ПЕПТИД ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПОВРЕЖДЕНИЙ КОЖИ, ВЫЗВАННЫХ АТМОСФЕРНЫМИ ЗАГРЯЗНЕНИЯМИ, И ДЛЯ ОМОЛАЖИВАЮЩЕЙ ТЕРАПИИ, А ТАКЖЕ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Российский патент 2022 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61P17/16 A61Q17/00 A61Q19/08 A61K8/64 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому пептиду, способному предотвращать повреждения кожи, вызванные загрязнениями, а также оказывающему омолаживающий эффект на кожу, и к применению данного пептида.

Предшествующий уровень техники

В современном обществе вызванные образованием больших городов и индустриализацией атмосферные загрязнения представляют серьезную социальную проблему, результаты разнообразных исследований показали, что атмосферные загрязнения могут негативно влиять на общее состояние здоровья человека, включая респираторную систему. В частности, в Корее концентрация взвешенных частиц в воздухе по сравнению с предыдущими годами значительно возросла, средства массовой информации постоянно обращают на это внимание, и, таким образом, интерес и беспокойство общественности по вопросам серьезности проблемы загрязнения воздуха увеличились.

Хотя среди всех внутренних органов организма человека респираторная система более всего подвержена действию атмосферных загрязнений, однако кожа, обладающая большой площадью поверхности, непосредственно контактирующей с загрязнениями и непрерывно подвергающаяся воздействию воздуха, представляет собой один из органов, являющихся основной мишенью загрязнителей. Обычно проблему ухудшения здоровья кожи, вызванного действием внешней среды, связывали с действием ультрафиолетового излучения в составе солнечного света, однако более нельзя пренебрегать и результатами исследований усилившегося загрязнения окружающей среды и возрастающим количеством загрязнений в атмосфере. Существует потребность в исследованиях и разработках материалов или содержащих их косметических продуктов, способных защитить кожу от атмосферного загрязнения и восстановить ее.

Рецептор ароматических углеводородов (AhR) является ключевым рецептором, который индуцирует повреждение кожи, передавая в клетку причиняющие вред сигналы, когда с кожей контактируют атмосферные загрязнения. При действии на кожу человека такие диоксины, как 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин (TCDD) и полиароматические углеводороды (PAH), связываются с AhR и перемещаются в клеточное ядро, как при механизме действия стероидных гормонов, что вызывает токсические эффекты. В ядре комплекс AhR с диоксином связывается с ядерным транслокаторным белком AhR (Arnt), и комплекс AhR/Arnt связывается с последовательностью нуклеотидов, называемой элементом ответа на лекарства/ксенобиотики (drug/xenobiotic responsive element, DRE или XRE), в транскрипционном регуляторном участке целевого гена, включающего цитохромы P450s (P450 или cyps; CYP1A1, CYP1A2 и CYP1B1), что индуцирует транскрипцию нескольких групп генов и приводит к токсичности.

С другой стороны, клетки кожи могут по различным причинам подвергаться старению, и вследствие старения клеток кожи могут возникать морщины. Старение можно разделить на возрастное старение (эндогенное старение), которое представляет собой естественное старение, проявляющееся со временем вследствие биологических процессов, и фотостарение (фотогенное старение), когда дегенеративные изменения, возникающие в месте, подвергавшемся действию солнечного света, и возрастное старение оказывают объединенное воздействие. Если ингибируется экспрессия или активность различных факторов, связанных с ростом клетки, может возникать естественное старение, фотостарение клеток кожи может протекать под действием света с длиной волны от 280 до 400 нм в составе солнечного света. В частности, повреждение кожи или волокон может осуществляться по причине облучения ультрафиолетовыми лучами, такими как UVB с длиной волны в диапазоне от 280 до 320 нм, при этом кожа может загореть и при загаре ее цвет может стать более темным. Облучение UVB облегчает накопление активных форм кислорода (ROS) и свободных радикалов в клетках кожи, а радикалы стимулируют внутриклеточные сигнальные системы, которые способны вызывать окислительный стресс биомолекул, таких как ДНК, белки и липиды, а это может приводить к повреждению кожной ткани.

Усиление окислительного стресса клеток кожи может приводить к стимулированию кератиноцитов эпидермиса или фибробластов дермы, может повышать экспрессию генов, таких как ген матричной металлопротеиназы (MMP), которая разрушает коллаген посредством серии процессов внутриклеточной передачи сигнала, может вызывать снижение содержания коллагена, составляющего 90% дермы и в качестве основного компонента кожи защищающего ее от внешних воздействий или сил, обеспечивая ее стойкость и прочность; таким образом, в результате может наблюдаться старение кожи и образование морщин. Таким образом, регулируя экспрессию генов, участвующих в синтезе, или деградацию фибриллярных белков, таких как коллаген, можно ожидать предотвращения старения клеток кожи и снижения числа морщин.

Эффект старения клеток по причине воздействия ультрафиолетового излучения в составе солнечного света или поступления атмосферных загрязнений, как описано выше, вызывает не только косметические проблемы по причине повреждения кожи, но также и серьезные проблемы со здоровьем, такие как рак, по причине повреждения ДНК клеток, центральной и периферической нервной системы, разрушения иммунной системы, нарушения в работе репродуктивных органов, нарушения в развитии младенцев и детей дошкольного возраста, а также хлоракне, и таким образом, поиск решения этих проблем является насущной задачей.

Для решения описанных проблем были разработаны различные материалы, а также были предприняты попытки преодолеть указанные проблемы с помощью экстрактов, полученных из различных растений или микроорганизмов. Часто, однако, состав экстрактов неизвестен, так как невозможно специфически идентифицировать, какое вещество в составе экстракта природного продукта может оказывать влияние на защиту клеток кожи и их восстановление после старения, и, таким образом, все неизвестные вещества в составе экстракта применяют целиком. Используя характеристики материала, который необходимо применять в непосредственном контакте с кожей или наносить на кожу человека, следует минимизировать побочные эффекты материала и гарантировать безопасность организма человека. Таким образом, необходимо точно идентифицировать отдельные вещества, способные решить вышеописанную проблему, а затем наносить их на кожу человека.

Описание воплощений

Техническая проблема

В настоящем изобретении предлагается пептид, который может быть использован для защиты клеток кожи путем предотвращения повреждения кожи, вызванного источниками загрязнения, путем ингибирования поступления загрязняющих веществ, таких как диоксины, взвешенные частицы и сигаретный дым, в клетки.

Предлагается пептид, который может быть использован для снижения явления старения клеток кожи, происходящего естественным путем или вызванного ультрафиолетовым излучением в составе солнечного света и, тем самым, для уменьшения числа морщин на коже.

Предлагается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболеваний, вызванных загрязняющими веществами, или для улучшения омолаживающей терапии кожи путем включения пептида в качестве активного ингредиента.

Предлагается косметическая композиция для профилактики повреждения кожи, вызванного загрязняющими веществами, или для улучшения омолаживающей терапии кожи путем включения пептида в качестве активного ингредиента.

Решение технической проблемы

Для достижения вышеописанной задачи, в соответствии с аспектом настоящего изобретения, предлагается пептид для профилактики повреждения кожи, вызванного загрязняющими веществами, причем пептид включает последовательность аминокислот SEQ ID No: 1.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предлагается пептид для омолаживающей терапии кожи, причем пептид включает последовательность аминокислот SEQ ID No: 1.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предлагается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболеваний, вызванных загрязняющими веществами, причем фармацевтическая композиция включает последовательность аминокислот SEQ ID No: 1.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предлагается фармацевтическая композиция для улучшения омолаживающей терапии кожи, причем фармацевтическая композиция включает последовательность аминокислот SEQ ID No: 1.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предлагается косметическая композиция для профилактики повреждений кожи, вызванных загрязняющими веществами, и для улучшения омолаживающей терапии кожи, причем косметическая композиция включает пептид, включающий последовательность аминокислот SEQ ID No: 1 в качестве активного ингредиента.

