ТИРОЗИНОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ИММУНОСУПРЕССИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В КЛЕТКАХ-ПРЕДШЕСТВЕННИКАХ НЕОНАТАЛЬНЫХ КЕРАТИНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2023 года по МПК A61K38/08 A61P29/00 

Перекрестная ссылка на родственную заявку

[1] Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет на основании заявки на патент США 62/794582, поданной 19 января 2019 года, содержание которой включено посредством ссылки наряду с другими источниками, цитируемыми в настоящей заявке.

Перечень последовательностей

[2] В настоящую заявку включен посредством ссылки перечень последовательностей под названием «20200120_ELIXP005_ST25.TXT» (3 килобайта), созданный 20 января 2020 года и поданный в электронном виде с настоящей заявкой.

Уровень техники

[3] Настоящее изобретение относится к области новых биологических агентов.

Краткое описание изобретения

[4] Варианты реализации относятся к тирозиновым ингибиторам, которые проявляют иммуносупрессивную активность в клетках-предшественниках неонатальных кератиноцитов человека. Конкретные варианты реализации относятся к иммуносупрессивному действию декапептида и/или оксиресвератрола, измеренному двумя разными способами: блокада стимулированного роста клеток и ингибирование цитотоксического уничтожения.

[5] Некоторые варианты реализации включают способ лечения субъекта, который позволяет осуществлять иммуносупрессию клетки, при этом указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество одного или более пептидов, оксиресвератрола или того и другого, причем указанные один или более пептидов содержат SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ. ID NO: 12. Указанная клетка может представлять собой клетку млекопитающего. Указанная клетка может представлять собой клетку кожи. Введение может включать пероральное введение. В настоящем патенте описаны различные варианты реализации.

[6] В одном из вариантов реализации предложен способ лечения субъекта путем осуществления иммуносупрессии клетки, при этом указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество одного или более пептидов, причем указанные один или более пептидов содержат SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ. ID NO: 12.

[7] В различных вариантах реализации указанный пептид состоит из SEQ ID NO: 9. Клетка представляет собой клетку млекопитающего. Указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку кожи. Указанная клетка кожи млекопитающего является клеткой-предшественником. Указанная клетка-предшественник представляет собой предшественник эпидермального кератиноцита, меланобласт, фибробласт, гистиобласт или дендробласт. Введение осуществляют перорально. Клетка является окончательно дифференцированной. Клетка представляет собой кератиноцит, меланоцит, фиброцит, гистиоцит или дендроцит. Пептид присутствует в концентрации примерно 1 миллимоль или меньше. Композиция дополнительно содержит оксиресвератрол.

[8] В одном из вариантов реализации предложен способ лечения субъекта путем осуществления иммуносупрессии клетки, при этом указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество оксиресвератрола.

[9] В различных вариантах реализации оксиресвератрол присутствует в концентрации от примерно 0,1 миллимоль до примерно 1,0 миллимоль. Композиция дополнительно содержит эффективное количество одного или более пептидов, при этом указанные один или более пептидов содержат SEQ ID NO: 9. Клетка представляет собой клетку млекопитающего. Указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку кожи. Указанная клетка кожи млекопитающего является клеткой-предшественником. Указанная клетка-предшественник представляет собой клетку-предшественник эпидермального кератиноцита, меланобласт, фибробласт, гистиобласт или дендробласт. Введение осуществляют перорально. Клетка представляет собой окончательно дифференцированный кератиноцит, меланоцит, фиброцит, гистиоцит или дендроцит.

[10] Другие задачи, признаки и преимущества настоящего изобретения будут понятны при прочтении нижеследующего подробного описания и прилагаемых чертежей, на которых одинаковые условные обозначения представляют одинаковые признаки на всех фигурах.

Краткое описание чертежей

[11] На Фиг. 1А показана дозозависимая повышающая регуляция транскрипции SIRT1 (а). Данные выражены в виде кратного увеличения относительно гена внутреннего контроля 18S и представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (SEM) для 3 независимых экспериментов.

[12] На Фиг. 1В показана дозозависимая повышающая регуляция транскрипции SIRT3, (b). Данные выражены в виде кратного увеличения относительно гена внутреннего контроля 18S и представляют собой средние значения ± SEM для 3 независимых экспериментов.

[13] На Фиг. 1С показана дозозависимая повышающая регуляция транскрипции SIRT6 (c). Данные выражены в виде кратного увеличения относительно гена внутреннего контроля 18S и представляют собой средние значения ± SEM для 3 независимых экспериментов.

[14] На Фиг. 1D показана дозозависимая повышающая регуляция транскрипции SIRT7 (d). Данные выражены в виде кратного увеличения относительно гена внутреннего контроля 18S и представляют собой средние значения ± SEM для 3 независимых экспериментов.

[15] На Фиг. 2А показано цитотоксическое действие декапептида-12 и оксиресвератрола на эпидермальные кератиноциты. Данные выражены в виде процента относительно контроля и представляют собой средние значения ± SEM для 3 отдельных экспериментов. *P<0,05.

[16] На Фиг. 2В показано влияние декапептида-12 и оксиресвератрола на пролиферацию эпидермальных кератиноцитов. Данные выражены в виде процента относительно контроля и представляют собой средние значения ± SEM для 3 отдельных экспериментов. *P<0,05.

[17] На Фиг. 3 представлена химическая структура декапептида P4 с SEQ ID NO: 9.

[18] На Фиг. 4 представлена химическая структура оксиресвератрола.

[19] Фиг. 5 представляет собой график иммуносупрессивного действия декапептида P4 с SEQ ID NO: 9.

[20] Фиг. 6 представляет собой график иммуносупрессивного действия оксиресвератрола.

[21] Фиг. 7 представляет собой график иммуносупрессивного действия декапептида P4 с SEQ ID NO: 9.

[22] Фиг. 8 представляет собой график иммуносупрессивного действия оксиресвератрола.

Подробное описание изобретения

[23] На коже проявляются последствия хронологического старения и фотостарения, что постоянно напоминает нам о процессе старения и заставляет искать средства, чтобы замедлить или обратить вспять его воздействие. Старение кожи традиционно подразделяется на внешнее и внутреннее. Данные, полученные за последнее время, указывают на то, что оба типа имеют общие важные молекулярные признаки, включая измененные пути передачи сигнала, которые способствуют экспрессии матриксной металлопротеиназы, снижению синтеза проколлагена и повреждению соединительной ткани.

[24] В коже человека старение связано с увеличением количества стареющих клеток и снижением способности к пролиферации и дифференцировке клеток. Значительные данные подтверждают теорию о том, что старение является, главным образом, следствием свободнорадикального повреждения различными эндогенными активными формами кислорода (АФК). Velarde et al. сообщили о подтверждении in vivo причинно-следственной связи между окислительным повреждением митохондрий, клеточным старением и фенотипами старения в коже. Кроме того, ультрафиолетовое (УФ) излучение стимулирует синтез АФК, который вовлечен в мутагенез и фотостарение. В соответствии с этими сведениями, данные позволяют предположить изменение экспрессии активности сиртуина в коже, облученной ультрафиолетом, по сравнению с кожей, защищенной от солнца, и то, что эти различия могут быть ответственны за определенные аспекты старения кожи.

[25] Клеточное старение описывает процесс, при котором клетки перестают делиться и претерпевают характерные изменения фенотипа, включая глубокие изменения хроматина и секретома, а также активацию супрессора опухоли. Многочисленные сообщаемые данные помогли утвердить концепцию сиртуинов как эффективных антивозрастных белков, подробно описав их плейотропную роль в замедлении клеточного старения и преждевременного старения. Сиртуины являются ключевыми эффекторами в таких путях, как устранение повреждений ДНК, укорочение теломер, клеточный ответ на окислительный стресс и облегчение патологий, индуцированных АФК.

[26] У млекопитающих существует семь генов сиртуина (SIRT1-7), локализованных в разных компартментах клетки и способных к различным действиям. Биохимически сиртуины представляют собой класс белков, которые обладают, главным образом, активностью НАД⁺-зависимой лизиндеацетилазы. Сиртуины широко признаны в качестве имеющих критическое значение регуляторов множества метаболических путей, сенсоров энергии и окислительно-восстановительного статуса в клетках, и модуляторов окислительного стресса.

