ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ЗАЩИТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ОТ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОК, ВЫЗЫВАЕМОГО ТВЕРДЫМИ ЧАСТИЦАМИ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК A61K38/06 A61K8/64 A61Q19/02 A61Q19/08 C07K5/08 A61P17/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящая заявка относится к пептиду, обладающему защитной активностью от повреждения клеток, вызванного твердыми частицами, и к применению пептида.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Термин твердые частицы относится к пыли из мелких невидимых частиц. Твердые частицы представляют собой загрязнители воздуха, включая двуокись серы, оксиды азота, свинец, озон, окись углерода и т. п., они образуются при работе автомобилей, на заводах, в процессе приготовления пищи и т. д. и остаются во взвешенном состоянии в атмосфере в течение длительного периода времени. Частицы диаметром 50 мкм или меньше, находящиеся в атмосфере, называются общими взвешенными частицами (TSP), а частицы размером менее 10 мкм среди этих TSP обычно называют твердыми частицами. Твердые частицы разделяются в зависимости от диаметра частиц. Частицы с диаметром 10 мкм или менее обозначаются PM 10, а частицы с диаметром менее 2,5 мкм обозначаются PM 2,5, и они также называются «мелкодисперсными частицами» или «сверхмелкодисперсными частицами».

[0003] Твердые частицы содержат углерод, органические углеводороды, нитраты, сульфаты и вредные металлические компоненты, и известно, что они напрямую вызывают респираторные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, заболевания глаз, рак, кожные заболевания, головные боли и т. д. или усугубляют эти заболевания. Кроме того, поскольку размер твердых частиц составляет около одной пятой диаметра пор кожи, при проникновении твердых частиц в кожу повреждается защитная мембранная функция наружного слоя кожи, и кожа становится чувствительной к раздражению.

[0004] Полиароматические углеводороды (PAH), содержащиеся в твердых частицах, проникают в кожу через волосяные фолликулы в коже, увеличивая количество меланоцитов и пигментных пятен, уменьшая синтез коллагена и усиливая разложение коллагена, тем самым вызывая появление морщин и снижение эластичности, а также способствуя старению кожи. Полиароматические углеводороды могут проникать в клетки, связываться с арилуглеводородным рецептором (AHR) и транслоцироваться в ядро. AHR, транслоцированный в ядро, образует комплекс AHR/ARNT с ядерным транслокатором AHR (ARNT), а комплекс «AHR/ARNT» связывается с AHR-чувствительным элементом (AHRE), диоксин-чувствительным элементом (DRE) и последовательностью ксенобиотик-реактивного элемента (XRE) на ДНК с образованием активных форм кислорода (ROS) или с образованием токсичных веществ с помощью таких ферментов, как CYP1A1, CYP1A2 и CYP1B1, тем самым вызывая повреждение клеток и увеличивая экспрессию различных медиаторов воспаления, микрофтальмия-ассоциированного фактора транскрипции (Mitf), который представляет собой фактор транскрипции, связанный с синтезом меланина, и матриксных металлопротеаз (MMP), которые представляют собой ферменты, связанные с образованием морщин, вызывающими дерматит, пигментную гиперплазию (мелазму, веснушки и т. п.) и морщины на коже.

[0005] [ДОКУМЕНТЫ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ]

[0006] [ПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ]

[0007] Корейский патент № 10-2065171.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

[0008] Авторы настоящего изобретения исследовали и предприняли усилия по разработке пептида, обладающего активностью, способной предотвращать повреждение клеток, вызванное контактом клеток организма с твердыми частицами. В результате настоящее изобретение было завершено экспериментальным доказательством того, что пептид, разработанный авторами настоящего изобретения, обладает защитной активностью на клеточном уровне за счет ингибирования активации AHR, индуцированной твердыми частицами, и одновременного ингибирования активности цитохрома Р450, индуцированной активацией AHR.

[0009] Соответственно, аспект настоящего изобретения относится к пептиду, обладающему активностью эффективного предотвращения повреждения клеток, вызванного твердыми частицами.

[0010] Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции для предотвращения повреждения клеток, включающей пептид, обладающий описанной выше активностью, в качестве действующего ингредиента.

[0011] Еще один аспект настоящего изобретения относится к косметической композиции для предотвращения повреждения клеток кожи, причем композиция включает пептид, обладающий описанной выше активностью, в качестве действующего ингредиента.