Полезные эффекты от раскрытия изобретения

Пептид, предлагаемый настоящим изобретением, способен предотвращать поступление присутствующих в воздухе загрязняющих веществ, таких как диоксины, взвешенные частицы и сигаретный дым, и ингибировать явления старения клеток кожи; тем самым он может быть использован в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции для профилактики или лечения рака, которое может вызываться загрязняющими веществами, заболеваний кожи, заболеваний легких или для уменьшения старения кожи, и может быть использован в качестве активного ингредиента косметической композиции для защиты кожи от загрязняющих веществ и для уменьшения старения кожи и образования морщин.

Однако, эффекты настоящего изобретения не ограничиваются указанными, и в свете последующего описания специалисту в уровне техники будут легко понятны и другие эффекты.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1А - 1С демонстрирует результаты вестерн-блоттинга, которые подтверждают число транслокаций AhR в ядро при действии TCDD, PM и CSE, соответственно, на клетки HaCaT, обработанные пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1; Далее "Контр." означает контроль, а "Отр. Контр." означает отрицательный контроль;

фиг. 1D демонстрирует результаты вестерн-блоттинга, которые подтверждают число транслокаций AhR в ядро при действии CSE на клетки A549, обработанные пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1;

фиг. 2А - 2С демонстрирует результаты ОТ-ПЦР, которые подтверждают уровни экспрессии генов CYP1A1 и COX-2 при действии TCDD, PM, и CSE, соответственно, на клетки HaCaT, обработанные пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1;

фиг. 3А и 3В демонстрирует результаты вестерн-блоттинга, которые подтверждают количество белка MMP-1 и COX-2 при действии TCDD и PM, соответственно, на клетки HaCaT, обработанные пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1;

фиг. 4А и 4В представляют собой изображения, которые показывают, осаждается ли пептид, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, при поглощении PM и CSE, соответственно;

фиг. 5А демонстрирует результат вестерн-блоттинга, который подтверждает количество белка p-Akt и p-ERK клеток HaCaT, обработанных пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1;

фиг. 5В демонстрирует результат ОТ-ПЦР, который подтверждает уровни экспрессии гена SIRT1 клеток HaCaT, обработанных пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1;

фиг. 6А демонстрирует результат вестерн-блоттинга, который подтверждает количество белка p-Akt и p-ERK клеток NIH3T3, обработанных пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1;

фиг. 6В демонстрирует результаты ОТ-ПЦР, которые подтверждают уровни экспрессии генов коллагена (Col1a1), фибронектина и эластина клеток NIH3T3, обработанных пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1;

фиг. 7 демонстрирует результаты ОТ-ПЦР, которые подтверждают уровни экспрессии генов SIRT1 и AQP3 клеток HaCaT, на которые подействовали UVB и обработали пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1;

фиг. 8А демонстрирует результаты ОТ-ПЦР, которые подтверждают уровни экспрессии генов коллагена (Col1a1), фибронектина и эластина клеток NIH3T3, на которые подействовали UVB и обработали пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1; и

фиг. 8В демонстрирует результаты вестерн-блоттинга, которые подтверждают количество белка MMP-1 клеток NIH3T3, на которые подействовали UVB и обработали пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, а также результаты зимографии с желатином, которые подтверждают количество белка MMP-2 клеток NIH3T3, на которые подействовали UVB и обработали пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1.

Подробное описание

Далее приводится подробное описание настоящего изобретения.

1. Пептид для профилактики повреждений кожи, вызванных загрязняющими веществами, или для омолаживающей терапии.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения, предлагается новый пептид, способный предотвращать повреждения кожи, вызванные загрязняющими веществами.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предлагается новый пептид, способный ингибировать старение кожи.

Пептид означает полимер, состоящий из двух или более аминокислот, связанных пептидной связью. Размер пептида слишком большой, чтобы он мог эффективно проникать в целевые ткани или клетки, или у него короткий период полураспада, и, таким образом, он исчезает в организме за непродолжительное время. Пептид по настоящему изобретению состоит из 20 или менее, например, 15 или менее или 10 или менее аминокислот, которые могут ингибировать поступление в клетку загрязняющих веществ.

Пептид по настоящему изобретению может включать последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 и может включать варианты или фрагменты аминокислот с различными последовательностями, образованными путем делеции, вставки, замены или комбинирования аминокислотных остатков в диапазоне, не влияющем на способность ингибировать повреждения кожи, вызванные загрязняющими веществами, а также на омолаживающие свойства пептида. В уровне техники известны аминокислотные замены в пептиде, которые не полностью модифицируют способность ингибировать повреждения кожи, вызванные загрязняющими веществами, и омолаживающую активность пептида. Иногда пептид может быть модифицирован путем фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования и фарнезилирования. Соответственно, настоящее изобретение включает пептид, включающий последовательность аминокислот, которая в значительной степени идентична последовательности пептида, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, а также его вариант или активный фрагмент. В значительной степени идентичный белок означает такой, у которого последовательность аминокислот характеризуется 75% или более, например, 80% или более, 90% или более, 95% или более гомологией последовательности с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1. Кроме того, пептид может дополнительно включать целевую последовательность, метку, меченый остаток, или последовательность аминокислот, приготовленные для специфической цели повышения стабильности или периода полужизни пептида.

Дополнительно, пептид по настоящему изобретению можно получить различными способами, хорошо известными в уровне техники. Например, пептид можно приготовить методом полинуклеотидного рекомбинирования и системы экспрессии белка, синтезом in vitro путем химического синтеза, такого как синтез пептидов, и бесклеточного белкового синтеза.

Дополнительно, для достижения лучшей химической стабильности, улучшенных фармакологических свойств (период полураспада, абсорбционная способность, активность, эффективность и т.д.), модификации специфичности (например, широкий спектр биологической активности) и уменьшения антигенности с N- или С-концом пептида можно связать защитную группу. Например, защитная группа может представлять собой ацетильную группу, флуоренилметоксикарбонильную группу, формильную группу, пальмитоильную группу, миристильную группу, стеарильную группу или полиэтиленгликоновую (ПЭГ) группу, но может без ограничений включать любой элемент, способный усиливать модификацию пептида, например, стабильность пептида. Термин «стабильность», используемый в настоящем изобретении, означает стабильность при хранении (например, стабильность при хранении при комнатной температуре), а также стабильность in-vivo, означающую защиту пептида по настоящему изобретению от атаки расщепляющих белок ферментов in vivo.

Термин «загрязняющие вещества», используемый в настоящем изобретении, может означать диоксин (TCDD), взвешенные частицы (PM) или экстракт сигаретного дыма (CSE), но воплощения не ограничены ими, и загрязняющие вещества могут включать любые ксенобиотики, которые поступают в клетку снаружи и оказывают токсическое влияние на рост и нормальный метаболизм клеток. Профилактика повреждения кожи загрязняющими веществами может быть достигнута путем предотвращения проникновения загрязняющих веществ в клетки, что делает невозможным токсический эффект загрязняющих веществ на клетки.

Дополнительно, пептид по настоящему изобретению может ингибировать поступление загрязняющих веществ в клетку путем адсорбции на них. Когда загрязняющие вещества, такие как диоксин, попадают в клетку, они могут связываться с AhR, индуцируя экспрессию нескольких групп генов, и, соответственно, экспрессия CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, COX-2, и MMP может возрастать. В этом отношении цитопротекторный эффект пептида по настоящему изобретению посредством ингибирования поступления загрязняющих веществ в клетку можно определить проверкой изменения уровня экспрессии этих генов.

Термин «омолаживающая терапия кожи», используемый в настоящем изобретении, может означать эффект подавления старения клеток кожи. Старение может быть естественным старением клеток со временем, может быть фотостарением, вызванным действием солнечного света, и, в частности, может быть фотостарением, вызванным действием ультрафиолетового излучения. Дополнительно, старение может быть индуцировано внутриклеточным окислительным стрессом, который может быть вызван различными причинами, и приводить к ингибированию клеточного роста и апоптоза, а также к ингибированию синтеза различных фибриллярных белков, входящих в состав клеток кожи, и повышению экспрессии разрушающих ферментов. В частности, при облучении УФ-светом в клетках кожи подавляется экспрессия таких генов, как SIRT1, AQP3, Col1a1, фибронектин и эластин, а экспрессия генов MMP-1 и MMP-2 усиливается, что может вызывать фотостарение клеток кожи и образование морщин.

