекомбинантных бактерий можно использовать в качестве хозяев для экспрессии слитых белков, содержащих представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии. Например, в качестве хозяев можно использовать эндофитные штаммы Bacillus megaterium EE385, Bacillus sp. EE387, Bacillus circulans EE388, Bacillus subtilis EE405, Lysinibacillus fusiformis EE442, Lysinibacillus spp. EE443 или Bacillus pumilus EE-B00143.
[001131] Использование эндофитных штаммов бактерий в этих способах позволяет бактериям выжить и оставаться в ткани растения, так что как бактерии, так и слитые белки, экспрессируемые бактериями, будут проглатываться в значительных количествах животным при употреблении растительного материала из растения. Таким образом, посредством простого добавления рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или других рекомбинантных бактерий при посеве, полезные ферменты можно распространять в ткани растения и доставлять животным посредством употребления ими растительного материала.
Пример 58: Применение различных нацеливающих последовательностей для экспрессии эндоглюканазы на поверхности спор представителя семейства Bacillus cereus, и использование таких спор для стимуляции роста растений
[001132] Плазмиду pSUPER модифицировали путем клонирования полученного с помощью ПЦР фрагмента способом гомологичной рекомбинации, который осуществлял слияние промотора BclA, инициирующего кодона и аминокислот 20-35 BclA (аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1) в рамке считывания с эндоглюканазой Bacillus subtilis 168 (pSUPER-BclA 20-35-Endo), как описано выше в примере 44. Затем эту плазмиду подвергали обратной ПЦР для амплификации всего плазмидного остова, за исключением последовательности, соответствующей аминокислотам 20-35 BclA. Этот продукт обратной ПЦР комбинировали с продуктом ПЦР, который амплифицировал эквивалентную область из каждой из SEQ ID NO: 5, 15, 25, 81, 85, 87 или аминокислот 20-33 SEQ ID NO: 1. Таким образом, получали конструкции, которые содержали каждую из следующих нацеливающих последовательностей, слитую в рамке считывания с эндоглюканазой Bacillus subtilis 168: (1) аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1; (2) аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 5; (3) аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 15; (4) аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 25; (5) аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 81; (6) аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 85; (7) аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 87; и (8) аминокислоты 20-33 SEQ ID NO: 1. Каждая конструкция содержала промотор BclA дикого типа и метионин в положении инициирующего кодона, за которыми следовала нацеливающая последовательность, слитая в рамке считывания с геном эндоглюканазы Bacillus subtilis. Каждую из этих конструкций трансформировали в E. coli и высевали с получением отдельных колоний на чашках со средой Луриа плюс ампициллин (100 мкг/мл). Плазмиды из каждой отдельной колонии выращивали в ночных культурах в бульоне Луриа плюс ампициллин, и очищали с использованием минипрепаративного набора WIZARD SV, и последовательности подтверждали секвенироавнием по методу Сэнгера. ДНК также количественно определяли посредством спектрофотометрии, и ДНК вводили в Bacillus thuringiensis BT013A. Кроме того, конструкцию pSUPER-BclA-20-35 Endo вводили в Bacillus thuringiensis BT013A, из генома которых был удален нативный белок BclA посредством гомологичной рекомбинации (нокаут BclA, "BclA KO"). Правильные колонии подвергали скринингу путем посева на чашки с питательным бульоном, содержащим антибиотик (тетрациклин в количестве 10 мкг/мл). Каждую положительную колонию выращивали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой при 30°C в течение ночи при 300 об/мин с антибиотиком, и геномную ДНК очищали и повторно секвенировали для подтверждения генетической чистоты. Подтвержденные колонии выращивали в течение ночи в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой с 10 мкг/мл тетрациклина и индуцировали к споруляции посредством споруляции в среде на основе дрожжевого экстракта.
[001133] Каждую продуцированную партию в среде на основе дрожжевого экстракта собирали через 48 часов после продукции спор и подвергали сравнению ферментов в полученных спорах с использованием методологии, описанной в примере 45. Поглощение определяли при 540 нм с использованием нанофотометра IMPLEN P330. Для каждой реакции было три образца и пустой образец. Результаты определения ферментов представлены в таблице 56.
[001134] Для кукурузы 1 мкл цельного бульона в каждом случае для каждой из конструкций помещали на каждое семя. Для патиссона 2 мкл цельного бульона для каждой конструкции наносили на каждое семя. Для этого 50 семян помещали в 50-мл пропиленовую пробирку с коническим дном и слегка встряхивали с использованием вихревого смесителя. В пробирку с этими вращающимися семенами медленно добавляли пипеткой 50 мкл (для кукурузы) или 100 мкл (для патиссона) бульона, содержавшего рекомбинантные споры, и встряхивающее действие покрывало семена равномерным покрытием бульона с цельными клетками для каждой конструкции. Затем эти семена высевали на глубину 1" (2,54 см) в естественную почву с использованием горшка для посева размером 39,6 см3 (15,6 дюймов3), по два семени на горшок. Затем горшки поливали до насыщения и растениям позволяли прорастать. Растения выращивали в помещении для контролируемого роста при 70°F в течение дня и 60°F вечером со световым периодом 14 часов/сутки, в условиях искусственного освещения в течение 14 суток. Через 14 суток измеряли рост растений и результаты нормализовывали к контрольной группе, в которой проводили обработку только водой в качестве обработки семян.
Таблица 56. Уровни ферментов и фенотипы роста растений
а.к.=аминокислоты
ND=не определено
[001135] Представленные выше данные показывают, что каждая из этих конструкций была способна стимулировать рост растений, и показывают, что использование различных нацеливающих последовательностей позволяет контролировать уровень экспрессии фермента снаружи споры.
[001136] Использование аминокислот 20-35 SEQ ID NO: 1 или а.к.13-28 SEQ ID NO: 85 в качестве нацеливающей последовательности привело к наиболее высоким уровням продукции фермента. Это является неожиданным с учетом низкой степени идентичности между этими нацеливающими последовательностями (идентичность 43,8% на протяжении всей длины нацеливающей последовательности). Использование аминокислот 28-43 SEQ ID NO: 15 или аминокислот 9-24 SEQ ID NO: 25 приводило к наиболее высокому ответу растений среди двух типов растений. Экспрессия слитого белка, содержащего аминокислоты 20-25 SEQ ID NO: 1, в качестве нацеливающей последовательность в хозяине BT013A BclA KO, привела к очень большому (263,8%) увеличению уровня ферментативной активности на поверхности спор по сравнению с экспрессией того же слитого белка в штамме дикого типа.
Пример 59: Использование различных нацеливающих последовательностей и белков экзоспория для экспрессии фосфолипазы, липазы и эндоглюканазы на поверхности спор представителя семейства Bacillus cereus и применение таких спор для стимуляции роста растений
[001137] Плазмиду pSUPER модифицировали посредством клонирования полученного способом ПЦР фрагмента (расщепление XhoI и лигирование), в котором были слиты промотор BclA, инициирующий кодон и аминокислоты 20-35 BclA (аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1), за которым следовала линкерная последовательность из шести остатков аланина, в рамке считывания с геном либо фосфатидилхолин-специфической фосфолипазы C Bacillus thuringiensis (PC-PLC) (pSUPER-BclA 20-35-PL), либо липазы LipA Bacillus subtilis (pSUPER-BclA-20-35-липаза), либо эндоглюканазы eglS Bacillus subtilis (pSUPER-BclA-20-35-Endo) как описано выше в примере 44. Затем эти плазмиды подвергали обратной ПЦР для амплификации всего остова плазмиды, за исключением последовательности, соответствующей аминокислотам 20-35 BclA. Этот продукт обратной ПЦР комбинировали с продуктом ПЦР, который амплифицировал эквивалентную область из каждой из SEQ ID NO: 5 (т.е. аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 5), 15 (т.е. аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 15) и 25 (т.е. аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 25); полноразмерные белки экзоспория SEQ ID NO: 120, 111, 121, 108 и 114 или аминокислоты 20-33, 20-31, 21-33, 23-33 или 23- 31 SEQ ID NO: 1. Каждая из этих конструкций содержала промотор BclA дикого типа, метионин в положении инициирующего кодона, за которым следовала нацеливающая последовательность или белок экзоспория, слитые в рамке считывания с геном фосфатидилхолин-специфической фосфолипазы C Bacillus cereus, липазы LipA Bacillus subtilis 168 или эндоглюканазы eglS Bacillus subtilis 168. Каждую из этих конструкций подвергали скринингу в отношении правильных трансформантов, как описано в примере 58 выше.
[001138] Каждую продуцированную партию в среде на основе дрожжевого экстракта собирали через 48 часов после продукции спор и подвергали сравнению ферментов полученных спор. Получение данных о ферментах для эндоглюканазы проводили, как описано выше в примере 58. Для анализа фермента фосфолипазы C 1 мл рекомбинантных спор осаждали при 10000×g в течение 3 минут и супернатант удаляли и выбрасывали. Затем осадок со спорами ресуспендировали в 500-мкл реакционном буфере (0,25 мМ Tris-HCL, 60% глицерин, 20 мМ o-нитрофенилфосфорилхолин, pH 7,2). Отрицательный контроль для анализов ферментов содержал споры BT013A без экспрессии ферментов. Каждый образец инкубировали при 37°C в течение 18 часов, вновь центрифугировали для удаления спор, разбавляли 1:1 в воде и проводили считывание Abs540 с использованием спектрофотометра. Это сравнивали со стандартной кривой против коммерчески приобретенных контролей фосфолипазы и липазы для установления активности в Е/мл. Результаты данных определения ферментов представлены в таблице 57 и в таблице 58.
Таблица 57. Уровни фермента эндоглюканазы
А.к.=аминокислоты
[001139] Многие из нацеливающих последовательностей и белков экзоспория были способны экспонировать большое количество активных ферментов на поверхности спор, включая SEQ ID NO: 108, 111, 114, 120 и 121. Аминокислоты 20-31, 21-33 и 23-31 SEQ ID NO: 1 обеспечили сходные уровни экспрессии ферментов с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, что указывает на то, что фрагменты меньших размеров являются достаточными для экспонирования ферментов на поверхности спор. Только аминокислоты 23-33 SEQ ID NO: 1 демонстрировали сниженный уровень экспонирования фермента на спорах.
Таблица 58. Уровни фермента фосфолипазы
А.к.=аминокислоты
[001140] Аналогично результатам, показанным выше в таблице 57, наиболее высокие уровни фосфолипазы или липазы на поверхности спор наблюдали, когда использовали аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1, аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 5 или белковую последовательность экзоспория SEQ ID NO: 120.
[001141] Эффекты этих спор, экспрессирующих несколько из этих конструкций, на образование клубеньков в сое, представлены в таблице 59.
Таблица 59. Ответы растений на фосфолипазу
[001142] Растения сои покрывали, как описано выше, однако анализ проводили до периода 3 недель. Растения осторожно извлекали, с корней осторожно смывали грязь и для каждого растения подсчитывали клубеньки. Как показано в таблице 59, нанесение спор, экспонирующих фосфолипазу, на семена сои, обеспечивает увеличенное количество клубеньков на растениях, что является положительным признаком как раннего роста, так и конечного увеличения урожая сои.
Пример 60: Связывание РНК MIR319 и случайной РНК 1 со спорами Bacillus cereus, экспрессирующими слитый белок, содержащий связывающий нуклеиновую кислоту белок, и применение таких спор для доставки РНК в растения
[001143] ДНК и РНК можно связывать со спорами представителя семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитые белки, содержащие нацеливающую последовательность и связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид на их экзоспории, как описано в примерах выше и в описании. Споры действуют в качестве механизма доставки, доставляя нуклеиновую кислоту-мишень (например, микроРНК) в растение-мишень. Для демонстрации этой способности спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus sporesо бычную микроРНК MIR319 доставляли в сою с использованием спор, экспрессирующих слитый белок, содержащий аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1, слитые в рамке считывания с известным геном ДНК-связывающего белка SspC. MIR319 имеет различные эффекты на фенотип растений в различных растениях, и даже в различных частях одного и того же растения. Например, в некоторых видах обработка листьев MIR319 приводит к скручиванию листьев, в то время как в других видах использование MIR319 приводит к устойчивости к стрессовым воздействиям. MIR319 является повсеместной среди геномов растений, является общим регулятором каскадов, и ее доставка в различные растения приводит к различным фенотипам.
Таблица 60: РНК, используемые в этом исследовании
[001144] Синтетическую микроРНК MIR319 из Glycine max (соя) конструировали, чтобы она соответствовала последовательности MIR319, доступной в miRBase (miRBase.org, центральный репозитарий последовательностей микроРНК). Две частично комплементарных одноцепочечных последовательности синтезировали в Integrated DNA Technologies (IDT, Iowa), чтобы они соответствовали 3ʹ- и 5ʹ-продуктам зрелых генов, о которых известно, что они существуют in vivo (использовали две различных версии 5ʹ-последовательности). Аналогично, синтезировали две одноцепочечных РНК со случайными последовательностями, несоответствующими геному сои, в качестве контроля. Двухцепочечные (дц) продукты генов получали путем комбинирования двух одноцепочечных (оц) продуктов при 95°C в течение 10 мин, а затем медленного охлаждения при комнатной температуре, чтобы обеспечить отжиг. Bacillus thuringiensis, экспрессирующие слитый белок, содержащий промотор BclA, остаток метионина в положении инициирующего кодона и аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1, слитые в рамке считывания с известным геном ДНК-связывающего белка SspC (SASP α/β типа, малый растворимый в кислоте белок C спор Bacillus thuringiensis BT013A), конструировали с помощью стандартных методик клонирования, как описано выше в примере 58. Эту конструкцию (SspC-BclA) создавали в E. coli, трансформировали в Bacillus thuringiensis BT013A и клоны подтверждали секвенированием ДНК. Споры B. thuringiensis, экспрессирующие SspC-BclA, получали путем выращивания в течение ночи трансформированных бактерий в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой (BHI) в течение 2 суток в среде на основе дрожжевого экстракта до достижения плотности 2×108 спор на миллилитр (мл) с менее чем 1% вегетативных клеток. ДНК экстрагировали из аликвоты родительской культуры BHI и отправляли на секвенирование для подтверждения встраивания плазмиды SspC-BclA. Для получения спор для обработки семян 1 мл культуры спор в среде на основе дрожжевого экстракта осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 100 мкл воды. Эту концентрированную суспензию подсчитывали и споры использовали в количестве 6×108 спор/мл. Для каждого семени споры 1 мкл спор комбинировали с 10 мкл РНК в концентрации 10 мкМ и инкубировали при 30°C в течение 2 часов (в увеличенном масштабе для множества семян). После этой инкубации споры осаждали (содержащие связанную РНК) и избыточную несвязанную РНК в супернатанте удаляли и осадок ресуспендировали в 10 мкл воды. Образцы наносили на семена следующим образом: подготавливали 39,6 см3 (15,6 дюймов3) коммерческой почвы верхнего слоя торговой марки Timberline в каждом горшке и проводили углубление на 1 дюйм (2,54 СМ), в которое вносили 2 мл воды, и сверху помещали одно семя. Образец 10 мкл спор+связанная РНК наносили посредством микропипетки непосредственно сверху семян. Семена оставляли на 30 мин, а затем соседней почвой свободно накрывали семена. Семенам позволяли прорастать в течение 4 суток в помещении для выращивания растений с искусственным освещением с циклом 13/11 часов на свету/сутки, и при диапазоне температур 21°C днем/15°C ночью. На 14 сутки растения вырывали, фотографировали и измеряли. Высоту нормализовывали к высоте растений, обработанных контролем в виде воды (см. таблицу 61).
[001145] В примере 41 выше описана способность спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus с SspC-BclA связывать и удерживать ДНК. Для оценки способности связывать РНК у спор, экспрессирующих SspC-BclA, синтезировали меченные биотином случайные последовательности РНК посредством IDT, и инкубировали со спорами, в точности как проводили для обработок, описанных выше (1 мкл спор в количестве 6×108 спор/мл+10 мкл 10 мкМ РНК в течение 2 часов при 30°C, осажденные и ресуспендированные в 10 мкл воды). К образцу 10 мкл спор+РНК добавляли авидин, конъюгированный с флуоресцеином (FITC) (Life Technologies) в конечной концентрации 20 мкг/мл, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Известно, что авидин связывает биотин, и FITC является флуоресцентной меткой. Споры вновь осаждали для удаления избытка не связавшегося авидина-FITC и ресуспенировали в 4% параформальдегиде в PBS, и хранили при 4°C в течение ночи в темноте. Споры исследовали в отношении флуоресценции и фотографировали (см. таблицу 62). Кроме того, как показано на фиг.10, споры, меченные Sspc-BclA, были способны связывать и удерживать как оцРНК, так и дцРНК, как показано по мечению FITC-авидином спор в присутствии оцРНК или дцРНК, связанной с биотином. Для получения результатов, показанных на фиг.10, споры инкубировали либо с двухцепочечной, либо с одноцепочечной РНК (случайной последовательности), меченной биотином, и подвергали детекции с помощью авидина, конъюгированного с флуоресцеином (FITC). На спорах, инкубированных только с водой, не было обнаружено флуоресценции. Изображения светлопольной микроскопии и соответствующие изображения флуоресценции получали с помощью объектива 40X и окуляра 10X.
[001146] Как видно в таблице 61 ниже, основной эффект MIR319 в качестве обработки семян в отношении сою состоит в росте корней и общей высоте. Закручивающиеся корни определяли как имеющие по меньшей мере два поворота на 180°. Высоту измеряли для основного стебля. Когда растения сои вырывали и анализировали в отношении присутствия "закручивающихся корней", специфического фенотипа сои, наблюдаемого группой авторов изобретения, не наблюдали признаков закручивающихся корней в обработанном водой контроле, контрольном штамме BT013A, контроле, обработанном только двухцепочечной (дцРНК) РНК или спорах отдельно (контроль в виде носителя). Единственный признак закручивающихся корней отмечали, когда споры SspC-BclA (носитель) доставляли в семена вместе с дцРНК (60% закручивающихся корней) (также см. фиг.10). На фиг.11 также представлены фенотипические изменения растений вои, подвергнутых воздействию сор SspC-BclA в комбинации с РНК dsMIR319. Когда споры используют для доставки РНК, воздействие РНК усиливается, что приводит к увеличенной задержке роста и фенотипу с закручивающимися корнями, представленному на фиг.11. Для получения результатов, представленных на фиг.11, семена сои обрабатывали двухцепочечной (дц) MIR319 с предшествующим связыванием спор B. thuringiensis, экспрессирующих SspC-BclA, или без него. Применение dsMIR319 приводило в среднем к несколько более высоким растениям; однако применение dsMIR319, связанной со спорами, приводило к "закручивающимся" корням, определяемым как наличие по меньшей мере двух поворотов на 180°, и к меньшей высоте в целом. Представлен срединный образец из каждых экспериментальных условий. Изображения получали с использованием цифровой камеры с растениями вместе на одном изображении.
[001147] В качестве РНК-контроля на сою наносили набор оцРНК (одноцепочечные) и дцРНК. В этих экспериментах случайная оцРНК не имела эффекта, когда ее применяли отдельно, в то время как дцРНК имела эффект задержки роста на высоту растений при доставке на семена. В обоих случаях, когда споры (носитель) использовали совместно со случайной версией либо оцРНК, либо дцРНК, происходило значительное усиление фенотипа задержки роста (задержка роста 33% и 27,8%, соответственно). Эта задержка роста не является заметой в случае образцов спор (контроль в виде носителя) отдельно. Эти данные, взятые вместе, демонстрируют способность спор усиливать и специфически доставлять оцРНК и дцРНК в растения путем нанесения на семена, и демонстрируют способность двух различных РНК (случайная #1 и MIR319) влиять на фенотип при доставке через споры Bacillus cereus, экспрессирующие слитый белок, содержащий ДНК/РНК-связывающий белок.
Таблица 61: Эффект MIR319 в отношении корней и высоты на развитие сои
Таблица 62: Флуоресцентное обнаружение эспресссирующих SspC-BclA спор со связанной меченной биотином РНК
[001148] Как можно видеть в таблице 62, на спорах без присутствия РНК не было обнаружено флуоресценции. На спорах обнаруживалась как одноцепочечная (оц), так и двухцепочечная (дц) РНК.
Пример 61: Доставка нуклеиновых кислот в нематоды Caenorhabditis elegans путем кормления их рекомбинантными спорами Bacillus thuringiensis, экспрессирующими слитый белок
[001149] Доставка РНК и ДНК в нематоды имеет множество применений в науке растений, для здоровья животных и в фундаментальных исследованиях. Нематоды вызывают значительное повреждение и потери урожая при коммерческом и некоммерческом выращивании ключевых культур, и паразитические нематоды вызывают высокую заболеваемость у человека и других животных во многих бедных регионах мира. Доставка РНК и ДНК имеет потенциал к смягчению и лечению многих нематодных проблем, и было продемонстрировано, что доставка конструкций РНК и ДНК является пригодной для воздействия на целевые нематоды. Этот пример иллюстрирует применимость механизма доставки РНК/ДНК, описанного выше в примере 60, для доставки спор в нематоды.
[001150] Нематоды C. elegans дикого типа приобретали от Carolina Biological (North Carolina) и поддерживали при 23°C на чашках с агаром NGM-Lite, покрытых OP50 E. coli для питания. Конструировали два различных штамма Bacillus thuringiensis BT013A с помощью стандартных методик клонирования для экспрессии аминокислот 20-35 SEQ ID NO: 1, слитых в рамке считывания с зеленым флуоресцентным белком (GFP) или mCherry для отслеживания присутствия спор в кишечнике. Эти споры, меченные зеленым или красным флуоресцентным красителем, получали путем выращивания в течение ночи в среде BHI (с сердечно-мозговой вытяжкой), а затем в течение трех суток в среде на основе дрожжевого экстракта до достижения плотности приблизительно 2×108 спор на миллилитр (мл) с менее чем 1% вегетативных клеток. Для получения спор для кормления нематод 1 мл культуры спор в среде осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 100 мкл воды для удаления избыточной среды. Эту концентрированную суспензию подсчитывали и разбавляли до 1×108 спор/мл. Для кормления червей спорами 1 мкл суспензии спор, содержавшей споры, меченные как красным, так и зеленым флуоресцентны красителем, добавляли в 60-мм чашку с агаром NGM-lite с 10 мкл PBS (фосфатно-солевой буфер) для облегчения распределения. Другие источники пищи были недоступными. Двадцать нематод дикого типа различного возраста сразу переносили в чашки. Живые нематоды проверяли через 5 часов на употребление спор с использованием стандартной флуоресцентной микроскопии.
[001151] Как можно видеть на фиг.12 и в таблице 63, централизованный кишечник нематод имел флуоресценцию, когда их кормили рекомбинантными спорами представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующими слитый белок, содержащий нацеливающую последовательность и GFP, в то время как кишечник не имел флуоресценции, когда их кормили OP50 E. coli (стандартная пища). Изображения живых нематод получали с объективом 4× и окуляром 10×. Это демонстрирует способность этих спор как быть проглоченными так и доставлять "груз" в виде белков-мишеней, примером которых является зеленый флуоресцентный белок. Также можно использовать другие белки экзоспория и нацеливающие белки взаимозаменяемо с нацеливающей последовательностью для доставки РНК и ДНК в нематоду или другой организм-мишень. Также можно использовать другие рекомбинантные споры представителей семейства Bacillus cereus вследствие в высокой степени консервативной природы экзоспория и его образования на поверхности спор.
Таблица 63: Флуоресценция C. elegans, обнаруженная в кишечнике
Пример 62: Конструирование, очистка и применение фрагментов экзоспория
[001152] Мутанты с нокаутом (KO): Для получения мутантных штаммов Bacillus thuringiensis BT013A с нокаутом exsY и cotE (KO) конструировали челночную плазмиду pKOKI и встраивающийся вектор, который содержал остов pUC57, который способен реплицироваться в E. coli, а также кассету резистентости к эритромицину с ориджином репликации из pE194. Эта конструкция способна реплицироваться как в E. coli, так и в Bacillus spp. Область ДНК размером 1 т.п.н., которая соответствовала вышележащей области гена cotE, и область размером 1 т.п.н., которая соответствовала нижележащей области гена cotE, амплифицировали способом ПЦР из Bacillus thuringiensis BT013A. Получали вторую конструкцию, которая содержала область ДНК размером 1 т.п.н., которая соответствовала вышележащей области гена exsY, и область размером 1 т.п.н., которая соответствовала нижележащей области гена exsY, обе из которых амплифицировали способом ПЦР из Bacillus thuringiensis BT013A. Затем для каждой конструкции две области размером 1 т.п.н. подвергали сплайсингу с использованием гомологичной рекомбинации с перекрывающимися областями с плазмидой pKOKI. Плазмидную конструкцию подтверждали посредством расщепления и секвенирования ДНК. Клоны подвергали скринингу на резистентность к эритромицину.
[001153] Клоны пассировали при высокой температуре (40°C) в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой. Индивидуальные колонии отбирали зубочисткой на чашки с агаром LB, содержавшие 5 мкг/мл эритромицина, выращивали при 30°C и подвергали скринингу в отношении присутствия плазмиды pKOKI в качестве свободной плазмиды посредством ПЦР колоний. Колонии, которые имели событие встраивания, продолжали пассировать для скрининга единичных колоний, которые утрачивали резистентность к эритромицину (утрата в значительной степени плазмиды, но рекомбинация и удаление генов exsY или cotE). Делеции подтверждали амплификацией ПЦР и секвенированием заданной области хромосомы. Плазмиду pSUPER-BclA 20-35 Endo (описанную в примере 58) трансформировали в каждый из мутантов exsY и cotE KO. Как описано выше в примере 48, мутант cotE KO также трансформировали плазмидой pSUPER BclA 20-35 eGFP (полученной, как описано выше в примере 44, но с заменой eGFP эндоглюканазой посредством гомологичной рекомбинации).
[001154] Доминантно-негативные мутанты: для получения доминантно-негативного мутанта авторы настоящего изобретения амплифицировали способом ПЦР N-концевую половину и C-концевую половину CotO (SEQ ID NO: 126), содержавшие аминокислоты 1-81 и 81-199, соответственно, и клонировали эти фрагменты в вектор pHP13 с использованием гомологичной рекомбинации (вектор pHP13 описан выше в примере 1). Правильные клоны подтверждали секвенированием по методу Сэнгера. Каждый из двух доминантно-негативных мутантов CotO вводили в Bacillus thuringiensis BT013A, которые содержали конструкцию pSUPER-BclA 20-35 Endo, которая продуцирует эндоглюканазу на поверхности споры, как проиллюстрировано выше в примере 58.
[001155] Получение фрагментов экзоспория: Для каждого из двух мутантов KO и для обоих доминантно-негативных мутантов ночную культуру выращивали в среде BHI при 30°C, 300 об/мин, в колбах с дефлекторами с селекцией антибиотиками. Один миллилитр этой ночной культуры инокулировали в среду на основе дрожжевого экстракта (50 мл) в колбе с дефлектором и выращивали при 30°C в течение 3 суток. Аликвоту спор удаляли, добавляли 1% Tween и споры перемешивали путем встряхивания в течение одной минуты. Споры собирали центрифугированием при 10000×g в течение 5 минут и супернатант, содержавший фрагменты экзоспория, фильтровали через 0,22-мкм фильтр для удаления каких-либо остаточных спор. Супернатант (содержавший разрушенные фрагменты экзоспория) фильтровали через мембранный фильтр с пороговым значением 100000 Да с получением очищенных фрагментов экзоспория, содержавших слитые белки. Белки с меньшей ММ удаляли путем пропускания через фильтр с пороговым значением 100 кДа. В фильтрате или ретентате супернатанта спор обнаружено не было.
[001156] На фиг.15 представлены фотографии, полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, демонстрирующие интактные споры Bacillus thuringiensis BT013A (панель A), окруженные прикрепленным к ним экзоспорием, и мутантные споры Bacillus thuringiensis BT013A с нокаутом CotE (панель B), от которых экзоспорий отделен. Стрелки на панели A фиг.15 указывают на экзоспорий интактных спор, в то время как стрелки на панели B на фиг.15 указывают на экзоспорий, который отделен от спор. На панели C на фиг.15 представлена фотография, полученная с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, очищенного препарата фрагментов экзоспория, полученного из спор Bacillus thuringiensis BT013A с нокаутом CotE (полученных, как описано выше посредством встряхивания, центрифугирования и фильтрации супернатанта), визуализированных посредством негативного окрашивания. Изображения получали на трансмиссионном микроскопе JEOL JEM 1400. Видимых фрагментов экзоспория не наблюдали, когда контрольные споры (Bacillus thuringiensis BT013A без нокаута CotE, экспрессирующие слитый белок BclA 20-35 Endo, данные не представлены) подвергали тем же процедурам встряхивания, центрифугирования, фильтрации, которые описаны выше.
[001157] Присутствие эндоглюканазы BclA 20-35 в коллекции фрагментов экзоспория из мутантов с нокаутом CotE и ExsY и доминантно-негативных мутантов CotO: Фрагменты экзоспория получали и очищали, как описано выше, которые содержали плазмиду pSUPER BclA 20-35-Endo, которая обеспечивает экзоспорий, который содержит ферменты-эндоглюканазы на поверхности спор. Фрагменты экзоспория, содержавшие эту конструкцию, получали из мутантных спор с нокаутом cotE, мутантных спор с нокаутом exsY, спор с доминантным N-концевым мутантом CotO или спор с доминантным C-концевым мутантом CotO. В каждом из этих экспериментов уровень активности эндоглюканазы на фрагментах экзоспория количественно определяли в качестве процента от общих уровней фермента. Эти результаты сравнивали против конструкции дикого типа, которая не содержала никаких мутантов, но содержала плазмиду pSUPER BclA 20-35-Endo.
[001158] Эффекты фрагментов экзоспория на рост растений: затем эти фрагменты экзоспория наносили посредством обработки семян на семена сои (как описано в примере 59 выше). Контроль дикого типа (B. thuringiensis BT013A, экспрессирующие конструкцию BclA 20-35 Endo) также наносили на семена сои. Для каждого эксперимента на каждое семя наносили 1 мкл фрагментов экзоспория из каждой конструкции или разведение фрагментов 1:2, 1:4 или 1:8.
Таблица 64: Ферментативная активность фрагментов экзоспория и ростовой ответ растений
[001159] Эти результаты демонстрируют, что мутации, которые разрушают экзоспорий, такие как мутация с нокаутом гена cotE или exsY, или доминантно-негативная мутация в белке CotO, можно использовать для получения фрагментов экзоспория, которые по существу свободны от спор, и демонстрируют, что эти фрагменты экзоспория содержат слитые белки, которые нацелены на экзоспорий. Эти фрагменты можно использовать для стимуляции роста растений и в других применениях. Существовал небольшой уровень фоновой активности эндоглюканазы в препарате фрагментов экзоспория из штамма BT013, не имеющего мутаций и экспрессирующего конструкцию BclA 20-25 Endo (BT013A BclA 20-35 Endo). Это было неожиданным и может соответствовать низкому уровню нестабильного экзоспория, который высвобождается из спор и захватывается в процессе сбора фрагментов экзоспория. Штаммы CotE и ExsY KO содержат наиболее высокое количество фермента во фракции фрагментов экзоспория. Доминантно-негативные мутанты CotO, которые экспрессируют слитый белок, также имеют повышенный уровень фермента во фракции фрагментов экзоспория.
[001160] Фрагменты экзоспория из мутантов CotE и ExsY (не экспрессирующих BclA 20-35 Endo), нанесенные непосредственно на растения, имели отрицательный эффект на рост и были исключены из этого эксперимента. Когда фрагменты экзоспория из BT013A BclA 20-35 Endo наносили на сою, это приводило к негативному фенотипу роста. Когда к сое добавляли фрагменты экзоспория из мутантов CotE или ExsY, экспрессировавших слитый белок BclA 20-35 Endo, происходило значительное увеличение скорости роста (+28,3% и +14,8% для фрагментов BT013A BclA 20-35 Endo). Фрагменты экзоспория с мутацией CotE все еще были активными в разведении 1:4, однако фрагменты экзоспория ExsY более не обеспечивали пользу для роста растений сои в этом разведении. Доминантно-негативные мутанты CotO, экспрессирующие слитый белок BclA 20-35 Endo, обеспечили небольшое увеличение роста сои по сравнению с фрагментами из BT013A BclA 20-35 Endo, обеспечив рост +6,5% и +2,7%, соответственно.