[27] Эти данные вызвали интерес к разработке низкомолекулярных активаторов или лекарственных средств, помогающих замедлить прогрессирование старения и широкий спектр нарушений, связанных с возрастом. Из семи сиртуинов млекопитающих SIRT1 наиболее исследован в отношении старения и продолжительности жизни. Например, антивозрастное действие ресвератрола, главным образом, связано с активацией SIRT1. Действительно, Ido et al. сообщили, что ресвератрол через повышение активности AMP-активированной протеинкиназы и сиртуинов ослаблял клеточное старение и пролиферативную дисфункцию.

[28] Ранее авторы настоящего изобретения сообщали о высокой эффективности декапептида-12 в коже человека в отношении гипопигментации. Дальнейшие клинические исследования показали общее улучшение внешнего вида кожи лица у пациентов с дисхромией, которых дважды в день лечили кремом для топического применения, содержащим 0,01 процента декапептида-12, в течение 8 недель. Эти данные позволили авторам настоящего изобретения высказать гипотезу о том, что декапептид-12 может модулировать активность сиртуина и улучшать общий внешний вид кожи. Чтобы прояснить эту возможность авторы настоящего изобретения оценивали влияние декапептида-12 на транскрипцию сиртуина в эпидермальных клетках-предшественниках человека.

[29] В приведенных сведениях подробно описана плейотропная роль сиртуинов в подавлении преждевременного старения, замедлении клеточного старения, увеличении продолжительности жизни и облегчении широкого спектра нарушений, связанных со старением. В настоящем описании авторы настоящего изобретения сообщают о полученных ими результатах по эффективному активатору сиртуина, декапептиду-12, и сравнивают его эффективность с хорошо описанным в документах оксиресвератролом. Обработка клеток-предшественников эпидермальных кератиноцитов человека 100-микромолярным декапептидом-12 увеличивала транскрипцию SIRT1 на 141±11 процентов по сравнению с контрольными клетками, тогда как уровни SIRT3, SIRT6 и SIRT7 повышались на 121±13 процентов, 147±8 процентов и 95±14 процентов соответственно. Декапептид-12 повышающе регулировал транскрипцию сиртуина до уровней, схожих с оксиресвератролом, но со сниженной цитотоксичностью.

[30] Материалы и методы

[31] Реагенты

[32] Декапептид-12 (YRSRKYSSWY), SEQ ID NO: 9, был синтезирован Bio Basic, Inc. (Онтарио, Канада) с применением твердофазной химии FMOC. Оксиресвератрол приобретали у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).

[33] Культивирование клеток

[34] Неонатальные эпидермальные клетки-предшественники человека (Thermo Fisher Scientific, Нью-Йорк) высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 2×10⁵ клеток на лунку. В каждую лунку вводили 2 миллилитра среды Epilife, содержащей 60 микромоль хлорида кальция (Thermo Fisher Scientific, Нью-Йорк). Планшеты инкубировали в увлажненной камере при 37 градусах Цельсия и 5-процентном CO₂. Через двадцать четыре часа клетки обрабатывали различными концентрациями оксиресвератрола или декапептида-12, растворенного в ФБР, содержащем 5-процентный ДМСО. В контрольные лунки вводили только носитель (5-процентный ДМСО и ФБР). Конечная концентрация ДМСО в каждой лунке составляла 0,05 процента.

[35] Экстракция тотальной РНК, количественный анализ и синтез кДНК

[36] После 72-часового периода инкубации клетки трипсинизировали и экстрагировали тотальную РНК с использованием набора RNeasy kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния) в соответствии с протоколом производителя.

[37] Концентрацию РНК определяли с помощью nanodrop (Thermo fisher Scientific, Нью-Йорк). Два мкг тотальной РНК использовали для синтеза кДНК с использованием праймеров oligo dT и реагентов для обратной транскрипции TaqMan (Thermo fisher Scientific, Нью-Йорк). Реакцию проводили в термоциклере DNA Engine Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния). Температура отжига составляла 25 градусов Цельсия в течение 10 минут с последующим синтезом первой цепи при 48 градусах Цельсия в течение 1 часа и тепловой инактивацией при 95 градусах Цельсия в течение 5 минут.

[38] Полуколичественный анализ

[39] Получали праймеры SIRT1-7 (таблица A) с использованием Primer3. Реакции полуколичественной ПЦР проводили в термоциклере DNA Engine Peltier Thermo Cycler (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния). ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация при 94 градусах Цельсия в течение 2 минут и удлинение праймера при 54 градусах Цельсия в течение 30 секунд в 34 циклах для SIRT 1-7 и гена «домашнего хозяйства» 18S.

[40] Таблица A: последовательности праймеров для SIRT1-7 и 18S

Ген Последовательность праймера (5'-3') SIRT1 SEQ ID NO: 1 Прямой (П) GCCAATCATAAGATGTTGCTGAAC
Обратный (О) TAGAGCCTCACATGCAAGCTCTA SIRT2 SEQ ID NO: 2 П AACCTCCCTCATCTCTAACT
О GTCTCCAATAAGCAATGTCT SIRT3 SEQ ID NO: 3 П GTTGGTTACAAGATCCAGAC
О AGATAGAAAGTGCTGGAATG SIRT4 SEQ ID NO: 4 П AGAGCTGTGAGAGAATGAAG
О TTTCTGACCTGTAGTCTGGT SIRT5 SEQ ID NO: 5 П TCTTCCATACACTTTACTACCTT
О TTTATATGATAGTGTCTTGTTGC SIRT6 SEQ ID NO: 6 П CAGCTTAAACAGGAGTGAAC
О TTATTGCATTGAGGACTTTT SIRT7 SEQ ID NO: 7 П GACATTTTTAGCCATTTGTC
О CATCCAGTACAGAGAGGATT 18S
SEQ ID NO: 8 П CGGAGGTTCGAAGACGATCAGATA
О TTGGTTTCCCGGAAGCTGCC

[41] Образцы анализировали и разделяли на 1,5-процентном агарозном геле, содержащем 0,5 микрограмма на миллилитр бромида этидия, и визуализировали с использованием системы визуализации FluorChem HD2 Imaging System (Protein simple, Сан-Хосе, Калифорния). Выполняли денситометрический анализ с использованием программного обеспечения AlphaEase FC (Protein simple, Сан-Хосе, Калифорния). Соотношения интенсивности рассчитывали в виде значения интенсивности для каждого гена, деленного на значение интенсивности гена внутреннего контроля 18S.

[42] Анализы жизнеспособности/пролиферации и цитотоксичности

[43] Скорости пролиферации определяли с использованием набора TACS® MTT Cell Proliferation Kit (R&D systems, Миннеаполис, Миннесота). Клетки высевали по 2,5×10⁴ на лунку в 96-луночные планшеты в увлажненной атмосфере с 5-процентным CO₂ при 37 градусах Цельсия. Через двадцать четыре часа в соответствующие лунки добавляли декапептид-12 или оксиресвератрол в различных концентрациях (0, 3, 10, 30, 100, 300 и 1000 микромоль), и затем культуры инкубировали в течение 72 часов. Оставшуюся часть методики выполняли в соответствии с протоколом производителя.

[44] Измеряли клеточную токсичность с использованием анализа с исключением красителя трипанового синего. Клетки культивировали в 6-луночных планшетах с плотностью 4×10⁵ клеток на лунку. В каждую лунку вводили разную концентрацию декапептида-12 или оксиресвератрола (0, 3, 10, 30, 100, 300 и 1000 микромоль). Планшеты инкубировали при 37 градусах Цельсия в увлажненной камере с 5-процентным CO₂. Через 72 часа отбирали аликвоту и подсчитывали клетки с использованием гемоцитометра. Измеряли цитотоксичность в соответствии со следующей формулой: [1 - (# клеток в контроле - # живых клеток в тестируемом образце) / # клеток в контроле] × 100 процентов.

[45] Статистический анализ

[46] Рассчитывали средние значения и их стандартные ошибки из 3 независимых анализов с использованием Microsoft Excel, и определяли статистическую значимость с использованием парного дисперсионного анализа. P-значения считали статистически значимыми при P<0,05.