Пептиды по настоящему изобретению могут повышать экспрессию генов каскадов, связанных с пролиферацией клеток кожи, усиливать экспрессию генов фибриллярных белков или индуцировать подавление экспрессии генов ферментов, вызывающих протеолиз фибриллярных белков. Таким образом, пептид может уменьшать образование морщин и улучшать эластичность кожи путем усиления синтеза фибриллярных белков, а также проявлять омолаживающие кожу свойства, улучшая кожный барьер. Способность пептида по настоящему изобретению проявлять омолаживающий эффект и снижать образование морщин на коже можно определить, измеряя уровни экспрессии генов, ассоциированных с белками, участвующими в пролиферации клеток, генов, опосредующих омолаживающий эффект, а также генов фибриллярных белков и разрушающих их ферментов, где уровни экспрессии в клетках кожи меняются при прогрессировании старения кожи.

Для того, чтобы определить эффект профилактики вызванного загрязняющими веществами повреждения кожи со стороны пептида по настоящему изобретению, в соответствии с одним специфическим воплощением настоящего изобретения, в качестве результата, подтверждающего уровень транслокации AhR в ядро и уровни экспрессии CYP1A1, COX-2 и MMP-1 после обработки кератиноцитов и фибробластов пептидами, включающими последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и загрязняющими веществами, такими как диоксин, PM и CSE, было показано, что поступление загрязняющих веществ, таких как диоксин, PM и CSE, подавлялся и что уровень транслокации AhR в ядра и уровни экспрессии CYP1A1, COX-2 и MMP-1 в ответ на поступление загрязняющих веществ снижались в зависимости от обработки с использованием пептида по настоящему изобретению (см. фиг. 1А - 3В).

Кроме того, чтобы определить адсорбцию между пептидом и загрязняющим веществом, в другом специфическом воплощении настоящего изобретения при наблюдении невооруженным глазом в результате смешивания PM и CSE с пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, было показано, что пептид по настоящему изобретению осаждался при адсорбции с загрязняющими веществами, такими как PM и CSE, и что адсорбция происходила в зависимости от количества пептида (см. фиг. 4А и 4В).

Кроме того, чтобы определить ингибирующий эффект пептида по настоящему изобретению на естественное старение клеток кожи, в другом специфическом воплощении настоящего изобретения путем обнаружения достаточного для подтверждения количества фосфорилированного Akt и ERK и уровней экспрессии SIRT1, коллагена, фибронектина и эластина было показано, что после обработки кератиноцитов и фибробластов пептидом, включая последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, количество фосфорилированной Akt и ERK, количество белка SIRT1 и уровни экспрессии фибриллярных белков, таких как коллаген, фибронектин и эластин, возрастали при обработке пептидом на настоящему изобретению (см. фиг. 5А - 6В).

Кроме того, чтобы определить восстанавливающий эффект пептида по настоящему изобретению на клетки кожи после фотостарения из-за воздействия ультрафиолетового (УФ) излучения, в другом специфическом воплощении настоящего изобретения в ходе эксперимента по проверке того, будет ли уменьшенный уровень экспрессии SIRT1, AQP3, коллагена, фибронектина и эластина увеличиваться снова и будет ли увеличенный уровень экспрессии MMP1 и MMP2 уменьшаться снова после обработки кератиноцитов и фибробластов пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, было показано, что уровень экспрессии SIRT1, AQP3, коллагена, фибронектина и эластина возрастал после обработки пептидом по настоящему изобретению, что подтверждало восстановление уровней экспрессии SIRT1, AQP3, коллагена, фибронектина и эластина, которые снижались после УФ-облучения (см. фиг. 7 и фиг. 8А), и что уровни экспрессии MMP-1 и MMP-2 уменьшались в зависимости от обработки пептидом по настоящему изобретению, что подтверждало восстановление уровней экспрессии MMP-1 и MMP-2, которые повышались после УФ-облучения (см. фиг. 8В).

Таким образом, пептид по настоящему изобретению предотвращает повреждение кожи, ингибируя поступление загрязняющих веществ, таких как TCDD, PM и CSE, в клетки, и контролирует экспрессию генов, связанных с естественным старением клеток кожи или фотостарением, вызванным ультрафиолетовым излучением, и, тем самым, понятно, что пептид способен уменьшать количество морщин на коже, проявляя омолаживающую активность; таким образом, пептид по настоящему изобретению может быть эффективно использован в качестве активного ингредиента состава для профилактики повреждений кожи, вызванных загрязняющими веществами, для омолаживающей терапии и для уменьшения морщин на коже.

2. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболеваний, вызванных загрязняющими веществами, и для уменьшения старения кожи

В соответствии с другим аспектом одного или более воплощений настоящего изобретения, предлагается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболеваний, вызванных загрязняющими веществами, причем в качестве активного ингредиента фармацевтическая композиция включает пептид, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1.

В соответствии с другим аспектом одного или более воплощений настоящего изобретения, предлагается фармацевтическая композиция для уменьшения старения кожи, причем в качестве активного ингредиента фармацевтическая композиция включает пептид, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1.

Пептид, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, это тот же пептид, что описан в разделе «1. Пептид для профилактики повреждений кожи, вызванных загрязняющими веществами, или для омолаживающей терапии», и, таким образом, подробное описание пептида, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, может быть сделано по ссылке на раздел «1. Пептид для профилактики повреждений кожи, вызванных загрязняющими веществами, или для омолаживающей терапии». Далее будут описаны только уникальные характеристики фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболеваний, вызванных загрязняющими веществами, и для уменьшения старения кожи.

Поскольку пептид по настоящему изобретению эффективно позволяет ингибировать поступление загрязняющих веществ в клетки кожи и подавлять старение клеток кожи, включающая пептид в качестве активного ингредиента фармацевтическая композиция может использоваться для профилактики или лечения заболеваний, вызванных загрязняющими веществами, а также для уменьшения морщин и повышения эластичности кожи путем уменьшения старения клеток кожи.

Заболевания, вызванные загрязняющими веществами, означают заболевания, вызванные такими атмосферными загрязнениями, как диоксин, взвешенные частицы и сигаретный дым, и включают заболевания кожи, заболевания легких, заболевания нервной системы, заболевания репродуктивной системы и сердечно-сосудистые заболевания, которые могут включать рак, атопический дерматит, контактный дерматит, себорейный дерматит, акне, сухость кожи, псориаз, смерть, иммунотоксичность, повреждения периферической нервной системы, повреждения центральной нервной системы, нарушения в работе эндокринной системы, нарушения в развитии младенцев и детей дошкольного возраста, анемию, бронхит, эмфизему, снижение функции легких, астму, хронический бронхит, аритмию, острый коронарный синдром, стенокардию или инфаркт миокарда.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для профилактики возникновения заболевания, вызванного загрязняющими веществами, путем ингибирования поступления загрязняющих веществ в клетки, для уменьшения симптомов путем подавления дополнительного поступления загрязняющих веществ в клетки пациентов с заболеваниями, а также для лечения заболеваний путем ингибирования ухудшения состояния.

Старение кожи означает отрицательное изменение состояния кожи, которое может быть вызвано естественным старением или фотостарением клеток кожи. Старение кожи может быть физиологическим и (или) фотостарением, которое включает морщины, мимические морщинки, уменьшение эластичности и (или) натяжения кожи, помятость, утончение и уменьшение блеска и глянца кожи, может представлять собой внутреннюю деградацию кожи, при котором дерма после воздействия ультрафиолетового света становится тонкой, или может представлять собой внешнюю деградацию кожи, в частности, вызванную старением по причине разрушения коллагеновых волокон.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для уменьшения старения кожи, когда эластичность кожи можно восстановить до медицински приемлемого состояния кожи, такого как нормальный уровень, в сравнении с естественным старением кожи или старением, вызванным светом, поскольку фармацевтическая композиция по настоящему изобретению подавляет явление старения, которое может иметь место в клетках кожи.