Пример 63: Дополнительная демонстрация пригодности эндофитных представителей семейства Bacillus cereus и других рекомбинантных видов Bacillus для эндофитной доставки пептидов, белков и ферментов в растение
[001161] Было обнаружено, что Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus thuringiensis EE-B00184, Bacillus cereus EE439 и Bacillus sp. EE387 обладают способностью к эндофитному росту и способны служить в качестве штамма-хозяина для системы BEMD (см. примеры 52 и 53). Для демонстрации способности этих Bacilli к эндофитному росту и способности служить в качестве штамма-хозяина для системы BEMD, каждый из этих штаммов трансформировали плазмидой pMK4-BclA 20-35-eGFP (описанной выше в примере 62). Споры получали и очищали, как описано выше в примере 40.
[001162] Эти споры разбавляли до концентрации 1×108/мл, а затем 1 мкл бульона с цельными клетками добавляли к коммерческим гибридным семенам кукурузы в горшечной почве при посеве. Семена кукурузы покрывали фунгицидом и биологическим инокулятом. Гибридный сорт кукурузы представлял собой BECK 6175YE, который содержит ген резистентности к глифосату ROUNDUP READY и ген резистентности к засухе AQUAMAX. Растения выращивали при искусственном освещении в течение 14 часов в сутки и определяли рост растений в течение десяти суток. В ходе эксперимента растения поливали каждые трое суток.
[001163] Затем Bacillus thuringiensis EE417, Bacillus thuringiensis EE-B00184, Bacillus cereus EE439 и Bacillus sp. EE387, экспрессирующие BclA 20-35-eGFP, выделяли из растений кукурузы. Растения, выращиваемые в течение десяти суток, извлекали из почвы и промывали для удаления избыточных остатков почвы. Растения переворачивали, промывали водой, подвергали воздействию 5% отбеливателя в течение десяти минут, промывали водой, подвергали воздействию 70% этанола в течение десяти минут, вновь промывали водой, и стебли разделяли стерильным лезвием бритвы. Разделенные половины стеблей помещали лицевой стороной вниз на чашки с питательным агаром на два часа при 30°C. Через два часа стебли удаляли и чашки с агаром инкубировали при 30°C в течение 48 часов. Через 48 часов чашки исследовали в отношении морфологии колоний, и колонии Bacillus, обнаруженные внутри растения, отбирали зубочисткой на чашки с питательным агаром и чашки с питательным агаром плюс хлорамфеникол (для селекции бактерий, содержащих плазмиду pMK4-20-35 BclA-eGFP). Результаты представлены в таблице 65. Эти результаты демонстрируют возможность введения системы BEMD в растение-мишень посредством экспрессии в эндофитном штамме представителя Bacillus cereus. На фиг.13 также продемонстрирована способность Bacillus thuringiensis EE-B00184 экспрессировать eGFP на спорах, о чем свидетельствует флуоресцентная микроскопия. На фиг.13, стрелками указаны единичные споры. На фиг.14 продемонстрирована способность выделенных бактериальных колоний к зеленой флуоресценции, что демонстрирует, что они в действительности доставляют представляющие интерес белок (в данном случае eGFP) внутрь растений. На фиг.14 представлена флуоресценция колоний эндофитных бактерий, выделенных из растений кукурузы на чашках, облученных лампой с фильтром для GFP.
Таблица 65: Эндофитная доставка "грузовых" белков
[001164] Чтобы далее продемонстрировать способность этих эндофитных штаммов экспрессировать белки на поверхности спор, следующие конструкции вводили в плазмиду Bacillus sp. EE387: pHP13, в которых эндоглюканаза была слита с любым из: BclA 20-35, CotB, CotG, CotC, CgeA, InhA, InhA2, InhA1, CotY или AcpC (аминокислоты 20-25 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 252, 256, 253, 254, 108, 121, 114, 111 и 120, соответственно). Конструкцию pSUPER BclA-20-35 Endo, описанную выше в примере 58, также вводили в Bacillus thuringiensis EE-B00184, другой эндофитный штамм. Скрининг трансформированных клеток проводили способом ПЦР и секвенированием по методу Сэнгера. Споры каждой из этих конструкций получали путем выращивания ночной культуры в BHI с селекцией (хлорамфеникол), и 500 мкл каждой культуры счищали на чашки с питательным агаром, и позволяли им инкубироваться при 30°C в течение 3 суток. Через 3 суток споры счищали в PBS, разбавляли до концентрации 1×108/мл, осаждали центрифугированием для выделения спор и проводили количественное определение фермента на спорах, как описано выше в примере 58. Концентрацию фермента вычисляли в качестве мЕ/мл для каждой конструкции. На способность Bacillus sp. EE387 экспрессировать слитые белки на поверхности их спор указывают уровни фермента. Bacillus sp. EE387 были способны экспрессировать все из слитых белков спор на их поверхности, однако AcpC (SEQ ID NO: 120) был наилучшим слитым белком для этого штамма. Эти данные были неожиданными, поскольку Bacillus sp. EE387 не является штаммом представителя семейства Bacillus cereus и не имеет экзоспория, но, тем не менее, демонстрирует поверхностную экспрессию слитых белков, включающих белки экзоспория или нацеливающие последовательности, происходящие из белков экзоспория (например, CotY, AcpC и аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1).
Таблица 66: Эндофитные штаммы Bacillus sp. EE387 (EE387) и Bacillus thuringiensis EE-B00184 (EE-B00184), экспрессирующие слитые белки
[001165] Эти эндофитные штаммы также можно вводить в растение путем добавления в среду для роста растений, в том числе почву, с составы для полива и в гранульные составы. Эндофитные штаммы также могут проникать в растение-мишень через надземные части растения. Это обеспечивает уникальный и эффективный механизм доставки представляющих интерес белков и пептидов в растение, или, в случае ДНК- и РНК-связывающих белков, доставку РНК и ДНК в растение.
[001166] Эти данные для Bacillus sp. EE387 также демонстрируют, что все из аминокислот 20-35 BclA (SEQ ID NO: 1) и SEQ ID NO: 108, 121 и 120 отчетливо имеют положительные данные в штаммах Bacillus вне семейства Bacillus cereus. Bacillus thuringiensis EE-B00184 также является исключительной экспрессирующей системой-хозяином. Эти уровни являются как заметными, так и положительными, что указывает на то, что консервативный механизм связывания для этих белков может присутствовать в других видах Bacillus.
[001167] Поверхностная экспрессия на спорах Bacillus thuringiensis EE-B00184. Bacillus thuringiensis EE-B00184 трансформировали pSUPER BclA 20-35 eGFP, и позволяли им спорулировать, как описано выше. Споры осаждали, промывали и подвергали флуоресцентной микроскопии для демонстрации поверхности спор, нагруженной белками eGFP, на фиг.13.
Пример 64: Экспрессия слитых белков в деградирующих гербициды и пестициды штаммах представителей семейства Bacillus cereus
[001168] Примеры 49 и 51 выше демонстрируют способность деградирующего гербицид штамма представителя семейства Bacillus cereus EE349 как деградировать гербициды, так и служить в качестве штамма-хозяина для экспрессии слитого белка, связанного с экзоспорием его спор. Для дальнейшей демонстрации способности деградирующих гербициды штаммов продуцировать нагруженный ферментом экзоспорий на их спорах, авторы настоящего ввели pHP13 CotC-Endo (SEQ ID NO: 253), pSUPER AcpC-Endo (SEQ ID NO: 120), pSUPER InhA2-Endo (SEQ ID NO: 121) и pSUPER 23-38 SEQ ID NO: 5-Endo) в представителя семейства Bacillus cereus EE-B00377. Описание pHP13 CotC-Endo может быть найдено в примере 54, описание pSUPER AcpC-Endo и pSUPER InhA2-Endo может быть найдено в примере 59, и описание pSUPER 23-38 SEQ ID NO: 5-Endo может быть найдено в примере 58. Было идентифицировано, что представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 эффективно деградирует пиретрин, дикамбу и 2,4-D. Деградацию гербицидов и пестицидов подтверждали как по росту на гербициде или пестициде в качестве источника питательных веществ, так и по снижению уровня дикамбы и 2,4-D в присутствии деградирующего гербицид или пестицид штамма. Плазмиды получали и клетки трансформировали идентично примеру 48 выше. Каждую конструкцию подтверждали секвенированием по методу Сэнгера. Споры получали с использованием среды для споруляции, и условия приведены в примере 48. Активность фермента также определяли, как в примере 58 выше.
Таблица 67: Уровни экспрессии фермантов слитых белков в деградирующем пестицид штамме представителя семейства Bacillus cereus EE-B00377
[001169] Как можно видеть из таблицы 67, представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 способен продуцировать эндоглюканазу и экспонировать эндоглюканазу на его экзоспории при использовании нескольких различных белков экзоспория или нацеливающих последовательностей. Из исследованных конструкций аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 253 обеспечили наиболее высокие уровни ферментов в этом штамме.
[001170] Этот пример демонстрирует способность системы экспонирования на споре экспрессироваться в деградирующих гербициды и пестициды штаммах. Эту систему можно использовать для экспрессии других белков-мишеней на поверхности спор, в том числе белков, которые сами действуют на гербициды или пестициды, такие как ферменты деградации гербицидов, ферменты деградации пестицидов, метаболические ферменты, редуктазы, оксидазы и другие полезные ферменты для разрушения пестицидов отдельно или в присутствии растений.
Пример 65: Применение свободной синтазы оксида азота (NOS) и связанной со спорами NOS для усиления прорастания растений
[001171] В примере 40 продемонстрирована способность синтазы оксида азота (NOS) из Bacillus subtilis 168 стимулировать прорастание, когда она связана с экзоспорием представителей семейства Bacillus cereus, и доставка этой слитой конструкции NOS-белок споры в семена или в область вблизи семян. В этом примере свободная NOS из Bacillus thuringiensis BT013A (SEQ ID NO: 261) и свободная eNOS (эпителиальная NOS из бычьих нейтрофилов, Sigma-Aldrich, каталожный номер № N1533) также может помогать индуцировать прорастание и увеличенный рост семян, подвергнутых воздействию NOS. Плазмиды pHP13 BclA-BT NOS, pHP13 BclA-BS NOS и pHP13 BclA-SODA (супероксиддисмутаза) получали идентично pHP13 BclA-BS NOS, как описано в примере 40, и трансформировали в Bacillus thuringiensis BT013A. pHP13 BclA- BT NOS содержит промотор BclA, инициирующий кодон, аминокислоты 20-35 BclA, линкер из 6 остатков аланина и ген NOS Bacillus thuringiensis BT013A (см. таблицу 9, SEQ ID NO: 263). pHP13 BclA-BS NOS содержит промотор BclA, инициирующий кодон, аминокислоты 20-35 BclA, линкер из 6 остатков аланина и ген NOS Bacillus subtilis 168 (см. таблицу 9, SEQ ID NO: 264). pHP13 BclA-SODA содержит промотор BclA, аминокислоты 20-35 BclA, линкер из 6 остатков аланина и ген супероксиддисмутазы 1 (SODA1) Bacillus cereus (SEQ ID NO: 155).
[001172] В таблице 68 представлены результаты анализа прорастания в почве. В этом анализе коммерческий сорт BECKʹS 294NR (ROUNDUP READY) покрывали либо 1 мкл воды (контроль), либо 1 мкл воды с добавлением 34,2 мЕ eNOS бычьих нейтрофилов. Затем 50 семян из каждой группы сеяли и выращивали, как описано в примере 58, но с 4 семенами на горшок. Через 7 суток измеряли высоту растений. Как видно из таблицы 68, присутствие eNOS позволяло увеличенный рост семян, что приводило к увеличению на 30,7% высоты побегов обработанной сои.
Таблица 68: Влияние свободной eNOS на рост растений в сое
[001173] В дополнение к испытанию прорастания в почве, описанному выше, проводили стандартные анализы прорастания, как описано в примере 40. Для сои авторы настоящего изобретения выбирали семена сои возрастом 2 года с низким уровнем прорастания и покрывали их по 1 мкл на каждое из 50 обрабатываемых семян. Обработка представляла собой контроль в виде H2O (вода), L-аргинин, Bacillus thuringiensis BT013A (контрольный штамм), Bacillus thuringiensis BT013A с pHP13 BclA-BT NOS и Bacillus thuringiensis BT013A с pHP13 BclA BS NOS. Результаты для сои представлены в таблице 69 ниже.
Таблица 69: Влияние экспонированной на спорах NOS на уровень прорастания в сое
[001174] Стандартные анализы прорастания также проводили, как как описано выше, для коммерческих гибридов сорго. Каждое из 50 обрабатываемых семян сорго покрывали по 0,5 мкл. Обработка представляла собой контроль в виде H2O (вода), L-аргинин, Bacillus thuringiensis BT013A (контрольный штамм), Bacillus thuringiensis BT013A с pHP13 BclA-BT NOS и Bacillus thuringiensis BT013A с pHP13 BclA BS NOS. Через 4 суток измеряли высоту побегов и длину корней для исследования увеличенного прорастания семян, и все данные нормализовывали к данным для контроля в виде воды. Результаты представлены в таблице 70 ниже. Добавление либо BT NOS, либо BS NOS привело к значительно увеличенной длине корня и росту побега, причем отличие было наиболее заметным в случае обработки BS NOS.
Таблица 70: Связанная со спорами NOS и увеличенное прорастание сорго
[001175] Эксперимент, описанный выше для сорго, повторяли, но с несколько другими обработками. Обработки включали контроль в виде H2O (вода), Bacillus thuringiensis BT013A (контрольный штамм), Bacillus thuringiensis BT013A с pHP13 BclA-SODA или свободную бычью eNOS. Через 4 суток измеряли высоту побегов и длину корней для изучения увеличенного прорастания семян, и все данные нормализовывали к данным для контроля в виде воды. Результаты представлены в таблице 71 ниже. Добавление либо BT SODA, либо свободного NOS (eNOS), приводит к значительно увеличенной длине корней и росту побегов.
Таблица 71: Связанная со спорами SODA и свободная NOS и увеличенный рост сорго
[001176] Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что сверхэкспрессию синтазы оксида азота из множества источников можно сообщать семенам и можно повышать их уровень прорастания и разрастания из семян как в почве, так и при традиционных способах проращивания. Этот эффект также может быть обнаружен при добавлении свободной NOS к семенам. Добавление супероксиддисмутазы к спорам также приводит к увеличению прорастания семян. L-аргинин способствовал увеличению уровня прорастания, когда его использовали отдельно, или способствовал в меньшей степени, когда его смешивали с ферментами NOS.
[001177] Гены NOS распространены в различных микроорганизмах, и эти микроорганизмы можно генетически модифицировать для усиления их способности экспрессировать NOS на семени или вблизи семени растения в среде для роста растений. Экспрессия NOS на спорах обеспечивает лучшую систему доставки, поскольку вегетативные микроорганизмы являются более нестабильными и не живут на семенах в течение длительных периодов времени. Экспрессия на спорах с использованием любых из нацеливающих последовательностей, белков экзоспория, фрагментов белков экзоспория и белков оболочки споры, описанных в настоящем описании, является эффективным путем доставки NOS в семена.
Пример 66: Модулирование экспрессии фермента и роста растений
[001178] Как продемонстрировано в примерах 44, 45 и 46, сверхэксрессия белка-модулятора в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, который совместно экспрессирует слитый белок, может приводить к увеличенным или сниженным уровням этого слитого белка, включаемого в экзоспорий. Слитые белки и конструкции получали и споры получали, как описано выше в примерах 44 и 45. Анализ роста проводили, как описано выше в примере 46.
[001179] Как можно видеть в таблице 72, экспрессия слитых белков pSUPER BclA 20-35 Endo на поверхности спор Bacillus thuringiensis BT013A с использованием аминокислот 20-35 SEQ ID NO: 1 в качестве нацеливающей последовательности приводила к увеличенному росту в кукурузе, сое и патиссоне. Этот эффект может усиливаться, когда сверхэкспрессируется второй белок экзоспория. Каждый из штаммов со сверхэкспрессией CotO, BxpB и YjcB имел выраженный эффект на рост кукурузы, сои и/или патиссона, причем наиболее выраженным было это увеличение роста в кукурузе.
Таблица 72: Связанная со спорами SODA и свободная NOS и увеличение роста сорго
[001180] Сверхэкспрессия других белков-модуляторов также может модулировать уровни экспрессии слитых белков, а также эффекты на рост растений, включая эффекты, описанные в настоящем примере и в примерах 44 и 45 выше. Каждый из них можно использовать для изменения или коррекции уровней фермента до желаемых эффективных уровней.
Пример 67: Сверхэкспрессия белков экзоспория и эффекты на растения
[001181] Сверхэкспрессия встречающихся в природе белков спор и экзоспория может влиять на эффект, который стимулирующие рост растений, эндофитные и другие представители семейства Bacillus cereus имеют на растения. Экспрессия различных белков экзоспория в качестве части слитого белка или в качестве свободного фермента может иметь благоприятные эффекты на растения, как проиллюстрировано выше для фосфатаз (примеры 11 и 36), синтазы оксида азота (пример 65) и протеаз, таких как InhA (примеры 3, 6, 7, 13). Другие белки экзоспория и спор, такие как аланинрацемаза и гидролазы, предпочитающие инозин и уридин, могут препятствовать или замедлять прорастание спор, и их сверхэкспрессия приведет к тому, что споры будут в меньшей степени подвержены быстрому прорастанию, которое является нежелательным побочным эффектом при использовании многих типов спор. Наконец, споры, которые сверхэкспрессируют определенные белки экзоспория, могут изменять общую сборку экзоспория, что приводит к изменениям связывания спор с растениями. Пример этого можно видеть в таблице 73 ниже.
[001182] Споры получали, как описано для Bacillus thuringiensis BT013A в примере 58. Анализ роста проводили путем помещения 1 мкл бульона с цельными клетками для каждой конструкции на семя кукурузы или 2 мкл на семя патиссона. Обработку семян, посев и регистрацию данных проводили, как описано в примере 58.
[001183] Штамм Bacillus mycoides EE155, стимулирующий рост растений штамм семейства Bacillus cereus, трансформировали экспрессирующими плазмидами, как описано в примере 44. Сверхэкспрессия белков экзоспория в этом штамме прямо приводила к увеличению связывания спор с растением, и она приводит к более высокой стимуляции роста растений. В частности, сверхэкспрессия BclB, BclA, CotO, CotE приводила к усиленной стимуляции роста растений. Можно сверхэкспрессировать другие белки экзоспория, которые могут приводить к изменениям структуры экзоспория, включая ExsY, ExsFA/BxpB, CotY, CotO, ExsFB, InhA1, InhA2, ExsJ, ExsH, YjcA, YjcB, BclC, AcpC, InhA3, аланинрацемазу 1, аланинрацемазу 2, BclA, BclB, BxpA, BclE, BetA/BAS3290, CotE, ExsA, ExsK, ExsB, YabG, Tgl, супероксиддисмутазу 1 (SODA1) и супероксиддисмутазу 2 (SODA2). Сверхэкспрессия или мутация любого из этих генов приводит к изменениям структуры экзоспория и приводит к повышению пользы в отношении роста растений, ассоциированной с представителями семейства Bacillus cereus.
Таблица 73: Сверхэкспрессия белков экзоспория в Bacillus mycoides EE155
Пример 68: Связывание с тканями растений с использованием экспонированных на экзоспории связывающих белков
[001184] Споры, которые являются пригодными для экспонирования экзогенных и эндогенных белков, можно использовать в качестве партнеров по слиянию для усиления связывания спор с поверхностями, в том числе с тканями растений. Для демонстрации этого признака споры Bacillus thuringiensis BT013A трансформировали плазмидами pSUPER BclA 20-35 TasA, pSUPER BclA 20-35 экспансин, pSUPER BclA 20-35 Endo и pSUPER BclA 20-35 контроль. TasA и экспансин представляют собой связывающиеся с растениями белки. Контрольная плазмида содержала промотор BclA, инициирующий кодон и аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1, но не включала партнер по слиянию. Эти конструкции получали идентично другим конструкциям, описанным выше в примере 58.
[001185] Для проведения анализа связывания тканей растения кукурузы выращивали в течение 2 недель и растения сои выращивали в течение 3 недель, как описано в примере 58, но без какой-либо обработки семян. Затем первичный лист и первый трилистник растений протирали 1 мл спор, содержавших каждую из описанных выше конструкций. Листья оставляли сохнуть, отсекали от растений и помещали в 50-мл коническую пробирку с 10 мл воды и интенсивно встряхивали. Споры, которые высвобождались с листа в воду, подсчитывали на гемоцитометре, и количества сравнивали с количествами, ожидаемыми в том случае, если бы споры не связывались с листьями. Этот эксперимент повторяли десять раз и проводили второй эксперимент, который вовлекал посев этой воды на чашки с антибиотиками (тетрациклин плюс питательный агар) в течение ночи при 30°C. Конечные количества представлены в таблице 74.
Таблица 74: Связывание ткани растения увеличивалось при экспрессии связывающего белка на спорах
[001186] Как можно видеть из таблицы 74, контрольные споры BT013A обладают высокой аффинностью к сое со связыванием 58,3% и 65,2% контрольных спор. Несмотря на это, экспрессия эндоглюканазы, экспансина или TasA на поверхности спор привела к повышению связывания сор с листьями сои, причем многие препараты спор достигали 100% связывания с листьями. В кукурузе происходило значительно меньшее связывание контрольных спор, особенно в анализе на чашках. Результаты анализа на чашках являются наиболее неожиданными, демонстрируя увеличение связывания для каждой из экспрессирующих конструкций, причем TasA обеспечивал 100% связывание спор в этом анализе.
[001187] Эти связывающие белки также можно использовать в любом из рекомбинантных спорообразующих микроорганизмов с использованием любой из экспрессирующих систем или партнеров по слиянию, описанных в настоящем описании. Эта система также является полезной совместно с полосами экзоспория для получения системы доставки белков, которая как является бесклеточной, так и прочно связывается с листьями.
Пример 69: Применение рекомбинантных спорообразующих бактерий, экспрессирующих слитые белки, содержащие белки Cot/Cge и фермент для стимуляции роста растений
[001188] Белки оболочки спор из белковых слоев обнаруживаются на всех спорах видов Bacillus, описанных в настоящем описании, а также родственных родов Virginibacillus, Lysinibacillus, Clostridia и Paenibacillus. Слияние представляющих интерес белков или пептидов с белками оболочки позволяет экспрессию чужеродных белков на поверхности споры и доставку этих представляющих интерес белков или пептидов в растения. Для демонстрации способности белков оболочки доставлять ферменты в растения была создана серия конструкций. Плазмиду pHP13 из коллекции Bacillus Genetic Stock Culture использовали для клонирования каждой из конструкций, описанных ниже, в участок множественного клонирования с использованием гомологичной рекомбинации с помощью их нативных промоторных элементов.
[001189] CotB, CotG и CotC из Bacillus subtilis M01099 или CgeA из Bacillus amyloliquefaciens подвергали слиянию в рамке считывания с геном эндоглюканазы eglS из Bacillus subtilis 168, геном липазы lipA из Bacillus subtilis 168 или геном pc-plc из Bacillus thuringiensis BT013A. Эти конструкции клонировали в pHP13 посредством гомологичной рекомбинации, подтверждали секвенированием по методу Сэнгера и трансформировали в Bacillus subtilis EE405, Bacillus subtilis A09, представитель семейства Bacillus cereus EE439, Bacillus sp. EE398 или Bacillus thuringiensis EE-B00184. Каждый трансформант также подвергали скринингу в отношении правильных клонов посредством секвенирования по методу Сэнгера. После подтверждения клонов каждый клон выращивали в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой (BHI) с тетрациклином (10 мкг/мл) в течение ночи при 30°C, и 100 мкл ночной культуры счищали на чашки с питательным агаром с тетрациклином. Эти чашки инкубировали при 30°C в течение 3 суток и споры собирали, счищая их с помощью смоченного водой хлопкового валика, и ресуспендировали в воде.
[001190] Затем споры для анализа эндоглюканазы разбавляли до 1×108 к.о.е./мл в воде и анализировали в отношении ферментативной активности с использованием хромофора 4-хлор-2 нитрофенилцеллотетрозы (4C2NC, 3 мМ в воде). Для этого способа 50 мкл спор помещали в 96-луночный планшет и в каждый планшет добавляли 50 мкл 300 нМ раствора 4C2NC. Затем планшет инкубировали при 30°C и считывали поглощение при 410 нм через 0,5 часа. Во всех случаях соответствующее поглощение контрольного штамма вычитали из общего поглощения каждого клона для устранения какой-либо фоновой активности.
[001191] Споры для анализа липазы разбавляли до 1×108 к.о.е./мл в воде и анализировали в отношении ферментативной активности во втором способе с использованием хромофора 4-нитрофенилпальмитата (4NP, 3 мМ в воде). Для этого способа 50 мкл спор помещали в 96-луночный планшет и в каждый планшет добавляли 50 мкл 300 нМ раствора 4NP. Затем планшет инкубировали при 30°C и считывали поглощение при 410 нм через 0,5 часа. Во всех случаях соответствующее поглощение контрольного штамма вычитали из общего поглощения каждого клона для устранения какой-либо фоновой активности.
[001192] Споры для анализа фосфолипазы разбавляли до 1×108 к.о.е./мл в воде и анализировали в отношении ферментативной активности, как описано выше для фосфолипазы в примере 58. Во всех случаях соответствующее поглощение контрольного штамма вычитали из общего поглощения каждого клона для устранения какой-либо фоновой активности.
[001193] Определение ростовых ответов растений и обработку и сбор проводили, как описано для патиссона в примере 58 выше. Все данные о росте нормализовывали к данным для контрольного штамма без экспонирования фермента на спорах.
Таблица 75: Слитые конструкции белков оболочки и их уровни экспрессии ферментов
N/A=не применимо
ND=не определено
[001194] Данные в таблице 75 демонстрируют, что белки оболочки широко действуют на ряд полезных для растений ферментов, как в представителях семейства Bacillus cereus (EE184, EE439), так и не в представителях семейства Bacillus cereus (EE405, A09 и EE387 из данного примера и примера 65). Добавление экспонированных на спорах ферментов, в этом примере эндоглюканазы, приводит в большинстве случаев к фенотипу увеличения роста растений.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[001195] Для дальнейшей иллюстрации ниже приведены дополнительные неограничивающие варианты осуществления настоящего изобретения.
[001196] Вариант осуществления 1 представляет собой слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 59; (2) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 59; (3) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 60; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 59; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 4-30 SEQ ID NO: 59; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 6-30 SEQ ID NO: 59; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 61; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 61; (9) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 61; (10) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 62; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 61; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 61; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 61; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 61; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 63; (16) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 63; (17) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 64; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 63; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 63; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 63; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 63; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 63; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 65; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 65; (25) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 65; (26) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 66; (27) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 107; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 65; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 65; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 67; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 67; (32) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 67; (33) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 68; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 67; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 67; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 67; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 69; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 69; (39) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 69; (40) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 70; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 69; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 69; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 69; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 69; (45) белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 72; (46) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 73; (47) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 74; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-42 SEQ ID NO: 75; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 27-42 SEQ ID NO: 75; (50) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 75; (51) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 76; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-42 SEQ ID NO: 75; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-42 SEQ ID NO: 75; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-42 SEQ ID NO: 75; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-42 SEQ ID NO: 75; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-42 SEQ ID NO: 75; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-42 SEQ ID NO: 75; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 77; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 77; (60) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 77; (61) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 78; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 77; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 77; (64) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 80; (65) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 81; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 81; (67) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 81; (68) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 82; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 81; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 81; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 81; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 81; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 81; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-34 SEQ ID NO: 83; (75) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 83; (76) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 84; (77) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 86; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 87; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 87; (80) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 87; (81) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 88; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 87; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 87; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 87; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 89; (86) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 89; (87) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 90; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 89; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 89; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 89; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-93 SEQ ID NO: 91; (92) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 91; (93) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 92; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-93 SEQ ID NO: 91; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-93 SEQ ID NO: 91; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-93 SEQ ID NO: 91; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-93 SEQ ID NO: 91; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-93 SEQ ID NO: 91; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-93 SEQ ID NO: 91; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-93 SEQ ID NO: 91; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 93; (102) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 93; (103) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 94; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 93; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 93; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 93; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 93; или (108) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 122.
[001197] Вариант осуществления 2 представляет собой слитый белок согласно варианту осуществления 1, где слитый белок содержит: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 59; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 4-30 SEQ ID NO: 59; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 6-30 SEQ ID NO: 59; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 61; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 61; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 61; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 61; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 63; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 63; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 63; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 63; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 63; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 65; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 65; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 67; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 67; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 67; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 69; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 69; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 69; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 69; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-42 SEQ ID NO: 75; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-42 SEQ ID NO: 75; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-42 SEQ ID NO: 75; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-42 SEQ ID NO: 75; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-42 SEQ ID NO: 75; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-42 SEQ ID NO: 75; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 77; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 77; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 81; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 81; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 81; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 81; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 81; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 87; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 87; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 87; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 89; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 89; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 89; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-93 SEQ ID NO: 91; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-93 SEQ ID NO: 91; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-93 SEQ ID NO: 91; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-93 SEQ ID NO: 91; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-93 SEQ ID NO: 91; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-93 SEQ ID NO: 91; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-93 SEQ ID NO: 91; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 93; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 93; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 93; или (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 93.
[001198] Вариант осуществления 3 представляет собой слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и: (1) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 20-33 SEQ ID NO: 1; (2) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 21-33 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 23-31 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 96; (5) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 96; (6) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 12-25 SEQ ID NO: 3; (7) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 13-25 SEQ ID NO: 3; (8) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 15-23 SEQ ID NO: 3; (9) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 97; (10) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 98; (11) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 23-36 SEQ ID NO: 5; (12) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 23-34 SEQ ID NO: 5; (13) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 24-36 SEQ ID NO: 5; (14) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 26-34 SEQ ID NO: 5; (15) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 13-26 SEQ ID NO: 7; (16) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 13-24 SEQ ID NO: 7; (17) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 14-26 SEQ ID NO: 7; (18) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 16-24 SEQ ID NO: 7; (19) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-22 SEQ ID NO: 9; (20) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-20 SEQ ID NO: 9; (21) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 10-22 SEQ ID NO: 9; (22) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 12-20 SEQ ID NO: 9; (23) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 105; (24) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 105; (25) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-31 SEQ ID NO: 11; (26) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-29 SEQ ID NO: 11; (27) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 19-31 SEQ ID NO: 11; (28) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 98; (29) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 98; (30) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-31 SEQ ID NO: 13; (31) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-29 SEQ ID NO: 13; (32) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 19-31 SEQ ID NO: 13; (33) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 21-29 SEQ ID NO: 13; (34) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 99; (35) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 99; (36) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 28-41 SEQ ID NO: 15; (37) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 28-39 SEQ ID NO: 15; (38) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 29-41 SEQ ID NO: 15; (39) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 31-39 SEQ ID NO: 15; (40) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 12-25 SEQ ID NO: 17; (41) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 13-25 SEQ ID NO: 17; (42) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 100; (43) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-31 SEQ ID NO: 19; (44) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-29 SEQ ID NO: 19; (45) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 19-31 SEQ ID NO: 19; (46) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 21-29 SEQ ID NO: 19; (47) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-31 SEQ ID NO: 21; (48) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-29 SEQ ID NO: 21; (49) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 19-31 SEQ ID NO: 21; (50) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 21-29 SEQ ID NO: 21; (51) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 101; (52) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 101; (53) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-22 SEQ ID NO: 23; (54) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-20 SEQ ID NO: 23; (55) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 10-22 SEQ ID NO: 23; (56) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 12-20 SEQ ID NO: 23; (57) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 102; (58) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 102; (59) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-22 SEQ ID NO: 25; (60) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 9-20 SEQ ID NO: 25; (61) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 10-22 SEQ ID NO: 25; (62) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 12-20 SEQ ID NO: 25; (63) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 103; (64) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 103; (65) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 15-28 SEQ ID NO: 27; (66) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 15-26 SEQ ID NO: 27; (67) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 16-28 SEQ ID NO: 27; (68) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-26 SEQ ID NO: 27; (69) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 104; (70) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 104; (71) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 33; (72) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-11 SEQ ID NO: 33; (73) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 3-11 SEQ ID NO: 33; (74) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-14 SEQ ID NO: 35; (75) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-12 SEQ ID NO: 35; (76) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 2-14 SEQ ID NO: 35; (77) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 14-27 SEQ ID NO: 43; (78) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 14-25 SEQ ID NO: 43; (79) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 15-27 SEQ ID NO: 43; (80) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 20-33 SEQ ID NO: 45; (81) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 20-31 SEQ ID NO: 45; (82) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 21-33 SEQ ID NO: 45; (83) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 106; (84) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 1-13 SEQ ID NO: 106; (85) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 28-41 SEQ ID NO: 47; (86) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 28-39 SEQ ID NO: 47; (87) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-31 SEQ ID NO: 53; (88) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 18-29 SEQ ID NO: 53; (89) нацеливающую последовательность, состоящую из аминокислот 19-31 SEQ ID NO: 53; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-31 SEQ ID NO: 61; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-29 SEQ ID NO: 61; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 19-31 SEQ ID NO: 61; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-22 SEQ ID NO: 65; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-20 SEQ ID NO: 65; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-22 SEQ ID NO: 65; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 107; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-13 SEQ ID NO: 107; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-25 SEQ ID NO: 67; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-23 SEQ ID NO: 67; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-25 SEQ ID NO: 67; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-23 SEQ ID NO: 67; (102) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-36 SEQ ID NO: 69; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-34 SEQ ID NO: 69; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 24-36 SEQ ID NO: 69; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 26-34 SEQ ID NO: 69; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 27-40 SEQ ID NO: 75; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 27-38 SEQ ID NO: 75; (108) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-22 SEQ ID NO: 77; (109) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-20 SEQ ID NO: 77; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10¬¬-22 SEQ ID NO: 77; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-20 SEQ ID NO: 77; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-36 SEQ ID NO: 81; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-34 SEQ ID NO: 81; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 24-36 SEQ ID NO: 81; (115) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 26-34 SEQ ID NO: 81; (116) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-26 SEQ ID NO: 87; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-24 SEQ ID NO: 87; или (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-26 SEQ ID NO: 87.