[0012] Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для лечения или профилактики заболевания, вызванного контактом с твердыми частицами, причем композиция включает пептид, обладающий описанной выше активностью, в качестве действующего ингредиента.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

[0013] Согласно аспекту настоящего изобретения,

[0014] предложен пептид, обладающий активностью в отношении предотвращения повреждения клеток, вызванного твердыми частицами, причем пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

[0015] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция для предотвращения повреждения клеток, вызванного твердыми частицами, причем композиция включает пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в качестве действующего ингредиента.

[0016] В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложена косметическая композиция для предотвращения повреждения клеток кожи, вызванного твердыми частицами, причем косметическая композиция включает пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в качестве действующего ингредиента.

[0017] В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболевания, вызванного твердыми частицами, причем фармацевтическая композиция включает пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в качестве действующего ингредиента.

[0018]

[0019] Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

[0020] 1. Пептид и активность

[0021] В соответствии с аспектом настоящего изобретения предложен пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

[0022] Используемый в настоящем документе термин «пептид» относится к линейной молекуле, образованной аминокислотными остатками, соединенными друг с другом пептидными связями.

[0023] Пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, можно использовать без модификации, но, с другой стороны, пептид может представлять собой аминокислотный вариант или фрагмент, имеющий другую последовательность, созданную делецией, вставкой, заменой или их комбинацией, аминокислотных остатков в диапазоне, который не влияет на первоначальную активность пептида, такую как активность защиты клеток от повреждения, вызванного твердыми частицами.

[0024] Пептид по настоящему изобретению может быть модифицирован фосфорилированием, сульфатированием, акрилированием, гликозилированием, метилированием, фарнезилированием и т. п. в диапазоне, который не изменяет активность пептида.

[0025] Пептид по настоящему изобретению включает пептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу идентичную аминокислотной последовательности пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и его вариант или его активный фрагмент. Пептид, включающий по существу идентичную аминокислотную последовательность, означает пептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ. ID NO: 1. Пептид может также включать дополнительные последовательности, такие как последовательности-мишени, метки, меченые остатки или аминокислоты, введенные для конкретной цели увеличения периода полужизни или стабильности пептида.

[0026] Пептид по настоящему изобретению может иметь N-концевые и/или С-концевые модификации, введенные для отбора некоторых участков аминокислотной последовательности и повышения их активности. Стабильность пептида по настоящему изобретению может быть значительно улучшена за счет модификаций N-конца и/или С-конца, и, например, период полужизни пептида может быть увеличен при введении пептида in vivo. Термин «стабильность» пептида относится не только к стабильности in vivo для защиты пептида по настоящему изобретению от воздействия протеаз in vivo, но и к стабильности при хранении (например, стабильности при хранении при комнатной температуре).

[0027] N-концевая модификация может представлять собой связывание защитной группы, выбранной из группы, состоящей из ацетильной группы, флуоренилметоксикарбонильной группы, формильной группы, пальмитоильной группы, миристильной группы, стеарильной группы и полиэтиленгликоля (ПЭГ), с N-концом пептида.

[0028] С-концевая модификация может представлять собой связывание гидроксильной группы (-ОН), аминогруппы (-NH₂), азида (-NHNH₂) и т.п. с С-концом пептида, но не ограничивается этим.

[0029] Пептид по настоящему изобретению может быть получен различными способами, широко известными в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Например, пептиды по настоящему изобретению могут быть получены с использованием способов химического синтеза, известных в данной области техники, в частности способов твердофазного синтеза Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al. Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nd ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) или метода жидкофазного синтеза (патент США № 5516891).

[0030] Пептид по настоящему изобретению может эффективно предотвращать повреждение клеток, вызванное твердыми частицами.

[0031] Полиароматические углеводороды (PAH), содержащиеся в твердых частицах, могут проникать в клетки, а полиароматические углеводороды, которые проникают в клетки, связываются с арилуглеводородным рецептором (AHR) и транслоцируются в ядро. AHR, транслоцированный в ядро, образует комплекс AHR/ARNT с ядерным транслокатором AHR (ARNT), и комплекс «AHR/ARNT» связывается с AHR-чувствительным элементом (AHRE), диоксин-чувствительным элементом (DRE) и последовательностью ксенобиотик-реактивного элемента (XRE), присутствующих на ДНК, с созданием активных форм кислорода (ROS) или с увеличением экспрессии или активности ферментов, таких как CYP1A1, CYP1A2 и CYP1B1, тем самым генерируя токсичные вещества, вызывающие повреждение клеток, а также увеличивая экспрессию различных медиаторов воспаления.