[47] Результаты

[48] Влияние декапептида на скорости пролиферации и цитотоксичность:

[49] Сначала авторы настоящего изобретения оценивали цитотоксическое действие декапептида-12 и оксиресвератрола на эпидермальные клетки-предшественники человека. На Фиг. 2А показано, что обработка 100-микромолярным декапептидом-12 или оксиресвератролом вызывала гибель 3±1 процент или 6±1 процент клеток соответственно. В концентрации 1 миллимоль декапептид-12 или оксиресвератрол вызывали гибель 7±2 процента или 16±2 процента клеток соответственно.

[50] Авторы настоящего изобретения также оценивали влияние декапептида-12 и оксиресвератрола на жизнеспособность и пролиферацию эпидермальных клеток-предшественников человека. На Фиг. 2В показано, что обработка 300-микромолярным декапептидом-12 или оксиресвератролом приводила к уменьшению пролиферации клеток на 2±1 процент или 5±1 процент соответственно. Однако в отличие от 1-миллимолярного декапептида-12, который уменьшал пролиферацию на 3±2 процента, 3-дневная инкубация с оксиресвератролом приводила к уменьшению пролиферацию на 12±2 процента.

[51] Декапептид-12 повышающе регулировал транскрипцию SIRT1-7:

[52] Затем авторы настоящего изобретения оценивали влияние оксиресвератрола и декапептида-12 на экспрессию сиртуина в эпидермальных клетках-предшественниках человека. На Фиг. 1A-1D и в таблице B показана транскрипция SIRT1-7, модулируемая декапептидом-12 и оксиресвератролом, в зависимости от дозы. В случае 30-микромолярного оксиресвератрола уровни транскрипции SIRT1 повышались на 125±9 процентов по сравнению с контрольными клетками, тогда как уровни SIRT3, SIRT6 и SIRT7 повышались на 133±5 процентов, 73±8 процентов и 95±7 процентов соответственно.

[53] Таблица B и Таблица C. Профиль экспрессии генов SIRT 1-7 в ответ на обработку декапептидом-12 (таблица B) и оксиресвератролом (таблица C). Результаты представляют собой усредненные значения для трех независимых анализов.

[54] Таблица B

Дека [мкМ] SIRT1 SIRT2 SIRT3 SIRT4 SIRT5 SIRT6 SIRT7 3 3±1% 1±1% 4±1% 3±1% 3±1% 3±1% 5±1% 10 12,2±3,1% 4,1±3% 9,2±2,8% 8,1±4% 5,2±3% 21,3±8,1% 15±4,2% 30 34±6,7% 11,2±3,7% 32,2±6,1% 12,1±7% 21±6,7% 52±5,1% 34,4±9,2% 50 79,2±12% 21,5±4,9% 65±12,1% 41,2±13,1% 33,1±6,1% 95,4±13,4% 61,3±10,2% 100 141,2±11% 35,4±5,5% 121±13,2% 71,4±14,1% 46±7,3% 147±8,4% 95,4±14,2% 300 188±12% 61,1±6,8% 165,2±12,4% 115±11,7% 67±9,3% 189±9,5% 148±9,6% 500 205±13,3% 76±6,1% 177±9,2% 145±12,7% 87,4±15,1% 194±14% 171,4±8,4% 1000 213±13,4% 76±7,1% 171±9% 151±13,4% 92,1±16,8% 167±12,2% 181,1±8,4%

[55] Таблица C

Окси [мкΜ] SIRT1 SIRT2 SIRT3 SIRT4 SIRT5 SIRT6 SIRT7 3 8,7±1% 7,9±2% 10±3% 8,1±1% 7,1±1% 6,1±1% 6,3±1% 10 45±7,7% 14,9±1,9% 52,7±5,1% 12,4±2,1% 12,3±3% 34±5,5% 65±2,9% 30 124,5±8,6% 43,1±2,4% 133±4,8% 49±6,7% 45,1±4,3% 73±8,1% 95±6,7% 50 166±14,5% 56,3±7,7% 156±9,2% 52,1±6,6% 46±4% 81,3±8,1% 114±8,1% 100 187±16,6% 41,2±8,1% 148±7,3% 64,1±7,4% 36,1±6,7% 82,4±8,4% 132±7,6% 300 187±15,4% 39±9,3% 152,2±9% 67±8,7% 33,4±7,1% 87,4±9,3% 168±4,8% 500 176±10% 33,1±12,4% 151±8,1% 61,2±8,8% 35,1±8,1% 81,2±12,4% 177±6,6% 1000 175±9% 31,2±12,3% 151±7,4% 71,3±9,2% 37±6,8% 75±15,1% 165±5,1%

[56] Данные показывают, что 100-микромолярный декапептид-12 увеличивал транскрипцию SIRT1 на 141±11 процентов по сравнению с необработанными клетками, тогда как SIRT3, SIRT6 и SIRT7 увеличивали на 121±13 процентов, 147±8 процентов и 95±14 процентов соответственно (фиг. 1A-1D).

[57] Обсуждение

[58] Плейотропная роль сиртуинов в замедлении клеточного старения и блокировании развития преждевременного старения позволила подтвердить, что они являются эффективными антивозрастными белками. Терапевтическое применение ресвератрола в качестве активатора SIRT1 и потенциального антивозрастного агента подробно исследовано и задокументировано. Ресвератрол защищает эндотелий человека от H2O2-индуируемого окислительного стресса и старения через активацию SIRT1. Аналогичным образом оксиресвератрол также представляет собой эффективный антиоксидант и поглотитель свободных радикалов. Однако в отличие от ресвератрола он проявляет меньшую цитотоксичность и более высокую растворимость в воде. Соответственно, авторы настоящего изобретения выбрали его для применения в качестве положительного контроля, с которым сравнивали эффективность декапептида-12 и его способность модулировать транскрипцию сиртуина в эпидермальных кератиноцитах человека.

[59] Несмотря на то, что происходила повышающая регуляция всех 7 сиртуинов после обработки декапептидом-12, дальнейшее обсуждение будет сосредоточено на тех сиртуинах, которые непосредственно вовлечены в старение кожи.

[60] В концентрации 100 микромоль или 1 миллимоль декапептид-12 увеличивал транскрипцию SIRT1 на значительные 141 или 213 процентов соответственно. SIRT1 представляет собой прежде всего ядерную деацетилазу. Он контролирует различные клеточные процессы, такие как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, метаболизм, реакция на стресс, стабильность генома и выживаемость клеток. По сообщениям Cao et al. SIRT1 обеспечивает защиту от УФВ-и H2O2-индуцируемой гибели клеток за счет модуляции p53 и N-концевых киназ c-Jun в культивированных кератиноцитах кожи, что позволяет предположить, что активаторы SIRT1 могут служить новыми агентами против старения кожи. По сообщениям других исследователей SIRT1 может подавлять передачу сигнала NF-κB и таким образом замедлять процесс старения и увеличивать продолжительность жизни. Активация SIRT1 ингибирует передачу сигнала NF-κB непосредственно путем деацетилирования субъединицы p65 комплекса NF-κB и усиливает окислительный метаболизм и разрешение воспаления. Соответственно, SIRT1 можно рассматривать как ключевой антивозрастной белок, который опосредует широко распространенные эффекты в предотвращении преждевременного старения и ускоренного старения путем регуляции нескольких молекулярных путей.

[61] Транскрипция SIRT3 увеличивалась на 121 процент после обработки 100-микромолярным декапептидом. SIRT3 в первую очередь связан с регуляцией ряда митохондриальных процессов, таких как β-окисление, образование АТФ и управление АФК. SIRT3 также вовлечен в поддержание регенеративной способности гемопоэтических стволовых клеток. SIRT3 с возрастом подавляется, и повышающая регуляции SIRT3 в старых гемопоэтических стволовых клетках улучшает их регенеративную способность. Это обнаружение определяет значительную роль SIRT3 в поддержании стволовости и, что еще важнее, помогает «проложить путь» для будущих вмешательств на основе стволовых клеток при метаболических нарушениях, приводящих к преждевременному старению.

[62] SIRT6 можно рассматривать как важный антивозрастной белок, играющий многоплановую роль в устранении повреждений ДНК, регуляции метаболизма, воспалении и подавлении опухолей. SIRT6 стал известен, когда в мышиной модели с его нокаутом развивались фенотипы тяжелого преждевременного старения со смертностью в течение месяца. Более того, SIRT6 представляет собой единственный сиртуин млекопитающих, который демонстрировал явное увеличение продолжительности жизни, когда он сверхэкспрессировался во всем организме мышей. Кроме того, по сообщениям Kawahara et al. SIRT6 снижает гиперактивную передачу сигнала NF-κB путем деацетилирования гистона H3 по K9 на промоторах генов-мишеней NF-κB, что усиливает роль SIRT6 в качестве противовоспалительного белка, имеющего критическое значение.