[001199] Вариант осуществления 4 представляет собой слитый белок, содержащий фермент, который катализирует продукцию оксида азота, или связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, и: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 1; (5) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 2; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 3; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 3; (13) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 3; (14) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 4; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 5; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 5; (21) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 5; (22) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 6; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 7; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 7; (31) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 7; (32) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 8; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 9; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 9; (39) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 9; (40) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 10; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 11; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 11; (46) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 11; (47) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 12; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 13; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 13; (55) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 13; (56) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 14; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 15; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 15; (64) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 15; (65) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 16; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 17; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 17; (75) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 17; (76) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 18; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 19; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 19; (83) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 19; (84) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 20; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 21; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 21; (92) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 21; (93) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 22; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 23; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 23; (101) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 23; (102) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 24; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 25; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 25; (108) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 25; (109) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 26; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 27; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 27; (115) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 27; (116) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 28; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (119) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (120) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (121) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 29; (122) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 29; (123) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 29; (124) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 30; (125) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (126) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (127) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (128) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (129) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (130) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 31; (131) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 31; (132) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 31; (133) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 32; (134) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (135) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (136) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (137) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 33; (138) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 33; (139) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 34; (140) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-16 SEQ ID NO: 35; (141) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 35; (142) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 36; (143) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-29 SEQ ID NO: 43; (144) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-29 SEQ ID NO: 43; (145) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 43; (146) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 44; (147) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (148) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (149) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (150) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (151) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 45; (152) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 45; (153) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 45; (154) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 46; (155) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (156) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (157) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (158) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (159) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (160) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 47; (161) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 47; (162) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 47; (163) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 48; (164) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (165) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (166) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (167) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (168) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (169) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (170) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (171) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-32 SEQ ID NO: 49; (172) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 17-32 SEQ ID NO: 49; (173) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 49; (174) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 50; (175) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (176) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (177) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (178) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (179) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (180) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 51; (181) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 51; (182) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 51; (183) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 52; (184) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (185) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (186) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (187) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (188) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (189) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 53; (190) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 53; (191) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 53; (192) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 54; (193) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (194) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (195) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (196) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (197) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (198) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 55; (199) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 55; (200) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 55; (201) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 56; (202) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (203) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (204) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (205) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (206) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 57; (207) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 115-130 SEQ ID NO: 57; (208) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 57; (209) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 58; (210) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (211) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (212) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (213) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (214) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (215) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (216) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (217) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (218) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (219) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (220) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (221) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; (222) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57; (223) фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 95; (224) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 96; (225) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 97; (226) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 98; (227) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 99; (228) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 100; (229) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 101; (230) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 102; (231) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 103; (232) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 104; (233) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 105; (234) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 106; (235) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 108; (236) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 109; (237) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 110; (238) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 111; (239) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 112; (240) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 113; (241) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 114; (242) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 115; (243) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 116; (244) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 117; (245) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 118; (246) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 119; (247) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 120; (248) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 121; (249) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-31 SEQ ID NO: 1; (250) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-33 SEQ ID NO: 1; (251) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-31 SEQ ID NO: 1; (252) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-23 SEQ ID NO: 3; (253) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-25 SEQ ID NO: 3; или (254) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-23 SEQ ID NO: 3.
[001200] Вариант осуществления 5 представляет собой слитый белок, содержащий антиген или фермент рекультивации и: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-31 SEQ ID NO: 1; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-33 SEQ ID NO: 1; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-31 SEQ ID NO: 1; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-23 SEQ ID NO: 3; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-25 SEQ ID NO: 3; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-23 SEQ ID NO: 3; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 9; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 9; (28) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 9; (29) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 10; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 11; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 11; (35) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 11; (36) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 12; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 13; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 13; (44) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 13; (45) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 14; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 15; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 15; (53) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 15; (54) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 16; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 17; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 17; (64) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 17; (65) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 18; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 19; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 19; (72) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 19; (73) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 20; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (75) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (76) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 21; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 21; (81) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 21; (82) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 22; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 23; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 23; (90) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 23; (91) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 24; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 25; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 25; (97) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 25; (98) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 26; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (102) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 27; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 27; (104) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 27; (105) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 28; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (108) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (109) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 29; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 29; (112) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 29; (113) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 30; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (115) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (116) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (119) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 31; (120) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 31; (121) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 31; (122) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 32; (123) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (124) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (125) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (126) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 33; (127) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 33; (128) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 34; (129) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-16 SEQ ID NO: 35; (130) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 35; (131) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 36; (132) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-29 SEQ ID NO: 43; (133) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-29 SEQ ID NO: 43; (134) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 43; (135) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 44; (136) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (137) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (138) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (139) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (140) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 45; (141) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 45; (142) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 45; (143) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 46; (144) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (145) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (146) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (147) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (148) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (149) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 47; (150) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 47; (151) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 47; (152) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 48; (153) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (154) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (155) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (156) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (157) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (158) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (159) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (160) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-32 SEQ ID NO: 49; (161) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 17-32 SEQ ID NO: 49; (162) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 49; (163) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 50; (164) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (165) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (166) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (167) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (168) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (169) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 51; (170) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 51; (171) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 51; (172) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 52; (173) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (174) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (175) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (176) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (177) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (178) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 53; (179) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 53; (180) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 53; (181) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 54; (182) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (183) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (184) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (185) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (186) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (187) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 55; (188) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 55; (189) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 55; (190) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 56; (191) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (192) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (193) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (194) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (195) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 57; (196) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 115-130 SEQ ID NO: 57; (197) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 57; (198) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 58; (199) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (200) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (201) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (202) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (203) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (204) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (205) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (206) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (207) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (208) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (209) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (210) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; (211) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57; (212) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 97; (213) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 98; (214) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 99; (215) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 100; (216) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 101; (217) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 102; (218) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 103; (219) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 104; (220) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 105; (221) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 106; (222) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 108; (223) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 109; (224) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 110; (225) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 111; (226) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 112; (227) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 113; (228) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 114; (229) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 115; (230) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 116; (231) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 117; (232) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 118; (233) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 119; (234) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 120; или (235) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 121.
[001201] Вариант осуществления 6 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 1-3, где представляющий интерес белок или пептид включает антиген или фермент рекультивации.
[001202] Вариант осуществления 7 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 1-3, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва пласта, или антибактериальный белок или пептид.
[001203] Вариант осуществления 8 представляет собой слитый белок, содержащий фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва пласта, или антибактериальный белок или пептид и: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 1; (5) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 2; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 3; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 3; (13) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 3; (14) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 4; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 5; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 5; (21) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 5; (22) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 6; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 7; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 7; (31) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 7; (32) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 8; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 9; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 9; (39) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 9; (40) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 10; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 11; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 11; (46) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 11; (47) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 12; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 13; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 13; (55) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 13; (56) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 14; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 15; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 15; (64) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 15; (65) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 16; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 17; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 17; (75) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 17; (76) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 18; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 19; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 19; (83) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 19; (84) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 20; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 21; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 21; (92) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 21; (93) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 22; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 23; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 23; (101) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 23; (102) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 24; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 25; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 25; (108) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 25; (109) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 26; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 27; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 27; (115) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 27; (116) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 28; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (119) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (120) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (121) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 29; (122) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 29; (123) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 29; (124) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 30; (125) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (126) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (127) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (128) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (129) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (130) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 31; (131) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 31; (132) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 31; (133) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 32; (134) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (135) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (136) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (137) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 33; (138) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 33; (139) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 34; (140) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-16 SEQ ID NO: 35; (141) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 35; (142) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 36; (143) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-29 SEQ ID NO: 43; (144) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-29 SEQ ID NO: 43; (145) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 43; (146) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 44; (147) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (148) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (149) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (150) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (151) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 45; (152) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 45; (153) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 45; (154) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 46; (155) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (156) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (157) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (158) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (159) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (160) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 47; (161) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 47; (162) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 47; (163) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 48; (164) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (165) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (166) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (167) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (168) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (169) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (170) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (171) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-32 SEQ ID NO: 49; (172) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 17-32 SEQ ID NO: 49; (173) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 49; (174) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 50; (175) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (176) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (177) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (178) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (179) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (180) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 51; (181) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 51; (182) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 51; (183) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 52; (184) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (185) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (186) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (187) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (188) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (189) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 53; (190) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 53; (191) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 53; (192) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 54; (193) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (194) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (195) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (196) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (197) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (198) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 55; (199) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 55; (200) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 55; (201) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 56; (202) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (203) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (204) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (205) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (206) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 57; (207) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 115-130 SEQ ID NO: 57; (208) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 57; (209) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 58; (210) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (211) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (212) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (213) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (214) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (215) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (216) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (217) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (218) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (219) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (220) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (221) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; (222) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57; (223) фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 95; (224) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 96; (225) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 97; (226) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 98; (227) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 99; (228) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 100; (229) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 101; (230) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 102; (231) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 103; (232) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 104; (233) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 105; (234) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 106; (235) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 108; (236) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 109; (237) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 110; (238) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 111; (239) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 112; (240) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 113; (241) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 114; (242) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 115; (243) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 116; (244) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 117; (245) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 118; (246) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 119; (247) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 120; (248) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 121; (249) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-31 SEQ ID NO: 1; (250) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-33 SEQ ID NO: 1; (251) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-31 SEQ ID NO: 1; (252) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-23 SEQ ID NO: 3; (253) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-25 SEQ ID NO: 3; или (254) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-23 SEQ ID NO: 3.
[001204] Вариант осуществления 9 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 5-8, где нацеливающая последовательность содержит: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (64) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (65) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (75) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (76) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (102) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (108) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (109) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (115) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (116) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; или (119) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57.
[001205] Вариант осуществления 10 представляет собой слитый белок согласно варианту осуществления 9, в котором нацеливающая последовательность включает: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (64) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (65) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51; (75) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (76) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; или (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57.
[001206] Вариант осуществления 11 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 5-10, в котором нацеливающая последовательность включает: (1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9; (2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9; (3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11; (4) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11; (5) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11; (6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11; (7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13; (8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13; (9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13; (10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13; (11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15; (12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15; (13) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15; (14) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15; (15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15; (16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15; (17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17; (18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17; (19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17; (20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19; (21) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19; (22) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19; (23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19; (24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21; (25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21; (26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21; (27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21; (28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23; (29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23; (30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25; (31) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25; (32) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27; (33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27; (34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27; (35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29; (36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29; (37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29; (38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29; (39) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31; (40) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31; (41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43; (42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43; (43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43; (44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45; (45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45; (46) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45; (47) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45; (48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47; (49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47; (50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47; (51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47; (52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47; (53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47; (54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49; (55) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49; (56) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49; (57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49; (58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51; (59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51; (60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51; (61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51; (62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53; (63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53; (64) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53; (65) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53; (66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55; (67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55; (68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55; (69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57; (70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57; (71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 57; (72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57; (73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57; (74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57; (75) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57; (76) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57; (77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57; (78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57; (79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57; (80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57; (81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 4-30 SEQ ID NO: 59; (82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 6-30 SEQ ID NO: 59; (83) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 61; (84) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 61; (85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 61; (86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 63; (87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 63; (88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 63; (89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 63; (90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 65; (91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 67; (92) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 67; (93) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 69; (94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 69; (95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 69; (96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-42 SEQ ID NO: 75; (97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-42 SEQ ID NO: 75; (98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-42 SEQ ID NO: 75; (99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-42 SEQ ID NO: 75; (100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-42 SEQ ID NO: 75; (101) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 77; (102) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 81; (103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 81; (104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 81; (105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 81; (106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 87; (107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 87; (108) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 89; (109) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 89; (110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-93 SEQ ID NO: 91; (111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-93 SEQ ID NO: 91; (112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-93 SEQ ID NO: 91; (113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-93 SEQ ID NO: 91; (114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-93 SEQ ID NO: 91; (115) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-93 SEQ ID NO: 91; (116) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 93; (117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 93; или (118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 93.
[001207] Вариант осуществления 12 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 5 и 9-11, где представляющий интерес белок или пептид включает антиген.
[001208] Вариант осуществления 13 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 5 и 9-11, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент рекультивации.
[001209] Вариант осуществления 14 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 7-11, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля в жидкости гидроразрыва пласта.
[001210] Вариант осуществления 15 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 7-11, где представляющий интерес белок или пептид включает антибактериальный белок или пептид.
[001211] Вариант осуществления 16 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 1-15.
[001212] Вариант осуществления 17 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует:
(i) слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus; и
(ii) белок-модулятор, где экспрессия белка-модулятора увеличена по сравнению с экспрессией белка-модулятора в представителе семейства Bacillus cereus в тех же условиях; и
где совместная экспрессия белка-модулятора со слитым белком в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus приводит к увеличенной или сниженной экспрессии слитого белка относительно уровня экспрессии слитого белка в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, который не экспрессирует белок-модулятор на увеличенном уровне, в тех же условиях по сравнению с экспрессией белка-модулятора в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа.
[001213] Вариант осуществления 18 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 17, где белок-модулятор включает белок ExsY, белок ExsFA/BxpB, белок CotY, белок CotO, белок ExsFB, белок InhA1, белок InhA2, белок ExsJ, белок ExsH, белок YjcA, белок YjcB, белок BclC, белок AcpC, белок InhA3, аланинрацемазу 1, аланинрацемазу 2, белок BclA, белок BclB, белок BxpA, белок BclE, белок BetA/BAS3290, белок CotE, белок ExsA, белок ExsK, белок ExsB, белок YabG, белок Tgl, белок SODA1, белок SODA2, вариант любого из них или комбинацию любых из них.
[001214] Вариант осуществления 19 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 17 или 18, где белок-модулятор, когда он совместно экспрессируется в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus со слитым белком, приводит к увеличенной экспрессии слитого белка относительно уровня экспрессии слитого белка в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, который не экспрессирует белок-модулятор на увеличенном уровне, в тех же условиях по сравнению с экспрессией белка-модулятора в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа.
[001215] Вариант осуществления 20 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 19, где белок-модулятор включает белок BclB, белок CotE, a BxpB белок, белок CotO, белок BclA, вариант любого из них или комбинацию любых из них.
[001216] Вариант осуществления 21 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 17 или 18, где белок-модулятор, когда он совместно экспрессируется в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus со слитым белком, приводит к сниженной экспрессии слитого белка относительно уровня экспрессии слитого белка в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus, который не экспрессирует белок-модулятор на повышенным уровне, в тех же условиях по сравнению с экспрессией белка-модулятора в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа.
[001217] Вариант осуществления 22 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 21, где белок-модулятор включает белок BclC, белок ApcC, белок YjcB, вариант любого из них или комбинацию любых из них.
[001218] Вариант осуществления 23 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 17 или 18, где белок-модулятор включает белок CotO, белок BclB, белок ExsFA/BxpB, белок YjcB, вариант любого из них или комбинацию любых из них.
[001219] Вариант осуществления 24 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 17-23, где белок-модулятор содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 123-156.
[001220] Вариант осуществления 25 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 17-24, где белок-модулятор включает SEQ ID NO: 124, 126, 134, 135, 143 или 144.
[001221] Вариант осуществления 26 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 17-25, содержащий вектор, кодирующий белок-модулятор.
[001222] Вариант осуществления 27 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 26, где вектор включает многокопийный плазмидный вектор.
[001223] Вариант осуществления 28 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus; где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию, которая частично или полностью инактивирует споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или повышает чувствительность спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus к физической или химической инактивации по сравнению с теми же спорами, которые не содержат мутацию, и где мутация включает мутацию в гене, кодирующем рецептор прорастания, мутацию в гене, кодирующем литический фермент коры споры, мутацию в гене, кодирующем малый растворимый в кислоте белок споры (SASP), или мутацию в гене, кодирующем белок оболочки или коры споры.
[001224] Вариант осуществления 29 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 1-15; где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию, которая частично или полностью инактивирует споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или повышает чувствительность спор рекомбинантного представителя Bacillus cereus к физической или химической инактивации по сравнению с теми же спорами, которые не содержат мутацию.
[001225] Вариант осуществления 30 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus, которая экспрессирует протеазу или нуклеазу, где экспрессия протеазы или нуклеазы увеличена по сравнению с экспрессией протеазы или нуклеазы в бактерии дикого типа рода Bacillus в тех же условиях, и где увеличенная экспрессия протеазы или нуклеазы частично или полностью инактивирует споры рекомбинантной бактерии рода Bacillus или повышает чувствительность спор рекомбинантной бактерии рода Bacillus к физической или химической инактивации.
[001226] Вариант осуществления 31 представляет собой рекомбинантную бактерию согласно варианту осуществления 30, где рекомбинантная бактерия рода Bacillus включает рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus.
[001227] Вариант осуществления 32 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно варианту осуществления 30 или 31, где рекомбинантная бактерия рода Bacillus экспрессирует протеазу и нуклеазу, где экспрессия протеазы увеличена по сравнению с экспрессией в бактерии дикого типа рода Bacillus в тех же условиях и экспрессия нуклеазы увеличена по сравнению с экспрессией нуклеазы в бактерии дикого типа рода Bacillus в тех же условиях.
[001228] Вариант осуществления 33 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно любому из вариантов осуществления 30-32, где протеаза включает неспецифическую протеазу.
[001229] Вариант осуществления 34 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно любому из вариантов осуществления 30-33, где протеаза включает сериновую протеазу, треониновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспартатную протеазу, протеазу глутаминовой кислоты, щелочную протеазу, субтилизин, гистидиновую протеазу или металлопротеиназу.
[001230] Вариант осуществления 35 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно любому из вариантов осуществления 30, 32 и 34, где протеаза включает протеазу прорастания споры.
[001231] Вариант осуществления 36 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно варианту осуществления 35, где протеаза прорастания споры включает активную форму протеазы прорастания споры.
[001232] Вариант осуществления 37 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно варианту осуществления 35 или 36, где протеаза прорастания споры включает протеазу прорастания споры Bacillus subtilis, протеазу прорастания споры Bacillus mycoides или протеазу прорастания споры Bacillus thuringiensis.
[001233] Вариант осуществления 38 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно любому из вариантов осуществления 35-37, где протеаза прорастания споры содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 233 или 234.
[001234] Вариант осуществления 39 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно любому из вариантов осуществления 30-38, где нуклеаза включает эндонуклеазу или экзонуклеазу.
[001235] Вариант осуществления 40 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно варианту осуществления 39, где нуклеаза включает неспецифическую эндонуклеазу.
[001236] Вариант осуществления 41 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно варианту осуществления 40, где неспецифическая эндонуклеаза включает эндонуклеазу 1 Bacillus subtilis.
[001237] Вариант осуществления 42 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно варианту осуществления 40 или 41, где неспецифическая эндонуклеаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 232.
[001238] Вариант осуществления 43 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно любому из вариантов осуществления 30-42, где нуклеаза или протеаза экспрессируется под контролем промотора, содержащего промоторную последовательность сигма G.
[001239] Вариант осуществления 44 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно варианту осуществления 43, где промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с последовательностью нуклеиновой кислоты согласно любой из SEQ ID NO: 235-246.
[001240] Вариант осуществления 45 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно любому из вариантов осуществления 30-44, где споры рекомбинантной бактерии рода Bacillus являются более чувствительными к инактивации посредством облучения ультрафиолетовым излучением, облучения гамма-излучением или обработки отбеливателем, пероксидом водорода, хлороформом, фенолом или уксусной кислотой относительно тех же спор, которые не экспрессируют протеазу или нуклеазу на повышенном уровне по сравнению с экспрессией протеазы или нуклеазы в бактерии дикого типа рода Bacillus, обработанной в тех же условиях.
[001241] Вариант осуществления 46 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 31-45, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, кроме того, содержит мутацию, которая частично или полностью инактивирует споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или повышает чувствительность спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus к физической или химической инактивации по сравнению с теми же спорами, которые не содержат мутацию.
[001242] Вариант осуществления 47 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 46, где мутация включает мутацию в гене, кодирующем рецептор прорастания, мутацию в гене, кодирующем литический фермент коры споры, мутацию в гене, кодирующем малый растворимый в кислоте белок споры (SASP), или мутацию в гене, кодирующем белок оболочки или коры споры.
[001243] Вариант осуществления 48 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 28, 29 или 47, где мутация включает мутацию в гене, кодирующем рецептор прорастания.
[001244] Вариант осуществления 49 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 48, где мутация в гене, кодирующем рецептор прорастания, включает нокаут гена, кодирующего рецептор прорастания.
[001245] Вариант осуществления 50 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 48 или 49, где рецептор прорастания включает GerA, GerB, GerK, GerH, GerI, GerG, GerL, GerQ, GerR, GerS, GerN, GerU или GerX.
[001246] Вариант осуществления 51 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 28, 29 и 47-50, где мутация включает мутацию в гене, кодирующем литический фермент коры споры.
[001247] Вариант осуществления 52 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 51, где мутация в гене, кодирующем литический фермент коры споры, включает нокаут гена, кодирующего литический фермент коры споры.
[001248] Вариант осуществления 53 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 51 или 52, где литический фермент коры споры включает SleB или CwlJ.
[001249] Вариант осуществления 54 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 28, 29 и 47-53, где мутация включает мутацию в гене, кодирующем SASP.
[001250] Вариант осуществления 55 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 54, где мутация в гене, кодирующем SASP, включает нокаут гена, кодирующего SASP.
[001251] Вариант осуществления 56 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 54 или 55, где мутация в гене, кодирующем SASP, включает мутацию в гене SspA, мутацию в гене SspB, мутацию в гене SspC, мутацию в гене SspD, мутацию в гене SspE, мутацию в гене SspF, мутацию в гене SspG, мутацию в гене SspH, мутацию в гене SspI, мутацию в гене SspJ, мутацию в гене SspK, мутацию в гене SspL, мутацию в гене SspM, мутацию в гене SspN, мутацию в гене SspO, мутацию в гене SspP или их комбинацию.
[001252] Вариант осуществления 57 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 54-56, где SASP включает SASPα, SASPβ или SASPγ.
[001253] Вариант осуществления 58 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 54-57, где споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus являются более чувствительными к инактивации посредством облучения ультрафиолетовым излучением или облучения гамма-излучением по сравнению с теми же спорами, которые не содержат мутацию в гене, кодирующем SASP.
[001254] Вариант осуществления 59 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 28, 29 и 47-58, где мутация включает мутацию в гене, кодирующем белок оболочки или коры споры.
[001255] Вариант осуществления 60 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 59, где мутация в гене, кодирующем белок оболочки или коры споры, включает нокаут гена, кодирующего белок оболочки или коры споры.
[001256] Вариант осуществления 61 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 59 или 60, где белок оболочки или коры споры включает CotA, CotB или CotC.
[001257] Вариант осуществления 62 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 59-61, где споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus являются более чувствительными к инактивации посредством облучения ультрафиолетовым излучением, облучения гамма-излучением или посредством обработки отбеливателем, пероксидом водорода, хлороформом, фенолом или уксусной кислотой, по сравнению с теми же спорами, которые не содержат мутацию в белке оболочки или коры споры, обработанными в тех же условиях.
[001258] Вариант осуществления 63 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 31-62, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus также экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[001259] Вариант осуществления 64 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует белок экзоспория, где экспрессия белка экзоспория увеличена по сравнению с экспрессией белка экзоспория в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях, и где белок экзоспория включает:
фермент экзоспория, где фермент экзоспория включает фермент, вовлеченный в солюбилизацию питательных веществ, инозинуридингидролазу, протеазу, фермент, который катализирует деградацию свободного радикала, аргиназу или аланинрацемазу; или
белок BclA, белок BclB, белок CotE белок CotO, an белок ExsY, белок ExsFA/BxpB, белок CotY, белок ExsFB, белок ExsJ, белок ExsH, белок YjcA, белок YjcB, белок BclC, белок BxpA, белок BclE, белок BetA/BAS3290, белок ExsA, белок ExsK, белок ExsB, белок YabG или белок Tgl.
[001260] Вариант осуществления 65 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 64, где белок экзоспория не является частью слитого белка.
[001261] Вариант осуществления 66 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 64 или 65, где белок экзоспория включает фермент экзоспория, где фермент экзоспория включает фермент, вовлеченный в солюбилизацию питательных веществ, инозинуридингидролазу, протеазу, фермент, который катализирует деградацию свободного радикала, аргиназу или аланинрацемазу.
[001262] Вариант осуществления 67 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 66, где фермент, вовлеченный в солюбилизацию питательных веществ, включает фермент, вовлеченный в солюбилизацию фосфатов.
[001263] Вариант осуществления 68 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 67, где фермент, вовлеченный в солюбилизацию фосфатов, включает кислую фосфатазу.
[001264] Вариант осуществления 69 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 68, где кислая фосфатаза включает AcpC.
[001265] Вариант осуществления 70 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 68 или 69, где кислая фосфатаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 137.
[001266] Вариант осуществления 71 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 64 или 65, где фермент экзоспория включает инозинуридингидролазу.
[001267] Вариант осуществления 72 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 71, где инозинуридингидролаза включает IunH1 или IunH2.
[001268] Вариант осуществления 73 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 71 или 72, где инозинуридингидролаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 250 или 251.
[001269] Вариант осуществления 74 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 64 или 65, где фермент экзоспория включает протеазу.
[001270] Вариант осуществления 75 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 74, где протеаза включает металлопротеиназу.
[001271] Вариант осуществления 76 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 75, где металлопротеиназа включает InhA1, InhA2 или InhA3.
[001272] Вариант осуществления 77 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 75 или 76, где металлопротеиназа содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 100% идентичностью с SEQ ID NO: 114, 121, 122, 129, 130 или 138.
[001273] Вариант осуществления 78 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 64 или 65, где фермент, который катализирует деградацию свободного радикала, включает супероксиддисмутазу.
[001274] Вариант осуществления 79 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 78, где супероксиддисмутаза включает супероксиддисмутазу 1 (SODA1) или супероксиддисмутазу 2 (SODA2).
[001275] Вариант осуществления 80 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 78 или 79, где супероксиддисмутаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[001276] Вариант осуществления 81 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 64 или 65, где фермент экзоспория включает аргиназу.
[001277] Вариант осуществления 82 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 81, где аргиназа включает аргиназу Bacillus thuringiensis.
[001278] Вариант осуществления 83 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 81 или 82, где аргиназа содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 249.
[001279] Вариант осуществления 84 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 64 или 65, где фермент экзоспория включает аланинрацемазу.
[001280] Вариант осуществления 85 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 84, где аланинрацемаза включает аланинрацемазу 1 (ALR1) или аланинрацемазу 2 (ALR2).
[001281] Вариант осуществления 86 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 84 или 85, где аланинрацемаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 247 или 248.
[001282] Вариант осуществления 87 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 64 или 65, где белок экзоспория включает белок BclA, белок BclB, белок CotE белок CotO, an белок ExsY, белок ExsFA/BxpB, белок CotY, белок ExsFB, белок ExsJ, белок ExsH, белок YjcA, белок YjcB, белок BclC, белок BxpA, белок BclE, белок BetA/BAS3290, белок ExsA, белок ExsK, белок ExsB, белок YabG или белок Tgl.
[001283] Вариант осуществления 88 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 87, где белок экзоспория включает белок BclA, белок BclB, белок CotE или белок CotO.
[001284] Вариант осуществления 89 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 87 или 88, где белок экзоспория включает белок BclA.
[001285] Вариант осуществления 90 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 89, где белок BclA содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 141 или 142.
[001286] Вариант осуществления 91 представляет собой представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 87 или 88, где белок экзоспория включает белок BclB.
[001287] Вариант осуществления 92 представляет собой представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 91, где белок BclB содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 143 или 144.
[001288] Вариант осуществления 93 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 87 или 88, где экзоспория включает белок CotE.
[001289] Вариант осуществления 94 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 93, где белок CotE содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 149.
[001290] Вариант осуществления 95 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 87 или 88, где белок экзоспория включает белок CotO.
[001291] Вариант осуществления 96 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 95, где белок CotO содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 126.
[001292] Вариант осуществления 97 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 87, где белок экзоспория включает белок ExsY, белок ExsFA/BxpB, белок CotY, белок ExsFB, белок ExsJ, белок ExsH, белок YjcA, белок YjcB, белок BclC, белок BxpA, белок BclE, белок BetA/BAS3290, белок ExsA, белок ExsK, белок ExsB, белок YabG или белок Tgl.
[001293] Вариант осуществления 98 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 97, где белок экзоспория включает:
белок ExsY, где белок ExsY содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 123;
белок ExsFA/BxpB, где белок ExsFA/BxpB содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 124;
белок CotY, где белок CotY содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 125;
белок ExsFB, где белок ExsFB содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 127 или 128;
белок ExsJ, где белок ExJ содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 131;
белок ExsH, где белок ExsH содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 132;
белок YjcA, где белок YjcA содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 133;
белок YjcB, где белок YjcB содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 134 или 135;
белок BclC, где белок BclC содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% with SEQ ID NO: 136;
белок BxpA, где белок BxpA содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% with SEQ ID NO: 145;
белок BclE, где белок BclE содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 146 или 147;
белок BetA/BAS3290, где белок BetA/BAS3290 содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 148;
белок ExsA, где белок ExsA содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 150;
белок ExsK, где белок ExsK содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 151;
белок ExsB, где белок ExsB содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 152;
белок YabG, где белок YabG содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 153; или
белок Tjl, где белок Tjl содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 156.
[001294] Вариант осуществления 99 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 64-98, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus также экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[001295] Вариант осуществления 100 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus; где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию или экспрессирует белок, где экспрессия белка увеличена по сравнению с экспрессией белка в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях, и где мутация или увеличенная экспрессия белка обеспечивает споры Bacillus cereus, имеющие экзоспорий, который легче удалить из споры по сравнению с экзоспорием споры дикого типа.
[001296] Вариант осуществления 101 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus; где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus:
(i) содержит мутацию в гене CotE;
(ii) экспрессирует белок ExsY, где экспрессия белка ExsY увеличена по сравнению с экспрессией белка ExsY в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях, и где белок ExsY содержит С-концевую метку, содержащую глобулярный белок;
(iii) экспрессирует белок BclB, где экспрессия белка BclB увеличена по сравнению с экспрессией белка BclB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях;
(iv) экспрессирует белок YjcB, где экспрессия белка YjcB увеличена по сравнению с экспрессией белка YjcB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях;
(v) содержит мутцию в гене ExsY;
(vi) содержит мутацию в гене CotY;
(vii) содержит мутацию в гене ExsA; или
(viii) содержит мутацию в гене CotO.
[001297] Вариант осуществления 102 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 100 или 101, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию в гене CotE.
[001298] Вариант осуществления 103 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 102, где мутация в гене CotE частично или полностью ингибирует способность CotE связывать экзоспорий со спорой.