Фармацевтическую композицию, содержащую пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, можно смешивать с использованием фармацевтически приемлемого носителя и (или) добавки хорошо известным в уровне техники способом с получением дозированной лекарственной формы с разовыми дозировками или с включением в многодозовый контейнер. Здесь препарат может представлять собой раствор в масляной или водной среде, суспензию, эмульгирующий раствор, экстракт, порошок, гранулы, таблетку, капсулу или гель (например, гидрогель) и может дополнительно включать диспергирующий или стабилизирующий агент.

Кроме того, пептид фармацевтической композиции может находится в фармацевтически приемлемых носителях, таких как коллоидные суспензии, порошки, физиологический раствор, липиды, липосомы, микросферы или сферические наночастицы. Эти пептиды могут образовывать или связываться с комплексом с носителем и могут переноситься in vivo с использованием систем носителей, известных в уровне техники, таких как липиды, липосомы, микрочастицы, золото, наночастицы, полимеры, конденсирующие реагенты, полисахариды, полиаминокислоты, дендримеры, сапонин, усиливающие адсорбцию вещества или жирные кислоты.

Дополнительно фармацевтически приемлемый носитель может включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, которое обычно используют в лекарственных формах, но воплощения не ограничиваются указанными соединениями. Дополнительно, фармацевтическая композиция может включать смазывающее вещество, увлажняющий агент, подсластитель, ароматизатор, эмульсификатор, агент для суспендирования и консервант, в дополнение к вышеуказанным ингредиентам.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению в ходе клинического применения можно вводить перорально или парентерально и он может быть включен в стандартный фармацевтический состав. Это означает, что при фактическом клиническом введении фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в составе различных пероральных и парентеральных лекарственных форм, но при смешивании можно использовать разбавители или вспомогательные вещества, такие как наполнители, разбавители, связывающие компоненты, увлажняющие агенты, разрыхлители или поверхностно активные вещества, которые обычно используются в составе лекарственных препаратов. Твердые лекарственные формы для орального введения могут включать таблетки, пилюли, порошки, гранулы и капсулы, и эти твердые лекарственные формы получают, смешивая растительный экстракт или растительный ферментированный продукт по меньшей мере с одним вспомогательным веществом, например, крахмалом, карбонатом кальция, сахарозой, лактозой или желатином. Кроме того, в дополнение к простым вспомогательным веществам можно использовать смазывающие вещества, такие как стеарат магния или тальк. Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут включать суспензии, растворы, эмульсии и сиропы, вышеупомянутые лекарственные формы могут содержать различные вспомогательные вещества, такие как увлажняющие агенты, подсластители, ароматизаторы и консерванты в дополнение к обычно используемым простым разбавителям, таким как вода и жидкий парафин. Лекарственные формы для парентерального введения могут включать стерилизованные водные растворы, водорастворимые вспомогательные вещества, суспензии, эмульсии, лиофилизированные формы и суппозитории. Водорастворимые вспомогательные вещества и суспензии могут включать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, и предназначенный для инъекций сложный эфир, такой как этилолат. Суппозитории могут включать витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лауриновое масло, глицерин и желатин.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в фармацевтически эффективной дозе. В настоящем изобретении термин «фармацевтически эффективная доза» означает достаточное количество для лечения заболевания с разумным соотношением пользы и риска, применимому для медицинского лечения, и эффективную дозу можно определить в соответствии с факторами, включая тип и тяжесть заболевания пациента, активность лекарства, чувствительность к лекарству, время введения, путь введения, скорость выведения, продолжительность лечения и одновременно используемые лекарства, а также другие факторы, хорошо известные в медицине. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить как отдельный терапевтический агент или в комбинации с другими терапевтическими агентами для лечения заболеваний, вызванных загрязняющими веществами, или для уменьшения старения кожи, и можно вводить одновременно, по отдельности или последовательно с обычными терапевтическими агентами, а также можно вводить однократно или многократно. Важно рассмотреть все факторы и вводить количество, достаточное для получения максимального эффекта при минимальных побочных эффектах или без них; такое количество легко может определить специалист в уровне техники.

В частности, эффективная доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению может зависеть от возраста, пола, состояния и массы тела пациента, от всасывания активного ингредиента in vivo, от скорости инактивации, скорости выведения, типа заболевания и совместно используемых лекарств и может повышаться или снижаться в соответствии с путем введения, степенью ожирения, полом, массой тела и возрастом. Например, пептид по настоящему изобретению можно вводить в количестве от около 0,0001 мкг до 500 мг, например, от около 0,01 мкг до 100 мг на кг массы тела пациента в день. Дополнительно, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить несколько раз в день, например, 2-3 раза в день через регулярные временные интервалы в соответствии с решением врача или фармацевта.

3. Косметическая композиция для профилактики повреждения кожи, вызванного загрязняющими веществами, или для уменьшения старения кожи

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается косметическая композиция для профилактики повреждения кожи, вызванного загрязняющими веществами, или для уменьшения старения кожи, причем фармацевтическая композиция включает пептид, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1. Пептид, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, это тот же пептид, что описан в разделе «1. Пептид для профилактики повреждений кожи, вызванных загрязняющими веществами, или для омолаживающей терапии», и, таким образом, подробное описание пептида, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, может быть сделано по ссылке на раздел «1. Пептид для профилактики повреждений кожи, вызванных загрязняющими веществами, или для омолаживающей терапии». Далее будут описаны только уникальные характеристики косметической композиции для лечения повреждений кожи, вызванных загрязняющими веществами, и для уменьшения старения кожи.

Поскольку пептид по настоящему изобретению эффективно позволяет ингибировать поступление загрязняющих веществ в клетки кожи и подавлять старение клеток кожи, включающая пептид в качестве активного ингредиента косметическая композиция может использоваться для профилактики повреждений кожи, вызванных загрязняющими веществами, а также для снижения морщин и повышения эластичности кожи путем уменьшения старения клеток кожи.

Пептид может входить в ее состав в количестве в диапазоне приблизительно от 0,001 до 30 %масс., например, приблизительно от 0,1 до 20 %масс., приблизительно от 0,1 до 10 %масс., приблизительно от 1 до 10 %масс. или приблизительно от 2 до 5 %масс., на основании общей массы 100 % масс. косметической композиции, однако воплощения не ограничены этими значениями.

Косметическая композиция по настоящему изобретению, включающая пептид в качестве активного ингредиента, может, например, включать дополнительные ингредиенты с характеристиками, усиливающими активность пептида в диапазоне, в котором он не проявляет активности по ингибированию поступления загрязняющих веществ в клетки и по уменьшению старения клеток кожи. Например, косметическая композиция может дополнительно включать адъюванты, такие как содержащие жиры вещества, органические растворители, солюбилизаторы, загустители, желеобразующие агенты, смягчители, антиоксиданты, средства для суспендирования, стабилизаторы, пенообразующие агенты, отдушку, поверхностно-активные вещества, воду, ионные эмульсификаторы, неионные эмульсификаторы, наполнители, связывающие агенты, хелаторы, консерванты, витамины, блокирующие агенты, увлажнители, ароматические масла, красители, пигменты, гидрофильные активные агенты, липофильные активные агенты, липидные везикулы или любые ингредиенты, обычно используемые в косметических или дерматологических составах, и эти компоненты могут содержаться в количестве, обычно используемом в дерматологии.

Из косметической композиции по настоящему изобретению можно приготовить любой препарат, обычно используемый в уровне техники, и примеры препаратов могут включать такие косметические продукты, как раствор, суспензию, эмульсию, гель, лосьон, эссенция, крем, порошок, мыло, шампунь, кондиционер, маску, содержащее поверхностно-активное вещество очищающее средство, очищающую воду, масла, жидкий тональный крем, крем-основа или спрей.