[63] Baohua et al. продемонстрировали, что SIRT6 играет ключевую роль в процессе старения кожи за счет модуляции метаболизма коллагена и передачи сигнала NF-κB. По их сообщениям блокирование SIRT6 значительно уменьшало содержание гидроксипролина в результате ингибирования транскрипции коллагена 1 типа, стимулируя секрецию матриксной металлопротеиназы 1 и усиливая передачу сигнала NF-κB. В целом, SIRT6 выступает в качестве ключевого модулятора антивозрастных процессов путем регуляции несколько путей с замедлением клеточного старения и ускоренного старения. Следовательно, декапептид-12, который усиливал транскрипцию SIRT6 на 147 процентов при 100 мкМ, может быть крайне перспективен в качестве терапевтического антивозрастного кандидата для устранения часто совпадающих фенотипов преждевременного старения кожи и фотоповреждения кожи.

[64] Таким образом, декапептид-12, как было показано в этом сообщении, в значительной степени повышает уровни транскрипции SIRT1, SIRT3 и SIRT6, все 3 из которых играют значительную роль в противодействии старению кожи и другим патологиям, связанным с возрастом. В настоящее время разрабатывается дизайн клинических исследований с применением различных составов для топического применения, содержащих декапептид-12, для подтверждения результатов in vitro и тестирования эффективности этого эффективного активатора сиртуина in vivo.

[65] ПРИМЕР

[66] В этом примере осуществляли определенные модификации декапептида P4, как подробно описано в следующей таблице D.

[67] Таблица D

Пептид Краткое обозначение Последовательность Модификация Нативный-P4
SEQ ID NO: 9 P4 YRSRKYSSWY Отсутствует Пальм-P4-амид
SEQ ID NO: 10 P4A Пальмитоил-YRSRKYSSWY-амид •N-конец: пальмитоил.
•C-конец: амид. Пальм-D-ИЗО-амид
SEQ ID NO: 11 P4B Пальмитоил-YRSRK[*Y]SSWY-амид •N-конец: пальмитоил. •Внутренняя часть: тирозин в положении 6 в D-изоформе.
•C-конец: амид. Ацет-P4-амид
SEQ ID NO: 12 P4C Ацетил-YRSRKYSSWY-амид •N-конец: ацетил.
•C-конец: амид.

[68] Эти модификации декапептида P4 могут служить для повышения стабильности против протеаз и для усиления чрескожного или трансклеточного проникновения, или того и другого.

[69] Пептиды согласно настоящему изобретению могут содержать остатки любых встречающихся в природе аминокислот или не встречающихся в природе аминокислот. Эти встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе аминокислоты могут иметь D- или L-конфигурацию, или могут включать обе правовращающие формы. Термины «D» и «L» используются в настоящей заявке, поскольку они, как известно, используются в данной области техники. Пептиды согласно настоящему изобретению включают отдельные аминокислоты и короткие участки (например, 1-20) из аминокислот. Кроме того, модифицированные пептиды согласно настоящему изобретению могут также включать мономер или димер.

[70] В настоящей заявке используются стандартные однобуквенные и трехбуквенные обозначения аминокислот, и они приведены в таблице E ниже.

[71] Таблица E

А (Аla) Аланин C (Cys) Цистеин D (Asp) Аспарагиновая кислота E (Glu) Глутаминовая кислота F (Phe) Фенилаламин G (Gly) Глицин H (His) Гистидин I (Ile) Изолейцин K (Lys) лизин L (Leu) Лейцин M (Met) Метионин N (Asn) Аспарагин P (Pro) Пролин Q (Gln) Глутамин R (Arg) Аргинин S (Ser) Серин T (Thr) Треонин В (Val) Валин W (Trp) Триптофан Y (Tyr) Тирозин

[72] Как описано выше, указанные остатки могут представлять собой встречающуюся в природе L-аминокислоту или ее модификацию, т.е. химическую модификацию, оптический изомер или связь с модифицирующей группой. Предполагается, что могут быть осуществлены конкретные модификации пептида, которые сохраняют способность пептидов согласно настоящему изобретению специфично модулировать экспрессию гена (генов) сиртуина.

[73] Оценивали влияние декапептидов P4, P4A, P4B и P4C на уровни транскрипции сиртуинов 1-7. В таблице F приведены уровни транскрипции для всех четырех декапептидов с соответствующими генами в тестируемых концентрациях: 10, 30, 50, 100 и 300 (все в микромолях).

[74] Таблица F

Концентрация Ген P4 P4A P4B P4C 10 мкМ SIRT1 12±3% 18±2% 10±4% 7±3% SIRT2 4±3% 14±1% 5±1% 5,00 SIRT3 9±3% 25±4% 22±3% 8±3% SIRT4 8±3% 16±1% 9±1% 3±1% SIRT5 5±3% 13±2% 2,00 4±1% SIRT6 21±8% 24±5% 21±5% 12±3% SIRT7 15±4% 29±6% 20±6% 14±5% Концентрация Ген P4 P4A P4B P4C 30 мкМ SIRT1 34±7% 19±1% 10±3% 5,00 SIRT2 11±4% 15±1% 8±3% 2±1% SIRT3 32±6% 26±3% 23±2% 6±2% SIRT4 12±7% 16±1% 10±1% 3±1% SIRT5 21±7% 12±2% 1,00 2±1% SIRT6 52±5% 25±5% 22±4% 9±4% SIRT7 34±9% 33±5% 23±5% 7±2% Концентрация Ген P4 P4A P4B P4C 50 мкМ SIRT1 79±12% 42±5% 48±3% 1,00 SIRT2 22±5% 6±3% 17±6% 1,00 SIRT3 65±12% 60±4% 28±5% 45±9% SIRT4 41±13% 9±4% 17±1% 11±6% SIRT5 33±6% 10±3% 1,00 3±1% SIRT6 95±13% 33±7% 10±4% 31±5% SIRT7 61±10% 52±4% 54±7% 46±5% Концентрация Ген P4 P4A P4B P4C 100 мкМ SIRT1 141±11% 144±5% 135±12% 137±8% SIRT2 35±5% 48±1% 52±4% 42±1% SIRT3 121±13% 152±2% 78±10% 82±8% SIRT4 71±14% 98±12% 86±6% 32±9% SIRT5 46±7% 47±7% 35±3% 35±2% SIRT6 147±8% 135±10% 107±2% 124±7% SIRT7 95±14% 87±6% 61±7% 80±11% Концентрация Ген P4 P4A P4B P4C 300 мкМ SIRT1 188±12% 184±2% 155±3% 190±9% SIRT2 61±7% 30±5% 40±4% 31±9% SIRT3 165±12% 147±2% 142±5% 159±6% SIRT4 115±12% 65±1% 49±4 67±9% SIRT5 67±9% 29±4% 29±5% 28±9% SIRT6 189±10% 85±5% 81±4% 87±3% SIRT7 148±10% 113±2% 103±8% 130±9%

[75] В низких концентрациях нативный декапептид P4 демонстрировал повышенные уровни транскрипции по сравнению с модифицированными декапептидами. Однако каждый из трех модифицированных декапептидов (P4A, P4B и P4C) повышал уровни транскрипции генов сиртуина по сравнению с контролем. В концентрации 100 микромоль влияние на уровень транскрипции было сопоставимым для всех четырех декапептидов.

[76] Скорости пролиферации трех линий клеток человека (эпидермальные клетки-предшественники, меланобласты и фибробласты) определяли с использованием набора TACS® MTT Cell Proliferation Kit. Клетки высевали по 2,5×104 на лунку в 96-луночные планшеты в увлажненной атмосфере с 5-процентным CO2 при 37 градусах Цельсия. Через двадцать четыре часа в соответствующие лунки добавляли декапептиды в различных концентрациях и инкубировали в течение 72 часов. Оставшуюся часть методики выполняли в соответствии с протоколом производителя.

[77] В таблице G представлена скорость пролиферации эпидермальных предшественников через 72 часа.