[001299] Вариант осуществления 104 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 102 или 103, где мутация в гене CotE включает нокаут гена CotE или доминантно-негативную форму гена CotE.
[001300] Вариант осуществления 105 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-104, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует белок ExsY, где экспрессия белка ExsY увеличена по сравнению с экспрессией белка ExsY в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях, и где белок ExsY содержит С-концевую метку, содержащую глобулярный белок.
[001301] Вариант осуществления 106 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 105, где глобулярный белок имеет молекулярную массу от 25 кДа до 100 кДа.
[001302] Вариант осуществления 107 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 105 или 106, где глобулярный белок включает зеленый флуоресцентный белок (GFP) или его вариант.
[001303] Вариант осуществления 108 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 105-107, где экспрессия белка ExsY, содержащего С-концевую метку, содержащую глобулярный белок, ингибирует связывание белка ExsY с его мишенями в экзоспории.
[001304] Вариант осуществления 109 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-108, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует белок BclB, где экспрессия белка BclB увеличена по сравнению с экспрессией белка BclB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[001305] Вариант осуществления 110 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 109, где экспрессия белка BclB приводит к образованию непрочного экзоспория.
[001306] Вариант осуществления 111 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-110, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует белок YjcB, где экспрессия белка YjcB увеличена по сравнению с экспрессией белка YjcB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[001307] Вариант осуществления 112 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 111, где экспрессия белка YjcB приводит к фрагментарному формированию экзоспория вместо целой структуры.
[001308] Вариант осуществления 113 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-112, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию в гене ExsY.
[001309] Вариант осуществления 114 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 113, где мутация в гене ExsY частично или полностью ингибирует способность ExsY завершать формирование экзоспория или связывать экзоспорий со спорой.
[001310] Вариант осуществления 115 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 113 или 114, где мутация в гене ExsY включает нокаут гена ExsY.
[001311] Вариант осуществления 116 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-115, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию в гене CotY.
[001312] Вариант осуществления 117 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 116, где мутация в гене CotY включает нокаут гена CotY.
[001313] Вариант осуществления 118 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 116 или 117, где мутация в гене CotY приводит к образованию непрочного экзоспория.
[001314] Вариант осуществления 119 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-118, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает мутацию в гене ExsA.
[001315] Вариант осуществления 120 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 119, где мутация в гене ExsA включает нокаут гена ExsA.
[001316] Вариант осуществления 121 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 119 или 120, где мутация в гене ExsA приводит к образованию непрочного экзоспория.
[001317] Вариант осуществления 122 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-121, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию в гене CotO.
[001318] Вариант осуществления 123 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 122, где мутация в гене CotO включает нокаут гена CotO или доминантно-негативную форму гена CotO.
[001319] Вариант осуществления 124 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 122 или 123, где мутация в гене CotO приводит к формированию экзоспория полосами.
[001320] Вариант осуществления 125 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает эндофитный штамм бактерий, штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид, или пробиотический штамм бактерий.
[001321] Вариант осуществления 126 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 125, где эндофитный штамм включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001322] Вариант осуществления 127 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 125, где эндофитный штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977) или Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001323] Вариант осуществления 128 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 125, где штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид, включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001324] Вариант осуществления 129 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 125, где пробиотический штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979) или Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977).
[001326] Вариант осуществления 131 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 4, 8 и 12-15 или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 16 или 130, где нацеливающая последовательность содержит:
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 56% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 62% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 68% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%; или
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 90%.
[001327] Вариант осуществления 132 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 4, 8 и 12-15 или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 16 или 130, где нацеливающая последовательность состоит из:
(a) аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%;
(b) аминокислот 1-35 SEQ ID NO: 1;
(c) аминокислот 20-35 SEQ ID NO: 1;
(d) SEQ ID NO: 1;
(e) SEQ ID NO: 96; или
(f) SEQ ID NO: 120.
[001328] Вариант осуществления 133 представляет собой слитый белок или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 131, где нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности.
[001329] Вариант осуществления 134 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 4, 8 и 12-15 или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 16 или 130, где слитый белок содержит белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 и 121.
[001330] Вариант осуществления 135 представляет собой слитый белок согласно варианту осуществления 1 или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 16 или 130, где слитый белок содержит белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 или 122.
[001331] Вариант осуществления 136 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 1-15 и 131-135 или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63 и 99-135, где нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория содержат аминокислотную последовательность GXT на их C-конце, где X представляет собой любую аминокислоту.
[001332] Вариант осуществления 137 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 1-15 и 131-136 или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63 и 99-136, где нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория содержат остаток аланина в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
[001333] Вариант осуществления 138 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 1-15 и 131-137 или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63 и 99-137, где нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория дополнительно содержат остаток метионина, серина или треонина в положении аминокислоты, непосредственно предшествующем первой аминокислоте нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория, или в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
[001334] Вариант осуществления 139 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 1-15 и 131-138 или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63 и 99-138, где слитый белок, кроме того, содержит аминокислотный линкер между нацеливающей последовательностью, белком экзоспория или фрагментом белка экзоспория и представляющим интерес белком или пептидом.
[001335] Вариант осуществления 140 представляет собой слитый белок или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 139, где линкер включает полиаланиновый линкер, полиглициновый линкер или линкер, содержащий смесь как остатков аланина, так и остатков глицина.
[001336] Вариант осуществления 141 представляет собой слитый белок или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 139 или 140, где линкер содержит участок распознавания протеазой.
[001337] Вариант осуществления 142 представляет собой слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, где белок оболочки споры включает белок CotB/H, белок споры X или белок CotY, где белок CotY содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 258 или 259.
[001338] Вариант осуществления 143 представляет собой слитый белок согласно варианту осуществления 142, где белок оболочки споры включает белок CotB/H.
[001339] Вариант осуществления 144 представляет собой слитый белок согласно варианту осуществления 142, где белок оболочки споры включает белок споры X.
[001340] Вариант осуществления 145 представляет собой слитый белок согласно варианту осуществления 142, где белок оболочки споры включает белок CotY, где белок CotY содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO: 258 или 259.
[001341] Вариант осуществления 146 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 142-145, где белок оболочки споры содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 255, 257, 258 или 259.
[001342] Вариант осуществления 147 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию, которая экспрессирует слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 142-146.
[001343] Вариант осуществления 148 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно варианту осуществления 147, где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений.
[001344] Вариант осуществления 149 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию, которая экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, где белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок CotG, белок оболочки споры X или белок CotY; и где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений.
[001345] Вариант осуществления 150 представляет собой семя растения, покрытое рекомбинантной спорообразующей бактерией, где рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, где белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок Cot G, белок споры X или белок CotY.
[001346] Вариант осуществления 151 представляет собой рекомбинантная спорообразующая бактерия согласно варианту осуществления 147, 148 или 149 или семя растения согласно варианту осуществления 150, где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает бактерию рода Bacillus, Lysinibacillus, Virginibacillus, Clostridia или Paenibacillus.
[001347] Вариант осуществления 152 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно любому из вариантов осуществления 30-45, где рекомбинантная бактерия содержит рекомбинантную спорообразующую бактерию и где рекомбинантная спорообразующая бактерия также экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, где белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок Cot G, белок оболочки споры X или белок CotY.
[001348] Вариант осуществления 153 представляет собой рекомбинантную бактерию рода Bacillus согласно варианту осуществления 152, где рекомбинантная бактерия включает эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений.
[001349] Вариант осуществления 154 представляет собой семя растения, покрытое рекомбинантной спорообразующей бактерией согласно варианту осуществления 152 или 153.
[001350] Вариант осуществления 155 представляет собой семя растения согласно варианту осуществления 150, 151 или 154, где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений.
[001351] Вариант осуществления 156 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно варианту осуществления 148, 149 или 153, или семя согласно варианту осуществления 155, где эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений, включает Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975), Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), Bacillus subtilis EE148 (NRRL B-50927), Bacillus subtilis EE218 (NRRL B-50926) или Bacillus megaterium EE281 (NRRL B-50925).
[001352] Вариант осуществления 157 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя согласно варианту осуществления 156, где эндофитный штамм бактерий включает Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978) или Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980).
[001353] Вариант осуществления 158 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно варианту осуществления 148, 149 или 153 или семя согласно варианту осуществления 155, где эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий, или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений, включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), Bacillus mycoides BT155 (NRRL № B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL № B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL № B-50921), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL № B-50922), представитель семейства Bacillus cereus EE128 (NRRL № B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL № B-50924) или представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928).
[001354] Вариант осуществления 159 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 149, 151, 152, 153 и 156-158, или семя согласно варианту осуществления 150, 151 и 154-158, где белок оболочки споры содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[001355] Вариант осуществления 160 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию, которая экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, где рекомбинантная спорообразующая бактерия не является рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, и белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, включает аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96 или аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 121.
[001356] Вариант осуществления 161 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно варианту осуществления 160, где белок, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, включает аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 121.
[001357] Вариант осуществления 162 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно варианту осуществления 160 или 161, где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений.
[001358] Вариант осуществления 163 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно варианту осуществления 162, где эндофитный штамм бактерий, стимулирующий рост растений штамм бактерий, или штамм бактерий, который является как эндофитным, так и стимулирующим рост растений, включает Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975), Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), Bacillus subtilis EE148 (NRRL B-50927), Bacillus subtilis EE218 (NRRL B-50926) или Bacillus megaterium EE281 (NRRL B-50925).
[001359] Вариант осуществления 164 представляет собой рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно варианту осуществления 163, где эндофитный штамм бактерий включает Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981).
[001360] Вариант осуществления 165 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 142-146, рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-164, или семя согласно любому из вариантов осуществления 150, 151 и 154-159, где слитый белок, кроме того, содержит аминокислотный линкер между белком оболочки споры и представляющим интерес белком или пептидом.
[001361] Вариант осуществления 166 представляет собой слитый белок, рекомбинантную спорообразующую бактерия или семя согласно варианту осуществления 165, где линкер включает полиаланиновый линкер, полиглициновый линкер или линкер, содержащий смесь остатков как аланина, так и глицина.
[001362] Вариант осуществления 167 представляет собой слитый белок, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя согласно варианту осуществления 165 или 166, где линкер содержит участок распознавания протеазой.
[001363] Вариант осуществления 168 представляет собой слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 1-3 и 142-146, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63 и 99-141, рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-167, или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 150, 151 и 154-167, где представляющий интерес белок или пептид включает стимулирующий рост растений белок или пептид, белок или пептид, который защищает растение от патогена, белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, связывающийся с растением белок или пептид, фермент, который катализирует продукцию оксида азота или связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид.
[001364] Вариант осуществления 169 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 168, где представляющий интерес белок или пептид включает стимулирующий рост растений белок или пептид.
[001365] Вариант осуществления 170 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 169, где стимулирующий рост растений белок или пептид включает пептидный гормон, негормональный пептид, фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения или фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений.
[001366] Вариант осуществления 171 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 170, где стимулирующий рост растений белок или пептид включает пептидный гормон.
[001367] Вариант осуществления 172 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 171, где пептидный гормон включает фитосульфокин, clavata 3 (CLV3), системин, ZmlGF или SCR/SP11.
[001368] Вариант осуществления 173 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя бактерии согласно варианту осуществления 172, где фитосульфокин включает фитосульфокин-α.
[001369] Вариант осуществления 174 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 170, где стимулирующий рост растений белок или пептид включает негормональный пептид.
[001370] Вариант осуществления 175 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 174, где непептидный гормон включает RKN 16D10, Hg-Syv46, пептид eNOD40, мелиттин, мастопаран, Mas7, RHPP, POLARIS или ингибитор трипсина kunitz (KTI).
[001371] Вариант осуществления 176 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 170, где стимулирующий рост растений белок или пептид включает фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения.
[001372] Вариант осуществления 177 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 176, где стимулирующее рост растений соединение включает соединение, продуцируемое бактериями или грибами в ризосфере.
[001373] Вариант осуществления 178 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 177, где соединение, продуцируемое бактериями или грибами в ризосфере, включает 2,3-бутандиол.
[001374] Вариант осуществления 179 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 176, где стимулирующее рост растений соединение включает гормон роста растений.
[001375] Вариант осуществления 180 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 179, где гормон роста растений включает цитокинин или производное цитокинина, этилен, ауксин или производное ауксина, гибберелловую кислоту или производное гиберраловой кислоты, абсцизовую кислоту или производное абсцизовой кислоты, жасмоновую кислоту или производное жасмоновой кислоты.
[001376] Вариант осуществления 181 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 180, где гормон роста растений включает цитокинин или производное цитокинина, и цитокинин или производное цитокинина включает кинетин, цис-зеатин, транс-зеатин, 6-бензиламинопурин, дигидроксизеатин, N6-(D2-изопентенил)аденин, рибозилзеатин, N6-(D2-изопентенил)аденозин, 2-метилтио-цис-рибозилзеатин, цис-рибозилзеатин, транс-рибозилзеатин, 2-метилтио-транс-рибозилзеатин, рибозилзеатин-5-монофосфат, N6-метиламинопурин, N6-диметиламинопурин, 2ʹ-дезоксизеатинрибозид, 4-гидрокси-3-метил-транс-2-бутениламинопурин, орто-тополин, мета-тополин, бензиладенин, орто-метилтополин, мета-метилтополин или их комбинацию; или, когда гормон роста растения включает ауксин или производное ауксина, ауксин или производное ауксина может включать активный ауксин, неактивный ауксин, конъюгированный ауксин, встречающийся в природе ауксин, синтетический ауксин, или их комбинацию.
[001377] Вариант осуществления 182 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 180 или 181, где гормон роста растений включает ауксин или производное ауксина, и ауксин или производное ауксина включает индол-3-уксусную кислоту, индол-3-пировиноградную кислоту, индол-3-ацетальдоксим, индол-3-ацетамид, индол-3-ацетонитрил, индол-3-этанол, индол-3-пируват, индол-3-ацетальдоксим, индол-3-масляную кислоту, фенилуксусную кислоту, 4-хлориндол-3-уксусную кислоту, конъюгированный с глюкозой ауксин или их комбинацию.
[001378] Вариант осуществления 183 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 176-182, где стимулирующий рост растений белок или пептид включает фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения, и фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения, включает ацетоинредуктазу, индол-3-ацетамидгидролазу, триптофанмонооксигеназу, ацетолактатсинтетазу, α-ацетолактатдекарбоксилазу, пируватдекарбоксилазу, диацетилредуктазу, бутандиолдегидрогеназу, аминотрансферазу (например, триптофанаминотрансферазу), триптофандекарбоксилазу, аминоксидазу, индол-3-пируватдекарбоксилазу, индол-3-ацетальдегиддегидрогеназу, оксидазу боковой цепи триптофана, нитрилгидролазу, нитрилазу, пептидазу, протеазу, аденозинфосфатизопентенилтрансферазу, фосфатазу, аденозинкиназу, аденинфосфорибозилтрансферазу, CYP735A, 5ʹ-рибонуклеотидфосфогидролазу, аденозиннуклеозидазу, зеатин-цис-транс-изомеразу, зеатин-O-глюкозилтрансферазу, β-глюкозидазу, цис-гидроксилазу, цис-гидроксилазу CK, N-глюкозилтрансферазу CK, 2,5-рибонуклеотидфосфогидролазу, аденозиннуклеозидазу, пуриннуклеозидфосфорилазу, зеатинредуктазу, гидроксиламинредуктазу, 2-оксоглутаратдиоксигеназу, гибберелловую 2B/3B гидролазу, гиббераллин-3-оксидазу, гиббераллин-20-оксидазу, хитозаназу, хитиназу, β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, дезаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты или фермент, вовлеченный в продукцию фактора nod.
[001379] Вариант осуществления 184 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 183, где фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения включает фермент, вовлеченный в продукцию фактора nod, и фермент, вовлеченный в продукцию фактора nod, включает nodA, nodB или nodI; или где фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения, включает аминотрансферазу, и аминотрансфераза включает триптофанаминотрансферазу.
[001380] Вариант осуществления 185 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 183, где фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения, включает протеазу или пептидазу, которая расщепляет белки, пептиды, пробелки или препробелки с образованием биологически активного пептида.
[001381] Вариант осуществления 186 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 183, где протеаза или пептидаза включает субтилизин, кислую протеазу, щелочную протеазу, протеиназу, эндопептидазу, экзопептидазу, термолизин, папаин, пепсин, трипсин, проназу, карбоксилазу, сериновую протеазу, глутаминовую протеазу, аспартатную протеазу, цистеиновую протеазу, треониновую протеазу или металлопротеиназу.
[001382] Вариант осуществления 187 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 185 или 186, где биологический активный пептид включает RKN 16D10 или RHPP.
[001383] Вариант осуществления 188 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 185-187, где протеаза или пептидаза расщепляет белки в богатом белком материале.
[001384] Вариант осуществления 189 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 188, где богатый белком материал представляет собой соевую муку или дрожжевой экстракт.
[001385] Вариант осуществления 190 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 183, где фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения, включает хитозаназу, где хитозаназа содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или a 100% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[001386] Вариант осуществления 191 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 170, где стимулирующий рост растений белок или пептид включает фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений.
[001387] Вариант осуществления 192 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 191, где фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, включает целлюлазу, липазу, лигниноксидазу, протеазу, гликозидгидролазу, фосфатазу, нитрогеназу, нуклеазу, амидазу, нитратредуктазу, нитритредуктазу, амилазу, оксидазу аммиака, лигниназу, глюкозидазу, фосфолипазу, фитазу, пектиназу, глюканазу, сульфатазу, уреазу, ксиланазу или сидерофор.
[001388] Вариант осуществления 193 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 192, где фосфолипаза включает фосфолипазу A1, фосфолипазу A2, фосфолипазу C, фосфолипазу D или лизофосфолипазу.
[001389] Вариант осуществления 194 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 193, где фосфолипаза включает фосфолипазу C, и фосфолипаза C содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
[001390] Вариант осуществления 195 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 192, где фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, включает целлюлазу и целлюлаза включает эндоцеллюлазу, экзоцеллюлазу или β-глюкозидазу.
[001391] Вариант осуществления 196 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 195, где целлюлаза включает эндоцеллюлазу, и эндоцеллюлаза включает эндоглюканазу.
[001392] Вариант осуществления 197 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 195 или 196, где целлюлаза включает эндоцеллюлазу, и эндоцеллюлаза включает эндоглюканазу Bacillus subtilis, эндоглюканазу Bacillus thuringiensis, эндоглюканазу Bacillus cereus или эндоглюканазу Bacillus clausii.
[001393] Вариант осуществления 198 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 197, где целлюлаза включает эндоглюканазу Bacillus subtilis, и эндоглюканаза Bacillus subtilis содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
[001394] Вариант осуществления 199 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 195, где целлюлаза включает экзоцеллюлазу и экзоцеллюлаза включает экзоцеллюлазу Trichoderma reesei.
[001395] Вариант осуществления 200 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 195, где целлюлаза включает β-глюкозидазу, и β-глюкозидаза включает β-глюкозидазу Bacillus subtilis, β-глюкозидазу Bacillus thuringiensis, β-глюкозидазу Bacillus cereus или β-глюкозидазу Bacillus clausii.
[001396] Вариант осуществления 201 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 192, где фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, включает липазу, и липаза включает липазу Bacillus subtilis, липазу Bacillus thuringiensis, липазу Bacillus cereus или липазу Bacillus clausii.
[001397] Вариант осуществления 202 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 192, где фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, включает лигниноксидазу, и лигниноксидаза включает пероксидазу лигнина, лакказу, глиоксальоксидазу, лигниназу или пероксидазу марганца.
[001398] Вариант осуществления 203 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 192, где фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, включает протеазу, и протеаза включает субтилизин, кислую протеазу, щелочную протеазу, протеиназу, пептидазу, эндопептидазу, экзопептидазу, термолизин, папаин, пепсин, трипсин, проназу, карбоксилазу, сериновую протеазу, глутаминовую протеазу, аспартатную протеазу, цистеиновую протеазу, треониновую протеазу или металлопротеиназу.
[001399] Вариант осуществления 204 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 192, где фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, включает фосфатазу, и фосфатаза включает гидролазу сложных моноэфиров фосфорной кислоты, фосфомоноэстеразу, гидролазу сложных диэфиров фосфорной кислоты, фосфодиэстеразу, гидролазу сложных моноэфиров трифосфорной кислоты, фосфорилангидридгидролазу, пирофосфатазу, фитазу, триметафосфатазу или трифосфатазу.
[001400] Вариант осуществления 205 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 204, где фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, включает фосфомоноэстеразу, и фосфомоноэстераза включает PhoA4; или где фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, включает фитазу, и фитаза включает фитазу Bacillus subtilis EE148 или фитазу Bacillus thuringiensis BT013A.
[001401] Вариант осуществления 206 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 192, где фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, включает нитрогеназу, и нитрогеназа включает нитрогеназу семейства Nif.
[001402] Вариант осуществления 207 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 206, где нитрогеназа семейства Nif включает NifBDEHKNXV Paenibacillus massiliensis.
[001403] Вариант осуществления 208 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 168, где представляющий интерес белок или пептид включает белок или пептид, который защищает растение от патогена.
[001404] Вариант осуществления 209 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 208, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает белок или пептид, усиливающий иммунную систему растения.
[001405] Вариант осуществления 210 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 209, где белок, усиливающий иммунную систему растения, включает гарпин, гарпин-подобный белок, α-эластин, β-эластин, системин, фенилаланинаммиаклиазу, элицитин, дефензин, криптогеин, белок флагеллин или пептид флагеллина.
[001406] Вариант осуществления 211 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 210, где пептид флагеллина включает flg22.
[001407] Вариант осуществления 212 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 208, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, обладает антибактериальной активностью, противогрибковой активностью или как антибактериальной, так и противогрибковой активностью.
[001408] Вариант осуществления 213 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 212, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает бактериоцин, лизоцим, пептида лизоцим, сидерофор, авидин, стрептавидин, нерибосомальный активный пептид, кональбумин, альбумин, лактоферрин, пептид лактоферрина или TasA.
[001409] Вариант осуществления 214 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 213, где пептид лизоцима включает LysM или где пептид лактоферрина включает LfcinB.
[001410] Вариант осуществления 215 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 208, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, обладает инсектицидной активностью, гельминтицидной активностью, подавляет хищничество насекомых или червей, или имеет комбинацию этих эффектов.
[001411] Вариант осуществления 216 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 215, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает инсектицидный бактериальный токсин, эндотоксин, токсин Cry, белок или пептид, являющийся ингибитором протеазы, цистеиновую протеазу или хитиназу.
[001412] Вариант осуществления 217 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 216, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает инсектицидный бактериальный токсин, и инсектицидный бактериальный токсин включает инсектицидный токсин VIP; где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает белок или пептид, являющийся ингибитором протеазы, и белок или пептид, являющийся ингибитором протеазы, включает ингибитор трипсина или ингибитор протеазы arrowhead; или где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает токсин Cry, и токсин Cry включает токсин Cry из Bacillus thuringiensis.
[001413] Вариант осуществления 218 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 217, где токсин Cry включает токсин Cry из Bacillus thuringiensis, и токсин Cry из Bacillus thuringiensis включает белок Cry5B или белок Cry21A.
[001414] Вариант осуществления 219 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 208, где белок, который защищает растение от патогена, включает фермент.
[001415] Вариант осуществления 220 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 219, где фермент включает протеазу или лактоназу.
[001416] Вариант осуществления 221 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 220, где протеаза или лактоназа является специфичной к бактериальной сигнальной молекуле.
[001417] Вариант осуществления 222 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 221, где бактериальная сигнальная молекула включает бактериальную сигнальную молекулу лактон гомосерина.
[001418] Вариант осуществления 223 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 220-222, где фермент включает лактоназу, и лактоназа включает 1,4-лактоназу, 2-пирон-4,6-дикарбоксилатлактоназу, 3-оксоадипат-енол-лактоназу, актиномицинлактоназу, дезоксилимонат A-кольцевую лактоназу, глюконолактоназу, L-рамноно-1,4-лактоназу, лимонин-D-кольцевую лактоназу, стероид-лактоназу, триацетат-лактоназу или ксилоно-1,4-лактоназу.
[001419] Вариант осуществления 224 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 219, где фермент является специфичным к клеточному компоненту бактерии или гриба.
[001420] Вариант осуществления 225 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 224, где фермент включает β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, хитозаназу, хитиназу, хитозаназа-подобный фермент, литиказу, пептидазу, протеазу, протеазу, мутанолизин, стафолизин или лизоцим.
[001421] Вариант осуществления 226 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 225, где фермент включает хитозаназу, где хитозаназа содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
[001422] Вариант осуществления 227 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 225, где протеаза включает щелочную протеазу, кислую протеазу или нейтральную протеазу.
[001423] Вариант осуществления 228 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 208-227, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, защищает растение от бактериального патогена, грибного патогена, патогена-червя или патогена-насекомого.
[001424] Вариант осуществления 229 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 228, где бактериальный патоген включает протеобактерию α-класса, протеобактерию β-класса, протеобактерию γ-класса или их комбинацию; или где бактериальный патоген включает Agrobacterium tumefaciens, Pantoea stewartii, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas campestris или их комбинацию.
[001425] Вариант осуществления 230 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 228, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, защищает растение от хищничества патогена-черва или патогена-насекомого.
[001426] Вариант осуществления 231 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 228 или 230, где патоген-червь или патоген-насекомое включает гусеницу, совку-ипсилон, мотылька кукурузного, совку травяную, бабочку-совку, хрущика японского, малую кукурузную стеблевую огневку, долгоносика кукурузного, личинку мухи ростковой, гусеницу, выпускающую паутину, огневку кукурузную стеблевую, южного кукурузного корневого червя, южного картофельного проволочника, стеблевого точильщика, жука сахарного тростника, личинку хруща, совку капустную, долгоносика хлопкового, желтую полосатую гусеницу, пьявицу красногрудую, клопа постельного, тлю, совку малую, мексиканскую зерновку бобовую, соевую совку, соевого стеблевого точильщика или их комбинацию.
[001427] Вариант осуществления 232 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 168, где представляющий интерес белок или пептид включает по меньшей мере один белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
[001428] Вариант осуществления 233 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 232, где белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, включает фермент, который деградирует обуславливающее стресс соединение.
[001429] Вариант осуществления 234 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя согласно варианту осуществления 233, где обуславливающее стресс соединение включает аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (ACC), активные формы кислорода, оксид азота, оксилипин, фенольное соединение или их комбинацию.
[001430] Вариант осуществления 235 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 233 или 234, где фермент, который деградирует обуславливающее стресс соединение, включает супероксиддисмутазу, оксидазу, каталазу, дезаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты, пероксидазу, антиоксидантный фермент или антиоксидантный пептид.
[001431] Вариант осуществления 236 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 235, где фермент, который деградирует обуславливающее стресс соединение, включает супероксиддисмутазу.
[001432] Вариант осуществления 237 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 235 или 236, где супероксиддисмутаза включает супероксиддисмутазу 1 (SODA1) или супероксиддисмутазу 2 (SODA2).
[001433] Вариант осуществления 238 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 237, где супероксиддисмутаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[001434] Вариант осуществления 239 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 232, где белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, включает белок или пептид, который защищает растение от стрессового воздействия внешней среды.
[001435] Вариант осуществления 240 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 239, где стрессовое воздействие внешней среды включает засуху, наводнение, жару, заморозки, соль, тяжелые металлы, низкие значения pH, высокие значения pH или их комбинацию.
[001436] Вариант осуществления 241 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 239 или 240, где белок или пептид, который защищает растение от стрессового воздействия внешней среды, включает белок, индуцирующий формирование микрокристаллов льда, пролиназу, фенилаланинаммиаклиазу, изохоризматсинтазу, изохоризматпируватлиазу или холиндегидрогеназу.
[001437] Вариант осуществления 242 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 168, где слитый белок включает по меньшей мере один связывающийся с растениями белок или пептид.
[001438] Вариант осуществления 243 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 242, где связывающийся с растениями белок или пептид включает адгезин, флагеллин, омптин, лектин, экспансин, структурный белок биопленки, билок пилуса, белок завитка, интимин, инвазин, агглютинин, афимбриальный белок.
[001439] Вариант осуществления 244 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 243, где связывающийся с растениями белок включает адгезин, и адгезин включает рикадгезин; или где связывающийся с растениями белок включает структурный белок биопленки, и структурный белок биопленки включает TasA или YuaB.
[001440] Вариант осуществления 245 представляет собой слитый белок согласно варианту осуществления 4, или слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 168, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент, который катализирует продукцию оксида азота.
[001441] Вариант осуществления 246 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 245, где фермент, который катализирует продукцию оксида азота, включает синтазу оксида азота или аргиназу.
[001442] Вариант осуществления 247 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 245, где фермент, который катализирует продукцию оксида азота, включает синтазу оксида азота.
[001443] Вариант осуществления 248 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 247, где синтаза оксида азота включает синтазу оксида азота Bacillus thuringiensis или синтазу оксида азота Bacillus subtilis.
[001444] Вариант осуществления 249 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 248, где синтаза оксида азота включает синтазу оксида азота из Bacillus thuringiensis BT013A или Bacillus subtilis 168.
[001445] Вариант осуществления 250 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 245-249, где синтаза оксида азота содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[001446] Вариант осуществления 251 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 245-250, где слитый белок включает SEQ ID NO: 262 или 263.
[001447] Вариант осуществления 252 представляет собой слитый белок согласно варианту осуществления 4, или слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 168, где представляющий интерес белок или пептид включает связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид.
[001448] Вариант осуществления 253 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 252, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид включает РНК-связывающий белок или пептид или ДНК-связывающий белок или пептид.
[001449] Вариант осуществления 254 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 253, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид включает РНК-связывающий белок или пептид.
[001450] Вариант осуществления 255 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 254, где РНК-связывающий белок или пептид включает неспецифический РНК-связывающий белок или пептид.
[001451] Вариант осуществления 256 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 254, где РНК-связывающий белок или пептид включает специфический РНК-связывающий белок или пептид.
[001452] Вариант осуществления 257 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 254, где РНК-связывающий белок или пептид включает белок Hfq.
[001453] Вариант осуществления 258 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 257, где белок Hfq включает белок Hqf Bacillus thuringiensis.
[001454] Вариант осуществления 259 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 253, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид включает ДНК-связывающий белок или пептид.
[001455] Вариант осуществления 260 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 259, где ДНК-связывающий белок или пептид включает малый растворимый в кислоте белок споры (SASP).
[001456] Вариант осуществления 261 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 260, где SASP включает SASP, кодируемый геном SspA, геном SspB, геном SspC, геном SspD, геном SspE, геном SspF, геном SspG, геном SspH, геном SspI, геном SspJ, геном SspK, геном SspL, геном SspM, геном SspN, геном SspO или геном SspP.
[001457] Вариант осуществления 262 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 261, где SASP включает SASPα, SASPβ или SASPγ.
[001458] Вариант осуществления 263 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 260-262, где SASP включает SASP Bacillus thuringiensis.
[001459] Вариант осуществления 264 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 252-263, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264-266.
[001460] Вариант осуществления 265 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, или рекомбинантную спорообразующую бактерию, или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 252-264, где слитый белок содержит SEQ ID NO: 267, 268 или 269.
[001461] Вариант осуществления 266 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 252-254 и 259, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид включает нуклеазу, имеющую инактивированный активный центр.
[001462] Вариант осуществления 267 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 252-266, дополнительно включающие молекулу нуклеиновой кислоты, связанную со связывающим нуклеиновую кислоту белком или пептдом.
[001463] Вариант осуществления 268 представляет собой слитый белок, рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или семя растения согласно варианту осуществления 267, где молекула нуклеиновой кислоты включает модулирующую молекулу РНК; молекулу РНК-i; микроРНК; аптамер или молекулу ДНК, которая кодирует модулирующую молекулу РНК, молекулу РНК-i, микроРНК или аптамер.
[001464] Вариант осуществления 269 представляет собой слитый белок согласно варианту осуществления 4 или рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, или семя растения согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63, 99-141 и 168-268, где нацеливающая последовательность содержит SEQ ID NO: 96.
[001465] Вариант осуществления 270 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который совместно экспрессирует по меньшей мере один слитый белок, содержащий стимулирующий рост растений белок или пептид, белок или пептид, который защищает растение от патогена, белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, фермент, который катализирует продукцию оксида азота, или связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид согласно любому из вариантов осуществления 168-241 и 245-269 и по меньшей мере один слитый белок, содержащий связывающийся с растением белок или пептид согласно любому из вариантов осуществления 242-244 и 269.