[0032] Пептид по настоящему изобретению существенно ингибирует ядерную транслокацию арилуглеводородного рецептора (AHR), которая увеличивается в клетках из-за контакта с твердыми частицами, и усиливающуюся в результате этого активность цитохрома Р450, тем самым предотвращая повреждение клеток, вызванное твердыми частицами.

[0033]

[0034] 2. Композиция для предотвращения повреждения клеток

[0035] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция для предотвращения повреждения клеток, вызванного твердыми частицами, причем композиция включает пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в качестве действующего ингредиента.

[0036] В варианте осуществления повреждение клеток может представлять собой повреждение клеток кожи, респираторных клеток или клеток роговицы.

[0037] В другом варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может обладать активностью по ингибированию активации арилуглеводородного рецептора (AHR). Ингибирование активации AHR пептидом может представлять собой ингибирование транслокации AHR в ядро.

[0038] В другом варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может обладать активностью по ингибированию активности цитохрома Р450. Ингибирование активности цитохрома Р450 пептидом представлять собой ингибирование активации или экспрессии цитохрома Р450.

[0039] В другом варианте твердые частицы могут включать полициклические ароматические углеводороды (PAH).

[0040] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена косметическая композиция для предотвращения повреждения клеток кожи, вызванного твердыми частицами, причем косметическая композиция включает пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в качестве действующего ингредиента.

[0041] В настоящем изобретении повреждение клеток кожи, вызванное твердыми частицами, может включать, например, старение кожи, увеличение морщин на коже, нарушение эластичности кожи, нарушение цвета кожи, гиперплазию пигмента, меланодермию, веснушки, сухость кожи, воспаление кожи, контактный дерматит, атопический дерматит или псориаз.

[0042] Косметическая композиция может представлять собой композицию, предназначенную для уменьшения: старения кожи, увеличения морщин на коже, нарушения эластичности кожи, нарушения цвета кожи, гиперплазии пигмента, мелазмы, веснушек, сухости кожи, воспаления кожи, контактного дерматита, атопического дерматита или псориаза.

[0043] Косметическая композиция по настоящему изобретению может включать (i) косметически эффективное количество пептида по настоящему изобретению, описанного выше; и (ii) косметически приемлемый носитель.

[0044] Термин «косметически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для того, чтобы композиция по настоящему изобретению достигла эффекта предотвращения повреждения клеток кожи, вызванного твердыми частицами.

[0045] Косметическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена в любом составе, обычно изготавливаемом в данной области, и, например, может быть изготовлена в виде раствора, суспензии, эмульсии, пасты, геля, крема, лосьона, порошка, мыла, содержащего поверхностно-активное вещество очищающего средства, масла, компактной тональной основы, эмульсионной тональной основы, восковой тональной основы и спрея, но не ограничиваясь этим. Более конкретно, она может быть изготовлена в виде средства для смягчения кожи, питательного лосьона, питательного крема, массажного крема, эссенции, крема для глаз, очищающего крема, очищающей пены, очищающей воды, компресса, спрея или пудры.

[0046] Когда состав косметической композиции по настоящему изобретению представляет собой пасту, крем или гель, в качестве компонента-носителя могут использоваться масло животного происхождения, растительное масло, воск, парафин, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоль, силикон, бентонит, диоксид кремния, тальк, или оксид цинка. Когда состав косметической композиции по настоящему изобретению представляет собой порошок или спрей, в качестве компонента-носителя могут использоваться лактоза, тальк, диоксид кремния, гидроксид алюминия, силикат кальция или полиамидный порошок, и, в частности, когда композиция представляет собой спрей, в ней может содержаться пропеллент, такой как хлорфторуглеводород, пропан/бутан или диметиловый эфир.