[78] Таблица G

Концентрация (мкМ) P4 P4A P4B P4C 3 100% 99±1% 99±1% 99±1% 10 99±1% 99±1% 99±1% 99±1% 30 98±1% 98±1% 98±1% 98±1% 50 97±1% 97±1% 98±1% 98±1% 100 97±1% 97±2% 97±1% 97±1% 300 96±1% 96±2% 97±1% 97±1% 500 96±2% 96±2% 95±2% 96±2% 1000 94±2% 94±2% 94±2% 96±2%

[79] В таблице H представлена скорость пролиферации меланобластов через 72 часа.

[80] Таблица H

Концентрация (мкМ) P4 P4A P4B P4C 3 100% 100% 100% 100% 10 100% 100% 100% 100% 30 99±1% 99±1% 99±1% 99±1% 50 98±1% 98±1% 98±1% 98±1% 100 97±1% 97±2% 97±2% 97±2% 300 97±1% 97±2% 96±2% 96±3% 500 95±2% 96±2% 95±2% 95±2% 1000 95±2% 95±2% 94±2% 95±2%

[81] В таблице I представлена скорость пролиферации фибробластов через 72 часа.

[82] Таблица I

Концентрация (мкМ) P4 P4A P4B P4C 3 100% 100% 100% 100% 10 99±1% 99±1% 99±1% 99±1% 30 99±1% 98±1% 99±1% 99±1% 50 98±1% 98±1% 99±1% 99±1% 100 97±1% 97±2% 98±2% 98±2% 300 97±1% 97±2% 97±2% 97±2% 500 97±2% 96±2% 96±2% 96±2% 1000 96±2% 95±2% 96±2% 96±2%

[83] После 72-часовой инкубации эпидермальных клеток-предшественников, меланобластов и фибробластов совместно с 100 микромолями декапептида P4A результатом было 3-процентное снижение скорости пролиферации всех трех линий клеток.

[84] В случае концентрации 1000 микромоль скорость пролиферации эпидермальных клеток-предшественников снижалась на 6 процентов, тогда как у меланобластов и фибробластов - снижалась на 5 процентов и 4 процента соответственно.

[85] Также тестировали влияние каждого из указанных декапептидов на жизнеспособность клеток. В частности, клетки инкубировали совместно с декапептидом в различных концентрациях, а затем подсчитывали на предмет жизнеспособности по сравнению с контролем (необработанные клетки) с использованием трипанового синего. Цитотоксичность измеряли в соответствии со следующей формулой:

[1 - (# клеток в контроле - # живых клеток в тестируемом образце) / # клеток в контроле] × 100 процентов.

[86] В таблице J показана жизнеспособность эпидермальных клеток-предшественников через 7 дней.

[87] Таблица J

Концентрация (мкМ) P4 P4A P4B P4C 3 100% 100% 100% 100% 10 99±1% 99±1% 99±1% 99±1% 30 98,4±1% 98,2±1% 98,2±1% 98±1% 50 97,8±1% 97,5±1% 98±1% 97,4±1% 100 97,1±1% 96,9±2% 97±1% 96,6±2% 300 95,6±2% 95,6±2% 96,5±2% 95,7±3% 500 94,2±2% 94,3±2% 95,5±2% 94,8±3% 1000 93,8±2% 93,6±3% 94,5±2% 94±3%

[88] В таблице K показана жизнеспособность меланобластов через 7 дней.

[89] Таблица K

Концентрация (мкМ) P4 P4A P4B P4C 3 100% 100% 100% 100% 10 99±1% 99±1% 98,5±1% 99±1% 30 98,3±1% 98,5±1% 97,8±3% 98,4±1% 50 98±1% 98±1% 97,2±2% 97,9±1% 100 97,3±1% 97±2% 96,3±2% 97±2% 300 95,2±2% 96,2±2% 95,6±2% 96±3% 500 94,6±2% 95,6±2% 94,6±2% 95,5±3% 1000 94±2% 94,8±2% 93,8±2% 94,8±3%

[90] В таблице L показана жизнеспособность фибробластов через 7 дней.

[91] Таблица L

Концентрация (мкМ) P4 P4A P4B P4C 3 100% 100% 100% 100% 10 98,6±1% 98,9±1% 98,8±1% 98,9±1% 30 98,2±1% 98,4±1% 98,3±1% 98,3±1% 50 97,8±1% 98±1% 97,6±1% 97,8±1% 100 97,2±1% 97,4±2% 97,3±2% 97,4±2% 300 95,6±2% 96,6±2% 96,5±2% 96,5±2% 500 94,5±2% 95,5±2% 95,3±3% 95,7±2% 1000 93,8±1% 94,3±2% 94,2±3% 94,9±3%

[92] В случае концентрации 100 микромоль жизнеспособность клеток сохранялась на уровне более 97 процентов для всех трех линий клеток. В случае 1000 микромоль жизнеспособность клеток упала на 6 процентов по сравнению с контролем.

[93] В заключение, в недавних сообщениях подробно описана плейотропная роль сиртуинов в подавлении преждевременного старения, замедлении клеточного старения, увеличении продолжительности жизни и облегчении широкого спектра нарушений, связанных со старением. В настоящем описании авторы настоящего изобретения сообщают о полученных ими результатах по эффективному активатору сиртуина, декапептиду-12, и сравнивают его эффективность с хорошо описанным в документах оксиресвератролом. Обработка эпидермальных клеток-предшественников человека 100-микромолярным декапептидом-12 увеличивала транскрипцию SIRT1 на 141±11 процентов по сравнению с контрольными клетками, тогда как уровни SIRT3, SIRT6 и SIRT7 повышались на 121±13 процентов, 147±8 процентов и 95,4±14 процентов соответственно. Декапептид-12 повышающе регулировал транскрипцию сиртуина до уровней, схожих с оксиресвератролом, но со сниженной цитотоксичностью. Таким образом, декапептид-12 может быть перспективен в качестве более безопасного терапевтического средства для противодействия старению кожи и другим патологиям, связанным с возрастом.

[94] Хотя в приведенном выше описании упомянута типичная концентрация декапептида 100 микромоль или больше с указанием, где эффект был очевиден, результаты также демонстрируют, что более низкие концентрации оказывали положительный эффект. Таким образом, в некоторых вариантах реализации можно использовать концентрацию декапептида 1 микромоль или больше, и в конкретных вариантах реализации можно использовать диапазон концентраций пептида 100 микромоль или больше. Примерами диапазонов концентраций пептида в соответствии с различными вариантами реализации являются: 1 микромоль или больше, 5 микромоль или больше, 10 микромоль или больше, 30 микромоль или больше, 50 микромоль или больше, 100 микромоль или больше, 300 микромоль или больше, 500 микромоль или больше и 1000 микромоль или больше.

[95] Кроме того, следует отметить, что конкретный декапептид можно применять в комбинации с другим компонентом (компонентами) для достижения желаемого эффекта. Например, конкретный декапептид можно применять в комбинации с другими пептидами, такими как декапептиды P4A, 4B и/или 4C, и/или с другими компонентами, такими как оксиресвератрол. Согласно таким вариантам реализации синергетический эффект, достигаемый путем включения других компонентов, может в конечном итоге привести к снижению концентрации какого-либо отдельного компонента (например, декапептида, другого компонента), что необходимо для достижения желаемого результата.

[96] Хотя вышеуказанное, в частности, включает декапептиды и оксиресвератрол в качестве возможных дополнительных компонентов, варианты реализации этим не ограничиваются. Примеры других возможных добавок могут включать в том числе, но не ограничиваются ими, α-липоевую кислоту, биотин, кофеин, церамиды, кофермент Q10, гликолевую кислоту, зеленый чай, стволовые клетки человека, экстракты стволовых клеток человека, гиалуроновую кислоту, гидрохинон, масло жожоба, койевую кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, ниацинамид, олигопептиды, пептиды, стволовые клетки растений, экстракты стволовых клеток растений, ресвератрол, ретинол, витамин C, витамин E и витамин K.

[97] Следует отметить, что варианты реализации можно применять для лечения различных типов клеток кожи. Примеры окончательно дифференцированных клеток кожи могут включать, но не ограничиваются ими, кератиноциты, фиброциты, меланоциты и иммунные клетки, такие как клетки Лангерганса (например, гистиоциты или дендроциты), которые также стареют со временем.