Если форма представляет собой раствор или эмульсию, растворитель, солюбилизатор или эмульсификатор можно использовать в качестве компонента носителя, и, например, можно использовать воду, эталон, изопропанол, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензил бензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутилгликолевое масло, алифатический эфир глицерина, полиэтиленгликоль или эфир жирной кислоты и сорбитана. Если форма представляет собой суспензию, в качестве носителя можно использовать жидкий разбавитель, такой как вода, этанол или пропиленгликоль, этоксилированный изостеариловый спирт, суспендирующий агент, такой как полиоксиэтилена сорбитоловый эфир и полиоксиэтилена сорбитановый эфир, метагидроксид алюминия, микрокристаллическую целлюлозу, бентонит, агар или тракант. Если форма представляет собой крем или гель, в качестве носителя можно использовать воск, парафин, тракант, животное масло, крахмал, производные целлюлозы, силикон, бентонит, полиэтиленгликоль, кремнезем, оксид цинка или тальк. Если форма представляет собой порошок или спрей, в качестве носителя можно включить пропеллент, такой как кремнезем, тальк, гидроксиды алюминия, лактоза, силикат кальция, хлорфторуглеводород, пропан/бутан или диметиловый эфир. Если форма представляет собой содержащее поверхностно-активное вещество очищающее средство, в качестве носителя можно использовать сульфат алифатического спирта, сульфат простого эфира алифатического спирта, моноэфир сульфоянтарной кислоты, производные имидазола, изетионат, метилтаурат, саркозинат, сульфат простого эфира амида жирной кислоты, алифатический спирт, алкиламидобетаин, глицерид жирной кислоты, диэтаноламид жирной кислоты, растительное масло, производное ланолина или эфир этоксилированного глицерина и жирной кислоты.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно на примерах.

Однако, эти примеры предназначены для подробной иллюстрации описанного, и настоящее изобретение не ограничивается ими.

[Пример приготовления] Приготовление пептида

Пептид с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, показанный в таблице 1 ниже, синтезировали с использованием автоматизированного пептидного синтезатора (Milligen 9050, доступен в компании Millipore, США), синтезированный пептид выделили и очистили методом обращенно-фазовой высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с С18 (оборудование доступно в компании Waters Associates, США). Для ВЭЖХ использовали колонку ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2,1 мм х 100 мм, 1,7 мм, доступна в компании Waters Co, США).

Таблица 1 SEQ ID NO: Последовательность пептида 1 SYSGVLFFLK

[Экспериментальный пример 1] Подтверждение уменьшения числа транслокаций AhR в ядро после обработки пептидом

Для того, чтобы определить влияния ингибирования поступления загрязняющих веществ в клетки, определили число транслокаций AhR в ядро после обработки клетки диоксином (далее называемый также "TCDD"), взвешенными частицами (далее называемые также "PM") и экстрактом из сигаретного дыма (далее называемый также "CSE"). Когда ксенобиотики попадают в клетку извне, AhR может связываться с ними, действовать как фактор транскрипции и перемещаться в ядро клетки, и, таким образом, степень проникновения загрязняющих веществ в клетку можно определить по числу транслокаций AhR в ядро. Число транслокаций AhR в ядро кератиноцитов человека (клетки HaCaT) определили после обработки клеток TCDD, PM и CSE, соответственно, и число транслокаций AhR в ядро альвеолярных эпителиальных клеток человека (A549 cells) определили после обработки клеток CSE. Каждый из TCDD, PM и CSE использовали после их смешивания с пептидом по настоящему изобретению и предварительного выдерживания смеси клеток в бессывороточной среде приблизительно в течение 1 часа.

Чтобы получить результаты для клеток, обработанных TCDD, сначала 74-й пассаж клеток HaCaT высеяли на 6-луночный планшет при плотности клеток 3×10⁵/лунку и культивировали около 16 часов, затем культуральный раствор заменили на бессывороточную среду и в полученную смесь добавили предварительно прореагировавшую смесь TCDD и пептида приблизительно на 1 час. Смесь включала TCDD в концентрации приблизительно 0,1 мкМ и пептид в концентрации приблизительно 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ, соответственно. Отрицательный контроль не обрабатывали пептидом, он реагировал только с TCDD, и положительный контроль взаимодействовал с CH223191 в концентрации около 10 мкМ и с TCDD. После того, как клетки взаимодействовали со смесью около 1 часа, выделили только нуклеопротеины, воспользовавшись набором, способным расщеплять клетки и разделять цитоплазму и нуклеопротеины (Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Kit, доступен в компании Thermo scientific, США), после чего выполнили вестерн-блоттинг AhR, использовав антитела к AhR (доступны в компании Santacruz biotechnology, США) и антитела к HDAC (доступны в компании Santacruz biotechnology, США). HDAC определяли, чтобы сравнить общее количество нуклеопротеинов, использованных в эксперименте.

Эксперименты для образцов, обработанных PM и CSE, выполнили таким же способом, что и для образцов, обработанных TCDD, при этом PM использовали в концентрации около 50 мкг/см², а CSE в концентрации около 2%, соответственно. CSE приготовили, заполнив колбу сниженного давления 50 мл PBS и подключив ее к вакуумному насосу с последующим сожжением 40 сигарет. Экспериментальная методика по действию на клетки A549 (альвеолярные эпителиальные клетки человека) CSE была аналогична описанным выше методикам, 48-пассаж клеток A549 высеяли на 6-луночный планшет с плотностью клеток около 5×10⁵/лунку и обработали CSE. После этого из полученных клеток выделили нуклеопротеины и затем провели вестерн-блоттинг.

В результате, как показано на фиг. 1А - 1D, когда клетки были обработаны пептидом, количество AhR в ядре снижалось с увеличением концентрации пептида, по сравнению с отрицательным контролем, обработанным только TCDD, PM или CSE и не обработанным пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, для которого количество AhR в нуклеопротеинах клеток было большим.

Можно сделать вывод, что поступление загрязняющих веществ, таких как TCDD, PM и CSE, в клетки HaCaT и A549 ингибируется пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и, тем самым, число транслокаций AhR в ядро также снижается.

[Экспериментальный пример 2] Подтверждение снижения уровней экспрессии CYP1A1 и COX-2 после обработки пептидом

Чтобы другим способом определить эффект ингибирования поступления загрязняющих веществ в клетки, последние обработали TCDD, PM и CSE и определили уровни экспрессии CYP1A1 и COX-2. Если активность AhR стимулируется загрязняющими веществами, такими как TCDD, AhR выступает в роли фактора транскрипции и повышает экспрессию CYP1A1 и COX-2, и, таким образом, степень поступления загрязняющих веществ в клетку и активацию AhR можно определить, измеряя уровни экспрессии генов CYP1A1 и COX-2. Каждый из TCDD, PM и CSE использовали после их смешивания с пептидом по настоящему изобретению и предварительного выдерживания смеси клеток на бессывороточной среде приблизительно в течение 1 часа.

Чтобы получить результаты для клеток, обработанных TCDD, сначала 78-й пассаж клеток HaCaT высеяли на 6-луночный планшет при плотности клеток 3×10⁵/лунку и культивировали около 16 часов, затем культуральный раствор заменили на бессывороточную среду и в полученную смесь добавили предварительно прореагировавшую смесь TCDD и пептида приблизительно на 2 часа. Смесь включала TCDD в концентрации приблизительно 0,1 мкМ и пептид в концентрации приблизительно 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ, соответственно. Отрицательный контроль не обрабатывали пептидом, он реагировал только с TCDD, и положительный контроль взаимодействовал с CH223191 в концентрации около 10 мкМ и с TCDD. После того, как клетки взаимодействовали со смесью около 2 часов, выделили РНК. После удаления культурального раствора планшет, на котором культивировали клетки, обработали TRIzol (доступен в компании Thermo Fisher Scientific, США), содержащий РНК образец извлекли с помощью скребка. Затем образец обработали хлороформом и центрифугировали, получив надосадочный раствор. Надосадочный раствор обработали изопропанолом, снова центрифугировали и убедились в наличии на дне осадка РНК. Осадок промывали 70% этанолом, после чего в достаточной степени сушили, выделив тем самым РНК. Выделенную РНК растворили в не содержащей РНК-аз воде (доступна в компании Corning, США). Выделенную РНК обратно транскрибировали в кДНК и провели ОТ-ПЦР (набор для полимеразиции кДНК и мастер-микс ПЦР доступны в компании Intron, Корея) с помощью праймеров CYP1A1 и COX-2 (таблица 2). Праймер GAPDH, последовательность которого показана в таблице 2, использовали для сравнения общего количества РНК в каждой из контрольных групп.