[001466] Вариант осуществления 271 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-270, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis или их комбинацию.
[001467] Вариант осуществления 272 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 271, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает Bacillus thuringiensis или Bacillus mycoides.
[001468] Вариант осуществления 273 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 271 или 272, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает стимулирующий рост растений штамм бактерий.
[001469] Вариант осуществления 274 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 273, где стимулирующий рост растений штамм бактерий продуцирует инсектицидный токсин, продуцирует фунгицидное соединение, продуцирует нематоцидное соединение, продуцирует бактерицидное соединение, является резистентным к одному или нескольким антибиотикам, содержит одну или несколько свободно реплицирующихся плазмид, связывается с корнями растений, колонизирует корни растений, образует биопленки, солюбилизирует питательные вещества, секретирует органические кислоты или имеет комбинацию этих эффектов.
[001470] Вариант осуществления 275 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 274, где инсектицидный токсин включает токсин Cry; где фунгицидное соединение включает β-1,3-глюканазу, хитозаназу, литиказу или их комбинацию; или где нематоцидное соединение включает токсин Cry.
[001471] Вариант осуществления 276 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 273-275, где стимулирующий рост растений штамм бактерий включает Bacillus mycoides BT155 (NRRL № B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL № B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL № B-50921), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL № B-50922), представитель семейства Bacillus cereus EE128 (NRRL № B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL № B-50924), представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928); представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001472] Вариант осуществления 277 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 276, где стимулирующий рост растений штамм бактерий включает Bacillus mycoides BT155 (NRRL № B-50921), Bacillus mycoides EE141 (NRRL № B-50921) или Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL № B-50924).
[001473] Вариант осуществления 278 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-275, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает эндофитный штамм бактерий.
[001474] Вариант осуществления 279 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 278, где эндофитный штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), или Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001475] Вариант осуществления 280 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 279, где эндофитный штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001476] Вариант осуществления 281 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 186-275, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид.
[001477] Вариант осуществления 282 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 281, где штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид, включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001478] Вариант осуществления 283 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 125, 128, 281 и 282, где штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид, деградирует гербицид на основе сульфонилмочевины, гербицид на основе арилтриазина, дикамбу, 2,4-D, фенокси-гербицид, пиретрин, пиретроид или их комбинацию.
[001479] Вариант осуществления 284 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 283, где гербицид на основе сульфонилмочевины включает сульфентразон.
[001480] Вариант осуществления 285 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 282 или 283, где штамм бактерий, который способен деградировать пестицид, деградирует пиретрин.
[001481] Вариант осуществления 286 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 186-275, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает пробиотический штамм бактерий.
[001482] Вариант осуществления 287 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 286, где пробиотический штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979) или Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977).
[001483] Вариант осуществления 288 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно вариантам осуществления 16-141 и 168-287, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит инактивирующую мутацию в его гене BclA.
[001484] Вариант осуществления 289 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 288, где инактивирующая мутация в гене BclA включает нокаут гена BclA.
[001485] Вариант осуществления 290 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63, 99-141 и 168-289, где слитый белок экспрессируется под контролем промотора споруляции, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория, в слитом белке или его части.
[001486] Вариант осуществления 291 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 17-27, где белок-модулятор экспрессируется под контролем его нативного промотора или его части.
[001487] Вариант осуществления 292 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63, 99-141 и 168-291, где слитый белок или белок-модулятор экспрессируется под контролем промотора споруляции с высокой экспрессией.
[001488] Вариант осуществления 293 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 292, где промотор споруляции с высокой экспрессией включает последовательность промотора специфичной к споруляции полимеразы сигма-K.
[001489] Вариант осуществления 294 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 290-293, где промотор споруляции содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157-231.
[001490] Вариант осуществления 295 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 290-293, где промотор одержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 157, 158, 161, 162, 189, 190, 215, 220, 221, 225, 229 или 230.
[001491] Вариант осуществления 296 представляет собой рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 293-295, где последовательность или последовательности промотора специфичной к споруляции полимеразы сигма-K обладает 100% идентичностью с соответствующими нуклеотидами любой из SEQ ID NO: 157-231.
[001492] Вариант осуществления 297 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой:
(a) представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979);
(b) Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979);
(c) Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977);
(d) Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983);
(e) Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122);
(f) представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119);
(g) Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); или
(h) Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001493] Вариант осуществления 298 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 297, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 277.
[001494] Вариант осуществления 299 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 297, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 278.
[001495] Вариант осуществления 300 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 297, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus cereus EE444(NRRL B-50977), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 279.
[001496] Вариант осуществления 301 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 297, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 280.
[001497] Вариант осуществления 302 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 297, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 301.
[001498] Вариант осуществления 303 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 297, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 304.
[001499] Вариант осуществления 304 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 297, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 303.
[001500] Вариант осуществления 305 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 297, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 302.
[001501] Вариант осуществления 306 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру, где бактерии в бактериальной культуре являются мутантами бактерий согласно любому из вариантов осуществления 297-305, включающими одну или несколько мутаций, где бактерии являются эндофитными.
[001502] Вариант осуществления 307 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру где бактерии в бактериальной культуре представляют собой:
(a) Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980);
(b) Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981);
(c) Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982);
(d) Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978);
(e) Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975);
(f) Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976); или
(g) Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123).
[001503] Вариант осуществления 308 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 307, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 281.
[001504] Вариант осуществления 309 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 307, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 282.
[001505] Вариант осуществления 310 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 307, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 283.
[001506] Вариант осуществления 311 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 307, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus subtilis EE405(NRRL B-50978), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 284.
[001507] Вариант осуществления 312 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 307, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 285.
[001508] Вариант осуществления 313 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 307, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 286.
[001509] Вариант осуществления 314 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру согласно варианту осуществления 307, где бактерии в бактериальной культуре представляют собой Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), и бактерии имеют последовательность 16S рибосомальной РНК, обладающую по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 305.
[001510] Вариант осуществления 315 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру, где бактерии в бактериальной культуре являются мутантами согласно любому из вариантов осуществления 307-314, содержащими одну или несколько мутаций, где бактерии являются эндофитными.
[001511] Вариант осуществления 316 представляет собой биологически чистую бактериальную культуру где бактерии в бактериальной культуре являются мутантами согласно любому из вариантов осуществления 307-315, содержащими одну или несколько мутаций, где бактерии являются пробиотическими.
[001512] Вариант осуществления 317 представляет собой инокулят для внесения на растения, семена растения, в среду для роста растений или в область, окружающую растение или семя растения, где инокулят содержит эффективное количество биологически чистой бактериальной культуры согласно любому из вариантов осуществления 297-316 и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.
[001513] Вариант осуществления 318 представляет собой инокулят согласно варианту осуществления 317, где инокулят содержит эффективное количество смеси, содержащей по меньшей мере две биологически чистых бактериальных культуры согласно любому из вариантов осуществления 297-316.
[001514] Вариант осуществления 319 представляет собой инокулят согласно варианту осуществления 317 или 318, где инокулят дополнительно содержит эффективное количество ризобактерий.
[001515] Вариант осуществления 320 представляет собой инокулят согласно варианту осуществления 319, где ризобактерии представляют собой биологически чистую бактериальную культуру штамма ризобактерий.
[001516] Вариант осуществления 321 представляет собой инокулят согласно варианту осуществления 319 или 320, где ризобактерии включают бактерии рода Bradyrhizobium, бактерии рода Rhizobium или их комбинацию.
[001517] Вариант осуществления 322 представляет собой инокулят согласно варианту осуществления 321, где бактерии рода Bradyrhizobium включают Bradyrhizobium japonicum.
[001518] Вариант осуществления 323 представляет собой инокулят согласно варианту осуществления 322, где бактерии рода Rhizobium включают Rhizobium phaseoli, Rhizobium leguminosarum или их комбинацию.
[001519] Вариант осуществления 324 представляет собой семя растения, покрытое: (i) ферментом, который катализирует продукцию оксида азота; (ii) супероксиддисмутазой; или (iii) рекомбинантным микроорганизмом, который экспрессирует фермент, который катализирует продукцию оксида азота, или супероксиддисмутазу, где экспрессия фермента, который катализирует продукцию оксида азота, или супероксиддисмутазы увеличена по сравнению с экспрессией фермента, который катализирует продукцию оксида азота, или супероксиддисмутазы, в микроорганизме дикого типа в тех же условиях.
[001520] Вариант осуществления 325 представляет собой семя растения согласно варианту осуществления 324, где семя растения покрыто ферментом, который катализирует продукцию оксида азота.
[001521] Вариант осуществления 326 представляет собой семя растения согласно варианту осуществления 324 или 325, где семя растения покрыто рекомбинантным микроорганизмом, который экспрессирует фермент, который катализирует продукцию оксида азота.
[001522] Вариант осуществления 327 представляет собой семя растения согласно любому из вариантов осуществления 324-326, где фермент, который катализирует продукцию оксида азота включает синтазу оксида азота или аргиназу.
[001523] Вариант осуществления 328 представляет собой семя растения согласно варианту осуществления 327, где фермент, который катализирует продукцию оксида азота включает синтазу оксида азота.
[001524] Вариант осуществления 329 представляет собой семя растения согласно варианту осуществления 328, где синтаза оксида азота включает синтазу оксида азота из Bacillus thuringiensis BT013A или Bacillus subtilis 168.
[001525] Вариант осуществления 330 представляет собой семя растения согласно варианту осуществления 328 или 329, где синтаза оксида азота содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[001526] Вариант осуществления 331 представляет собой семя растения согласно любому из вариантов осуществления 324-330, где семя растения покрыто супероксиддисмутазой.
[001527] Вариант осуществления 332 представляет собой семя растения согласно любому из вариантов осуществления 324-331, где семя растения покрыто рекомбинантным микроорганизмом, который экспрессирует супероксиддисмутазу.
[001528] Вариант осуществления 333 представляет собой семя растения согласно любому из вариантов осуществления 324-332, где супероксиддисмутаза включает супероксиддисмутазу 1 (SODA1) или супероксиддисмутазу 2 (SODA2).
[001529] Вариант осуществления 334 представляет собой семя растения согласно любому из вариантов осуществления 331-333, где супероксиддисмутаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[001530] Вариант осуществления 335 представляет собой семя растения согласно любому из вариантов осуществления 324-334, где рекомбинантный микроорганизм включает вид Bacillus, Escherechia coli, вид Aspergillus или вид Sacchromyces.
[001531] Вариант осуществления 336 представляет собой семя растения согласно варианту осуществления 335, где вид Bacillus включает представитель семейства Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis или Bacillus megaterium.
[001532] Вариант осуществления 337 представляет собой семя растения согласно варианту осуществления 335, где вид Aspergillus включает Aspergillus niger или где вид Sacchromyces включает Sacchromyces cerevisiae.
[001533] Вариант осуществления 338 представляет собой состав, содержащий рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296 или рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 152-154 и 156-268 и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.
[001534] Вариант осуществления 339 представляет собой состав, содержащий фрагменты экзоспория, происходящие из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124, 130-141 и 168-296, и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.
[001535] Вариант осуществления 340 представляет собой семя растения согласно любому из вариантов осуществления 150, 151 и 154-268, где семя покрыто составом, содержащим рекомбинантную спорообразующую бактерию и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.
[001536] Вариант осуществления 341 представляет собой семя растения согласно любому из вариантов осуществления 324-337, где семя покрыто составом, содержащим фермент или рекомбинантный микроорганизм и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.
[001537] Вариант осуществления 342 представляет собой состав согласно варианту осуществления 338 или 339, семя растения согласно варианту осуществления 340 или 341, или инокулят согласно любому из вариантов осуществления 317-323, где приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель включает диспергирующее средство, поверхностно-активное вещество, добавку, воду, загуститель, средство против слеживания, средство для разрушения осадка, состав для компостирования, гранулярный состав, диатомитовую землю, масло, краситель, стабилизатор, консервант, полимер, покрытие или их комбинацию.
[001538] Вариант осуществления 343 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 342, где приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель включает добавку, и добавка включает масло, камедь, смолу, глину, полиоксиэтиленгликоль, терпен, вязкое органическое соединение, сложный эфир жирной кислоты, сульфатированный спирт, алкилсульфонат, нефтяной сульфонат, сульфат спирта, натрий алкилбутандиамат, полиэфир натрийтиобутандиоата, бензольное производное ацетонитрила, белковый материал или их комбинацию; приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель включает загуститель, и загуститель включает длинноцепочечный алкилсульфонат полиэтиленгликоля, полиоксиэтилен олеат или их комбинацию; приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель включает поверхностно-активное вещество, и поверхностно-активное вещество включает тяжелое нефтяное масло, тяжелый нефтяной дистиллят, сложный эфир полиола и жирной кислоты, сложный эфир полиэтоксилированной жирной кислоты, арилалкилполиоксиэтиленгликоль, алкиламинацетат, алкиларилсульфонат, многоатомный спирт, алкилфосфат или их комбинацию; или приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель включает средство против слеживания, и средство против слеживания включает натриевую соль, карбонат кальция, диатомитовую землю или их комбинацию.
[001539] Вариант осуществления 344 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 343, где добавка включает белковый материал, и белковый материал включает молочный продукт, пшеничную муку, соевую муку, кровь, альбумин, желатин, люцерновую муку, дрожжевой экстракт или их комбинацию; или средство против слеживания включает натриевую соль, и натриевая соль включает натриевую соль монометилнафталинсульфоната, натриевую соль диметилнафталинсульфоната, сульфит натрия, сульфат натрия или их комбинацию.
[001540] Вариант осуществления 345 представляет собой состав, семя растения, согласно любому из вариантов осуществления 338-344 или инокулят согласно любому из вариантов осуществления 317-323 и 342-344, где приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель включает вермикулит, уголь, фильтрпрессную грязь для карбонизации на производстве сахара, рисовую шелуху, карбоксиметилцеллюлозу, торф, перлит, мелкий песок, карбонат кальция, муку, квасцы, крахмал, тальк, поливинилпирролидон или их комбинацию.
[001541] Вариант осуществления 346 представляет собой состав, семя растения, согласно любому из вариантов осуществления 338-345 или инокулят согласно любому из вариантов осуществления 317-323 и 342-345, где состав или инокулят содержит состав для покрытия семени, жидкий состав для внесения на растения или в среду для роста растений, или твердый состав для внесения на растения или в среду для роста растений.
[001542] Вариант осуществления 347 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 346, где состав для покрытия семян содержит водный или масляный раствор для нанесения на семена или порошковый или гранульный состав для нанесения на семена.
[001543] Вариант осуществления 348 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 346, где жидкий состав для внесения на растения или в среду для роста растений включает концентрированный состав или готовый для применения состав.
[001544] Вариант осуществления 349 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 346, где твердый состав для внесения на растения или в среду для роста растений включает гранульный состав или порошковое средство.
[001545] Вариант осуществления 350 представляет собой состав согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-349, семя растения согласно варианту осуществления 340 или 341, или инокулят согласно любому из вариантов осуществления 317-323 и 342-349, где состав или инокулят дополнительно содержат агрохимикат, включающий удобрение, материал микроудобрения, инсектицид, гербицид, средство для изменения роста растений, фунгицид, инсектицид, моллюскоцид, альгицид, бактериальный инокулят, грибной инокулят или их комбинацию.
[001546] Вариант осуществления 351 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 350, где состав или инокулят содержит бактериальный инокулят, и бактериальный инокулят содержит стимулирующий рост растений штамм бактерий.
[001547] Вариант осуществления 352 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 351, где стимулирующий рост растений штамм бактерий продуцирует инсектицидный токсин, продуцирует фунгицидное соединение, продуцирует нематоцидное соединение, продуцирует бактерицидное соединение, является устойчивым к одному или нескольким антибиотикам, содержит одну или несколько свободно реплицирующихся плазмид, связывается с корнями растения, колонизирует корни растений, образует биопленки, солюбилизирует питательные вещества, секретирует органические кислоты или имеет комбинацию этих эффектов.
[001548] Вариант осуществления 353 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 352, где инсектицидный токсин включает токсин Cry; где фунгицидное соединение включает β-1,3-глюканазу, хитозаназу, литиказу или их комбинацию; или где нематоцидное соединение включает токсин Cry.
[001549] Вариант осуществления 354 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно любому из вариантов осуществления 351-353, где стимулирующий рост растений штамм бактерий включает Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL № B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL № B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL № B-50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL № B-50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL № B-50921), Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL № B-50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL № NRRL B-50821), Bacillus mycoides EE118 (NRRL № B-50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL № B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL № B-50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL № B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL № B-50922), представитель семейства Bacillus cereus EE128 (NRRL № B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL № B-50924), Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL № B-50923), представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL № B-50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL № B-50925), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120), Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123) или Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), или их комбинацию.
[001550] Вариант осуществления 355 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 354, где стимулирующий рост растений штамм бактерий включает Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL № B-50820), Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL № B-50819) или Bacillus megaterium EE281 (NRRL № B-50925), и состав дополнительно включает рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 276 или 277.
[001551] Вариант осуществления 356 представляет собой семя растения, покрытое рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296, фрагментами экзоспория, происходящими из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124, 130-141 и 168-296, рекомбинантной спорообразующей бактерией согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268, биологически чистой бактериальной культурой согласно любому из вариантов осуществления 297-316, инокулятом согласно любому из вариантов осуществления 317-323 и 342-355, или составов согласно любому из вариантов осуществления 338, 339 и 342-355.
[001552] Вариант осуществления 357 представляет собой способ стимуляции роста растений, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий стимулирующий рост растений белок или пептид.
[001553] Вариант осуществления 358 представляет собой способ стимуляции роста растений, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268, или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий стимулирующий рост растений белок или пептид.
[001554] Вариант осуществления 359 представляет собой способ защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355, или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий белок или пептид, который защищает растение от патогена, или белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
[001555] Вариант осуществления 360 представляет собой способ защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий белок или пептид, который защищает растение от патогена, или белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
[001556] Вариант осуществления 361 представляет собой способ согласно варианту осуществления 359 или 360, где способ представляет собой способ защиты растения от патогена, и растения, выращенные в среде для роста растений, содержащей рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию, являются менее чувствительными к инфекции патогеном по сравнению с растениями, выращенными в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию.
[001557] Вариант осуществления 362 представляет собой способ согласно варианту осуществления 359 или 360, где способ представляет собой способ повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, и растения, выращенные в среде для роста растений, содержащей рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию, являются менее чувствительными к стрессовым воздействиям по сравнению с растениями, выращенными в тех же условиях в идентичной среде для роста растений. которая не содержит рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию.
[001558] Вариант осуществления 363 представляет собой способ иммобилизации спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растении, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий связывающийся с растением белок или пептид.
[001559] Вариант осуществления 364 представляет собой способ иммобилизации споры рекомбинантной спорообразующей бактерии на растении, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий связывающий растение пептид.
[001560] Вариант осуществления 365 представляет собой способ стимуляции прорастания семени растения, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий супероксиддисмутазу или фермент, который катализирует продукцию оксида азота.
[001561] Вариант осуществления 366 представляет собой способ стимуляции прорастания семени растения, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий супероксиддисмутазу, или фермент, который катализирует продукцию оксида азота.
[001562] Вариант осуществления 367 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 357-360 и 363-366, где стимулирующий рост растений белок или пептид, белок или пептид, который защищает растение от патогена, белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, связывающийся с растениями белок или пептид, или супероксиддисмутаза или фермент, который катализирует продукцию оксида азота, физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[001563] Вариант осуществления 368 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 365-367, где способ включает нанесение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, рекомбинантной спорообразующей бактерии или состава на семя растения.
[001564] Вариант осуществления 369 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления вариант осуществления 365-371, дополнительно включающий внесение L-аргинина в среду для роста растений, нанесение на семя растение, растение или область, окружающую растение или семя растения.
[001565] Вариант осуществления 370 представляет собой способ согласно варианту осуществления 369, где способ включает нанесение L-аргинина на надземную часть растения.
[001566] Вариант осуществления 371 представляет собой способ согласно варианту осуществления 369, где способ включает нанесение L-аргинина на семя растения.
[001567] Вариант осуществления 372 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 365-371, где семена в среде для роста растений, содержащей рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию, или семена, на которые нанесен рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантная спорообразующая бактерия, имеют увеличенный уровень прорастания или имеют более длинный главный корень после прорастания по сравнению с семенами, проращиваемыми в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию, или семенами, на которые не нанесен рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантная спорообразующая бактерия, выращенными в тех же условиях.
[001568] Вариант осуществления 373 представляет собой способ доставки нуклеиновых кислот в растение, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий связывающий нуклеиновую кислоту белок, и где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты.
[001569] Вариант осуществления 374 представляет собой способ согласно 373, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает эндофитный штамм бактерий.
[001570] Вариант осуществления 375 представляет собой способ согласно варианту осуществления 374, где эндофитный штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977) или Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001571] Вариант осуществления 376 представляет собой способ согласно варианту осуществления 375, где эндофитный штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977) или Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001572] Вариант осуществления 377 представляет собой способ доставки нуклеиновых кислот в растение, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий связывающий нуклеиновую кислоту белок, и где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты.
[001573] Вариант осуществления 378 представляет собой способ согласно варианту осуществления 377, где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий.
[001574] Вариант осуществления 379 представляет собой способ согласно варианту осуществления 378, где эндофитный штамм бактерий включает Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975), или Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), или Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123).
[001575] Вариант осуществления 380 представляет собой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты животному, насекомому или червю, включающий кормление животного, насекомого или червя растением, модифицированным так, чтобы оно содержало уровень молекулы нуклеиновой кислоты, который превышает уровень молекулы нуклеиновой кислоты в том же растении, которое не было модифицировано, выращенном в тех же условиях.
[001576] Вариант осуществления 381 представляет собой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты животному, насекомому или червю, включающий кормление животного, насекомого или червя:
рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, экспрессирующим слитый белок, содержащий представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus; или
рекомбинантной спорообразующей бактерией, которая экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии;
где представляющий интерес белок или пептид включает a связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид и со связывающим нуклеиновую кислоту белком или пептидом связана молекула нуклеиновой кислоты.
[001577] Вариант осуществления 382 представляет собой способ согласно варианту осуществления 380 или 381, где червь представляет собой нематоду.
[001578] Вариант осуществления 383 представляет собой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты в гриб или простейшее, включающий приведение гриба или простейшего в контакт с:
рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, экспрессирующим слитый белок, содержащий представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus; или
рекомбинантной спорообразующей бактерией, которая экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии;
где представляющий интерес белок или пептид включает связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид и со связывающим нуклеиновую кислоту белком или пептидом связана молекула нуклеиновой кислоты.
[001579] Вариант осуществления 384 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 373-379 и 381-383, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[001580] Вариант осуществления 385 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 373-384, где молекула нуклеиновой кислоты содержит модулирующую молекулу РНК; молекулу РНК-i; микроРНК; аптамер; или молекулу ДНК, которая кодирует модулирующую молекулу РНК, молекулу РНК-i, микроРНК или аптамер.
[001581] Вариант осуществления 386 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 381-385, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63, 100-141 и 186-296.
[001582] Вариант осуществления 387 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 381-386, где слитый белок включает слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 252-266.
[001583] Вариант осуществления 388 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 381-385, где белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок CotG, белок оболочки споры X или белок CotY.
[001584] Вариант осуществления 389 представляет собой способ согласно варианту осуществления 388, где белок оболочки споры содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 252-259.
[001585] Вариант осуществления 390 представляет собой способ стимуляции роста растения, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 64-70, 74-77 и 87-99 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
или нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 64-70, 74-77 и 87-99 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует фермент, вовлеченный в солюбилизацию питательных веществ, протеазу, белок BclA, белок BclB, белок CotE белок CotO, an белок ExsY, белок ExsFA/BxpB, белок CotY, белок ExsFB, белок ExsJ, белок ExsH, белок YjcA, белок YjcB, белок BclC, белок BxpA, белок BclE, белок BetA/BAS3290, белок ExsA, белок ExsK, белок ExsB, белок YabG, или белок Tgl, где экспрессия фермента, вовлеченного в солюбилизацию питательных веществ, протеазы, белка BclA, белка BclB, белка CotE, белка CotO, белка ExsY, белка ExsFA/BxpB, белка CotY, белка ExsFB, белка ExsJ, белка ExsH, белка YjcA, белка YjcB, белка BclC, белка BxpA, белка BclE, белка BetA/BAS3290, белка ExsA, белка ExsK, белка ExsB, белка YabG или белка Tgl увеличена по сравнению с экспрессией фермента, вовлеченного в солюбилизацию питательных веществ, протеазы, белка BclA, белка BclB, белка CotE, белка CotO, белка ExsY, белка ExsFA/BxpB, белка CotY, белка ExsFB, белка ExsJ, белка ExsH, белка YjcA, белка YjcB, белка BclC, белка BxpA, белка BclE, белка BetA/BAS3290, белка ExsA, белка ExsK, белка ExsB, белка YabG или белка Tgl в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[001586] Вариант осуществления 391 представляет собой способ повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 64, 65 и 78-83 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
или нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 64, 65 и 78-83 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует супероксиддисмутазу или аргиназу, где экспрессия супероксиддисмутазы или аргиназы увеличена по сравнению с экспрессией супероксиддисмутазы или аргиназы в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[001587] Вариант осуществления 392 представляет собой способ защиты растения от патогена, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 64, 65 и 74-77 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
или нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 64, 65 и 74-77 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует протеазу, где экспрессия протеазы увеличена по сравнению с экспрессией протеазы в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[001588] Вариант осуществления 393 представляет собой способ замедления прорастания споры представителя семейства Bacillus cereus, включающий модификацию представителя семейства Bacillus cereus для экспрессии инозинуридингидролазы или аланинрацемазы, где экспрессия инозинуридингидролазы или аланинрацемазы увеличена по сравнению с экспрессией инозинуридингидролазы или аланинрацемазы в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
[001589] Вариант осуществления 394 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 357-379 и 381-393, дополнительно включающий инактивацию рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантной спорообразующей бактерии перед внесением в среду для роста растений или нанесением на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения.
[001590] Вариант осуществления 395 представляет собой способ согласно варианту осуществления 394, где инактивация включает воздействие на рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus или рекомбинантную спорообразующую бактерию термической обработки; облучения гамма-излучением; облучения рентгеновским излучением, облучения УФ-A; облучения UV-B; обработки глутаральдегидом, формальдегидом, пероксидом водорода, уксусной кислотой, отбеливателем, хлороформом или фенолом, или их комбинацией.
[001591] Вариант осуществления 396 представляет собой способ согласно варианту осуществления 394 или 395, где инактивация включает модификацию рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или рекомбинантной спорообразующей бактерии для экспрессии протеазы прорастания споры или неспецифической эндонуклеазы, где экспрессия протеазы прорастания споры или неспецифической эндонуклеазы увеличена по сравнению с экспрессией протеазы прорастания споры или неспецифической эндонуклеазы в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях, и где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает рекомбинантную бактерию рода Bacillus.
[001592] Вариант осуществления 397 представляет собой способ удаления экзоспория из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, включающий:
воздействие на суспензию, содержащую споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124, центрифугирования или фильтрации с получением фрагментов экзоспория, которые отделены от спор;
где фрагменты экзоспория содержат слитый белок.
[001593] Вариант осуществления 398 представляет собой способ согласно варианту осуществления 397, где способ включает воздействие на суспензию, содержащую споры, центрифугирования, и, кроме того, включает сбор супернатанта, где супернатант содержит фрагменты экзоспория и по существу свободен от спор.
[001594] Вариант осуществления 399 представляет собой способ согласно варианту осуществления 397, где способ включает воздействие на суспензию, содержащую споры, фильтрации, и, кроме того, включает сбор фильтрата, где фильтрат содержит фрагменты экзоспория и по существу свободен от спор.
[001595] Вариант осуществления 400 представляет собой способ стимуляции роста растений, включающий:
внесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 в среду для роста растений; или
нанесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения;
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и слитый белок содержит стимулирующий рост растений белок или пептид.
[001596] Вариант осуществления 401 представляет собой способ защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, включающий:
внесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 в среду для роста растений; или
нанесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения;
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и слитый белок содержит белок или пептид, который защищает растение от патогена или белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
[001597] Вариант осуществления 402 представляет собой способ согласно варианту осуществления 401, где способ представляет собой способ защиты растения от патогена и где слитый белок содержит белок или пептид, который защищает растение от патогена.
[001598] Вариант осуществления 403 представляет собой способ защиты растения от патогена согласно варианту осуществления 402, где растения, выращенные в среде для роста растений, содержащей фрагменты экзоспория, являются менее чувствительными к инфекции патогеном по сравнению с растениями, выращенными в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит фрагменты экзоспория.
[001599] Вариант осуществления 404 представляет собой способ согласно варианту осуществления 401, где способ представляет собой способ повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, и где слитый белок содержит белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
[001600] Вариант осуществления 405 представляет собой способ повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям согласно варианту осуществления 404, где растения, выращенные в среде для роста растений, содержащей фрагменты экзоспория, являются менее чувствительными к стрессовым воздействиям по сравнению с растениями, выращенными в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит фрагменты экзоспория.
[001601] Вариант осуществления 406 представляет собой способ иммобилизации фрагментов экзоспория на растении, включающий:
внесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 в среду для роста растений; или
нанесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения;
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержит слитый белок, и слитый белок содержит связывающийся с растением белок или пептид.
[001602] Вариант осуществления 407 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 363, 364 и 406, где связывающийся с растениями белок или пептид селективно нацеливает и удерживает рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или фрагменты экзоспория фрагменты в растении.
[001603] Вариант осуществления 408 представляет собой способ согласно варианту осуществления 407, где связывающийся с растениями белок или пептид селективно нацеливает и удерживает рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или фрагменты экзоспория в корнях растений, субструктурах корней, надземной части растения или субструктуре надземной части растения.
[001604] Вариант осуществления 409 представляет собой способ стимуляции прорастания семени растения, включающий:
внесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 в среду для роста растений; или
нанесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 на семя растения или область, окружающую растение или семя растения;
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и слитый белок содержит супероксиддисмутазу или фермент, который катализирует продукцию оксида азота.
[001605] Вариант осуществления 410 представляет собой способ согласно варианту осуществления 409, где способ включает нанесение фрагментов экзоспория на семя растения.
[001606] Вариант осуществления 411 представляет собой способ согласно варианту осуществления 409 или 410, дополнительно включающий внесение L-аргинина в среду для роста растений, нанесение на семя растения или область, окружающую семя растения.
[001607] Вариант осуществления 412 представляет собой способ согласно варианту осуществления 411, где способ включает нанесение L-аргинина на семя растения.
[001608] Вариант осуществления 413 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 409-412, где семена в среде для роста растений, содержащей фрагменты экзоспория, или семена, на которые нанесены фрагменты экзоспория, имеют увеличенный уровень прорастания или имеют более длинный главный корень после прорастания по сравнению с теми же семенами, проращиваемыми в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит фрагменты экзоспория, или теми же семенами, проращиваемыми в тех же условиях, на которые фрагменты экзоспория не были нанесены.
[001609] Вариант осуществления 414 представляет собой способ доставки нуклеиновых кислот в растение, включающий:
внесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 в среду для роста растений; или
нанесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения;
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и слитый белок содержит связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, и где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты.
[001610] Вариант осуществления 415 представляет собой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты животному, насекомому или червю, включающий кормление животного, насекомого или червя фрагментами экзоспория, где фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, где слитый белок содержит связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, и где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты.
[001611] Вариант осуществления 416 представляет собой способ согласно варианту осуществления 415, где червь представляет собой нематоду.
[001612] Вариант осуществления 417 представляет собой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты в гриб или простейшее, включающий приведение в контакт гриба или простейшего с фрагментами экзоспория, где фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, где слитый белок содержит связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид, и где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты.
[001613] Вариант осуществления 418 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 414-417, где молекула нуклеиновой кислоты включает модулирующую молекулу РНК; молекулу РНК-i; микроРНК; аптамер или молекулу ДНК, которая кодирует модулирующую молекулу РНК, молекулу РНК-i, микроРНК или аптамер.
[001614] Вариант осуществления 419 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 414-418, где слитый белок содержит слитый белок согласно любому из вариантов осуществления 253-266.