[98] Варианты реализации также можно применять для лечения клеток-предшественников кожи для уменьшения старения кожи и обеспечения обновления кожи на протяжении всей жизни. Примеры таких клеток-предшественников могут включать, но не ограничиваются ими, предшественники эпидермальных кератиноцитов, фибробласты, меланобласты, гистиобласты или дендробласты, которые являются предшественниками клеток Лангерганса, которые «селятся» в эпидермисе.

[99] Наконец, хотя выше описано лечение клеток кожи человека, конкретные варианты реализации не ограничиваются такими подходами. В альтернативных вариантах реализации можно использовать лечение клеток кожи других организмов, включая, но не ограничиваясь ими, млекопитающих, таких как коровы (например, при производстве выделанной кожи), свиньи и другие животные (например, собаки, кошки и другие животные, которых можно оценивать на основе внешнего вида кожи для целей конкурса).

[100] Пункт 1A. Пептид, состоящий из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ. ID NO: 12.

[101] Пункт 2А. Пептид по пункту 1A, отличающийся тем, что указанный пептид состоит из SEQ ID NO: 9, модифицированной модифицирующей группой, причем указанная модифицирующая группа представляет собой либо пальмитоильную группу или ацетильную группу на аминоконце, либо амидирование карбоксиконца, либо и то, и другое.

[102] Пункт 3А. Пептид по любому из пунктов 1A-2A, состоящий из SEQ ID NO: 11, содержащей аминокислоту тирозин в положении 6 в виде D-изоформы, и при этом все остальные аминокислоты представляют собой L-изоформы.

[103] Пункт 4А. Композиция, содержащая первый пептид, состоящий из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ. ID NO: 12.

[104] Пункт 5А. Композиция по пункту 4A, отличающаяся тем, что указанный пептид состоит из SEQ ID NO: 9, модифицированной модифицирующей группой, причем указанная модифицирующая группа представляет собой либо пальмитоильную группу или ацетильную группу на аминоконце, либо амидирование карбоксиконца, либо и то, и другое.

[105] Пункт 6А. Композиция по любому из пунктов 4A-5A, состоящая из SEQ ID NO: 11, содержащей аминокислоту тирозин в положении 6 в виде D-изоформы, и при этом все остальные аминокислоты представляют собой L-изоформы.

[106] Пункт 7A. Композиция по любому из пунктов 4A-6A, отличающаяся тем, что указанный пептид присутствует в концентрации 1 мкм или больше.

[107] Пункт 8A. Способ лечения субъекта путем модулирования экспрессии гена сиртуина в клетке кожи для уменьшения симптомов старения кожи, при этом указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество одного или более пептидов, причем указанные один или более пептидов состоят из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ. ID NO: 12.

[108] Пункт 9А. Способ по пункту 8A, отличающийся тем, что указанный пептид состоит из SEQ ID NO: 9, модифицированной модифицирующей группой, причем указанная модифицирующая группа представляет собой либо пальмитоильную группу или ацетильную группу на аминоконце, либо амидирование карбоксиконца, либо и то, и другое.

[109] Пункт 10А. Способ по любому из пунктов 8A-9A, отличающийся тем, что указанный пептид состоит из SEQ ID NO: 11, содержащей аминокислоту тирозин в положении 6 в виде D-изоформы, и при этом все остальные аминокислоты представляют собой L-изоформы.

[110] Пункт 11A. Способ по любому из пунктов 8A-10A, отличающийся тем, что указанная клетка кожи является клеткой-предшественником.

[111] Пункт 12А. Способ по пункту 11A, отличающийся тем, что указанная клетка-предшественник представляет собой клетку-предшественник эпидермального кератиноцита, меланобласт, фибробласт, гистиобласт или дендробласт.

[112] Пункт 13A. Способ по любому из пунктов 8A-10A, отличающийся тем, что указанная клетка кожи является окончательно дифференцированной.

[113] Пункт 14A. Способ по пункту 13A, отличающийся тем, что указанная клетка кожи представляет собой кератиноцит, меланоцит, фиброцит, гистиоцит или дендроцит.

[114] Пункт 15A. Способ по любому из пунктов 8A-14A, отличающийся тем, что указанный пептид присутствует в концентрации 1 мкм или больше.

[115] Пункт 16А. Способ по любому из пунктов 8A-15A, отличающийся тем, что ген сиртуина содержит SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

[116] Пункт 17A. Способ по любому из пунктов 8A-16A, отличающийся тем, что указанная композиция дополнительно содержит оксиресвератрол.

[117] Пункт 18А. Способ по любому из пунктов 8A-17A, отличающийся тем, что указанная клетка кожи представляет собой клетку млекопитающего.

[118] Пункт 19А. Способ по пункту 18А, отличающийся тем, что указанная клетка кожи является клеткой кожи человека.

[119] Пункт 20. Способ модуляции экспрессии гена сиртуина в клетке кожи, при этом указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество одного или более пептидов, причем указанные один или более пептидов состоят из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ. ID NO: 12.

[120] Также отмечают иммуносупрессивное действие составов пептидов и/или оксиресвератрола. На Фиг. 3 представлена химическая структура декапептида P4 с SEQ ID NO: 9. На Фиг. 4 представлена химическая структура оксиресвератрола.

[121] В частности, декапептид-12 (P4) с SEQ ID NO: 9 и оксиресвератрол демонстрировали противовоспалительное действие, измеренное двумя разными способами:

[122] 1) блокада стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и

[123] 2) ингибирование цитотоксического уничтожения, опосредованного естественными клетками-киллерами (NK).

[124] Эти результаты подробно описаны в приведенном ниже примере.

[125] ПРИМЕР

[126] Анализы пролиферации МКПК и NK-цитотоксического уничтожения

[127] Криоконсервированные МКПК человека приобретали у Astarte Biologies (Редмонд, Вашингтон, США), активировали фитогемагглютинином (PHA) и оценивали на предмет пролиферации. Активированное интерлейкином (IL)-2 цитотоксическое уничтожение NK-клетками человека клеток K562 оценивали с использованием набора для нерадиоактивного анализа цитотоксичности CytoTox96 (Promega). В среды добавляли ингибитор протеазы для предотвращения распада декапептида-12.

[128] Для каждого эксперимента проводили три независимых испытания. Использовали Microsoft Excel (Сиэтл, Вашингтон) для расчета средних значений и стандартных ошибок, а статистическую значимость определяли с использованием непарного дисперсионного анализа или двустороннего T-критерия Стьюдента. P-значения <0,05 считали статистически значимыми.

[129] Исследовали влияние декапептида-12 и оксиресвератрола на скорости пролиферации МКПК после воздействия PHA в течение 72 часов.

[130] На графике на фиг. 5 показано иммуносупрессивное действие декапептида-12 (P4) в отношении пролиферации PHA-стимулированных МКПК. Данные выражены в процентах (%) относительно контроля и представляют собой средние значения ± SEM для 3 отдельных экспериментов. *P<0,05. E:T обозначает соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней.

[131] На Фиг. 5 показано, что декапептид-12 статистически значимо (p<0,02) уменьшал пролиферацию на 28,0±3,8 процента в концентрации 0,05 миллимоль и на 54,3±1,1 в концентрации 0,1 миллимоль. В концентрации 0,3 или 1 миллимоль не достигали дополнительного значительного уменьшения (p>0,05).

[132] На графике на фиг. 6 показано иммуносупрессивное действие оксиресвератрола в отношении пролиферации PHA-стимулированных МКПК. Данные выражены в процентах (%) относительно контроля и представляют собой средние значения ± SEM для трех отдельных экспериментов. *P<0,05. E:T обозначает соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней.

[133] На фиг. 6 показано, что оксиресвератрол также уменьшал пролиферацию на 35,3±1,8 процента (p<0,02) в концентрации 0,1 миллимоль и на 14,7±3,4 процента в концентрации 3 миллимоль (p<0,02).

[134] Также оценивали влияние декапептида-12 на опосредованное IL-2-примированными NK цитотоксическое уничтожение клеток K562.

[135] На графике на фиг. 7 показано иммуносупрессивное действие декапептида-12 (P4) в отношении NK92-опосредованного цитотоксического уничтожения клеток K562. Данные выражены в процентах (%) относительно контроля и представляют собой средние значения ± SEM для 3 отдельных экспериментов. *P<0,05. E:T обозначает соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней.