Эксперименты для образцов, обработанных PM и CSE, выполнили таким же способом, что и для образцов, обработанных TCDD, при этом PM использовали в концентрации около 50 мкг/см², а CSE в концентрации около 2%, соответственно. CSE приготовили, заполнив колбу сниженного давления 50 мл PBS и подключив ее к вакуумному насосу с последующим сожжением 40 сигарет.

Таблица 2 SEQ ID NO: Наименование последовательности Последовательность нуклеотидов 2 CYP1A1 прямая 5'- GGATCTTTCTCTGTACCCTGG -3' 3 CYP1A1 обратная 5'- AGCATGTCCTTCAGCCCAGA -3' 4 COX-2 прямая 5'- ATCATTCACCAGGCAAATTGC -3' 5 COX-2 обратная 5'- GGCTTCAGCATAAAGCGTTTG -3' 6 GAPDH прямая 5'- GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG -3' 7 GAPDH обратная 5'- CCGTTGAATTTGCCGTGAGTGGAGT -3'

В результате, как показано для ОТ-ПЦР на фиг. 2А - 2С, при обработке клеток пептидом, уровни экспрессии CYP1A1 и COX-2 снижались с увеличением концентрации пептида, по сравнению с отрицательным контролем, обработанным только TCDD, PM или CSE и не обработанным пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, для которого уровни экспрессии генов CYP1A1 и COX-2 были высокими.

Можно сделать вывод, что поступление загрязняющих веществ, таких как TCDD, PM и CSE, в клетки HaCaT ингибируется пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и, тем самым, уровни экспрессии CYP1A1 и COX-2 также снижаются.

[Экспериментальный пример 3] Подтверждение снижения количества белков MMP-1 и COX-2 после обработки пептидом

Клетки HaCaT обработали TCDD и PM, и измерили количество белков MMP-1 и COX-2 для подтверждения эффекта ингибирования поступления загрязняющих веществ в клетки другим способом. MMP-1 является коллагеназой. Если активность AhR стимулируется загрязняющими веществами, такими как TCDD, AhR выступает в роли фактора транскрипции и повышает экспрессию MMP-1 and COX-2, и, таким образом, степень поступления загрязняющих веществ в клетку и активацию AhR можно определить, измеряя уровни экспрессии генов MMP-1 и COX-2. Каждый из TCDD и PM использовали после их смешивания с пептидом по настоящему изобретению и предварительного выдерживания смеси клеток на бессывороточной среде приблизительно в течение 1 часа.

Чтобы получить результаты для клеток, обработанных TCDD, сначала 80-й пассаж клеток HaCaT высеяли на 6-луночный планшет при плотности клеток 3×10⁵/лунку и культивировали около 16 часов, затем культуральный раствор заменили на бессывороточную среду и в полученную смесь добавили предварительно прореагировавшую смесь TCDD и пептида приблизительно на 24 часа. Смесь включала TCDD в концентрации приблизительно 0,1 мкМ и пептид в концентрации приблизительно 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ, соответственно. Отрицательный контроль не обрабатывали пептидом, он реагировал только с TCDD, и положительный контроль взаимодействовал с CH223191 в концентрации около 10 мкМ и с TCDD. После того, как клетки взаимодействовали со смесью около 24 часов, получали клеточный лизат и проводили вестерн-блоттинг MMP-1 и COX-2, используя антитела к MMP-1 (доступны в компании Cell Signaling, США) и к COX-2 (доступны в компании Santacruz biotechnology, США).

Для сравнения общего количества белков в исследовании использовали β-актин (антитело к β-актину, доступное в компании Santacruz biotechnology, США).

Эксперименты для образцов, обработанных PM, выполнили таким же способом, что и для образцов, обработанных TCDD, при этом PM использовали в концентрации около 50 мкг/см².

В результате, как показано для вестерн-блоттинга на фиг. 3A и 3B, при обработке клеток пептидом количество MMP-1 и COX-2 снижалось с увеличением концентрации пептида, по сравнению с отрицательным контролем, обработанным только TCDD или PM и не обработанным пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, для которого количество белков MMP-1 и COX-2 было большим.

Можно сделать вывод, что поступление загрязняющих веществ, таких как TCDD и PM, в клетки HaCaT ингибируется пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и, тем самым, количество белков MMP-1 и COX-2 также снижается.

[Экспериментальный пример 4] Подтверждение эффекта адсорбции пептидом загрязняющих веществ

Профиль осаждения смеси пептида и загрязняющих веществ наблюдали невооруженным глазом, чтобы определить, что пептид по настоящему изобретению адсорбирует загрязняющие вещества.

Сначала для определения степени адсорбции взвешенных частиц 100 мкг/мл PM и по 200 мкМ и 200 мкМ пептида смешали и изучили профиль осаждения. CSE, приготовленный из дыма 40 сигарет, и 200 мкМ пептида также смешали и наблюдали невооруженным глазом.

В результате, как показано на фиг. 4А и 4В, когда клетки обрабатывали пептидом, степень постепенного осаждения возрастала с повышением концентрации пептида, по сравнению с клетками, обработанными только PM или CSE и не обработанным пептидом, включающим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, в этом случае PM и CSE оставались в смеси.

Можно сделать вывод, что пептид, включающий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, захватывает и адсорбирует молекулы загрязняющих веществ, таких как PM или CSE, и, таким образом, наблюдается эффект ингибирования поступления молекул загрязняющих веществ в кожу.

[Экспериментальный пример 5] Подтверждение стимуляции активности кератиноцитов путем обработки пептидом, ингибирующим естественное старение

Измерили количество белков и уровни экспрессии генов, участвующих в естественном старении, чтобы определить, может ли пептид по настоящему изобретению ингибировать естественно прогрессирующее старение клеток, на примере кератиноцитов.

<5-1> Подтверждение фосфорилирования сигнальных белков, связанных с пролиферацией

Так как Akt и ERK являются белками, вовлеченными в процесс передачи сигнала, связанный с пролиферацией клеток, и демонстрируют активность в своих фосфорилированных формах (p-Akt и p-ERK, соответственно), мы определили, может ли усиление фосфорилирования Akt и ERK подавлять клеточное старение, когда клетки обработаны пептидом по настоящему изобретению.

Сначала 81-й пассаж клеток HaCaT высеяли на 6-луночный планшет при плотности клеток 3×10⁵/лунку и культивировали около 24 часов, затем клетки обрабатывали пептидом по настоящему изобретению в концентрации приблизительно 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ, соответственно, около 15 минут. Положительный контроль обрабатывали факторами роста, 100 нМ bFGF и 100 нМ IGF, соответственно, а не пептидом. Реакция продолжалась около 15 минут, затем получили лизат клеток и выполнили вестерн-блоттинг p-Akt и p-ERK, используя антитела против p-Akt (доступные в компании Cell Signaling, США) и против p-ERK (доступные в компании Cell Signaling, США).

β-Актин (антитела к β-актину, доступны в компании Santacruz biotechnology, США) использовали для сравнения общего количества белка.

В результате, как показано для вестерн-блоттинга на фиг. 5А, обнаружили, что степень фосфорилирования Akt и ERK постепенно повышается с увеличением концентрации пептида, которым обрабатывали клетки.

Можно сделать вывод, что степень фосфорилирования Akt и ERK в клетках HaCaT возрастает под действием пептида, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, что характеризует стимуляцию роста клеток, и, таким образом, показано, что явление природного старения можно подавить, обрабатывая клетки пептидом.

<5-2> Подтверждение повышения экспрессии SIRT1 (омолаживающий ген)

Возможность подавления старения клеток их обработкой пептидами по настоящему изобретению определили, проверив, повышается ли уровень экспрессии гена SIRT1, который предотвращает старение клеток.