[001615] Вариант осуществления 420 представляет собой способ стимуляции прорастания семени растения, включающий внесение в среду для роста растений, или нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения: (i) фермента, который катализирует продукцию оксида азота; (ii) супероксиддисмутазы; или (iii) рекомбинантного микроорганизма, который экспрессирует фермент, который катализирует продукцию оксида азота, или супероксиддисмутазу, где экспрессия фермента, который катализирует продукцию оксида азота, или супероксиддисмутазы увеличена по сравнению с экспрессией фермента, который катализирует продукцию оксида азота, или супероксиддисмутазы в микроорганизме дикого типа в тех же условиях.
[001616] Вариант осуществления 421 представляет собой способ согласно варианту осуществления 420, где способ включает нанесение фермента или микроорганизма на семя растения.
[001617] Вариант осуществления 422 представляет собой способ согласно варианту осуществления 420 или 421, дополнительно включающий внесение L-аргинина в среду для роста растений, на семя растения или в область, окружающую семя растения.
[001618] Вариант осуществления 423 представляет собой способ согласно варианту осуществления 422, где способ включает нанесение L-аргинина на семя растения.
[001619] Вариант осуществления 424 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 420-423, где семена в среде для роста растений, содержащей фермент или микроорганизм, или семена, на которые нанесен фермент или микроорганизм, имеют увеличенный уровень прорастания или более длинный главный корень после прорастания по сравнению с семенами, проращиваемыми в тех же условиях в идентичной среде для роста растений, которая не содержит фермент или микроорганизм, или семенами, на которые не был нанесен фермент или микроорганизм, проращиваемыми в тех же условиях.
[001620] Вариант осуществления 425 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 420-424, где фермент, который катализирует продукцию оксида азота, включает синтазу оксида азота или аргиназу.
[001621] Вариант осуществления 426 представляет собой способ согласно варианту осуществления 425, где фермент, который катализирует продукцию оксида азота, включает синтазу оксида азота.
[001622] Вариант осуществления 427 представляет собой способ согласно варианту осуществления 426, где синтаза оксида азота включает синтазу оксида азота из Bacillus thuringiensis BT013A или Bacillus subtilis 168.
[001623] Вариант осуществления 428 представляет собой способ согласно варианту осуществления 426 или 427, где синтаза оксида азота содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 260 или 261.
[001624] Вариант осуществления 429 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 420-438, где супероксиддисмутаза включает супероксиддисмутазу 1 (SODA1) или супероксиддисмутазу 2 (SODA2).
[001625] Вариант осуществления 430 представляет собой способ согласно варианту осуществления 429, где супероксиддисмутаза содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
[001626] Вариант осуществления 431 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 420-430, где рекомбинантный микроорганизм включает вид Bacillus, Escherechia coli, вид Aspergillus или вид Sacchromyces.
[001627] Вариант осуществления 432 представляет собой способ согласно варианту осуществления 431, где вид Bacillus включает представитель семейства Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis или Bacillus megaterium.
[001628] Вариант осуществления 433 представляет собой способ согласно варианту осуществления 431, где вид Aspergillus включает Aspergillus niger или где вид Sacchromyces включает Sacchromyces cerevisiae.
[001629] Вариант осуществления 434 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 420-433, где фермент или рекомбинантный микроорганизм вносят в среду для роста растений или наносят на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, в составе, содержащем фермент или рекомбинантный микроорганизм и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.
[001630] Вариант осуществления 435 представляет собой способ доставки ферментов в растение, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где представляющий интерес белок или пептид включает фермент.
[001631] Вариант осуществления 436 представляет собой способ доставки ферментов в растение, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153, и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где представляющий интерес белок или пептид включает фермент.
[001632] Вариант осуществления 437 представляет собой способ доставки ферментов в растение согласно варианту осуществления 435 или 436, где фермент физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[001633] Вариант осуществления 438 представляет собой способ доставки ферментов в растение, включающий:
внесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 в среду для роста растений; или
нанесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения;
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и представляющий интерес белок или пептид включает фермент.
[001634] Вариант осуществления 439 представляет собой способ согласно варианту осуществления 438, где способ дополнительно включает обработку растения усиливающим проникновением средством, поверхностно-активным веществом, детергентом, маслом или их комбинацией.
[001635] Вариант осуществления 440 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 435-441, где фермент является пригодным для деградации биомассы, расщепления целлюлозного материала, способствования пищеварению в пищеварительной системе целевого животного, которого можно кормить растением, или для продукции биотоплива.
[001636] Вариант осуществления 441 представляет собой способ согласно варианту осуществления 440, где фермент включает неспецифическую протеазу, металлопротеиназу, целлюлазу, ксиланазу, фосфатазу, эндоглюканазу, экзоглюканазу, β-глюкозидазу, амилазу, пектиназу, ксилозидазу, липазу, фосфолипазу или их комбинацию.
[001637] Вариант осуществления 442 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 434-441, где растение представляет собой культуру, выбранную из кукурузы, люцерны, пшеницы, пастбищной культуры, фуражной культуры, сои, проса, хикамы, сладкого сорго, сахарного тростника или их комбинации.
[001638] Вариант осуществления 443 представляет собой способ изменения свойства растения, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно варианту осуществления 16-141 и 168-296 или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где представляющий интерес белок или пептид включает сигнальную молекулу растения или фермент, который влияет на состав растения.
[001639] Вариант осуществления 444 представляет собой способ изменения свойства растения, включающий:
внесение в среду для роста растений рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355; или
нанесение на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, рекомбинантной спорообразующей бактерии согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-268 или состава, содержащего рекомбинантную спорообразующую бактерию согласно любому из вариантов осуществления 338 и 342-355;
где представляющий интерес белок или пептид включает сигнальную молекулу растения или фермент, который влияет на состав растения.
[001640] Вариант осуществления 445 представляет собой способ согласно варианту осуществления 443 или 444, где представляющий интерес белок или пептид физически связан с экзоспорием рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или с оболочкой споры рекомбинантной спорообразующей бактерии.
[001641] Вариант осуществления 446 представляет собой способ изменения свойства растения, включающий:
внесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 в среду для роста растений; или
нанесение фрагментов экзоспория или состава согласно варианту осуществления 339 на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения;
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и представляющий интерес белок или пептид включает сигнальную молекулу растения или фермент, который влияет на состав растения.
[001642] Вариант осуществления 447 представляет собой способ согласно варианту осуществления 446, где способ дополнительно включает обработку растения усиливающим проникновение средством, поверхностно-активным веществом, детергентом, маслом или их комбинацией.
[001643] Вариант осуществления 448 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 435-447, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерия или фрагменты экзоспория наносят на внекорневую часть растения перед сбором урожая.
[001644] Вариант осуществления 449 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 443-450, где фермент включает эндоглюканазу, протеазу, фосфолипазу, дезаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты, липазу или их комбинацию.
[001645] Вариант осуществления 450 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 443-448, где сигнальная молекула растения включает пептид флагеллина, криптогеин, гарпин, гарпин-подобный белок, фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений, или их комбинацию.
[001646] Вариант осуществления 451 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 443-450, где растение выбрано из винограда, сахарного тростника, проса, сладкого сорго, зерновой культуры, злаковой культуры, рапса, канолы, соли, подсолнечника, марихуаны или их комбинации.
[001647] Вариант осуществления 452 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 443-451, где свойство растения, подлежащее изменению, включает метаболическое изменение.
[001648] Вариант осуществления 453 представляет собой способ согласно варианту осуществления 452, где метаболическое изменение включает увеличение усвоения макронутриентов или микронутриентов или содержания ткани растения путем увеличения его корневой системы, увеличение содержания белка, увеличение усвоения азота, модифицированное содержание масел, модифицированное содержание сахаров или сахарозы, увеличенное содержание медицинского соединения, увеличенное содержание каннабиноидов, или их комбинацию.
[001649] Вариант осуществления 454 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 357-379, 390-396, 400-414 и 420-453, где среду для роста растений дополняют субстратом или кофактором фермента.
[001650] Вариант осуществления 455 представляет собой способ согласно варианту осуществления 454, где субстрат или кофактор включает триптофан, аденозинмонофосфат, аденозиндифосфат, аденозинтрифосфат, индол, триметафосфат, ферродоксин, ацетоин, диацетил, пируват, ацетолактат, пектин, целлюлозу, метилцеллюлозу, крахмал, хитин, пектин, белковую муку, производное целлюлозы, фосфат, ацетоин, хитозан, неактивное производное индол-3-уксусной кислоты, неактивное производное гибберелловой кислоты, ксилан, арабиноксилан, жир, воск, масло, фитиновую кислоту, лигнин, гуминовую кислоту, холин, производное холина, пролин, пролин-богатый белок, пролин-богатую муку, фенилаланин, хоризмат, L-аргинин, NADH, NADPH, ATP, GTP, цитохром C, цитохром p450 или их комбинацию.
[001651] Вариант осуществления 456 представляет собой способ согласно варианту осуществления 455, где аденозинтрифосфат включает аденозин-3-трифосфат.
[001652] Вариант осуществления 457 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 357-379, 390-396, 400-414 и 420-456, включающий покрытие семян рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, рекомбинантной спорообразующей бактерией или фрагментами экзоспория или составом, содержащим рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или фрагменты экзоспория, перед посевом.
[001653] Вариант осуществления 458 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 357-379, 390-396, 400-414 и 420-457, включающий нанесение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, рекомбинантной спорообразующей бактерии или фрагментов экзоспория, или состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или фрагменты экзоспория, на надземную часть растения.
[001654] Вариант осуществления 459 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 357-379, 390-396, 400-414 и 420-458, где внесение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, рекомбинантной спорообразующей бактерии или фрагментов экзоспория в среду для роста растений включает внесение в среду жидкого или твердого состава, содержащего рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, рекомбинантную спорообразующую бактерию или фрагменты экзоспория.
[001655] Вариант осуществления 460 представляет собой способ согласно варианту осуществления 459, где способ включает внесение состава в среду для роста растений до, одновременно или после посева семян, проростков, черенков, луковиц или растений в среду для роста растений.
[001656] Вариант осуществления 461 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 357-379, 390-396, 400-414 и 420-460, дополнительно включающий внесение по меньшей мере одного агрохимиката в среду для роста растений или нанесение по меньшей мере одного агрохимиката на растения или семена.
[001657] Вариант осуществления 462 представляет собой способ согласно варианту осуществления 461, где агрохимикат включает удобрение, материал микроудобрения, инсектицид, гербицид, фунгицид, моллюскоцид, альгицид, модификатор роста растений, бактериальный инокулят, грибной инокулят или их комбинацию.
[001658] Вариант осуществления 463 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 350 или способ согласно варианту осуществления 462, где агрохимикат включает удобрение, и удобрение включает жидкое удобрение; где агрохимикат включает материал микроудобрения, и материал микроудобрения включает борную кислоту, борат, борную фритту, сульфат меди, медную фритту, хелат меди, натрия тетраборат декагидрат, сульфат железа, оксид железа, сульфат железа аммония, железную фритту, хелат железа, сульфат марганца, оксид марганца, хелат марганца, хлорид марганца, марганцевую фритту, молибдат натрия, молибденовую кислоту, сульфат цинка, оксид цинка, карбонат цинка, цинковую фритту, фосфат цинка, хелат цинка или их комбинацию; где агрохимикат включает инсектицид, и инсектицид включает фосфороорганическое соединение, карбамат, пиретроид, акарицид, алкилфталат, борную кислоту, борат, фторид, серу, галогенароматическую замещенную мочевину, сложный эфир углеводорода, инсектицид на биологической основе, или их комбинацию; где агрохимикат включает гербицид, и гербицид включает хлорфеноксисоединение, нитрофенольное соединение, нитрокрезольное соединение, дипиридильное соединение, ацетамид, алифатическую кислоту, анилид, бензамид, бензойную кислоту, производное бензойной кислоты, анисовую кислоту, производное анисовой кислоты, бензонитрил, бензотиадиазинона диоксид, тиокарбамат, карбамат, карбанилат, хлорпиридинил, производное циклогексенона, производное динитроаминобензола, соединение фтординитротолуидина, изоксазолидинон, никотиновую кислоту, изопропиламин, производное изопропиламина, оксадиазолинона, фосфат, фталат, соединение пиколиновой кислоты, триазин, триазол, урацил, производное мочевины, эндоталл, хлорат натрия или их комбинацию; где агрохимикат содержит фунгицид, и фунгицид содержит замещенный бензол, тиокарбамат, этилен бис-дитиокарбамат, тиофталидамид, соединение медь, ртутьорганическое соединение, оловоорганическое соединение, соединение кадмия, анилазин, беномил, циклогексамид, додин, этридиазол, ипродион, метлаксил, тиамимефон, трифорин или их комбинацию; где агрохимикат включает грибной инокулят, и грибной инокулят включает грибной инокулят семейства Glomeraceae, грибной инокулят семейства Claroidoglomeraceae, грибной инокулят семейства Gigasporaceae, грибной инокулят семейства Acaulosporaceae, грибной инокулят семейства Sacculosporaceae, грибной инокулят семейства Entrophosporaceae, грибной инокулят семейства Pacidsporaceae, грибной инокулят семейства Diversisporaceae, грибной инокулят семейства Paraglomeraceae, грибной инокулят семейства Archaeosporaceae, грибной инокулят семейства Geosiphonaceae, грибной инокулят семейства Ambisporaceae, грибной инокулят семейства Scutellosporaceae, грибной инокулят семейства Dentiscultataceae, грибной инокулят семейства Racocetraceae, грибной инокулят отдела Basidiomycota, грибной инокулят отдела Ascomycota, грибной инокулят отдела Zygomycota или их комбинацию; или где агрохимикат включает бактериальный инокулят и бактериальный инокулят включает бактериальный инокулят рода Rhizobium, бактериальный инокулят рода Bradyrhizobium, бактериальный инокулят рода Mesorhizobium, бактериальный инокулят рода Azorhizobium, бактериальный инокулят рода Allorhizobium, бактериальный инокулят рода Sinorhizobium, бактериальный инокулят рода Kluyvera, бактериальный инокулят рода Azotobacter, бактериальный инокулят рода Pseudomonas, бактериальный инокулят рода Azospirillium, бактериальный инокулят рода Bacillus, бактериальный инокулят рода Streptomyces, бактериальный инокулят рода Paenibacillus, бактериальный инокулят рода Paracoccus, бактериальный инокулят рода Enterobacter, бактериальный инокулят рода Alcaligenes, бактериальный инокулят рода Mycobacterium, бактериальный инокулят рода Trichoderma, бактериальный инокулят рода Gliocladium, бактериальный инокулят рода Glomus, бактериальный инокулят рода Klebsiella или их комбинацию.
[001659] Вариант осуществления 464 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 350 или способ согласно варианту осуществления 462, где агрохимикат включает фунгицид, и фунгицид включает алдиморф, ампропилфос, ампропилфос калий, андоприм, анилазин, азоконазол, азоксистробин, беналаксил, беноданил, беномил, бензамакрил, бензамакрил-изобутил, биалафос, бинапакрил, бифенил, битертанол, бластицидин-S, боскалид, бромуконазол, бупиримат, бутиобат, полисульфид кальция, капсимицин, каптафол, каптан, карбендазим, карвон, хинометионат, хлобентиазон, хлорфеназол, хлоронеб, хлорпикрин, хлороталонил, хлозолинат, клозилакон, куфранеб, цимоксанил, ципроконазол, ципродинил, ципрофурам, дебакарб, дихлорофен, диклобутразол, диклофлуанид, дикломезин, диклоран, диэтофенкарб, диметиримол, диметоморф, димоксистробин, диниконазол, диниконазол-M, динокап, дифениламин, дипиритион, диталимфос, дитианон, додеморф, додин, дразоксолон, эдифенфос, эпоксиконазол, этаконазол, этиримол, этридиазол, фамоксадон, фенапанил, фенаримол, фенбуконазол, фенфурам, фенитропан, фенпиклонил, фенпропидин, фенпропиморф, фентин ацетат, фентин гидроксид, фербам, феримзон, флуазинам, флеметовер, фторомид, флухинконазол, флурпримидол, флусилазол, флусульфамид, флутоланил, флутриафол, фолпет, фосетил-алюминий, фосетил-натрий, фталид, фуберидазол, фуралаксил, фураметпир, фуркарбонил, фурконазол, фурконазол-цис, фурмeциклокс, гуазатин, гексахлорбензол, гексаконазол, гимексазол, имазалил, имибенконазол, иминоктадин, иминоктадин албесилат, иминоктадин триацетат, йодокарб, ипробенфос (IBP), ипродион, ирумамицин, изопротиолан, изоваледион, касугамицин, крезоксим-метил, препараты меди, такие как: гидроксид меди, нафтенат меди, оксихлорид меди, сульфат меди, оксид меди, оксин-медь и бордосская жидкость, манкупрум, манкозеб, манеб, меферимзон, мепанипирим, мепронил, металаксил, метконазол, метасульфокарб, метфуроксам, метирам, метомеклам, метсульфовакс, милдиомицин, миклобутанил, миклозолин, диметилдитиокарбамат никеля, нитротал-изопропил, нуаримол, офурас, оксадиксил, оксамокарб, оксолиновую кислоту, оксикарбоксим, оксифентиин, паклобутразол, пефуразоат, пенконазол, пенцикурон, фосдифен, пимарицин, пипералин, полиоксин, полиоксорим, пробеназол, прохлораз, процимидон, пропамокарб, пропанозин-натрий, пропиконазол, пропинеб, протиоциназол, пиразофос, пирифенокс, пириметанил, пироквилон, пироксифур, хиноконазол, квинтозен (PCNB), серу и препараты серы, тебуконазол, теклофталам, текназен, тетцикласис, тетраконазол, тиабендазол, тициофен, тифлузамид, тиофанат-метил, тиоксимид, толклофос-метил, толилфлуанид, триадимефон, триадименол, триазбутил, триазоксид, трихламид, трициклазол, тридеморф, трифлоксистробин, трифлумизол, трифорин, униконазол, валидамицин A, винкозолин, виниконазол, зариламид, зинеб, зирам, а также Dagger G, OK-8705, OK-8801, a-(1,1-диметилэтил)-(3-(2-феноксиэтил)-1H-1,2,4-триазол-1-этанол, a-(2,4-дихлорфенил)-[3-фтор-3-пропил-1H-1,2,4-триазол-1-этанол, a-(2,4-дихлорфенил)-[3-метокси-a-метил-1 H-1,2,4-триазол-1-этанол, a-(5-метил-1,3-диоксан-5-ил)-[3-[[4-(трифторметил)-фенил]метилен]-1H-1,2,4-триазол-1-этанол, (5RS,6RS)-6-гидрокси-2,2,7,7-тетраметил-5-(1 H-1,2,4-триазол-1-ил)-3-октанон, (E)-a-(метоксиимино)-N-метил-2-феноксифенилацетамид, 1-изопропил{2-метил-1-[[[1-(4-метилфенил)этил]амино]карбонил]пропил}карбамат, 1-(2,4-дихлорфенил)-2-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)этанон-O-(фенилметил)оксим, 1-(2-метил-1-нафталенил)-1H-пиррол-2,5-дион, 1-(3,5-дихлорфенил)-3-(2-пропенил)-2,5-пирролидиндион, 1-[(дийодометил)сульфонил]-4-метилбензол, 1-[[2-(2,4-дихлорфенил)-1,3-диоксолан-2-ил]метил]-1H-имидазол, 1-[[2-(4-хлорфенил)-3-фенилоксиранил]метил]-1H-1,2,4-триазол, 1-[1-[2-[(2,4-дихлорфенил)-метокси]фенил]этенил]-1H-имидазол, 1-метил-5-нонил-2-(фенилметил)-3-пирролидинол, 2',6'-дибром-2-метил-4'-трифторметокси-4'-трифторметил-1, 3-тиазолкарбоксанилид, 2,2-дихлор-N-[1-(4-хлорфенил)этил]-1-этил-3-метилциклопропанкарбоксамид, 2,6-дихлор-5-(метилтио)-4-пиримидинилтиоцианат, 2,6-дихлор-N-(4-трифторметилбензил)бензамид, 2,6-дихлор-N-[[4-(трифторметил)фенил]метил]бензамид, 2-(2,3,3-трийод-2-пропенил)-2H-тетразол, 2-[(1-метилэтил)-сульфонил]-5-(трихлорметил)-1,3,4-тиадиазол, 2-[[6-дезокси-4-O-(4-O-метил-(3-D-гликопиранозил)-a-D-глюкопиранозил]амино]-4-метокси-1H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбонитрил, 2-аминобутан, 2-бром-2-(бромметил)пентандинитрил, 2-хлор-N-(2,3-дигидро-1,1,3-триметил-1H-инден-4-ил)-3-пиридинкарбоксамид, 2-хлор-N-(2,6-диметилфенил)-N-(изотиоцианатметил)ацетамид, 2-фенилфенол (OPP), 3,4-дихлор-1-[4-(дифторметокси)фенил]пиррол-2,5-дион, 3,5-дихлор-N-[циано[(1-метил-2-пропинил)окси]метил]бензамид, 3-(1,1-диметилпропил-1-оксо-1H-инден-2-карбонитрил, 3-[2-(4-хлорфенил)-5-этокси-3-изоксазолидинил]пиридин, 4-хлор-2-циано-N,N-диметил-5-(4-метилфенил)-1H-имидазол-1-сульфонамид, 4-метилтетразолo[1,5-a]хиназолин-5(4H)-он, 8-(1,1-диметилэтил)-N-этил-N-пропил-1,4-диоксаспиро[4,5]декан-2-метанамин, сульфат 8-гидроксихинолина, 9H-ксантен-2-[(фениламино)карбонил]-9-карбоновый гидразид, бис-(1-метилэтил)-3-метил-4-[(3-метилбензоил)окси]-2,5-тиофендикарбоксилат, цис-1-(4-хлорфенил)-2-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)циклогептанол, цис-4-[3-[4-(1,1-диметилпропил)фенил-2-метилпропил]-2,6-диметилморфолина гидрохлорид, этил [(4-хлорфенил)-азо]цианоацетат, бикарбонат калия, метантетратиол-натриевую соль, метил 1-(2,3-дигидро-2,2-диметилинден-1-ил)-1H-имидазол-5-карбоксилат, метил N-(2,6-диметилфенил)-N-(5-изоксазолилкарбонил)-DL-аланинат, метил-N-(хлорацетил)-N-(2,6-диметилфенил)-DL-аланинат, N-(2,3-дихлор-4-гидроксифенил)-1-метилциклогексанкарбоксамид, N-(2,6-диметилфенил)-2-метокси-N-(тетрагидро-2-оксо-3-фуранил)ацетамид, N-(2,6-диметилфенил)-2-метокси-N-(тетрагидро-2-оксо-3-тиенил)ацетамид, N-(2-хлор-4-нитрофенил)-4-метил-3-нитробензолсульфонамид, N-(4-циклогексилфенил)-1,4,5,6-тетрагидро-2-пиримидинамин, N-(4-гексилфенил)-1,4,5,6-тетрагидро-2-пиримидинамин, N-(5-хлор-2-метилфенил)-2-метокси-N-(2-оксо-3-оксазолидинил)ацетамид, N-(6-метокси)-3-пиридинил)циклопропанкарбоксамид, N-[2,2,2-трихлор-1-[(хлорацетил)амино]этил]бензамид, N-[3-хлор-4,5-бис(2-пропинилокси)фенил]-N'-метоксиметанимидамид, N-формил-N-гидрокси-DL-аланин-натриевую соль, O,O-диэтил [2-(дипропиламино)-2-оксоэтил]этилфосфорамидотиоат, O-метил S-фенилфенилпропилфосфорамидотиоат, S-метил-1,2,3-бензотиадиазол-7-карботиоат и спиро[2H]-1-бензопиран-2,1'(3'H)-изобензофуран]-3'-он, N-трихлорметил)тио-4-циклогексан-l,2-дикарбоксимид, тетраметилтиопероксидикарбоновый диамид, метил-N-(2,6-диметилфенил)-N-(метоксиацетил)-DL-аланинат, 4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-1-H-пиррол-3-карбонитрил или их комбинацию.
[001660] Вариант осуществления 465 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 350 или способ согласно варианту осуществления 462, где агрохимикат включает бактериальный инокулят рода Bacillus, и бактериальный инокулят рода Bacillus включает Bacillus argri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus, Bacillus endorhythmos, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus lentimorbus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus medusa, Bacillus metiens, Bacillus natto, Bacillus nigrificans, Bacillus popillae, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus sphearicus, Bacillus spp., Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatu, или их комбинацию.
[001661] Вариант осуществления 466 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 350 или способ согласно варианту осуществления 462, где агрохимикат включает гербицид, и гербицид включает 2,4-D, 2,4-DB, ацетохлор, ацифлуорфен, алахлор, аметрин, атразин, аминопиралид, бенефин, бенсульфурон, бенсулид, бентазон, бромацил, бромксинил, бутилат, карфентразон, хлоримурон, хлорсульфурон, клетодим, кломазон, клопиралид, клорансулам, циклоат, DCPA, десмедифам, дикамбу, дихлобенил, диклофоп, диклосулам, дифлуфензопир, диметенамид, дикват, диурон, DSMA, эндотал, EPTC, эталфлуралин, этофумесат, феноксапроп, флуазифоп-P, флукарбазон, флуфанецет, флуметсулам, флумиклорак, флумиоксазин, флуометурон, флуроксипир, фомесафен, форамсульфурон, глюфосинат, глифосат, галосульфурон, гексазинон, имазаметабенц, имазамокс, имазапик, имазаквин, имазетапир, изоксабен, изоксафлутол, лактофен, линурон, MCPA, MCPB, мезотрион, метолахлор-с, метрибузин, метсульфурон, молинат, MSMA, напропамид, напталам, никосульфурон, норфлуразон, оризалин, оксидиазон, оксифлуорфен, паракват, пеларгоновую кислоту, пендиметалин, фенмедифам, пиклорам, примисульфурон, продиамин, прометрин, пронамид, пропанил, просульфурон, пиразон, пиритиобак, квинклорак, квизалофоп, римсульфурон, сетоксидим, сидурон, симазин, сульфентразон, сульфометурон, сульфосульфурон, тебутиурон, тебацил, тиазопир, тифенсульфурон, тиобенкарб, тралкоксидим, триаллат, триасульфурон, трибенурон, триклопир, трифлуралин, трифлусульфурон или их комбинацию.
[001662] Вариант осуществления 467 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно варианту осуществления 350 или способ согласно варианту осуществления 463, где состав или инокулят включает гербицид и штамм бактерий, который способен деградировать гербицид.
[001663] Вариант осуществления 468 представляет собой состав, семя растения, инокулят или способ согласно варианту осуществления 467, где штамм бактерий, который способен деградировать гербицид, включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121) или их комбинацию.
[001664] Вариант осуществления 469 представляет собой состав, семя растения, инокулят или способ согласно любому из вариантов осуществления 463-468, где гербицид включает сульфонилмочевину, арилтриазин, дикамбу, феноксигербицид, 2,4-D, пиретрин, пиретроид или их комбинацию.
[001665] Вариант осуществления 470 представляет собой состав, семя растения, инокулят или способ согласно варианту осуществления 469, где соединение сульфонилмочевины включает сульфентразон.
[001666] Вариант осуществления 471 представляет собой состав, семя растения или инокулят согласно любому из вариантов осуществления 350 и 463-470 или способ согласно любому из вариантов осуществления 461-470, где удобрение включает сульфат аммония, нитрат аммония, сульфат нитрат аммония, хлорид аммония, бисульфат аммония, полисульфид аммония, тиосульфат аммония, водный аммиак, безводный аммиак, полифосфат аммония, сульфат алюминия, нитрат кальция, нитрат кальция аммония, сульфат кальция, кальцинированный магнезит, кальцинированный известняк, оксид кальция, нитрат кальция, доломитовый известняк, гашеную известь, карбонат кальция, фосфат диаммония, фосфат моноаммония, нитрат магния, сульфат магния, нитрат калия, хлорид калия, сульфат калия магния, сульфат калия, нитраты натрия, магнезиальный известняк, магнезию, мочевину, мочевину-формальдегиды, мочевины аммония нитрат, покрытую серой мочевину, покрытую полимером мочевину, изобутилиден димочевину, K2SO4-2MgSO4, каинит, сильвинит, кизерит, английскую соль, элементарную серу, известковую глину, измельченные ракушки устриц, рыбную муку, жмыхи, рыбный ток, кровяную муку, фосфатную руду, суперфосфаты, шлак, костную муку, древесный пепел, навоз, гуано летучих мышей, торфяной мох, компост, глауконитовый песок, муку из семян хлопчатника, муку из перьев, крабовую кормовую муку, рыбную эмульсию, гуминовую кислоту или их комбинацию.
[001667] Вариант осуществления 472 представляет собой способ доставки полезных бактерий животному, включающий кормление животного растением, модифицированным так, чтобы оно содержало уровень эндофитного и пробиотического штамма бактерий, превышающий уровень эндофитного и пробиотического штамма бактерий в том же растении, которое не было модифицировано, выращенном в тех же условиях.
[001668] Вариант осуществления 473 представляет собой способ согласно варианту осуществления 472, где растение, которым кормят животное, включает растение, выращенное в среде для роста растений, содержащей эндофитный и пробиотический штамм бактерий или состав, содержащий эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, на которое нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, выращенное из семени, на которое был нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, выращенное в области, на которую нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, или семя, выращенное в области, на которую нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий.
[001669] Вариант осуществления 474 представляет собой способ согласно варианту осуществления 472 или 473, где эндофитный и пробиотический штамм бактерий включает вид Bacillus или Lysinibacillus.
[001670] Вариант осуществления 475 представляет собой способ согласно варианту осуществления 474, где вид Bacillus включает Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus toyocerin, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis или их комбинацию.
[001671] Вариант осуществления 476 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 472-475, где эндофитный и пробиотический штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975), или Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), или их комбинацию.
[001672] Вариант осуществления 477 представляет собой способ доставки белков или пептидов животному, включающий кормление животного рекомбинантным представителем семейства Bacillus cereus, экспрессирующим слитый белок, содержащий представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, или кормление животного фрагментами экзоспория, происходящими из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующего слитый белок, содержащий представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[001673] Вариант осуществления 478 представляет собой способ согласно варианту осуществления 477, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63, 125-141 и 186-296 или где фрагменты экзоспория включают фрагменты экзоспория, происходящие из представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124.
[001674] Вариант осуществления 479 представляет собой способ согласно варианту осуществления 477 или 478, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает эндофитный штамм бактерий.
[001675] Вариант осуществления 480 представляет собой способ согласно варианту осуществления 479, где эндофитный штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001676] Вариант осуществления 481 представляет собой способ согласно варианту осуществления 480, где эндофитный штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), или Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001677] Вариант осуществления 482 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 477-479, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает пробиотический штамм бактерий.
[001678] Вариант осуществления 483 представляет собой способ согласно варианту осуществления 482, где пробиотический штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL № B-50924) или их комбинацию.
[001679] Вариант осуществления 484 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 479-481, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus находится в растении, которым кормят животное.
[001680] Вариант осуществления 485 представляет собой способ согласно варианту осуществления 477 или 478, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает штамм бактерий, который способен колонизировать филлоплану растения.
[001681] Вариант осуществления 486 представляет собой способ согласно варианту осуществления 485, где штамм бактерий, который способен колонизировать филлоплану растения, включает Bacillus mycoides BT155 (NRRL № B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL № B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL № B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL № B-50922), представитель семейства Bacillus cereus EE218 (NRRL № B-50926), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL № B-50924), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119), Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001682] Вариант осуществления 487 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 485 или 486, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus находится на филлоплане растения, которым кормят животное.
[001683] Вариант осуществления 488 представляет собой вакцину, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок согласно варианту осуществления 12.
[001684] Вариант осуществления 489 представляет собой вакцину, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и фрагменты экзоспория, где фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и слитый белок содержит антиген.
[001685] Вариант осуществления 490 представляет собой вакцину, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 17-27, где слитый белок содержит антиген.
[001686] Вариант осуществления 491 представляет собой вакцину согласно любому из вариантов осуществления 488-490, где вакцина является пригодной для внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, внутримышечного, подкожного, внутриплеврального, местного, перорального, интраназального, внутрикожноо, трансэпителиального введения или посредством ингаляции.
[001687] Вариант осуществления 492 представляет собой вакцину согласно любому из вариантов осуществления 488-490, где вакцина является пригодной для перорального или трансэпителиального введения.
[001688] Вариант осуществления 493 представляет собой способ индукции иммуногенного ответа у индивидуума, причем способ включает введение индивидууму вакцины согласно любому из вариантов осуществления 488-492.