[0047] Когда состав косметической композиции по настоящему изобретению представляет собой раствор или эмульсию, в качестве компонента-носителя используют растворитель, солюбилизатор или эмульгатор, и, например, могут использоваться вода, этанол, изопропанол, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутилгликолевое масло, глицериновый алифатический эфир, полиэтиленгликоль или эфир жирной кислоты и сорбитана.

[0048] Когда состав косметической композиции по настоящему изобретению представляет собой суспензию в качестве компонента-носителя могут быть использоваться жидкий разбавитель, такой как вода, этанол или пропиленгликоль, суспендирующий агент, такой как этоксилированный изостеариловый спирт, сложный эфир полиоксиэтиленсорбита, сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар, трагакант и т.п.

[0049] Когда состав косметической композиции по настоящему изобретению представляет собой содержащее поверхностно-активное вещество очищающее средство, в качестве компонента-носителя могут использоваться сульфат алифатического спирта, сульфат эфира алифатического спирта, моноэфир сульфоянтарной кислоты, изетионат, производные имидазолия, метилтаурат, саркозинат, сульфат эфира амида жирной кислоты, алкиламидобетаин, алифатический спирт, глицерид жирной кислоты, диэтаноламид жирной кислоты, растительное масло, производные ланолина, сложный эфир этоксилированного глицерина и жирной кислоты и т.п.

[0050] Косметическая композиция по настоящему изобретению помимо пептида в качестве действующего ингредиента и компонента-носителя может включать ингредиенты, традиционно используемые в косметической композиции, и может включать обычные добавки, например, антиоксиданты, стабилизаторы, солюбилизаторы, витамины, пигменты и ароматизаторы.

[0051] В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболевания, вызванного твердыми частицами, причем фармацевтическая композиция включает пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 в качестве действующего ингредиента.

[0052] В одном варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может обладать активностью по ингибированию активации арилуглеводородного рецептора (AHR). Ингибирование активации AHR пептидом может представлять собой ингибирование транслокации AHR в ядро.

[0053] В другом варианте осуществления пептид по настоящему изобретению может обладать активностью ингибирования активности цитохрома Р450. Ингибирование активности цитохрома Р450 пептидом может представлять собой ингибирование активации или экспрессии цитохрома Р450.

[0054] В другом варианте осуществления твердые частицы могут включать полициклические ароматические углеводороды (PAH).

[0055] Термин «профилактика» относится к ингибированию возникновения симптомов, обусловленных заболеванием, вызванным твердыми частицами, или симптомов, обусловленных его осложнениями, а термин «лечение» относится к облегчению или устранению симптомов, обусловленных заболеванием, уже вызванным твердыми частицами, или симптомов, вызванных осложнением заболевания.

[0056] Заболевание, вызванное твердыми частицами, может представлять собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из атопического дерматита, контактного дерматита, себорейного дерматита, акне, ксеродермии, псориаза; аллергического ринита, острого бронхита, хронического бронхита, эмфиземы легких, недостаточности функции легких, астмы, бронхоэктаза, идиопатического легочного фиброза, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), муковисцидоза, бронхиолита, острых инфекций верхних дыхательных путей, пневмонии, назосинусита, фарингита, тонзиллита, ларингита; ксерофтальмии, аллергического конъюнктивита, глаукомы, катаракты, дегенерации желтого пятна, кровоизлияния в сетчатку, отслойки сетчатки, пигментного ретинита, старческой дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии; рака, иммунотоксичности, поражения периферической нервной системы, поражения центральной нервной системы, эндокринопатии, болезней репродуктивных органов, нарушений развития младенцев и детей ясельного возраста, анемии, аритмии, сердечного приступа, стенокардии и инфаркта миокарда, но не ограничиваются ими.

[0057] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает: (i) терапевтически эффективное количество пептида по настоящему изобретению, описанного выше; и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.

[0058] Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для того, чтобы композиция по настоящему изобретению достигла эффекта лечения или профилактики заболевания, вызванного твердыми частицами.

[0059] Фармацевтически приемлемый носитель обычно используется во время приготовления препарата, и его примеры могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т.п., но не ограничиваются ими. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и составы подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (19-е изд., 1995).

[0060] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально, и в случае парентерального введения введение можно осуществлять с помощью внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, чрескожного введения и т. п.