78-й пассаж клеток HaCaT высеяли на 6-луночный планшет при плотности клеток 3×10⁵/лунку и культивировали около 24 часов, затем клетки обрабатывали пептидом по настоящему изобретению в концентрации приблизительно 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ, соответственно, приблизительно 24 часа. Положительный контроль обрабатывали факторами роста, 100 нМ bFGF и 100 нМ IGF, соответственно, а не пептидом. После реакции в течение приблизительно 24 часов из клеток выделили РНК тем же способом, который описан в экспериментальном примере 2, и выделенную РНК обратно транскрибировали в кДНК, после чего провели ОТ-ПЦР (набор для полимеризации кДНК и мастер-микс ПЦР доступны в компании Intron, Корея) с помощью праймера SIRT1 (таблица 3). Праймер GAPDH, последовательность которого показана в таблице 2, использовали для сравнения общего количества РНК в каждой из контрольных групп.

1.

Таблица 3 SEQ ID NO: Наименование последовательности Последовательность нуклеотидов 8 SIRT1 прямая 5'- TCAGTGGCTGGAACAGTGAG -3' 9 SIRT1 обратная 5'- TCTGGCATGTCCCACTATCA -3'

В результате, как показано для ОТ-ПЦР на фиг. 5В, обнаружили, что уровень экспрессии гена SIRT1 увеличивался при увеличении концентрации пептида, которым обрабатывали клетки.

Можно сделать вывод, что уровень экспрессии омолаживающего гена SIRT1 в клетках HaCaT возрастает под действием пептида, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и таким способом можно подавить естественное старение клеток.

[Экспериментальный пример 6] Подтверждение стимуляции активности фибробластов путем обработки пептидом, ингибирующим естественное старение

Измерили количество белков и уровни экспрессии генов, участвующих в естественном старении, чтобы определить, может ли пептид по настоящему изобретению подавлять естественно прогрессирующее старение клеток, на примере фибробластов.

<6-1> Подтверждение фосфорилирования сигнальных белков, связанных с пролиферацией

Так как Akt и ERK являются белками, вовлеченными в процесс передачи сигнала, связанный с пролиферацией клеток, и демонстрируют активность в своих фосфорилированных формах (p-Akt и p-ERK, соответственно), мы определили, могут ли фосфорилированные Akt и ERK подавлять клеточное старение, когда клетки обработаны пептидом по настоящему изобретению.

Сначала 38-й пассаж клеток NIH3T3 (мышиные фибробласты) высеяли на 6-луночный планшет при плотности клеток 3×10⁵/лунку и культивировали около 24 часов, затем клетки обрабатывали пептидом по настоящему изобретению в концентрации приблизительно 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ, соответственно, около 15 минут. Положительный контроль обрабатывали факторами роста, 50 нМ bFGF и 25 нМ IGF, соответственно, а не пептидом. Реакция продолжалась около 15 минут, затем получили лизат клеток и выполнили вестерн-блоттинг p-Akt и p-ERK, используя антитела против p-Akt (доступные в компании Cell Signaling, США) и против p-ERK (доступные в компании Cell Signaling, США). β-Актин (антитела к β-актину, доступны в компании Santacruz biotechnology, США) использовали для сравнения общего количества белка.

В результате, как показано для вестерн-блоттинга на фиг. 6А, обнаружили, что степень фосфорилирования Akt и ERK постепенно повышается с увеличением концентрации пептида, которым обрабатывали клетки

Можно сделать вывод, что степень фосфорилирования Akt и ERK в клетках NIH3T3 возрастает под действием пептида, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, что характеризует стимуляцию роста клеток, и, таким образом, показано, что явление природного старения можно подавить, обрабатывая клетки пептидом.

<6-2> Подтверждение повышения экспрессии компонентов кожи (коллаген, фибронектин и эластин)

Возможность подавления старения клеток их обработкой пептидами по настоящему изобретению определили, проверив, повышается ли уровень экспрессии генов коллагена, фибронектина и эластина, связанных с образованием волокон, где коллаген, фибронектин и эластин являются компонентами, составляющими дерму. Геном, кодирующим коллаген I, является COL1A1.

26-й пассаж клеток NIH3T3 высеяли на 6-луночный планшет при плотности клеток 3×10⁵/лунку и культивировали около 24 часов в бессывороточной среде, затем клетки обрабатывали пептидом по настоящему изобретению в концентрации приблизительно 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ, соответственно, приблизительно 24 часа. Положительный контроль обрабатывали факторами роста, 100 нМ bFGF и 5 нМ IGF^β1, соответственно, а не пептидом. После реакции в течение приблизительно 24 часов из клеток выделили РНК тем же способом, который описан в экспериментальном примере 2, и выделенную РНК обратно транскрибировали в кДНК, после чего провели ОТ-ПЦР (набор для полимеризации кДНК и мастер-микс ПЦР доступны в компании Intron, Корея) с помощью праймеров Col1a1, фибронектина и эластина (таблица 4). Праймер GAPDH, последовательность которого показана в таблице 2, использовали для сравнения общего количества РНК в каждой из контрольных групп.

Таблица 4 SEQ ID NO: Наименование последовательности Последовательность нуклеотидов 16 AQP3 прямая 5'- CCTTCTTGGGTGCTGGAATA -3' 17 AQP3 обратная 5'- ACACGATAAGGGAGGCTCTG -3'

В результате, как показано для ОТ-ПЦР на фиг. 7, обнаружили, что уровень экспрессии генов SIRT1 и AQP3, ингибированных UVB-облучением, постепенно увеличивался при увеличении концентрации пептида, которым обрабатывали клетки.

Можно сделать вывод, что уровень экспрессии омолаживающего гена SIRT1 и гена барьерного компонента кожи AQP3, которые снижались в клетках HaCaT, могут возрастать и восстанавливаться под действием пептида, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и таким способом можно подавить фотостарение клеток.

[Экспериментальный пример 8] Подтверждение восстановления активности фибробластов, подавленного вызывающим фотостарение УФ-светом

<8-1> Подтверждение восстановления экспрессии компонентов дермы (коллаген, фибронектин и эластин)

При облучении УФ-светом ингибируется экспрессия генов коллагена, фибронектина и эластина, входящих в состав дермы, и, таким образом, возможность подавления фотостарения клеток проверяли, определяя, восстанавливаются и повышаются ли уровень экспрессии коллагена, фибронектина и эластина после обработки клеток пептидом по настоящему изобретению.

Сначала 34-й пассаж клеток NIH3T3 высеяли на 6-луночный планшет при плотности клеток 5×10⁵/лунку и культивировали около 16 часов в бессывороточной среде, затем клетки обрабатывали пептидом по настоящему изобретению в концентрации приблизительно 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ, соответственно, около 1 часа. Полученный осадок промыли PBS, заполнили PBS и предварительно еще раз облучали UVA интенсивностью 6 Дж/см² в течение 1 часа. Затем клетки обрабатывали пептидом по настоящему изобретению в указанных концентрациях около 6 часов. Положительный контроль обрабатывали 2,5 мМ NaC и 50 мкМ кверцетина, соответственно, а не пептидом. После реакции клеток с пептидом в течение приблизительно 6 часов из клеток выделили РНК тем же способом, который описан в экспериментальном примере 2, и выделенную РНК обратно транскрибировали в кДНК, после чего провели ОТ-ПЦР (набор для полимеризации кДНК и мастер-микс ПЦР доступны в компании Intron, Корея) с помощью праймеров Col1a1, фибронектина и эластина (таблица 4). Праймер GAPDH, последовательность которого показана в таблице 2, использовали для сравнения общего количества РНК в каждой из контрольных групп.

В результате, как показано для ОТ-ПЦР на фиг. 8А, обнаружили, что уровень экспрессии гена коллагена (Col1a1), фибронектина и эластина постепенно увеличивался при увеличении концентрации пептида, которым обрабатывали клетки.

Можно сделать вывод, что уровни экспрессии гена коллагена (Col1a1), фибронектина и эластина, которые снижаются после облучения UVA, в клетках NIH3T3 могут увеличиваться и восстанавливаться под действием пептида, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и таким способом, в результате подавления фотостарения клеток под действием белков, экспрессируемых указанными выше генами, может наблюдаться эффект снижения числа морщин на коже.