[001689] Вариант осуществления 494 представляет собой способ уменьшения количества загрязнителей в окружающей среде, включающий воздействие на загрязненную окружающую среду спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, которые экспрессируют слитый белок согласно варианту осуществления 13.
[001690] Вариант осуществления 495 представляет собой способ уменьшения количества загрязнителей в окружающей среде, включающий воздействие на загрязненную окружающую среду фрагментов экзоспория, где фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и где слитый белок содержит фермент рекультивации.
[001691] Вариант осуществления 496 представляет собой способ уменьшения количества загрязнителей в окружающей среде, включающий воздействие на загрязненную окружающую среду спор рекомбинантного представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 17-27, где слитый белок содержит фермент рекультивации.
[001692] Вариант осуществления 497 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 494-496, где загрязненная окружающая среда включает газ, жидкость, полужидкое вещество, гель, пленку, полутвердое вещество или твердое вещество.
[001693] Вариант осуществления 498 представляет собой способ согласно варианту осуществления 497, где твердое вещество включает поверхностную почву, подпахотный слой почвы, компост, пожнивные остатки, листья, мульчу, срубленные деревья, биопленку, слой грязи, гумус, отстой, песок, шлак, осадочное отложение, сточные воды, пустую породу, ядерные отходы, боеприпасы и снаряды, больничные отходы, части автомобилей под пресс, металлическую обрез, изоляционные отходы, пищевые отходы, асбест, элементы питания, лом металлообработки, полигонные отходы, отходы деревообработки, отходы текстильного производства, стекольный бой, кожевенные отходы, резиновые отходы, пластмассовые отходы, отходы электронных компонентов, сельскохозяйственные отходы, фотографические отходы, керамические отходы, фармацевтические отходы, воск, израсходованные катализаторы или их комбинации
[001694] Вариант осуществления 499 представляет собой способ согласно варианту осуществления 497, где жидкость включает питьевую воду, подземные воды, поверхностную воду, солевые растворы, резервуары, отстойники, водные экосистемы, промышленные сточные воды, кислые шахтные воды, израсходованную автомобильную жидкость, израсходованные электролитические ванны, растворы для обезжиривания, растворы для сухой очистки, машинные охлаждающие жидкости, отходы буровых жидкостей, отходы смазочно-охлаждающих жидкостей, отходы жидкостей гидроразрыва пласта, отходы смазывающих веществ, краску, бытовую сточную воду, нефтезагрязненые стоки, стоки целлюлозных заводов, системы подготовки воды, систему очистки стоков, канализацию, отстойник для осаждения, накопитель сточных вод, озеро, реку или их комбинацию.
[001695] Вариант осуществления 500 представляет собой способ согласно варианту осуществления 497, где газ включает воздух, выхлопной газ, такой как выбросы энергостанций, мусоросжигательных заводов, крематориев или нефтеперегонных заводов, технологический выходящий поток, свалочный газ, природный газ, пропан или их комбинацию.
[001696] Вариант осуществления 501 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 494-500, где загрязнитель включает химическое боевое средство, включая зарин (GB; o-изопропилметилфосфонофлуоридат); зоман (GD; o-пинаколилметилфосфонофлуоридат); циклозарин (GF; o-циклогексилметилфосфонофлуоридат); VX (O-этил-S-[2-(диизопропиламино)этил]метилфосфонотиоат); табун (GA; N,N-диметилэтилфосфороамидоцианидат), DFP (диизопропилфосфорофлуоридат) или иприт.
[001697] Вариант осуществления 502 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 494-500, где загрязнитель включает неорганическое соединение, включающее мышьяк, сурьму, барий, бериллий, кадмий, хром, медь, железо, свинец, марганец, ртуть, никель, селен, серебро, олово, таллий, уран, цинк или их комбинацию.
[001698] Вариант осуществления 503 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 494-500, где загрязнитель включает органическое соединение, содержащее полициклический ароматический углеводород (PAH), хлорированное ароматическое соединение, хлорированное алифатическое соединение, нитроароматическое соединение (NAC), фенольное соединение, цианосоединение, диоксин или их комбинацию.
[001699] Вариант осуществления 504 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 494-500, где загрязнитель включает неочищенную нефть, очищенную нефть, топливную нефть, дизельное топливо, бензин, масло для гидросистем и керосин или их летучий компонент.
[001700] Вариант осуществления 505 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 494-500, где загрязнитель включает взрывчатое вещество, удобрение, пестицид, инсектицид или гербицид.
[001701] Вариант осуществления 506 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 494-500, где фермент включает фосфатсвязывающий белок, протеазу, гидролиазу углеводов, липазу, фосфолипазу, нуклеазу, связывающий питательные вещества белок, целлюлазу, оксидоредуктазу, монооксигеназу, диоксигеназу, лакказу, лигнинпероксидазу, марганцевую пероксидазу, пероксидазу, дегалогеназу, каталазу, амилазу, редуктазу, оксидазу, амидазу, лигниназу, ксиланазу, пектиназу, ксилозидазу, эндоглюканазу, экзоглюканазу, глюкозидазу, ингибирующий биопленку пептид, деградирующий гербицид фермент, деградирующий пестицид фермент или их комбинацию.
[001702] Вариант осуществления 507 представляет собой способ согласно варианту осуществления 506, где деградирующий пестицид фермент включает пиретриназу.
[001703] Вариант осуществления 508 представляет собой способ согласно варианту осуществления 506, где фермент включает деградирующий гербицид фермент или деградирующий пестицид фермент, и рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид.
[001704] Вариант осуществления 509 представляет собой способ согласно варианту осуществления 508, где штамм бактерий, который способен деградировать гербицид или пестицид, включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120) или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001705] Вариант осуществления 510 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 494-509, где споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus или фрагменты экзоспория приводят в контакт с загрязненной внешней средой путем включения спор или фрагментов экзоспория в поток, содержащий загрязнитель, приведения в контакт потока, содержащего загрязнитель, с иммобилизующим материалом, содержащим споры или фрагменты экзоспория, включения спор или фрагментов экзоспория в гранулы, подлежащие смешению с загрязненной внешней средой, распыления спор или фрагментов экзоспория на или в загрязненную окружающую среду, инжектирования спор или фрагментов экзоспория в загрязненную окружающую среду, или полива загрязненной окружающей среды спорами или фрагментами экзоспория.
[001706] Вариант осуществления 511 представляет собой способ фиторекультивации загрязненной почвы, причем способ включает:
внесение спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus в загрязненную почву; или
нанесение спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus на растение, посаженное в загрязненную почву, или семя растения для посадки в загрязненную почву, или область загрязненной почвы, окружающую растение или семя растения;
где споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus экспрессируют слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, где слитый белок содержит слитый белок согласно варианту осуществления 13 и где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает эндофитный штамм бактерий или колонизирующий корни штамм бактерий.
[001707] Вариант осуществления 512 представляет собой способ фиторекультивации загрязненной почвы, способ, включающий экспрессию фермента рекультивации в спорах представителя семейства Bacillus cereus, где экспрессия фермента рекультивации в рекомбинантном представителе семейства Bacillus cereus увеличена по сравнению с экспрессией фермента рекультивации в спорах представителя семейства Bacillus cereus дикого типа.
[001708] Вариант осуществления 513 представляет собой способ фиторекультивации загрязненной почвы, причем способ включает:
внесение рекомбинантной спорообразующей бактерии в загрязненную почву; или
нанесение рекомбинантной спорообразующей бактерии на растение, посаженное в загрязненную почву, или семя растения для посадки в загрязненную почву, или область загрязненной почвы, окружающую растение или семя растения, где рекомбинантная спорообразующая бактерия экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и белок оболочки споры, который нацеливает слитый белок на поверхность споры бактерии, где белок оболочки споры включает белок CotB, белок CotC, белок CgeA, белок CotB/H, белок Cot G, белок оболочки споры X или белок CotY; рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий или колонизирующий корни штамм бактерий; и представляющий интерес белок или пептид включает фермент рекультивации.
[001709] Вариант осуществления 514 представляет собой способ согласно варианту осуществления 513, где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный штамм бактерий.
[001710] Вариант осуществления 515 представляет собой способ фиторекультивации загрязненной почвы, причем способ включает внесение фрагментов экзоспория в загрязненную почву или нанесение фрагментов экзоспория на растение, посаженное в загрязненную почву, или семя растения для посадки в загрязненную почву, или область загрязненной почвы, окружающую растение или семя растения, где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, где слитый белок содержит фермент рекультивации.
[001711] Вариант осуществления 516 представляет собой способ для фиторекультивации загрязненной почвы, включающий внесение спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 17-27 в загрязненную почву или нанесение спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 17-27 на растение, посаженное в загрязненную почву, или семя растения для посадки в загрязненную почву, или область загрязненной почвы, окружающую растение или семя растения, где слитый белок содержит фермент рекультивации.
[001712] Вариант осуществления 517 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 511-516, где споры или фрагменты экзоспория наносят на растение или семя растения, и растение или растение, выращенное из семени растения, является толерантным к заданному загрязнителю, подлежащему рекультивации из загрязненной почвы.
[001713] Вариант осуществления 518 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 494-517, где споры рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus включают эндофитный штамм бактерий.
[001714] Вариант осуществления 519 представляет собой способ согласно варианту осуществления 518, где эндофитный штамм бактерий включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979), Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979), Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977), или Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983), Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); или Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121).
[001715] Вариант осуществления 520 представляет собой способ уменьшения количества примесей в окружающей среде, включающий воздействие на загрязненную окружающую среду спор штамма представителя семейства Bacillus cereus, которые способны деградировать гербицид или пестицид; где загрязнители в окружающей среде включают гербицид, пестицид или их комбинацию; и где представитель семейства Bacillus cereus, который способен деградировать гербицид или пестицид, включает представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL № B-50928), представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121) или их комбинацию.
[001716] Вариант осуществления 521 представляет собой способ согласно варианту осуществления 520, где штамм представителя семейства Bacillus cereus, который способен деградировать гербицид или пестицид, включает рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus.
[001717] Вариант осуществления 522 представляет собой способ согласно варианту осуществления 521, где представляющий интерес белок или пептид включает деградирующий гербицид фермент, деградирующий пестицид фермент или их комбинацию.
[001718] Вариант осуществления 523 представляет собой способ обработки жидкости гидроразрыва пласта для разрушения эмульсии или геля в жидкости, причем способ включает добавление спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus в жидкость гидроразрыва пласта, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует слитый белок, содержащий по меньшей мере один представляющий интерес белок или пептид и нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, которые нацеливают слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, и представляющий интерес белок или пептид включает фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля.
[001719] Вариант осуществления 524 представляет собой способ согласно варианту осуществления 523, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 16-29, 48-63, 125-141 и 168-296.
[001720] Вариант осуществления 525 представляет собой способ обработки жидкости гидроразрыва пласта для разрушения эмульсии или геля в жидкости, причем способ включает добавление фрагментов экзоспория в жидкость гидроразрыва пласта, где фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и где слитый белок содержит фермент, пригодный для разрушения эмульсии или геля.
[001721] Вариант осуществления 526 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 523-525, где слитый белок включает слитый белок согласно варианту осуществления 14.
[001722] Вариант осуществления 527 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 523-526, где фермент включает гемицеллюлазу, амилазу, пектиназу, гидролиазу углеводов, целлюлазу, агаразу, полигалактуроназу, эндоглюканазу или их комбинацию.
[001723] Вариант осуществления 528 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 523-527, где эмульсия или гель включает полимер, аравийскую камедь, агар, ксантановую смолу, целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлозу, гидроксиэтилметилцеллюлозу, гуар, производное гуара или их комбинацию.
[001724] Вариант осуществления 529 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 523-528, где споры инжектируют в скважину, которая находится в контакте с подземным содержащим углеводороды пластом.
[001725] Вариант осуществления 530 представляет собой способ дезинфекции поверхности, включающий воздействие на поверхность рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок согласно варианту осуществления 15.
[001726] Вариант осуществления 531 представляет собой способ дезинфекции поверхности, включающий воздействие на поверхность фрагментов экзоспория, где фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и где слитый белок содержит антибактериальный белок или пептид.
[001727] Вариант осуществления 532 представляет собой способ дезинфекции поверхности, включающий воздействие на поверхность рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 17-27, где слитый белок включает антибактериальный белок или пептид.
[001728] Вариант осуществления 533 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 530-532, где антибактериальный белок или пептид минимизирует или предупреждает образование вирусных агентов, бактерий, амеб, паразитов или плесени на поверхности или их связывание с поверхностью.
[001729] Вариант осуществления 534 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 530-533, где антибактериальный белок или пептид включает протеазу, нуклеазу, противомикробный пептид, LysM, LfcinB, лизостафин, альбумин, дефензин, бактериоцин, липопептид, пептид врожденной иммунной системы, лизоцим, литиказу или их комбинацию.
[001730] Вариант осуществления 535 представляет собой применение слитых белков, содержащих фермент в качестве представляющего интерес белка или пептида согласно любому из вариантов осуществления 13 или 15, или рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, экспрессирующий слитый белок, содержащий фермент в качестве представляющего интерес белка или пептида согласно любому из вариантов осуществления 13 или 15, для обработки или дегуммирования смазки, масла или жира; переработки шкур в кожу; получения биотоплива, биодизеля или биоэтанола; переработки или конверсии сахаров; обработки крахмала; переработки бумаги или льна; обработки побочных продуктов животных или грибов или выделения аминокислот; направленного расщепления технических отходов; добавок в пищу и корма; диетических добавок; кормов для животных; промышленной очистки; переработки зерна; косметического производства; дезодорации; переработки продуктов питания или напитков; оптимизации пивоварения или добавки для пивоварения; детергентных добавок или переработки тканей или пряжи.
[001731] Вариант осуществления 536 представляет собой применение фрагментов экзоспория для обработки или дегуммирования смазки, масла или жира; переработки шкур в кожу; получения биотоплива, биодизеля или биоэтанола; переработки или конверсии сахаров; обработки крахмала; переработки бумаги или льна; обработки побочных продуктов животных или грибов или выделения аминокислот; направленного расщепления технических отходов; добавок в пищу и корма; диетических добавок; кормов для животных; промышленной очистки; переработки зерна; косметического производства; дезодорации; переработки продуктов питания или напитков; оптимизации пивоварения или добавки для пивоварения; детергентных добавок или переработки тканей или пряжи; где фрагменты экзоспория происходят из рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 100-124 и содержат слитый белок, и где слитый белок содержит фермент.
[001732] Вариант осуществления 537 представляет собой применение рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из вариантов осуществления 17-27 для обработки или дегуммирования смазки, масла или жира; переработки шкур в кожу; получения биотоплива, биодизеля или биоэтанола; переработки или конверсии сахаров; обработки крахмала; переработки бумаги или льна; обработки побочных продуктов животных или грибов или выделения аминокислот; направленного расщепления технических отходов; добавок в пищу и корма; диетических добавок; кормов для животных; промышленной очистки; переработки зерна; косметического производства; дезодорации; переработки продуктов питания или напитков; оптимизации пивоварения или добавки для пивоварения; детергентных добавок или переработки тканей или пряжи; где слитый белок содержит фермент.
[001733] Вариант осуществления 538 представляет собой применение согласно любому из вариантов осуществления 535-537, где фермент включает β-лактамазу, протеазу, липазу, фосфолипазу, целлюлазу, эндоглюканазу, экзоглюконазу, пектиназу, лигниназу, амилазу, полигалактуроназу, глюкозидазу, галактозидазу, гидролиазу углеводов, гидролазу клеточной стенки, нуклеазу, гемицеллюлазу, ксиланазу, манназу, лакказу, лактазу, эстеразу, фитазу, фосфатазу, инвертазу, глюкозаоксидазу, каталазe, литиказу, ацетолактатдекарбоксилазу или уреазу.
[001734] Вариант осуществления 539 представляет собой применение согласно варианту осуществления 538, где амилаза включает α-амилазу, β-амилазу или глюкоамилазу; или где эстераза включает пектинметилэстеразу.
[001736] Вариант осуществления 541 представляет собой способ согласно варианту осуществления 540, где нацеливающая последовательность содержит:
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 56% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 62% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 68% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%;
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 81%; или
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 90%.
[001737] Вариант осуществления 542 представляет собой способ согласно варианту осуществления 540, где нацеливающая последовательность состоит из:
(a) аминокислотной последовательности, состоящей из 16 аминокислот и обладающей по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%;
(b) аминокислот 1-35 SEQ ID NO: 1;
(c) аминокислот 20-35 SEQ ID NO: 1;
(d) SEQ ID NO: 1;
(e) SEQ ID NO: 96; или
(f) SEQ ID NO: 120.
[001738] Вариант осуществления 543 представляет собой способ согласно варианту осуществления 541, где нацеливающая последовательность состоит из аминокислотной последовательности.
[001739] Вариант осуществления 544 представляет собой способ согласно варианту осуществления 540, где белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 и 122.
[001740] Вариант осуществления 545 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 477-544, где нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория содержит аминокислотную последовательность GXT на ее С-конце, где X представляет собой любую аминокислоту.
[001741] Вариант осуществления 546 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 477-545, где нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория содержит остаток аланина в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
[001742] Вариант осуществления 547 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 477-546, где нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория дополнительно содержат остаток метионина, серина или треонина в положении аминокислоты, непосредственно предшествующем первой аминокислоте нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория, или в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
[001743] Вариант осуществления 548 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 477-547, где слитый белок дополнительно содержит аминокислотный линкер между нацеливающей последовательностью, белком экзоспория или фрагментом белка экзоспория и представляющим интерес белком или пептидом.
[001744] Вариант осуществления 549 представляет собой способ согласно варианту осуществления 548, где линкер включает полиаланиновый линкер, полиглициновый линкер или линкер. содержащий смесь остатков как аланина, так и глицина.
[001745] Вариант осуществления 550 представляет собой способ согласно варианту осуществления 548 или 549, где линкер содержит участок распознавания протеазой.
[001746] Вариант осуществления 551 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 447-550, где слитый белок экспрессируется под контролем промотора споруляции, нативного для нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория слитого белка или его части.
[001747] Вариант осуществления 552 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 447-551, где слитый белок экспрессируется под контролем промотора споруляции с высокой экспрессией.
[001748] Вариант осуществления 553 представляет собой способ согласно любому варианту осуществления 552, где промотор споруляции с высокой экспрессией включает последовательность промотора специфичной к споруляции полимеразы сигма-K.
[001749] Вариант осуществления 554 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 551-553, где промотор споруляции содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 157-231.
[001750] Вариант осуществления 555 представляет собой способ согласно варианту осуществления 553 или 554, последовательность или последовательности промотора сигма-K специфичной к споруляции полимеразы или последовательности обладают 100% идентичностью с соответствующими нуклеотидами любой из SEQ ID NO: 157-231.
[001751] Вариант осуществления 556 представляет собой способ доставки белков или пептидов животному, включающему кормление животного рекомбинантной спорообразующей бактерией согласно любому из вариантов осуществления 147-149, 151-153 и 156-167.
[001752] Вариант осуществления 557 представляет собой способ согласно варианту осуществления 556, где рекомбинантная спорообразующая бактерия включает эндофитный и пробиотический штамм бактерий.
[001753] Вариант осуществления 558 представляет собой способ согласно варианту осуществления 557, где эндофитный и пробиотический штамм бактерий включает Bacillus megaterium EE385 (NRRL B-50980), Bacillus sp. EE387 (NRRL B-50981), Bacillus circulans EE388 (NRRL B-50982), Bacillus subtilis EE405 (NRRL B-50978), Lysinibacillus fusiformis EE442 (NRRL B-50975) или Lysinibacillus sphaericus EE443 (NRRL B-50976), Bacillus pumilus EE-B00143 (NRRL B-67123), или их комбинацию.
[001754] Вариант осуществления 559 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 556-558, где рекомбинантная спорообразующая бактерия содержится в растении, которым кормят животное.
[001755] Вариант осуществления 560 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 472-487 и 540-559, где растение перерабатывают перед кормлением животного.
[001756] Вариант осуществления 561 представляет собой способ согласно варианту осуществления 472-487 и 540-560, где способ дополнительно включает:
внесение эндофитного штамма бактерий или состава, содержащего эндофитный штамм бактерий, в среду для роста растений; или
нанесение эндофитного штамма бактерий или состава, содержащего эндофитный штамм бактерий, на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения;
где растение, которым кормят животное, включает растение, выращенное в среде для роста растений, содержащей эндофитный и пробиотический штамм бактерий или состав, содержащий эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, на которое нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, выращенное из семени растения, на которое нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, растение, выращенное в области, на которую нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий, или семя, выращенное в области, на которую нанесен эндофитный и пробиотический штамм бактерий.
[001757] Вариант осуществления 562 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 477-487 и 540-561, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент.
[001758] Вариант осуществления 563 представляет собой способ согласно варианту осуществления 562, где фермент включает ксиланазу, ксилозидазу, фитазу, фосфатазу, протеазу, целлюлазу, эндоглюканазу, экзоглюконазу, глюканазу, амилазу, липазу, фосфолипазу, гликозилазу, галактаназу, α-галактозидазу, β-глюкозидазу, амилазу, пектиназу, биотиназу, полигалактуроназу, лигниназу или их комбинацию.
[001759] Вариант осуществления 564 представляет собой способ согласно варианту осуществления 563, где липаза включает фосфолипазу A1, фосфолипазу A2, фосфолипазу C, фосфолипазу D, лизофосфолипазу или их комбинацию.
[001760] Вариант осуществления 565 представляет собой способ согласно варианту осуществления 563, где амилаза включает α-амилазу или β-амилазу.
[001761] Вариант осуществления 566 представляет собой способ согласно варианту осуществления 563, где фермент включает ксиланазу или фитазу.
[001762] Вариант осуществления 567 представляет собой способ согласно любому из вариантов осуществления 472-487 и 540-566, где животное включает млекопитающее, птицу, рыбу или ракообразное.
[001763] Вариант осуществления 568 представляет собой способ согласно варианту осуществления 567, где млекопитающее включает овцу, козу, корову, свинью, оленя, альпаку, бизона, верблюда, осла, лошадь, мула, ламу, кролика, собаку или кошку; где птица включает курицу, индейку, утку, гуся, перепела или фазана; где рыба включает лосось, форель, тиляпию, тунца, сома или карпа; или где ракообразное включает мелкую креветку, крупную креветку, лобстера, краба или рака.
[001764] Ввиду вышесказанного, можно видеть, что достигается несколько задач изобретения, и обеспечиваются другие преимущественные результаты.
[001765] Поскольку в описанные выше продукты, композиции и способы можно вносить различные изменения без отклонения от объема изобретения, подразумевается, что весь материал, содержащийся в описанном выше описании и показанный на прилагаемых чертежах, следует интерпретировать как иллюстративный, но не ограничивающий.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ КЛЕТКИ BACILLUS И ИНСЕКТИЦИД | 2015 |
|
RU2736562C2 |
| КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ КЛЕТКИ BACILLUS И ДРУГОЙ АГЕНТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БОРЬБЫ | 2015 |
|
RU2736827C2 |
| ГИБРИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ, ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ И ИММОБИЛИЗАЦИИ СПОР BACILLUS НА РАСТЕНИЯХ | 2014 |
|
RU2688832C2 |
| ГИБРИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ, ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ И ИММОБИЛИЗАЦИИ СПОР BACILLUS НА РАСТЕНИЯХ | 2014 |
|
RU2815587C2 |
| СПОСОБЫ УЛУЧШЕНИЯ ЗДОРОВЬЯ РАСТЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ СВОБОДНЫХ ФЕРМЕНТОВ И МИКРООРГАНИЗМОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТЫ НА ПОВЫШЕННОМ УРОВНЕ | 2017 |
|
RU2802848C2 |
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВИДОВ БАКТЕРИЙ Bacillus, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2004 |
|
RU2382822C2 |
| НОВЫЕ БЕЛКИ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ИНГИБИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К НАСЕКОМЫМ | 2016 |
|
RU2765310C2 |
| НОВЫЕ ПЕСТИЦИДНЫЕ ПРОТЕИНЫ И ШТАММЫ | 1995 |
|
RU2196824C2 |
| ГЕН АХМ1554, КОДИРУЮЩИЙ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИН, И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2755282C2 |
| РЕКОМБИНАНТНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ПЕПТИДОВ | 2010 |
|
RU2548815C2 |
Изобретение относится к биотехнологии. Описан рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий: (A) представляющий интерес белок или пептид; и (B) нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, который нацеливает слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Также описан состав, содержащий фрагменты экзоспория, происходящие из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель, причем состав стимулирует рост растений, защищает растение от патогена и/или повышает устойчивость растений к стрессовым воздействиям. Кроме того, представлено семя растения, покрытое фрагментами экзоспория, происходящими из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus. Описаны способы стимуляции роста растений, защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, иммобилизации фрагментов экзоспория на растении, стимуляции прорастания семени растения, доставки нуклеиновых кислот в растение, защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, включающие использование фрагментов экзоспория на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения, где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно описанному выше и содержат слитый белок и слитый белок содержит белок или пептид. Изобретение расширяет арсенал средств защиты растений, повышения прорастания семян. 9 н. и 112 з.п. ф-лы, 15 ил., 75 табл., 69 пр.
1. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus, который экспрессирует слитый белок, содержащий:
(A) представляющий интерес белок или пептид и
(B) нацеливающую последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория, который нацеливает слитый белок в экзоспорий рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus, где нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория включает:
(1) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность с по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%;
(2) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1;
(3) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 1;
(4) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 1;
(5) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 2;
(6) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 1;
(7) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 1;
(8) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 1;
(9) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 1;
(10) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 1;
(11) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 3;
(12) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 3;
(13) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 3;
(14) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 4;
(15) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 3;
(16) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 3;
(17) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 3;
(18) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 3;
(19) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 5;
(20) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 5;
(21) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 5;
(22) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 6;
(23) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 5;
(24) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 5;
(25) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-38 SEQ ID NO: 5;
(26) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 5;
(27) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 5;
(28) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 5;
(29) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 7;
(30) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 7;
(31) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 7;
(32) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 8;
(33) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 7;
(34) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 7;
(35) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-28 SEQ ID NO: 7;
(36) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 7;
(37) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 9;
(38) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 9;
(39) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 9;
(40) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 10;
(41) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 9;
(42) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 9;
(43) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 9;
(44) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 11;
(45) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 11;
(46) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 11;
(47) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 12;
(48) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 11;
(49) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 11;
(50) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 11;
(51) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 11;
(52) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 11;
(53) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 13;
(54) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 13;
(55) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 13;
(56) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 14;
(57) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 13;
(58) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 13;
(59) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 13;
(60) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 13;
(61) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 13;
(62) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 15;
(63) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 15;
(64) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 15;
(65) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 16;
(66) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 15;
(67) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 15;
(68) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 15;
(69) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 15;
(70) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 15;
(71) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 15;
(72) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 15;
(73) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 17;
(74) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 17;
(75) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 17;
(76) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 18;
(77) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 17;
(78) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 17;
(79) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-27 SEQ ID NO: 17;
(80) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 17;
(81) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 19;
(82) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 19;
(83) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 19;
(84) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 20;
(85) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 19;
(86) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 19;
(87) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 19;
(88) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 19;
(89) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 19;
(90) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 21;
(91) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 21;
(92) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 21;
(93) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 22;
(94) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 21;
(95) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 21;
(96) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 21;
(97) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 21;
(98) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 21;
(99) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 23;
(100) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 23;
(101) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 23;
(102) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 24;
(103) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 23;
(104) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 23;
(105) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 23;
(106) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 25;
(107) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 25;
(108) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 25;
(109) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 26;
(110) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 25;
(111) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 25;
(112) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 25;
(113) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 27;
(114) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 27;
(115) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 27;
(116) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 28;
(117) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 27;
(118) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 27;
(119) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 27;
(120) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 27;
(121) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 29;
(122) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 29;
(123) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 29;
(124) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 30;
(125) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 29;
(126) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 29;
(127) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 29;
(128) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 29;
(129) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 29;
(130) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 31;
(131) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 31;
(132) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 31;
(133) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 32;
(134) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 31;
(135) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 31;
(136) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-24 SEQ ID NO: 31;
(137) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 33;
(138) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 33;
(139) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 34;
(140) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-16 SEQ ID NO: 35;
(141) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 35;
(142) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 36;
(143) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-29 SEQ ID NO: 43;
(144) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-29 SEQ ID NO: 43;
(145) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 43;
(146) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 44;
(147) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-29 SEQ ID NO: 43;
(148) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-29 SEQ ID NO: 43;
(149) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-29 SEQ ID NO: 43;
(150) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-29 SEQ ID NO: 43;
(151) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 45;
(152) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-35 SEQ ID NO: 45;
(153) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 45;
(154) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 46;
(155) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 45;
(156) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 45;
(157) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 45;
(158) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 45;
(159) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 45;
(160) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 47;
(161) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-43 SEQ ID NO: 47;
(162) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 47;
(163) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 48;
(164) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-43 SEQ ID NO: 47;
(165) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-43 SEQ ID NO: 47;
(166) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-43 SEQ ID NO: 47;
(167) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-43 SEQ ID NO: 47;
(168) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-43 SEQ ID NO: 47;
(169) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-43 SEQ ID NO: 47;
(170) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-43 SEQ ID NO: 47;
(171) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-32 SEQ ID NO: 49;
(172) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 17-32 SEQ ID NO: 49;
(173) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 49;
(174) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 50;
(175) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-32 SEQ ID NO: 49;
(176) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-32 SEQ ID NO: 49;
(177) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-32 SEQ ID NO: 49;
(178) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-32 SEQ ID NO: 49;
(179) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-32 SEQ ID NO: 49;
(180) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 51;
(181) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 51;
(182) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 51;
(183) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 52;
(184) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 51;
(185) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 51;
(186) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 51;
(187) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 51;
(188) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 51;
(189) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 53;
(190) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 53;
(191) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 53;
(192) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 54;
(193) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 53;
(194) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 53;
(195) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-33 SEQ ID NO: 53;
(196) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 53;
(197) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 53;
(198) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 55;
(199) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-30 SEQ ID NO: 55;
(200) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 55;
(201) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 56;
(202) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 55;
(203) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-30 SEQ ID NO: 55;
(204) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-30 SEQ ID NO: 55;
(205) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-30 SEQ ID NO: 55;
(206) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 57;
(207) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 115-130 SEQ ID NO: 57;
(208) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 57;
(209) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 58;
(210) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 57;
(211) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-130 SEQ ID NO: 57;
(212) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-130 SEQ ID NO: 57;
(213) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 57;
(214) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 57;
(215) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-130 SEQ ID NO: 57;
(216) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-130 SEQ ID NO: 57;
(217) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-130 SEQ ID NO: 57;
(218) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 70-130 SEQ ID NO: 57;
(219) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 80-130 SEQ ID NO: 57;
(220) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 90-130 SEQ ID NO: 57;
(221) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 100-130 SEQ ID NO: 57;
(222) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 110-130 SEQ ID NO: 57;
(223) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 95;
(224) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 96;
(225) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 97;
(226) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 98;
(227) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 99;
(228) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 100;
(229) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 101;
(230) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 102;
(231) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 103;
(232) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 104;
(233) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 105;
(234) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 106;
(235) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 108;
(236) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 109;
(237) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 110;
(238) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 111;
(239) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 112;
(240) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 113;
(241) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 114;
(242) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 115;
(243) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 116;
(244) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 117;
(245) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 118;
(246) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 119;
(247) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 120;
(248) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 121;
(249) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-31 SEQ ID NO: 1;
(250) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 22-33 SEQ ID NO: 1;
(251) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-31 SEQ ID NO: 1;
(252) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-23 SEQ ID NO: 3;
(253) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-25 SEQ ID NO: 3;
(254) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-23 SEQ ID NO: 3;
(255) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-30 SEQ ID NO: 59;
(256) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 59;
(257) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 60;
(258) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-30 SEQ ID NO: 59;
(259) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 4-30 SEQ ID NO: 59;
(260) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 6-30 SEQ ID NO: 59;
(261) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-33 SEQ ID NO: 61;
(262) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-33 SEQ ID NO: 61;
(263) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 61;
(264) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 62;
(265) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-33 SEQ ID NO: 61;
(266) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-33 SEQ ID NO: 61;
(267) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-33 SEQ ID NO: 61;
(268) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-33 SEQ ID NO: 61;
(269) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 63;
(270) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 63;
(271) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 64;
(272) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-35 SEQ ID NO: 63;
(273) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-35 SEQ ID NO: 63;
(274) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 8-35 SEQ ID NO: 63;
(275) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-35 SEQ ID NO: 63;
(276) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-35 SEQ ID NO: 63;
(277) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 65;
(278) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 65;
(279) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 65;
(280) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 66;
(281) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 107;
(282) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 65;
(283) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 65;
(284) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-27 SEQ ID NO: 67;
(285) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-27 SEQ ID NO: 67;
(286) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 67;
(287) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 68;
(288) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-27 SEQ ID NO: 67;
(289) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-27 SEQ ID NO: 67;
(290) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-27 SEQ ID NO: 67;
(291) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 69;
(292) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 69;
(293) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 69;
(294) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 70;
(295) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 69;
(296) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 69;
(297) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 69;
(298) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 69;
(299) белок экзоспория, содержащий SEQ ID NO: 72;
(300) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 73;
(301) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 74;
(302) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-42 SEQ ID NO: 75;
(303) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 27-42 SEQ ID NO: 75;
(304) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 75;
(305) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 76;
(306) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-42 SEQ ID NO: 75;
(307) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-42 SEQ ID NO: 75;
(308) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-42 SEQ ID NO: 75;
(309) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-42 SEQ ID NO: 75;
(310) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-42 SEQ ID NO: 75;
(311) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 25-42 SEQ ID NO: 75;
(312) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 77;
(313) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-24 SEQ ID NO: 77;
(314) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 77;
(315) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 78;
(316) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-24 SEQ ID NO: 77;
(317) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-24 SEQ ID NO: 77;
(318) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 80;
(319) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-38 SEQ ID NO: 81;
(320) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-38 SEQ ID NO: 81;
(321) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 81;
(322) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 82;
(323) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-38 SEQ ID NO: 81;
(324) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-38 SEQ ID NO: 81;
(325) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-38 SEQ ID NO: 81;
(326) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-38 SEQ ID NO: 81;
(327) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-38 SEQ ID NO: 81;
(328) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-34 SEQ ID NO: 83;
(329) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 83;
(330) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 84;
(331) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 86;
(332) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 87;
(333) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-28 SEQ ID NO: 87;
(334) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 87;
(335) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 88;
(336) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 87;
(337) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 87;
(338) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 87;
(339) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-28 SEQ ID NO: 89;
(340) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 89;
(341) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 90;
(342) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-28 SEQ ID NO: 89;
(343) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 5-28 SEQ ID NO: 89;
(344) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-28 SEQ ID NO: 89;
(345) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-93 SEQ ID NO: 91;
(346) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 91;
(347) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 92;
(348) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-93 SEQ ID NO: 91;
(349) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-93 SEQ ID NO: 91;
(350) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-93 SEQ ID NO: 91;
(351) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-93 SEQ ID NO: 91;
(352) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 40-93 SEQ ID NO: 91;
(353) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 50-93 SEQ ID NO: 91;
(354) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 60-93 SEQ ID NO: 91;
(355) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-130 SEQ ID NO: 93;
(356) нацеливающую последовательность, содержащую SEQ ID NO: 93;
(357) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 94;
(358) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2-130 SEQ ID NO: 93;
(359) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-130 SEQ ID NO: 93;
(360) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-130 SEQ ID NO: 93;
(361) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 30-130 SEQ ID NO: 93;
(362) белок экзоспория, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 122;
(363) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20-33 SEQ ID NO: 1;
(364) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 21-33 SEQ ID NO: 1;
(365) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-31 SEQ ID NO: 1;
(366) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 96;
(367) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-13 SEQ ID NO: 96;
(368) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-25 SEQ ID NO: 3;
(369) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-25 SEQ ID NO: 3;
(370) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15-23 SEQ ID NO: 3;
(371) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 97;
(372) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-13 SEQ ID NO: 97;
(373) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-36 SEQ ID NO: 5;
(374) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23-34 SEQ ID NO: 5;
(375) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 24-36 SEQ ID NO: 5;
(376) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 26-34 SEQ ID NO: 5;
(377) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-26 SEQ ID NO: 7;
(378) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13-24 SEQ ID NO: 7;
(379) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14-26 SEQ ID NO: 7;
(380) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 16-24 SEQ ID NO: 7;
(381) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-22 SEQ ID NO: 9;
(382) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9-20 SEQ ID NO: 9;
(383) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10-22 SEQ ID NO: 9;
(384) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-22 SEQ ID NO: 9;
(385) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 105;
(386) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-13 SEQ ID NO: 105;
(387) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-31 SEQ ID NO: 11;
(388) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-29 SEQ ID NO: 11;
(389) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 19-31 SEQ ID NO: 11;
(390) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 98;
(391) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-13 SEQ ID NO: 98;
(392) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-31 SEQ ID NO: 13;
(393) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18-29 SEQ ID NO: 13;
(394) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 19-31 SEQ ID NO: 13;
(395) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 21-29 SEQ ID NO: 13;
(396) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-15 SEQ ID NO: 99;
(397) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1-13 SEQ ID NO: 99;
(398) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-41 SEQ ID NO: 15;
(399) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28-39 SEQ ID NO: 15;
(400) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 29-41 SEQ ID NO: 15;
(401) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 31-39 SEQ ID NO: 15;
(402) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12-25 SEQ ID NO: 17;
(403) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13–25 SEQ ID NO: 17;
(404) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–15 SEQ ID NO: 100;
(405) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18–31 SEQ ID NO: 19;
(406) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18–29 SEQ ID NO: 19;
(407) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 19–31 SEQ ID NO: 19;
(408) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 21–29 SEQ ID NO: 19;
(409) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18–31 SEQ ID NO: 21;
(410) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18–29 SEQ ID NO: 21;
(411) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 19–31 SEQ ID NO: 21;
(412) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 21–29 SEQ ID NO: 21;
(413) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–15 SEQ ID NO: 101;
(414) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–13 SEQ ID NO: 101;
(415) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9–22 SEQ ID NO: 23;
(416) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9–20 SEQ ID NO: 23;
(417) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10–22 SEQ ID NO: 23;
(418) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12–20 SEQ ID NO: 23;
(419) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–15 SEQ ID NO: 102;
(420) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–13 SEQ ID NO: 102;
(421) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9–22 SEQ ID NO: 25;
(422) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9–20 SEQ ID NO: 25;
(423) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10–22 SEQ ID NO: 25;
(424) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12–20 SEQ ID NO: 25;
(425) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–15 SEQ ID NO: 103;
(426) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–13 SEQ ID NO: 103;
(427) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15–28 SEQ ID NO: 27;
(428) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15–26 SEQ ID NO: 27;
(429) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 16–28 SEQ ID NO: 27;
(430) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18–26 SEQ ID NO: 27;
(431) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–15 SEQ ID NO: 104;
(432) a нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–13 SEQ ID NO: 104;
(433) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–13 SEQ ID NO: 33;
(434) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–11 SEQ ID NO: 33;
(435) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 3–11 SEQ ID NO: 33;
(436) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–14 SEQ ID NO: 35;
(437) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–12 SEQ ID NO: 35;
(438) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 2–14 SEQ ID NO: 35;
(439) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14–27 SEQ ID NO: 43;
(440) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14–25 SEQ ID NO: 43;
(441) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15–27 SEQ ID NO: 43;
(442) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20–33 SEQ ID NO: 45;
(443) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 20–31 SEQ ID NO: 45;
(444) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 21–33 SEQ ID NO: 45;
(445) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–15 SEQ ID NO: 106;
(446) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–13 SEQ ID NO: 106;
(447) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28–41 SEQ ID NO: 47;
(448) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 28–39 SEQ ID NO: 47;
(449) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18–31 SEQ ID NO: 53;
(450) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18–29 SEQ ID NO: 53;
(451) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 19–31 SEQ ID NO: 53;
(452) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18–31 SEQ ID NO: 61;
(453) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 18–29 SEQ ID NO: 61;
(454) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 19–31 SEQ ID NO: 61;
(455) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9–22 SEQ ID NO: 65;
(456) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9–20 SEQ ID NO: 65;
(457) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10–22 SEQ ID NO: 65;
(458) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–15 SEQ ID NO: 107;
(459) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 1–13 SEQ ID NO: 107;
(460) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12–25 SEQ ID NO: 67;
(461) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12–23 SEQ ID NO: 67;
(462) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13–25 SEQ ID NO: 67;
(463) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 15–23 SEQ ID NO: 67;
(464) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23–36 SEQ ID NO: 69;
(465) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23–34 SEQ ID NO: 69;
(466) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 24–36 SEQ ID NO: 69;
(467) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 26–34 SEQ ID NO: 69;
(468) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 27–40 SEQ ID NO: 75;
(469) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 27–38 SEQ ID NO: 75;
(470) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9–22 SEQ ID NO: 77;
(471) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 9–20 SEQ ID NO: 77;
(472) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 10–22 SEQ ID NO: 77;
(473) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 12–20 SEQ ID NO: 77;
(474) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23–36 SEQ ID NO: 81;
(475) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 23–34 SEQ ID NO: 81;
(476) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 24–36 SEQ ID NO: 81;
(477) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 26–34 SEQ ID NO: 81;
(478) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13–26 SEQ ID NO: 87;
(479) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 13–24 SEQ ID NO: 87; или
(480) нацеливающую последовательность, содержащую аминокислоты 14–26 SEQ ID NO: 87;
и где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus:
(i) содержит мутацию в гене ExsY, где ген ExsY кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 123;
(ii) содержит мутацию в гене CotE, где ген CotE кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 149;
(iii) экспрессирует белок ExsY, где экспрессия белка ExsY увеличена по сравнению с экспрессией белка ExsY в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях, где белок ExsY содержит карбоксиконцевую метку, содержащую глобулярный белок, и где белок ExsY содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 123;
(iv) экспрессирует белок BclB, где экспрессия белка BclB увеличена по сравнению с экспрессией белка BclB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях и где белок BclB содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 143 или 144;
(v) экспрессирует белок YjcB, где экспрессия белка YjcB увеличена по сравнению с экспрессией белка YjcB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях и где белок YjcB содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 134 или 135;
(vi) содержит мутацию в гене CotY, где ген CotY кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 125;
(vii) содержит мутацию в гене ExsA, где ген ExsA кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 150; и/или
(viii) содержит мутацию в гене CotO, где ген CotO кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 126;
и где мутация в гене ExsY, мутация в гене CotE, экспрессия белка ExsY, экспрессия белка BclB, экспрессия белка YjcB, мутация в гене CotY, мутация в гене ExsA и/или мутация в гене CotO обеспечивает споры представителей семейства Bacillus cereus, имеющие экзоспорий, который легче удалить из споры по сравнению с экзоспорием споры дикого типа.
2. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию в гене CotE.
3. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.2, где мутация в гене CotE частично или полностью ингибирует способность CotE прикреплять экзоспорий к споре.
4. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.2, где мутация в гене CotE включает нокаут гена CotE или доминантно-негативную форму гена CotE.
5. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует белок ExsY, где экспрессия белка ExsY увеличена по сравнению с экспрессией белка ExsY в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях и где белок ExsY содержит С-концевую метку, содержащую глобулярный белок.
6. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.5, где глобулярный белок имеет молекулярную массу от 25 до 100 кДа.
7. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.5, где глобулярный белок включает зеленый флуоресцентный белок (GFP) или его вариант.
8. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.5, где экспрессия белка ExsY, содержащего карбоксиконцевую метку, содержащую глобулярный белок, ингибирует связывание белка ExsY с его мишенями в экзоспории.
9. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует белок BclB, где экспрессия белка BclB увеличена по сравнению с экспрессией белка BclB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
10. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.9, где экспрессия белка BclB приводит к формированию непрочного экзоспория.
11. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus экспрессирует белок YjcB, где экспрессия белка YjcB увеличена по сравнению с экспрессией белка YjcB в представителе семейства Bacillus cereus дикого типа в тех же условиях.
12. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.11, где экспрессия белка YjcB обуславливает формирование экзоспория фрагментарно вместо полной структуры.
13. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию в гене ExsY.
14. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.13, где мутация в гене ExsY включает нокаут гена ExsY.
15. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.13, где мутация в гене ExsY частично или полностью ингибирует способность ExsY к полному формированию экзоспория или связыванию экзоспория со спорой.
16. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию в гене CotY.
17. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.16, где мутация в гене CotY включает нокаут гена CotY.
18. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.17, где мутация в гене CotY приводит к образованию непрочного экзоспория.
19. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию в гене ExsA.
20. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.19, где мутация в гене ExsA включает нокаут гена ExsA.
21. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.19, где мутация в гене ExsA приводит к образованию непрочного экзоспория.
22. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus содержит мутацию в гене CotO.
23. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.22, где мутация в гене CotO включает нокаут гена CotO или доминантно-негативную форму гена CotO.
24. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.22, где мутация в гене CotO обуславливает формирование экзоспория полосами.
25. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где нацеливающая последовательность содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью с аминокислотами 20-35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 63%.
26. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где нацеливающая последовательность содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере приблизительно 62% идентичностью с аминокислотами 20–35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 72%.
27. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где нацеливающая последовательность содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью с аминокислотами 20–35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 90%.
28. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где нацеливающая последовательность или белок экзоспория содержит:
(a) аминокислотную последовательность, состоящую из 16 аминокислот и обладающую по меньшей мере приблизительно 43% идентичностью с аминокислотами 20–35 SEQ ID NO: 1, где идентичность с аминокислотами 25-35 составляет по меньшей мере приблизительно 54%;
(b) аминокислоты 1–35 SEQ ID NO: 1;
(c) аминокислоты 20–35 SEQ ID NO: 1;
(d) SEQ ID NO: 1;
(e) SEQ ID NO: 96; или
(f) SEQ ID NO: 120.
29. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где нацеливающая последовательность содержит SEQ ID NO: 96.
30. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 или 122.
31. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория включает аминокислотную последовательность GXT на их C-конце, где X представляет собой любую аминокислоту.
32. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где нацеливающая последовательность, белок экзоспория или фрагмент белка экзоспория дополнительно включает остаток метионина, серина или треонина в положении аминокислоты, непосредственно предшествующем первой аминокислоте нацеливающей последовательности, белка экзоспория или фрагмента белка экзоспория, или в положении нацеливающей последовательности, которое соответствует аминокислоте 20 SEQ ID NO: 1.
33. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где слитый белок дополнительно содержит аминокислотный линкер между нацеливающей последовательностью, белком экзоспория или фрагментом белка экзоспория и представляющим интерес белком или пептидом.
34. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.33, где линкер включает полиаланиновый линкер, полиглициновый линкер или линкер, содержащий смесь остатков как аланина, так и глицина.
35. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где представляющий интерес белок или пептид включает стимулирующий рост растений белок или пептид, белок или пептид, который защищает растение от патогена, белок или пептид, который повышает устойчивость растений к стрессовым воздействиям, связывающийся с растением белок или пептид, фермент, который катализирует продукцию оксида азота или связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид.
36. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.35, где представляющий интерес белок или пептид включает стимулирующий рост растений белок или пептид.
37. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.36, где стимулирующий рост растений белок или пептид включает пептидный гормон или негормональный пептид.
38. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.37, где пептидный гормон включает фитосульфокин, clavata 3 (CLV3), системин, ZmlGF или SCR/SP11 или где негормональный пептид включает RKN 16D10, Hg-Syv46, пептид eNOD40, мелиттин, мастопаран, Mas7, RHPP, POLARIS или ингибитор трипсина kunitz (KTI).
39. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения.
40. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.39, где стимулирующее рост растений соединение включает 2,3-бутандиол или гормон роста растений, где гормон роста растений включает цитокинин или производное цитокинина, этилен, ауксин или производное ауксина, гибберелловую кислоту или производное гибберелловой кислоты, абсцизовую кислоту или производное абсцизовой кислоты или жасмоновую кислоту или производное жасмоновой кислоты.
41. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.39, где фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения, включает ацетоинредуктазу, индол-3-ацетамидгидролазу, триптофанмонооксигеназу, ацетолактатсинтетазу, α-ацетолактатдекарбоксилазу, пируватдекарбоксилазу, диацетилредуктазу, бутандиолдегидрогеназу, аминотрансферазу, триптофандекарбоксилазу, аминоксидазу, индол-3-пируватдекарбоксилазу, индол-3-ацетальдегиддегидрогеназу, оксидазу боковой цепи триптофана, нитрилгидролазу, нитрилазу, пептидазу, протеазу, аденозинфосфатизопентенилтрансферазу, фосфатазу, аденозинкиназу, аденинфосфорибозилтрансферазу, CYP735A, 5'-рибонуклеотидфосфогидролазу, аденозиннуклеозидазу, зеатин-цис-транс-изомеразу, зеатин-O-глюкозилтрансферазу, β-глюкозидазу, цис-гидроксилазу, цис-гидроксилазу CK, N-глюкозилтрансферазу CK, 2,5-рибонуклеотидфосфогидролазу, аденозиннуклеозидазу, пуриннуклеозидфосфорилазу, зеатинредуктазу, гидроксиламинредуктазу, 2-оксоглутаратдиоксигеназу, гибберелловую 2B/3B гидролазу, гиббераллин-3-оксидазу, гиббераллин-20-оксидазу, хитозаназу, хитиназу, β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, дезаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты или фермент, вовлеченный в продукцию фактора nod.
42. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.41, где фермент, вовлеченный в продукцию или активацию стимулирующего рост растений соединения, включает протеазу или пептидазу, которая расщепляет белки, пептиды, пробелки или препробелки с образованием биологически активного пептида, где протеаза или пептидаза включает субтилизин, кислую протеазу, щелочную протеазу, протеиназу, эндопептидазу, экзопептидазу, термолизин, папаин, пепсин, трипсин, проназу, карбоксилазу, сериновую протеазу, глутаминовую протеазу, аспартатную протеазу, цистеиновую протеазу, треониновую протеазу или металлопротеиназу.
43. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент.
44. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.43, где фермент включает фермент, который деградирует или модифицирует источник питательных веществ бактерий, грибов или растений.
45. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.43, где фермент включает целлюлазу, липазу, лигниноксидазу, протеазу, гликозидгидролазу, фосфатазу, нитрогеназу, нуклеазу, амидазу, нитратредуктазу, нитритредуктазу, амилазу, оксидазу аммиака, лигниназу, глюкозидазу, фосфолипазу, фитазу, пектиназу, глюканазу, сульфатазу, уреазу, ксиланазу или хитозаназу.
46. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.45, где фермент включает фосфолипазу и фосфолипаза включает фосфолипазу A1, фосфолипазу A2, фосфолипазу C, фосфолипазу D или лизофосфолипазу.
47. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.46, где фосфолипаза включает фосфолипазу C и фосфолипаза C включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
48. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.46, где фосфолипаза включает фосфолипазу C и фосфолипаза C включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
49. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.46, где фосфолипаза включает фосфолипазу C и фосфолипаза C включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
50. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.46, где фосфолипаза включает фосфолипазу C и фосфолипаза C включает аминокислотную последовательность со 100% идентичностью с SEQ ID NO: 312.
51. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.45, где фермент включает целлюлазу и целлюлаза включает эндоцеллюлазу, экзоцеллюлазу или β-глюкозидазу.
52. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.51, где целлюлаза включает эндоцеллюлазу и эндоцеллюлаза включает эндоглюканазу.
53. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.51, где целлюлаза включает эндоцеллюлазу и эндоцеллюлаза включает эндоцеллюлазу Bacillus subtilis, эндоцеллюлазу Bacillus thuringiensis, эндоцеллюлазу Bacillus cereus или эндоцеллюлазу Bacillus clausii.
54. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.53, где целлюлаза включает эндоцеллюлазу Bacillus subtilis и эндоцеллюлаза Bacillus subtilis включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
55. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.53, где целлюлаза включает эндоцеллюлазу Bacillus subtilis и эндоцеллюлаза Bacillus subtilis включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
56. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.53, где целлюлаза включает эндоцеллюлазу Bacillus subtilis и эндоцеллюлаза Bacillus subtilis включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
57. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.53, где целлюлаза включает эндоцеллюлазу Bacillus subtilis и эндоцеллюлаза Bacillus subtilis включает аминокислотную последовательность со 100% идентичностью с SEQ ID NO: 311.
58. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.45, где фермент включает липазу и липаза включает липазу Bacillus subtilis, липазу Bacillus thuringiensis, липазу Bacillus cereus или липазу Bacillus clausii.
59. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.46, где фермент включает оксидазу лигнина и оксидаза лигнина включает пероксидазу лигнина, лакказу, глиоксальоксидазу, лигниназу или марганцевую пероксидазу.
60. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.45, где фермент включает протеазу и протеаза включает субтилизин, кислую протеазу, щелочную протеазу, протеиназу, пептидазу, эндопептидазу, экзопептидазу, термолизин, папаин, пепсин, трипсин, проназу, карбоксилазу, сериновую протеазу, глутаминовую протеазу, аспартатную протеазу, цистеиновую протеазу, треониновую протеазу или металлопротеиназу.
61. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.45, где фермент включает фосфатазу и фосфатаза включает гидролазу сложных моноэфиров фосфорной кислоты, фосфомоноэстеразу, гидролазу сложных диэфиров фосфорной кислоты, фосфодиэстеразу, гидролазу сложных моноэфиров трифосфорной кислоты, фосфорилангидридгидролазу, пирофосфатазу, фитазу, триметафосфатазу или трифосфатазу.
62. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.61, где фермент включает фосфомоноэстеразу и фосфомоноэстераза включает PhoA4 или где фермент включает фитазу и фитаза включает фитазу Bacillus subtilis EE148 или фитазу Bacillus thuringiensis BT013A.
63. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.45, где фермент включает нитрогеназу и нитрогеназа включает нитрогеназу семейства Nif.
64. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.45, где фермент включает хитозаназу, где хитозаназа содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
65. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.45, где фермент включает хитозаназу, где хитозаназа содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
66. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.45, где фермент включает хитозаназу, где хитозаназа содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
67. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.45, где фермент включает хитозаназу, где хитозаназа содержит аминокислотную последовательность со 100% идентичностью с SEQ ID NO: 313.
68. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п. 43, отличающийся тем, что фермент включает дезаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты.
69. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.35, где представляющий интерес белок или пептид включает белок или пептид, который защищает растение от патогена.
70. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.69, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает белок или пептид, усиливающий иммунную систему растений.
71. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.70, где белок или пептид, усиливающий иммунную систему растений, включает гарпин, гарпинподобный белок, α-эластин, β-эластин, системин, фенилаланинаммиаклиазу, элицитин, дефензин, криптогеин, белок флагеллин или пептид флагеллина.
72. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.69, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, обладает антибактериальной активностью, противогрибковой активностью или как антибактериальной, так и противогрибковой активностью или где белок или пептид, который защищает растение от патогена, обладает инсектицидной активностью, гельминтицидной активностью, подавляет хищничество насекомых или червей или их комбинацией.
73. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.72, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает бактериоцин, лизоцим, пептид лизоцима, авидин, стрептавидин, нерибосомальный активный пептид, кональбумин, альбумин, лактоферрин, пептид лактоферрина, TasA, инсектицидный бактериальный токсин, эндотоксин, токсин Cry, ингибирующий протеазу белок или пептид, цистеиновую протеазу или хитиназу.
74. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.73, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает инсектицидный бактериальный токсин и инсектицидный бактериальный токсин включает инсектицидный токсин VIP; где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает ингибирующий протеазу белок или пептид и ингибирующий протеазу белок или пептид включает ингибитор трипсина или ингибитор протеазы arrowhead; или где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает токсин Cry и токсин Cry включает токсин Cry из Bacillus thuringiensis.
75. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.74, где токсин Cry включает токсин Cry из Bacillus thuringiensis и токсин Cry toxin, включающий токсин Cry из Bacillus thuringiensis, включает белок Cry5B или Cry21A.
76. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.69, где белок или пептид, который защищает растение от патогена, включает фермент.
77. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.76, где фермент включает протеазу или лактоназу, где протеаза или лактоназа является специфичной к бактериальной сигнальной молекуле гомосерина.
78. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.76, где фермент является специфичным к клеточному компоненту бактерии или гриба, где фермент включает β-1,3-глюканазу, β-1,4-глюканазу, β-1,6-глюканазу, хитозаназу, хитиназу, хитозаназаподобный фермент, литиказу, пептидазу, протеиназу, протеазу, мутанолизин, стафолизин или лизоцим.
79. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.35, где представляющий интерес белок или пептид включает по меньшей мере один белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
80. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.79, где белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, включает фермент, который деградирует обуславливающее стресс соединение, где обуславливающее стресс соединение включает аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (ACC), активные формы кислорода, оксид азота, оксилипин, фенол или их комбинацию.
81. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.80, где белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, включает фермент, который деградирует обуславливающее стресс соединение, и фермент включает супероксиддисмутазу, оксидазу, каталазу, дезаминазу аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты, пероксидазу, антиоксидантный фермент или антиоксидантный пептид.
82. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.81, где фермент, который деградирует обуславливающее стресс соединение, включает супероксиддисмутазу, где супероксиддисмутаза включает супероксиддисмутазу 1 (SODA1) или супероксиддисмутазу 2 (SODA2).
83. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.82, где супероксиддисмутаза включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
84. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.82, где супероксиддисмутаза включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
85. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.82, где супероксиддисмутаза включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
86. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.82, где супероксиддисмутаза включает аминокислотную последовательность со 100% идентичностью с SEQ ID NO: 155 или 156.
87. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.79, где белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям, включает белок или пептид, который защищает растение от стрессовых воздействий внешней среды, где стрессовые воздействия внешней среды включают засуху, наводнение, жару, заморозки, соль, тяжелые металлы, низкие значения pH, высокие значения pH или их комбинацию.
88. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.87, где белок или пептид, который защищает растение от стрессовых воздействий внешней среды, включает белок, индуцирующий формирование микрокристаллов льда, пролиназу, фенилаланинаммиаклиазу, изохоризматсинтазу, изохоризматпируватлиазу или холиндегидрогеназу.
89. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.35, где слитый белок включает по меньшей мере один связывающийся с растением белок или пептид.
90. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.89, где связывающийся с растением белок или пептид включает адгезин, рикадгезин, флагеллин, омптин, лектин, экспансин, структурный белок биопленки, TasA, YuaB, белок пилуса, белок завитка, интимин, инвазин, агглютинин, афимбриальный белок.
91. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.35, где представляющий интерес белок или пептид включает фермент, который катализирует продукцию оксида азота.
92. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.91, где фермент, который катализирует продукцию оксида азота, включает синтазу оксида азота или аргиназу.
93. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.92, где фермент, который катализирует продукцию оксида азота, включает синтазу оксида азота, где синтаза оксида азота включает синтазу оксида азота из Bacillus thuringiensis или синтазу оксида азота из Bacillus subtilis.
94. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.93, где синтаза оксида азота включает синтазу оксида азота из Bacillus thuringiensis BT013A или Bacillus subtilis 168.
95. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.92, где синтаза оксида азота включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с SEQ ID NO: 260 или 261.
96. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.92, где синтаза оксида азота включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 260 или 261.
97. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.92, где синтаза оксида азота включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 260 или 261.
98. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.92, где синтаза оксида азота включает аминокислотную последовательность со 100% идентичностью с SEQ ID NO: 260 или 261.
99. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.35, где представляющий интерес белок или пептид включает связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид.
100. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.99, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид включает белок Hfq или малый растворимый в кислоте белок споры (SASP).
101. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.102, где SASP включает SASPα, SASPβ или SASPγ.
102. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.99, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264–266.
103. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.99, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264–266.
104. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.99, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид включает аминокислотную последовательность с по меньшей мере 98% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264–266.
105. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.99, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид включает аминокислотную последовательность со 100% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 264–266.
106. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.99, где слитый белок содержит SEQ ID NO: 267, 268 или 269.
107. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.99, где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид включает нуклеазу, имеющую инактивированный активный центр.
108. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.99, дополнительно включающий молекулу нуклеиновой кислоты, связанную со связывающим нуклеиновую кислоту белком или пептидом, где молекула нуклеиновой кислоты включает модулирующую молекулу РНК; молекулу РНК-i; микроРНК; аптамер; или молекулу ДНК, которая кодирует модулирующую молекулу РНК, молекулу РНК-i, микроРНК или аптамер.
109. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, отличающийся тем, что рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, Bacillus toyoiensis или их комбинацию.
110. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.109, отличающийся тем, что рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus включает Bacillus mycoides BT155 (NRRL No. B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL No. B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL No. B-50921), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No. B-50922), представитель семейства Bacillus cereus EE128 (NRRL No. B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), представитель семейства Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928); представитель семейства Bacillus cereus EE-B00377 (NRRL B-67119); Bacillus pseudomycoides EE-B00366 (NRRL B-67120); Bacillus mycoides EE-B00363 (NRRL B-67121); представитель семейства Bacillus cereus EE439 (NRRL B-50979); Bacillus thuringiensis EE417 (NRRL B-50979); Bacillus cereus EE444 (NRRL B-50977); Bacillus thuringiensis EE319 (NRRL B-50983); или Bacillus thuringiensis EE-B00184 (NRRL B-67122).
111. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.1, отличающийся тем, что рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus дополнительно включает инактивирующую мутацию в его гене BclA.
112. Рекомбинантный представитель семейства Bacillus cereus по п.111, где инактивирующая мутация в гене BclA включает нокаут гена BclA.
113. Состав, содержащий фрагменты экзоспория, происходящие из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из пп.1–112, и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель, причем состав стимулирует рост растений, защищает растение от патогена и/или повышает устойчивость растений к стрессовым воздействиям.
114. Семя растения, покрытое фрагментами экзоспория, происходящими из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из пп.1–112.
115. Семя растения по п.114, отличающееся тем, что семя растения покрыто фрагментами экзоспория.
116. Способ стимуляции роста растений, включающий
внесение фрагментов экзоспория в среду для роста растений или
нанесение фрагментов экзоспория на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения,
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из пп.1–112 и содержат слитый белок и слитый белок содержит стимулирующий рост растений белок или пептид.
117. Способ защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, включающий
внесение фрагментов экзоспория в среду для роста растений,
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из пп.1–112 и содержат слитый белок и слитый белок содержит белок или пептид, который защищает растение от патогена, или белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
118. Способ иммобилизации фрагментов экзоспория на растении, включающий
внесение фрагментов экзоспория в среду для роста растений или
нанесение фрагментов экзоспория на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения,
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из пп.1–112 и содержат слитый белок и слитый белок содержит связывающийся с растением белок или пептид.
119. Способ стимуляции прорастания семени растения, включающий
внесение фрагментов экзоспория в среду для роста растений или
нанесение фрагментов экзоспория на семя растения или область, окружающую растение или семя растения,
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из пп.1–112 и содержат слитый белок и слитый белок содержит супероксиддисмутазу или фермент, который катализирует продукцию оксида азота.
120. Способ доставки нуклеиновых кислот в растение, включающий
внесение фрагментов экзоспория в среду для роста растений или
нанесение фрагментов экзоспория на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения,
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из пп.1–112 и содержат слитый белок и слитый белок содержит связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид и где связывающий нуклеиновую кислоту белок или пептид связан с молекулой нуклеиновой кислоты.
121. Способ защиты растения от патогена или повышения устойчивости растения к стрессовым воздействиям, включающий
нанесение фрагментов экзоспория на растение, семя растения или область, окружающую растение или семя растения,
где фрагменты экзоспория происходят из спор рекомбинантного представителя семейства Bacillus cereus согласно любому из пп.1–112 и содержат слитый белок и слитый белок содержит белок или пептид, который защищает растение от патогена, или белок или пептид, который повышает устойчивость растения к стрессовым воздействиям.
| WO 2005028654 A, 31.03.2005 | |||
| US 2012259101 A1, 11.10.2012 | |||
| BRIAN M | |||
| THOMPSON et al., Assembly of the BclB glycoprotein into the exosporium and evidence for its role in the formation of the exosporium ‘cap’ structure in Bacillus anthracis, Molecular Microbiology Vol | |||
| Пюпитр для работы на пишущих машинах | 1922 |
|
SU86A1 |
| ЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ЛАМПА НАКАЛИВАНИЯ С НЕСКОЛЬКИМИ НИТЯМИ | 1924 |
|
SU1073A1 |
| ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS СEREUS-ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ | 1999 |
|
RU2160778C1 |
| ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 1E6 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К СПОРАМ Bacillus anthracis | 2010 |
|
RU2439148C1 |