[0061] Подходящая дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению варьирует в зависимости от таких факторов, как способ приготовления, способ введения, возраст пациента, масса тела, пол, состояние, диета, время введения, способ введения, скорость экскреции и чувствительность ответа, и обычный квалифицированный врач может легко определить и назначить эффективную дозировку для желаемого лечения или профилактики.

[0062] Суточная доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению составляет 0,001-10000 мг/кг.

[0063] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно изготовить в дозированной лекарственной форме путем составления рецептуры с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или вспомогательного вещества, или ее можно изготовить путем включения в многодозовый контейнер в соответствии со способом, который легко выполняется специалистами в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В этом случае препарат может находиться в форме раствора, суспензии или эмульсии в масле или водной среде, или может находиться в форме экстракта, порошка, гранул, таблеток или капсул и может дополнительно включать диспергирующий агент или стабилизатор.

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ

[0064] Пептид по настоящему изобретению обладает исключительной активностью в отношении предотвращения повреждения клеток, вызванного твердыми частицами, и может использоваться в качестве активного вещества для защиты клеток кожи, дыхательных путей или клеток роговицы от твердых частиц. Кроме того, пептид по настоящему изобретению может быть представлен в качестве терапевтического средства для лечения различных заболеваний, вызванных твердыми частицами.

[0065] Однако эффекты настоящего изобретения не ограничиваются вышеуказанными эффектами, и другие эффекты, которые не указаны, будут очевидно понятны специалисту в данной области техники из нижеследующего описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0066] Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее механизмы передачи сигнала, опосредованные арилуглеводородным рецептором (AHR).

[0067] На фиг. 2 показан результат эксперимента с использованием вестерн-блоттинга, показывающий, что увеличение ядерной транслокации AHR, вызванное обработкой твердыми частицами кератиноцитов человека (НаСаТ), снижается зависимым от концентрации образом в результате обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

[0068] На фиг. 3 показан результат эксперимента по измерению активности Р450, показывающий, что увеличение активности цитохрома Р450, вызванное обработкой твердыми частицами кератиноцитов человека (НаСаТ), снижается зависимым от концентрации образом в результате обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

[0069] На фиг. 4 показан результат эксперимента по измерению активности Р450, показывающий, что повышение активности цитохрома Р450, вызванное обработкой твердыми частицами клеток альвеолярного эпителия человека А549, снижается зависимым от концентрации образом в результате обработки пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0070] Далее настоящая заявка будет подробно описана со ссылкой на примеры. Однако нижеследующие примеры только иллюстрируют настоящую заявку, и содержание настоящей заявки не ограничивается нижеследующими примерами.

[0071] Примеры

[0072]

[0073] Пример получения 1: получение пептида

[0074] Пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, приведенную в таблице 1 ниже, были синтезированы с использованием автоматического синтезатора пептидов (Liberty, CEM Corporation, США), и эти синтезированные пептиды были очищены с помощью обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на C18 (U-3000, Thermo fisher Scientific, США). В качестве колонки использовали Pursuit XRs C18 (250*4,65 мм 100 Å, Agilent, США).

[0075]

[Таблица 1] SEQ ID NO Аминокислотная последовательность пептида 1 WYM

[0076]

[0077] Экспериментальный пример 1: тест на ядерную транслокацию AHR

[0078] Полиароматические углеводороды (PAH), присутствующие в твердых частицах, действуют как лиганд AHR, тем самым способствуя ядерной транслокации AHR, когда PAH проникают в клетки и связываются с AHR. Чтобы подтвердить влияние синтезированного пептида на ингибирование повреждения клеток, вызванного твердыми частицами, был проведен эксперимент, чтобы доказать, ингибирует ли пептид ядерную транслокацию AHR, которая обычно наблюдается во время связывания лиганда с AHR после обработки клеток твердыми частицами.

[0079] Клетки HaCaT, которые представляют собой кератиноциты человека, высевали в 6-луночный планшет с плотностью 5×10⁵ клеток/лунку. После инкубации в течение ночи среду заменяли бессывороточной средой. Кератиноциты HaCaT предварительно обрабатывали синтезированными пептидами в течение 1 часа в каждой концентрации (20 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ). Затем клетки обрабатывали 50 мкг/см² городских твердых частиц (Sigma, NIST1648A) в течение 1 часа. После сбора кератиноцитов готовили экстракты клеточных ядер и проводили вестерн-блоттинг. Вестерн-блоттинг выполняли с использованием антител против AHR (Cell Signaling Technology) в соответствии с протоколом, известным в данной области.