[136] На Фиг. 7 показано, что декапептид-12 уменьшал NK-уничтожение на 81,4±1,3 процента и 59,3±3,6 процента в концентрации 0,1 и 0,3 миллимоль соответственно (p>0,05) при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней (E:T), составляющем 10:1. При соотношении 30:1 декапептид-12 уменьшал NK-уничтожение на 64,8±5,3 процента и 44,8±3,2 процента в концентрации 0,1 и 0,3 миллимоль соответственно (р<0,04).

[137] На графике на фиг. 8 показано иммуносупрессивное действие оксиресвератрола в отношении NK92-опосредованного цитотоксического уничтожения клеток K562. Данные выражены в процентах (%) относительно контроля и представляют собой средние значения ± SEM для трех отдельных экспериментов. *P<0,05. E:T обозначает соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней.

[138] На Фиг. 8 показано, что оксиресвератрол уменьшал NK-уничтожение на 88,7±1,8 процента и 86,1±0,9 процента в концентрации 0,1 и 0,3 миллимоль соответственно (p<0,03) при соотношении E:T, составляющем 10:1. При соотношении 30:1 оксиресвератрол блокировал NK-уничтожение на 72,8±1,9 процента и 64,0±3,4 процента в концентрации 0,1 и 0,3 миллимоль соответственно (p<0,03).

[139] Таким образом, исследования показали, что декапептид-12 и оксиресвератрол оказывают противовоспалительное действие, измеренное двумя способами: 1) блокада пролиферации PHA-стимулированных МКПК и 2) ингибирование NK-опосредованного цитотоксического уничтожения.

[140] В случае тестирования блокады пролиферации эффект декапептида-12 оказался дозозависимым. Эффект оксиресвератрола проявлялся в ограниченном диапазоне ингибирующих концентраций.

[141] В действительности, общая тенденция показала, что оксиресвератрол может иметь двухфазный эффект. Это обусловлено тем, что концентрации 0,3 и 1 миллимоль демонстрировали все меньшее ингибирование, чем в случае концентрации 0,1 миллимоль.

[142] Декапептид-12 демонстрировал плато или максимальное ингибирование в концентрации 0,1 миллимоль или больше в тестируемом диапазоне концентраций. Это можно объяснить дозозависимыми различиями в активации нижележащих сигнальных путей или циклов обратной связи. Действительно, тщательное изучение кривых зависимости профилей экспрессии сиртуинов от дозы позволяет обнаружить двухфазные эффекты, при которых более высокие концентрации становятся ингибирующими.

[143] Напротив, прекращение NK-уничтожения оказалось дозозависимым как для декапептида-12, так и для оксиресвератрола. Оксиресвератрол демонстрировал более выраженное ингибирование во всех тестируемых концентрациях.

[144] Ингибирующее действие было больше при соотношении E:T 10:1, чем при 30:1 как для декапептида-12, так и для оксиресвератрола. Это может быть обусловлено блокадой NKG2D и цитотоксичностью, опосредованной перфорином.

[145] Следует отметить, что ресвератрол (аналог оксиресвератрола) ингибирует PHA-индуцированную пролиферацию в концентрации 0,1 миллимоль. Этот эффект подавления может быть обусловлен ингибированием NF-каппа B, который также регулируется сиртуинами и связан с иммунными и воспалительными ответами, а также с регуляцией пролиферации клеток и апоптоза, среди прочих эффектов.

[146] В целом, наблюдаемое иммуносупрессивное действие позволяет предположить, что в разных ветвях иммунной системы задействованы уникальные и специфические регуляторные пути. Дальнейшие исследования могут прояснить эти плейотропные эффекты.

[147] Например, может быть информативной оценка влияния этих двух агентов на провоспалительные медиаторы, такие как TNFα, IL-1β, IFNγ и IL-6. В дополнение к этому может быть информативным определение трансляционных и других транскрипционных эффектов активированных МКПК по сравнению с покоящимися МКПК.

[148] Хотя в приведенном выше описании упомянута типичная концентрация декапептида в диапазоне примерно 0-1,0 миллимоль с указанием, где эффект был очевиден, другие концентрации могут демонстрировать положительный эффект. Таким образом, в некоторых вариантах реализации можно использовать концентрацию декапептида 1,0 миллимоль или больше. Примерами диапазонов концентраций пептидов согласно различным вариантам реализации являются 0,025 миллимоль, 0,05 миллимоль, 0,1 миллимоль, 0,2 миллимоль, 0,3 миллимоль, 0,4 миллимоль, 0,5 миллимоль, 0,6 миллимоль, 0,7 миллимоль, 0,8 миллимоль, 0,9 миллимоль и 1,0 миллимоль или больше.

[149] И хотя в приведенном выше описании упомянута типичная концентрация оксиресвератрола в диапазоне примерно 0,1-1,0 миллимоль с указанием, где эффект был очевиден, другие концентрации могут демонстрировать положительный эффект. Таким образом, в некоторых вариантах реализации можно использовать концентрацию оксиресвератрола 1,0 миллимоль или больше. Примерами диапазонов концентраций оксиресвератрола согласно различным вариантам реализации являются 0,1 миллимоль, 0,2 миллимоль, 0,3 миллимоль, 0,4 миллимоль, 0,5 миллимоль, 0,6 миллимоль, 0,7 миллимоль, 0,8 миллимоль, 0,9 миллимоль и 1,0 миллимоль или больше.

[150] Также следует отметить, что конкретный компонент (например, декапептид, оксиресвератрол) можно применять в комбинации с другим компонентом (компонентами) для достижения желаемого эффекта. Например, конкретный декапептид можно применять в комбинации с другими пептидами, такими как декапептиды P4A, 4B и/или 4C, и/или с другими компонентами, такими как оксиресвератрол. Согласно таким вариантам реализации синергетический эффект, достигаемый путем включения других компонентов, может в конечном итоге привести к снижению концентрации какого-либо отдельного компонента (например, декапептида, оксиресвератрола, другого компонента), что необходимо для достижения желаемого результата.

[151] Хотя вышеуказанное, в частности, включает декапептиды и оксиресвератрол в качестве возможных дополнительных компонентов, варианты реализации этим не ограничиваются. Примеры других возможных добавок могут включать в том числе, но не ограничиваются ими, α-липоевую кислоту, биотин, кофеин, церамиды, кофермент Q10, гликолевую кислоту, зеленый чай, стволовые клетки человека, экстракты стволовых клеток человека, гиалуроновую кислоту, гидрохинон, масло жожоба, койевую кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, ниацинамид, олигопептиды, пептиды, стволовые клетки растений, экстракты стволовых клеток растений, ресвератрол, ретинол, витамин C, витамин E и витамин K.

[152] Следует отметить, что можно применять различные варианты реализации для иммуносупрессии различных типов клеток кожи. Примеры окончательно дифференцированных клеток кожи могут включать, но не ограничиваются ими, кератиноциты, фиброциты, меланоциты и иммунные клетки, такие как клетки Лангерганса (например, гистиоциты или дендроциты), которые также стареют со временем.

[153] Некоторые варианты реализации можно также применять для лечения клеток-предшественников кожи для иммуносупрессии и уменьшения старения кожи, и обеспечения обновления кожи на протяжении всей жизни. Примеры таких клеток-предшественников могут включать, но не ограничиваются ими, клетки-предшественники эпидермальных кератиноцитов, фибробласты, меланобласты, гистиобласты или дендробласты, которые являются предшественниками клеток Лангерганса, которые «селятся» в эпидермисе.

[154] Хотя вышеприведенное описание сфокусировано на лечении клеток кожи человека, конкретные варианты реализации не ограничиваются такими подходами. В альтернативных вариантах реализации можно использовать лечение клеток кожи других организмов, включая, но не ограничиваясь ими, млекопитающих, таких как коровы (например, при производстве выделанной кожи из кожи), свиньи и другие животные (например, собаки, кошки и другие животные, которых можно оценивать на основе внешнего вида кожи для целей конкурса).

[155] Более того, хотя вышеприведенное описание сфокусировано на лечении клеток кожи, варианты реализации не ограничиваются этим или любым другим типом клетки. В некоторых вариантах реализации можно лечить различные типы клеток млекопитающих и даже не млекопитающих.