<8-2> Подтверждение ингибирования экспрессии MMP-1 и MMP-2

Поскольку экспрессия генов, кодирующих белки MMP-1 and MMP-2, связана с деградацией коллагена под действием УФ облучения, проверили, можно ли подавить старение клеток при подавлении синтеза белков MMP-1 and MMP-2 в результате обработки клеток пептидом по настоящему изобретению.

Сначала 31-й пассаж клеток NIH3T3 высеяли на 6-луночный планшет при плотности клеток 5×10⁵/лунку и культивировали около 16 часов в бессывороточной среде, затем клетки обрабатывали пептидом по настоящему изобретению в концентрации приблизительно 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ, соответственно, около 1 часа. Полученный осадок промыли PBS, заполнили PBS и предварительно еще раз облучали UVA интенсивностью 6 Дж/см² в течение 1 часа. Затем клетки обрабатывали пептидом по настоящему изобретению в указанных концентрациях около 48 часов. Положительный контроль обрабатывали 2,5 мМ NaC и 50 мкМ кверцетина, соответственно, а не пептидом. После реакции клеток со смесью в течение приблизительно 48 часов получили лизат клеток и выполнили вестерн-блоттинг MMP-1, используя антитела против MMP-1 (доступные в компании Cell Signaling, США). β-Актин (антитела к β-актину, доступны в компании Santacruz biotechnology, США) использовали для сравнения общего количества белка.

Кроме того, для анализа количества MMP-2 приготовили лизат из полученных клеток и для него провели зимографию с желатином. С использованием желатина (2 мг/мл) в качестве субстрата выполнили белковый электрофорез (SDS-PAGE). После него гель погрузили в 2,5% Тритон Х-100 на 30 минут и затем инкубировали в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl, 0,2 M NaCl и 5 мМ CaCl₂, а также 1% Тритон Х-100 при температуре 37°C в течение 24 часов. После инкубации гель окрасили красителем Coomassie Brilliant Blue R250 (доступен в компании Sigma), затем обработали обесцвечивающим буфером, содержащим 5% этанол, 7,5 уксусную кислоту и дистиллированную воду. После этого наблюдали пустые полосы гелевой фазы, образованные в ходе гидролиза желатина, что подтверждает активность MMP-2.

В результате, как показано для вестерн-блоттинга и зимографии на фиг. 8В, обнаружили, что количество белка MMP-1 and MMP-2 постепенно снижается с увеличением концентрации пептида, которым обрабатывали клетки.

Можно сделать вывод, что количество белка MMP-1 and MMP-2, увеличивавшееся под действием облучения UVA в клетках NIH3T3, может снизиться и восстановиться под действием пептида, включающего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, а количество коллагена может опять возрасти, что приводит к снижению числа морщин на коже по мере уменьшения фотостарения.

Как описано выше, хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на одно или более описанное здесь воплощение, специалисту в уровне техники очевидно, что области технической концепции настоящего изобретения возможны различные изменения и модификации, а также очевидно, что такие изменения и модификации соответствуют духу и области, описанным в следующей формуле изобретения.

--->

<110> CAREGEN CO., LTD.

<120> Peptides for protecting skin damage by pollutants and

anti-aging and use thereof

<130> 2018DPA3173

<160> 17

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Peptide 1

<400> 1

Ser Tyr Ser Gly Val Leu Phe Phe Leu Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CYP1A1 forward primer sequence

<400> 2

ggatctttct ctgtaccctg g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CYP1A1 reverse primer sequence

<400> 3

agcatgtcct tcagcccaga 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COX-2 forward primer sequence

<400> 4

atcattcacc aggcaaattg c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COX-2 reverse primer sequence

<400> 5

ggcttcagca taaagcgttt g 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH forward primer sequence

<400> 6

ggtgtgaacg gatttggccg tattg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH reverse primer sequence

<400> 7

ccgttgaatt tgccgtgagt ggagt 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SIRT1 forward primer sequence

<400> 8

tcagtggctg gaacagtgag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SIRT1 reverse primer sequence

<400> 9

tctggcatgt cccactatca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Col1a1 forward primer sequence

<400> 10

caccctcaag agcctgagtc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Col1a1 reverse primer sequence

<400> 11

agacggctga gtagggaaca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Fibronectin forward primer sequence

<400> 12

ccaggaaccg agtacaccat 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Fibronectin reverse primer sequence

<400> 13

atacccaggt tgggtgatga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Elastin forward primer sequence

<400> 14

ggacccctga ctcgcgacct 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Elastin reverse primer sequence

<400> 15

ggggaggtgg gactgcccaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AQP3 forward primer sequence

<400> 16

ccttcttggg tgctggaata 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AQP3 reverse primer sequence

<400> 17

acacgataag ggaggctctg 20

<---

Изобретение относится к новому пептиду SYSGVLFFLK (SEQ ID NO: 1), характеризующемуся способностью предотвращать повреждение кожи, вызванное загрязняющими веществами, омолаживающей активностью в отношении кожи и способностью снижать образование морщин; а также к применению пептида, которое связано с профилактикой или лечением заболеваний кожи, вызванных загрязняющими веществами, или к улучшению омолаживающей терапии кожи. В частности, новый пептид по настоящему изобретению ингибирует поступление в клетки кожи загрязняющих веществ, таких как диоксин, взвешенные частицы и сигаретный дым, и регулирует экспрессию связанных со старением кожи генов, и, тем самым, может эффективно использоваться в качестве активного ингредиента в составе фармацевтической композиции или в качестве активного ингредиента в составе косметической композиции. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 8 пр.

1. Пептид для профилактики повреждения кожи, вызванного загрязняющими веществами, причем пептид состоит из последовательности аминокислот SEQ ID No: 1.

2. Пептид по п. 1, причем пептид характеризуется способностью ингибировать поступление загрязняющих веществ в кожу.

3. Пептид по п. 1, причем пептид адсорбирует загрязняющие вещества.

4. Пептид по любому из пп. 1–3, причем загрязняющие вещества выбраны из группы, состоящей из диоксина, взвешенных частиц и экстракта из сигаретного дыма.

5. Пептид для омоложения кожи, причем пептид состоит из последовательности аминокислот SEQ ID No: 1.

6. Пептид по п. 5, причем омоложение кожи представляет собой уменьшение морщин на коже или улучшение эластичности кожи.

7. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболеваний, вызванных загрязняющими веществами, причем фармацевтическая композиция содержит пептид по п. 1 в качестве активного ингредиента.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, причем заболевания, вызванные загрязняющими веществами, представляют собой по меньшей мере те, которые выбраны из группы, состоящей из рака, атопического дерматита, контактного дерматита, себорейного дерматита, акне, сухости кожи, псориаза, смерти, иммунотоксичности, повреждений периферической нервной системы, повреждений центральной нервной системы, нарушений в работе эндокринной системы, нарушений в работе репродуктивной системы, нарушения в развитии младенцев и детей дошкольного возраста, анемии, бронхита, эмфиземы, снижения функции легких, астмы, хронического бронхита, аритмии, острого коронарного синдрома, стенокардии или инфаркта миокарда.

9. Композиция для улучшения омоложения кожи, причем композиция содержит пептид по п. 5 в качестве активного ингредиента.

10. Композиция по п. 9, причем улучшение омоложения кожи представляет собой уменьшение морщин.

11. Косметическая композиция для профилактики повреждения кожи, вызванного загрязняющими веществами или для улучшения омоложения кожи, причем косметическая композиция содержит пептид по любому из пп. 1 или 5 в качестве активного ингредиента.

12. Косметическая композиция по п. 11, причем косметическая композиция представлена по меньшей мере одним составом, выбранным из группы, состоящей из раствора, суспензии, эмульсии, геля, лосьона, эссенции, крема, порошка, мыла, шампуня, кондиционера, маски, содержащего поверхностно-активное вещество очищающего средства, очищающей пены, очищающей воды, масла, жидкого тонального крема, крем-основы или спрея.