[0080] В результате эксперимента, как видно из результатов вестерн-блоттинга, показанных на фиг. 2, было подтверждено, что ядерная транслокация AHR в клетках, обработанных твердыми частицами (NC), быстро увеличивалась по сравнению с контрольными клетками (Con), которые не были обработаны твердыми частицами. Кроме того, было подтверждено, что в клетках, обработанных пептидом с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, уровень ядерной транслокации AHR, повышенный обработкой твердыми частицами, был значительно снижен. Кроме того, увеличение транслокации AHR в ядро при обработке твердыми частицами уменьшалось в зависимости от концентрации пептида, используемого для обработки клеток.

[0081]

[0082] Экспериментальный пример 2: анализ активности цитохрома Р450

[0083] Когда полиароматические углеводороды (PAH), присутствующие в твердых частицах, проникают в клетки и связываются с AHR, это способствует ядерной транслокации AHR. Известно, что транслоцированный в ядро AHR образует комплекс AHR/ARNT с ядерным транслокатором AHR (ARNT), и этот комплекс действует как фактор транскрипции, стимулируя экспрессию цитохрома P450 (CYP). Чтобы подтвердить влияние синтезированного пептида на ингибирование повреждения клеток, вызванного твердыми частицами, был проведен эксперимент для подтверждения того, ингибирует ли пептид активность цитохрома Р450 после обработки клеток твердыми частицами.

[0084] Сначала клетки НаСаТ, которые представляют собой кератиноциты человека, высевали в 96-луночный планшет с плотностью 1×10⁴ клеток/лунку. После инкубации в течение ночи среду заменяли бессывороточной средой. Кератиноциты HaCaT предварительно обрабатывали синтезированными пептидами в течение 1 часа в каждой концентрации (20 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ). Затем клетки обрабатывали 50 мкг/см² городских твердых частиц (Sigma, NIST1648A) в течение 24 часов. После сбора кератиноцитов активность цитохрома Р450 измеряли с использованием набора для анализа P450-Glo™ (Promega).

[0085] В результате эксперимента, как видно из результатов измерения активности цитохрома Р450, представленных на фиг. 3, было подтверждено, что активность цитохрома Р450 быстро повышалась в клетках, обработанных твердыми частицами (NC), по сравнению с контрольными клетками (Con), которые не подвергались обработке твердыми частицами. Кроме того, было подтверждено, что в клетках, обработанных пептидом с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, активность цитохрома Р450, повышающаяся при обработке твердыми частицами, была снижена. Кроме того, увеличение активности цитохрома Р450 при обработке твердыми частицами снижалось в зависимости от концентрации пептида, используемого для обработки клеток.

[0086] Кроме того, чтобы подтвердить, может ли пептид по настоящему изобретению подавлять повреждение органов дыхания, вызванное твердыми частицами, также был проведен эксперимент по измерению активности цитохрома Р450 в клетках А549, которые представляют собой клетки альвеолярного эпителия человека.

[0087] Сначала клетки альвеолярного эпителия человека (клетки A549) высевали в 96-луночный планшет с плотностью 1,2×10⁴ клеток/лунку. После инкубации в течение ночи среду заменяли бессывороточной средой. Клетки А549 предварительно обрабатывали синтезированными пептидами в течение 1 часа в каждой концентрации (20 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ). Затем клетки обрабатывали 50 мкг/см² городских твердых частиц (Sigma, NIST1648A) в течение 24 часов. После сбора обработанных клеток активность цитохрома Р450 измеряли с использованием набора для анализа P450-Glo™ (Promega).

[0088] В результате эксперимента, как видно из результатов измерения активности цитохрома Р450, представленных на фиг. 4, было подтверждено, что активность цитохрома Р450 быстро повышалась в клетках, обработанных твердыми частицами (NC), по сравнению с контрольными клетками (Con), которые не подвергались обработке твердыми частицами, и было подтверждено, что повышение активности цитохрома Р450 при обработке твердыми частицами уменьшалось в клетках, обработанных пептидом с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Кроме того, увеличение активности цитохрома Р450 при обработке твердыми частицами снижалось способом, зависящим от концентрации пептида, используемого для обработки.