[156] И, согласно некоторым вариантам реализации, лечение можно осуществлять путем перорального введения субъекту, представляющему собой млекопитающее. В качестве альтернативы, лечение может включать другие формы доставки, такие как непосредственное нанесение или прицельное местное применение (например, инъекция).

[157] Пункт 1B. Способ лечения субъекта путем осуществления иммуносупрессии клетки, при этом указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество одного или более пептидов, причем указанные один или более пептидов содержат SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ. ID NO: 12.

[158] Пункт 2B. Способ по пункту 1B, отличающийся тем, что указанный пептид состоит из SEQ ID NO: 9.

[159] Пункт 3B. Способ по пункту 1B, отличающийся тем, что указанный пептид состоит из SEQ ID NO: 9, модифицированной модифицирующей группой, причем указанная модифицирующая группа представляет собой либо пальмитоильную группу или ацетильную группу на аминоконце, либо амидирование карбоксиконца, либо и то, и другое.

[160] Пункт 4B. Способ по пункту 1В, отличающийся тем, что указанный пептид состоит из SEQ ID NO: 11, содержащей аминокислоту тирозин в положении 6 в виде D-изоформы, и при этом все остальные аминокислоты представляют собой L-изоформы.

[161] Пункт 5B. Способ по пункту 1B, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой клетку млекопитающего.

[162] Пункт 6B. Способ по пункту 5B, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку кожи.

[163] Пункт 7B. Способ по пункту 6B, отличающийся тем, что указанная клетка кожи млекопитающего является клеткой-предшественником.

[164] Пункт 8B. Способ по пункту 7B, отличающийся тем, что указанная клетка-предшественник представляет собой клетку-предшественник эпидермального кератиноцита, меланобласт, фибробласт, гистиобласт или дендробласт.

[165] Пункт 9B. Способ по любому из пунктов 1B, 5B, 6B, 7B и 8B, отличающийся тем, что введение осуществляют перорально.

[166] Пункт 10B. Способ по пункту 1В, отличающийся тем, что указанная клетка является окончательно дифференцированной.

[167] Пункт 11B. Способ по пункту 10B, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой кератиноцит, меланоцит, фиброцит, гистиоцит или дендроцит.

[168] Пункт 12B. Способ по пункту 1B, отличающийся тем, что указанный пептид присутствует в концентрации примерно 1 миллимоль или меньше.

[169] Пункт 13B. Способ по пункту 1B, отличающийся тем, что указанная композиция дополнительно содержит оксиресвератрол.

[170] Пункт 14B. Способ лечения субъекта путем осуществления иммуносупрессии клетки, при этом указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество оксиресвератрола.

[171] Пункт 15B. Способ по пункту 14B, отличающийся тем, что оксиресвератрол присутствует в концентрации в диапазоне примерно 0,1-1,0 миллимоль.

[172] Пункт 16B. Способ по пункту 14B, отличающийся тем, что указанная композиция дополнительно содержит эффективное количество одного или более пептидов, при этом указанные один или более пептидов содержат SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ. ID NO: 12.

[173] Пункт 17B. Способ по пункту 16B, отличающийся тем, что указанный пептид состоит из SEQ ID NO: 9.

[174] Пункт 18B. Способ по пункту 16B, отличающийся тем, что указанный пептид присутствует в концентрации примерно 1 миллимоль или меньше.

[175] Пункт 19B. Способ по пункту 14B, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой клетку млекопитающего.

[176] Пункт 20B. Способ по пункту 19B, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку кожи.

[177] Пункт 21B. Способ по пункту 20B, отличающийся тем, что указанная клетка кожи млекопитающего является клеткой-предшественником.

[178] Пункт 22B. Способ по пункту 21B, отличающийся тем, что указанная клетка-предшественник представляет собой клетку-предшественник эпидермального кератиноцита, меланобласт, фибробласт, гистиобласт или дендробласт.

[179] Пункт 23B. Способ по любому из пунктов 14B, 19B, 20B, 21B и 22B, отличающийся тем, что введение осуществляют перорально.

[180] Пункт 24B. Способ по пункту 14В, отличающийся тем, что указанная клетка является окончательно дифференцированной.

[181] Пункт 25B. Способ по пункту 24B, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой кератиноцит, меланоцит, фиброцит, гистиоцит или дендроцит.

[182] Описание настоящего изобретения представлено в целях иллюстрации и описания. Оно не является исчерпывающим или ограничивающим настоящее изобретение точной описанной формой, и в свете идеи, изложенной выше, возможно множество модификаций и вариаций. Указанные варианты реализации выбраны и описаны для лучшего пояснения принципов настоящего изобретения и его практического применения. Настоящее описание позволит специалисту в данной области техники наилучшим образом применять и реализовывать на практике настоящее изобретение в различных вариантах реализации и с различными модификациями, которые подходят для конкретного применения. Объем настоящего изобретения определяется следующей ниже формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Escape Therapeutics, Inc.

<120> Тирозиновые ингибиторы, обладающие иммуносупрессивной активностью в

клетках-предшественниках неонатальных кератиноцитов человека

<130> ELIXP005PC

<150> US 62/794,582

<151> 2019-01-19

<160> 12

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

gccaatcata agatgttgct gaac 24

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

aacctccctc atctctaact 20

<210> 3

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

gttggttaca agatccagac 20

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

agagctgtga gagaatgaag 20

<210> 5

<211> 23

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 5

tcttccatac actttactac ctt 23

<210> 6

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

cagcttaaac aggagtgaac 20

<210> 7

<211> 20

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 7

gacattttta gccatttgtc 20

<210> 8

<211> 24

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 8

cggaggttcg aagacgatca gata 24

<210> 9

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 9

Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой пальмитоил

<220>

<221> АМИДИРОВАНИЕ

<222> (10)..(10)

<400> 10

Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой пальмитоил

<220>

<221> САЙТ

<222> (6)..(6)

<223> D-изоформа

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> АМИДИРОВАНИЕ

<400> 11

Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> АЦЕТИЛИРОВАНИЕ

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> АМИДИРОВАНИЕ

<400> 12

Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr

1 5 10

<---

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к терапии и иммунологии, и предназначена для уменьшения воспаления у субъекта. Способ уменьшения воспаления у субъекта путем осуществления иммуносупрессии клетки включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество одного или более пептидов, причем указанные один или более пептидов содержат SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12. В другом воплощении, представлен способ уменьшения воспаления у субъекта путем осуществления иммуносупрессии клетки, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество оксиресвератрола. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность уменьшения воспаления у субъекта. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 8 ил., 12 табл.

1. Способ уменьшения воспаления у субъекта путем осуществления иммуносупрессии клетки, при этом указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество одного или более пептидов, причем указанные один или более пептидов содержат SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный пептид состоит из SEQ ID NO: 9.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой клетку млекопитающего.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку кожи.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанная клетка кожи млекопитающего является клеткой-предшественником.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанная клетка-предшественник представляет собой клетку-предшественник эпидермального кератиноцита, меланобласт, фибробласт, гистиобласт или дендробласт.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что введение осуществляют перорально.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная клетка является окончательно дифференцированной.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой кератиноцит, меланоцит, фиброцит, гистиоцит или дендроцит.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный пептид присутствует в концентрации приблизительно 1 миллимоль или меньше.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция дополнительно содержит оксиресвератрол.

12. Способ уменьшения воспаления у субъекта путем осуществления иммуносупрессии клетки, при этом указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество оксиресвератрола.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что оксиресвератрол присутствует в концентрации от приблизительно 0,1 миллимоль до приблизительно 1,0 миллимоль.

14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанная композиция дополнительно содержит эффективное количество одного или более пептидов, при этом указанные один или более пептидов содержат SEQ ID NO: 9.

15. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой клетку млекопитающего.

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку кожи.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанная клетка кожи млекопитающего является клеткой-предшественником.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указанная клетка-предшественник представляет собой клетку-предшественник эпидермального кератиноцита, меланобласт, фибробласт, гистиобласт или дендробласт.

19. Способ по любому из пп. 12 или 15-18, отличающийся тем, что введение осуществляют перорально.

20. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой окончательно дифференцированный кератиноцит, меланоцит, фиброцит, гистиоцит или дендроцит.