[0089]

[0090] Хотя репрезентативные варианты осуществления настоящей заявки были описаны в качестве примера, объем настоящей заявки не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными выше, и специалист в данной области техники может изменить настоящую заявку в пределах объема, описанного в пунктах настоящей заявки.

[Список последовательностей в свободной форме]

[0091] SEQ ID NO: 1: Trp Tyr Met

--->

<110> CAREGEN CO., LTD

<120> Пептид, обладающий защитной активностью от повреждения

клеток, вызываемого твердыми частицами, и его применение

<130> 2020-OPA-4695PCT

<150> KR 10-2020-0159848

<151> 2020-11-25

<160> 1

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 1

Trp Tyr Met

1

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композиции пептида, обладающего защитной активностью от повреждения клеток, вызванного твердыми частицами, и может быть использовано в косметологии для предотвращения вызванного твердыми частицами повреждения клеток кожи и медицине для лечения или профилактики заболевания, вызванного твердыми частицами. Изобретение обеспечивает предотвращение повреждения клеток кожи, респираторных клеток или клеток роговицы, вызванного твердыми частицами, содержащими полициклические ароматические углеводороды (PAHs), где повреждение клеток включает повреждение клеток, вызванное активными формами кислорода (ROS) или воспалением, за счет использования пептида с SEQ ID NO: 1 в качестве активного ингредиента композиции. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Композиция для предотвращения повреждения клеток, вызванного твердыми частицами, содержащая эффективное количество пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в качестве действующего ингредиента, где повреждение клеток включает повреждение клеток, вызванное активными формами кислорода (ROS) или воспалением, где твердые частицы содержат полициклические ароматические углеводороды (PAHs) и где повреждение клеток представляет собой повреждение клеток кожи, респираторных клеток или клеток роговицы.

2. Композиция по п.1, где пептид ингибирует активацию арилуглеводородного рецептора (AHR).

3. Композиция по п.1, где пептид ингибирует активность цитохрома Р450.

4. Косметическая композиция для предотвращения повреждения клеток кожи, вызванного твердыми частицами, содержащая эффективное количество пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 в качестве действующего ингредиента, где повреждение клеток кожи, вызванное твердыми частицами, включает старение кожи, увеличение морщин на коже, нарушение эластичности кожи, нарушение цвета кожи, гиперплазию пигмента, меланодермию, веснушки, сухость кожи, воспаление кожи, контактный дерматит, атопический дерматит или псориаз и где твердые частицы содержат полициклические ароматические углеводороды (PAHs).

5. Косметическая композиция по п.4, где композиция имеет один состав, выбранный из группы, состоящей из раствора, суспензии, эмульсии, геля, лосьона, эссенции, крема, порошка, мыла, шампуня, ополаскивателя, маски, содержащего поверхностно-активное вещество очищающего средства, очищающей пены, очищающей воды, масла, жидкой тональной основы, кремовой тональной основы и спрея.

6. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболевания, вызванного твердыми частицами, содержащая эффективное количество пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в качестве действующего ингредиента, где твердые частицы содержат полициклические ароматические углеводороды (PAHs), где заболевание, вызванное твердыми частицами, представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из атопического дерматита, контактного дерматита, себорейного дерматита, акне, ксеродермии, псориаза; аллергического ринита, острого бронхита, хронического бронхита, эмфиземы легких, недостаточности функции легких, астмы, бронхоэктаза, идиопатического легочного фиброза, хронической обструктивной болезни легких, муковисцидоза, бронхиолита, острых инфекций верхних дыхательных путей, пневмонии, назосинусита, фарингита, тонзиллита, ларингита; ксерофтальмии, аллергического конъюнктивита, глаукомы, катаракты, дегенерации желтого пятна, кровоизлияния в сетчатку, отслойки сетчатки, пигментного ретинита, старческой дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии; рака, иммунотоксичности, поражения периферической нервной системы, поражения центральной нервной системы, эндокринопатии, болезней репродуктивных органов, нарушений развития младенцев и детей ясельного возраста, анемии, аритмии, сердечного приступа, стенокардии и инфаркта миокарда.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, где пептид ингибирует активацию арилуглеводородного рецептора (AHR).

8. Фармацевтическая композиция по п.6, где пептид ингибирует активность цитохрома Р450.